HU228700B1 - Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests - Google Patents

Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests Download PDF

Info

Publication number
HU228700B1
HU228700B1 HU0500459A HUP0500459A HU228700B1 HU 228700 B1 HU228700 B1 HU 228700B1 HU 0500459 A HU0500459 A HU 0500459A HU P0500459 A HUP0500459 A HU P0500459A HU 228700 B1 HU228700 B1 HU 228700B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
strains
serotype
genes
type
Prior art date
Application number
HU0500459A
Other languages
English (en)
Inventor
Hilda Elizabeth Smith
Original Assignee
Stichting Dienst Landbouwkundi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stichting Dienst Landbouwkundi filed Critical Stichting Dienst Landbouwkundi
Publication of HUP0500459A2 publication Critical patent/HUP0500459A2/hu
Publication of HUP0500459A3 publication Critical patent/HUP0500459A3/hu
Publication of HU228700B1 publication Critical patent/HU228700B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Stxeptococcus raís vakcinák és diagnosséikai tesx™
A találmány tárgyát, általánosságban sertések Strsptococc«s~föntözéseivel szembeni vakcinák képezik.
A találmány tárgyát képezik továbbá rekombináns Streptococcös suis mutánsok..
A találmány szerinti megoldás alkalmas Streptococors scis gyors detektálására és/vagy szerotipízálására, valamint szeretípus-specífikus Streptococcus-betegségek ellen védettséget nyújtó vakcinák és Stzeptccoccus-fertozések elleni maltivalens vakcinák kifejlesztésére.
.A Streptococcas-fajokát - melyek közül igen. sok háziállatokban és emberekben fertőzéseket okoz - gyakran a Lancefield-féle csoportosítás szerint osztályozzák. A Lancefíeld-féle tipizálás olyan szerorogíai determinánsokon
«X χ*** alapul, amelyek - többek között - a baktériumok tokjában, találhatók, és csak hozzávetőleges meghatározást tesznek lehetővé (gyakran különböző csoportba tartozó baktériumok kereszt-reaktivitást mutatnak egymással, míg egyén dtreptococcüs-okban determináns egyáltalán nem azonosítható. Λ csoportokon beiül szerotipisálással gyakran további megkülönböztetés lehetséges; ezek a szerotlpusok tovább növelik a S't.reptocoocus-ok antigén-változatosságát, ami a Streptoccccas-fertözések diagnosztizálásában és az ellenük történő vakeinálásfoan számos nehézséget okoz.
A Lancefield-féie ”A csoportba, tartozó Streptococcus-fajok (“Lancefleld group A StreptococcusGAS, Síreptococcus pycgenes; gyermekekben gyakoriak; orr-garat, fertőzéseket és komplikációkat okoznak. Az állatok közül elsősorban a szarvasmarhák érzékenyek a GAS-ra, amely gyakran tögygynlladást okoz bennük.
Az A” csoportba tartozó Streptococcus-ok a gyermekek leggyakoribb bakteriális fertőzésének a Streptococcus-erede tű garathurut (phsryngítis i és az ótvar (impetigo; kórokai, és egyéb kevésbé általános, de potenciálisan életveszélyes fertőzéseket okoznak {pl, iágyszövati fertőzéseket, bacteraemiáf és pneumoníát). Ezen. túlmenően, a GAS - egyedülálló módon - gyakran az akut reumás lázzal járó fertőzés utáni autoimmun, tünete gyű ttessel és a poststreptococcalis glomerul.ouephritís-szel is összefüggésbe hozható.
Számos cikkben beszámoltak arról, hogy a GAS okozta súlyos fertőzés, valamint az akut reumás iáz előfordulási gyakorisága az utóbbi évtizedben megnőtt, ami az érdeklő-
dóst az organizmus e betegségek patogenezisében szerepet játszó virulencia-faktorai sajátosságainak meghatározására irányitotta.
A GAS több olyan, felületi komponenst és extrac-elluláris terméket termel/ amelyek a virul éneia szempontjából fontosak lehetnek. .Legrészletesebben a fő felületi proteint, az F-protaint tanulmányozták, melyről bebizonyosodott, hogy szerepet játszik mind a virulenciában, mind az immunitásban. Az ^-proteinben gazdag izolátumok képesek szaporodni az emberi vérben, s ez a. sajátság arra utal, hogy az Mprotein képes a fagocitézis megakadályozására. Ezek az izolátumok kísérleti állatokban igen virulensek.
A Láncétleld-féle ”Brí csoportba tartozó ótreptococ·· cas-ok (GBS) leggyakrabban szarvasmarhákban fordulnak, elő (tőgygyuiiadást okozva')·, azonban az általuk okozott fertőzésekre emberi csecsemők is érzékenyek (gyakran halálon kimenetellel) . A GB.S-fajok az Egyesült Államokban és NyugatEurópában emberi újszülöttekben a bakteriális szopszis és a meningitis legfőbb okozói, és a fejlődő országokban is egyre jelentősebb újszülöft-pafcogének,
A GBS-törzsek újszülöttekben csak az Egyesült Államokban - becslések szerint - 10-15 000 invazív fertőzésért felelősek. A korai -diagnosztizálásban é-s kezelésben bekövetkezett javulás ellenére a GBS-fajo.k okozta neonatalis szep-szís mortalitási aránya 15 %-rói 20 %-ra nőtt. Ezen túlmenően, a GBS-okozta· mening.iti.st túlélő páciensek 30-50 %—á.bam hosszú időtartamú neurológiai következmények léptek fel. Az utóbbi két évtizedben a GBS emberi csecsemők fontos • * pata-génjeként való felismerése következtében az érdeklődés - a GBS virulenciája és a GSS-fertőzésre adott immunreakció szempont j ábő-1 lényeges ~ bakteriális és gazdaszervezeti faktorok azonosítására irányult.
Különösen nagy érdeklődésre tarthatott számot az ilyen baktériumok: fő felületi antigénjének tartott tok-poiiszauharid, A Rebecca Láncotleld által kidolgozott rendszer módosított változatában a GBS-törzseket tok-poliszacharidjaikban tapasztalható antigén-különbségek alapján, illetve szerológiailag definiált C-proteinek jelenléte vagy hiánya alapján szerotipizálják. Míg a nem humán forrásokból izolált GSS-fcőrzsekbői gyakran hiányzik a szerológiailag de te. k tálba tó tok, a neonataiis fertőzéssel összefüggd törzsek döntő többsége a négy fő tok-szerotipus (la, Ib, rí vagy III; valamelyikébe tartozik. A tok-poiiszacharidok a baktér iums-ej tet körülvevő legkülső - sejtfalon kívüli burkot alkotják, A tok anyaga eltér a sejtfsl-asszo-ciált Bcsoportos szénhidrátoktól. Felvetődött, hogy a baktériumtokban - a meníngitist okozd - sziálsav jelenléte lényeges e baktériumok vér-agy gáton áthatoló képessége szempontjábői, valóban, st agaiactlsé-ban a sziálsavrői kimutatták, hogy kulcsfontosságú szerepet játszik a 111, típusú baktériumtok virulencia-funkciójában. A S. suls tokja glükózból, galaktőzböl, M-acetil-giüközamlnbói, ramnózból és sziái.savból áll,
A B-csoportos poliszacharid - ellentétben a típusspecifikus tokkal - valamennyi GSS-törzsben jelen van, és az organizmusok Lancefield-féie B“ csoportba történő szerp'tipizálásásak alapját képezi. A Lancef ield^ és mtsai, által végzett korai kísérletek eredményei azt mutatták; hogy nyarakban a teljes GBS-organizmusck ellen termeltetett antitestek egerekben védelmet hiztosito-ttak a homológ toktípusú törzsekkel végzett immunprőbávai szemben, ami azt bizonyltja, hogy a tok-poiíszacharid védő antigénként központi szerepet játszik. Az 1970-es években Baker és Kasper által végzett vizsgálatok eredményei azt bizonyították, hogy a Σ1Ί. típusú GBS-szepszishen szenvedő emberi újszülöttek köidökvénájából vett vér III. típusú baktériumtok elleni antitesteket alacsony vagy kixmztathatatian koncentrációban tartalmazott, ami arra utal, hogy a baktériumtok elleni antitestek hiánya az emberi újszülöttek GSS-okozta betegségre vonatkozó érzékenységének kulcsfontosságú rektorát képezi.
A Lancefield-féle C csoportba tartozó baktériumok (pi. Sl égni, S. zooepidemicus, S. dysgalactiae, stb,· okozta fertőzések főként lovakban, szarvasmarhákban és sertésekben figyelhetők meg, de ezek a baktériumok emberek fertőzésére is képesek, A. Lancefleid-féle Dw csoport tagjai ÍS. bovisj okozta fertőzések valamennyi emlősben és madárban előfordulnak, s bizonyos esetekben sndocardifist vagy septieaemíát okoznak.
A Lancefield-féle ”E!!, JÍG,!, L”, !,Ut! és V csoportok fajai íd. poroinns.x S, canrs, S, dysgalactiae; különféle gazdaállatokban találhatok meg, és újszülöttkor 1, fertőzéseket, nasopharyngealis fertőzéseket és mastitist okoznak.
Λ 4 ♦ ♦ *» X* **
«. «Λ X X * * X * * *
4> 4 »» ·«··* ♦ * * X * * * * . * «»»♦ ΧΦ»Χ *♦ *« 9»
Az Lanceííeid-féle R, Sn és T” csoportban (és csoportba sea sorolt típusokban) helyezhető ei a 5. suis, amely fiatal malacokban agyhártyagyu.iladást (meningitis; , septioaemiáfc, arthritist és hirtelen halait okoz, sőt,· esetenként emberekben is okozhat meni.ngit.ist.
A Strepéococcy.s stus fiatal malacokban a meningitis, septicaemia, arthritis és hirtelen halál okozója [ClixtonHadley, a hivatkozások listájában (4) hivatkozás; valamint
Veoht és latsai. .(46) és esetenként emberekben is okozhat meniogitist íArends és Zanen (1)]. A S, suis törzseket általában morfológiai, biokémiai és szsrolégiai tulajdonságaik alapján azonosítják és osztályozzák fid. Hőmmés és mtsai. (58); Killper-B&lz és S-chleifer (59); Veoht és mtsai. A szerológiai osztályozás specifikus, poliszacharid antigének jelenlétén vagy hiányán alapul; mindezidáig 35 különböző s zero típust. írtak le (lö. 9., 56. és 14.
hivatkozás) . Több európai országban a beteg sertésekből leggyakrabban a S. saís 2. szerotípusát izolálták, melyet a y. és 1. szeretípus követett. A 2. suís szerológiai tipizálása különböző aggintinizácíós tesztek alkalmazásával valósítható meg. S tesztekben Izolált és biokémiaiiag karaktérízált d. sulis sejteket 35 specifikus vérsavö sorozatával agglutinálnak. Ezek az eljárások nagyon munka- és időigényesek .
A 2. suís okozta betegség ontogeneziséről keveset tudunk, nem beszélve a 5. aula különböző szerotipussiről. Potenciális viruleucía-faktorként számos baktérium-komponenst Írtak le, például, extraceliuiáris és sejtmembrán-asszocí<· * ált proteineket, £imbriákat, haemaglutínineket és beírna! í2int (ld. 9., 10., ll,, IS., 15., 47. és 49. hivatkozások). Hindasónál tel, e protein-komponenseknek a betegség patogeneslsében betöltött pontos- szerepe nem ismert <37.. hivatkozás) , Ismeretes, hogy különböző atreptococcrs-ok es egyéb gr-am-poz.itiv baktériumok polissa-charid-tokja nagy jelentőségű a pato-gene-zis szempontjából <3.., 6<, 35., 51. és 5-2. hivatkozás) . Λ tok e mikroorganizmusok számára f a-goci tó zással szembeni rezisztenciát biztosít, igy fontos virulenciafaktornak tekinthető. Az u többi időben a óh suís tok pato-genezisben játszott szerepét is felvetették (ld. 5. hivatkozás) . A S. suls tok-p-oliszacharidjának szintéziséért felelős gének (cos-gének) szerkezete, szerveződése és működése egyelőre ismeretlen. Az 1. és- 2. szerotipusű S. suls törzsek sertésekben tapasztalható viruienciája eltérő lehet (id. 41., 45. és 49. hivatkozás) , Az I. és 2. típusba tartozó törzsek némelyike virulens, míg mások nem. Mivel az 1. és 2. típus virulens és avirulens törzsei egyaránt tokozottak, előfordulhat, hogy a tok a virulencia szempontjából nem releváns faktor.
A S. su.is okozta fertőzések, illetve betegségek elleni küzdelem, sikerességét hátráltatja, hogy a betegség epidemiológiájáról nem állnak rendelkezésre megfelelő ismeretek, továbbá nincsenek hatékony vakcinák és érzékeny diagnosztikai rendszerek, Jói ismert és általánosan elfogadott tény, hogy a különböző Streptooocous-fajok és egyéb grampozitív baktériumok poliszacharid-tokja. fontos szerepet játszik a patogenezisben, A tok biztosítja e mikroorganiz3 ♦ Jf
musok f'agocítözissal szembeni elienálíoképességét, s ezáltal lényeges vírulencia-faktornak tekinthető.
Az egéreredetű polimorf, sejtmagvú leukocíták nagyobb mértékben fagocitálják a tokkal nem bíró S. ssis törzsek sejtjeit, mint a tokozott S. stis törzsekéit. Ezen túlmenően, az ín vivő szaporított virulens törzsek tokja vastagságának növekedését jegyezték fel, míg az avírulars törzsek esetében ilyen növekedés nem volt tapasztalható. Ezek az adatok szintén azt bizonyítják, hogy a S. su.ís tokja szerepet játszik a patogenezisben.
A. csoportba ne® sorolt Streptococous fajok - mint pl. az emberekben veszettséget okozó- A. mutáns, a szarvasmarhákban tögygyuiladást okozó a. uberis, az emberekben komoly fertőzéseket okozó S, pnenmonia@f valamint az Enterococcas raeoaiis és az A. faeclmn - tovább bővítik a Atreptoooccusok népes csoportját.
A dt.reptccoccas pneumoníee (pnemococcus) fertőző betegségeket (pl. tüdőgyulladást, bactsraemiát és méníngitist) okozó humán patogén. Az antibiotikumok széles körű hoz zárérhetőséae ellenére a pneumococcus-fertőzés továbbra ís gyakori, és - különösen a nagy rizikó-faktoré csoportokban (pl. kisgyermekekben és idősekben) - halálos kimenetelű ís lehet. Elsősorban a fejlődő országokban évente sok öt év alatti gyermek hal meg pneumococcus-eredetü tüdőgyulladásban . A S. pneamoniae-t - a fentiek mellett - az otitis média és a sinusitis fő okozójaként tartják számon. Ezek a fertőzések kevésbé súlyosak, azonban jelentős gyógyászati költségeket vonnak maguk után, különösen komplikációk (pl.
X* állandó süketség) esetén. A pneumococcus normális ökológiai niche-e az emberi orrgarat. Időről időre minden emberben megfigyelhető pneumococcus-kolonizáció, és adott pillanatban az emberek akár 60 %-a. is hordozó lehet. A pneumococcusok emberi orrgaratfoan való jelenléte azonos srerotipus okozta fertőzéssel szemben védettséget nyújt. A legtöbb fertőzést nem az orrgaratban hosszabb ideje meglévő törzsek, hanem újonnan bekerült törzsek okozzak. Számos baktérium. tartalmaz felületi polrszaeharidokat, amelyek védettséget biztosítanak a környezettel szemben, A pacogén baktériumok felületi poliszacharídjai a baktériumokat rendszerint védetté teszik a gazdaszervezet védekezési mechanizmusával (pl. a vérsavó iitikus hatásával vagy a fa.gocit6z.is~ sál) szeriben, S tekintetben a őtreptocoecus pneumoniae szerofípus-speoifikus tok-poliszacharidga (CP) fontos vi.rul.en~ cia. faktor. A tok nélküli törzsek avirulensek, és a tokpolíszacharid elleni antitestek védő hatásúak. A védettség szsrotipus-scecififcus; mindegyik szerotípusnak megvan a saját, specifikus tok-pcií szacharid. szerkezete. 90 különböző tok-szerotipusf azonosítottak; jelenleg 23 tok-poliszacharid szerotípus van vakcinába foglalva.
A Streptococcus-fertözések elleni vakcinák a különböző őtreptocOCCUS-fajok políszacharid-tekja elleni ímmunreakcíőt használják ki, különösen, mivel a poliszacharid-tokot tartják e baktériumok fő virudeneia-faktorának. A baktériumtok a fertőzés során rezisztenciát biztosit a fagooitőzissal szemben, ezáltal megvédi a baktériumot a gazdaszervezet immunrendszerétől (azaz a makrofágoktol és neutrofilektől).
A bakteriatok különösen hatásos védelmet biztosít a kompiement-közvetítette opsonofagocitózissal szemben. Szén túlmenően, bizonyos baktériumok olyan tok-poiiszaoharídokat termelnek, amelyek utánozzák a gazda szervezet molekuláit,· s ezáltal biztosítanak védelmet a gazda immunrendszerével szemben. Ezenfelül/ még ha. a baktériumok fagooitózist is szenvednek; az intracelluláris elpusztítást gátolja a tok jelenléte.
Általában úgy vélik, hogy a baktériumot csak akkor ismeri fel a gazda immunrendszere, ha a gazda rendelkezik baktériumtok elleni antitestekkel vagy egyéb szérum-faktorokkal , Ilyen esetben a baktérium semlegesítése opsoniflkadé utáni fagocitózissal, a baktérium elpusztításával valósul meg.
Mindazonáltal, ezek az antitestek szeroiípus-specifi~ kusak, és gyakran a Screptococcus-ok csoportjára jellemző számos szerotípus csupán egyikével szemben biztosítanak védettséget .
Például, a jelenleg kereskedelmi forgalomban beszerezhető S. surs vakcinák - amelyek általában egész sejtes baktérium-készítményeken vagy a ő. sara Cbaktériumtok~tar~ talmában feldúsított) frakcióján alapulnak - heteroióg törzsekkel szemben csak korlátozott védelmet biztosítanak. Az Egyesült Államokban 1983-ban engedélyeztetett pneumocoecusvakcina 2.3 puenmococcus-szerotlpusbol áll, miközben legalább 90 tok-poiiszaoharíd létezik.
** X*
E pneursococctis-vakcina összetétele ac Egyesült Államokban megfigyelt betegség-izolátumok előfordulási gyakoriságán és a különböző szórótípnsok közötti keresztreaktivitáson alapul. Bár ez a vakcina as egészséges felnőttek számára védettséget biztosít a vakcinában lévő szerotipusok okozta fertőzések ellen, azonban a 18 hónaposnál fiatalabb csecsemőkben nem vált ki védő hatású immunreakciőt, és idősebb emberekben is kevésbé hatásosak. Ezen túlmenően, a vakcina iramunhíányos és hematológiai malígnáns betegségektől szenvedő páciensekben csak korlátozott védettséget nyűjt.
A fentieknek megfelelően, szükség van Streptöcoccus’fertőzések elleni javított vakcinák kifejlesztésére. Sok figyelmet fordítottak a tok-poliszacharid vakcinák - releváns poliszacharídok kémiai vagy rekombináns módszerekkel történő előállításával történő - létrehozására, azonban a poiiszacharídok kémiai szintézise költséges, míg a fokpoliszacharídok rekombináns módszerekkel történő előállításához szükség van íí megfelelő gének ismeretére, ami nem áll mindig rendelkezésre, és minden egyes szerotípusra külön meg keli határozni.
A fentieknek megfelelően, feltárunk egy izolált vagy rekombináns nukleinsavat, amely Streptococeus suio tok-poiiszacharídjainak szintéziséért felelős tepsi gén-klasztert alkot. A fok-poiiszacharídok bioszintézisét általános szinten számos Gram-pozltiv és Gram-negativ baktériumban vizsgálták (Íd. 32. hivatkozás). Gram-negativ baktériumokban (valamint számos Gram-pozitív baktériumban) a poiiszacharidók bioszintézisében szerepet játszó gének egyetlen lótuszban csoportosainak (klasztereket képezve) . A Streptocc-ccus suia - találmányunk értelmében feltárt - tok-génjei közös genetikai szerveződést mutatnak, amelyre három különálló régió jellemző.. A központi régió szerotípus-speeifíkus, és a políszacharid.ok szintéziséért és polimsrizációjáért felelős enzimeket kódol. Ezt a régiót két ~ Streptococous sorsban konzervált - régió szegélyezi, melyek olyan általános funkciókat betöltő proteineket kódolnák, mint a políszacharid sejtmembránon keresztüli transzportjáért felelős proteinek. A különböző fajok között csak kismértékű homológia létezik, ami megnehezíti a látszólag hasonló gének összehasonlítását e.s detektálását. A szegélyező régiókat kódoló nukleinsav ismerete lehetővé teszi a Streptoooccvs suis szerotípusok központi régiója nukleinsavának típus-specifikus meghatározását (Id. a kísérleti részt).
A találmány vonatkozásában jelentős egy izolált vagy rekornbináns nukleinsav, amely Streptococcus snis tok-génkiaszterét vagy annak egy génjét vagy géntragmensét alkotja. Az ilyen nukleinsav, például, a Str^tococcus evés szerotípusok bármelyikéből származó kromoszómális DNS-nek a találmány szerinti 1., 2. vagy 9. szeretípusú Sfreptooocous suis tokgénkiaszterből származó gént alkotó nuklaínsavval (Id. pl. 4. és 5. táblázat) végzett hibridizáltatásával és a ítípusspecifikus ) gének klónozásával állítható elő (Id. a kísérleti részt). Legalább 14 nyitott leolvasási fázist azonosítottunk. A legtöbb gén egy transzkripciós egységbe tartozik, ami e gének koordinált szabályozását teszi lehetővé, s ezáltal ezek (valamint az általuk kódolt enzimek és proteinek) együttesen működve hozzák létre a megfelelő poliszacharidokat tartalmazó tokot. A találmány vonatkozásában jelentősek a eps-gének. és az. általuk kódolt proteinek, melyek a vezérlésben (CpsA), a lánchosszúság meghatározásában (CpsB, CpsCj, a pűliszaoharidok szállításában (CpsC)r illetve bioszintézisében (GpsE, F, G, H, J ás K) játszanak szerepet . Bár a bruttó szerveződés első· látásra hasonló számos Gram-pozítiv baktérium cps- és eps-génklaszteréhez fid. 19., 32. és 42, hivatkozás)·, az össz homo lóg ia alacsony (Id. 3. tábla zat). A bioszintézisben szerepet játszó régió a gánklaszter központjában helyezkedik el, amelyet két - általánosabb funkciójú géneket tartalmazó - régió szegélyez..
A találmány vonatkozásában jelentős egy izolált vagy rekombináns nukleinsav, amely 2. szerotipusű Streptococcus suis génklaszt-ert (vagy abból, származó gént vagy génfragmenst) alkot (előnyösen a 3. ábrán megadottak szerint). Az e génklaszterbe tartozó gének poliszacharid-tok komponensek és antigének bioszintézisében játszanak szerepet. Az ilyen gének részletesebb leírását illetően 1-d. pl. a 2, táblázatot; például, a opsA-gén tok-poliszacharid szintézisének szabályozásában, mig a cpsB- és cpsC-gén a lánchosszűság meghatározásában játszik szerepet. Egyéb gének (mint pl. a cpsD, E, F, G, Η, X, J, A és rokon gének) a poiiszacharídszinfcéz.isben töltenek be szerepet (pl. glökozil- vagy glikozil-transzterázként működve) , A cpsF, G, Η, I és J gének, nagyobb tipus-specifitásé proteineket kódolnak, mint a szegélyező gének, amelyek a fajok között többé-kevésbé fconzerváltak, és klónozást megelőző PCR-amplífikáciős vagy kereszt -hibridizációs kísérletekben alkalmazható iáncínditők, illetve próbák kiválasztásának alapjaként szolgálhatnak.
A találmány vonatkozásában jelentős továbbá egy izolált vagy rekombináns nukleinsav, amely 1. szerotípusű Shreptococcus .suis génklaszte-rt (vagy abból származó gént vagy géntragmenst} alkot (előnyösen a 4. ábrán megadottak szerint).
A találmány vonatkozásában jelentős továbbá eov iso-
ΐ ?h< j *· vagy rekombináns n u ki e i n s a v, a®
Str<&p tococcue suds génki .asztert (vagy >
vagy gén.f regmensf) alkot (előnyösen az
szerint} .
Szintén jelentős a találmány vonatkozásában a S. suís cps-lokuszának fragmense vagy annak részei, amely(ek) tokpoliszacharid bioszintézísében játszanak szerepet, és a S, suis egyéb szerotipusaiból származó rokon fragmensak egyszerű azonosítását vagy detektálását teszi(k) lehetővé.
A találmány vonatkozásában jelentős továbbá egy nukleinsav-próba. vagy láncíndíté, amely találmány szerinti nuklein-savból származik, és· lehetővé teszi a ő«. se is faj- vagy szerotipus-spe-cifikus detektálását. A találmány szerinti próba vagy iáncindító (mely kifejezéseket a leírásban egymás szinonimáiként alkalmazzuk) DNS-, RNS- vagy PNS- (peptid-nukle-insav) próba lehet, amely találmány szerinti baktérium to-k-nukleinsavval képes hibridizálódni. é faj specifikus detektálást előnyösen úgy valósítjuk meg, hogy egy fajspecifikus régióból (pl. szegélyezőrégióból) próba- vagy láncinbitó-szekvenciát szelektálunk, míg a szeretIpus-~speci.fik.us detektáláshoz a próba vagy láncinditó szekvenciáját egy találmány szerinti bsktéríumfok-génklaszter típus-specifikus régiójából (pl. központi régióból) választjuk ki. Az ilyen próba vagy láncinditó módosítatlan alakban alkalmazható, például, kereszt-hibridizációs vagy polimeráz-láncreakcíós (PCP.) kísérletekben .{pl. a kísérleti részben leírtak szerint) . Feltárjuk a S. suis 1. és 9, típusának további típus-specifikus epe-génjeinek karakter!zálását. Széniéiül, leírjuk - a 3S már ismert S. suis szerotípus közül - az I., 2. es 9. szerotípus eps-Iokúszónak genetikai diverzitását. Feltárjuk továbbá, például, a 9. szerotípus esetében végzett típus-specifikus. polímeráz-láncreakciót, amely gyors, megbízható és érzékeny vizsgálati eljárás, és orr- vagy mandula-kenettel (vagy fertőzött vagy hordozó állatokból származó egyéb mintákkal) közvetlenül végrehajtható.
A találmány vonathozásában jelentős továbbá egy olyan próba vagy láncinditó, amely legalább egy riportermolekulát is tartalmaz. A riportermolekulák számos példája ismeretes; például, a ríportermolekula. további nukieinsavat is tartalmazhat, amely megfelelő szekvenciához híbridízálődó specifikus szekvenciát (pl. olxgo-dl) hordoz. A megfelelő szekvenciához történd hibridizáció könnyen kimutatható, mivel - például - szilárd hordozóhoz van rögzítve.
Egyéb riportermolekulák kromofőr csoportokat (pl. fluor©krómokat) tartalmazhatnak, ami vizuális detektálást tesz lehetővé, például, £énymikroszkópos vagy fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) technika alkalmazásával. Ismét más riportermoleknlák enzimet (pl. tormaperoxídázt.) tarts!máznék, ami enzimatikus detektálást tesz lehetővé, pl. enzim-kötött tesztekkel (EIA). A riportermolekulék. további példái közé tartoznak a radioaktív vegyületeket tartalmazók, amelyek radioaktivitáson alapuló technikákkal detektálhatok.·
A találmány egy előnyös megvalósítási módja értelmében legalább egy találmány szerinti próbát vagy láncindítöt riportermolekul.áva.1 és blokkoló (kveacser) molekulával látunk el (jelölünk), jelöletlen próbával vagy láncínditőval együtt alkalmazva FCR-alspű tesztben specifikus hibridizáció gyors detektálásának elősegítése céljából.
A találmány vonatkozásában jelentős továbbá egy diagnosztikai teszt vagy tesztelő reagenskészlet, amely találmány szerinti próbát vagy láncindítót tartalmaz. A találmány szerinti teszt vagy tesztelő reag-enskészlet (pl. kereszt “hibridizációs teszt vagy PCR-alapú teszt) előnyösen alkalmazható Streptoccccus suis gyors detektálására és/vagy szerotipizálására. Szintén jelentős a találmány vonatkozásában egy protein vagy proteínfragmens, amelyet találmány szerinti nukieinsav kódol. Az ilyen proteinek és fragmenaek példái közé tartoznak, például, a 2. táblázatban felsorolt proteinek; ilyenformán, a opsA-protein a tok-poliszacharid szintézisének szabályozásában, mig a cpsB és opsC a iánchosszüság meghatározásában játszik szerepet. Egyéb proteinek és funkcionális fragmenseik (mint pi. a cpsD, E, F, G, Η, 1, J, K és rokon proteinek) a S, aula poliszaeharíd-hioszintézisében töltenek be szerepet (pl. glükozil- vagy glikozíl-transzférésként működve).
Szintén jelentős a találmány vonatkozásában egy eljárás Sfcreptococcus suis baktéríumtok-antigén előállítására, melynek során találmány szerinti proteint vagy annak funkcionális fragmensét alkalmazzuk. Szintén feltárjuk a találmány szerinti eljárással előállítható Streptococcns suis baktériumtok-antigént. A cps2-gének predíktlv aminosavszekvenciájának adatbázisokban fellelhető szekvenciákkal végzett összehasonlítása eredményeként az egyes funkciókat nyitott leolvasási fázisokhoz lehet rendelni. A központi régió tartalmazza a típus-specifikus giikozil-transzferézokat. és a feltételezett poiiszaeharid-poümsrázt. Ezt a régiót két másik régió szegélyezi, melyek olyan általános funkciókat betöltő proteineket kódolnak, mint a pollszaoharid sejtmembránon keresztüli transzportjáért felelős proteinek. A Sfrep tccoccus fcofc-poliszacharid-antigén - találmány szerinti protein vagy annak funkcionális fragmense alkalmazásával végzett - bioszintézise előnyösen alkalmazható· kemo-enzimátikus szintézisre és a szerőtípus-specifikus Streptococcos-betegségek ellen védettséget nyújtó vakolnák kifejlesztésére, továbbá előnyösen alkalmazható Strepfococcus-íertőzések. elleni, multivalens· vakcinák kifejlesztésére. Az ilyen vakcinák baktérium-tok elleni antitestek termelődését váltják ki, amelyek a gazdaszervezet számára védettséget b i z t o s i t a n a k.
Ezen túlmenően, szintén a találmány tárgyát képezi egy tok nélküli StrepPocoecus-mutáns vakcinában történő alkalmazásra.? az ilyen mutánsból származó vakcínatö-rzs? il** β>* ·* « * X « « * β * > χ. * letve a vakoinatorzsböi származó vakcina. A találmány szerinti megoldás értelmében - meglepő módon, és a technika állása szerinti általános szemlélettel szemben -· baktériumtok- termelésben. deíiciens Strepfoooccus-mutáns vakcinában történő alkalmazását tárjuk fel.
A tok nélküli átreptococcus-mutánsok régóta ismertek, és megtalálhatók a természetben (Griffíth; J. Hyg. 27, 113 (1928)1, ami azt bizonyítja, hogy a pneumococcusok átalakulhatnak egyik típusból a másikba. Gríffitb beszámolt arról, hogy ha egerekbe élő 2. típusú durva” tok nélküli pneumococcusokat injektált, az egerek életben maradtak, ha azonban az egereket élé, 2. típusú durva és hővel elölt sima (tokozott; 1, típusú pneumococcusok siegyévei (azonos dózisban) oltotta be, az egerek elpusztultak, és vérükből 1, típusú élő sima pneumococcusokat izolált. E felismerés idején az átalakulási (transzformációs) elmélet lényegét nem értették, azonban ez tisztázódott, amikor bebizonyosodott, hogy a transzformáció során bekövetkező fenotípusos változásokért felelős genetikai anyag a DNS.
A baktériumtok-termeiésben deficiens Streptococcssmutárusok számos alakban előfordulnak; némelyikük egyáltalán nem. képes tok termelésére, és teljesen tok nélküli, míg mások hiányos tokot képeznek (amelyre a baktéríumtok-génkiaszterben bekövetkezett mutáció· jellemző). A defíoiencia érintheti a baktériumtok kialakulását, amikor is a bakteriuratok anyagának szerveződése átrendeződött (ami elektronmikroszkópos vizsgálattal kimutatható). Ismét más deficiens mutánsok csaknem teljesen kialakult tokkal bírnak, amely csak bizonyos cukorkomponens tekint.etében hiányos.
Mostanra - a biotechnológia hatalmas fejlődését követően, és annak ellenére, hogy továbbra is keveset tudunk a Streptöcoccu-S'-ok baktériumtok-szintézisében szerepet játszó gének lokalizációjáról és szekvenciájáról - lehetőség nyílott St.reptococcus-mutánsok, például, homológ rekoiabínáciövai vagy transzpozonos műtagenezissei történő létrehozására, mely technikákat, például, a GAS esetében (%'essels és mtsai.: PNAS 88, 8317 (1991)], a GBS esetében (dessels és mtsai.: PNAS 86, 8983 (1989)], a S. suís esetében (Smith;
ID-DLO Annual Report 1998, 1.8-19. oldal; Charland és mtsai.: Microbioi. 144, 325 (1993)] és a 2. pneisuoma esetében [Kcikman és mtsai. : >1. Bact. 178, 3736 (1996)] alkalmazták, Az ilyen rekombináns mutánsok (vagy izogén mutánsok) könnyen összehasonlíthatók a vad típusú törzsekkel (amelyekből maguk a mutánsok is származnak),
A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint rekombináns, bsktériumtok-termelésben deficiens .Streptocoocus-smtáns· vakcinában történő alkalmazását tárjuk fel. Az ilyen mutánsok létrehozására hasznos rekombináns technikák közé tartozik, például, a homológ rekombináció, a transzpozonos mutsgenezis, stb., melyekkel a baktérium genomjába deléciők, inszsrciók vagy (pont)mutációk iktathatok be. A rekombináns módszerek előnye, hogy stabil mutánsok hozhatók létre (különösen homológ rekombinációval és kettős ”crcss-ovsr!' technikával), továbbá, hogy a kapott mutáns genomjában ismert a deléció, mutáció vagy inszeroiö pontos helye.
’ί:
A találmány egy még előnyösebb megvalósítási módja értelmében olyan - baktéríumtok-termeiésben deficiens stabil mutánst tárunk fel, amely, például, homológ rekombinációval vagy cross-over1* integrációs esemény révén hozható létre. Az ilyen mutánsok példáit a kísérleti részben írjuk le fa találmány szerinti stabil mutánsok két példája a lOcpsB- és iOcpsF-mutáns).
Szintén a találmány tárgyát képezi egy Streptococcas vakcínatörzs és vakcina, amely baktériumtok-termelésben deficiens Streptococcus-mutánsböi származik. Általában az ilyen törzs vagy vakcina az összes Streptococcus-fertőzés esetében alkalmazható, legyen az állatokat vagy embereket érintő vagy zoonotikus fertőzés. Természetesen lehetőség van arra, hogy először kiválasszunk egy általános vakcinatörzset, és abból baktériumtok-tsrmeiésben deficiens Streptococcus-mutánst származtassunk le, amely felhasználható a találmány szerinti vakcinában.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja értelmében baktéríumtok-termeiésben deficiens Streptococcas-mutans vakcinában történő alkalmazását tárjuk fel, mely Strepfo-coccus-mutáns a következők valamelyike; Screptococcus A csoport, Streptococcus 3 csoport, dtrepíococcas sais és St.reptococous pneumonra. Ennek megfelelően, vakcina tör z sebet és vakcinákat tárunk fel ezen rendkívül heteroiög Streptocöccus-okkal történő alkalmazásra (melyek számos szerotípusa létezik). A találmány szerinti - baktériumtoktermelésben deficiens, specifikus Streptococcus-mutánsból származó - vakcinának a heterológ védelemre vonatkozó prob- 21 ~ lámái kiküszöbölhetek, mivei ezek a mutánsok nem per se tok-antigénéken alapuló védelmet indukálnak.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja érteimében a vakeínatörzset annak alapján választjuk ki, hogy immunkompetens gazdában vagy gazdasejtekben képes-e életben maradni vagy akár replikálódní, s ezáltal, a gazdában - defioiens volta ellenére - bizonyos ideig {1-2 naptői 1-2 hétig terjedő ideig! fennmaradni.
Sár az immundefioiens gazda igen különböző - egy vagy több virulencia-faktorban deficiens - baktériumok replíkáciőját teszi lehetővé, általánosan a Streptoeocous-ok patogenítása jellemzőjének tekinthető azt a tény, hogy normái gazdában vagy gazdasejtekben (pl. makrofágokban) bizonyos ideig képesek életben maradni, illetve replikálódní. Például, Wíliams és Blakemore íbeuropafch. Appi. Neurobiol, lé, 345 (1990); Neuropath, Appl. Neurobiol. 16, 377 (1590); J. Infeot. Dis. 162, 474 (1990)] kimutatták, hogy 5. mais elleni antitesteket nem tartalmazó sertésekben a. polimorf sejtmagvú sejtek és a makrofágsejtek egyaránt képesek a patogén S. su.is f agocitáiására, és a makrói ágokon, illetve a sertésen beiül csak a patogén baktériumok képesek szaporodni .
Mindazonáltal, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint defioiens vagy avirulens mutánst vagy vakcinatörzset tárunk fel, amely az említett gazdában legalább 4-5 napig, előnyösen legalább 8-19 napig képes életben maradni, lehetővé téve ezáltal a későbbi Strepto-coccus-fertőzésekkel. szembeni stabil ímmunreakciőt.
? 9
A találmány szerinti otreptococcus-mutáns vagy vakcinatörzs - p-erzísstens, de avírulens sajátságának köszönhetően - igen .alkalmas S'treptococcüs-antigének elleni specifikus és/vagy hosszú időtartamú imnrnnreakcíők kiváltására, sőt, a gazda baktérinmtok elleni esetleges specifikus iromunreakciői viszonylag jelentéktelenek, mivel a találmány szerinti vakcinatörzset az ilyen antitestek általában nem ismerik .fel.
Ezenfelül, a találmány tárgyához tartozik egy olyan Streptococcns-vakciraförzs, amely Streptocoocns-vírulenciafaktor vagy antigén-determináns expresszálására képes mutánst tartalmaz.
Ά találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti Streptococous-vakcinatörzs Streptococ™ cus-vírnienciafaktor expresszálására képes mutánst tartalmaz, mely viruienciafaktor vagy antigén-determináns oeliulárís komponensek közül való; például, a mnramidáz által felszabadított protein ÍMREj, extracelluláris faktor (EF) és sejtmambrán-asszociált proteinek, SO k.D-os· hösokk-protein, pnenmococcus-eredetű felületi proteín-A (Psp é) , pneumoiizin, c-proteia, protein-M, fímbriák, haemaglutininek és hemolizin, valamint az ezekkel funkcionálisan rokon komponensek.
A találmány egy még előnyösebb megvalósítási módja szerint a találmány szerinti Streptococeus-vakcinatörzs a Streptococcus-virulencíafaktor túlzott mértékű expresszálására képes mutánst tartalmaz. Ilyenformán, olyan - vakcinába foglalható - vakcinatörzset tárunk fel, amely egy gazda** β 9 «·* ** szervezetben antigénen szempontból lényeges (fentebb felsorolt) virulencia-dstermínánsok elleni specifikus immunreakciöt vált ki, s ezáltal specifikus védettséget nyújt ez említett determinánsokkal szemben. A túlzott mértékű expreszsziö, például, a megfelelő gén erős promoter mögé történő klónozásával érhető el, amely, például, több kópiás rendszerben konstitutivan expresszálódík, akár plazmádban, akár gec omb a integrálődva.
A találmány egy további megvalósítási módja érteimében a találmány szerinti Strepfococcus-vakcinatörzs nem Streptococcus-eredetű protein termelésére képes mutánst tartalmaz. Az ilyen vektor Streptococcus-vakcinatörzs vakcinában alkalmazva - dtreptococcus-ektől eltérő patogének ellen nyújt védettséget.
A találmány szerinti ütreptoeoecus-vakcinatörzs vagy mutáns - perzisztens, de aviruiens sajátságának köszönhetően - igen alkalmas nemcsak Streptocoocus-antigének elleni, de (ha a törzs termel ilyeneket) egyéb antigének elleni specifikus és/vagy hosszú időtartamú immnnreakciők kiváltására is. Különösen az egyéb patogénekből származó antigének expresszálása előnyös, ami kiküszöböli az antigén vagy patogén gazdaszervezetre nézve egyébként káros hatásait.
Az ilyen vektorok egyik példája egy Streptococcusvakoinatörzs vagy mutáns, amely patogénból (pi. Actínobaciiías ρ.Ιοννρρ<ϊοηη?οηίη, Aíycopiasmatae, Bczdateila, Fasíeurella, A, coli, őalmoneiiaz Carnpyia&3cterz Serpulina, stb.) származó antigént expresszál.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy vakcina, amely találmány szerinti Streptococcus-vakcinatörzset vagy mutánst, valamint gyógyászati szempontból elfogadható hordozót vagy adjuvánst tartalmaz. A hordozók és aójuvánsok szakember számára jól ismertek, mint pl. a foszfátpuffereit sóoldat, a fiziológiás sóoldatok, (dupla) ólaj-a-vizben emulziók, aiumínium-hldroxid, Specol, blokk- vagy köpdimerek, stb,
A találmány szerinti vakcina a vakcinatörzset elölt vagy élő alakban tartalmazhatja. Például, egy átreptoooccüs- vagy heterológ eredetű, antigént vagy virulenciafaktort (túlzott mértékben) termelő törzset tartalmazó elölt vakolna nagyon alkalmas immunreakcíó kiváltására., A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint olyan vakcinát tárunk fel, amely élő vakcinatörzset tartalmaz, mely Strepfococcus-vakcínatörzs - perzisztens, de aviruiens sajátságának köszönhetően - igen alkalmas specifikus és hosszú időtartamú immunreakciók kiváltására.
Feltárunk továbbá egy eljárást Streptococcus-eredetű betegség adott populációban történő leküzdésére, mélyítők során a populáció egyebeit találmány szerinti vakcinával vakcinázzuk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a Strepfococcus-eredetü betegség leküzdési eljárása során a találmány szerinti vakcinával teljesen vagy részlegesen vakcináit populációból származó legalább egy páciensből vagy állatból {pl. csecsemőből vagy sertésből) vett mintát (pl. vérmintát, orr- vagy torok-kenetst, ürüléket, vizeieφ * φφ • * X Φ φφ φφΧΦ Φ* »βφ ♦ tét vagy egyéb mintát, .amely, például, vágás során vagy azt követően vehető) baktéríumtokot tartalmazó Streptococcustörzsek vagy -mutánsok jelenlétére teszteljük. Mivel a találmány szerinti vakcinatörzs: vagy mutáns nem patogén, és a baktériumtok-termelés alapján megkülönböztethető a vad típusú. törzsektől, a (teljesen) tokozott Sfcrépfcoooocus-törzsek detektálása a vad típusú törzs okozta fertőzés jelenlétét igazolja. A vad típusú törzsekkel fertőzött egyedek elkülöníthetők a populáció többi tagjától, míg a fertőzés ei nem múlik. Háziállatok ipl. sertések) esetében lehetőség van a fertőzött egyedek kiselejtezésére. A vad típusú baktériumtörzsek detektálása hagyományos tenyésztési eljárásokkal vagy gyors detektálási technikákkal (pi. FCR-alapú detektálással) hajtható végre.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a. St.reptococcus-eredetű betegség leküzdési eljárása során a találmány szerinti vakcinával teljesen vagy részlegesen vakcináit populációból származó legalább egy egyedből vett mintát Streptococcus-törzsek elleni tok-specifikus antitestek jelenlétére teszteljük. A tok-specifikus antitestek a szakirodalomból ismert, klasszikus eljárásokkal (pl. a Lance.fi éld-féle csoport-tipizálásra vagy szerotipizálásra alkalmazott eljárással) detektálhatok.
A. találmány egy még előnyösebb megvalósítási módja értelmében a Streptococcns-eredetű betegség populációban, történő leküzdési eljárása során a populáció tagjait találmány szerinti vakcinával vakcináijuk, és a populáció legalább egy tagjából vett mintát tokozott Streptoccccas-tör** ** >X *» > ♦ * Μ « « » « « * « * «Φ »- Sf * 9 * « 9 < » * * « «,«*# **«t *« «* *4 zsek jelenlétére és/vagy Streptococcus-törzsek elleni tokspecifikus antitestek jelenlétére teszteljük.
A Streptccoccus-eredefcü betegség populációban történő leküzdési eljárásénak egyik példája szerint az eljárást Shreptococcus amis okozta betegség leküzdése céljából végezzük .
Szintén a. találmány tárgyát képezi egy diagnosztikai teszt találmány szerinti eljárásban történő alkalmazásra, amely a tokozott átreptococcus-törzsek detektálására és/vagy a Streptococcos-törzsek elleni tok-specifikus antitestek detektálására legalább egy eszközt tartalmaz.
Ezen. túlmenően, a találmány tárgyához tartozik egy vakcina, amely találmány szerinti vakcinát és megfelelő hordozót vagy adjuvánst tartalmaz. A találmány szerinti baktériamfcofc-antigén immunogénitása hordozóhoz (pl. hordozőproteinhez) történő kapcsolással, fokozható., elősegítve a T-sejtek toborzását, s ezáltal az immunreakció kialakulását .
A találmány tárgyát képezi továbbá egy rekombináns mikroorganizmus, amely a ntreptococcus suús-eredetű baktérlumtok-génkiaszter legalább egy részét tartalmazza. Például, feltárunk egy tejsav-baktériumot, amely a Streptococcus suis-eredetü baktériumtok-génklaszter legalább egy részét tartalmazza, A különféle élelmiszeripari tej sav-baktériumokat (Lactococcus lactis, Lactobaclllus casei, lactobac.illns pia.nla.rítus és otraptoccccus gondii; nyálkahártyán keresztüli immunizálás céljára bejuttatőrendszerként alkalmazzák. Kimutattuk, hogy a rekombináns f. .lactis, L.act.obacll.l us és
Z i « β * X #χ « «
Streptococcus gondii orális nyálkahártyán, keresztüli adagolása expresszált antigén, elleni helyi igA és/vagy IgG antitest-reakciót válthat ki. A fertőző betegségek elleni immunizálás orális módja kívánatos, mivel az orális vakcinák könnyebben adagolhatok, jobban alkalmazhatók, továbbá a nyálkahártyán felületek számos patógán mikrobiáiis anyag bejutási helyét képezik. Szakember számára nem okoz gondot az ilyen (további) géneket tartalmazó mikroorganizmusok létrehozása.
A találmány szerinti megoldás értelmében feltárunk egy rekombináns Streptococcus suis mutánst, amely módosított baktérlamtok-génklaszfcerrei van ellátva. Az azonos fajba tartozó törzsek közötti géncsere technikája .szakember számára jói ismert. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti módosított baktériumtokgénklaszter legalább egy részének bejuttatásí célpontjaként aviruiens S. suis mutánst választunk ki.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy vakcina, amely találmány szerinti mikroorganizmust vagy mutánst tartalmaz. A találmány szerinti vakcinák előnye a jelenleg alkalmazott vakcinákhoz képest, hogy pontosan definiált mikroorganizmusokat és jól fcarakterizált antigéneket tartalmaznak, ami a különböző antigének elleni immunreakciók pontos meghatározását teszi lehetővé,
A találmány szerinti megoldást az alábbi, kísérleti részben mutatjuk be részletesen, azzal, hogy az itt leírtak nem jelentik a találmány oltalmi körének korlátozását.
χ·* *·♦
Anyagok és módszerek
Baktériumtörzsek és tenyésztési félté telek
A kísérletekben felhasznált baktériumtör zsebet és piazmidokat az 1. táblázatban soroljuk fel, A 5. süss törzseket Todd-Kewítt táplevesben (kód: CM189; Orozd- szaporítottuk, és- - β térfogaté lóvért tartalmazó - Columbía-agar véralapra (köd: CM331; Oxoidj szélesítettük. Az E, coli törzseket luría-táplevesben (íd. 28. hivatkozás) szaporítottuk» majd 1,5 térfogaté agart tartalmazó Luria-tápközsgre szélesztettük. Kívánt esetben a lemezekhez antibiotikumokat adtunk, a következő koncentrációkban: sztreptomicin: 100 pg/ml (Si aula) és 50 pg/ml (E, coll); ampioiilin: 50 pg/ml.
S z erotiplzálás
A Si sulis törzseket szerotipus-specifikus antitestek alkalmazásával végzett tárgyiemez-agglutinizáciős teszttel s zsrotίρ iζált u k.
DbS-teehníkák
A rutinszerű DdS-manipuiációkat Sambrook és mtsai. leírása szerint végeztük (id, 36. hivatkozási,
Alkálikus foszfatáz aktivitás
A BhoA-füziök .S, ooi.i-ban történő szkrinelése érdekében plazmidkonyvtárakat konstruáltunk. Ennek során 2. típusú S, suís kromoszómái!» DdS-ét Alul-gyei emésztettük, a. 300-500 bp-os fragmenseket Smal-gyel emésztett pPH0S2~piaz~ mádba ligáituk, és a iígálasí eleggyel PhoA £. coli CCilitorzset transzformáltunk. A. transzformánsokat - 5-brőm-4klőr-3-Í.ndolilfoszfáftal ÍBC1P, 50 pg/ml; Boehrlnger** VV *·♦· , * * * ♦ « X Φ * Λ. V* » » « « «ΦΧ4 Χ«φφ ** 4
ΦΦ
Mannheim, Németország} kiegészített - LB~táptalajra szélesítettük, és a kék telepeket, a kék fenotípus igazolása céljából, friss zB/BCIP-lemezeken tisztítottuk.
DNS—szekvencia-analízis
A DNS-szekvenciákat 37 3A típusú DNS-szekvenálo rendszer (Applied Biosystems, Marrington, Nagy-Britannia) alkalmazásával határoztak meg, A mintákat ABI/FB1SM ”dya térm.inator cycle sequsncíng ready reactioni reagenskészlet (Applied Biosystems; alkalmazásával készítettük. A szekvenálási adatokat ÍSMacMollyTetraí! programmal állítottuk össze és analizáltuk. A Life Technologies-tói rendelésre készített szekvenáló iánclndítokát vásároltunk. A proteineken belüli hidrofób szakaszokat Klein és mtsai. módszerével jósoltuk meg (id, 17. hivatkozás}. A DNS-szekvenciá.kbói megjósolt aminosav-szekvenciákkal rokon proteinszekvenciák keresésére a Netscape Navigator^-on hozzáférhető BLASTprogramot alkalmaztuk,
A 5. suus génspe cí f 1 tus knock-out” mutánsain a k létrehozása
A löcpsB és lűcpsEF mutáns törzs létrehozása céljából a S'< suis 2, szérótipusú 10-es törzsét (Id. 4.5, és 49. hivatkozás) pCPSll···, illetve pCPS28-plazmiddal elektrotranszforrnál tűk. E plazmidokban a cpsB- és cpsSF-gén spektlnomicin-rezisztencia {Spc:’} gén Ínszsrtálásával meg van szakítva. A pCPSil-plazmíd előállításához a pCPS7-piazmidban lévő cpsB-gén 4 00 bp-os Pstl/Bam'HI-fragmensét az Spcx-génnel helyettesítettük. Ebből a célból a pCBS7-piazmÍdot Esti- és BamHl-endonukleázzai emésztettük, majd a piC-spc-pIazmidbél φ X *Φ φ ♦ » *
ΦΦΧ* »**« *Χ származó - Spcx-gént tartalmazó - 1200 bp~os Pstl/BamHIfragmenshez ligálíuk. A pCPS28-plazmíd előállításához, a pXC2OR-plasmidot alkalmaztuk. Ebbe a plazmidba a pCPSlplazmid Kpnl/SalI-fragmensét inszertáltek (pCPS.25~plazmid;ot eredményezve), illetve a p€P'S20-piasmid XbaX/Clal-fragmensét, ami a pCPS27-plazmidot eredményezte.. A p:CPS27-plazmidot Pstl-gyei és Xhol-gyel emésztettük, majd a pIC-spcplazmádból .származó - Spc*~gént 'tartalmazó - 1200 bp-os Pstl/XhoI-fragmenshez lígáltuk. A 5. suis sejtekbe történd elektrotranszformációt korábbi leírás szerint hajtottuk végre (ld. 38, hivatkozás;,
Southem-blot és hibridiráció
Kromoszómáiis DNS-t Sambrook és mtsai. leírása szerint izoláltunk (ld. 36. hivatkozási . A DMS-fragmenseket 0,8 %-os agarózgéleken választottuk el, ss ,fZeta-Probé GT!! membránokra. (Bio-Rád) másoltuk (Id. 36, hivatkozás) . A DNS— próbákat - random láncin.dí hókat tartalmazó jelölő reagenskészlet (Boehringer-Hannheim) alkalmazásával - [ ( •’hp) dCTP-vel (3000 Cí/mmol; Amers-ham) jelöltük. A lenyomatokon lévő DNS-t 65 9C~on - a Zeta-Probe” membrán gyártója által ajánlott - megfelelő DNS-próbákkal hibridizáltattuk, majd a membránokat 1 mN EDTA-t és 5 % SDS-t tartalmazó 40 mM nátrium-foszfát puff erb-en .fpB - 7,2) 65 °'C-on kétszer 30 percig, majd I idd EDTA-t és 1 1 SDS-t tartalmazó 40 mM nátrium-foszfát puf fezben (pH - 7,2) 65 °C-on kétszer 30 percig mostuk.
- 31 P olime rá z ·~ 1 án ereakció
A cps2J amplífikálása céljából végzett poliaerázláncreakcíö során a őt síiis eps2-lokusza 13791-13813. és 14465-14443. pozíciójának megfelelő láncínditő-párt használtuk. E két Iáncindító szekvenciája a. következő: 5ZCAAACGCAAGGAAlTACGGTATC-3' és 5f -GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG3' . A. cpsll axnplif lkai ása céljából végzett poiimerázláncreakció során a Őt suis cpsl-szekvenciái a 4398-4417. és 4839-4821. pozíciójának megfelelő iáncindítő-párt alkalmaztuk (5f-GGCGGTCTAGCAGATGCTCG-3x és 5'-GCGAACTGTTAGCAATGAC3f ) . A cps9K aiaplífikálása céljából végzett polimerásláncreakció során a S. srác eps9~szekve.ucíáj a 4406-4126. és 4494-4475. pozíciójának megfelelő láncinditő-párt alkalmaztuk ! 5 f-GGCEACATATAATGGAAGCCC-3 f és 5*' -CGGAAGTATCTGGGCTACTG-3*).
& 5, snis génspecifikus knock-out* mutánsainak létrehozása
A lOcpsB és lÖcpsSE mutáns törzs létrehozása céljából a ő. suis 2. szerotipusú 10-ss törzsét pCPSll-, illetve pCFS23~plazmlddal elektrotranszformáltuk. E plazmátokban a cpsB- és cpsEF-gén spektinomicín-rezisztencia ;SpcR> gén. inszertálásévaí meg van szakítva. A pCPSli-plazmid előállításához a pCPS7-plazmádban lévő cpsB-gén 400 bp-os Pstl/BamHI-fragmensét az Spc^-génnel helyettesítettük. Ebből a célból a pCFS7-plazrnidot Ps-tl- és BamHl-sndonuklaázzal emésztettük, majd a pIC-spe-p 1 azmídfoől származó - Spcs:gént tartalmazó - 1200 bp-os PstI/BamHl-fragmenshez Ugattuk . A pCBSz8-plazmid előállításához a plC2OR-plazminot al32 *« 44 »« * 4 * * χ * * 4 4t * 4
X 4 X 4 4 44 kuimaztuk. Ebbe a plazmádba a pCPS17-plazmid Kpni/SaiTfragmensét inszertaltuk (pCPS25-p.lazm.idot eredményezve}, illetve a pCPSzO-plazmid Xbal/Clal-f ragmer· sét, ami a pCPS27-plazmidot eredményezte. A pCPS27-plazmídot Pstl-gyel és XhoI-gyel emésztettük, majd a pfC-spe-piazmidbol származó - Spc^-gént tartalmazó - 1200 top-os Pstl/XhoI-fragmenshez ligái tűk... A 5. sala sejtekbe történd elektrotranszformációt korábbi leírás szerint hajtottuk végre íld. 38. hivatkozás) .
Fa go ci t ó z i s -1 e s z t e k
A fagocítózis-teszteket Lelj és mtsai. leírása szerint végeztük (iá. 2.3. hivatkozás) . Röviden összefoglalva: a sejtek opszonifikálása céljából 107 S, suis sejtet (percenként hat fordniatszámmal működtetett head-over-head rotorban) 37 °C-on 30 percig 6 1 SPF~sertésszérummal inkabáliunk. 10' alveolarís makrofágot (AMI és 10' opszouifikált S, suls sejttel elegyítettünk, és a sejt elegyet 3'? 'όση, percenként hat fordulatszámmal működtetett rotorban ínkubáltuk. A 0., 30., 60. és 90. percben 1 ml-es mintákat vettunk, és azokat - a fagocítözis leállítása érdekében - 4 rai jéghideg EMEM-oldattal elegyítettük. A tagodtákat 110 x g-vei 4 °C-on végzett 9 perces centrifugálássál eltávolítottak, és a f.elülűszókban meghatároztuk a teiepképzö egységek (CEO; eolony forming unit”) számát. A kontroll kísérleteket egyidejűleg, 10' darab opszonifikált S. suis sejt EMEM-oídattal végzett elegyítésével (AM nélkül) végez- 33 ·* *
X * >χ «««
Sejtpusztítási tesztek
Alveolarls makrótágokat (iO'/mlj osszon fikáit 5, sufs sejtekkel (107mi) 1:1 arányban, elegyítettünk, és a sejtelegyet percenkénti hatos fordulatszámmal működtetett rotorban 10 percig 37 °C~on ínkubáltuk. A további fagocitözis és sejtpusztitás leállítása érdekében a sejtekhez jéghideg EMSM-oidatot adtunk. Az extracelluláris di suls sejtek eltávolítása céljából a. fagocítákat kétszer mostuk (110 x g, 4 °C, 4 perc), majd 6 % SPF-szérumot tartalmazó 5 ml EdEM-oldatban, űjraszuszpendáltuk. A kémcsöveket 37 °C-on percenként hat fordulatszámmal működtetett rotorban inkuháltuk. A 0., 15. 30., 60. és 90. percben mintákat vettünk, és azokat - a további sejtpusztítás leállítása érdekében jéghideg EMEM-oidattal elegyítettük. A mintákat 4 °C~on 110 x g-vei 4 percig centrifugáltuk, és a fagoeitózisos sejteket 1 % ssáponint tartalmazó EMEM-oldatban, szobahőmérsékleten 20 percig líráitok, majd a szu.szpenz lókban meghatároztuk a telepképző egységek (CFV) számát.
Sertések
A nagy torkshíre-i és a Holland földrajzi rasszba tartozó sertésfajták keresztezéséből származó steril (ivartalan) sertéseket császármetszéssel vettük ki az anyadiszuőkból. A sebészeti beavatkozást steril, flexibilis film izolátorokban végeztük. A malacokat egyenként négy állatból álló csoportokra osztottuk, és rozsdamentes acélból készült steril inkubátorokban tartottuk.
·# ν > * « X *·φ·» 4 * * » * * * * ♦ >♦«« 9* »*
Kísérleti fertőzések
Ά malacokat, intranazálisan 2, típusú 3, suís sejtekkel oltottuk be. A malacok 5. suis fertőzéshez történő előkészítése érdekében öt napos malacokat intranazálisan .Soráét el la b-ronchiseptica 92932-es törzzsel (kb. 1ÖJ CFU) fertőztük. Két nappal később a malacokat intranazálisan 2. típusú 3, suis sejtekkel (10* CFU) fertőztök, A malacokban a betegség klinikai tüneteit (pl. lás, idegesség vagy gyengeség) naponta kétszer ellenőriztük, Mindegyik malacból hetente háromszor vért vettünk, a fehérvérsejteket számát sejtszámlálóval meghatároztuk. A S. suis és B. bronchiseptica okozta fertőzések kimutatása (é.s a szennyeződések hiányának ellenőrzése) céljából naponta orrgarati és ürülék kenetmintákat vettünk. A kereteket közvetlenül 6 á ló-szérumot tartalmazó - Columbía-agarra ssélesztettük. Károm hét elteltével a malacokat leéltük, és megvizsgáltuk a patológiai változásokat. A központi idegrendszerből, serosaböi és ízületekből vett szövetmintákat korábbi leírások szerint bakteroiőgiaí és szövettani vizsgálatnak vetettük alá a (Id. 45. és 49. hivatkozásokat) .. A sorosa koIonizációd át akkor tekintettük pozitívnak, ha a pericardiuiabói, a thoracalis pleuráből és a peritoneumből 3. suis sejteket izoláltunk. Az ízületek kolonizációját akkor Ítéltük pozitívnak, ha egy vagy több ízületből, sikerült 3, suís sejteket izolálni (állatonként összesen 12 ízületet vizsgáltunk) ,
Vakcinálás és immunpróba
Sgy hetes malacokat a lOcpsEE vagy lOcpsb s. sais törzs lö” CFU dózisával intravénásán vakoináltunk. Három, héttel később a malacokat intravénásán a. 2. szex©típusba tartozó l-Ö-és patogén törzzsel í 10'' CEU) ííKmunpróbáztuk.. A betegség monitorozását, a haematoiőgiai, szexológiai és bakterolögia.i vizsgálatokat, valamint a postxnortalis vizsgálatokat a kísérleti fertőzések'” szakaszban leírtak szerint végeztük.
E1 ektromaikroszkópos vi.zsgálat
A baktériumokat Wagen.a.ar és mtsai. (Id. 50, hivatkozási leírása szerint készítettük elő az elektronjai kroszkőpos vizsgálathoz, Röviden összefoglalva: a baktériumokat 37 °C~os MP-agarózzal (Boehringer-Mannheim) 0,7 % koncentrációban elegyítettük, majd az elegyet jégen azonnal 1 ehütöttük. A gélesedést követően a mintákat 1-1,5 mm-es szeletekre vágtuk, és 0,8 % glutáraldehidel és 0,8 % ozmiumtetraoxidot tartalmazó fixálószexben inkubáltuk. Ezután a mintákat mikrohullámú stimuláció mellett uraniiacetáttai fixáltuk és festettük, dehidratáltnk, végül eponaraldíte gyantába ágyaztuk. Az ültravékony metszeteket ölom-citráttál ellentestettük, és Philips CM 10 típusú elektronmikroszkóppal (80 kV feszültséggel) vizsgáltuk.
Sertéseredetű aiveelarls makrofágok (ÁM) izolálasa
A serfcéseredetű AM~sejteket specifikus paiogénmentns (SPF) sertések tüdejéből izoláltuk. Leengoed leírása szerint (Id, 43. hivatkozási tüdőmosö mintákat gyűjtöttünk. A sejteket - 6 térfogati
SPF-sertésssérumot tartalmazó
6
J. 4 4 « « * * » * Φ
Φ Φ Μ ΦΦΦ * X φ Φ Φ φ * Φ «
ENEM-oldatban ίI0f sejt/mi végkoncentrácíóban) szuszpendáitűk.
Eredmények
1. pél d'a
A cps-lokusz azonosítása
A s. snis 2. típus cps-iokuszát az export-proteinek genetikai azonosítására kifejlesztett módszer fid. a 13. és 31. hivatkozásokat) alkalmazásával azonosítottuk. E rendszerben csonkított alkalíkus foszfatáz gént· (amelyből hiányzik a promóter, a transzlációs kezdőhely és a szignálszekvencia) tartalmazó pPHOS.?.-plazaddot alkalmaztunk (Id. 13. hivatkozás). A plazmidban a csonkított gén előtt egyedüli Smal-felismerési hely található.. A 2. típusú S. suis kromoszómális DNS-ét Alul-gyel. emésztettük, majd rendem módon e felismerési helyre klónoztuk. Mivel az alkalíkus foszfatáz (PhoA) enzimatifcus aktivitásához az enzimnek az
E. coli citoplazmrkus membránján keresztüli transzlokáciőjára van szükség, a rendszer olyan S. svis fragmensek szelektálására alkalmazható, amelyek tartalmaznak promóterszekvenciát, transzlációs kezdőhelyet és funkcionális szignáiszekvencíát. Az 560 tésztáit E. coli klón közül - BCIP-t tartalmazó táptalajra történő szélasztés után -16 mutatott sötétkék fenotipust. £ plazmídok közül többnek az ínszértjét DNS-szekvencia-anaiisisnek vetettük alá (eredményeket nem közlünk), és a DNS-szekvenciából leszármaztatott aminosav-szekvenciákat analizáltuk. A kiének egyike (pPHOS'7) által kódolt aminosav-szekvencia hídrofóbitási profilja (eredményeket nem köziünk) azt mutatta, hogy a szekvencia ^-terminális része tipikus· szignálszekvenciára emlékeztet: egy rövid hidrofil, ^-terminális régiót 38 aminosavas hídrofób régió követ. Ez arra utal, hogy a phoA-rendszert sikeresen alkalmaztuk az exportált proteineket kódoló 5. sxxis gének -szelektálására. Szén. túlmenően, a szekvenciákat adatbázisok ssekv-encíáivai mutatott hasonlóságukra is teszteltük. A pPHOS? szekvenciája nagymértékben (37 %-ba.n) hasonló volt a Streptococcus pneamonúse cpsl4C~génje által kódolt proteinével (Id. 13. hivatkozási . Ez arra utal, hogy a pPHOS7 a S. suis 2. típus cps-operonjának egy részét tartalmasa .
2. példa
A szegélyező cps-gének klónozása
A 5, sxxds 2. típus szegélyező cps-génjeínek klónozása céljából szegélyező cps-géneket tartalmazó kromoszömáiis DNS-f ragmensek azonosítására próbaként a p-PHOS7-plazmád inszertáit fragmensét alkalmaztuk. Azonosítottunk egy 6 kb— os HindiII-fragmenst, és ezt pKHN 13-plazmádba klónozva a pCPSú-klőnt (1/C ábra) kaptuk. A pCPSS inszertáit fragmensének (inszertjének) szekvenálásával kimutattuk, hogy a pCFSú legnagyobb valószínűséggel a cps-iokusz S?-végét tartalmazza, azonban továbbra is hiányzik belőle a 3'-vég. ilyenformán, végül a pCkSS 3-végének szekvenciáját alkalmaztuk próbaként a 3'-irányban még távolabb lévő cps-szekvenciákat tartalmazó kromoszömáiis £ragmensek azonosítására, Ezeket a fragmenseket ís pKUNl9-plazmídba klónoztuk, miáltal a pCPSl7~plazmidot kaptuk. Ugyanezen ”kromoszóma<5 séta rendszer alkalmazásával hoztuk létre a 3'-irányban lévő cps-szekvenciákat tartalmazó pCRS18~, pCPS20~, p€ES23~ és pGPS26-pla.zmidókat is.
d. példa
A cps -operon yi z s g á 1 a. t a
A klónozott fragmeneek teljes nukleofeidssekvencíáját meghatároztuk (id. 4. ábra). Az összeállított szekvencia vizsgálatával legalább 13 potenciális nyitott leolvasási, fázis (ORF) jelenlétét mutattuk ki (0rf2Y, QrfSX és Cgs2ACpszK; id. 1/A ábra). Ezenfelül, a. szekvencia 5'-végén egy 14., nem teljes nyitott leolvasási fázis ÍOrfSk) helyezkedett el. Két potenciális promoter-szekvenciát azonosítottunk. Az egyik az OrfSX-től 5*-irányban, 313 bp távolságra helyezkedik el (1865-1865, és 1834-1889. pozíciók!. A másik lehetséges promóter-szekvencia az OrffY-tói 5'-irányban, 68 bp távolságra helyezkedik el (2241-2236. és 2216-2211. pozíciók) . Az Orf2Y ellenkező orientációban expresszálódik. Az Orf.2Y és Orf2X közötti szekvencia potenciális mag-hurok struktúrát tartalmaz, amely transzkripciós terrdnátorként funkcionálhat. Mindegyik nyitott leolvasási fázis előtt ríboszórna™kötőhely található, és a leolvasási fázisok többsége nagyon szorosan kapcsolt. Az egyetlen lényeges génközi rés (383 nukleotid) a Cps2G és a Cps2K között helyezkedik el, azonban e régióban egyértelmű promőter-szekvencia vagy potenciális mag-hurok, struktúra nem található. Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy az 0rf2X és a CpszACps2h operánként varurak rendeződve.
'3 4
ΦΦ X# ..*·* »v *»
X 4» Φ * X Φ X ·* * * « φ φφ* φ * φ ♦ φ X * * * φφφχ χφ'φφ «« ΦΙΦ **
Az azonosított nyitott leolvasási fázisokat és tulajdonságaikat a 2. táblázatban foglaljuk össze. A prediktív géntermékek többsége a poliszachariá-bioszimtézisben szerepet játszó proteinekkel mutat rokonságot. Az Orfzk némi hasonlóságot. mutatott a Bacillus suhfilis YitS-proteinjével. A YitS-t a S. subfilis teljes genomjánafc szekvencia-analízise során azonosítottuk. A protein funkciója ismeretlen.
Az OrfzY a .Sseillus subtilis YcsD-proteinjévei (Id. 53. hivatkozás? mutatott hasonlóságot. Az YcxD és a Rhizobluz! melíioti MocR-proteinje (33. hivatkozás) közötti hasonlóság arra utal, hogy az YcxD szabályozóprotein..
Az Orf£X hasonlóságot mutatott a Haemoph.il us influenzáé és A. coli hipotetikus YAAA-proteinjelvei. E proteinek funkciója ismeretlen.
A cps2A~, cps2B-, cpszC- és eps2D--gén által kódolt géntermékek s Streptococcus pneunsoniae különböző szerotipusain&k CpsA-, CpsC~, CpsD-, illetve CpsB-proteinjével (19. hivatkozás), ami azt sugallja, hogy e proteinek funkciója hasonló. Ilyenformán, a Cps2A a tok-poliszaoharid-szintézis szabályozásában; a CpszB és CpszC a 2. típusú tokpol.iszacharid iánchosszáságának meghatározásában, illetve a CpszC még a poliszacharid exportjában, játszhat szerepet. A S. sui.s Cps2D~proteinje a o. pneumorlae CpsB-proteínjével, továbbá egyéb Gram-pozitív baktériumok gébjei által kódolt - poliszacharid- vagy exopolíszacharid-szintézisben szerepet játszó - proteinekkel mutat rokonságot, melyek funkciója ismeretlen (id. 19. hivatkozás).
«»
XX « Λ X X * « X * * * $ χ- ♦ ♦ Λβ* X
X » » * * . ♦ »^S> * χ-χΧ’» *♦ <β» J0*
A. cpséK-gen által kódolt protein több - gllkozlltranszferé2 aktivitással bíró - bakteriális proteinnel mutatott hasonlóságot; ezek a proteinek a következők: a S, pneömniae 14. és 19.F szerofcípusánafc Cps.l4E~, illetve CpslSfE-proteinje (18., 19. és 29, hivatkozás); a Sireptccaccvs saivaríus CpsE-proteinje (X9498Q) és a Streptoeoccs.s agalactiae CpsD-proteinje (34. hivatkozás), Kolkman és mtsai, (18. hivatkozás) kimutatták, hogy a CpsláF egy glu~ kozíl-l-foszfát transzferár, amely a glükózt lipid hordozóhoz kapcsolja (ami a 5. pneumoníae 14, típus ismétlődő egysége bioszintézisének első lépése). Ezek alapján a s. suís Cps2£~proteinje hasonló funkciót tölthet be,
A cps2F-gén által kódolt protein hasonlóságot muta-
-rí cica rfbü-génje á Ital kódolt
:ozás), mely hasonl< tság legklf
terminális régióját san nyilvám.
:ták, hogy mannozil- {-- V» Ι-Λ .·,· +* ,—V ·>«· -~r » CS.i.i O-.it»-1 k- &·. ¢1.
hivatkozás),
.1 kódolt protein me rsékelt has
vitást kódol (Id. 25
A eps2G~gén ál got mutatott a Campylobacter hyáilei rfbF-génjenek termékével (Iá. 22. hivatkozás); a Só tnermophf .2 us epsF~génjének termékével (40, hivatkozás); illetve a S. aureus capM-génjenek termékével (24. hivatkozás). A hasonlóság alapján okkal feltételezhető, hogy az rfbF-, epsF- és capK-gén gáláktozil--·transzferár aktivitást kódol; ilyenformán, a ops2Gqéntermék hasonló glikozil-transzferáz aktivitást tölthet m ί — »«· ·*'* » * < * * * < » * * « ♦ ♦·* *** ¥ * « « * X * X . * *y*A «φ»ν ** ’δ®· **
A cps2H~gén olyan, proteint kódol, amely hasonló a Haemophilus influenzáé igtD-géntérmékének (U327S8) N-torjai~ nális régiójához. Ezen túlmenően, a Cps2H és Lgtű hidrofóbl.tási görbéje s régiókban nagyon hasonló volt (adatokat nem közlünk!. A szekvencia-hasonlóság alapján az IgtD-géntermék .feltehetően glíkozil-transzferáz aktivitást kódol (U32768).
A cps2I~gén által kódolt termék némi hasonlóságot matatott az Acfcínobacíiias actínoisycetemcomifcans egyik proteinjével. Ez a protein az A. actinomycetemcomitans szeretipus-b-speoifikus antigénjét kódoló génklaszter része. S protein funkciója ismeretlen.
A cpszJ™ és cpszK-gén által kódolt géntermék jelentős mértékű hasonlóságot mutatott a őt pneumoniae Cps14u-proteinjével. A. S, pnemnonlae cpsKJ-génjérői bebizonyosodott, hogy β-l, 4-galatozí1-transzferáz aktivitást kódol, A St pnenmonlae-ban a CpsJ-proteír a 14. szerotípusú S. pneumoniae poiiszaoharid szintézise során a negyedik (vagyis utolsó} cnkorkomponens poliszacharid-lánohoz történő hozzáadásáért felelős <ld. 20. hivatkozás). A Cps2J és Cps2K kozott találtunk némi hasonlóságot dd. 2. ábra; 25,5 %-os hasonlóság), amely a proteinek N-terminális· régiójában volt a legkifejezettebb. Az utóbbi időben a Cpsi4J és Cpslil N-termínálisában két kis konzervált régiót azonosítottak (id, 20. hivatkozás) . Ezekről a, régiókról, azt feltételezték, hogy a katalitikus aktivitás szempontjából fontosak lehetnek. Mindkét régió (D.XS és DXDS; 2. ábra) megtalálható a Cps2J- és üps2h-proteínhsn is.
4, példa
A cps2~gének megoszlása egyéb 5. aais szeretípusokban
A cps2-gének és az egyéb S. suta szerotípusokban megtalálható ops-gének közötti kapcsolat tanulmányozása céljából kereszt-hibridizációs kísérleteket végeztünk. Az egyes cps2~gének DNS-fragmenseít poiimeráz-Iáncreakcióval ampiifíkáltuk, ::p~izotóppal jelöltük, és a. 3S különböző S. sais szerotipus: referencia törzseinek kromoszórná11s DNS-évei végzett Sonthern-blotok próbáiként alkalmaztak. A hibridizációs mintázatokban nagy különbségeket tapasztaltunk (id. 4. táblázat). Pozitív kontrollként iáS-rRKS-re specifikus próbát alkalmaztunk. A 1őS-rRNS-prőba valamennyi tesztelt szerot apussal hi.bridisáiődott, azonban az egyéb tesztelt gének egyike sem volt egyszerre jelen mindegyik szerotipusben, A gének genetikai szerveződése alapján előzetesen felvetettük, hogy az orfX-, valamint a cpsA-cpsK-gének egyetlen operon. részét képezik, és az e gének által kódolt proteinek mindegyike a poiíszacharid-bioszintésisben játszik szerepet. Az orf¥ és orff «eas képezik részét ennek az operonnak, s a poliszacharid-bioszintézisben betöltött szerepük tisztázatlan. A szekvencia-hasonlósági adatok alapján arra a következtetésre juthatunk, hogy az OrfY a cps2-gének vezérlésében játszik szerepet. Az Qrff feltételezhetően nem áll összefüggésben a poiiszaeharid-bioszintézissel. Az orfz-, -orfY-, orfX-, , cpsA-, cpsB-, cpsC- és cpsD-génre specifikus próbák a legtöbb egyéb szerotipussal htbridízálődtak, ami arra utal, hogy az e gének által kódolt proteinek nem típus-specif ikusa-k, de a tok-poliszacharidok bioszintézisében általánosabb funkciót tölthetnek be. Sz. alátámasztja azon korábbi adatokat, melyek szerint a cps2A~ cps2D gének nagymértékben hasonlók a Streptosoccus pneusaoniae több szerotípusának cps-génjelvei. E hasonlóság alapján a CpszA valószínűleg szsbáiyozöprotein, míg a CpszA és Cps2C a poiiszacharidok lánchosszúságának meghatározásában és exportjában játszhat szerepet. A cpszE-gén hibridizálődott az 1., 2., 14. és 1/2 szerotípusű DNS-se.l; ez a gén nagymértékű hasonlóságot mutatott a 5. pnewniae cps!4E-génjéhez (id. 18. hivatkozás). Erről az enzimről bebizonyosodott , hogy giükozil-l-foszfát transzferáz aktivitást fejt ki, és a glükóz iipid hordozóhoz történő szálIrtását katalizálja (13. hivatkozás). Ezek az adatok azt jelzik, hogy a S. süss 1., 2. 14. és 1/2 szerotipusában a poliszacharid-bioszintézis első lépéséért egy - a CpsláS-proteinnel közeli rokon - glikozil-transzferáz lehet felelős. A cps2F-, cps2G~, cps2S~, cps2.T~ és cpskJ-gén csak a 2. és 1/2 szerotipus kromoszomális DNS-ével hibridizáíöőott (ugyanakkor, a ops2G~gén. a 34. szerotipus DNS-ével is mutatott gyenge hibridizációs jelet). Az agglutinizáciös tesztekben az 1/2 szerotipus a 2. .szeretípusra specifikus szérummal, valamint az 1. szerotípusra specifikus szérummal mutatott aggiutinizációt. Ez arra utal, hogy az 1/2 szerotipus az I. és 2. típussal közös antigéndetermi.nánsokat tartalmaz. A hibridizációs tesztek eredményei alátámasztották e feltételezést, A. 2. szerotipus valamennyi feltételezett giikozii-transzferáza jelen van az 1/2 szerofcipusban is. A epslK-gén hibridizációs mintázata hasonló volt
ΔΔ ** Λ* ΦΧ >Χ ΦΦ φ ♦ * * Φ φ > Φ Φ Λ
Λ ♦ # φ *Φ* Φ «
Φ · X Φ * φ ♦
X X Φ * ΦΦΧΑ XX «» φφ a cps2S-génével; hibridizációt detektáltunk az 1,, 2,, 14. és 1/2 szerotípus DNS-ével. S hibridizációs adatok együttesen aet Mutatják, hogy & cps2~génkla.szter báron régióra osztható: egy központi régióra (.amely típus-specifikus- géneket tartalmas), és két szegélyező régióra (melyek különböző szerotípusokra közösen jellemző géneket tartalmaznak).
5. példa
Az 1., és 9, szerotípus típus-spécifikus cps-génjeinek klónozása
A 5. suis 1, szerotipusának típus-specifikus cps-génjeinek klónozására az 1. típus - szegélyező cps-geneket tartalmazó - kromoszómáiis DNS-fragmensezt azonosító próbaként a cpslE-gént alkalmaztuk. Azonosítóttünk egy 5 kb-os EcoRV-fragmenst, amelyet pKWlS-pla.ZMi.dha. klónozva a pCPSl1-plazmidot kaptuk (l/B ábra) . végül ezt a fragmens alkalmaztuk próbaként egy átfedő 2,2 kb-os HíndTII-fragmens azonosítására, Az e Hindii!-fragmenst tartalmazó pKWI9-plazííddot pCPSl-2-nek neveztük el. A 9. szerotipus típus-specifikus ops-génjeinek azonosítása és klónozása érdekében ugyanezt a stratégiát követtük. Azonosítottunk egy 0,8 kbos HindIII/XbaI~fragmenst, amelynek klónozásával a pCPS2-l~ piazmidot (i/C ábra) kaptuk, Ezt a fragmenst végül egy 4 kb-os Xbal-fragmens azonosításának próbájaként alkalmaztuk; az e 4 kb-os Xbal-fragmeust tartalmazó pKUNlÜ-pIszmidot pC?S9-2-nek neveztük el.
- as
ő. példa
A klón.ozott cpsl-gének vizsgálata
A pCFSl-1 és pCPSl-2 kló-nok inszert jelnek teljes nukIsotidszekvenciáját meghatároztuk íld. 5. ábra), A szekvencia tanulmányozásának eredményeként öt komplett és két nem teljes nyitott leolvasási fázis jelenlétét mutattuk ki fl/B ábra), Valamennyi leolvasási fázis előtt riboszöma-kötőhely helyezkedett el. A 2. szerőtípus cpsz-génjelvei kapott adatokhoz hasonlóan a nyitott leolvasási fázisok többsége nagyon szorosan kapcsolt volt; az egyetlen jelentős méretű hézag (718 bp) a CpslG és a CpslH között volt megfigyelhető. b régióban egyértelmű prométer-szekvenciákat vagy poteiwiálís mag-hurok struktúrákat nem. találtunk. Ez arra utal, hogy - hasonlóan a 2. szerotípushoz - az 1. szeretipás cps-génjeí operont alkotnak,
A nyitott leolvasási fázisokat és tulajdonságaikat a 2. táblázatban mutatjuk be. Ahogy a hibridizációs adatok (4, táblázat) alapján várható volt, a cpslE-gén által kódolt protein rokonságot mutat a 5- suis 2. típusának CpszEproteinjével (86 %-os azonosság), A pCPSl-l-plazmídba kiónozott fragmensboi hiányzott a cpslE-gén első hét aminosavának kódolörégiója,
A cpslF- és cpsaG-gén által kódolt protein nagymértékű hasonlóságot mutatott a 14, szerotipusü Streptooooous pnenmoniae Cpsl4F~, illetve Cpsl4G~proteínjével (20. hivatkozás) < A Cpsl4F~protein funkciója nem teljesen tisztázott, de felvetették annak lehetőségét, hogy serkentő szerepet játszhat a glikozil-transzferáz aktivitásban.
A S,
- 4 6 ··· *♦ > < X « φ♦ « < -e.y* χ φ ·> κ * * * * ♦ **·Μ «*»Λ> *♦ *·* «.·>
pneuinoniae cps 14G~génjéről kimutatták, hogy β~1,4-galaktozí 1-transzferáz aktivitást kódol. A Streptococcus pneiMonias 14. típusában ez az aktivitás az olígcszacharidaiegység bioszintézisének második lépéséhez szükséges (Id. 20, hivatkozás). A hasonlósági adatok a S, suis 1. típusának cpslG- és cpslF-géí'íjére hasonló glikozil-transzferáz és serkentő aktivitást sugallnak.
A cpslH-gén által kódolt protein hasonló volt a ótreptococcus preumoniae CpsI4H~proteinjéhes, A szekvenciahasonlóság alapján a CpsliH-proteint poliszaeharid-polimeráznak tekintjük (20. hivatkozás).
A cpsll-gen olyan proteint kódol, amely a Str&ptococcus pneumonáae CpsiáJ-proteinjéhes (19. hivatkozási hasonlót, A cpsi4J-génről kimutatták, hogy β-l,4-gaiaktoziltranszferáz aktivitást kódol, arai a 5, pneemoniae 14. szere típusú poliszacharidjának szintézise során a negyedik (vagyis utolsó; cukorkomponens poliszacharid-lánchos történő hozzáadásáért felelős.
A cpslG- és cpslH-géu között '718 hp-os hézagot találtunk, Ez a régió három kis nyitott leolvasási fázist foglal magában; e három ORF három különböző leolvasási fázisban ezpresszálődik, és nem áll előttük potenciális rihoszómakötőhely, továbbá potenciális kezdőhelyet sem tartalmaznak. Mindazonáltal, az e régió által kódolt három potenciális géntermék némi hasonlóságot mutatott a Streptoooocus íh&zraopiílus SpsK-proteinje e-terminális részének három egymást követő régiójával (27 %-os azonosság; 40. hivatkozás; , Az első 82 aminosavval rokon régió hiányzik.
#> ♦*
7. példa
A_k lőne zott op s -9 - g é nek vizsgálata
Ugyancsak meghatároztuk a pCFSá-l- és pC?Sá--2-plazmád teljes nukleotidszekvenciáját (Id. 6. ábra). A szekvencia tanulmányézásával három komplett és két nea teljes nyitott leolvasási fázis jelenlétét azonosítottuk tl/C ábra;. Hasonlóan az 1, és- 2. szerotipus esetében tapasztaltakhoz, valamennyi nyitott leolvasási fázis előtt ríbőssóma-kötőhelyet találtunk, és a leolvasási fázisok szorosan kapcsoltak voltak. Ahogy a hibridizációs adatok (4. táblázat) alapján várható volt, s Cps2D- és Cps9D-prote.ln nagymértékű hasonlóságot mutat (2. táblázat). A szekvencia-összehasonlítások alapján megái lapítottuk, hogy a pCPSH-l-bői hiányzott a CpsSE-protein első 2? asünosava.
A opsák-gén. által kódolt protein némileg· hasonló volt az 1-es szerotipusú dtaphylocooous aureus CepD-proteínjéhez (24. hivatkozás). A szekvencia-hasonlósági adatok azt sugallták, hogy a CapiD-probeín spimeráz vagy dehidratáz funkciót tölt fce az N-acetíI-fruktózamiu vagy az N-acetilgaiaktőzamin szintézisében (63. hivatkozás).
A CpsűF-protein némi hasonlóságot mutatott a 3. aureiis S. és- 8. szero típusának CspM~p.ro te. in jetivel (id. a 61.» 64, és 65« hivatkozásokat; . A szskvencí«--hasonlósági adatok alapján a CapSM és CapöM feltehetően glikoziitranszferázofc (63. hivatkozás).
A cps9G-gsn által kódolt protein némileg hasonló volt az Actinobaciilus actínopycetemcomitana egyik proteinjéhez (AB002668 4). Ez a protein az áct.;C:O.öaoA: 1 us « o t i n omyce £ eme omi t a n s szereti pu s ~ b - s p ec i f í ku s ant igényeiért felelős génkiaszter része, azonban funkciója ismeretlen.
A cps9N—gén. által kódolt gén bizonyos mértékű hasonló ságot mutatott a Fe.rsin.ia entereidtica rfbB~génje által kódolt proteinhez (SS. hivatkozás). Az RfbB-protein kulcsfontosságúnak bizonyult az O-antigén-szintézísben, az 0:3 lípopoliszacharid szintézisében betöltött szerepe azonban ismeretlen.
ö. példa
1. szerotípusra és 9. szerotípusra specifikus eps-gének
Annak méghatározása céljából, hogy a pCFSl~l, pCPSl2, pC?S9-l és pCPS9-2 klónozott fragmensei tartalmaztak e az 1., illetve 9. szérótapusra specifikus géneket, kereszthibridizációs kísérleteket végeztünk. Az egyes cpsl··· és cpsS-gének DMS-fragmenseit polimeráz-láncreakoicval amplifíkáltuk, íi;P~i zotoppai jelöltük, és a 35 különböző suis szerotípus referencia törzseinek kromoszómális DNS-ével végzett Southern-blotok próbáiként alkalmaztuk. Az eredményeket az S. táblázatban mutatjuk be. A cpszE-prőbával kapott adatok alapján, (id. 4. táblázat) azt vártuk, hogy a opsiE-pröba az 1., 2., 14., 27. és 1/2 szerotípus kromoszömalis DNS-ével hibrídizál. A cpsiH-, opsaE- és cps9F-pröba a legtöbb egyéb szerotípus kromoszőmális DNS-ével hibrid!zárt. Mindezek ellenére, a cpslF-, cpslG- és cpsll-prőba csak az 1. és 14. szerotipussal, a eps9G~ és cpsFH-pröba pedig csak a 9. szerotipussal mutatott hibridéerőt. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a cpsSG- és cps9H~próba spec.if.i~ w ΧΛ» X « * * ·> * * *
Λ*Χ» ** X* ** kus a 9. szerotípusra, s ezáltal hasznos eszköze lehet a 9. típusú S. süss fertőzések gyors és érzékeny kimutatását lehetővé tevő diagnosztikai tesztek kifejlesztésének.
9. példa
Típus-specifikus polimeráz-láncreakció
Eddig a próbákat csak a 35 különböző referencia törzsön teszteltük. A tipas-speoifikus cps-próbák diagnosztikai értékének további tesztelése céljából számos egyéb 1., 2,, 1/2, 9, és 14. szerotipusba tartozó - S. suis törzset alkalmaztunk. Ezenfelül, mivel, a 'PCR-alapú eljárás még gyorsabb és érzékenyebb, mint a hibridizációs teszt, azt is vizsgáltuk, hogy a PCR alkalmazható-® a. 5, suis törzsek szerotipizálására. A láncinditő-oligonukleotid párokat a cps2J~·, cps!I- és cps9H~gén szekvenciái alapján terveztük, és ~ a gének sorrendjében - 675 bp-os, 380 bp-os, illetve 390 bp-os ampiifikait fragmen.sekot vártunk. Az eredmények azt mutatják, hogy a 675 bp-os fragmensek - cps2J-láncinditök alkalmazása esetén - a 2. és 1/2 típusú törzseknél; 380 bp-os fragmensek (cpsü-láncinditok alkalmazása esetén) az 1. és 14. típusú törzseknél; és 390 bp-os fragmensek (cps9R“láncinditök alkalmazása, esetén; a 9. típusú törzseknél ampád fikálődtak.
A baktérium-tok termelésben óaflclens mutánsok létrehozása
A 2. típusú Si suís tokjának patogenezisben betöltött szerepének értékelése céljából két szögén mutánst hoztunk ·♦·*' létre, melyek toktermeiését károsítottuk. A IQcpsB-mutáns létrehozására a pCPSlI-plazmldot alkalmaztak, amelyben a cps2.B-gén egy része spektinomicin-reziszf en.oia-génnei van helyettesítve. A 1OcpsEF-mutáns létrehozására a PCPS28plazmidot alkalmaztak, amelyben a cps2E-gén 3z-vége, valamint a cps2F~gen 5f~váge a spektinomicin-rezisztencia-génnel van helyettesítve. A pCPSll- és pCPS2 8-plazmidda.i a 2. típusú S. süís 10-es törzsét elektrotranszformáltuk, majd spsktinomicln-rezisztens telepeket szelektáltunk. A kétszeres crosslng-over integrációs események szelektálására South.ern-hl.ot és hibridizációs technikát alkalmaztunk (az eredményeket nem közöljük).. Annak tesztelése céljából, hogy a löcpsB- és lOcpsEF-törzs tokstruktűrája károsodott-e, a mutáns törzsek hiperimmun anfcí-S. sris 2. típus szérumban (ld. 44. hivatkozás) készített szuszpenzíójának alkalmazásával végzett tárgyiemez-agglutinízácíös tesztet alkalmaztunk. Az eredmények azt mutatták, hogy a baktériumok - még szerotípus-speolfikus antiszérum hiányában is - aggiatináiödtak. Ez azt jelzi, hogy a mutáns törzsekben a baktériumtok-szerkezet károsodott. Ennek igazolása céljából a vad típusú és a mutáns törzsek vékonymetszeteit elektronmikroszkópos vizsgálattal összehasonlítottuk. Az eredmények alapján megállapítottuk, hogy a vad típus által termeit baktériumtok mennyiségéhez viszonyítva (id. 3/A ábra) a mutáns törzsekben termelődött tok mennyisége (3/B és 3/C ábra) jelentős mértékben csökkent. A. mutáns törzsek felületén szinte egyáltalán néz; detektáltuk tokanyagot.
** «*» ♦*
11. példa
A toktermeiésukben károsított mutánsok sertéseredetű alveo1 a r 1 s makrofágok (PAM) ált al kifejtett fagoc 1 tóz.isra és sejtpusztltásra vonatkozó érzékenységének vizsgálata
A szóban forgó mutánsokat azon képességükre teszteltük, hogy sertés-SEF-szérum jelenlétében mennyire rezisztensek a EAM általi fagocítózisra. Az ΓΟ-es vad típusú törzs ilyen feltételek mellett rezísztensnek tűnt a fagooltózisra fid. 4/A ábra}. Ezzel szemben, a mutáns törzseket a makrofágok hatékonyan fagocitáiták (4/A ábra}. 90 perc elteltével a IöcpsS-törzs mutáns sejtjeinek több, mint 99,7 %-át, míg a 1OcpsEF-törzs mutáns sejtjeinek több, mint 99, 8 9-át kebelezték be a makrofágok. Ezen túlmenően, ahogy a 4/B ábrán is látható, a bekebelezett sejteket a makrofágok el Is pusztították; 90 perc alatt a bekebelezett sejtek 90-98 %-a elpusztult. E tekintetben a vad típusú és mutáns törzsek között nem tapasztaltunk különbséget. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a 2. típusú S. .sala tokja hatékony védelmet biztosit a makrofágok in rdt.ro íagocitőzí sávai s z emben.
il, példa
A tokt érméié síikben.....károsított mutánsok ivartalan (steril/ malacokban kifejtett vlru(lene Iáján akyteszteiése
A vad típusú és mutáns törzsek virulencia-tuiajdonságaít újszülött steril malacok kísérleti fertőzését követően teszteltük (45. és 49. hivatkozás}. Az 1. táblázatban látható, hogy a vad típusú törzzsel fertőzött malacok mindégyikében megfigyelhetők a betegség specifikus és sem speciί»*» φ*·** fikus jelei. Szén túlmenően, a kisérlet ideje alatt az összes, vad típusú törzzsel oltott malac elpusztult (vagy a súlyos betegség vagy idegrendszeri rendellenesség miatt leültük Őket; id. 3. táblázat). Ezzel szemben, a lOcpsS- és lOcpsEF-törzzsel oltott malacokban a betegség specifikus tünetei nem jelentek meg, és a kísérlet végéig valamennyi malac életben maradt. A vad típusú törzzsel beoltott malacok testhőmérséklete az oltás után két nappal megemelkedett, és az 5. napig magas szinten maradt (Id. 3. táblázat) . A mutáns törzsekkel beoltott malacok testhőmérséklete néha meghaladta a 40 °ü~ot, azonban a vad típussal, illetve a mutáns törzsekkel oltott malacok között a lázíndexben (amely egy kísérleti csoportban azon megfigyelések százalékos aránya, amelyeknél a malacok 4 0 °C-nál magasabb lázat matattak) jelentős különbségeket tapasztaltunk. Valamennyi malacban megnövekedett számú polimorf sejtmagvú ieukocitát (PMLí figyeltünk meg .(>10 x lö'5 PML/li.ter; Id. 3. táblázat}, azonban a mutáns törzsekkel oltott malacokban a megnövekedett számú polimorf sejtmagvú Ieukocitát tartalmazd menták százalékos aránya lényegesen kisebb volt. A fertőzés utáni 1. naptól a kísérlet végéig az orrgaratból és az ürülékből, vett kenetmintákból 2, suls törzseket és S< bronc.hu s-ept..íc<a-t tudtunk izolálni (3. táblázat). Az állatok leölése után a vad típusú törzset gyakran tudtuk izolálni a központi idegrendszerből, veséből, szívből, májbői, lépbői, sorosából, Ízületekből és mandulákból. A mutáns törzseket a mandulákból könnyen tudtuk izolálni, a veséből, májból vagy
1épből azonban sosem. Érdekes módon, kevés számú mutáns törzset a központi idegrendszerből, a sárosából, az ízületekből,· a tüdőkből és a szívből is sikerült izolálni, összefoglalva, ezek az adatok azt sugallják, hogy a toktermelés ükben károsított mutáns S, suis törzsek újszülött steril malacokban nem virulensek.
151 példa a ni s t o k -poliszacharlö-bfoszintézísében szerepet játszó ops-1okusz azonosltása és molekuláris karaterizálása
Úgy tűnik, hogy a szóban forgó: gének többsége egyetlen transzkripciós egységhez tartozik, ami e gének koordinált szabályozására utal, A legtöbb géntermékhez funkciót rendeltünk; ilyenformán, olyan régiókat azonosítottunk, amelyek a vezérlésben (CpszA) , a lánchosszúság-meghatározásban (Cps2B, CpszC), az exportban iCps2Cj , és a bíoszintézisben, játszanak s.zerepet (Cps2S, F, G, H, J, K) . A bioszintézisben szerepet játszó régió a génklaszter központi részén helyezkedik el, és ezt két - általánosabb funkciókat betöltő géneket tartalmazó - régió szegélyezi. A nem teljes orf£2-gén a klónozott fragmens Sz-végén helyezkedett el. Az Orr22 némileg hasonló volt a S. subtilis Yl.tS-protemjéhez, azonban - mivel a YitS-protein funkciója ismeretien - ez nem adott semmiféle információt az Orf 23 lehetséges funkciójáról. Mivel az orf'22-gén nem része a cps-operonnak, s gén várhatóan nem játszik szerepet a poliszacharid-biosztíntézisben. Az orf2Y-protein. némi hasonlóságot mutatott a S. subtilis IcxD-proteinjévei (53, hivatkozás). Az YcxD felreS« 44 44 4Χ 44 4 4 X 4> 4 4 4 4 4 X * * 44 *44 4 4 4 « X 4 ♦ 4 * «Χ 44 4«X« 4* <®« X* hetőén szabályozőproteín. Hasonlóan, az Orf2Y~protein eserepet játszhat a poiiszacharid-bioszíntézis szabályozásában, Az 0rf2X a Haemöpái1vs influenzás és S. coli YAAA-proteinjeivel mutatott 'hasonlóságot. E proteinek funkciója ismeretlen. A 2. típusú 5«. suis-ban az orf2X-gén vaiöszinűleg a eps2~operon első génje, ami azt sugallja, hogy az orf2X szerepet játszik a políszacharid-bioszintézísben. Mindazonáltal, üaemophiius intiuenzae-ben és Eí ccdi-ban e proteinek nincsenek összefüggésben a. foaktériamtok-génklaszterrel, Az OrfzX termeíésébexr károsított izogén mutánsok analízise nagyobb betekintést nyújthat az OrfzX 2. típusú S. suis poliszaeharid-bioszintézísében betöltött feltételezett szerepéről ,
A cps2E-, cps2F~, cpskG, cps2B~, cps2J- és cpszK-gének által kódolt géntermékek kevés hasonlóságot mutattak a különféle Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok giikozll-transzfsrácaival (13., 19., 20., 22. és 25. hivatkozási . A cps2B-géntérmék néxai hasonlóságot mutat a S, pneumoniae CpsI3S~proteinjévei (13. és 19. hivatkozási. A CpsüE glükózé 1-1-foszfát transzferáz, amely a glükózt lipid hordozóhoz kapcsolja (ld. 13. hivatkozás!. S. pneamouíae~ban ez az ismétlődő oligoszacharid-egység bioszintézisének első lépése. A 2. szérótipusü S, sala tok glükózból, gaiaktőzhói, ramnözből, N-acetil-giukőzaminbói és sziálsavböi áll (3:1:1:1:1 arányban; ld. 7, hivatkozás!. Ezek alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a Sí suls Cps2E~proteinje glükozil-transzferáz aktivitást fejt ki, és az első cakorkomponens lipid hordozóhoz történő kap•t:
csolásában játszik szerepet.
A cpszF-géntermék C-terminális régiója némi haso-niőságot mutatott a Salmonslla en-terit.íc-a rfbU-génje -által kódolt proteinnel. Az Rfbü-proteinröi kimutatták, hogy mannosíi-trauszferáz aktivitást ködei (ld. 24. hivatkozás). Mivel a mannőz nea komponense a S. .suis 2, szere típus tok-poliszaoharidjának, ebben az organizmusban mannozil-transxferáz aktivitás nem várható. Mindazonáltal, a cps2F más cukor-spéci fi tásű gilkozil-transzferázt kódol.
A cps2G~gén által kódolt protein egy - gaiaktozilfcranszferáz aktivitású - genfcermék-osaláddai mutatott mérsékelt hasonlóságot (id. 22., 24. és 40, hivatkozás), a cpsúG-génterxaék hasonló giikozii-transzferáz aktivitást fejthet ki.,
A cps2b-~gén olyan proteint kódol, amely hasonló a üeemopniius influenzáé LgtD-proteinéhez ÍU32768). Mivel az LgtD-protein feltehetően: giikozil-transzferás aktivitást fejt ki, a Cps2H ís- hasonló aktivitású lehet,
A Cos2J és Cps2K jelentős mértékű hasonlóságot mutatott a S. pneumon.íae Cps 14J-proteinjével (ld. 20. hivatkozás) , ugyanakkor, a Cpslál hasonlít a S. pneamoniae Cpsléiproteinjéhez is. A S. pnevmoniae Cpslél-proteinjéröl bebizc>nyosodott, hogy N~aeeiil~glük6zaminí 1-transzferáz aktivitású, míg a Cpsl4J β-l,4-gaíatozÍl-transzferáz aktivitást fejt ki. s. pneamoniae-ben a Cpsl41 a 14-es típusú ismétlődő egység szintézisében a harmadik oukorkomponens hozzáadásáért, míg a Cps.14J-protein a negyedik (vagyis utolsó) unkorkomponens hozzáadásáért felelős (id, 20. hivatkozás).
Φ* φφ φφ φ > φφ φ Φ φ * Φ * Φ * ·* * « » Φφ XX» X * φ φ φ φ * * *
Φ**Φ «♦*·« ** »<* **
Hívei a őt rozs 2. típusú tokja gaiaktós, illetve N-acetilglükózamin komponenst is tartalmaz, a cps2ü-génterméfc ga~ laktozil-transzferáz aktivitást, a cps2K-géntermék pedig Nacetil-giükózamini l-feranszferáz aktivitást fejthet ki. Ahogy a Cpslil és CpsliJ esetében megfigyelhető, Cps2J és CpsZK M-terminálisa jelentős mértékű szakvencia-hasonlóságot mutatott. A Cpsí4l és CpsléJ 'N- terminál is dómén j én belül két kis régiót azonosítottak, amelyek több más yiifcozil-transzfsrásban is konzerváltak (Id. 22, hivatkozás) . E régiók két assparaginsaváról feltételezték, hogy lényegesek a katalitikus aktivitás szempontjából. Mindkét konzervált régió (DXS és DXDD) megtalálható a CpszJ- és Cps2K-proteinben is.
A. Cpszl-proteín funkciója ismeretlen.· Ez a protein némi hasonlóságot mutatott az Actinobaciilus actinomycetemcomitans- egyik proteinjével. Bár ez a protein az A, ac 11n omycetemeamitans szerotipus~B~spe c1fí kus ant ig énj ét kódoló génklas-zter része, a protein funkciója ismeretlen.
14. példa
A S. suis 1., 2. és 9, szerotlpnsára specifikus eps-gének azonosítása és karakterizálása
Miután a. 2. szerotípusú S. suis teljes ops2-.lokuszát klónoztuk és karakterizáltuk, a szekvenoia-homoiógíák alapján a legtöbb cps2~gén termékéhez funkciót tudtunk rendelni. Ezen adatok alapján a - típus-spécififáshoz szükséges giikozii-transzferáz aktivitások az operon központi részén lokalizálhatok. Ezt az elképzelést alátámasztották - a pró«« 9 Λ ψ X V * » Ο » * * *
X ν *χ *** * * ♦ * ♦ » * * * **♦« ·»**# ** ** baken.t az egyes cps2~gének alkalmazásával - 35 különböző szerotipus kromoszómáiig DNS-ével végzett kereszt-hibridizációs kísérletek. Az 1. és 9. szerotipus típus-specifikus génjeit tartalmazó régiók kiónozhatok és karakter!zárhatók voltak, ami azt mutatja, hogy az egyéb 9. suis szerotípusok cps-operonjaira azonos genetikai szerveződés jellemző, A cpslS-, cpslF-, cpslG-, cpsl'fí- és cpsll-gén feltűnő hasonlóságot mutatott a S. pneumonise cpsléS-, cpsl4F~, cpsüG-, epsl4H~, illetve cpsl4o~génjévei. Érdekes, hogy a S, pneumoniae 14-es szerotípusa fordul elő leggyakrabban a kisgyermekek pneumocoecus-íertőzése esetén (Id. 54. hivatkozás), mig az 1. szerotípusű 5. avas törzsek leggyakrabban 8 hetesnél fiatalabb maiatokból izolálhatok {46, hivatkozás) . 5. pnetmoniae-ben a cpsl4S~, cpsleG-, cpslíi- és cpsí4a—gének a 14, típusú tetramer Ismétlődő egység szintéziséhez szükséges glíkozíi-transzferázokat kódolják, ami azt mutatja, hogy a cpslF, cpslG és cpsll-gén glikoziitranszférátokat kódol. E gének pontos funkciója, valamint az általuk kódolt enzimek szubsztrát-speoifítása megállapítható.. S. pneumoniae-ben. a cps!4J glükozii-I-foszfát transzferázt kódol, amely a glükóz iípid hordozóhoz történő kapcsolását katalizálja. Ezenfelül, a S. pneumoniae 9N, 13., 14,, 1SS, 15C, 18F, ISA és I9F szerotípusaiban opsSszerű gének találhatók (id, 60, hivatkozás). A 9.N, 13., 14, és 15B szerotapusból CpsE-mntánsokat hoztunk létre; e mutánsok egyike sem volt képes giükozil-transzferáz aktivitás kifejtésére (60, hivatkozás). Ezenfelül, e 9, pneumoniae szerotípusok mindegyikében a cpsE-gén iátszőtt felelősnek a
... 58 ~ ♦ * ** «X *Λ.
V i * ♦ ♦ * V * *
«. V Α» *>* * ·♦. * « « * * . V- ν* φ ·.*ίΦ ί·* *# <·* glükóz iipid hordozóhoz történő kapcsolásáért. Ezen adatok alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a Sh suis 1. típusban a cpslE-gén hasonló funkciót tölthet be. A 5. sais 1. típus tokjának szerkezete nem ismeretes, összetétele azonban igen: glükózt, galaktözt, N-acetii-glükózamint, Nacetil-galaktősamint és sziálsavat tartalmaz (1:2,1:1:1:1,1 arányban; Id. 5. hivatkozás}. Ilyenformán, a cpsE-szern glükózé1-transzferáz aktivitás szerepe könnyen megjósolható . A CpsE-szerű szekvenciák a 2, 1/2: és '1.4. szerotipusnál is megtalálhatők.
A 11. típusú S. pneumondae poiíszacharid-bioszíntézisét illetően, az ismétlődő egység második cukorkomponensének az első Iipídkötött cukorhoz történő szállítását a cpsllE· és cpsllG-gén termőkéi végzik (Id, 20. hivatkozás) . Hasonlóan a CpsllE-hez és üpsllG-hez, a a. suis 1. típusának CpsIE- és CpslG-proteinje - azonos reakciót katalizáló glikozil-transzféráéként működhet. A 5', pneamoniae
CpsilF-, illetve CpsIlG-proteinje hasonlóságot mutatott a iph ingemen a s SpsK-protein.jenek ^-terminális, Illetve Ctermnnális felével (20. és 67. hivatkozás). Es mindkét protein esetében kombinált funkció létezését sugallja. Ezen túlmenően, a cpsllF- és cpsléG-szerű szekvenciák a S. pmeumoníse több szerotipusában Is megtalálhatók, és ezek a gének mindig együttesen fordulnak elő (60. hivatkozás) , Ugyanezt tapasztaltuk a S. sala I. típusa esetében is. A cpslF- és cpsle-pröbák az 1. típusú és 14. típusú törzsekkel hibridízálődtak.
A cpsüi-gén és a >5. pneumoruae cpsl4Ή—génje {id. 20, hivatkozás) közötti hasonlóság alapján arra következtethetünk, hogy a cpelK poliszacharid-polímerázt kódol,
A cpsll-gén által kódolt protein némi hasonlóságot mutatott a S. pneumoniae Cpsl4J-proteínjével (19. hivatkozás). A cpsliJ-gén β-1,4-gaIaktozil-transzferáz aktivitást ködői, amely a S, pnenmoniae 14. szerotipusü poliszacharidjának szintézise során a negyedik (vagyis utolsó) eukorkoaponens poiiszacharíd-lánohoz történő hozzáadásáért felelős. A 3, suis 2. típusában a cps2J- és cpszK-gének által kódolt proteinek hasonlóak a Cpsl4J-prot.ein.hez, azonban a Cps2J, CpsSK és CpslI esetében jelentős mértékű homológiát nem tapasztaltunk., A Cpsl4J és Cpsl41 N-terminális régiójában két kis konzervált régiót (DXS és DXDDj azonosítottak (19. hivatkozás) .. Ezekről a régiókról azt feltételezték, hogy a katalitikus aktivitás szempontjából fontosak lehetnek (13, hivatkozás). Mindkét régió megtalálható ugyanezen pozíciókban megtalálható a Cps2I--proteinben is.
A. CpslG és CpslH közötti régióban három rövid nyitott leolvasási fázist azonosítottunk, Mivel ezek három különböző leolvasási fázisban expresszálódnak, és nem tartalmaznak potenciális kezdőhelyeket, expressziöjuk nem várható, azonban az e régió által kódolt három potenciális géntermék hasonló volt a ótreptoooccas tbermophilus EpsK-proteínja Ctermináiís részének három egymást követő régiójával (27 %os azonosság; 40. hivatkozás). Az. első 82 aminosavvai rokon régió hiányzik. Az EpsK-protein feltehetően az ezopoliszacharid exportjában játszik szerepet, oly módon, hogy a polimerizált exopoiiszacharid hídroföbitását iipídec modifikáció révén növeli. Ezek az adatok azt sugalltatják, hogy a Cpslő és CpsiH közötti régió szekvenciái epsK-szerű szekvenciából származnak. Hibridizációs kísérletek eredményei azt mutatták, hogy sz az epsK-szerű régió egyéb 1. szeretípusú törzsekben, illetve 14. szerotípusű törzsekben is jelen van (az eredményeket nem közöljük}.
A 9. szerotipus legtöbb klónozott génjének megállapítható a funkciója. A szekvencia-hasonlósági adatok alapján a cps9E- és a cpsÚF-gén termékei glíkozi-transzrerázok lehetnek (61., 24., 63,, 64. és 65. hivatkozás}. Emellett, a cpsöG- és cpsöR-gén hasonló volt a poliszacharíd-bíosztintéz zsben szerepet játszó régiókban elhelyezkedő génekhez, e gének funkciója azonban ismeretlen (id, 68, hivatkozás) ,
A próbaként az egyes cps2~, epsi- és cps9-gének alkalmazásával végzett kereszt-hibridizációs kísérletek eredxaényei azt mutatták, hogy a ops9G- és cpsHH-proba .specifikusan hibridizálódott a 9. szerotípusba tartozó törzsekkel. Ennek megfelelően, ezek hasznos eszközei lehetnek a 9, típusú 5. suls törzsek azonosításának - akár diagnosztikai, akár epidemiológiai és továbbterjedés! vizsgálatokban. Korábban kifejlesztettünk egy PCR-eljárást, amely alkalmas a Si sö.í.s törzsek sertésekből származó orrüregí és mandulakénetekben történő kimutatására (Id, 62. hivatkozás). Ezt az eljárást, például, ó, aula 2, szerotípusának patogén (EE-pozítiv) törzseinek azonosítására alkalmaztuk. Az utóbbi években a 2. típusú 5.
söis törzsek mellett a 9. szere-
típus törzseit is gyakran izolálják beteg sertések szerveiből , azonban. mostanáig a 9. típusú törzsekre nem állt rendelkezésre gyors és érzékeny diagnosztikai teszt. Ennek megfelelően, a 9. típusra specifikus próbáknak, illetve a 9. típusra specifikus polímeráz-láncreakciónak nagy diagnosztikai értéke van. A cpsiE™, cpslG- és cpsli-próbák az I. és 14. szerotípusú törzsekkel egyaránt hibridizáiődtak, A ko-agglntinizációs tesztekben az 1. típusú, törzsek reakcióba léptek az 1. típus elleni, valamint a 14. típus elleni antíszérummal (id. .5.6. hivatkozás) . Ez a két szerotipus vonatkozásában közös epitopok jelenlétére utal. Más részről, az 1. típusú törzsek kizárólag az 1. típus elleni antíszérummal mutattak agglutinízácíót (56. és 57. hivatkozási , ami azt jelzi, hogy a két szerotipus között detektálna tök különbségek.
A cps2E~, cps2G-, cps2H~, cps21- és cps2J-prébák csak a 2. és 1/2 szerotipussal hibridizáiődtak. A 34. szerotipus gyenge hibridizációs jelet mutatott a cpszG-pröhára. Az aggiutinízácíós tesztek eredményeiből kitűnik, hogy az 1/2 típusú törzsek reagálnak az 1. típus elleni, illetve a 2, típus elleni antiszérummal (46. hivatkozás). Ennek megfelelően, az 1/2 típus az 1. és 2, típussal egyaránt tartalmazott közös antigéneket. Az 1/2' szerotípusú törzsek cpsl- és cps2~specifikus génekkel kapott hibridizációs mintázatai alapján úgy tűnik, hogy az 1/2 szerotípusú törzsek közelebbi rokonságban álinak a 2. típus törzseivel, mint az 1. típuséival. Mostani kísérleteinkben olyan típus-specifikus géneket, láncindítőkat, illetve próbákat azonosítottunk,
X* φφ >> χ» *** ν φ χ φφ *** * *
Φ -X » X * * *
ΦΦΧΦ ΧΦΦ* ** ** ** amelyek az 1., 141 és 2. és 1/2 szerotípusok és a már ismert 35 típus közül más szerotípusok megkülönböztetésére alkalmazhatok. Mindemellett, a jelenleg meg isiaeretien szerotipusokra (amint izolálásukra sor kerül) könnyen kifejleszthetők típus-specifikus gének, láncindítők, illetve próbák.
15. példa
A ups2-l.oku.sz egy további, ré szenek kié no zása és k arak téri zálása
Egy meghatározott szekvencia alapján 11 gént (opszncps2T, orfzü és or£2Vj azonosítót tünk, Az ismétlődő oligoszaeharid-egység polímerízáoiójában szerepet játszó génekkel homológ gént, valamint két ~ sziálsav-szintézísben szerepet játszó - gént (eps2F és cpslT) azonosítottunk. Hibridizációs kísérletekkel kimutattuk, hogy a sziáisav-szintézishen érdekeit gének a 5. süss 1., 2., 14,, 27. és 1/2 szeret apusában vannak jelen. A ”cps2M” és ”cps.2N” régiók hasonlóságot mutattak egyéb Gram-pozitiv baktériumok poliszaoharid-bíoszíntézísben érdekeit proteinjeivel, azonban ezek a régiók csonkitofctnak tűntek, illetve - fázíseitoiódási vagy pontmutáciök következtében - működésképtelenek voltak. A cps2-iokusz 3Z -végén két inszerciös elemet tartalmazott (orflU” és '”orf2V), melyek közül mindkettő működésképtelennek látszott.
A cp»2 maradék lokuszának. klónozása céljából a h irányban még távolabb lévő ops-szekvencíákat tartalmazó kromoszómális fragmens azonosítására a pCPS26 ő'-végí székΟ véneiéit (1/C ábra) alkalmaztuk. Ezt a fragmenst pKUN19plazmidba klónoztuk, miáltal a pCPS2.9-pIazmidot kaptuk. Hasonló rendszer alkalmazásával hoztuk létre a 3''-irányban lévő- cps-szekvencíákat tartalmazó pCPS'3Q— és p€PS3:4-pIazmi~ dókat ís (id. 1/C ábra).
1&, példa
Ά eps2-operon vizsgálata
A klónozott fragmensek teljes nukleotidszekvenciáját meghatároztuk. Az összeállított szekvencia tanulmányozásával a következő szekvenciák jelenlétét mutattuk ki: a Cps2K C-terminális részét kódoló szekvencia; ha látszólag funkcionális gén (cps2O-ops2i) ; továbbá öt különböző ősi gén maradéka (melyeket a következőképpen jelöljük: wcps2h”, !tcps2My cosÖN, orfáU” és 'orf2Vj . Sz utóbbiak csonkítottak, iii. nem teljesek, mégpedig stop-kodonok jelenléte vagy fáziséitolódási mutációk következtében (1/A ábra). S régióban sem potenciális promóter-szekveneiákat, sem potenciális mag-hurok struktúrákat nem találtunk. Valamennyi leolvasási fázis előtt ríbeszórna—kötőhely helyezkedett el, és a nyitott leolvasási fázisok többsége nagyon szorosan kapcsolt volt. Három génközi hézagot találtunk; egyet a ncps2M:,í és a cps2N között (176 nukleotíd) ; a másodikat a cps2O és cps2P között (52:5 nukleotíd) ; a harmadikat pedig a cps2T és !íorf2U,! között (200 nukleotíd.) . Ezek és a fenti adatok azt mutatják, hogy as orfzX és a cps2A-orf2T gének egyazon operon részét képezik.
ΚΦ φφ ** #> ** φ , φ « * Λ » * * * j, ψ ΦΦ ΦΦ* Φ ♦ φ X Φ * * * _ * ««ΦΦ φΑ«« Φ* ·'* **
Az egyes lokuszokat és tulajdonságaikat a 4. táblázatban mutatjuk be. A cps2L~régiö három - egymástól csak siop-kodonokkal elválasztott - potenciális nyitott leolvasási fázist tartalmazott, melyek 103 aminosavas, 79 aminosavas, illetve 152 aminosavas proteint kódolnak. Csak az első nyitott leolvasási fázis előtt helyezkedett ei potenciális riboszóma-kötöhely, és csak ez tartalmazott metionin start-kodont. Ez azt sugallja, hogy a ”cps2Lrí egy ősi cpsSL-génből származtatható, amely 339 aminosavas proteint kódolt. E hipotetikus Cpszh-protein funkciója ezidáig Ismeretien; a CpszL, illetve a proteinkönyvtárakban fellelhető proteinek között jelentős mértékű homo·légiát nem találtunk. Nem világos, hogy a !!cps2L!í-regíő első nyitott leolvasási fázisalOS aminosavas proteinné expresszálödik-e. A ”cps2Mf’régiö homológiát mutatott a Streptococcüs agalactiae és az £, coli (ΆΒ017355, 32) MenA-proteinjsínek 134 aminosavas Nterminális szakaszával. Mindazonáltal, bár a ”cps2M,s~régió tartalmaz potenciális riboszdma-kötőhelyet, a metionin kezdőkodon hiányzott belőle. Ebben a régióban - a 3. agalactiae szekvenciájával Összehasoniitva - az ATG kezdőkodon helyett 11zint kódoló AAG kodont találtunk. Ezenfelül, a 3, agaiactiae NeuA-proteinjenek első SS aminosavávai homológ régiót (77 %-os azonosság) egy 100 bp-t kódoló, ismétlődő DNS-szekvenoía választja el a NenA 59-134. aminosavaival homológ régiótól (Id. később). Ezen túlmenően, a NeuA. 59-95. aminosavalvai homológ régió (32 %-os azonosság; és a NeuA 95-134, ami nos a vai val homológ régió (50: %-os azonosság) eltérő leolvasási fázisban volt. Ennek megfelelően,
- fc, ~ «» »» XX· X* ** « « Φ X X Φ « ♦ * * β « φ» ΦΦ· φ * « β ♦ X * * * χ« « φ «««ν *Φ ♦» ** a részleges és csonkított bemA-homoiőg S. svís-bax; valószínű. lég nem működőképes. A Mcps2N~régió homológ volt a ók acaiactiac (ΆΒ0Ι7355) Cpsü-proteinjévei, azonban a Cpsa első 88 aminosavéval homológ szekvenciák az S. suís esetében .hiányoztak. Ezenfelül, a homológ régiók két különböző leolvasási fázisban helyezkedtek el. A cps20-gén által ködolt protein több - ismétlődő olígoszacharid-egységek transzportjában szerepet játszó - Streptooocous-proteinnel is homológ volt, ami a cpsSÖ-ra is hasonló funkciót sugall. A cps2P-z cps2S- és cps2T~gén által ködolt proteinek homológok voltak a Streptocoocus agalactiao és az £. coli (ABÖ17355) NeuB-, Neu.D~, illetve beoA-proteínjével. Mivel a 'rcps.2M’’-régíő szintén, homológnak bizonyult az ,E. coli NeuAproteinjévei, arra következtethetünk, hogy a S. suis cpszlokuss funkcionális neuA-gént (cps2T), valamint nem funkcionális {cpsaM) gént tartalmaz. E két régió közötti kölcsönös homológra amlnosav-szintet, az 1-58. aminosavakat illetően 77 %-os, mig az 59-134. aminosavakat illetően 49 %-os volt. A CpszQ és Cps2R a ők agalaotiae és A. coli NeuC-proteínjének N-terminál is, illetve C-termináiis részévei mutatott homológ!át. Sz arra utal, hogy 5. sais-ban a S. agaiactiae NeuC-proteinjének funkcióját valószínűleg két eltérő protein tölti be. Ismeretes, hogy £< coli-ban a neugén a sziáisav-szintézisben játszik szerepet. A NeuNAc szintézise NeuNAc.....szintetáz jelenlétében N-acetil-mannözamznhől és foszfoenolpzrnvátböl történik. Ezt követően a NeuNAc-t a CMP-NeuNAc-szintetáz CMP-NeüNAo-vé alakítja, A CMP-beuNAc a políszaeharid-szintézís suubszórátja. u. coli-
bán NeuNAc-szintetázként a Kl~NeuB funkcionál, mig -CHPNeuNAc-szintetázként a NeuA. A MeuC a NerNAc-szintézisben játszik -szerepet, pontos funkciója azonban ismeretlen. A NeuD pontos szerepe szintén ismeretlen. A Cos2.P~Cps2T~proteinek sziálsav-szintézisben játszott szerepe könnyen megjósolható, mivel a 2. szeretipusű 5, suis tokja sziálaavban gazdag, S. agalactíae-ben a sziálsavről kimutatták, hogy a III. típusú tok virulencia-funkciőja szempontból kulcsfontosságú. Ezenfelül, feltételezték, hogy a meningitist okozó baktériumok tokjában a szíálsav jelenléte lényeges lehet e baktériumok vér-agy gáton áthatold képessége szempontjából. Mindezidáig azonban a szi.álsav S. suás virulen.clájában játszott szerepe nem tisztázott.
Az ”Orf2ü?! és ”0rf2V!! homológiát mutatott két különböző inszerciós elemen található szekvencia által ködeit proteinnel, Az !'0rf2í?” a Streptococcss thermophilus Isiiéiproteinjével, míg az ”0rf2V!! a Streptoeoeeus psewonias feltételezett transzpozázával mutatott homologíát, Erről a feltételezett transzpozázröl az utóbbi időben bebizonyosodott, hogy a S, pneanoniise 2. típusú baktériumtok- iokuszával asszociált. A dtreptococcus thsr&ophJdus és a 5. p«ewföniae eredeti inszerciós elemeivel összehasonlítva valószínűleg az <!Grf2U és ”Orf27i! egyike sem működőképes (kődolőrégiójókban bekövetkezett fáziseltolódá.si mutációk miatt) .
Meglepő megfigyelés volt egy olyan 100 bp-os szekvencia jelenléte (9. ábra), amely a cps2-operonon beólnl háromszor ismétlődött. Ez a szekvencia nagymértékben (94 ϊ és .* ♦
% között) konzervált volt, és a cps2G és cps2H közötti, a 'cps2H”~en beiül, valamint a ops20 és a cps2P közötti génközi régiókban figyeltük meg. E 100 fop~os direkt. ismétlődő szekvencia és az adat-könyvtárakban lévő szekvenciák között jelentős mértékű homoiőgiát nem tapasztaltunk, ami arra utal, hogy ez a szekvencia a S. svis-ra egyedülállóan jellemző.
A cps2—szekvenciák megoszlása a 35 s. su.i.s szerotipusbsu
A sziálsavat kódoló gének jelenlétének egyéb S. suis szeretapusokban történő vizsgálata céljából kereszt-hibridizacios kísérleteket folytattunk. Az egyes cps2-gének DNSfragmenseit polrmeráz-láncreakeiőval araplif ikáltuk, ·5ζΡizotoppal jelöltük, és a 35 különböző .St suli szerotípus referencia törzseinek kromoszómáira DNS-ével hibrid!záltattűk, Pozitív kontrollként S. suis InS-rRNS-re specifikus próbát alkalmaztunk, A ISS-rRNS-próba valamennyi tesztelt szerotipussal csaknem azonos intenzitással hiforidizáródott (Id. 4. táblázat) . A í!cps2L~szekvencia az 1., 2., 14. és 1/2 szerotípus DNS-ével, míg a cpszM”-, eps20~·, eps2P~, cps2Q~, cps2R~, cps2S~ és cps2T-gének az 1., 2., 14., 27, és 1/2 szerotípus DNS-ével hibridizáiódott. Mivel a cps£Pcps2? gének legnagyobb valószínűséggel a szrálsav-színtézisben játszanak szerepet, ezek az eredmények azt sugallják, hogy a sziálsav az P. scis 1., 2. 14. 27, és 1/2 szórőtapusában is a baktériumtok részét képezi. Ez összhangban áll azzal a felismeréssel, hogy az 1., 2. és 1/2 szerotípus
-» « sziálsavban gazdag tokot tartalmaz. Bár az 14. és 27. 'sz.erofc.ipus kémiai össze tétele ismeretlen, az utóbbi időben - sziáisavhoz kötődő lekéinek alkalmazásával - végzett agglufínizáciös tesztek eredményei azt mutatják, hogy a 5, sü.ís 14. szer ©típusában jelen van a sziálsav, a 27. szeretípusban azonban nem mutatható ki. S. vizsgálatok a sziálsavat a '15. és 16. s zérót ípusban is kimutatták. Mivel ez utóbbi megfigyelés nincs összhangban saját hibridizációs tesztjeink eredményeivel, előfordulhat, hogy a 15. és 16. szeret ípusban. a sziálsav-szintézísert egyéb ~ a cps2P~ops2T génekkel nem homológ - gének felelősek,
A ”cpszir·-szekvenciákon alapuló próba az 1., 2., 14. és 1/2 szerotipusbói származó DNS-sel hibrid!zálódott. Ugyanakkor., az worf2ü-ra specifikus próba az !., 2.,
14., 24., 27., 32., 34. és 1/2 szérótipnssai, míg az orf2V-re specifikus próba számos különböző; szerotipussal hibridízálódott. Ezen túlmenően, a 100 bp-os direkt ismétlődő szekvenciára specifikus próbát is készítettünk.? ez a próba az 1,, 2., 13., 14., 22,, 24., 27., 29., 32,, 34. és 1/2 szerotipussal hibrid!zálódott (id, 4. táblázat). A direkt ismétlődő szekvencia kopíaszámának 2. szerotipusű S, suis kromoszómában történő vizsgálata céljából Southernblot hibridizációt végeztünk, ilyenformán, a 2. szerotípus kromoszómális DMS-éfc Ncol-gyei emésztettük, majd !;'P~izotoppal jelzett direkt ismétlődő szekvenciával hibridizáltattufc. A kísérlet eredményeként csupán egyetlen hibridizálő fragmenst találtunk, amely tartalmazta a cpsk-lokuszon elhelyezkedő három direkt ismétlődést (az eredményeket nem
J»·» «« V* φ· φ ν * * Φ * * * φ φ φχ # * φ 0 ♦ ·* * * * χ»«« «ΦΧ* ** ** ** mutatjuk be) . S.z azt jelzi, hogy a 100 bp-os direkt ismétlődő szekvencia csak a eps2~lokusszsl asszociált. S. pneuzKoruae'-beB az l.z 3-, 14. és 19F szerotipus baktériumtok-génjeivel egy 115 bp hosszúságú ismétlődő szekvencia bizonyult asszociáltunk. St pneumoniae-foen sz a. 115 bp-os szekvencia a pneumococcus-viruléneiában szerepet játszó egyéb (hialuronidáz és neurand nidéz} gének közelében is megfigyelhető. Fel.vetődött e 115 fop-os szekvencia virnlenokával kapcsolatos gének koordinált vezérlésében betöltött szabályozó szerepe.
18, pél da a baktér jurátok f agocitözissal szembeni rezisztenciában és a vlrulenclában játszőtt szerepe
A baktériumtok fagocitözissal szembeni rezisztenciában és a viruienciában játszott szerepének tanulmányozása céljából két izogén mutánst konstruáltunk, amelyekben a baktériumtok-termelést gátoltuk, A lOcpsB-mutánsban a cps2B-gént antibiotikum-rezisztencia gén leszerelőjavai szakltottuk meg, mig a löcpsSF-mutánsban a cps2F~ és cps2Sgén bizonyos részeit helyettesítettük. Mindként mutáns törzs teljesen tok nélkülinek bizonyult. Mivel a cps2~gének egy operon részének bizonyultak, a poláris hatásokra nem zárhatok ki. Ilyenformán, ezek az eredmények nem adnak felvilágosítást a Cps2B, Cps2S és Cps2F poliszacharid-bíoszintézisben betöltött szerepéről. Mindazonáltal, ezen eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy a 2, típusú 3. suis tok-poliszaoharidja egy anti-fagocitözisos aktivitású felú- 7ö X* * * lati komponens. uh zritro a vad típusú, tokozott bak.t ér rumokat a fagooiták csak nagyon ritkán kebelezik be, min a mutáns, tok nélküli baktér rumokat a sertéseredetű. makrofágok jő hatékonysággal kebelezik be. A makrofágok két óra alatt a mutáns baktériumok több, mint 99, 6 e-át kebelezték be, s a fagoeítáit baktériumok több, mint 92 %-a elpusztult. A vad típusú., illetve a mutáns törzsek intraceliuláris elpusztítása hasonló hatékonysággal következik be. Ez arra utal, hogy a baktériumtok hiánya összefügg a -makrofágok általi felvétellel szembeni ellenállóképesség csökkenésével. Ez az ellenéllöképesség-csökkenés a steril malacokban megfigyelt virulencía jelentős mérséklődésével függ össze. Valamennyi, mutáns törzsekkel beoltott malac túlélte a kísérletet, és ezek egyike sem mutatta a betegség specifikus klinika tüneteit; mindössze néhány, aspecifikus tünetet figyeltünk meg. Sót, a malacokból mutáns baktériumokat sikerült izolálni, ami alátámasztja azt az elképzelést, hogy a S. smis tokja - hasonlóan más pstogén Streptococcus-ok tokjához - fontos virulencía-faktorként funkcionál. A Chariand által létrehozott (toktermelésben károsított) transzpozonmntansok malacokban és egerekben csökkent virulenciát mutattak, E mutánsok előállítására a 2. típusba tartozó S73Sös referenoiatörzset alkalmaztuk, Korábban kimutattuk, hogy ez a törzs fiatal Taalacokban alig virulens. Ezen túlmenően, a transzporon inszerclós helye mindezidáig nem ismeretes.
IS. példa
A Screptocűccus suis 7 , szerotlpusának gyors PCR-teszt je
A sertések Streptocooous srác okozta fertőzésével kapcsolatban az utóbbi években végzett epidemiológiai vizsgálatok eredményei azt jelzik, hogy a 7.. szerotípus - az
1,, 2. és 9, típus mellett - szintén gyakran található oeg a beteg állatokban, azonban a 7. típusra nem állnak rendelkezésre gyors és érzékeny diagnosztikai eljárások, ami hátráltatja a betegség megelőzésére és leküzdésére irányuló programokat, Ebben a példában a S, suís 1. szerotípusának gyors és érzékeny detektálására alkalmas típus-specifikus PCR-teszt kifejlesztését írjuk le. Ez a teszt a 7, szerotípus bakteriamtok-génjeinek {cps-gének) DNS-szekvenciáin alapul, mely szekvenciák a 35 különböző S, suta szerotípus kromoszómáiis BES-einek különféle cps-génekkei történő kereszt-hibridizációjával azonosíthatók.
A utreptococour suís az agyhártyagyulladás (meningitis) , septicaemia, arthritis és fiatal malacok hirtelen halálának fontos okozója (Id. 69. és 70. hivatkozás?, azonban emberekben is okozhat agyhártyagyulladást (71, hivatkozás). A betegség megfékezésére tett kísérletek eredményességét gátolja az epidemiológiájára vonatkozó ismeretek, valamint a hatásos vakcinák és érzékeny diagnosztikai módszerek hiánya .
A S. snís törzsek morfológiai, biokémiai és szerelőgiaí jellemzőik alapján azonosíthatók és osztályozhatók (id. 70.,· 73. és 74. hivatkozás). & szerolőgiai osztályozás specifikus antigén-determinánsok jelenlétén alapul. Az izo5- * ·♦ ♦ * ♦ * » 9 ♦
« * «
Iáit és biokémiaílag karakter izéit SÍ suls sej teket specifikus szérumok sorozatával agglutinizálják. Az ilyen tipizálási eljárások nagyon munka- és időigényesek, és csak izolált telepeken hajthatók végre. Ezenfelül» beszámoltak arról, hogy a különbözei SÍ suis típusok között aspecifikus kereszt-reakciók fordulhatnak aló fid. 75. és 76. hivatkozás) .
Eridéig 35 különböző S. suis szerotípust írtak (7. 78. és 79. hivatkozás) . A beteg, sertésekből leggyakrabban izolált típus a S. suis 2. szerotípusa, melyet gyakoriságban a 9. és X. szerotipus követ, azonban az utóbbi években beteg sertésekből a 7, szerotípusba tartozó törzseket is gyakran izolálják {80., 81. és 82. hivatkozások). Ez azt jelenti, hogy a S. suis 7. szerotípusa okozta fertőzések egyre nagyobb problémát jelentenek. Ezen túlmenően, a ,81 suls 7. szerotípusába tartozó törzsek virulencíáját fiatal malacok kísérleti fertőzéseivel is igazolták (Id. 83. hivatkozás) .
Az utóbbi években a 2. (és 1/2) szerotípusra), az í. (és 14.) szerotípusra, valamint a 9. szerotípusra specifikus, gyors és érzékeny PCR-teszteket fejlesztettek ki (Id,
84. hivatkozás). Ezek a tesztek a SÍ suís 2., 1. és 9, szerotipusárak ops-loknszain alapulnak (Id. 84. és 85. hivatkozás) . Mindazonáltal, egészen mostanáig nera állt rendelkezésre olyan gyors és érzékeny diagnosztikai teszt, amely alkalmas lenne a 1. mais 7. szerotípusáEak kimutatására. A következőkben a 7. szerotipus törzseinek gyors és érzékeny detektálására alkalmas PCR-teszt kifejlesztését # **
XX «* ” ismertetjük. Ez a teszt a S. suis 7. szerotipus cps-lótuszának részét képező DNS-szekvenciákon alapul. A szerolőgrai tipizálási eljárásokkal összehasonlítva a FCE-teszt gyors, megbízható és érzékeny vizsgálati eljárás, ilyenformán, .az í>, 2. és 9. szerotípusra kifejlesztett PCR-tesztekkel kombinálva kétségtelenül hozzájárul a S. suis gyorsabb és megbízhatóbb diagnosztizálásához, és elősegítheti a
S. safs fertőzések leküzdését.
Anyagok és módszerek
Baktériumtörzsek, tenyésztő tápközegek és szerotipizál ás
Az a kísérletben alkalmazott baktériumtörzseket és plazmidokat a 7. táblázatban soroljuk fel. A S. ssis rezerend atőrzseket M. Gottschaik-től (Kanada? kaptuk. A S. suzs törzseket Todd-Hewítt táplevesben (kőd: -CM189; Ozoid? szaporítottuk, és - 6 térfogaté lóvért tartalmazó - Columbia-agar véralapra (kód: CM3.31; Oxoidj szélessiettük. Az z, coli törzseket Luria-táplevesben (id. 86. hivatkozás; szaporítottuk, majd 1,5 térfogati agart tartalmazó Luríatápközegre szélesztettük. Kívánt esetben a lemezekhez antibiotikumokat adtunk. A S. ssis törzseket szerotípus-specifíkus antitestek alkalmazásával végzett tárgylemez-aggiutinizácíós teszttel szerotípízártuk.
DNS-technikák
A rutinszerű DNS-msnipuláciöfcat és a PGE-reakciókat Sambrook és rácsai. leírása szerint végeztük (id. 88. hivatkozás? , A blottolást és a hibridizáltatást illetően lö. a ' * ** ** ** * it 9 4 4 * > ♦ * X .« « ** *#-* V 4
V 4 9 * * * ♦ «♦*» χ»«« ** «* »*
34. és 8ö. hivatkozásokat.
DNS-sze kvéne ía analízis.
A. ENS-szekvenciákat 373A típusú DNS-székvenáló rendszer (Applied Bíosystems, Warrington, Nagy-Britannia)· alkalmazásával határoztuk mag. A mintákat ABI/PRISM dye term.inat.or cycle seguaneing rsady reaction” reagens kész let (Applied. Biosystems) alkalmazásával készítettük. A DN.Sszekvenoiákböl leszármaztatott aminosav-szekvencíákkal homológ- proteinszekvenciák keresésére a BLAST-programot alkalmaztuk. A szekvenálási adatokat MscMcIlyTetra programmal állítottuk össze és analizáltuk. A Life Technologiestói rendelésre készített szakvenálo láncindítókat vásároltunk .
Ρ ο1i merá z-láncreakció
A cps7H pölimeráz-lánereakciós amplifikáciőjara a S. süís epsv--lokuszának 3334-3354. és 3585-3565, pozícióinak megfelelő láncindítő-párt használtuk. E lánc indítók. szekvenciája a kővetkező; 5? -AÖCTCTAACACGAAATAAGGC-IV és 5”GTCAAACACCCTGGATAGCCG-u'. A PCR-reakcíőalegy összetétele: lö idd Tris-HCl (pH - 8,3); 1, 5 mM MgCls; 50 mM RCi; mind a négy dNTP-böl 0,2-0,2 rák; mindkét láncinditóból 1 μΜ ; és 1 egység AmplíTag Gold” DES-polimeráz (Perkín Elmer Applied Bíosystems, New Jersey). .Az. atapllfikácíót Elmer 9600 típusú PCR-készülékben, a következő inkubáiási rendszer szerint végeztük: 95 sC~on 10 perces hőkezelés, majd 30 ciklussal, ciklusonként 95 *C~on egy perces, 56 °C--on 2 perces és 72 °C~on 2 perces inkubálás.
Eredmények és diszkusszió
A 7. szerotlpusra specifikus cps-gének klónozása
A 7. szerotípusű n. süss ops-génjeinek típus-specifikus izolálás® céljából próbaként (a 7. típus homológ DNSszekvenciákat tartalmazó kromoszómáiis DNS-fragmenseinek azonosítására) a 9. szerotipus cps9E-génjét alkalmaztuk (84. hivatkozás). A hibridizációval egy 1,6 kb-os estifragmenst azonosítottunk, és ezt a íragmenst pKöN'l9-plazmidha klónozva a pCF37-.l~plazm.idot (1I/C ábra) kaptuk, végei ezt a íragmenst próbaként alkalmazva egy 2,7 kb-os Scal/Clai-fragmens azonosítottunk, s az ez utóbbi íragmenst tartalmazó pGEM7-plazmídot pCPS7-2-nek (11/C ábra) neveztük
A. klónozott cps7 -gének vi zsgáláta
A. pCPS7-l és p.CPS'7-2 teljes nukleotidszekveneiáját meghatároztuk. A. cpsV-szekvencia tanulmányozásóval két teljes és két nem teljes XíVitott leolvasási fázist (ORF) azonosítottunk (Id. Il/C ábra) , Mindegyik leolvasási fázis előtt riboszőma-kötőhely helyezkedett el. Az 1., 2, és 9.
szerotipus cpsi~, eps2~, illetve opsu-génjévei kapott adatoknak megfelelően, a 7. típus nyitott leolvasási fázisai szorosan egymáshoz vannak kapcsolva; az egyetlen gének közötti hézagot a cps7E és a ops7F között (4475 nukleotid) találtuk. S régióban egyértelmű promőter-szekvenciákat, illetve potenciális mag-hurok struktúrákat nem találtunk, ami arra utal, hogy a 7. szerotipus cps-génjei. ~ hasonlóan az
1., 2. és 9. szerotipus cps-génjeihez - operont alkotnak.
* * •χ XX ΦΦ Φ* « * Φ Φ X Φ
Φ X *♦ *** * * * X φ * » Φ «X +'«♦·» »·*· »* «*
A nyitott leolvasási fázisok és tulajdonságaik áttekintését a 3. táblázatban mutatjuk be. Ahogy a cpsSEpróbával kapott hibridizációs adatok alapján várható aolt (84. hivatkozás), a cpslE-pröba sok különböző S. suis szerotipus kromoszómális DNS-ével hibridizálődott. Mig a cps7F- és ops7G-próba a 4., 5., 7., 1?. és .23. S, suis szerotipus kromoszómális DNS-ével hibridizálődott, a cps7H csak a 7. sze.ro típuséval mutatott hibridizációt, ami azt jelzi, hogy ez a gén specifikus a 7. szeretípusra.
T ip-u s - sp e c i f i ku s po1ímeráz-1áncrea kei6
Megvizsgáltuk, hogy a 7. szerotipusba tartozó S. suis törzsek tipizálására a hibridizációs módszer helyett alkalmazhatunk-e PCR-eljárast. Ebből a célból a cps?H~gén szekvenciáján belül olyan láncindítö-párt választottunk kí, amely várhatóan 251 bp-os amplifikáit fragmenst eredményez. Kísérleteinkbe több - referenciatörzstöl eltérő - 7. szerotlpusü St suis törzset vontunk be. Ezeket a törzseket különböző országokból kaptuk, és különböző szervekből voltak izolálva (71 táblázat).. Az eredmények azt mutatták, hogy valamennyi tesztelt 7, szerotipusú törzs esetében kb. 250 bp~o.s fragmens arnplif ikálődofct (,12,/B ábra), míg az 1.,, 2. és 9. szerotipusba tartozó törzsekkel .FCR-terméket nem kaptunk Q2./A ábra) . Ez azt jelenti, hogy az általunk feltárt PCR-teszt a 7, szerotipusú S. suis törzsek azonosításának gyors diagnosztikai eszköze. Mindezidáig e szerotípu-sra nem állt rendelkezésre ilyen diagnosztikai teszt. Az utóbbi években az 1., 2., 1/2, 14. és 9, sserotípusra kifejlesztett PCR-tesztekkel együtt ez a vizsgálati eljárás hasznos
4-Χ diagnosztikai eszköze lehet
1/2 η /<
szerotípusba tartozó d, amis törzseket hordozd sertések ki mutatásának, és elősegítheti a S. sai. betegségek elleni vé de k e z és t.
·** φφ.
*« *♦ φ Φ κ * > ·* ♦ &
Μ»*
Φ* '* ν»
1. táblázat
Baktériumtörzsek és plazmidok
Γ——- I Törzo/plazmiά Jellemző tulajdonságok Forrás/hivatkozás
* Ö X’ X v3 θ R 28. hivatkozás [a
továbbiakban;
I CC.11 θ j PhoA (26)]
| XL2 biue Stratagene
| 3. c'cii XB2 | blue Stratagene
5 í 5« suis * ......
| t V 2. szerotipusü virulens törzs (49)
3 2, szerotipus (63)
17 2.. szerotipus (6 3)
735 2t szerotipusü referencia törzs (63)
715 2. szerotipus (63)
6 5 5 5 1. s-zerotipusú referenciatörzs í 63 í
6388 1, szerotipus {53)
6290 1. szerotipus (63)
5637 1. szerotipus (63 ?
5673 1/2 szerotipus (63)
5679 1/2 szerotipus (63?
5928 1/2 szerotipus 5 63)
5934 1/2 szerotipus (63)
.1 ♦ táblásat (folytatás)
Tö r 2 s 7 plazmid Jellemző tulajdonságok Forrás/ hivatkozás
5209 1/2 szeretípusú referencíatörzs (53)
52 IS 9, szerotipusú referenciatörzs (65)
5973 9. szerotípus ;s3)
6437 9, szerotípus (63)
620? 3. szerotípus (63)
[referencia- 1—34. szerotípusoá (3, 56, 14}
} törzsek
í 5» sala
10 2. szerotipusú virulens törzs — 1 .2 .1 }
lOcpsS a 10. törzs Izogén cpsB-mutánsa találmányunk
leírása
lOcpsFF a 10. törzs izogén cpsEF-mutánsa találmányunk
leírása
Plazmídok
pKUdlS pUC repIlkaciós funkciói, AmpR (23)
pGSMCZf(k) püC replikációs funkciói, Argó Promega Corp.
plC19P pUC replikációs funkciói, AmpR (23)
p’I.C2öR pUC replikációs funkciói, Ampt: (29)
pIC-spc a pDL232 spcA-génjét tartalmazó laboratóriumi
pIC19R-plazm.íd kollekció
PDL282 pBR322 és pVT736-l replikációs (45}
funkciói, Amp'b Spc*
~ 8 0 ~
1, táblásat (folytatás;
Törzs/ plazmid Jellemző tulajdonságok Forrás/ hivatkozás
pPHO32 a pPHO7 csonkított phoA-génjét tartalmazó PstT/BamHl- fragmens ként tartalmazó p.IC~spc találmány leírása
pPHOT csonkított phoA-gént tartalmaz (15)
pP.HÖS? Kromoszomálís S, suis DNS-t tartalmazó pFHOSz-plazmid találmány leírása
pCFS6 6 kb-os Hindii1-fragmenst tártál- találmány le-
ma z ö pKUN19~pI a zm 1 d írása (I, ábra)
pCPS7 A cps-operőn 3,5 kb-os EocRI/Find111-fragmensét tartalmazó pKöNlS-plazmid találmány leírása. (1. ábra)
pCPTll pCPS7-pIazmíd, amelyben a cpsB- gén 0,4-kb-o s Ps11/BamHl- fragmense a pTC-apc-plazmáci SpcR- génjével van helyettesítve találmány leírása (1. ábra)
pCPSl7 A cps-operon 3,1 kb-os üpnl- fragmensét tartalmazó pKUNIS találmány leírása (1. ábra)
pCPSl8 A cps-operon 1,8 kb-o-s SnaBI- fragmensét tartalmazó pKUNlS találmány leírása (1. ábra)
pCPSzO A cps-operoxx 3, 3 kb-os Xbal/BindlTI-fragmensét tartalmazó pKUNl.9 találmány leírása (1. ábra)
pCPS23 A cps-operon 1,5 kb-os Miül- fragmensét tartalmazó pGEMTZf (t) ; találmány leírása (1, ábra)
1. táblazat(folytatás)
Törzs/ plazmid Γ ................................................ Oeriemzö tarajctönságok Forrás/ hivatkozás
pC.PS25 A pCPS‘17 2,5 kb-os Xpnl/Sail- Íragmensét tartalmazó pI'C-20R találmány leírása (1. ábra)
pCPS26 A cps-operon 3,0 kb-os Hindin- íragmensét tartalmazó pKUHlO találmány leírása (1, ábra)
pCP.S27 A pCPS20 2,3 kb-os Xbal(tompa)/Clal-tragmensét tar- taImazó pCPS25 találmány leírása (1. ábra) ;
pCPS28 A pIC-spc 1,2 kb-os Pstl/Xhol Spcd-génjét tartalmazó pCPS2? találmány leírása (1. ábra)
pCPS29 A cps-operon 2,2 kb-os Sacl/Pstl- tragmensét tartalmazó pKUNl.9 találmány leírása (1.. ábra)
pCPSl-1 Az 1. típusú cps-operon S kb-os EcoRV-fragmensét tartalmazó pKUKl.9 találmány leírása (1. ábra)
pCFSl-2 Az 1. típusú cps-operon 2,2 kb-os HindlII-fragmensét tartalmazó pKbblS találmány leírása (I. ábra)
pCPS9- 1 A 9. szerotipusú cps-operon 1 kb- os Hindiir/Xbal-íragmensét tartalmazó pKW19 találmány leírása (1. ábra)
pCPS9~2: A 9. szerotipusú cps-operon 4,0 kb-os XbaI/XbaI-ίragmensét tartalmazó pKUN19 találmány leírása (1. ábra)
Ampá; ampicíliin-rezisztens; Spc*: spect ínomioln-rszisztens; cps; tok-p-o-liszacharid
VJ /.
2. táblázat ?, 2, sMotípusú S, ssas gps-lokaszábas lévő nyitott leolvasási fázisok ÍORF-ek; tulajdonságai és egyéb baktétiwaok gáatexaékeivel. safcatstt hasoalősággk-
05; úikleotid- ( pozíciók k száaa GCl K gésterák feltételezett ffiskcíója1 Hasonló géntsnáksk {4-os azonosság)
örfZZ 1-719 249 44 isaeretlea 3. stbtíiis KtS (2öj
Qr£2Y 209-522 413 38 Transzkripciós szabályozás δ, sübülis í'ck'D (395)
Grg2X 2202-2334 244 32 IsEsretla 8. ítóráae YM (244)
CpszA 3041-4484 4S1 39 Szabályozás S. paeiSfliae Cpsl9fá ; (5öj
CpszS 4S04-5131 229 49 .Lánchosszűság aeghatározása S. pseasociáe type 3 Orfl (SOI)
CpszC 5203-Sm 225 : 49 lácfesszéság Esghatározása/exporí S, pneiwníae Cps23fD Iö/
CpszD 5313-0S48 243 35 Ismeretien S, psewaíae CpsS (621)
CpszE 667S-80S2 45? 33 -Slikozil-trariszferáz S, WaMiláe CpsliE
(563)
Cps2F 0209-225( 389 32 GÜkozíl-transzíeráz S. jmaoniáé Cps23fT
CpszG 9210-417 305 36 GilkOZn-traRSZreráZ S. üeaqútiss EpsF 125%)
Gps2H 10308-12176 «7 31 Slikazil-traHszíeráz $, sutass BG®/ (2¾)
Cps2I 12213-1340 910 23 CP-polaeráz S. pneaso&úe Cpsiőfl
Cps2J 13593-14579 332 29 Glikczll-transzferáz j, pneissoniae Cpsl45 (311)
Cps2K 14574-15576 339 37 SllkoziHraEszfeáz S, ps»ídae CpslW Rí)
“CpszL 15618-16535 103 3? Ismeretlen
*Cps2M 16811-17322 30 S.agsiaüise Cps?' (7¾) £ coli Seal, * {4711
GpszN” 17559-18342 ... 32 » S.sylactías GpsG í(M)
Cps20 18R1-19862 Í5 4ö Isstlődő egység szállítása í.sgaitóíáé GpsK (210)
Η Zl'
; Cps2P 23322-21331 335 33 Sziálsav-szintézis S.agslaotiae IfeaB (503; l coli SsuS (53tó
Cps2Q ( 2U5S-21865' 17Ö 12 Sziálsav-szintézis S.agslactiae totó (55lj 2. coli beutó ( A
CpskR 21933-22483 isi Sziáisav-szintézis S.pslsdiss S&T (5-5%) l coli Neutó {tótó
Cps23 22501-23125 208 tó Szíálsav-szintézis 2. coli toö (32tó
CpszT 23I3HW 395 tó Qffőgul®c-sz,intetáz S.aűaiáctóae Cpstó (tói; S, coli faá jtótó
Cps2ü!l 245$Η5488 166 tó Transzpozáz $. UeraopMlus IS1194 íóltó
• CpSiV 25691-26281 116 33 Transspozáz S. psssűuias orfl (353;
* -Szekvencia-hasonlóság alapján feltételezett funkció;
s A genraék S-tsnűiiáiísára vonatkozó hasonlóság;
“ A géntegék C-teüGuálisán vonatkozó bascslósás;
* Az Idézőjelbe tett ORF-ek csonkítottak vagy - fáziseltolódás’, vagy pontwitácíók következtében - sákűdsjkápíeisnek.
« »» 4 ♦ * » 4 1
4
4 ♦ k 4 :» í » 4
4 4 4 4 4 X 4 « 4 » « 4
X
3, táblázat
AH, és 9, sserotípiisü S. sais cps-geajeiben lévő nyitott leolvasási fázisok jORF-sk; tulajdon· sági és sgjéb baktériwk gsusnáketM itatott hasonlóságai
ORF Nu.kl.eo~ fci.d”· pozíciók G •l· Cl Mino- sa~ vak 5 2ÍUÍU Megjósolt rso- lekuUtö Kp ÍkD; : Megjósolt pl-erték A gében® k feltételezett funkciója1 Hasonló géiiter- isékek j-os azoffijsság! Rivatkeeá- si/nyilvánta rtési száa
CpslE* 1-1363 3« 454 52.2 10 Glákozíl- tassiísráa Strepücocüss pnewaiae CpsléE íéO; jói ó J r ,·μ·. Λ « ,· ,.ν ,ν, ,, ν, ·Μ ,, > ν,., Λ·Λ ,' ,.,,..,
.;JJ. VíiV U ύ'·\Λ.' L.· ν \λ ν' ^'λ ΐ CpsléE Ud! tiki
Cpslr 1374-1821 331 149 113 8,2 Isffieretle’a Stfeptűcoecüs psewiae CpsiéF íslj élé;
CpsűG ........................................ 1823-2315 251 364 19.5 15 flöksil- Uansrfeás Streptocoecas psswmae CpsléG jőéi (léi
Cpsla 3Ö35-42Ö2 2« 388 1 8,é í __ CP-poliaeréz .................................................. Síreptococcus pnesacruae CpsléH i39j ílé;
η t
Cpsll «97- Giökosil- transzferáz SírspiöCűCüiu pneiwniae Cpsltí <33ξ! 113) 2 íactoccpcss lacíis EpsG ÍUfti ! ?5ϊ :
V-’-b í b·.''; lirepzococíss ttecpfidus Epsí (333) (28) (
= CpslJ Glükszil- tfiPSÁsíáz Sírepíococcas pnewráe (CpsW ( ) (13)
i CpslF 373 27S 32.5 7.2 Glökozi'l- tíasszferáí jíreptecPK© pnesisoniág (CpshJ (444) (13)
CpsSB 1-6« 373 215 24.9 2.1 Ismeretien laep&caccüs s-uis Cps2D i (294) ;26)
Cps3S 633- Gíükozil- tPaasztsáz (Sízspíöcűccas aaress CaplD ((272) (12) ί
CpslSF 363 20Ö 22.3 3.2 Glkkozn- msszíeráz Súspiccüccss aaress Cápái )(528) (131
í *» » * >
ί
CpsSG ------------.... 151 t 31.5 w ;; V . Issterete kÜRűhíCliiilS scircr/ceisaíCűisÁrs (431) Á30ö?ó6d;Jj föfiiropíiiiűs ínfísscáe Lsg ÍÓ35M1!
; W ÍU Issrerstles Yersííua ateftlítíca Profi ;23ij (3.3;
1 Sxekvencia-h&sonléság alapján feltételezett funkció;
2 K protein N-tesinális résre hiúm;:;
• s protein C-tenúMlis része hiányzik;
X * ♦♦ »
X X X t X
X X »» X * X X ♦ X
X X » X » X X X X X
X X ♦ » .» X χΧΧ x»x χ > X X χ:»x
A 2, szsrotípsst gps-aéaek és szsgsbezs szekvenciáik hlcridi'ációia egyéb szeretipusok
Ι,ΛΛλ/.ί, Ía i
S..táblásat > L és 9. smrotípgé cps-géaskbísridlúclójs egyéb S.
sis szsmtípw faoaoszérói1$ DNS-ével
DNS-prbbák
iSzérotípús; ............... cpslS CpSÍf cpslS cssia cpsli 1 cpsip i cps 91 cps95 : cps9D IferBDS
1 7 h t ............ .... · t
Λ ώ T ... ... - ** ... -
3 1 t ... - ... i
1 - 7 - ί » - b
: 5 ... f 7 » « •l·
: s * ... - * ...
í - - - í- ... ! w - ...
8 - ... - * ... - f
9 « - ί 7 r 7
í......................................... 13 - » - * ί - - 7
n - » t 7 - 7
:: 12 ... “ í ... f í 7
13 ... » f 7 ... -
14 * T ί ·“ ... - 1
11 - - ** ... ... ... - ... ( +
; 18 - - .... ! - » 1
9δ
» « X
X «
X
Φ , X « « < m »«» ♦ * « χ »♦»
í. táblázat ha típusú ss tok nélküli tintása S, snis törzsek vraiesciája steril Biacokban
S. suis Malac/ Mcrta- ifcrbi- A csoport klinikai Lá z index' beukoci- S, sás izolálása sala-
törzsek' csoport irtás2 ditás' indexe ta index* eokbci isi csoportosként
Spéciii- fes spe- CHS- sorsa- ízűié-
kus tűse- cífikus bői hói tétből
tek5 tünetek5
ly á löt 100 lí 88 13 2 3 i
ÍOcpsS Λ y s G 10 1 3 i 3 2
löcnsE? Λ <1 0 u δ ö i ö 1 3 2
; A iű-es törzs «ad típusi, a McpsB és IGcpsS' pedig izosen, tok nélküli mutáns törzsek 1 A spontán elpusztult, illetve azcn maiatok száaa, amelyeket ánat-iáléti okokból kellett kölni . ♦ * ' Csak a specifikus tüneteket ®tató salatokat fipyeleshs véve ·*>;
, ♦ X 1 Klinikai index: a leírt kritériumnak megfelelő megfigyelések t-os aránya y 5 Ataxla, legalább eay ízületet érintő reseoes, merevség ff ί 5 Étvágytalanság, depresszió i fi
4<« ; A kísérleti csoportban a ét 'C-nái magasabb testhőmérséklet κοίigyelésénsk Hs aránya ·“*;
‘ A kísérleti csoportban a i7 sejt/liternél nagyobb yranuiocitaszá® véaistak i-ss aránya
7. táblázat
Baktériumtörzseb ás plazmirfok
Tör zs/p latraid. Lenyeges tu.1ajdórságok
Törzsek; ti coli XL2 híre
őt auás referen- cíatorzsek 1-34 < azerotípus
5 667 7, szerotípus, mandula (1993)
'•077 7. sserotípus, szervek (1934)
7044 7. szeretipus, agyak (1994;
7 0 60 7. szeretípus (1994;
7 64 b 7. szeretipus (1994)
7744 7. szerotípus, tüdők (1996)
77 59 7. gzerotipuS; ízületek (1996)
81 S 9 7. szeretípus (1997;
15973 7, szerotikus, agyhártya (1999)
Plazmid: pKUNIS pUC replikációs funkciói, Amps
pGSM7üf(+) pUC replikációs funkciói, ámp-''
pC?S9~l A 9. szeretipus cps-ooeronjának 1 kb-os: Hindi X'I/Xfoal-fragmensét tartalmazó pRUN19
pCPSP-z A 9. szeretipus cps-eperonjárak 4,0 kb-os Xbal/Xbal-fragmensét tartalmazó pXUN19
PCP37-1 A. 7. szeretipus cps-cperonjárnak 1,6 kb-os Psti-fragmensét tartalmazó pXUbI9
pCFS7~2 A 7. szeretipus eps-operonjának 2,7 kb-os 7cai/Ciai-fragmansét tartalmazó pGbM7
«φ»φ
8, táblázat
A 7.. szerotipusü 5. aula cps-génjeióen levő nyitott leolvasási fázisok (ORF-sk) tulajdonságai és egyéb baktériumok g én t e rmékeivel muta tett hasonlóságuk
ORF Nukleotid- pozíció A géntermék feltételezett funkciója. Ha s ο η1ö gén ter mé k (% ~ os azonosság)
Cps7E 1-719, Glíko-zíl- 3. suis CpsOE
transzferáz (99 %)
:Cps?F 1164-1863, Giikozil- Borba tel2a pertusaié
tran.szferáz BplG1 (43 %?; S. suta
CpsGS1 (33 %;
Cps7G 1872-3086, : Aminocukor bio- Borbatelia pertusaia
szintézise SplF (48 %)
Cps7H 3104-3737. Glikozí1- B. coli WbdN (35 %);
transzferéz 3, suis CpszK2 (31%)
: A hasonlóság a géntermék C-terminális részére vonatkozik A hasonlóság a géntermék N-terminális részére vonatkozik.
& λ motípusú egs-próbál hibridizációja egyéb 5. sás szerotípussk aososzósális
szeretl- ek 1 ___ 2 31 ' 4 λ ά·' 7 1 9 Β 12 13 y 15 15 Π 12 19 2Í1 .. 2L 22 21 21 25 25; 23 21 2S; 32 31 í í 5_______________ 33 31 1/2
iNS-préfcák
:cps;S ... 4 4 4 « 4 * 4 * 4 4 4 * ... ... 4. 4 4 4 4- 4 ... .... ... 4 4 ί 4 ri. ... ... »
cps?F - 4 >4 :· ... ... .... * - - 4 - ... - 4 ... ...
eps?G w - 4 :4 Λ» 4 » - 4 .... ... ... » - 4 » .... ... - - ~— ....... « ...
Cps7H * w ... ... ... 4 ... ... ... : tw » » * .... .... ... ... ... -
bS íSÍS 1 4 4 4 4 4 4 1™ ΐ 4 4 4 4. 4 ί 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 t 4 ; 4 4 4
< í ¢4 « > » >
♦ í » » »♦ » « « ♦ « 4 * ♦ » « Φ t í < .» í sú < í
K«í
X * Φ * φ * *♦ * * χΦ
Φ* ♦Χ·*'* ** *» ί κ » φφφ φ * * Φ Λ νΛ **
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Άζ 1. ábrán a. d, suis 2. szerotipusa génklaszterének szerveződését mutatjuk be. Az ábra (A) részén a opsz-géukiaszter genetikai térképe látható. Az árnyékeit nyilak a potenciális nyitott leolvasási fázisokat (ORF-eket) jelölik. A megszakított ORF-ek stop-kodonok vagy fázíseltolödási mutációk jelenlétét jelzik. A gének jelölését az ORF alatt tüntettük fel. A fekete nyilak a potenciális promóter-szekvencíák pozícióját jelzik; egy függőleges csík potenciális transzkripciós szabályozószekvencia pozícióját, míg a háromszoros függőleges csík a 100 bp-os ismétlődő szekvencia pozícióját jelzi.
Az ábra (B) részén a cps2-lokusz fizikai térképe látható. A restrikciós endoxrukleázos felismerési helyeket a következők szerinti rövidítéssel adtuk meg; A - Alul; C Cial; S - EcoRI; H Hindii!; K - KpnI; M ::: Miül; M ~ Nsíl; F - PstI; S - SnaBI; Sa - Sael; X - Xbal.
Az ábra (C) részén a különféle piazmídokba klónozott DNS-fragmenseket mutatjuk be.
A 2. ábrán etidium-bromiddal festett agarözgél fényképét mutatjuk be, amelyen az 1., 2., 1/2, 9, és 14, szerotípusba tartozó S, sais törzsek kromoszómáiis: DNS-ének és cpslI-láncindítók (A panel), cps2J-láneinöitők iB panel), illetve opséR-lánoindítók (C panel; alkalmazásával - az Anyagok és módszerek részben, leírtak szerint - végzett polimeráz-iáncreakciő termékei láthatók. 1-3, sáv: 1, szerotípusú törzsek; 4-6. sáv: 2, szerotipusú törzsek; 7-9. sáv: 1/2 szerotipusú törzsek; 10-12. sáv: 9. szerotipusú
- 9fe * 2 ‘,·’ ί ϊ ** törzsek; és 13-1S. sáv: 14. szerotipusű törzsek.
(B) A. 2 , f 1. vagy 9. típusú S. süss törzseket hordozó malacokból vett mandula-.keretekz valamint epsll-láneinditók (A panel.), cps2 J-láncindltók ;B panel}, illetve cps9H-iándndítók (c panel.) alkalmazásával - az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint - végzett polimeráz-láncreakeió termékeit bemutató, etidium-bromiddai festett agarózgél. Ιο, sáv: 1. típusú ők sais törzseket hordozó malacokból vett mandula-kenetékkel kapott PCR-terme kék; 4-6. sáv: 2. típusú
S. sui.s törzseket hordozó malacokból vett mandula-kenetekkel kapott PCR-terme kék; 7-9. sáv: 9. típusú 3, sa.is törzseket hordozó malacokból vett mandula-kénetekkel kapott PCR-termékek; 10-12. sáv: a 9., 2., Illetve 1. .szerotípus kromoszömális DKS-ével kapott PCR-termókek; 13. sáv: negatív kontroll, DNS nélkül.
A 3. ábrán cpsz-nukleotidszekvenciák és a megfelelő nyitott leolvasási fázisokból származó - aminosav-szekvendák láthatók.
A 4. ábrán cpsi-nukleotídszekveiicíák és a megfelelő nyitott leolvasási fázisokból származó - aminosav-szekvenciák láthatók.
Az 5. ábrán ops9nakleotídszekveneiák és a megfelelő - nyitott leolvasási fázisokból származó: - aminosav-szekvenciák láthatók.
A 6. ábrán cps7~nukleotid.szekvsneiák és a megfelelő nyitott leolvasási fázisokból származó - aminosav-szekvenciák láthatók.
X * * *
X «*
J,' X * <
**'5 •η:
Α 7. ábrán a Cps2J és a Cps2F X-terminál is végének összehasoxglítását (”align®enfc> mutatjuk be. Az azonos aminosavafcat függőleges vonalakkal jelöltük. A félkövér .betűtípussal szedett aminosavak a 5. pnevmoniae üpsléi- és Cpsl4J~proteingében, és főbb egyéb glikozü-transzf éráéban konzerváltak (19. hivatkozás;. A csillaggal jelölt aszparaginsavak konzerváltsága igen jelentős.
A. 8, ábrán a vad típusú (Ai, a mutáns löcpsB (B) és a mutáns iOcpsBF (C> o. su.rs törzsek vékonymetszeteinek transzmissziós elektronmikroszkópos felvételei láthatók. A méretvonal 100 nm-nek felel meg.
A 9./A ábrán vad típusú és mutáns S. suis törzsek sertéseredetü alveoiarls makrofágok (AM) általi tagodtozásának kinetikáját szemléltet juk. A fagocitódst az !f Anyagok és módszerek” részben leírtak szerint határoztuk meg, A •grafikon Y-tengeiyén a felülűszökban lévő telep képző egységek számát (CFU/ml) , az X-tengelyen pedig az eltelt időt ábrázoltuk (percekben). A négyzetek a vad típusú 10. törzs, a körök a mutáns lOcpsB-törzs, és a háromszögek a mutáns IQcpsSF-törzs eredményeit mutatják.
A á/B ábrán vad típusú és mutáns a- suis törzsek sertéseredetű alveoiarls makrofágok (AM) általi intracellulá” ris elpusztításának kinetikáját szemléltetjük. Az intraceiluláris sejtpusztítást az Anyagok és módszerek* részben leírtak szerint határoztuk meg. A grafikon Y-tengeiyén a feiüiúszőkban a makrofágok általi lizist követően jelenlévő tslepképző egységek számát (CFu/ml;, az X-tengelyen pedig az eltelt időt ábrázoltuk (percekben) . A. négyzetek a vad
típusú 10. törzs, a körök a mutáns löcpsB-torzs, és a háromszögek a mutáns lOcpsEF-törzs eredményeit mutatják.
A 10. ábrán a nagymértékben konzervált 100 bp-os: ismétlődő elemek nukleotidszekvenciájának Összehasonlítását c'alignment”) mutatjuk foe. As 1. szekvencia a opszG és cps2H közötti 100 bp-os ismétlődés; a 2, szekvencia a ”cps2'M:,'-eri belüli 100 bp-os ismétlődés; a 3. szekvencia pedig a cps2O és opszF közötti 100 bp-os ismétlődés.
A .11. ábrán a 2., 9. és 7. S. suis cps2~, cps9~, illetve cps7-génklaszfceréfc szemléltetjük.
Az ábra (A) részen a cps2~génklaszter genetikai szerveződése látható (84. hivatkozás). A. hosszú nyilak a potenciális nyitott leolvasási fázisokat (OBF-eket) jelölik. A gének elnevezését a nyitott leolvasási fázisok alatt tüntettük fel. Az azonos színezésű nyilak homológ GKF-eket jelölnek. A kis fekete nyilak potenciális promöter-szekvenciák pozícióját, míg a függőleges vonal potenciális transzkripciós szabályozó-szekvencia. pozícióját jelzik.
Az ábra (Bf részén a cps9~génkiaszter fizikai térképe és genetikai szerveződése láthatói. A restrikciós felismerési helyek rövidítései a következők: B - Barnül; P Pstl; H ~ HindiiI; X ~ X.bal, Feltüntettük a különböző plazmádéiba klónozott NOS-fragmenseket is. Az üres nyilak potenciális nyitott leolvasási fázisokat jelölnek.
Az ábra (C) részén a cpsv-génklaszter fizikai térképe és genetikai szerveződése látható. A, restrikciós felismerési helyek rövidítései a következők: C - Claf; P - Pstl; Se ~ Seal, Feltüntettük a különböző plazmi.dok.fea klónozott
NDS-fragmenseket is. Az üres nyilak potenciális .nyitott leolvasási fázisokat jelölnek.
A .1.2/A ábrán etídium-bx'omíddal festett agarözgél fényképét mutatjuk be, amelyen az '1., 2., S. és 7. szeretipusba tartozó 5. suis törzsek kromoszómális DNS-ének és cps7H-iáncindítő-pár alkalmazásával kapott PCR-termékek láthatók. A. törzsek jelölését a sávok felett adjuk meg. C; negatív kontroll, DNS nélkül; M: molekulatömeg-marker íEcoRI-gysi és HindlII-mal. emésztett λ) .
A 12/B ábrán etídium-bromiddal festett agarözgél fényképét mutatjuk be, amelyen különböző országokban és különböző szervekből gyűjtött 7. szerotipusú törzsekkel kapott PCR-termékek láthatók. A polimeráz-láncreakciöhoz alkalmas bakteriális DNS-t multiszkrínelésí eljárás alkalmazásával állítottuk elő (id. 39. hivatkozás}. A törzsek jelölését a sávok felett adjuk meg. M; molekulatömeg-marker (EcoRI-gyel és KindlII-mal emésztett λ) .
φφ
Hivatkozások iea-v
X- Arends, J. Ρ,( and Η. C. -2anen« 19-88. Meníngitis causec fey Strepfocbccus suis ín huis&ns. Rév. Infec 2, Arrecubiets, C., E. Garcia, and R
Dis, 18:131-137.
Lopez. 1995, Sequenee and tr-anscriptional analysis of a DNA region ínvolvcd in the prod-uction of capsular polysaccharide in Sfereptococnus pneumoniae fcype 3. Sene 157: 1-7
3. Arrecubieta, C.,- R. Lopsz, and E. Garda.. 1994. Molecular chaxrac tér izet ion of cspdA, a gene írom the operon requxred fór the synthe.s.is of the capsule of Sfreptn-c-occus pneura-oniae type 3: sequencing of wtations respossible fór the unencapsulated pheno-type and loc&iization ox the capsular clusfcer on the pneuraococc&l chromosome. J. Bacteriol. 17S:
0375-5383.
4. Clif too-hadley, F.A. 1983. Streptococcus suis type 2 infections, Br. Vet. J. 139:1-5,
5. Chariand, Μ, , 3. Harel, M- Kobisch, S. laoasse, and M. Gottscbalk. 1998. Streptococcus- suis serotype 2 sa-utants defxcient in capsulax expressi-on. Microbíol. 144:325-332..
S, Cross, A. S. 1990. The biolo-gical ei5nifi-can.ce of bacterial encap-sulati-on. Curx, Top. Microfoíol. Immunoi. ISO; 3 7-95.
. y ?ö. iné uype sp»c a χxo J. Bxp, hed. Ί.4 9
1899·
7. Elliott, S> D. and J. Y, Tai , polysacc-haride of Streptoooccus suis.
1784.
8. Peder, I.- M, H. Chengappa, S. Fenwick, h. Rider and J, Staats. 1994. 9a.rt.iai eha-racterizatíoh of Streptccoccas suis type 2 hexaolysin. J. Clin. Microfoio-1. 32:1256-1260.
9. Gott.soh3.Ik, M.., R. hlggins, M. Jaoques, M. Be-audoin, and J. Henrlchse-n. 1391. Characterization of six aew capsular types (23 through 28) of Strepfoeaceus suis. J. Clin. Mícíohiol. 29:2590-259410. Go-tfcschalk, M., 5. Lecouture, and -J. D. Ouforeuil..
Characteriraticn of ocroptocsccus suis type 2 haexBolvsin
1995.
♦ X « _ι. ο.
11. Gottschalk, Ml, A. Lehxun, M. Jacquss, and R. Higgins, 1990, H&eías gglutinati.cn pxopexties of .Streptoccccus ®vi«. J. Clin. Míctofeiol. 28: 2XS6-2158,
12. Gaidolin, A.,, J. Mi Morona, R. Mereng, D. Hanaman, and J, Cl Páron. 1934. Nucleotj.de seguence anaiysis of genes essential fór capsular polysaccharide biosynthesis In Gtreprccocons pneumoniae typs 19F. 1334. Inf-ect, Iwm, 62:
5.3 8 4 »5 3 96.
13. Guitiexrer, C., and Jl C. Devedjian. 1389. 9 lassuld fa ci Irtat Ing in vitro constructicn of PhoA fusicaas in £rCherichis coli. NucL. Beid, Rés. 17: 3999.
14. Higgins, R-, H. Gottschalk, M. Boudreau, A. Lebrnn, and
J. Renricdsen- 1995. Descripflcn of slx new capsular types (2.8 through 34) of Ftrsprococcss aula. J. Vet. Disgn. In vast.
7:405-406
15. Jacobs, A. A,., P. L, m, Loeffen, A. J. G. van den Ssrg, /
and Ρ. K. Stonsf 1994t Identification, pnrification and characterirari.cn of a thiol-actlvatéd heraolysin (sullysin) of 5'trept©c0cc:«,s suis. Infecr, Immun. 62: 1742-1748.
16. Jacques, Μ-, M. Gottscbalk, B. Foiry B.and R. Kiggins, 1990. ultrastructural sfeudy of surf acc oomponents of Streptccoccus suís. J. Sacfceriol. 172:2833—2838.
17. Klein Ρ., M, Kanehisa and C. DeLisi. 1385. The -detection and classification of membráné spanning proteiné. Biochim, Biophys. Acta, 851: 4 68-476.
IS, Koikman, Mi A. B., D. A. Morríson, B. A.. M, van dér Zeljst, and P. J. M. Nuijten. 1386. The capan.1® polysaccharide synthesis Xocus of BCreptoooccns pnennoniae serotype 14; idénrification of the glycosyl transferaee gene epri tó. J. Bacteriol. 178: 3736-3541,
19. Kol tanán, Μ. A. B.W. A, M. van dér Ssijst. 1337. in Streptococcns pnewaoniae
Wakerchnk, P. J, M. Nuijters., and R. Capeul&r pólyaacchaxide synthesis serotype 14: molecular analysís of tbe compiate qps locus and Identification of genes encoding glycosyitr&nsíerases xequired fór tbe híosynthesis of the ΐυ;
tetrasacoharrde sufounít. Mól. Microbiol, 26; 197-208»
20·. Kolkman, Μ. A, Β., B. A. M- van dér 2-eíjst and 2. J, m. Nuijfen, 1997. Functional anaiysis of glycosyitransferases encoded &y the capsular polysaccharí>áe biosynthesis locus of Streptoooccos psemonise serotype 14. J. Bioi. Chem. 272: 1950219508.
21. Konings» R, Ν. Η., E. J. M, Vsrhc-even,. and S. F H. Peetecs. 1987. pSöN «ectocs fór the sepaxate productien of bot.h DMA str&nds c£ recosíbinsnt plasmids. Methods Entyrool.
153: 12-34»
22. Rorolik, V«, 8. N. Fry, M, R. Alderton, S. A, H. van dér Seijst, and F. J. Colos. 1987, Express ion o£ Csmpyíóbester hyerlai. Irpo-olignsaccharrde (LOS) antígens ín .Sscftsríohia coli . Microbiol. 14 3; 3481-3483.
23. Lelj, R- C. 2», R. van Fnrth, and T. L, van Zwst. 1986. In vitro deferminstion o£ phagooytosis and intraooilular killing of polyssoxphonuclear and TOioauclear phagocytes. In Handbook of ExperlsventsX Immunology, vol. 2. Cellolar Xnmmology, ρρ. 18,1-46.21, Edited by 0. H. Weir, L. A. Kerrenberg, C. Bl&ckwell and I». A. Herzenberg. SlackweXX Scientific Publications, Oxford.
24. Li.n, «. $» f T. Canneea, and C, Y. Lee; 1994, Sequence analysis and rool.ecnl.ar characterization of gen.es reguired fór the feíosynthesis of type 1 eap-sular poiysacchaxide in Staphyloccccas ásreus. J. Bacteriol. 176: 7005-78X5.
25. Liu, D.„ A. b. Haase, L, Líndqvist, A,A. Lindberg, and P R. Reeves. 1993, Giycosyl transferases of Ó-antigén biosynthesis in Salwneila soterítioa; Identification and eharacterization of tranafsrase genes of group 8, ¢2., and El. J, baeteriol, 175: 3408-3413.
26. Manor.I.» Ci,» and J. Baekwith, 1985. A ir&nspooon próba fo:
protein export signals. Brec. heti
Sói. USA 32: 81288133.
27. Marsh, J. L., dl Erii©, and £,. J. 5üykes. 1.984. The pl plasmid and phage vectors with versatile cloning sites fór r ©combi n.snc seiectrcn by insertional inactivat ion . Gén©
103
ΦΦ Λ Φ
32:481-485.
2S. Miller., J. 1972. Experiménts in Moleeular Génét les. Cold Spríng Ksrbor, NY: Cold Spring Borbor Laboratory.
29. Morona, J. K., R. Korona, and J. C. Paton. 19-.97.
Charscterisation of the locus encodíng the .Streptococcus pneus?oníae type 19F oapsuisr polysaccheride bíosynthssis patbway. Hol. Mícrobíol. 23: 761-763.
30. Mufío.a, R., M, Mollerach, R. Lóper and E. Garda. 1997. Moleeular organiration of the gen-e s raqdrad fór the synthesis of type 1 eepsular poiys&eebatide of Strepfeoco-ccus pneamoníae; fo.mat.ion of b.inary enc&psulated pneu»ococci and
Identification of cryptic dTDE-rhamnose bíosynthesís .genes.
Mól. Mícrobíol. 25: 79-92.
31. Pearce S. J., Y. δ. Yín, and 8, R. Hasúra. 1993- Geneti? Identification of export ed protdns in Streptococces pneuatoniae. Hol. Mierobiol. 9: 1837-1050.
32- Róberts, I. S. 1996. The bíoohemístry and ge&stics of capsula-r polysaccharida produotion in battéria. Anxi. Rév. Microbiol. 50: 295-315.
33. Rossbach, S., D. A. Kulpa, 0. Rossbach, and F. d. de Sruin. 1994. Moleeular and génétic charscterirstíon of the rhitopine cataboiis» (mocABRC) genes of Ehiroblua aeliloti L5
38. Mól. Gén. Génét, 243: 11-24.
34. Rubens, C. £,, L. M, Beggen, R. F, Kait, and R. M, Wessds. 1993. Identification of epsö, a gene essentiai fór type IXX capsulo expre-ssion in group S sireptococci. Mól. Mícrobiol. 8: 843—855.
35. Rubens·., C. £., L. M. R. 'Wessels, L. M. Eeggen, and D, L. Kasper. 1987. Transposon mutagenesis of type XX1 group 8 Streptocoocus: correlatlon of capsuie expression wifc-h virulensre. ?roc. Kati, Acad, Sci, USA 84:7208-7212.
35, Sambrook, L, E. F. Fritsch, and T. Manistis. 1999, Moleeular cloning. A laboratory manual. Second edítion. Cold Spríng darbor Laboratory Press, Cold Spríng Harbor. Mev York.
37. Smith, Η, E., ö. Vncht, B. J. Misselink, B. Stoekhofe, Y- BXíS Γ5η3ΠΠ , M. A T 1 űt&íC· CvP b.
«ο * *
Lieshout, and Η.» E. Smith. pathogenicity of different
Streptococcus- suis types X and 2 ímpaired in expxess-íon of Riuramidase-reiesaed protein and extracellulax protein induce dísease ín newborn germfree pig-s. inf-ect Iwsa. 64: 4409-4412.
3-8, Ssaith, H. E.f H. J. «Fissslink, U, Vecht, A. L. J. -Gíeikens and K. A. Smits. 1385. Hlgh-efficiency tr.ansfo-mation and -gene ináétivatíon in stxeptococcus suis type 2. MicxobícX. 141; 181-188.
39. Sceenivasaa, Ρ. K., D. L. LeBianc, 1, M. Lee, and P. Fives-Taylox. 1991. Transf ormát ion of Actinodacillas acfcíno&yceteaoo&itan'S by electröporafcion, utilixin-g constructed shuttle plasmids. Tnfect. Immun. 59: 4621-4827.
40. Stringele F., J.-R, tesar, and B. Mellet. 1996.
Identification and ch-aracterixatio-n of the eps (exopoiyeaccharíde) gene clustex fross StxeptococcusthezMcphilns SfíS. J. Bacteriol. 178: 1680-1690.
41. Stockhof-e-ZarwiedenN, , ü. Veeht;, K. J. Wissslink, H.vac
1996. Comparatíve studíes on the Ftreptococcos rolr serotype 1 strains. In Froceedings of the 14th IPVS Congress. pp. 299.
42. van Kr&nenburg, R., d. D. Maxvgg, I. X< van Swaa, h. J. Willexn and 54. M. de Vos. 1997, Molecular cbatacteriratio-n. of the plasmid-eneoded éps gene oluster ess-ential tor exopolysaceharide b-iosynthesis in iactococcus l.actís Hol. -Micxobioi- 2 4; 387-3 97,
43. van Leengoed, 1. A,., S. M. Kamp, and J. Μ. Α» Pol. 1989. Toxicifcy of Aaamgphidnr pieurojMjeuaoniáe to perelne iung macroph.a.ges. Vet, Microhiol. 13: 337-349.
44. van Le-eng-oe-d, L. A. M G., ü. Vecht, and E. R. H. Vexheyen-. 1987, Stxeptococcus suis type 2 infections in pi-gs in The Ne-therlantís (part two) . Vet Quart, 9, 111-117.
45. Vecht, V-, -J. P. Axands, E. J. van dér Mólén, and 1. A.
M. G. van Leengoed. 1983. Oifferences- in víruience between fcwo strains of Strepr-ococcus suis typa 2 after experimentaily i n du c© d- ί n f ©-ct i -on o f 50:1037-1043.
; V e v h t 0 , l, ί sewoorn gerratree pigs
Am.
van Leengoed,
Verheyen. 1385« Streptococcus suis infections in pígs in The Netheriands (part one) . Vet. Quart. 7:315-321 47, Vacht, ü.# B. J. Wisselink, H« L. ·Jelleme, and Η. E. Smith. 1931. Identification of two protein® associafced with virulence of Streptoooccus stos type 2. Infect, Immun. 59:3156-3162.
48. Veeht, ül, H. J. Wisselink, N. Stoefchofe~Zuxwiedesn, and H, I. Sraith. 1998« Characterization of vixulence of the Straptococcus suis· serotype 2 referense strain Henrichsen S
35 in newborn gnotofeiotic pigs. Vet, Microbiol, 51:125-136.
49. Vecbfc, 0., H. J. Wisselink, J« E. van Dijk, and H« S. Smith. 1932. Virulence of Streptocoocus suis type 2 strains i newborn goxmfree pigs depends on phenotype. Infect, Immun. 60:550-556,
50. Wagen&ar, F-? 6. L. Kok, J, H, Sroekhuijsen-Pavies-r and <7, M, A, Folt 1993. Rapid cold fixation of tissue saxspies by microvave irradiation fór use in electxon microscopy.
K is t o chemi ca 1 0i 25: 719-725.
51. Keaaelo, M. R.and M. S. Bronza„ 1994 , Criticai xole of the group A streptococcsl capsule in pharyngeal coloniration and ínfection in mice. Proc. Háti. Acad, Sci. USA 91; 1223812242.
52, Wessels, ;
DiCasare. 1991.
R.
A. 3. Mosás, J. B, troníc acid capsule
Goldberg, and T. J. is a virulence faotor fór mucoid group A streptooocci. Proc. Háti. Acad. Sci. USA. 88; 8317-8321.
53. Yamane, Rt, M« Kumamano, and R.Kurita, 1996. The 25°-36V region of the Aacillna srhtilia chromosoíse: determination of the seguonce of a 146 kb segwnt and Identification of 113 genes. Microbiol. 142: 3047-3056,
54. Sutler,. J. €„, R. F. Breiman, H. 3. Lípman, J, Hoftiann, and R, B. Facklam. 1335. Serotyps distribution of Streprococcur pneumonfae infections assong preschool children in the United States, 1973-1394: implie&fcions fro development of a conjugate v««cine. J. Xnfect. Ois. 171; 8.85-883,
53, eh^rland, H., m. Jacques, S., Laccutte and M. GöttsehsTk «ί
1997, Characterisation and protective actlvity of a monod onai entibody against a capsular epitope shared by Streptococcus suis serohypes 1, 2 and 1/2. Microbiol. 143:9607-3614.
56. -Gottschaik, H, „ R. Hig-gins, M. -Jacques, K. R. Mittal,. and J. Henrichsen. Description of 14 new capsular types of Sfcreptococeus suis, J. Clin, Microbiol, 27:2633-2636.
57. Heathr 2. J.. S. W. Hunt, and <X> 9. Dúff. '1996,
Streptococcus sai« ssrotype 14 as a cause of pig disease in the OKI Vet. Rec. 2:450-451, $8. Ho^es, J.# L. A. Devrieze, J, Henrichsen, and F. Castryck. 1986, Identification and ch-ar&cterxzation of Sbreptococctxs suis. Vet. Microbiol. 16; 34 3-355.
59. Kiilper-Baiz, R»> and K. H. Schleifer. 1987., Ctreptococcus s«i.s sp« nov. nőm. rév. Int. J. Syst Sactertol. 37: 160-1.62.
60.
Kői kásán, M. A, ö.f 3, A, Ml van dér Zeijst, and
Sui3tan. 1998» Divereity of capsular polysaccharide synthesis gene clu.ste.rs in Streptococcus pneuraoaiae. Sebmitted fór pubIi cat ion.
61. Lee, J. t., S. Xuy A. Aldus, and P, 3. Livolsi. 1934. Genetic analysxs of type 5 capsular polysaccharide expression by Sfeaphyiococcws aareus. 3, Sacterioi. 176:4883-48 59,
62. Reek, F. 8., M, A. Smite, S. M. &amp, and H< E. Smith. 1995. üse of imlfciscrsen plates fór tbe preparation of bactsrial DNA suitafeie fór FÜR. BioT&ehnxques 19: 282-285.
63. San, S.f M, shasin, £. R. Wann, 51 C, Lse, T. J. .Foster, and C. Y« Lee» 1997. The Sbapbyiococcus aureus alielic génétic loci fór serotype 5 and 8 capsule expression contain. the typespecific genes flanfcsd by cotbou genes. Microbiol. 143: 239524 05.
64. San,
S,, and ci Y. Lee. 1996. Cloning of type
analysis of gene clusters fór the product
capsular po lysaccharides in S'taphy lococca;
ol. 178: X8-2126.
S., snd c, Y, Lee. 1997. Molecula r charsí
md transeription&l analysis of tyoe 8 capsule oene:
.n ,Ö7 at» »*
Staphydo-coccus aureus.· J. Sa-cfcerioX. 17$; 1€14~X€-21.
66. Smifch, R. E.# M. Rijnsfourgex, N, Sfcockhofe-Xnrwieden# H j, Wisselink., U. Vecht, and M. A, Smits. 1.997, Vírulenfc strains of streptococcus siris serotype 2 and highly virulent strains cf Sfcrspfcccoccna ewis ssrotype X can be recogniaed by a unigue ribotype profilé. J, Ciin. Mierabini. 35;1O49-1Q53.
67. Yamasaki, Μ., L. Yhorne# M. Mi kóla j csak, R. 5?.
Amentrotifc# and T. <J, Pollock. 1996, Linkage of genes essenfcial fór synthasis of a polysacchatide cápául© in Sphingomonaa sfcrain $88, J, Bactepiol. 178;26?€-2687.
68. Bhang, L># A.Al-Hendy# F, Toivanen, and M. Skcrnik. 1993. Genefcic organxcatíon and seguénce of the r.fb gen-e ciusfcer of Ysrsiria enfcerolitica sarotype ö;3: sxmiiarifci.es to fche dTDFL-rhamnooe bioaynthesia pafchway of Salmcnalla and to the hacteriai poiysaccharide fcranaport systw. Hol. Microfoiol. 2:309-321, :iiffcon-Madley, F.A. (1983) . Streptococcus aula type.
infectíons. Br. Vet. J. 139# 1-5.
Vechfc# ö., van Leengced# L. A, M. 0. and Varhayen# £> R, M. (1985) , Skreptoceccus su.is infectíons In pipa in The. hetberianás (psrr. -one). Vet. Quarfc. 7, 315-321
7Ί
Atends, and 2-anan# H. C, (,1886} , ingifcis eaused by Streptococcus suis in harsans. Rév. Infect, Oia. 1.0# 131 137 .
-Hőmmé z, J., Devrlexe# L, A, # Rcnrichsen# J. and Castryck, F. (1986; - Identificatio-n and characterizatio-n of Sfcreptoooccus suis. Vet. Hierobiol. 16# 349-355,
Kiilper-galz# R. and Schleifsr# K. H. (1987) .
Streptococcus sala sp. nov. ncas.rsv, Int. J. Sysfc, Badteriol, 37, 160-162.
Gott-schalk# M.r Higgins# R.
nd Jacques, M. (1933)
Production of cspsulsr -materia 1 by Streptoco-ceus suis serofcy? 2 under different conditions. C'an. J. Vet. Rés. S7, 49-52.
Kiggins, 8, and Gofctschaik# M, (1990). Un updafee on Strsp-fcccoccu-s suxs Identification. J. Vet. Diagn. Invest. 2#
A Q~ 7-9.9
Sortschalk, M,, Riggins, 8., dacques, Μ«, 8ea.udo.in, Μ.
and. Henxichsen, 3. (1991) . Cbaracferixatíon of síx new capsular fcypes (23 fchrough 28) of Streptococcus suis. J. Clin. Mxcrobiol. 25, 2550-2584.
Gottschalfc, Η», Higgíns, R., Jacques, M., Mittal, K. R. and Kenrichsen, 3. (1899) Bescription of 14 new capsular types of Streptococcus suis. J. Cl in. Mícrobiol. 27, 2638-2836,
Higgins., R>, Gottschalk, gM. Boudreau, M.,I»ébrun, A. and Henric-hsen, J. (19SS) , Descripfcíon of six new capsuiar typss (26 throug'h .34) of Sfcreptococcus sui®, 8. Vet. Öiagn. Invest. 7Z 405-406
Aarestrup, F- M.«, Jorsal, S, £·. and Jensen, Ν. £-. (1996).. Serologi-csl characterisatioo and antiaicrobial susceptibility of Str«ptoco«85 suis isolates f.rota diagnostie. aampl.es ín Deranark duxxng 1995 and 1.9961 Vet. Kícrohioi, 15« $9-66.
MacLennan, M., Foster, bick, K,
Smith, w,
J. and 8 and 1>
Nieisen, 8. (1996) . Streptococcus suis serotypes ?, 8 front diaoased pigs in Scotland. Vet Rec. 139, 423-424.
Slhvonen, !„, Kurlr 0. í5. and Renricbsen, J. (1938). Streptoooccus suís ísolates fro® pigs in Finiand. Acta Vet. Scand. 29, 9-13.
Soetner, A. G,, Binder, M< and .Bille-Hansen, V. (1987) , Streptococcus suís infectlons in Danish pígs and experimental infectton with Streptocoecus suis -sexotype 7, Act a Fath.
Mícrobiol. Immunoi. Scand. Bect. B, 95, 233-239. 83 Smith, Η. E., Veenherqen, V., vas dér Velde,
Párnán,
M.
Wisseiink, H, •j and SKtits, H.
(1988). The cps genes of
Streotococcus suis serotypes 1, 2 and 9: deveiopment of rapid serotype-specífic PCR assaye. J. Clin. Microfeíol, submitted
Steith, Η. E., Dansnan, F., van dér Velde, J, , Wagenaar,
F., Nissslink, H. J., Stockhofe~2urwíeden, N, and Smits, M. A. (1999) . Identification and characteriaation of the cps locus of Strsptococcas suis serotype 2v tho capsule protects against phagocytosis and is an important virulense factor. Infect. Immun, 67, 1756-1756,
Miller, J. (1972), Expexiwnfcs in Moie-culat Genetics.
φφ «φ ** φ « φ
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, ííI.
8€ Sembrook, j., SA F. Fritsch, and T, Mániátis. (1989) . Moiecular cloning; a laboratory manual. Cold Spring Karbor Laboratory, Cold Spring Karbor, HY,
Alién, A. and Maskeii, D. (1998) . The Identification, cloning and mutagenesis of a genetic Iccus requited fór lipopoiysaccharide biosynthesis ia Bordstella pertussis. Hol. Hlcrobiol. 19, 37-52.
Hang, L. and Reeves, P. R, (1998) .. Organízation of Escherighia coli 0157 o antigén gsne cluster and Identification of its speclfic genes, Inted, Immun·. 68, 35453551,
Wisselink, H. 01# Reek, F. H«, Vecht, A, StockhofeSurwieden, 8k# Sroits, M. A. and Smitb, H. £, (1999>,
Detection of virulent strains of Streptococcus suis type 2 and highly virulent strairss of Streptoeoccös suls type 1 in tonsillar specimen® of pigs b-y PCR. Vet. Microbiol, 67, 143157.
Konlngs, Ft Ν. K., Verhoeven, E. J. M. and Peeters, B. 9.
H. (1987). pKVN vecfcors fór the separate prodnction of both DNA st tanús of recombinant plasmids·, Metbods Enzymol» 153, 1.234 .·

Claims (8)

  1. s . Tok sélkbli Stre/bx.'f5ccM.i--mbáns, vakcbaként történő alkalmazásra,
  2. 2. Vakéba, amely tok nélküli SíVepmeííccas-moíájist tartalmaz,
  3. 3. A 2. igénypont szerbti vakcina, ahol a Sirqpfacacetis egy SSíreXecoccas snA.
  4. 4. A 2. vagy 3. Igénypont szerinti vakéba, amely Jöxí’bcoe'ejíí-metánskéb S/re/tíococcn? wuteciafaktor vagy antlgén-rieiermínáns termelésére képes mutánst tartalmaz.
  5. 5. A 2-4, igénypontok bánneiyike szerinti vakcina, amely Síreprecocéns-mutánskónt nsm-Sn'epmcöccíöeredetű protein termelésére képes mutánst tartalmaz.
  6. 6. Áz. 5, igénypont szerinti vakcina, amely nem-Sírepxöeoeess-eredeíÖ proteinként psiogénbőí származó protein termelésére képes mutánst tartalmaz,
  7. 7. Eljárás Sbezvococcss-eredetu betegségek elleni vakdnázás hatásosságának ellenőrzésére egy populációban, azzá? jettz&iszve, hogy a 2-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcinával teljesen vagy részlegesen vakcináit populációból származó legalább egy egyedből vett mintái tokozott Sireprtíeocíw-törzsek jöleslétére tesztelünk.
  8. 8. Eljárás 3bí?póíz.O£.-í^>eradehi betegségek elfeni vaké inázás hatásosságának ellenőrzésére egy populációban, azzal jellemezve, hogy a 2-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcinával teljeseit vagy részlegesen vakcináit populációból származó legalább egy egyediről vett ttrisiát Sífepr&wecus-tttesek ellesi! íok-specitikus antitestek jelenlétére tesztelünk.
HU0500459A 1998-07-22 1999-07-19 Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests HU228700B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98202465 1998-07-22
EP98202467 1998-07-22
PCT/NL1999/000460 WO2000005378A2 (en) 1998-07-22 1999-07-19 Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0500459A2 HUP0500459A2 (hu) 2005-08-29
HUP0500459A3 HUP0500459A3 (en) 2010-08-30
HU228700B1 true HU228700B1 (en) 2013-05-28

Family

ID=26150559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500459A HU228700B1 (en) 1998-07-22 1999-07-19 Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests

Country Status (9)

Country Link
US (4) US7125548B2 (hu)
EP (1) EP1098980B1 (hu)
AU (1) AU5070999A (hu)
CA (1) CA2341268C (hu)
DK (1) DK1098980T3 (hu)
ES (1) ES2512496T3 (hu)
HU (1) HU228700B1 (hu)
PL (1) PL204863B1 (hu)
WO (1) WO2000005378A2 (hu)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL204863B1 (pl) 1998-07-22 2010-02-26 Stichting Dienst Landbouwkundi Zastosowanie mutanta Streptococcus, szczepionka i sposoby kontrolowania lub eliminowania choroby paciorkowcowej w populacji
US6949372B2 (en) 1999-03-02 2005-09-27 The Johns Hopkins University Engineering intracellular sialylation pathways
WO2000052136A2 (en) 1999-03-02 2000-09-08 Human Genome Sciences, Inc. Human glycosylation enzymes
NZ593617A (en) * 2000-10-27 2012-04-27 Novartis Vaccines & Diagnostic Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
EP1205552A1 (en) 2000-11-09 2002-05-15 ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. Virulence of streptococci, involving ORFs from Streptococcus suis
WO2002061070A2 (en) 2001-02-02 2002-08-08 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Environmentally regulated genes, involved in the virulence of streptococcus suis
AU2002342485A1 (en) * 2001-11-23 2003-06-10 Universite De Montreal Streptococcus suis avirulent vaccine and uses in antibiotic design
JP4261855B2 (ja) 2002-09-19 2009-04-30 キヤノン株式会社 フェナントロリン化合物及びそれを用いた有機発光素子
WO2007126885A2 (en) * 2006-03-28 2007-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Live, attenuated pneumococcal vaccine
CN101020894B (zh) * 2007-01-17 2010-10-27 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 一株无毒2型猪链球菌及其制备方法、应用
CA2683748C (en) 2007-04-13 2016-02-16 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Mutants of cholesterol-dependent cytolysins and uses thereof
EP2023143A1 (en) * 2007-08-06 2009-02-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic streptococcus proteins
TW201043242A (en) 2009-03-26 2010-12-16 Intervet Int Bv Vaccine for protection against Streptococcus suis bacteria of various serotypes
GB201209014D0 (en) * 2012-05-22 2012-07-04 Moredun Res Inst Vaccine
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
WO2016081839A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Pneumolysin mutants and methods of use thereof
US11155585B2 (en) 2015-07-09 2021-10-26 Intervacc Ab Vaccine against S. suis infection
CA3000201A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Streptococcus suis polysacchari de-protein conjugate composition
CN105274102A (zh) * 2015-11-12 2016-01-27 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 辅助鉴定猪链球菌2型、猪链球菌7型和猪链球菌9型的引物组及其应用
AU2017357813A1 (en) * 2016-11-11 2019-06-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuating bacterial virulence by attenuating bacterial folate transport
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11103569B2 (en) 2017-12-15 2021-08-31 Intervet Inc. Vaccine for protection against Streptococcus suis
RU2020131305A (ru) * 2018-03-23 2022-04-26 Коранекс Кэпитал Прецизионные гликоконъюгаты в качестве терапевтических инструментов
EP3876980A1 (en) 2018-11-08 2021-09-15 Intervet International B.V. A vaccine for protection against streptococcus suis
CN112280880A (zh) * 2020-11-20 2021-01-29 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合及其检测试剂盒
CN112694988B (zh) * 2020-12-15 2022-12-06 武汉市农业科学院 一种鸡源猪链球菌弱毒株及其应用
CN113832068B (zh) * 2021-10-14 2023-07-25 河南兴华生物技术有限公司 链球菌菌株及防治猪链球菌病的疫苗
AU2022395498A1 (en) * 2021-11-25 2024-05-23 Chr. Hansen A/S Polysaccharides resulting in improved water holding capacity of dairy products
WO2023203238A1 (en) 2022-04-22 2023-10-26 Intervacc Ab Streptococcus suis vaccine composition comprising immunogenic fusion polypeptides

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9100510A (nl) 1991-03-21 1992-10-16 Centraal Diergeneeskundig Inst Dna-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en antilichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met s. suis bij zoogdieren, waaronder de mens.
SE468630B (sv) 1991-05-31 1993-02-22 Sts Komeetstaal Holding Bv Spaar- och avstickningsskaer med fyra symmetriska skaerhoern
FR2688515B1 (fr) 1992-03-13 1995-03-31 Institut Rech Agronomique Plasmide thermosensible.
US5928900A (en) 1993-09-01 1999-07-27 The Rockefeller University Bacterial exported proteins and acellular vaccines based thereon
EP0804582A1 (en) 1994-05-16 1997-11-05 The Uab Research Foundation $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE) CAPSULAR POLYSACCHARIDE GENES AND FLANKING REGIONS
US5681570A (en) * 1995-01-12 1997-10-28 Connaught Laboratories Limited Immunogenic conjugate molecules
ATE256749T1 (de) 1995-01-23 2004-01-15 Novozymes As Dna-integration durch transposition
EP0750042A1 (fr) * 1995-06-20 1996-12-27 Societe Des Produits Nestle S.A. Bactéries lactiques produisant des exopolysaccharides
EP0750043B1 (fr) * 1995-06-20 2001-05-23 Societe Des Produits Nestle S.A. Bactéries lactiques produisant des exopolysaccharides
JP2001510989A (ja) 1996-11-01 2001-08-07 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規コーディング配列
US6800744B1 (en) 1997-07-02 2004-10-05 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
US6248329B1 (en) * 1998-06-01 2001-06-19 Ramaswamy Chandrashekar Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof
PL204863B1 (pl) * 1998-07-22 2010-02-26 Stichting Dienst Landbouwkundi Zastosowanie mutanta Streptococcus, szczepionka i sposoby kontrolowania lub eliminowania choroby paciorkowcowej w populacji
WO2000006738A2 (en) 1998-07-27 2000-02-10 Microbial Technics Limited NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS FROM $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE)
EP1140157B1 (en) 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
EP1205552A1 (en) * 2000-11-09 2002-05-15 ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. Virulence of streptococci, involving ORFs from Streptococcus suis
WO2002061070A2 (en) 2001-02-02 2002-08-08 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Environmentally regulated genes, involved in the virulence of streptococcus suis
EP2023143A1 (en) 2007-08-06 2009-02-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic streptococcus proteins

Also Published As

Publication number Publication date
EP1098980B1 (en) 2014-09-03
US20110171252A1 (en) 2011-07-14
USRE45170E1 (en) 2014-09-30
PL204863B1 (pl) 2010-02-26
HUP0500459A3 (en) 2010-08-30
HUP0500459A2 (hu) 2005-08-29
US20070111236A1 (en) 2007-05-17
WO2000005378A2 (en) 2000-02-03
US7776323B2 (en) 2010-08-17
DK1098980T3 (da) 2014-09-29
CA2341268C (en) 2010-10-12
EP1098980A2 (en) 2001-05-16
US8728490B2 (en) 2014-05-20
US7125548B2 (en) 2006-10-24
US20020055168A1 (en) 2002-05-09
WO2000005378A3 (en) 2000-06-15
AU5070999A (en) 2000-02-14
PL346369A1 (en) 2002-02-11
ES2512496T3 (es) 2014-10-24
CA2341268A1 (en) 2000-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228700B1 (en) Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests
US8324354B2 (en) Environmentally regulated genes of Streptococcus suis
US6716432B1 (en) Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
RU2113234C1 (ru) Вакцина, способная сообщать хозяину иммунитет против инфекции, вызванной streptococcus группы b, способ предупреждения инфекции, вызванной streptococcus группы b, и способ ослабления инфекции, вызванной streptococcus группы b
JP2001510342A (ja) 新規微生物
ES2325911T3 (es) Fragmento genomico de streptococcus suis y usos clinicos del mismo.
KR20000049090A (ko) 헬리코박터 필로리 생백신
RU2234941C2 (ru) Вакцина против плевропневмонии животных, способ ее получения
US20050249755A1 (en) Mutant strains of Brucella melitensis and immunogenic compositions
EP1180119B1 (en) Recombinant haemophilus influenzae adhesin proteins
US6432669B1 (en) Protective recombinant Haemophilus influenzae high molecular weight proteins
dos Santos Pinheiro Development of a Streptococcus pneumoniae system to control exposure of immature peptidoglycan
US7785609B1 (en) Recombinant Haemophilus influenzae adhesin proteins
KR20060131809A (ko) 항혈청에 의한 삽입 돌연변이 라이브러리들의 스크리닝을통한 항원적으로 중요한 네이세리아 항원들의 확인

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: STICHTING DIENST LANDBOUWKUNDIG ONDERZOEK, NL

Free format text: FORMER OWNER(S): ID-LELYSTAD, INSTITUUT VOOR DIERHOUDERIJ EN DIERGEZONDHEID B.V., NL

HC9A Change of name, address

Owner name: STICHTING WAGENINGEN RESEARCH, NL

Free format text: FORMER OWNER(S): ID-LELYSTAD, INSTITUUT VOOR DIERHOUDERIJ EN DIERGEZONDHEID B.V., NL; STICHTING DIENST LANDBOUWKUNDIG ONDERZOEK, NL

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees