CN101020894B - 一株无毒2型猪链球菌及其制备方法、应用 - Google Patents

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本发明属细菌类，具体说是一株无毒2型猪链球菌及其制备方法，以及在猪链球菌病疫苗研制中的应用。一株无毒2型猪链球菌Streptococcus suis(Serotype2)05JYS68，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNo.1902。其制备方法为：用棉拭子从健康猪的咽、鼻部采集样本，放入THB培养基中混匀，30℃～39℃静置培养3～6小时；将其用常规方法提取总DNA作为模板，采用聚合酶链式反应、平板划线法、革兰氏染色和血清凝集实验，确定所分离的菌株为2型猪链球菌，命名为05JYS68；为证实该分离菌株为无毒株，将其注射实验猪，结果基本无病理反应，表明该分离株05JYS68为无毒的2型猪链球菌株。

Description

一株无毒2型猪链球菌及其制备方法、应用
技术领域
本发明属细菌类，具体说是一株无毒2型猪链球菌(Strep tococcus suis sero type 2)及其制备方法，以及在猪链球菌病疫苗研制中的应用。
背景技术
2型猪链球菌(Streptococcus suis，简称S.suis)是一种重要的人兽共患病病原体。猪群对2型S.suis普遍易感，感染后可致急性败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡等，如不及时治疗病死率达40％；病后存活的猪生长缓慢，存栏时间大为延长。近年我国南方省份的猪群中2型S.suis流行日趋严重，时有较大规模暴发，每年造成的经济损失达十亿元。该病原感染人类可导致脑膜炎、败血症等严重疾患。1998及2005年分别在我国江苏和四川资阳人群中发生暴发流行，病人中出现高比例的、国外罕见的中毒性休克综合征，病情凶险，病死率高(60％～80％)，引发严重的公共卫生事件。目前，国内外尚无理想的适合动物和人使用的疫苗，相关基础和应用研究对于该病的预防和控制具有重要意义。
传统的疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗是经灭活的全菌体死疫苗，其最大的有点是制备与生产容易，且稳定、易保存；但缺点是需多次接种、接种剂量大、接种后局部或全身毒、副反应明显，且有的疫苗保护作用欠佳。减毒活疫苗的优点是只需接种一次，接种剂量小，免疫效果较好，且免疫力教持久；缺点是不稳定、难保存，且可能出现毒力的回复突变。以上两种疫苗都是以全菌体为基础的疫苗，它们的共同缺点是：注入体内的抗原组分多而复杂，有许多组分其实是非保护性抗原。这些非保护性抗原组分的存在，一是干扰了机体对保护性抗原的应答(有时对非保护性抗原的应答成为主要应答，而保护性抗原是非主要应答甚至无应答)；二是非保护性抗原的存在可能带来严重的免疫毒副反应，如发烧、免疫性疾病等。
发明内容
本发明针对上述不足之处提供一株无毒2型猪链球菌及其制备方法、应用，从健康猪群中分离出一株无毒2型猪链球菌，为筛选2型猪链球菌蛋白性保护性抗原打下基础。经PCR法鉴定、形态学观察和血清学实验，证实该分离株为2型猪链球菌。
经动物实验，证实该菌株以108从耳静脉注射实验猪后无病理反应，而以05年四川分离的强毒株05ZYH33为阳性对照等量注射实验猪先后死亡，最快可在24小时内猝死。结果表明，该分离株为2型猪链球菌无毒株。
基于系统生物学和反向遗传学方法，拟对2型S.suis无毒株与强毒株的全基因组序列进行比较，采用生物信息学方法全面分析并鉴定出我国流行区2型S.suis毒力株的保护性抗原组分，为该菌疫苗走向应用奠定基础。
细胞特征：该菌属于球菌科、链球菌属，为革兰氏阳性菌，呈卵圆形，成双或以短链形式存在，兼性厌氧，在5％绵羊血琼脂培养基上37℃培养24小时，菌落直径达1～2mm，呈浅灰色或半透明，稍带粘液样，在不同动物的血平板上能产生各种类型的溶血环，但主要是α-溶血。部分菌株周围无溶血区带，但把菌落从血平板上移去，可见α-溶血或β-溶血。2型猪链球菌在绵羊血琼脂平板上产生明显的α-溶血，在马血琼脂平板上为β-溶血。
目前该2型猪链球菌菌种保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，本保藏中心登记入册编号是：CGMCC No.1902，分类命名：猪链球菌(2型)，菌种的拉丁学名是：Streptococcussuis，参据的微生物(株)：05JYS68，保藏日期是2006年12月18日。
一株无毒2型猪链球菌制备方法：
1.增菌培养
用棉拭子从健康猪的咽、鼻部采集样本，放入装有0.5ml的THB培养基(Todd Hewitt Broth，BactoTM)中，旋涡振荡器上混匀之后，30℃～39℃静置培养3～6小时。
2.纯化分离
将上述培养的杂菌用常规方法提取总DNA作为模板，用针对2型荚膜多糖(cps2)基因设计的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，结果为阳性的样本确定为含有2型猪链球菌。采用平板划线法，从阳性样本中挑取单菌落，再进行增菌培养，经过PCR、革兰氏染色和血清凝集实验，确定所分离的菌株为2型猪链球菌，命名为05JYS68。
3.动物实验
为证实该2型猪链球菌分离株为无毒株，将其增菌后以108从耳静脉注射3只健康长白仔猪，同时设置以05年四川分离的强毒株05ZYH33为阳性对照。结果，注射05JYS68的实验猪基本无病理反应，而注射05ZYH33的实验猪先后死亡，最快可在24小时内猝死。结果表明，该分离株05JYS68为2型猪链球菌无毒株。
全基因组序列测定：为获得2型猪链球菌无毒株05JYS68的更多信息，以便为猪链球菌疫苗研制打下基础，我们对其全基因组进行了测序，证实这是一株2型猪链球菌，而且与强毒株基因组相似性较大，适合用于疫苗研究与生产。然后，基于系统生物学和反向遗传学方法，拟对2型猪链球菌无毒株与强毒株的全基因组序列进行比较，采用生物信息学方法全面分析并鉴定出我国流行区2型猪链球菌毒力株的保护性抗原组分，为该菌疫苗走向应用奠定基础。
一株无毒2型猪链球菌在猪链球菌病疫苗中的应用。
本发明的突出优点：
1.该菌种从健康猪群分离，对人和动物无任何危害。
2.用该菌进行动物免疫实验，证实其对猪链球菌病具有很强的保护性。
3.与强毒株基因组相似性较大，适合用于疫苗研究与生产。
具体实施方式
实施例1：
一株无毒2型猪链球菌制备方法、应用：
1.增菌培养
用棉拭子从健康猪的咽、鼻部采集样本，放入装有0.5ml的THB培养基(Todd Hewitt Broth，BactoTM)中，旋涡振荡器上混匀之后，30℃静置培养6小时。
2.纯化分离
将上述培养的杂菌用常规方法提取总DNA作为模板，用针对2型荚膜多糖(cps2)基因设计的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，结果为阳性的样本确定为含有2型猪链球菌。采用平板划线法，从阳性样本中挑取单菌落，再进行增菌培养，经过PCR、革兰氏染色和血清凝集实验，确定所分离的菌株为2型猪链球菌，命名为05JYS68。
3.动物实验
为证实该2型猪链球菌分离株为无毒株，将其增菌后以108从耳静脉注射3只健康长白仔猪，同时设置以05年四川分离的强毒株05ZYH33为阳性对照。结果，注射05JYS68的实验猪基本无病理反应，而注射05ZYH33的实验猪先后死亡，最快可在24小时内猝死。结果表明，该分离株05JYS68为2型猪链球菌无毒株。
4.全基因组序列测定
为获得2型猪链球菌无毒株05JYS68的更多信息，以便为猪链球菌疫苗研制打下基础，我们对其全基因组进行了测序，证实这是一株2型猪链球菌，而且与强毒株基因组相似性较大，适合用于疫苗研究与生产。然后，基于系统生物学和反向遗传学思法，拟对2型猪链球菌无毒株与强毒株的全基因组序列进行比较，采用生物信息学方法全面分析并鉴定出我国流行区2型猪链球菌毒力株的保护性抗原组分，为该菌疫苗走向应用奠定基础。
实施例2：
一株无毒2型猪链球菌制备方法、应用：
1.增菌培养
用棉拭子从健康猪的咽、鼻部采集样本，放入装有0.5ml的THB培养基(Todd Hewitt Broth，BactoTM)中，旋涡振荡器上混匀之后，37℃静置培养4小时。
2.纯化分离
将上述培养的杂菌用常规方法提取总DNA作为模板，用针对2型荚膜多糖(cps2)基因设计的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，结果为阳性的样本确定为含有2型猪链球菌。采用平板划线法，从阳性样本中挑取单菌落，再进行增菌培养，经过PCR、革兰氏染色和血清凝集实验，确定所分离的菌株为2型猪链球菌，命名为05JYS68。
3.动物实验
为证实该2型猪链球菌分离株为无毒株，将其增菌后以108从耳静脉注射3只健康长白仔猪，同时设置以05年四川分离的强毒株05ZYH33为阳性对照。结果，注射05JYS68的实验猪基本无病理反应，而注射05ZYH33的实验猪先后死亡，最快可在24小时内猝死。结果表明，该分离株05JYS68为2型猪链球菌无毒株。
4.全基因组序列测定
为获得2型猪链球菌无毒株05JYS68的更多信息，以便为猪链球菌疫苗研制打下基础，我们对其全基因组进行了测序，证实这是一株2型猪链球菌，而且与强毒株基因组相似性较大，适合用于疫苗研究与生产。然后，基于系统生物学和反向遗传学思法，拟对2型猪链球菌无毒株与强毒株的全基因组序列进行比较，采用生物信息学方法全面分析并鉴定出我国流行区2型猪链球菌毒力株的保护性抗原组分，为该菌疫苗走向应用奠定基础。
实施例3：
一株无毒2型猪链球菌制备方法：
1.增菌培养
用棉拭子从健康猪的咽、鼻部采集样本，放入装有0.5ml的THB培养基(Todd Hewi tt Broth，BactoTM)中，旋涡振荡器上混匀之后，39℃静置培养3小时。
2.纯化分离
将上述培养的杂菌用常规方法提取总DNA作为模板，用针对2型荚膜多糖(cps2)基因设计的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，结果为阳性的样本确定为含有2型猪链球菌。采用平板划线法，从阳性样本中挑取单菌落，再进行增菌培养，经过PCR、革兰氏染色和血清凝集实验，确定所分离的菌株为2型猪链球菌，命名为05JYS68。
3.动物实验
为证实该2型猪链球菌分离株为无毒株，将其增菌后以108从耳静脉注射3只健康长白仔猪，同时设置以05年四川分离的强毒株05ZYH33为阳性对照。结果，注射05JYS68的实验猪基本无病理反应，而注射05ZYH33的实验猪先后死亡，最快可在24小时内猝死。结果表明，该分离株05JYS68为2型猪链球菌无毒株。
4.全基因组序列测定
为获得2型猪链球菌无毒株05JYS68的更多信息，以便为猪链球菌疫苗研制打下基础，我们对其全基因组进行了测序，证实这是一株2型猪链球菌，而且与强毒株基因组相似性较大，适合用于疫苗研究与生产。然后，基于系统生物学和反向遗传学思法，拟对2型猪链球菌无毒株与强毒株的全基因组序列进行比较，采用生物信息学方法全面分析并鉴定出我国流行区2型猪链球菌毒力株的保护性抗原组分，为该菌疫苗走向应用奠定基础。
一株无毒2型猪链球菌在猪链球菌病疫苗中的应用：用该菌进行动物免疫实验，证实其对猪链球菌病具有很强的保护性。即先用该菌对实验动物进行三次免疫，每周一次，然后用2型猪链球菌强毒株皮下注射攻击动物，结果发现动物无病死现象，除关节炎外无其它临床病理反应，而未用该菌免疫的动物用强毒株攻击后全部死亡，这说明该无毒2型猪链球菌菌株对猪链球菌病有明显的保护作用。

Claims (2)

1.一株无毒2型猪链球菌(Streptococcus suis Serotype 2)05JYS68，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.1902。
2.权利要求1所述的一株无毒2型猪链球菌在制备猪链球菌病疫苗中的应用。
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