NL9100510A - Dna-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en antilichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met s. suis bij zoogdieren, waaronder de mens. - Google Patents
Dna-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en antilichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met s. suis bij zoogdieren, waaronder de mens. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9100510A NL9100510A NL9100510A NL9100510A NL9100510A NL 9100510 A NL9100510 A NL 9100510A NL 9100510 A NL9100510 A NL 9100510A NL 9100510 A NL9100510 A NL 9100510A NL 9100510 A NL9100510 A NL 9100510A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- mrp
- polypeptide
- streptococcus suis
- sequence
- suis
- Prior art date
Links
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 title claims abstract description 90
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 49
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 46
- 230000001018 virulence Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000004224 protection Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 19
- 101710084977 Muramidase-released protein Proteins 0.000 claims abstract description 104
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 18
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 19
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 17
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 17
- 101150062876 mrp gene Proteins 0.000 description 16
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 11
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 6
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 6
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 6
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 6
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 5
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 5
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 5
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000002151 serous membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 2
- 101100190466 Caenorhabditis elegans pid-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 241001591005 Siga Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 101000986624 Streptococcus pyogenes Fibrinogen- and Ig-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 2
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001599236 Aleiodes codon Species 0.000 description 1
- 102100021253 Antileukoproteinase Human genes 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 201000004813 Bronchopneumonia Diseases 0.000 description 1
- 101100291031 Caenorhabditis elegans gly-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100228206 Caenorhabditis elegans gly-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100230463 Caenorhabditis elegans his-44 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100243943 Caenorhabditis elegans pid-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002691 Choroiditis Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000615334 Homo sapiens Antileukoproteinase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000194041 Lactococcus lactis subsp. lactis Species 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 206010024642 Listless Diseases 0.000 description 1
- 101150056222 MVP gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005736 Nervous System Malformations Diseases 0.000 description 1
- 101100109397 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010036141 Polyserositis Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 235000014969 Streptococcus diacetilactis Nutrition 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 101000815632 Streptococcus suis (strain 05ZYH33) Rqc2 homolog RqcH Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 240000001949 Taraxacum officinale Species 0.000 description 1
- 235000005187 Taraxacum officinale ssp. officinale Nutrition 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000019513 White blood cell disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 239000007382 columbia agar Substances 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001496 desquamative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 101150059027 eff gene Proteins 0.000 description 1
- 101150082032 efp gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- -1 etc.) Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 102000036072 fibronectin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000004394 hip joint Anatomy 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 210000004276 hyalin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000030175 lameness Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940051921 muramidase Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 206010030899 opisthotonus Diseases 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 238000001485 positron annihilation lifetime spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 150000003147 proline derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 108010010318 streptococcal M protein Proteins 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007078 todd-hewitt medium Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/885—Streptococcus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Description
DNA-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van Streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en anti-lichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met S. suis bij zoogdieren, waaronder de mens.
De uitvinding ligt op het gebied van de humane en veterinaire preventieve geneeskunde, in het bijzonder op dat van de diagnose van en de bescherming tegen infectie door pathogene stammen van de bacterie Streptococcus suis.
Infecties met Streptococcus suis serotype 2 bij jonge biggen rond het spenen zijn in Nederland sinds I983 een toenemend probleem. De ziekte wordt gekenmerkt door meningitis, arthritis, sepsis en sterfte (F.A. Clifton-Hadley, 1983. Streptococcus suis type 2 infections, Br. Vet. J. 139: 1-5; Vecht U., L.A.M.G. van Leengoed, en E.R.M. Verheijen, 1985, Streptococcus suis infections in pigs in The Netherlands (part one), Vet. Quart. 7: 315“321). Het percentage bedrijven met dergelijke problemen wordt geschat op 5”10. De mortaliteit wordt geschat op 2,5%, de morbiditeit op probleembedrijven is gemiddeld 2~5%. Therapeutische en preventieve maatregelen hebben slechts beperkt effect. De economische schade is dientengevolge aanzienlijk. De ziekte is een zoonose. Ook de mens is gevoelig voor deze infectie met het risico van sepsis, meningitis met mogelijk blijvende restverschijnselen; een enkel sterfgeval is gerapporteerd (Arends J.P., en H.C. Zanen, 1988, Meningitis caused by Streptococcus suis in humans, Rev. Infect. Dis. 10: 131-137). Dit betrof contactgevallen van mensen met een huidverwonding met besmet varkensvlees . Met name varkenshouders en slachthuispersoneel behoren tot de risicogroep.
Er zijn aanwijzingen dat de sinds 1983 toegenomen ziektefrequentie op Nederlandse varkensbedrijven te wijten is aan import van fokdieren die dragers zijn van S. suis type 2. Dragers zijn veelal gezonde volwassen varkens die de streptococcen in de tonsilplaten herbergen. Via deze dragers wordt de infectie op gevoelige dieren, veelal biggen van speen-leeftijd, overgebracht. Diagnostiek van reeds zieke of gestorven dieren berust op isolatie en determinatie van S. suis type 2 uit klinisch materiaal dan wel orgaanmateriaal. Detectie van dragers berust op bacteriologisch onderzoek van keelswabs of tonsilbiopten. met een selectief— electief medium (L.A.M.G. van Leengoed, U. Vecht en E.R.M. Verheijen, Streptococcus suis type 2 infections in pigs in the Netherlands (part two), Vet. Quart. 1987. 2.: 111-117). Op basis van -diagnostisch- onderzoek naar dragerschap zou een bestrijdingsprogramma opgezet kunnen worden. Onderzoek op dragerschap is echter bewerkelijk, hetgeen het verwerken van grote aantallen monsters compliceert; ook bestaat het risico van vals negatieve uitslagen door overgroeiing met contaminanten. Het aflezen van de test tenslotte vraagt veel ervaring. Diagnostiek en een eventuele bestrijding op basis van diagnostiek worden bovendien bemoeilijkt door het voorkomen van verschillen in pathogeniteit binnen het species S. suis serotype 2. Gestructureerd onderzoek op dragerschap in het kader van een bestrijdingsprogramma heeft pas zin wanneer werkelijk virulente stammen van S. suis type 2 kunnen worden onderscheiden van avirulente stammen. Met de gangbare diagnostische technieken wordt dit onderscheid niet gemaakt. Een gerichte bestrijding is daardoor vooralsnog niet mogelijk.
Virulentieverschillen worden onder meer toegeschreven aan de aan-of afwezigheid van virulentiefactoren. Reeds in 1984 werden door Arends en Zanen "lysozym-positieve eiwitten" in humane stammen beschreven (J. Arends en H.C. Zanen, Proc. of the 9th Lancefield Int. Symp. on Streptococci and Streptococcal Dis. p. 343. 1984). In een dierexperiment bleek dat een "lysozym-positieve" stam (D-282) pathogeen was voor gnotobiont-biggen in tegenstelling tot een "lysozym-negatieve" stam (T-15). (Vecht U., J.P. Arends, E.J. Van der Molen and L.A.M.G. van Leengoed, 1989. Differences in virulence between two strains of Streptococcus suis type II after experimentally induced infection of newborn germ-free pigs, Am. J. Vet. Res. 50: 1037“1043). Het "lysozym-positieve eiwit" is waarschijnlijk identiek aan het Muramidase-Released Protein (MRP) van stam D-282.
De varkenshouderij in Nederland kent een pyramidale structuur met in de top een beperkt aantal fokbedrijven van waaruit dieren verspreid worden naar vermeerderingsbedrijven. Deze leveren uiteindelijk aan een groot aantal afmestbedrijven, waarvan het (dier)produkt uiteindelijk naar de slachterijen gaat. Een bestrijdingsstrategie op basis van diagnostiek (certificering bedrijven, eliminatie positieve dragers, import-eisen) zou gericht moeten zijn op bedrijven die zich hoog in deze pyra-mide bevinden. Een vaccin zou ook lager in de pyramide moeten kunnen worden toegepast. Verder kunnen middelen en methoden voor de diagnostiek van infecties met Streptococcus suis in de humane geneeskunde van waarde zijn.
Doel van de uitvinding is het verschaffen van werkwijzen en middelen waarmee, op doeltreffender wijze dan tot nu toe, enerzijds infecties door Streptococcus suis kunnen worden opgespoord en anderzijds dergelijke infecties kunnen worden voorkomen.
Dit doel wordt bereikt doordat men een DNA-sequentie uit het gen dat codeert voor een kenmerk van virulentie van S. suis toepast. Onder een kenmerk van virulentie wordt hier verstaan een polypeptide waarvan de aanwezigheid samenhangt met de virulentie van een organisme, in dit geval de bacterie S. suis, in het bijzonder type 2.
Gevonden zijn twee genen van virulente stammen van S. suis type 2 die coderen voor twee eiwitten, die worden aangeduid als MRP (Muramidase Released Protein) en EF (Extracellulaire Factor) en die kenmerkend voor virulentie (virulentiefactoren) blijken te zijn. MRP en EF zijn hoog-moleculaire eiwitten. MRP (136 kD) is een met de celenvelop geassocieerd eiwit en kan met muramidase uit de celwand worden vrijgemaakt, EF (110 kD) is een extracellulair product dat de bacterie in het groeimedium uitscheidt (zie figuur 20 a, b). Op basis van deze genen en de expres-sieprodukten ervan zijn diagnostische methodieken ontwikkeld, die virulente en avirulente stammen kunnen onderscheiden. Op basis van de expressie van één of beide eiwitten door genoemde genen, worden tot dusver drie verschillende fenotypen van S. suis type 2 aangetroffen: nl. het MRP+ EF+ fenotype, het MRP+ EF- fenotype en het MRP- EF- fenotype. Stammen geïsoleerd uit organen van varkens met klinische ziekteverschijnselen bleken voor TJ% (n=lll) het MRP+ EF+ fenotype te bezitten, terwijl isolaten uit tonsillen van onverdachte normale slachtvarkens voor 86% (n=42) tot het MRP+ EF+ fenotype bleken te behoren. Het MRP+ EF- fenotype werd het meest frequent (74$) (n=27) aangetroffen in isolaten uit humane patiënten met infecties van S. suis type 2 (zie figuur 21). Aldus kunnen dragers van virulente stammen van S. suis worden opgespoord en kan een vaccin worden ontwikkeld. Hiermee kunnen methoden voor de bestrijding van infecties door S. suis type 2, bijvoorbeeld op varkensbedrijven, opgezet worden.
De uitvinding heeft derhalve betrekking op de DNA-sequentie van het gen dat, behalve voor bepaalde hoogmoleculaire polypeptiden, codeert voor het polypeptide van 90-120 kDa dat een kenmerk van virulentie van S. suis is, welk gen, hierna te noemen het ef-gen, voor S. suis serotype 2 stam D-282 de nucleotidenvolgorde volgens fig. 1 heeft, en op overeenkomstige sequenties en op delen van die sequenties. De nucleotide-sequentie van het gehele voor EF coderende gebied en de flankerende seqenties zijn bepaald. Analyse van de sequentie van liet ef-gen (fig. 1) levert een open leesraam van 2529 nucleotiden dat voor een polypeptide van 843 aminozuren (berekend molecuulgewicht 90014) codeert. Monoklonale antistoffen opgewekt tegen het 110-kDa EF, herkenden in Western blots eiwitten met een hoger moleculair gewicht in cultuursupernatanten van alle 38 onderzochte stammen met een MTP+ EF- fenotype. Dit geeft aan dat bepaalde epitopen van het 110-kDa EF en de hoog-moleculaire eiwitten identiek zijn. Geen van de $1 stammen met een MRP+ EF+ fenotype bleek deze hoog-moleculaire eiwitten te produceren. Tevens bleken DNA-probes op basis van het gen dat codeert voor het 110-kDa EF te hybridiseren met genen die coderen voor de hoog-moleculaire eiwitten van MRP+ EF- stammen. Dit geeft aan dat het 110 kDa EF en de hoog moleculaire eiwitten verwant zijn, hetgeen impliceert dat ten minste een deel van het ef-gen, van stammen met een MKP+ EF- fenotype, identiek is met het ef-gen van stammen met het MRP+ EF+ fenotype.
De uitvinding heeft eveneens betrekking op de DNA-sequentie van het gen dat codeert voor het polypeptide van 135-136 kDa dat eveneens een kenmerk van virulentie van S. suis is, welk gen, hierna te noemen het mrp-gen, voor S. suis serotype stam D-282 de nucleotidenvolgeorde volgens figuur 2 heeft, en op overeenkomstige sequenties en op delen van die sequenties. De nucleotidesequentie van het gehele voor MRP coderende gebied en de flankerende seqenties zijn bepaald. Analyse van de sequentie van het mrp-gen (fig. 2) toont een open leesraam van 3768 nucleoti-den dat voor een polypeptide van 1256 aminozuren (berekend molecuulge-wicht 13579*0 codeert.
Onder een overeenkomstige sequentie wordt hier verstaan een sequentie die in hoofdzaak gelijk is aan de weergegeven sequentie, maar daarmee kleine verschillen, zoals puntmutaties, of modificaties zoals door substitutie, deletie, insertie of additie, kan vertonen; evenzo wordt daaronder begrepen een sequentie die, ondanks eventuele verschillen in nucleotidenvolgorde, met de weergegeven sequentie of met het complement ervan hybridiseert, alsmede een sequentie die daarmee ontaard is, d.w.z. ondanks verschillen in nucleotidenvolgorde voor dezelfde aminozuurvolgorde codeert.
De uitvinding heeft verder betrekking op een recombinant polynucleotide dat een sequentie zoals hierboven omschreven van het ef-gen en/of van het mrp-gen, in aanwezigheid van een regulerende sequentie omvat. Een dergelijke recombinant, zoals een virusvector, een plasmide of een bacterie, kan worden gebruikt voor de expressie van het gen of van relevante gedeelten daarvan in een gewenste omgeving, bijvoorbeeld voor de produktie van immunogene peptiden bestemd voor de.diagnose van een besmetting of voor de bestrijding van infecties met virulente stammen van S. suis.
Van de uitvinding maken verder deel uit polynucleotideprobes die een sequentie zoals hierboven omschreven, afgeleid van een gen dat codeert voor een kenmerk van virulentie van S. suis, bevatten. Een dergelijke probe komt in het bijzonder overeen met een gedeelte van de nucleotidensequentie van een de twee genoemde genen. Een bruikbare probe heeft in het algemeen een lengte van ten minste 10 nucleotiden. De probe kan worden gebruikt voor het rechtstreeks aantonen van de aanwezigheid van sequenties van virulente stammen van S. suis. De probe kan ook worden gebruikt als primer voor de vermeerdering van polynucleotiden (bijvoorbeeld bij een Polymerase Chain Reaction) als onderdeel van een diagnosemethode of een beschermingsmethode.
De uitvinding betreft verder polypeptiden die zijn afgeleid van een hierboven omschreven DNA-sequentie. Een dergelijk polypeptide wordt hetzij gecodeerd door die sequentie, hetzij verkregen door expressie van die sequentie, en komt in hoofdzaak overeen met een voor virulentie kenmerkend eiwit van S. suis, of met een gedeelte daarvan. Een dergelijk polypeptide kan bij voorbeeld worden gebruikt als antigeen in een im-muunbepaling, als immunogeen bij het immuniseren van zoogdieren, of als immunogeen voor de produktie van antilichamen voor diagnostische doeleinden. De aldus opgewekte antilichaam behoren eveneens tot de uitvinding. Dergelijke antilichamen kunnen polyklonaal of monoklonaal zijn, en kunnen zijn voorzien van een merker (enzym, isotoop, luminescerende stof, complexvormer); ook kan het antilichaam zijn verbonden met vaste drager.
De uitvinding heeft tevens betrekking op werkwijzen voor het opsporen van een besmetting met een pathogene stam van S. suis, waarbij men een of meer polynucleotide-probes, polypeptiden en of antilichamen zoals hierboven omschreven gebruikt. Met "besmetting” wordt bedoeld de aanwezigheid van het pathogene organisme, zowel in het geval dat er sprake is van ziekteverschijnselen (infectie) als in het geval dat er geen symptomen van infectie zijn. Bij immuunbepalingen, zoals een bepaling van de aanwezigheid van antigenen van en/of antilichamen tegen S. suis, in een monster of in klinisch materiaal, kan bijvoorbeeld op een microtiterplaat een polypeptide dat is afgeleid van, en/of een antilichaam dat is opgewekt tegen het ef-gen of gedeelte daarvan (110 kDa) worden gebruikt. Daarnaast kan men tevens een van het mrp-gen of gedeelte daarvan afgeleid polypeptide (136 kDa) gebruiken. De diagnostische werkwijzen kunnen op op zichzelf bekende wijzen plaats vinden.
De hierboven beschreven werkwijzen kunnen worden uitgevoerd met behulp van diagnosekits. Een diagnosekit volgens de uitvinding bevat respectievelijk ten minste een polynucleotide, ofwel een polypeptide dat overeenkomt met of is afgeleid van een sequentie van het e/-gen of mrp-gen of een gedeelte daarvan of bevat een antiliehaam dat is opgewekt tegen het polypeptide afgeleid van een van de genoemde ef- en mrp-sequenties. Ook kunnen combinaties van probes e.d., in het bijzonder van e/-diagnostica en mrp-diagnostica, of combinaties van primers, bij voorbeeld voor uitvoering van PCR, worden toegepast. De kits kunnen verder de benodigde bestanddelen voor het uitvoeren van diagnoses bevatten, zoals reagentia (merkstoffen, kleurstoffen e.d.), dragers (filters, platen e.d.), medium, ijkmiddelen, alsmede een handleiding voor het uitvoeren van de diagnose.
De uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het beschermen van zoogdieren tegen infectie met Streptococcus suis waarbij men een polynucleotide, een polypeptide, dan wel een antiliehaam zoals hierboven omschreven toepast. Bij toepassing van een antiliehaam betreft het een passieve immunisatie, d.w.z. het rechtstreeks aanbieden van afweerstoffen tegen het pathogene organisme; doordat antilichamen die zijn afgeleid van EF en MRP tegen de meest virulente vormen van S. suis gericht zijn, kan een dergelijke werkwijze een effectieve methode voor het beschermen tegen of het bestrijden van infectie zijn, vooral wanneer het te beschermen dier zelf niet voldoende antistoffen kan aanmaken, bijvoorbeeld wanneer al besmetting heeft plaats gevonden of bij jonge dieren. Een andere vorm van passieve immunisatie bij varkens is de toediening van antilichamen aan de biggen via het colostrum van de zeug. Hierbij wordt het moederdier tijdens de dracht,' dus voor de geboorte van de biggen, actief geïmmuniseerd met een of beide polypeptiden. Bij toepassing van een polypeptide of een polynucleotide (eventueel in de vorm van een gerecombineerd organisme) is er sprake van actieve immunisatie, waarbij het te beschermen dier door middel van het immunogene polypeptide, dat rechtstreeks dan wel in de vorm van een tot expressie te brengen gen wordt toegediend, wordt aangezet tot het aanmaken van antistoffen.
Een andere geschikte wijze van immuniseren is het toedienen van een polypeptide waarvan de voor virulentie verantwoordelijke activiteit is geneutraliseerd. Een dergelijk polypeptide zou dan niet meer patho-geen zijn terwijl immunogene eigenschappen wel bewaard zijn gebleven. Het kan bij voorbeeld worden verkregen door expressie van een gen dat ten opzichte van het oorspronkelijke ef- of mrp-gen is gemodificeerd, zoals door middel van deletie.
Vaccins ter bescherming van zoogdieren tegen een infectie met S. suis, welk vaccin een polynucleotide, een polypeptide of een antiliehaam zoals boven omschreven bevatten behoren eveneens tot de uitvinding.
Een bijzonder vaccin volgens de uitvinding is een vaccin dat een materiaal van S. suis dat ten minste een van de polypeptiden overeenkomend met EF en MRP niet of niet geheel tot expressie brengt. Dit materiaal kan afkomstig zijn van of worden gevormd door een eventueel levende stam die niet of minder virulent is.
De rol van virulentiefactoren die zijn betrokken bij de pathogene-se van S. suis type 2 werd in vivo bestudeerd door middel van infecties van gnotobionten/kiemvrije biggen met qua virulentiefactoren (MRP en EF) gedefinieerde stammen van S. suis type 2. De dierproeven werden begeleid door middel van haematologische, bacteriologische en (histo)pathologische analysetechnieken.
Figuurbeschri j ving Figuur 1:
Nucleotidesequentie van het ef-gen en de aangrenzende sequenties en de daarvan afgeleide aminozuursequentie van EF. De veronderstelde ribosoombindingsplaats is onderstreept. De gebieden -35 en -10 van de veronderstelde promotoren zijn van een bovenliggende streep voorzien. Horizontale pijlen duiden op de gebieden met complementaire symmetrie. De verticale pijl geeft de mogelijke knipplaats voor signaalpeptidase aan.
Figuur 2:
Nucleotidesequentie van het EcoRI-HindlII-fragment van 4,6 kb met het mrp-gen van S. suis type 2 en de daarvan afgeleide aminozuursequentie van MRP. De vermoedelijke ribosoombindingsplaats is onderstreept. De gebieden -35 en -10 van de veronderstelde promotorsequenties zijn van een bovenliggende streep voorzien. De horizontale pijl duidt het gebied van complementaire symmetrie voorbij het mrp-gen aan. De verticale pijl geeft de potentiële knipplaats voor signaalpeptidase aan. P duidt op het proline-rijke gebied; Rl, R2 en R3 duiden op repeterende aminozuurse-quenties en E op het envelop-ankergebied.
Figuur 3:
Western-blot-analyse van eiwitten van plaques van recombinante bacteriofagen die zijn geselecteerd met monoklonalen tegen EF. Van elke recombinante bacteriofaag werden 10 plaques vanaf een agarplaat verzameld. De eiwitten in de plaques werden 24 uur bij 4°C geëlueerd met 200 pl Laemmli—buffer. Op de gel werden monsters van 5 ,μΐ aangebracht (6% PAA). Baan 1: positieve controle, supernatant van cultuur van stam D282; baan 2: kloon 1; baan 3* kloon 2.
Figuur 4:
Restrictiekaarten van DNA-inserties van vermoedelijke EF-positieve recombinante bacteriofagen. Restrictieplaatsen: Sa:SalI; SrSacI; P:PstI; K:Kpnl; B:BamHI.
Figuur 5:
Western-blot-analyse van door het recombinante plasmide pEF2-19 gecodeerde eiwitten die zijn geselecteerd met een monoklonaal anti-lichaam tegen EF. Baan 1: negatieve controle JM101 (pKUN19); baan 2: supernatant van cultuur van stam D282; baan 3- JM101 (pEF2-19).
Figuur 6:
Western-blot-analyse van vanaf plaques van recombinante bacteriofagen geëlueerde eiwitten die zijn geselecteerd met monoklonale antili-chamen tegen MRP, Van elke recombinante bacteriofaag werden 10 plaques van een agarplaat verzameld. De eiwitten in de plaques werden 24 uur bij 4°C met 200 μΐ Laemmli-buffer geëlueerd. Monsters van 5 pl werden op de gel aangebracht. Baan 1: negatieve controle; eiwitten geëxtraheerd uit de celwand van een MRP-negatieve stam van S. suis. Baan 2: positieve controle; ruw MRP geëxtraheerd uit de celwand van MRP-positieve stam D282. Baan 3: kloon 7· Baan 4: kloon 9· Baan 5: kloon 10. Baan 6: kloon 11. Baan 7: kloon 12. Baan 8: Lambda GEM11 met controleinsert.
Figuur 7:
Restrictiekaarten van de DNA-inserties van de vermoedelijke MRP-positieve recombinante bacteriofagen. De vette lijn geeft het DNA gebied aan dat in al deze klonen aanwezig is. Restrictieplaatsen: E: EcoRI; H: HindlII; X: Xbal; K: Kpnl.
Figuur 8:
Western-blot-analyse van door recombinante plasmiden en recombinante bacteriofagen gecodeerde eiwitten die zijn geselecteerd met monoklonale antilichamen tegen MRP. Baan 1: negatieve controle; eiwitten geëxtraheerd uit de celwand van een MRP-negatieve stam van S. suis. Baan 2: ruw MRP-preparaat dat uit de celwand van stam D282 geëxtraheerde eiwitten bevat. Baan 3: pMR7~l. Baan 4: pMR7-2. Baan 5! pMR9~l. Baan 6: pMR9~2. Baan 7: pMRIO-l. Baan 8: pMR10-2. Baan 9: Lambda GEM11 met controleinsert. Baan 10: Lambda kloon 7. Baan 11: Lambda kloon 9· Baan 12: Lambda kloon 10. Baan 13: Lambda kloon 11.
Figuur 9:
Southern-hybridisaties van met 32p gemerkt pMR7-2 probe-DNA met chromosomale DNA van S. suis D282 dat is geknipt met verschillende restrictieenzymen. Baan 1: Xbal-digest; baan 2: KpnI-digest. Linker strook: met ethidiumbromide gekleurde restrictiefragmenten. Rechter strook: hybridiserende fragmenten van dezelfde gel. M;Lambda DNA geknipt met HindlII en EcoRI.
Figuur 10:
Western-blot-analyse van eiwitten gecodeerd door pMRll die het met monoklonalen tegen MRP geselecteerde volledige mrp-gen bevatten. Baan 1: uit de celwand van stam D282 geëxtraheerd ruw MRP. Baan 2: door pMRll gecodeerde eiwitten.
Figuur 11:
Hydropathie-profiel (volgens Kyte en Doolittle, 1982. J. Mol. Biol. 157: IO5-I32) van MRP. Sequenties boven en beneden de horizontale lijn stellen hydrofobe resp. hydrofiele gebieden voor.
Figuur 12:
Homologie tussen C-terminale uiteinden van MRP en een aantal de envelop verankerende sequenties van eiwitten van grampositieve bacteriën. De aminozuursequentie van het MRP van S. suis werd vergeleken met M6-eiwit van Streptococcus pyogenes (Hollingshead, S.K. et al. 1987. J. Biol. Chem. 261: l677“l686), protein A van Staphylococcus aureus (Guss, B. et al., 1984. Eur. J. Biochem. 138: 413-420), protein G van groep G streptococci (Fahnestock, S.R. et al. 1987. J. Bacteriol. 16^: 87Ο-88Ο), AP4 van S. pyogenes (Frithz, E. et al. 1989. Mol. Microbiol. 1111-III9), WAP4 van Streptococcus mutans (Ferretti, J.J. et al. 1989. Mol. Microbiol. 2.: 469-478), T6 van S. pyogenes (Schneewind, 0. et al. 1990. J. Bacteriol. 172: 3310-3317)» LP van Lactococcus lactis (Vos, P. et al. 1989. J. Biol. Chem. 264: 13579-13585) en Fn-BP van S. aureus (Sigas, C. et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 699“703)·
Figuur 13:
Vergelijking van de interne repeats in MRP. Homologe stukken zijn met een vette lijn aangegeven.
Figuur 14:
Schematische weergave van eiwit MRP.
Figuur 15:
Bovenste grafiek: gemiddelde temperaturen van de zes groepen biggen uit sessie I.
Onderste grafiek: gemiddelde temperaturen van de twee MRP+ EF+ groepen (3 en 10) vergeleken met die van de MRP- EF- groepen (12, 16, 18 en 25).
PID = dag na infectie (Post Inoculation Day).
Figuur 16:
Gemiddelde temperaturen van de twee MRP+ EF+ groepen (3 en 22) vergeleken met die van de MRP+ EF- groepen (17, 24 en 26) en met de MRP-EF- groep 12, uit sessie II.
PID = dag na infectie (Post Inoculation Day).
Figuur 17:
Bovenste grafiek: gemiddelde aantallen polymorfkernige leucocyten (in aantallen * ÏO^/L) van de zes groepen biggen uit sessie I.
Onderste grafiek: gemiddelde aantallen polymorfkernige leucocyten van de twee MRP+ EF+ groepen (3 en 10), vergeleken met die van de MRP-EF- groepen (12, 16, 18 en 25).
PID = dag na infectie (Post Inoculation Day).
Figuur 18:
Gemiddelde polymorfkernige leucocyten (in aantallen * ÏO^/L) van de twee MRP+ EF+ groepen (3 en 22) vergeleken met die van de MRP+ EF-groepen (17, 24 en 28) en met de MRP- EF- groep 12, uit sessie II.
PID = dag na infectie (Post Inoculation Day).
Figuur 19:
Western-blot van protoplast-supernatant (pps) en celcultuursuper-natant (cult, sup.) van stam D-282, met drie sera: no. 1 = muis MAb anti-EF (1:4 verdunning); no. 2 = konijne PAb anti-MRP, anti-EF (K191) (1:500 verdunning); no. 3 = muis MAb anti-MRP (1:2 verdunning). Gebonden eiwitten werden geïdentificeerd met een 1:1000 verdunning van met alkalisch fosfatase geconjugeerd konijne-anti-muis-immunoglobuline (Zymed Laboratories, Inc. San Francisco, USA).
De band op MW 136 kD in de protoplast-supernatant en cultuur supernatant, en de band op MW 110 kD in de cultuursupernatant werden beide geïdentificeerd door de met alkalisch fosfatase geconjugeerde muize-MAb en de konijne(K191)-PAb.
Figuur 20a:
Eiwitpatroon van het protoplastsupernatant (PPS), cultuursuper-natant (Cult.Sup.) en de membranen (Membr.) van Streptococcus suis type 2 stammen op 6% SDS PAGE gels na zilverkleuring. Het 136 kDa MRP en het 110 kDa EF zijn met pijlen aangegeven. De banen in de gel zijn genummerd naar de stammen waarmee ze geladen zijn. Referentie stam 1 (D-282) en stam 5 waren geïsoleerd uit een big met meningitis. Referentiestam 2 (T-15) en stam 13 waren geïsoleerd uit de tonsillen van gezonde varkens. Stammen 24 en 26 waren isolaten afkomstig uit humane patiënten. M = high range (42,7 - 200 kilodalton) Molecuul Gewicht (MW) standaard (Biorad Laboratories, Richmond USA).
Figuur 20b:
Western blot van het van protoplastsupernatant (PPS), cultuur-supernatant (Cult.Sup.) en de membraanfracties (Membr.) met het poly-klonale anti-MRP/EF konijneserum (K191) (verdunning 1:500) als probe. De banen zijn genummerd als in figuur 20a.
Figuur 21:
Western blot van het cultuursupernatant van een aantal S, suis type 2 stammen na incubatie met met konijne-anti-MRP/EF-serum (K191) (verdunning 1:500). De PAbs laten drie fenotypes van S. suis type 2 zien: MRP+ EF+; MRP+ EF-; MRP- EF-. De banen in de gel zijn genummerd naar de stammen waarmee ze geladen zijn. Referentiestam 1 (D-282) en stammen 3~9 waren geïsoleerd uit biggen met S. suis meningitis. Referen-tiestam 2 (T-15) en stammen 10, 12, 16 en 17 waren geïsoleerd uit de tonsillen van gezonde varkens. Stammen 22, 23, 24, 25. 26, 28 en 29 waren geïsoleerd uit humane patiënten.
Voorbeelden
Beschrijving karakterisering e/- en mrp-genen Materialen en methoden.
Bacteriestammen en kweekomstandigheden.
De stam JM101 van E. colt (supE,thi,/\(lac-proAB-)fF1traD36, lac!qZ/\M15]; Messing, J. 1979· A multipurpose cloning system based on the single-stranded DNA bacteriophage M13. Recombinant DNA Technical Bulletin. NIH Publication 79“99 »2» No. 2, 43-48) werd gebruikt als gastheer voor recombinant plasmide-DNA.
Stam LE392 van E. coli (F",hsdR574(rk",mk+),supE44,supF58,TacYl, or l\(laclZY)6,galK2,galT22,melBl,trpR55; Murray, N.E., W.J. Brammer and K. Murray, 1977« Mol. Gen. Genet. 150» 53-58) werd gebruikt als gastheer voor recombinante bacteriofagen. S. suis type 2 stam D282 (Vecht, U. et al., 1989« Am. J. Vet. Res. fjQ» 1037-1043) werd gebruikt voor het isoleren van chromosomaal DNA. De E. coli-stammen werden gekweekt op vloeibaar LB-medium (Miller, J., 1972, Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY); vast LB-medium bevatte 1,5% agar. Zonodig werd ampicilline toegevoegd tot een eindcon-centratie van 50 pg/ml. De S. suis-stammen werden gekweekt in Todd-Hewitt-medium (Oxoid, Basingstoke, Hants, VK).
DNA-technieken.
Routinematige .DNA-bewerkingen werden .uitgevoerd.....zoals beschreven door Maniatis et al., 1989. Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor NY.
Southern blotting en hybridisatie.
DNA werd overgebracht naar Gene-Screen-plusmembranen (NEN research products, Dreieich, Duitsland) zoals beschreven door Maniatis et al. (zie boven). DNA-probes werden met een random primed labeling kit (Boehringer, Mannheim, Duitsland) volgens de aanwijzingen van de fabrikant gemerkt met (32p)dCTP (3000 Ci/mMol, Amersham, Radiochemical Centre, VK). De hydridisatie vond plaats volgens de aanwijzingen van de leverancier van de Gene-Screen-plusmembranen. Na hybridisatie werden de filters tweemaal gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met twee keer SSC (SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-citraat) en tweemaal gedurende 30 minuten bij 65°C in 0,1 ί SSC + 0,5 % natriumdodecylsulfaat (SDS) gewassen.
Constructie en immunologische screening van DNA-bibliotheek.
Een DNA-bibliotheek van S. suis type 2 stam D282 werd aan de hand van de aanwijzingen van de fabrikant (Promega, Madison, USA) in de LambdaGEM-11 vector geconstrueerd. Recombinant-fagen werden uitgezet op platen met E. coli stam LE 392. Na 16 uur bij 37°C werden nitrocellulose filters (Schleicher en Schuell, Dassel, Duitsland) gedurende 2 uur bij 37°C op de platen gebracht. Potentiële EF-positieve recombinanten werden zichtbaar gemaakt met anti-EF monoklonale antilichamen en konijne-anti-muis-immunoglobulinen geconjugeerd met alkalisch fosfatase (Zymed, Sanbio B.V., Uden, Nederland) zoals beschreven door Maniatis et al. (zie boven). Potentieel EF-positieve klonen werden gezuiverd door enkele malen afzonderlijk isoleren van platen en immunologische screening.
SDS-polyacrylamide gel-elektroforese (PAGE) en Western-blot-analyse.
SDS-PAGE werd uitgevoerd volgens Laemmli, U.K. 1970, Nature 227: 680-685. Scheidingsgelen bevatten 6% polyacrylamide. Na elektroforese werden de eiwitten door middel van een Semi-Dry-transfercel (BioRad, Richmond, USA) op nitrocellulose overgebracht. De eiwitten werden door middel van anti-EF-polyklonale of anti-EF-monoklonale antilichamen zichtbaar gemaakt.
Nucleotidesequentieanalyse.
De DNA-sequenties werden bepaald met de dideoxy-keten beëindi-gingsmethode (Sanger, F. et al., 1977. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, J4: 5463-5467). DNA- en aminozuur-sequenties werden geanalyseerd met behulp van het Wisconsin-programma.
Resultaten ef-gen.
Constructie en screening van de bibliotheek.
Chromosomaal DNA van S. suis type 2, stam D282 werd gedeeltelijk geknipt met restrictie-enzym Sau3A. Een bibliotheek van dit DNA werd geconstrueerd in de bacteriofaag Lambda GEM11 replacementvector. Er werden ongeveer 5 χ 1θ5 recombinanten per pg DNA verkregen. Van de 2000 onderzochte plaques reageerden er twee sterk met een monoklonaal antili-chaam tegen EF.
Karakterisering van de immunoreactieve recombinanten.
De expressie van EF door de twee gekozen recombinante bacteriofa-gen werd onderzocht met behulp van Western-blot analyse. De resultaten (fig. 3) tonen aan dat de recombinanten codeerden voor een eiwit dat met EF comigreerde en dat door een tegen EF gericht monoklonaal antilichaam werd herkend. Dit wijst erop dat de recombinante bacteriofagen de volledige voor de synthese van EF benodigde genetische informatie bevatten.
Ter bevestiging van deze aanwijzing werd de mate van overeenkomst van de DNA-sequenties van de twee recombinanten onderzocht. Daartoe werden restrictiekaarten van de DNA-inserten gemaakt. Zoals verwacht bezaten de twee klonen een identiek DNA-gebied. Dit gemeenschappelijke DNA-gebied van ongeveer 13 kb, dat in fig. 4 vet is weergegeven, zou de genetische informatie voor EF moeten bevatten.
Met het oog op een nadere lokalisering van de genetische informatie van het ef-gen op het DNA van de recombinante faag werden delen van het gemeenschappelijke DNA-gebied gesubkloneerd in plasmidevector pKUN19 (Konings, R.H.N. et al., 1987* Methods Enzymol. 153' 12-34), en werd de expressie van de voor EF coderende sequenties onderzocht door middel van Western-blot-analyse. Uit de resultaten (fig. 5) bleek dat een plasmide vector met het SalI-Kpnl-fragment van 8 kb (pEF2-19, in fig. 4 aangeduid met een vette lijn) codeerde voor een eiwit dat door een monoklonaal antilichaam tegen EF werd herkend en een molecuulgewicht had gelijk aan dat van EF. Dit fragment bevat derhalve waarschijnlijk alle genetische informatie die nodig is voor de synthese van EF.
Nucleotidesequentie van het e/-gen.
De nucleotidesequentie van het gehele voor EF coderende gebied en de flankerende sequenties werden bepaald. Bij analyse van de sequentie (fig. 1) bleek er een open leesraam van 2529 nucleotiden te zijn dat codeert voor een polypeptide van 843 aminozuren (berekend molecuulgewicht 90014). Het veronderstelde startcodon ATG wordt voorafgegaan door een sequentie die overeenkomst vertoont met bindingsplaatsen voor ribo-somen zoals gevonden in verscheidene grampositievebacteriën (Hager, P.W., en J.C. Rabinowitz, 1985* Translational specificity in Bacillus sübtilis, The Molecular Biology of the Bacilli, Dubnau, D.A. (uitg.), New York, Academic Press, 1-32). Ongeveer 1300 bp voorbij het stopcodon TAG zijn twee gebieden van verlengde complementaire symmetrie aanwezig.
Deze sequenties functioneren waarschijnlijk als transscriptieterminato-ren. Aangezien beide gebieden een reeks thymidine-residuen aan het uiteinde van de stem-loopstructuur bevatten, behoren zij tot de rho-onafhankelijke klasse (Platt, T. 1986. Ann. Rev. Biochem. 339"372).
Aangezien EF uitsluitend wordt aangetroffen in de supernatant van culturen van S. suis, is het te verwachten dat het eiwit wordt voorafgegaan door een signaalpeptide. De eerste 46 aminozuren van de EF-sequen-tie vertonen inderdaad de kenmerken van een signaalpeptide (fig. 1): een N-terminaal gedeelte met 6 positief geladen aminozuren dat wordt gevolgd door een hydrofobe kern van 21 aminozuren en een veronderstelde split-singsplaats voor een signaalpeptidase.
Resultaten mvp-gen.
Constructie en screening van de bibliotheek.
Chromosomaal DNA van S. suis type 2, stam D282 werd gedeeltelijk geknipt met restrictie-enzym Sau3A. Een bibliotheek van dit DNA werd geconstrueerd in de bacteriofaag Lambda GEM11 replacementvector. Er werden ongeveer 5 x 10^ recombinanten per pg DNA verkregen. Van de l400 onderzochte plaques reageerden er vijf sterk met een monoklonaal antili-chaam tegen MRP.
Karakterisering van de immunoreactieve recombinanten.
De expressie van MRP door de vijf gekozen recombinante bacteriofa-gen werd onderzocht met behulp van Western-blot-analyse.
De resultaten (fig. 6) toonden aan dat alle recombinanten coderen voor een eiwit dat door monoklonalen tegen MRP wordt herkend. De geschatte molecuulgewichten (MW) van deze eiwitten waren echter lager dan die van volledig MRP. Twee klonen coderen voor een eiwit van ongeveer 70 kD (fig. 6, banen 5 en 6), twee andere voor een eiwit van ongeveer 80 kD (fig. 6, banen 4 en 7) en de laatste voor een eiwit van ongeveer 90 kD (fig. 6, baan 3)· Dit doet vermoeden dat de recombinante klonen niet de volledige genetische informatie bevatten die nodig is voor de synthese van MRP, maar voor ingekorte eiwitten codeerden.
Ter bevestiging van dit vermoeden werden de verschillende inserties door middel van restrictieenzym-analyse vergeleken. Uit figuur 2 blijkt dat de.klonen een groot gemeenschappelijk DNA-gebied van ongeveer 17 kb hadden. Aangezien de verschillende klonen codeerden voor eiwitten van verschillende lengten, werden deze eiwitten waarschijnlijk vanaf een van de uiteinden van de inserties gecodeerd. De variatie in molecuulgewichten van de ingekorte eiwitten kwam goed overeen met de variatie in lengte aan de rechterzijde van de restrictiekaarten (vergelijk figuren 6 en 7a). Dit wijst erop dat het onvolledige mrp-gen gelokaliseerd is aan de rechter zijde van de DNA-inserties. Dit werd bevestigd door middel van subkloneren van de rechter uiteinden van de DNA-inserties van klonen 7, 9 en 10 (fig. 7b) in een plasmidevector pKUN19 (Konings, R.N.H. et al., 1987» Methods Enzymol. 153* 12-34) en door analyseren van de pro-dukten door middel van Western-blotting. De plasmiden bleken te coderen voor eiwitten die reageren met antilichamen tegen MRP, welke eiwitten dezelfde molecuulgewichten hadden als die eiwitten die door de recombi-nante fagen werden gecodeerd (fig. 8). Aangezien het EcoRI fragment van 1 kb (fig. 7b) kon worden verwijderd zonder enig effect op de expressie, moet het 5'-einde van het mrp-gen aan de rechter zijde van dit EcoRI-fragment gelegen zijn. Anderzijds leidt deletie van het EcoRI-Kpnl-fragment van 0,7 kb dat naast het EcoRI - fragment van 1,0 kb is gelegen tot verlies van expressie van het mrp-gen. Dit wijst erop dat de expressie van mrp wordt geïnitieerd vanaf het EcoRI-KpnI-fragment van 0,7 kb. Klonering van het volledige mrp-gen.
Voor het verkrijgen van de volledige genetische informatie die nodig is voor de synthese van MRP werd het KpnI-SacI-fragment van pMR7~2 (fig. 7b) als probe voor de hybridisatie met chromosomaal DNA van S. suis stam D282 gebruikt. Het chromosomale DNA werd met EcoRI, Kpnl of Xbal geknipt. Een EcoRI-fragment van 7 kb (niet weergegeven), een Kpnl-fragment van 7 kb (fig. 9. baan 2) en een Xbal-fragment van 20 kb bleken sterk met de probe te hybridiseren (fig. 9. baan 1). Anders dan het EcoRI-fragment dat, gezien de lengte, het volledige voor MRP coderende gebied zou moeten bevatten, moeten de Kpnl- en Xbal-fragmenten alleen de 3'-uiteinden bevatten. EcoRI- en Kpnl-fragmenten van 6-8 kb werden geïsoleerd vanaf een agarosegel en gekloneerd in de EcoRI- resp. Kpnl-plaats van pKUN19 (de Xbal-fragmenten werden niet voor verdere experimenten gebruikt). Voor het transformeren van E. eoli JM 101 werden ligatiemengsels gebruikt. Vanaf selectieve, Xgal-bevattende platen werden 2500 witte (recombinante) klonen die waren verkregen met EcoRI-fragmenten, geïsoleerd en deze werden onderzocht op de aanwezigheid van mrp-sequenties door middel van koloniehybridisatie met pMR7~2 als probe. Tegen de verwachting in gaf geen van de met de EcoRI - fragmenten verkregen kolonies .een positief signaal. Daarentegen hybridiseren 13 van de 50 met KpnI-fragmenten verkregen recombinante klonen met de probe, welke 13 alle een plasmide met een KpnI-insertie van 7 kb (pMR-C) bevatten. Het feit dat het EcoRI-fragment van 7 kb, dat het volledige mrp-gen zou moeten bevatten, niet werd aangetroffen tussen de 2500 onderzochte klonen, doet vermoeden dat de expressie van MRP in E. coli toxisch is. Niettemin kon een plasmide worden verkregen dat het volledige gen (pMRll) bevatte, waarin het 5'"Uiteinde (van pMR7-2) en het 3'~uiteinde (uit pMR-C) van het mrp-gen werden gecombineerd. Het aantal kopieën van dit plasmide bleek echter belangrijk minder te zijn (ongeveer 20 maal) dan dat van pKUN19· Door het geringere aantal kopieën werden waarschijnlijk de toxische effecten die bij hoge expressie van MRP in E. coli optraden tot een verdraagbaar niveau beperkt.
De expressie van MRP door E. coli dat pMRll bevatte werd onderzocht door middel van Western-blot-analyse. Zoals verwacht werd in deze cellen een eiwit van 130 kD dat met intakt MRP comigreerde door de polyklonale antilichamen tegen MRP herkend (fig. 10).
Nucleotidesequentie van het mrp-gen.
Begin- en eindsignalen.
De nucleotidesequentie van een EcoRI-HindlII fragment van 4,6 kb dat het volledige voor MRP coderende gebied en de aangrenzende gebieden bevat, werd bepaald. De gevonden sequentie is weergegeven in fig. 2 en blijkt een open leesraam van 3768 nucleotiden te bevatten die coderen voor een polypeptide van 1256 aminozuren (berekend MW 135*794). Het vermoedelijke startcodon ATG wordt voorafgegaan door een sequentie die overeenkomst vertoont met de in diverse grampositieve bacteriën gevonden, ribosoom-bindende plaatsen (Hager, P.W., en J.C. Rabinowitz. 1985, Translational specificity in Bacillus subtilis. The Molecular Biology of the Bacilli. Dubnau, D.A. (uitg.) New York, Academic Press, 1-32).
De startplaats voor transcriptie van mrp is nog niet vastgesteld, maar wel werden twee vermoedelijke promotorsequenties, die sterke overeenkomst vertonen met de consensus-sequenties -35 en -10 van promotoren van grampositieve bacteriën vastgesteld (deze sequenties zijn in fig. 2 met een bovenliggende streep aangegeven).
Voorbij het stopcodon TAG is een reverted repeat aanwezig. De mogelijke haarspeldstructuur bevat een stam van 12 bp die is gescheiden door een lus van 6 bp (/\G= -15.9 kcal/mol, berekend volgens de regels van Tinoco, Jr. I. et al. 1973. Nature 246: 40-4l). Aangezien er geen aan thymidine rijk gebied vlak voorbij de stem-loop-structuur aanwezig is (Platt T., 1986. Ann. Rev. Biochem. 339“372), is de terminator blijkbaar van.de rho-afhankelijke klasse.
Tabel A. Codons in S. suis mrp in vergelijking met 11 genen van Streptococcen (St) en 52 genen van E. coli (E.c.) *- MRP St. E.C. MRP St. E.c. ~ MRP St. E.C. MRP St. E.C.
TTT Phe 68 71 37 TCT Ser 20 16 23 TAT Tyr 56 73 40 TGT Cys 0 80 43 TTC Phe 32 29 63 TCC Ser 5 2 27 TAC Tyr 44 27 60 TGC Cys 0 20 57 TTA Leu 14 39 7 TCA Ser 46 41 7 TAA - 0 7 5 TGA - 0-17 TTG Leu 39 10 9 TCG Ser 6 4 11 TAG - 100 - 8 TGG Trp 100 100 100 CTT Leu 41 27 7 CCT Pro 30 33 12 CAT His 44 53 54 CGT Arg 58 39 56 CTC Leu 2 6 7 CCC Pro 0 6 7 CAC His 56 47 46 CGC Arg 11 13 36 CTA Leu 4 15 2 CCA Pro 59 55 16 CAA Gin 75 83 24 CGA Arg 8 5 3 CTG Leu 0 3 68 CCG Pro 11 6 65 CAG Gin 25 17 76 CGG Arg 0 11 3 ATT lie 60 49 36 ACT Thr 37 34 25 AAT Asn 52 55 26 AGT Ser 12 18 6 ATC lie 31 30 61 ACC Thr 7 16 50 AAC Asn 38 45 74 AGC Ser 11 19 26 ATA He 9 21 3 ACA Thr 47 40 7 AAA Lys 74 79 76 AGA Arg 19 36 1 ATG Met 100 100 100 ACG Thr 9 10 18 AAG Lys 26 21 24 AGG Arg 4 6 1 t GIT Val 60 42 36 GCT Ala 46 . 43 26 GAT Asp 76 64 46 GGT Gly 61 41 48 GTC Val 7 10 15 GCC Ala 6 5 21 GAC Asp 24 36 54 GGC Gly 13 18 39 GTA val 23 38 22 GCA Ala 35 44 22 GAA Glu 67 76 73 GGA Gly 20 29 5 GTG Val 10 10 27 GCG Ala 13 8 31 GAG Glu 33 24 27 GGG Gly 6 12 8
Codontype.
In tabel A is een vergelijking weergegeven van het type codons in het MRP-eiwit van S. suis met die welke in het algemeen voorkomen in streptococcen-groepen A (Chen, C.C. and P.P. Cleary, 1990· J· Biol. Chem. 265.: 3161-3167) en in E. coli (Piggot, P.J, and J.A. Hoch. 1985. Microbiol. Rev. 4^: 158-179)· Uit deze tabel blijkt dat de voor mrp gebruikte codons gelijkenis vertonen met die van de streptococcen-groep A maar belangrijk verschilt van die in E. coli. In overeenstemming met het hoge AT-gehalte (59.6 %) van mrp is er een duidelijke afkeer vein G en C, vooral op de derde positie van de codons. Verder komen codons die in genen van grampositieve bacteriën zoals TCC, TCG, CCC, CGG en AGG (Hollingshead, S.K. et al. 1987. J. Biol. Chem. 26l: I677“l686) zeldzaam zijn, ook weinig voor in mrp.
Hechting van MRP aan de cel-envelop.
Aangezien MRP een met de cel-envelop geassocieerd eiwit is, moet het over het cytoplasmische membraan worden getransporteerd. Daarom is te verwachten dat het volledige eiwit wordt voorafgegaan door een sig-naalpeptide. In fig. 11 is de hydropathie (Kyte, J. and R.F. Doolittle. 1982. J. Mol. Biol. 157· 105-132) van het MRP-eiwit uitgezet. De eerste 47 aminozuren hebben inderdaad het kenmerk van een signaalpeptide: een N-terminaal gedeelte met 7 positief geladen residuen dat wordt gevolgd door een hydrofobe kern (van 21 aminozuren) en een mogelijke knipplaats voor , signaalpeptidase (verticale pijl in fig. 2; zie Von Heijne, G. 1986. Nucleic Acids Res. 4683-4690). Verwijdering van het signaalpeptide geeft een rijp eiwit met een berekend MW van 131.094.
Een tweede hydrofoob gebied met een lengte van 20 aminozuren werd aangetroffen aan het C-terminale uiteinde van het eiwit. In analogie met andere met de envelop geassocieerde eiwitten functioneert dit gedeelte waarschijnlijk als celmembraananker. Het hydrofobe gebied wordt gevolgd door een kort sterk hydrofiel segment aan het C-uiteinde. Vergelijking met andere met de envelop geassocieerde eiwitten van grampositieve bacteriën wees verder op een duidelijke homologie in de gebieden voorafgaande aan de veronderstelde membraanankers (fig. 12). In dit gebied is een aantal aminozuren geconserveerd (Leu-Pro-X-Thr-Gly-Glu), en daarvan wordt aangenomen dat deze een rol spelen bij de binding aan de celwand. ..Primaire,structuur van MRP.
Naast de hierboven besproken aminozuursequenties aan het C-termi-nale uiteinde kunnen enkele andere karakteristieke gebieden in MRP worden onderscheiden. Deze zijn schematisch weergegeven in fig. 14. De rijpe vorm van MRP start met een unieke N-terminale sequentie van 824 aminozuren. Dit gebied wordt gevolgd door een reeks aminozuren die zeer rijk is aan prolineresiduen: 26 van de 86 aminozuren. Dit aan proline rijke gebied wordt gevolgd door een gebied dat drie gedeelten van 54 aminozuren bevat die in hoge mate repetitief zijn (fig. 13). Het eerste stuk wordt door 77 aminozuren gescheiden van het tweede stuk, en het tweede en het derde grenzen onmiddellijk aan elkaar. Het eerste en het tweede stuk zijn sterk geconserveerd (94# homologie), terwijl het derde stuk meer variaties vertoont. Het derde stuk wordt onmiddellijk gevolgd door de C-terminale sequentie voor het envelop-anker.
Overeenkomsten met andere eiwitten.
Er werd geen grote mate van algehele homologie in aminozuren tussen MRP en andere eiwitten in de EMBL-bibliotheek gevonden. Eén bepaald gebied binnen MRP (aminozuren 619-9^5) had echter enige overeenkomst (11,2% homologie over een lengte van 377 aminozuren) met een sequentie binnen het Fibronectine bindende eiwit van Staphylococcus aureus (Sigas, C. et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 699"703)·
Dierproeven Materiaal en methode 1. Varkens
Proefdieren waren 52 gnotobiont biggen, afkomstig van 4 zeugen, een kruising tussen Groot Yorkshires en Hollands Landvarken. De biggen werden middels een keizersnede binnen een steriele chirurgische isolator ter wereld gebracht. Daarna werden ze verdeeld over 12 groepen, elk bestaande uit 4 of 5 biggen, en gehuisvest in steriele roestvrij stalen isolatoren. Huisvesting en voeding waren zoals eerder beschreven (Vecht U., J.P. Arends, E.J. Van der Molen, and L.A.M.G. van Leengoed 1989» Differences in virulence between two strains of Streptococcus suis type II after experimentally induced infection of newborn germ-free pigs, Am. J. Vet. Res. 50:1037-1043).
2. Inocula
Tien S. suis type 2 stammen afkomstig uit drie verschillende bronnen werden opgewerkt tot een inoculum voor een-week-oude biggen. Deze 10 stammen behoorden tot drie fenotypes nl (MRP+ EF+) (MRP+ EF-) (MRP+ EF+). Zie voor nummers en oorsprong van de stammen [Tabel B]. Hiertoe werd een een-dag-oude kolonie van een Columbia-agarbodem met 6% paardebloed opgekweekt (18 uur, 37°C) tot een voorcultuur in Todd-Hewitt (Oxoid) bouillon. Culturen van de late log-fase werden verkregen door de voorcultuur in een 1 op 10 verdunning opnieuw in Todd-Hewittbouillon te enten, waarna de groei werd afgebroken zodra de extinctie E=0,5 bedroeg (bij 600 nm). Na centrifugatie (15 min., 4000g) werd het supernatant verwijderd en bewaard voor onderzoek op virulentiefactoren. De pellet werd in PBS pH 7*2 gewassen, waarna de bacteriën werden geresuspendeerd tot een extinctie E=l. Een 1 op 1000 verdunning van deze suspensie werd gebruikt als inoculum. Het kiemgetal (CFU= kolonie vormende eenheden) van het inoculum bedroeg 1*10^ CFU/ml. Voorafgaand aan de inoculatie met S. suis werden de biggen besmet met 10? CFU van Bordetella bronchi -septica, de bereiding van dit inoculum werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (Vecht U., J.P. Arends, E.J. Van der Molen, and L.A.M.G. van Leengoed 1989, Differences in virulence between two strains of Streptococcus suis type II after experimentally induced infection of newborn germ-free pigs, Am. J. Vet. Res. 50:1037-1043)·
Onderzoek van de stammen op virulentiefactoren.
Aangezien MRP behalve in het protoplastensupematant (PPS) tevens in het celcultuursupematant (CS) voorkomt, werd op MRP gescreend in twee celfracties: het PPS, bereid volgens standaardtechnieken (Vossen, J.M.B.M.van der, J. Kok and G. Venema 1985, Construction of cloning, promoter-screening and terminator-screening shuttle vectors for Bacillus subtilis and Lactococcus lactis subsp.lactis, Appl. Envir. Microbiol. 50:5^0-5^2) en het CS. Laatstgenoemde fractie werd tevens op EF onderzocht. Hiertoe werd aan 100 μΐ CS van de late-logfasecultuur 30 μΐ 50 mM TRIS buffer (pH 7*5) en 30 μΐ denaturatiemengsel (2 delen 20% SDS; 0,8 deel β-mercaptoethanol; 1 deel glycerine; 1 deel 0,1 % broomfenolblauw) toegevoegd. Vervolgens werd 5 minuten bij 95°C geïncubeerd. Het eiwit-profiel van het PPS en CS werd vervolgens onderzocht met behulp van SDS PAGE, gevolgd door Western Blotting.
Proefopzet.
De proeven werden uitgevoerd in twee sessies (nos I en II) met een tussenpoos van 5 maanden. In beide sessies werd stam 3 (MRP+ EF+) als de positieve controle en stam 12 (MRP- EF-) als negatieve controle gebruikt. Vijf dagen oude biggen werden intranasaal met 8,4 * 10^ CFU (sessie I) en 1,0 * 1θ7 CFU ( sessie II) van B. bronchiseptica besmet. Twee etmalen later werden de biggen intranasaal besmet met 0,5 ml suspensie in elk neusgat met een van de S. suis-stammen; per isolaatgroep werd een stam gebruikt (zie Tabel B). De inoculatie gebeurde binnen de .steriele isolator .gedurende de inspiratiefase .van .de ademhaling. Het klinisch, hematologisch, pathologisch en bacteriologisch onderzoek werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (Vecht U., J.P. Arends, E.J. Van der Molen, and L.A.M.G. van Leengoed 1989, Differences in virulence between two strains of Streptococcus suis type II after experimentally induced infection of newborn germ-free pigs, Am. J. Vet. Res. 50:1037“1043). Het histologisch onderzoek werd in tegenstelling tot de aangehaalde referentie steeds verricht op weefsels van Centraal Zenuwstelsel (CZS), hart, longen, sereuze vliezen en gewrichten, ongeacht of macroscopisch afwijkingen waren waargenomen of niet. Het fenotype van S. suis type 2 isola-ten uit organen en/of feces werd na afloop van het dierexperiment opnieuw m.b.v. SDS-PAGE en Western blotting vastgesteld.
Resultaten
Voorafgaande aan de inoculaties werd het eiwitprofiel van PPS en CS van de 10 stammen met SDS PAGE gevolgd door Western Blotting vastgesteld. Tabel B geeft de diverse fenotypes.
Klinische symptomen.
a) Lichaamstemperatuur. Op de tweede dag na infectie (Post Inoculation Day = PID) steeg de rectale temperatuur van individuele biggen die met de drie MRP+EF+stammen (Nrs 3. 10 en 22) geïnfecteerd waren, en deze bereikte op PID 4-9 een hoogtepunt met waarden tussen 40,0-4l,8°C. Gedurende het experiment was de gemiddelde temperatuur van de groepen die met de drie MRP+EF+stammen (Nrs 3· 10 en 22) geïnfecteerd waren hoger dan in de groepen die ofwel met de MRP+EF-stammen (nrs 17, 24 en 28) of met de MRP-EF-stammen geïnfecteerd waren (nrs 12, 16, 18 en 25). Dit was het geval in beide sessies (Fig. 15 en 16). Op PID 20 steeg bij biggen van twee groepen nl groep 17 en 24 (MRP+EF-) de lichaamstemperatuur tot boven de 40°C (Fig 16).
b) Aantal leukocyten. Stijging van de lichaamstemperatuur ging gepaard met een stijging van het aantal polymorfkernige leucocyten (PML) in het bloed. Het gemiddeld aantal PML's op PID 8 werd voor de drie fenotypes berekend: MRP+EF+ 26,1 (+ 17,6) * 10^ /L; MRP+EF- 7,0 (+ 6,7) * 1θ9 /L; de MRP-EF- 4,9 (+ 2,3) * 10^ /L. Bij individuele dieren van de groepen die met MRP+ EF+ stammen waren geïnfecteerd werden extreem hoge aantallen PML waargenomen, oplopend tot 70,7 * ÏO^./L. Gedurende het experiment was het gemiddelde aantal PML in de groepen die met de drie MRP+EF+stammen (Nrs 3, 10 en 22) geïnfecteerd waren steeds hoger dan in de overige groepen. Zie voor het verloop Fig. 17 en 18. Na PID 14 was het gemiddelde aantal PML in twee groepen die met de MRP+EF-stammen (nrs 24 en 28) geïnfecteerd waren ook verhoogd. De aantallen PML's in de groepen die met de MRP-EF-stammen (nrs 12,16,18 en 25) geïnfecteerd waren, bleven in beide sessies steeds normaal gedurende de observatieperiode, d.w.z. < 10 * 1θ9 PML/L.
c) Specifieke symptomen. Twee tot drie dagen na inoculatie traden bij alle biggen van de MRP+EF+groepen (3, 10, 22) algemene (aspecifieke) symptomen op: koorts, niet eten, diarree, sloomheid en veel liggen. De morbiditeit was hier 100?». Daarna volgden specifieke symptomen. Vanaf PID 3 trad bij 14/18 dieren van deze biggen (83#) kreupelheid, veelal aan meerdere ledematen, op, hetgeen duidt op polyarthritis. Vanaf PID 5 traden hersenverschijnselen op (ataxie, cirkelbewegingen, opisthotonus, convulsies, trillen, "fiets"bewegingen) bij 12/18 biggen (67%). In enkele gevallen gebeurde dit eerder (PID 3); die biggen stierven dan binnen enkele (2-3) dagen. In de MRP+EF-groepen bleven klinische symptomen uit tot PID 13: drie biggen van groep 24 en een big van groep 28 waren korte tijd (ca 24 uur) lusteloos en aten niet; dit was het geval gedurende de perioden van koorts en leucocytose na PID 20 (Fig. 16 en 18). Biggen van de MRP-EF-groepen vertoonden geen koorts, geen klinische symptomen, en geen leucocytose.
Mortaliteit
Vijf van de 18 dieren uit de MRP+EF+groepen (stamnrs 3» 10 en 22) stierven in de loop van het experiment, hetzelfde aantal werd in verband met een zeer slechte (terminale) conditie geëuthanaseerd. Dit brengt de mortaliteit op 10/17 (59%)· (Een big die overleed ten gevolge van de monstername van intraveneus bloed werd buiten deze berekening gehouden.) De dieren die overleden stierven meestal in de eerste week na infectie in de septichaemische fase, voordat specifieke symptomen optraden. Sterfte in de andere groepen (MRP+EF-; MRP-EF-) kwam niet voor. Pathologie
Pathologische afwijkingen in het centrale zenuwstelsel, de sereuze vliezen, en gewrichten werden voornamelijk waargenomen in groepen geïnfecteerd met stam 3» 10 en 22 (MRP+EF+), zoals te zien is in de tabellen C en D. Afwijkingen in het centrale zenuwstelsel betrof meningitis (12/18), encephalitis (9/18) en chorioiditis. Vier biggen hadden malacie van de hersenschors. Afwijkingen van de sereuze vliezen waren fibrineuze peritonitis, pericarditis en pleuritis (16/18). Bij de meeste dieren (I5/I8) werden deze afwijkingen in combinatie met arthritis aangetroffen: polyserositis, bij slechts enkele afzonderlijk. Onstekingsbeelden in het CSZ waren rondcellig, segmentkernig ofwel gemengd. Ook in de onstekingsbeelden van de sereuze vliezen waren een of beide celtypes aanwezig, vaak met opruiming en reorganisatie door fibroangioblasten. Bij biggen die met MRP+EF-stammen (nrs 17. 24 en 28) geïnfecteerd waren werd eenmaal encephalitis en eenmaal pericarditis gediagnostiseerd (2/12). Bij een big uit de MRP-EF-groepen (1/22) (stam nr 16, big nr 255) werd een geringe locale epicarditis gediagnostiseerd. Bij biggen van alle groepen werden diverse pathohistologische afwijkingen in de longen gediagnostiseerd. Deze bleken niet gerelateerd aan MRP en/of EF in de gebruikte stam. De long en de tonsil waren de enige organen van-waaruit Bordetella bvonchiseptica teruggeïsoleerd kon worden. De tendens bestond dat het afweerapparaat van biggen geïnoculeerd met MRP+ EF+ stammen minder actief was dan dat van biggen uit de MRP+EF- en MRP-EF-groepen. De laatste vertoonden in de milt vaker een geactiveerde witte pulpa (Wp) met follikelvorming in het B-celgebied en een blastair celbeeld met follikelvorming in het T-celgebied (de peri-arteriele lymfocytenschede, PALS): biggen van MRP+EF+groepen: geactiveerde Wp: 2/18 (11%) biggen van MRP+EF-groepen: geactiveerde Wp: 6/12 (50%) biggen van MRP-EF-groepen: geactiveerde Wp: 6/22 (27%)
Dit wijst erop dat MRP+EF- en MRP-EF-stammen het immuunapparaat van biggen beter stimuleren dan MRP+EF+stammen.
Bacteriologische bevindingen.
Zowel in sessie I als in sessie II werd enkel uit de organen van biggen van MRP+EF+groepen: 3. 10 en 22, Streptococcus suis type 2 geïsoleerd. Bovdetella bvonchiseptica werd niet uit organen geïsoleerd met uitzondering van de tonsillen en longen van biggen uit diverse groepen. (Zie de tabellen E en F: Isolaties van Streptococcus suis type 2 uit diverse organen).
Conclusie
De conclusie is dat stammen van Streptococcus suis type 2 met het fenotype MRP+EF+ voor jonge biggen duidelijk pathogeen zijn, dat stammen met het fenotype MRP+EF- zwak pathogeen zijn en dat stammen met het fenotype MRP-EF- niet pathogeen zijn.
Bereiding sera — Polyclonale antistoffen (PAb) gericht tegen MRP en EF werden geproduceerd in konijnen. — Monoclonale antistoffen (MAb) werden bereid in muizen. Hiertoe werd het supernatant van een vroeg— stationaire cultuur van stam D-282 in Todd-Hewittbouillon geconcentreerd d.m.v. filtratie (Amicon PM30 filters, Amicon Coop., Danvers MA, USA) tot 3 mg/L en gedialyseerd tegen TRIS-buffer (50 mM TBS, PH 7,5). Dit werd gebruikt als antigeen voor de productie van anti-MRP en anti-EF MAb. Van het antigeen werden emulsies bereid met gelijke volumina Freund's incompleet adjuvans (FIA). 0,5 ml antigeen met 25 pg eiwit werd intraperitoneaal aan de muizen toegediend. Deze-procedure werd na 3 weken herhaald. Op week 5 kregen de muizen een booster-vaccinatie met dezelfde dosis antigeen zonder FIA. Hybridomacellen werden bereid en getest op antistofproduktie zoals eerder beschreven (Zijderveld, F.G. van, F. Westenbrink, J. Anakotta, R.A.M. Brouwers and A.M. van
Zijderveld 1989. Characterization of the F4l Fimbrial Antigen of Entero-toxigenic Eschericia coli by Using Monoclonal Antibodies, Inf. and Imm. 57:1192-1199)· Na groei gedurende 10-14 dagen werd productie van MAb tegen MRPcq. EF in supernatanten van de hybridomacelcultures getest in een indirecte ELISA. Hiertoe werden polystyreen microtiterplaatjes (Greiner, Nurtingen, FRG) gecoat met geconcentreerd cultuursupernatant (verdund 1:40 in PBS pH 7,2) van stam D-282 en daarna gedurende 16 uur bij 37°C geïncubeerd. Tweevoudige verdunningen van de supernatanten van de hybridomacultuur werden opgebracht. Gebonden antilichamen werden geïncubeerd met anti-muis immunoglobulinen (verdund 1:500), geconjugeerd met HRPO (Horse Radish Peroxidase, Nordic, Tilburg). De aanwezigheid van anti-MRP dan wel anti-EF MAb in de hybridomacultuursupernatan-ten (verdund 1:2) werd aangetoond met Western blots van cultuursuperna-tanten van stam D-282. Zie figuur 19 en de bijbehorende beschrijving. De cellen in positieve cupjes werden gedoneerd met behulp van de "limiting dilution" methode in microtiterplaatjes. De positieve monoclonale cellijnen werden gebruikt om ascitesvloeistof te produceren in met pristaan voorbehandelde mannelijke BALB/c muizen. Van elke cellijn werden batches van ascitesvloeistof aangelegd. De antistoffen werden gezuiverd met ammoniumsulfaat-precipitatie (35“40# verzadiging) en gedialyseerd tegen PBS. De gezuiverde MAb’s werden op een concentratie van 8 mg eiwit/ml gebracht en bij -70°C opgeslagen.
Tabel B.
Fenotype, herkomst en inoculumgrootte Streptococcus suis type 2 stammen stam fenotype sessie herkomst aantal inoculum no biggen (CFU) 3 MRP+EF+ I (II) Meningitis big 5 1,8 * 10^ 10 MRP+EF+ I tonsil varken 5 1,5 * 10® 12 MRP-EF- I (II) tonsil varken 5 1,1 * 106 16 MRP-EF- I tonsil varken 4 7.0 * 10^ l8 MRP-EF- I tonsil varken 4 1,1 * 10° 25 MRP-EF- I humane patient 5 9.7 * 10-j 3 MRP+EF+ II (I) Meningitis big 4 2,0 * 10° 22 MRP+EF+ II humane patient 4 3,0 * 10° 12 MRP-EF- II (I) tonsil varken 4 0,9 * 10° 17 MRP+EF- II tonsil varken 4 1,3 * 10° 24 MRP+EF- II humane patient 4 1,2 * 10° 28 MRP+EF- II humane patient 4 1,2 * 10°
Tabel C.
HISTOPATHOLOGISCHE BEVINDINGEN. Sessie I.
Lesies
Big No CZS Longen Serosae Milt Gewr Lever Tons
Groep 232 Ml,M3 - Pl.Pe, Wp.Rp 2 Ppf E+ M+EF+ 233# Ml,M2+,Ch PBP 5 E2.M12 stam 3 235 Ml-3 IP+ Pe.Ep Rp - Mif 236 - IP+ PI,Pe.Ep - 1 Mpp+if - 237 - - Pc 2 if F+
Groep 238# Ml-4,Ch AFP Pe.Pc - 1 Ppf M+EF+ E1-3.M11 239# - ACB+IP+ Pe - 2 Pp+if -
stam 10 241# X ΙΡ+,ΗΜ Pc.Ep, - 1 - X
Pe.Pl 242 - IP Pc.Ep Wp 1 - F+E+
Pe.Pl
243# M1-4.M12 IP+ Pe+ Rp 8 X
El-4
Groep 244 - IP - M-EF 246 - - - Wp - - F+E+ 247 - (P)B,IP - - stam 12 248 - (P)B,DP - - F+E+ 249 - _____ F+E+
Groep 251 - - - Rp - - F+E+ M-EF- 252 - - - - F+E+
stam l8 253 " - - - - - X
254 - - - X
Groep 256 - - - Rp - - X
M-EF- 257 ~ - - Rp - - F+
stam 25 258 - - - Wp,Rp - - X
259 - - - _ 26Ο - - - - F+E+
Groep 234 - IP? - Wp M-EF- 245 - - - Wp - - F+
stam 16 25Ο - IP Wp - - X
255 “ - Ep+ - F+E+
Tabel D.
HISTOPATHOLOGISCHE BEVINDINGEN. Sessie II.
Lesies
Big No CZS Longen Serosae Milt Gewr Lever Tons
Groep 709J Ml-4,Ch2 - Pc Rp Mif F+ M+EF+ E2-3 stam 3 710 - - Pe,Pc 5 PP F+E+ 711# Ml-4,Ch3 - X 3 E1.2+.4.M12 712# Ml-3,Ch3 - Pe - 4
El-4
Groep 713j X X X X 7 X X
M+EF+ stam 22 714# Ml-4,Ch3 - Ep - 5
El-4 715+ Ml-4 AFP Pe.Ep - 8 Mif
El IP
716# Ml,2,4 AFP Ep.Pe(loc)- - Mif X
E4 (3*)
Groep 717 - - - F+ M+EF- 718 - IP+ Wp - - stam 17 719 - IP+ - Wp - pp+ F+E+
720 - - - X
Groep 721 - IP+ - Wp - if F+ M+EF- 722 E2+ - - Wp Mif,pp F+E+ stam 24 723 “ - - - if,PP F+E+ 724 - IP+ - pp
Groep 725 “ - - Wp - pp F+ M+EF- 726 - - - Wp - pp F+E+ stam 728 - PB+ - - - pp F+ 728 - IP Pe F+E+
ACB
Groep 729 - - - - - if F+ M-EF- 730 - - - - - if F+ stam 12 731 - PB,IP - F+ ACB+
732 - Wp if,PP
# = gestorven + = afgemaakt in verband met slechte conditie 3* = verlengde merg afwezig - = geen afwijkingen X = niet onderzocht
Verklaring bij tabellen C en D.
CZS: Centrale Zenuwstelsel M = Meningitis E = Encephalitis 1: Grote hersenen 2: Kleine hersenen 3: Verlengde merg 4: Pons/Mesencephalon Ml = malacie
Longen: ACB = acute catharrhale bronchopneumonie IP = interstitiele pneumonie AFP = acute fibrineuze pneumonie DP = desquamatieve pneumonie (P)B = (peri)bronchiolitis HM = hyaliene membraanvorming
Serosa: PI = pleuritis Pe = peritonitis
Ep = epicarditis Pc = pericarditis
Lever:
Pp = periportaal Mif= Miliaire intralobulaire foei i = intralobulair f = foei
Milt:
Wp = actieve witte pulpa Rp = actieve rode pulpa Tonsil: F+= actieve follikels in tonsil E+ = exudatie in crypten
Tabel E.
ISOLATIE VAN STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 UIT DIVERSE ORGANEN sessie I groep big nr CZS Long Organen Synovia Hart Tonsil M+3 232 + - - (1)* - + 233 + + - +(8) - + 235 + - - - - + 236 237 - + - +(2) - + M+10 238 + - - +(2)- + 239 " + +N** +(2) + + 241 + - +N +(3)- + 242 - - +(1) + + 243 + - +N +(2)- + M-12 244 ----- + 246 ----- + 247 ----- + 248 ----- + 249 ----- + M-16 234 ----- + 245 ----- + 250 ----- + 255 ----- + M-18 251 ----- + 252 ----- + 253 - - - - - 254 ----- + M-25 256 ----- + 257 ----- + 258 ----- + 259 - + - - - + 260 ----- + ** N = nier.
Tabel F.
ISOLATIE VAN STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 UIT DIVERSE ORGANEN sessie II
groep big nr CZS Long Organen Synovia* Hart Perit. Tonsil M+EF+ 709 + Bb + + + 710 + + - - - - + 3 711 + Bb/+ +(1) + (4) + 712 + - +(3) +(5) M+EF+ 713 + Bb + + 22 714 + Bb +(7)- + + 715 + Bb/+ +(2) +(16) + - + 716 + + +(2) +(16) + + + M+EF- 717 + 17 718 + 719 - + + 720 + + M+EF- 721 - +(1)- + 24 722 - - - +(1) + 723 - 724 + M+EF- 725 - - +(1)-- + 28 726 - - - - + 727 - - - - - 728 - - - - + M-EF- 729 - - - - + 12 730 - Bb - - + 731 - - 732 - Bb - - + * Betreft (meta)carpaal, (meta)tarsaal, elleboog, knie, boeg en heupgewrichten. Tussen haakjes staat het aantal BO positieve gewrichten.
** Perit. = peritoneum
Claims (20)
1. Toepassing van een DNA-sequentie uit het gen dat codeert voor een kenmerk van virulentie van Streptococcus suis, voor de diagnose van of de bescherming tegen een infectie met S. suis bij zoogdieren, waaronder de mens.
2. DNA-sequentie van het gen dat in virulente stammen van Streptococcus suis codeert voor een polypeptide van 90-000 - 120.000 dalton en dat in niet-virulente stammen van Streptococcus suis codeert voor een polypeptide dat een hoger molecuulgewicht heeft dan het eerdergenoemde polypeptide en dat eerdergenoemde polypeptide in hoofdzaak omvat, welke sequentie/welk gen voor S. suis serotype 2 stam D-282 de nucleotiden-volgorde volgens figuur 1 heeft, of een overeenkomstige sequentie of een deelsequentie daarvan.
3. DNA-sequentie van het gen dat codeert voor een polypeptide van 135-000 - I36.OOO dalton (Muramidase Released Protein) dat een kenmerk van virulentie van Streptococcus suis is, welke sequentie/welk gen voor S. suis serotype 2 stam D-282 de nucleotidenvolgorde volgens figuur 2 heeft, of een overeenkomstige sequentie of een deelsequentie daarvan.
4. DNA-sequentie volgens conclusie 2, die codeert voor een deel van het polypeptide met het hogere molecuulgewicht welk deel niet overeenkomt met het polypeptide van 90.000-120.000 dalton, of een deelsequentie daarvan.
5- Recombinant polynucleotide dat een sequentie volgens een der conclusies 2-4 in aanwezigheid van een regulerende sequentie omvat.
6. Polynucleotideprobe voor de diagnose van een infectie met Streptococcus suis, welke een sequentie volgens een der conclusies 2-4 omvat.
7. Polypeptide dat hetzij wordt gecodeerd door, hetzij kan worden verkregen door expressie van, een sequentie volgens een der conclusies 2-5-
8. Antilichaam opgewekt tegen een polypeptide volgens conclusie 7.
9. Werkwijze voor het opsporen van een besmetting met een patho-gene stam van Streptococcus suis, met het kenmerk dat men ten minste een probe volgens conclusie 6 gebruikt.
10. Werkwijze volgens conclusie 9» waarbij ..men ten minste een probe met een sequentie volgens conclusie 2 of 4 gebruikt.
11. Werkwijze voor het opsporen van een besmetting met een patho-gene stam van Streptococcus suis, met het kenmerk dat men ten minste een polypeptide volgens conclusie 7-
12. Werkwijze voor het opsporen van een besmetting met een patho-gene stam van Streptococcus suis, met het kenmerk dat men ten minste een antilichaam volgens conclusie 8 gebruikt.
13. Diagnosekit voor het opsporen van een besmetting met een pathogene stam van Streptococcus suis, met het kenmerk dat deze ten minste een probe volgens conclusie 6 bevat.
14. Diagnosekit voor het opsporen van een besmetting met een pathogene stam van Streptococcus suis, met het kenmerk dat deze ten minste een polypeptide volgens conclusie 7 bevat.
15. Diagnosekit voor het opsporen van een besmetting met een pathogene stam van Streptococcus suis, met het kenmerk dat deze ten minste een antilichaam volgens conclusie 8 bevat.
16. Werkwijze voor het beschermen van zoogdieren tegen infectie met Streptococcus suis, met het kenmerk dat men een polynucleotide volgens een der conclusies 2-5, een polypeptide volgens conclusie 7 of een antilichaam volgens conclusie 8 gebruikt.
17. Werkwijze voor het beschermen van zoogdieren tegen infectie met Streptococcus suis, met het kenmerk dat men ten minste een polypeptide volgens conclusie 7 waarin de voor virulentie verantwoordelijke delen ontbreken, gebruikt.
18. Vaccin dat zoogdieren bescherming biedt tegen een infectie met Streptococcus suis, dat een polynucleotide volgens conclusie 5 in een expressiesysteem, een polypeptide volgens conclusie 7 of een antilichaam volgens conclusie 8 bevat.
19. Vaccin dat zoogdieren bescherming biedt tegen een infectie met Streptococcus suis, dat een bij de werkwijze volgens conclusie 17 toegepast polypeptide bevat.
20. Vaccin dat zoogdieren bescherming biedt tegen een infectie met Streptococcus suis, dat een materiaal van een stam van Streptococcus suis dat ten minste een polypeptide volgens conclusie 7 niet tot expressie brengt, bevat.
Priority Applications (14)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9100510A NL9100510A (nl) | 1991-03-21 | 1991-03-21 | Dna-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en antilichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met s. suis bij zoogdieren, waaronder de mens. |
| NZ242037A NZ242037A (en) | 1991-03-21 | 1992-03-18 | Dna sequence coding for virulence characteristics of streptococcus suis, polypeptides, antibodies and their use in diagnosis or protection against s.suis infection |
| DE69214277T DE69214277T2 (de) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | Dna-sequenzen, die für die virulente eigenschaft von -i(streptococcus suis) kodieren, und teile davon, polypeptide und antikörper die sich davon ableiten und deren verwendung für diagnose und prophylaxe der infektion mit streptococcus suis in säugetieren, insbesondere in menschen |
| JP4507787A JP2776633B2 (ja) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | ストレプトコッカス・スイスの病毒性をコードするｄｎａ配列，該ｄｎａ配列の一部，該ｄｎａ配列に由来するポリペプチドおよび抗体 |
| DK92908242.8T DK0575497T3 (da) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | DNA-sekvenser, som koder for viruskarakteristika af Streptococcus suis og dele deraf, polypeptider og antistoffer afledt deraf og anvendelse deraf til diagnose af og beskyttelse mod infektion med S. suis i pattedyr, herunder mennesker |
| AU15464/92A AU659637B2 (en) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | DNA sequences which code for virulence characteristics of STREPTOCOCCUS SUIS and parts thereof, polypeptides and antibodies derived therefrom and the use thereof for the diagnosis of and protection against infection by S. SUIS in mammals, including man |
| ES92908242T ES2094907T3 (es) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | Secuencias de adn que codifican para caracteristicas de virulencia de -s(streptococcus suis) y partes del mismo, polipeptidos y anticuerpos derivados de este y su uso para la diagnosis y la proteccion contra la infeccion por -s(s. suis) en mamiferos, incluyendo el ser humano. |
| PCT/NL1992/000054 WO1992016630A1 (en) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | Dna sequences which code for virulence characteristics of streptococcus suis and parts thereof, polypeptides and antibodies derived therefrom and the use thereof for the diagnosis of and protection against infection by s. suis in mammals, including man |
| AT92908242T ATE143693T1 (de) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | Dna-sequenzen, die für die virulente eigenschaft von -i(streptococcus suis) kodieren, und teile davon, polypeptide und antikörper die sich davon ableiten und deren verwendung für diagnose und prophylaxe der infektion mit streptococcus suis in säugetieren, insbesondere in menschen |
| EP92908242A EP0575497B1 (en) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | Dna sequences which code for virulence characteristics of -$(streptococcus suis) and parts thereof, polypeptides and antibodies derived therefrom and the use thereof for the diagnosis of and protection against infection by -$(s. suis) in mammals, including man |
| CA002105057A CA2105057C (en) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | Dna sequences which code for virulence characteristics of streptococcus suis and part thereof polypeptides and antibodies derived therefrom and the use thereof for the diagnosis of and protection against infection by s. suis in mammals, including man |
| US08/119,125 US5610011A (en) | 1991-03-21 | 1992-03-19 | Virulence-encoding DNA sequences of Strepococcus suis and related products and methods |
| CN92101913A CN1055500C (zh) | 1991-03-21 | 1992-03-21 | 编码猪链球菌毒性特征的ｄｎａ序列及衍生的多肽和抗体 |
| GR960403484T GR3022052T3 (en) | 1991-03-21 | 1996-12-17 | Dna sequences which code for virulence characteristics of --(streptococcus suis) and parts thereof, polypeptides and antibodies derived therefrom and the use thereof for the diagnosis of and protection against infection by --(s. suis) in mammals, including man |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9100510A NL9100510A (nl) | 1991-03-21 | 1991-03-21 | Dna-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en antilichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met s. suis bij zoogdieren, waaronder de mens. |
| NL9100510 | 1991-03-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9100510A true NL9100510A (nl) | 1992-10-16 |
Family
ID=19859048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9100510A NL9100510A (nl) | 1991-03-21 | 1991-03-21 | Dna-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en antilichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met s. suis bij zoogdieren, waaronder de mens. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5610011A (nl) |
| EP (1) | EP0575497B1 (nl) |
| JP (1) | JP2776633B2 (nl) |
| CN (1) | CN1055500C (nl) |
| AT (1) | ATE143693T1 (nl) |
| AU (1) | AU659637B2 (nl) |
| CA (1) | CA2105057C (nl) |
| DE (1) | DE69214277T2 (nl) |
| DK (1) | DK0575497T3 (nl) |
| ES (1) | ES2094907T3 (nl) |
| GR (1) | GR3022052T3 (nl) |
| NL (1) | NL9100510A (nl) |
| NZ (1) | NZ242037A (nl) |
| WO (1) | WO1992016630A1 (nl) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6015889A (en) * | 1993-03-19 | 2000-01-18 | Gunnar Lindahl | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group B streptococcus: process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition |
| US5726016A (en) * | 1995-01-18 | 1998-03-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for diagnosis of diseases associated with actinobacillus actinomycetemcomitans infection |
| DE69621776T2 (de) * | 1995-01-30 | 2003-01-30 | Lunamed Ag Bottmingen | Antitumorpräparate, die eine lipoteichonsäure aus streptococcus enthalten |
| CA2341268C (en) | 1998-07-22 | 2010-10-12 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests |
| EP1205552A1 (en) | 2000-11-09 | 2002-05-15 | ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. | Virulence of streptococci, involving ORFs from Streptococcus suis |
| US6905816B2 (en) * | 2000-11-27 | 2005-06-14 | Intelligent Medical Devices, Inc. | Clinically intelligent diagnostic devices and methods |
| EP1368373B1 (en) * | 2001-02-02 | 2011-04-27 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Environmentally regulated genes, involved in the virulence of streptococcus suis |
| CA2620774C (en) * | 2005-09-02 | 2019-02-12 | Universite De Montreal | Streptococcus suis polypeptides and polynucleotides encoding same and their use in vaccinal and diagnostic applications |
| CN100388952C (zh) * | 2006-04-25 | 2008-05-21 | 范红结 | 一种链球菌重组亚单位疫苗及其制备方法 |
| CN100449005C (zh) * | 2006-06-29 | 2009-01-07 | 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 | 应用于猪链球菌2型致病性检测的多重荧光pcr检测试剂及方法 |
| CN100449006C (zh) * | 2006-08-10 | 2009-01-07 | 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 | 应用于猪链球菌2型胞外因子(ef)荧光pcr检测的引物和探针序列 |
| EP2023143A1 (en) * | 2007-08-06 | 2009-02-11 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Immunogenic streptococcus proteins |
| CN101613399B (zh) * | 2008-06-25 | 2012-11-28 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种猪链球菌2型表面蛋白、其制备方法及用途 |
| CN101613402B (zh) * | 2008-06-25 | 2012-11-28 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种猪链球菌2型表面蛋白、其制备方法及用途 |
| CN101613400B (zh) * | 2008-06-25 | 2012-11-28 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种猪链球菌2型表面细胞壁蛋白、其制备方法及用途 |
| US9655962B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-05-23 | Camas Incorporated | Methods and compositions for reducing microorganisms in the oropharynx, nasopharynx and oral cavities |
| CN104762244B (zh) * | 2015-02-04 | 2017-09-15 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株及其构建方法与应用 |
| CN107805660B (zh) * | 2017-12-08 | 2021-11-26 | 江汉大学 | 一种猪链球菌小种分离鉴定方法 |
| GB2587228B (en) * | 2019-09-20 | 2021-10-27 | Protein Ark Ltd | Biological sample purification apparatus, use of the same, and systems comprising the same |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4784948A (en) * | 1983-08-10 | 1988-11-15 | The Rockefeller University | Production of streptococcal m protein immunogens and molecular probes |
| CA2009708A1 (en) * | 1989-02-13 | 1990-08-13 | Jane D. Madonna | Nucleic acid probe for the detection of salmonella human pathogens |
-
1991
- 1991-03-21 NL NL9100510A patent/NL9100510A/nl not_active Application Discontinuation
-
1992
- 1992-03-18 NZ NZ242037A patent/NZ242037A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-19 DE DE69214277T patent/DE69214277T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-19 ES ES92908242T patent/ES2094907T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-19 EP EP92908242A patent/EP0575497B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-19 AT AT92908242T patent/ATE143693T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-03-19 WO PCT/NL1992/000054 patent/WO1992016630A1/en active IP Right Grant
- 1992-03-19 JP JP4507787A patent/JP2776633B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-19 DK DK92908242.8T patent/DK0575497T3/da active
- 1992-03-19 CA CA002105057A patent/CA2105057C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-19 AU AU15464/92A patent/AU659637B2/en not_active Ceased
- 1992-03-19 US US08/119,125 patent/US5610011A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-21 CN CN92101913A patent/CN1055500C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-12-17 GR GR960403484T patent/GR3022052T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU659637B2 (en) | 1995-05-25 |
| CN1065490A (zh) | 1992-10-21 |
| JP2776633B2 (ja) | 1998-07-16 |
| EP0575497B1 (en) | 1996-10-02 |
| DE69214277D1 (de) | 1996-11-07 |
| ATE143693T1 (de) | 1996-10-15 |
| EP0575497A1 (en) | 1993-12-29 |
| ES2094907T3 (es) | 1997-02-01 |
| CN1055500C (zh) | 2000-08-16 |
| AU1546492A (en) | 1992-10-21 |
| CA2105057C (en) | 2000-05-02 |
| NZ242037A (en) | 1997-03-24 |
| CA2105057A1 (en) | 1992-09-22 |
| JPH06505390A (ja) | 1994-06-23 |
| WO1992016630A1 (en) | 1992-10-01 |
| DK0575497T3 (da) | 1996-11-18 |
| DE69214277T2 (de) | 1997-03-20 |
| GR3022052T3 (en) | 1997-03-31 |
| US5610011A (en) | 1997-03-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL9100510A (nl) | Dna-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en antilichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met s. suis bij zoogdieren, waaronder de mens. | |
| Leung et al. | The yopM gene of Yersinia pestis encodes a released protein having homology with the human platelet surface protein GPIb alpha | |
| Vecht et al. | Identification of two proteins associated with virulence of Streptococcus suis type 2 | |
| US7670835B2 (en) | Virulence of streptococci | |
| Busque et al. | Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. | |
| Vishwanath et al. | A recombinant Rickettsia conorii vaccine protects guinea pigs from experimental boutonneuse fever and Rocky Mountain spotted fever | |
| TW494103B (en) | Vaccine against Streptococcus suis infection | |
| US20080241181A1 (en) | Environmentally regulated genes of Streptococcus suis | |
| Lepper et al. | The protective efficacy of cloned Moraxella bovis pili in monovalent and multivalent vaccine formulations against experimentally induced infectious bovine keratoconjunctivitis (IBK) | |
| CN1798574B (zh) | 无荚膜的多杀巴斯德氏菌hyaE缺失型突变株 | |
| ES2260804T3 (es) | Mutante de la toxina estreptococica c y metodos de uso. | |
| CN1226414C (zh) | 乳房链球菌的camp因子 | |
| JPH05507208A (ja) | 線虫ワクチン | |
| US3422188A (en) | Tissue culture hog cholera vaccine | |
| PT1914239E (pt) | BACTéRIAS GRAM-NEGATIVAS ATENUADAS | |
| Schoepe et al. | Neutralization of hemolytic and mouse lethal activities ofC. perfringensalpha-toxin need simultaneous blockade of two epitopes by monoclonal antibodies | |
| JP2001504335A (ja) | ストレプトコッカス・ユベリスのラクトフェリン結合タンパク質 | |
| NAGAI et al. | hlyIA-like sequence present in a genetic locus with low homology to appA in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 10 | |
| DE69935080T2 (de) | Gruppe-b-streptococcus-proteine und deren verwendung | |
| Carberry-Goh | Genetic and immunologic analysis of bovine Streptococcus agalactiae surface antigen Sas97/104 | |
| Kariuki | Studies on calf diseases special reference to infection escherichia coli | |
| Gorton | Physical mapping of the genome and elucidation of variable proteins of Mycoplasma gallisepticum | |
| Shewen | Immunology of bacterial infections | |
| MXPA05014008A (en) | Acapsular p. multocida hyae | |
| JPH07138185A (ja) | ｌｈａＡ遺伝子産物を有効成分として含有するアクチノバチルス（ヘモフィルス） プルロニューモニエ感染症ワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |