ES2260804T3 - Mutante de la toxina estreptococica c y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION, QUE SE REFIERE A UNAS TOXINAS ESTREPTOCOCOS C (SPE - C) MUTANTES O A SUS FRACCIONES, SE REFIERE TAMBIEN A UNAS VACUNAS Y COMPOSICIONES DE USO FARMACEUTICO ASI COMO A LOS PROCEDIMIENTOS DE USO DE DICHAS VACUNAS Y COMPOSICIONES. LA TOXINA SPE - C PREFERIDA DE LA INVENCION, QUE TIENE, POR LO MENOS, UNA MODIFICACION AMINOACIDA, NO TIENE INCIDENCIA LETAL, A LA INVERSA DE LA TOXINA SPE - C DE TIPO SALVAJE. ESTAS TOXINAS MUTANTES PUEDEN ENTRAR EN UNAS COMPOSICIONES VACUNALES EFICACES EN MATERIA DE PROTECCION CONTRA LAS ACTIVIDADES DE CARACTER BIOLOGICO DE LA TOXINA SPE - C DE TIPO SALVAJE EN EL ANIMAL.

Description

Mutante de la toxina estreptocócica C y métodos de uso.

El Streptococcus pyogenes, también conocido como estreptococo \beta-hemolítico del grupo A (GAS) es un microorganismo patógeno que puede provocar infecciones leves tal como la faringitis y el impétigo. Pueden producirse complicaciones autoinmunitarias post infecciosas, principalmente fiebre reumática y glomerulonefritis aguda. Los GAS también provocan enfermedades agudas graves tales como la escarlatina y el síndrome de choque tóxico estreptocócico (STSS). Las infecciones graves por GAS significaron un importante problema en los EE.UU. y en todo el mundo a principios de este siglo. A mediados de la década de los cuarenta, el número de casos y su gravedad disminuyó regularmente por motivos no comprendidos completamente. Sin embargo, más recientemente, un rebrote de patologías graves provocadas por los GAS ha ocasionado de 10.000 a 20.000 casos de STSS por año en los Estados Unidos. Entre el 50 y el 60% de dichos pacientes presentarán fascitis necrosante y miositis; entre el 30 y el 60% perecerán y se tendrá que amputar alguna extremidad a aproximadamente la mitad de los supervivientes.

En 1986 y 1987 dos informes describieron un brote epidémico de infecciones graves por GAS ubicadas en la zona de las Montañas Rocosas. Tras dichos informes en los últimos años han aparecido varios más describiendo una enfermedad que presentaba un cuadro clínico análogo. Los síntomas descritos para dicha enfermedad eran muy similares a los descritos para el síndrome de choque tóxico (TSS) y en 1992 un comité de científicos otorgó a dicho cuadro clínico el nombre formal de STSS y estableció los criterios para su diagnóstico. El STSS se define por la presencia de los siguientes:

1.

hipotensión y choque;

2.

aislamiento de estreptococos del grupo A:

3.

dos o más de los siguientes síntomas: fiebre de 38,5ºC o superior, exantema escarlatiniforme, vómitos y diarrea, disfunción hepática y renal, síndrome de dificultad respiratoria aguda, coagulación intravascular difusa, fascitis necrosante y/o miositis, bacteriemia.

Las colonias bacterianas de estreptococos obtenidas de los pacientes con el STSS predominantemente son del tipo M1 y M3, con M18 y organismos inclasificables constituyendo la mayor parte del resto. La mayoría de los M1, M3, M18 y de los organismos inclasificables asociados al STSS producían la exotoxina pirógena de tipo A (aproximadamente el 75%) con el resto de las colonias bacterianas produciendo la exotoxina pirógena de tipo C (SPE-C). Además, la administración de la SPE-C a un modelo animal de conejo y en inoculaciones accidentales en humanos puede reproducir los síntomas del STSS. Aparte de la asociación de la SPE-C al STSS los estudios realizados han demostrado que las colonias bacterianas de estreptococos obtenidas del grupo A a partir de pacientes con fiebre reumática y psoriasis en gotas producen la SPE-C.

La SPE-C consiste en un único péptido con un peso molecular equivalente a 24.000 daltonios. El gen del SPE-C, speC, ha podido clonar y expresarse con éxito en Escherichia coli. La SPE-C forma parte de una amplia familia de exotoxinas producidas por estreptococos y estafilococos, a las que se hace referencia como toxinas pirógenas sobre la base de su capacidad para producir fiebre y aumentar la susceptibilidad del hospedador a la endotoxina unas 100.000 veces.

Recientemente, se ha hecho referencia a dichas toxinas como superantígenos debido a su capacidad para provocar la proliferación masiva de linfocitos T, independientemente de su especificidad antigénica, y de un modo dependiente de la composición de la parte variable de la cadena \beta del receptor de los linfocitos T. Dichas toxinas también estimulan la liberación masiva de IFN-\gamma, IL-1, TNF-\alpha y TNF-\beta. Otros miembros de dicha familia son las exotoxinas estreptocócicas pirógenas de tipo A y B, la toxina 1 del síndrome de choque tóxico estafilocócico, las enterotoxinas estafilocócicas A, B, Cn, D, E, G y H, y las exotoxinas pirógenas estreptocócicas que no pertenecen al grupo A. Dichas toxinas presentan unas propiedades bioquímicas similares, actividades biológicas y diversos grados de similitud en la
secuencia.

Las manifestaciones más graves del STSS consisten en la hipotensión y el choque, que conducen a la muerte. En general se cree que la pérdida de fluido desde el espacio intravascular al intersticial es la causa final de la hipotensión, confirmado por la observación de que el tratamiento de sustitución de fluidos resulta eficaz en la prevención del choque en el modelo con conejos descrito anteriormente. Se ha planteado la hipótesis de que la SPE-C puede actuar de distintos modos en el hospedador para provocar dicha patología.

Se ha demostrado que la SPE-C bloquea la eliminación de las endotoxinas de origen endógeno de la flora, al alterar la actividad de las células hepáticas de Kuppfer. Ello parece provocar un aumento significativo de la endotoxina circulante que al unirse a la proteína de enlace con los lipopolisacáridos (LBP) y la señalización del CD14 produce la activación de los macrófagos con la posterior liberación de TNF-\alpha y otras citocinas. La confirmación del papel de la endotoxina en la enfermedad viene dada por el descubrimiento de que los efectos letales de la SPE-C pueden neutralizarse, al menos en parte, mediante la administración a animales de polimixina B o utilizando conejos sin patógenos.

Otra modalidad de inducción de choque podría consistir en la actividad directa de la toxina en las células endoteliales de los capilares. Dicha hipótesis sería el resultado del descubrimiento de que la toxina pirógena estafilocócica TSST-1 se une directamente con las células de las venas del cordón umbilical en humanos y que resulta citolítica para las células endoteliales aórticas porcinas aisladas.

Otra modalidad de acción de la toxina comprende su superantigenicidad, por la que la toxina interactúa con los linfocitos T del hospedador y los activa hasta el 50%. Esta estimulación masiva de linfocitos T provoca un nivel anormalmente alto de citocinas circulantes TNF-\beta e INF-\gamma que actúan directamente sobre los macrófagos provocando la liberación de TNF-\alpha e IL-1. Dichas citocinas también pueden producirse directamente a partir de los macrófagos por la SPE-C mediante su unión y señal con el MHC (complejo principal de histocompatibilidad) de clase II en ausencia de linfocitos T. Los niveles elevados de TNF-\alpha y TNF-\beta provocan diversos efectos que habitualmente se producen en el choque provocado por gramnegativos, entre los que se encuentran las lesiones en las células endoteliales y las pérdidas en los capilares. Sin embargo, la administración de SPE-A a conejos tratados con ciclosporina A, que bloquea la sobrerregulación de la IL-2 y la proliferación de los linfocitos T, no protegió los animales contra el choque, sugiriendo que los mecanismos adicionales pueden resultar más importantes para causar las pérdidas
capilares.

Goshorn et al., en Infec. Immun. 56(9): 2518 - 2520 (1988) dan a conocer la secuencia de nucleótidos del gen speC y la secuencia de aminoácidos de la exotoxina pirógena estreptocócica de tipo C. Kline et al. en Infec. Immun. 64(3): 861 - 869 (1996) analizan la actividad superantigénica de las formas mutante y alélica de la exotoxina pirógena estreptocócica A.

De este modo, nos encontramos con la necesidad de localizar zonas de la molécula de la SPE-C responsables de las distintas actividades biológicas. Se necesita crear variantes de la SPE-C que presenten cambios en las actividades biológicas tales como la toxicidad y la mitogenia. Hay la necesidad de crear composiciones útiles para vacunas destinadas a prevenir o mejorar el síndrome de choque tóxico estreptocócico. También hay la necesidad de crear fármacos útiles en el tratamiento del síndrome de choque tóxico estreptocócico y otras enfermedades.

Sumario de la invención

La presente invención comprende toxinas mutantes de la SPE-C y fragmentos de las mismas, vacunas y composiciones farmacéuticas y procedimientos de utilización de las vacunas y las composiciones farmacéuticas.

Las toxinas mutantes de la SPE-C presentan como mínimo un cambio en la secuencia de aminoácidos y resultan sustancialmente no letales en comparación con una proteína que se corresponda sustancialmente con la toxina SPE-C natural. En las composiciones de las vacunas, las toxinas mutantes también estimulan una respuesta inmunitaria protectora a como mínimo una actividad biológica de la toxina SPE-C natural. Las toxinas mutantes de las composiciones de las vacunas también pueden seleccionarse opcionalmente de modo que presenten un descenso en la intensificación del choque de la endotoxina y un descenso en la mitogenia de los linfocitos T en comparación con la SPE-C natural. En las composiciones farmacéuticas, se pretende que una toxina mutante sea sustancialmente no letal y que al mismo tiempo mantenga una mitogenia de los linfocitos T comparable a la de la toxina SPE-C
natural.

La invención también comprende fragmentos de una toxina SPE-C natural y mutantes de la toxina SPE-C. Los fragmentos y péptidos derivados de la SPE-C natural son toxinas SPE-C mutantes. Los fragmentos pueden comprender distintos dominios o regiones de la molécula unidos. Un fragmento resulta sustancialmente no letal cuando se compara con la toxina SPE-C natural. En las toxinas mutantes, un fragmento presenta como mínimo un cambio en la secuencia de aminoácidos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la SPE-C natural. Los fragmentos también resultan útiles en las vacunas y en las composiciones farmacéuticas.

La invención también comprende casetes de expresión, vectores y células transformadas. Un casete de expresión comprende una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-C mutante o un fragmento de la misma unido operativamente a un promotor funcional de la célula anfitriona. Los casetes de ADN se insertan preferentemente en un vector. Los vectores comprenden los plásmidos o los virus. Los vectores resultan útiles para proporcionar moldes de ADN destinados a generar ADN que codifique una toxina SPE-C mutante. Los casetes de ADN y los vectores también resultan útiles en las composiciones de las vacunas. Los ácidos nucleicos que codifican una toxina SPE-C mutante o un fragmento de la misma puede administrarse directamente para que se exprese en las células de los mamíferos. El promotor preferentemente consiste en un promotor funcional de una célula de un mamífero. Los ácidos nucleicos administrados directamente a las células puede provocar la expresión de la toxina SPE-C mutante en un individuo de modo que se provoque una respuesta inmunitaria protectora para al menos una actividad biológica de la toxina SPE-C natural.

Las composiciones adicionales de las vacunas comprenden células transformadas estables o vectores víricos que comprenden un casete de expresión que codifica una toxina SPE-C mutante o un fragmento de la misma. Pueden utilizarse vectores víricos tales como la viruela vacunoide para inmunizar seres humanos y de este modo generar una respuesta inmunitaria protectora contra al menos una actividad biológica de la toxina SPE-C natural. Las células transformadas consisten preferentemente en microorganismos tales como S. aureus, E. coli y Salmonella species spp. Los microorganismos transformados comprenden tanto la toxina SPE-C mutante como fragmentos de la misma en su superficie o resultan capaces de secretar la toxina mutante. Los microorganismos transformados pueden administrarse como vacunas elaboradas con microbios vivos, como vacunas atenuadas o como vacunas elaboradas con microbios muertos mediante el calor.

La invención también comprende métodos de utilización de las vacunas y las composiciones farmacéuticas. Las vacunas se administran a los animales en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria protectora para al menos una actividad biológica de la toxina SPE-C natural. Preferentemente, las vacunas se administran a seres humanos y los protegen contra el desarrollo del STSS. Las composiciones farmacéuticas se utilizan en los métodos de estimulación de la proliferación de los linfocitos T.

Las toxinas SPE-C mutantes y/o los fragmentos de las mismas y otras composiciones vacunales pueden resultar útiles para generar un suero inmunitario pasivo. Pueden utilizarse las toxinas SPE-C mutantes y/o los fragmentos de las mismas, los casetes de expresión de ADN o vectores, o microorganismos transformados para inmunizar un animal a fin de que produzca anticuerpos neutralizantes para al menos una actividad biológica de la toxina SPE-C natural. Los anticuerpos neutralizantes realizan una respuesta inmunitaria con la toxina SPE-C mutante y/o los fragmentos de la misma y la toxina SPE-C natural. El suero inmunitario pasivo puede administrarse a un animal que presente los síntomas de infección estreptocócica A y STSS.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos del speC. La numeración se realiza en referencia al codón de iniciación ATG. Se indican las posibles secuencias del promotor (-10, -35) y Shine-Dalgamo (SD). Se proporciona la secuencia de aminoácidos deducida debajo de la secuencia de nucleótidos. Un asterisco después del residuo 27 indica la zona de escisión entre el péptido señal y la proteína madura. Los nucleótidos 3' del codón de terminación indicados con una línea por encima consisten en secuencias palindrómicas.

La Figura 2 ilustra una vista frontal de una estructura en cinta de la SPE-C.

La Figura 3 ilustra una vista posterior de una estructura en cinta de la SPE-C.

La Figura 4 ilustra una vista frontal de una estructura en cinta de la SPE-C orientada para mostrar las zonas de contacto con el complejo principal de histocompatibilidad de tipo II en un complejo.

La Figura 5 ilustra una vista frontal de un diagrama en cinta de la SPE-C orientado para mostrar las zonas que entran en contacto con el receptor de los linfocitos T en un complejo.

La Figura 6 ilustra una vista posterior de una estructura en cinta de la SPE-C orientada para mostrar los residuos de la hélice \alpha que forma la base de la ranura que entra en contacto con el receptor de las células tubulares renales y hepáticas en un complejo con dicho receptor.

La Figura 7 ilustra la actividad mitógena de las mutantes simples Y15A y N38A.

La Figura 8 ilustra la actividad mitógena de las mutantes simples Y17A.

La Figura 9 ilustra la actividad mitógena de las mutantes dobles Y15A/N38A y Y17A/N38A.

La Figura 10 ilustra las vistas frontal y posterior de una estructura en cinta de la SPE-C mostrando los residuos sustituidos en el Ejemplo 6.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a toxinas SPE-C mutantes y fragmentos de las mismas, a composiciones vacunales y farmacéuticas que comprenden las toxinas SPE-C mutantes y los fragmentos de las mismas, a los métodos de preparación de las toxinas SPE-C mutantes y los fragmentos de las mismas y los métodos de utilización de las toxinas SPE-C y los fragmentos de las mismas.

Las toxinas SPE-C mutantes consisten en proteínas que presentan al menos un cambio en la secuencia de aminoácidos y que presentan al menos un cambio en su función biológica cuando se compara con una proteína que sustancialmente se corresponde con una toxina SPE-C natural. Preferentemente, la toxina SPE-C mutante resulta sustancialmente no letal cuando se compara con una toxina SPE-C natural a una misma dosis. Las toxinas SPE-C mutantes pueden generarse utilizando diversos métodos que comprenden la mutagenia dirigida, la mutagenia aleatoria, la mutagenia convencional, la mutagenia in vitro, la mutagenia espontánea y la síntesis química. Las toxinas SPE-C mutantes se seleccionan preferentemente a fin de: 1) garantizar como mínimo un cambio en la secuencia de aminoácidos; y 2) presentar un cambio en al menos una función biológica de la molécula, preferentemente una disminución o la eliminación de la letalidad sistémica. Las toxinas mutantes resultan útiles en las composiciones de las vacunas para proteger contra al menos una actividad biológica de la toxina SPE-C tal como la prevención o la mejora del STSS y en métodos de tratamiento de animales que presenten los síntomas del STSS.

A. Toxinas SPE-C mutantes o fragmentos de las mismas, vacunas y composiciones farmacéuticas

La invención comprende toxinas SPE-C mutantes que presentan al menos un cambio en la secuencia de aminoácidos y que presentan al menos un cambio en su función biológica cuando se comparan con proteínas que sustancialmente se corresponden y presentan las mismas actividades biológicas que la SPE-C natural.

La toxina SPE-C natural está codificada por el gen speC. La toxina SPE-C natural presenta un peso molecular de 24.000 daltonios determinados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de sodiododecilsulfato (SDS PACE) de la proteína purificada. En la Figura 1 se ilustra una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-C natural y la secuencia predicha de aminoácidos de una toxina SPE-C natural. Se ha clonado en E. coli y en S. aureus una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-C natural. La numeración de los aminoácidos en la presente solicitud se realiza haciendo referencia a la secuencia de la Figura 1 con el aspartato de la posición 28 designado como primer aminoácido. Los 27 primeros aminoácidos representan una secuencia guía que no se encuentra presente en la proteína madura.

La toxina SPE-C natural presenta diversas actividades biológicas. Dichas actividades comprenden: 1) fiebre; 2) STSS; 3) letalidad sistémica debido al desarrollo del STSS o al incremento del choque producido por la endotoxina; 4) incremento del choque producido por la endotoxina; 5) provocación de pérdidas en los capilares e hipotensión; 6) provocación de la liberación de citocinas tales como la IFN-\gamma, la IL-1, la TNF-\alpha y la TNF-\beta; 7) enlace con las células endoteliales aórticas porcinas; 8) enlace con las moléculas MHC de clase II; 9) enlace con los receptores de los linfocitos T; y 10) mitogenia (superantigenicidad) de los linfocitos T. Dichas actividades pueden analizarse y caracterizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la definición de una toxina SPE-C natural comprende variantes, tales como las variantes alélicas, de una toxina SPE-C natural que presentan la misma actividad biológica que la toxina SPE-C natural. Dichas toxinas SPE-C pueden presentar diferencias en la secuencia de aminoácidos o sus genes pueden presentar una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia ilustrada en la Figura 1 pero no presentan unas actividades biológicas distintas. Los cambios en la secuencia de aminoácidos resultan sinónimos fenotípicamente. Preferentemente, dichas moléculas de la toxina presentan una letalidad sistémica y un incremento del choque producido por la endotoxina del mismo grado que la toxina SPE-C natural ilustrada en la Figura 1. Preferentemente dichas toxinas presentan al menos entre un 60% y 99% de homología con la secuencia de aminoácidos de la toxina SPE-C natural tal como se ilustra en la Figura 1 determinada utilizando un algoritmo de alineación SS2 tal como ha descrito Altschul, S. F., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986). Las proteínas que presentan dichas características corresponden sustancialmente a una toxina SPE-C natural.

Una toxina SPE-C mutante consiste en una toxina que presenta al menos un cambio en la secuencia de aminoácidos cuando se compara con una proteína que corresponde sustancialmente a una toxina SPE-C natural. El cambio puede consistir en una sustitución, eliminación o adición de un aminoácido. Puede producirse más de un cambio en la secuencia de aminoácidos, preferentemente de 1 a 6 cambios. Se prefiere que se produzca más de un cambio en la secuencia de aminoácidos a fin de minimizar la reversión de la toxina SPE-C mutante a una toxina SPE-C natural que presenta letalidad o toxicidad sistémica. En las toxinas SPE-C mutantes útiles en las vacunas, se prefiere que el cambio en la secuencia de aminoácidos de la toxina no produzca cambio alguno en la capacidad de la toxina para estimular una respuesta inmunitaria que pueda neutralizar la toxina SPE-C natural. En las toxinas SPE-C mutantes útiles en las vacunas, resulta especialmente preferido que las toxinas mutantes sean reconocidas por anticuerpos policlonales neutralizantes contra la toxina SPE-C tales como las obtenidas en Toxin Technologies en Boca Raton, Fla. o Dr. Schlievert (Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN) y que el perfil proteolítico no se vea alterado en comparación con la SPE-C natural.

Los cambios en la secuencia de aminoácidos pueden consistir en cambios de posición específica en uno o más aminoácidos seleccionados de la toxina SPE-C natural. Los cambios de posición específica se seleccionan identificando los residuos en dominios particulares de la molécula tal como se ha descrito o en zonas donde se ubican los residuos de cisteína. Los cambios de posición específica en una posición particular pueden también seleccionarse opcionalmente al determinar si un aminoácido de una posición o en un dominio es idéntico o presenta propiedades similares al residuo equivalente en otras moléculas homólogas al realizar la comparación de homología de la secuencia primaria o su estructura tridimensional. Una molécula homóloga es aquella que puede identificarse al realizar la comparación de homología de la secuencia primaria utilizando el algoritmo de alineación SS2 de Altschul et al. citado anteriormente o utilizando un programa de modelado de homología tal como el Insight / Homology de BioSym, San Diego, CA. Una molécula homóloga es aquella que presenta un número significativo, normalmente entre el 30% y el 99%, de aminoácidos idénticos o cambiados de modo conservativo o que presenta una estructura tridimensional similar, normalmente con un error de valor cuadrático medio (RMS) en las regiones conservadas inferior a los 2 Angstroms, cuando se compara con una toxina SPE-C natural.

Los cambios en la secuencia de aminoácidos en una posición particular pueden realizarse de un modo aleatorio o pueden seleccionarse cambios específicos. Cuando se selecciona una posición específica se hace referencia a la referencia numérica del aminoácido y al aminoácido encontrado en dicha posición en la toxina SPE-C natural tal como se ilustra en la Figura 1. Las referencias numéricas de los aminoácidos que se realizan en la presente solicitud hacen referencia a la secuencia de la Figura 1 contándose el aspartato de la posición 28 como el primer aminoácido. Los aminoácidos equivalentes correspondientes a los identificados en una posición particular de las proteínas que sustancialmente se corresponden con una toxina SPE-C natural pueden presentar distintos números en los aminoácidos en función de la secuencia de referencia o de si se trata de fragmentos. Los residuos equivalentes son aquellos que se encuentran en las moléculas homólogas que pueden identificarse como equivalentes a los aminoácidos de las proteínas que se corresponden sustancialmente con una toxina SPE-C natural tanto si se compara la estructura primaria de los aminoácidos como si se compara la estructura modelada tal como se ilustra en la Figura 1 o realizando la comparación con una estructura cristalina conocida de una molécula homóloga. Se pretende que la invención cubra los cambios de aminoácidos equivalentes en posiciones iguales o similares independientemente de la referencia numérica del aminoácido.

Si se selecciona una sustitución específica de un aminoácido en una posición específica, el aminoácido a sustituir en dicha posición se selecciona de modo que comprenda un cambio estructural que pueda afectar a la actividad biológica en comparación con el aminoácido de dicha posición de la toxina SPE-C natural. La sustitución puede ser conservativa o no conservativa. Las sustituciones que producen un cambio estructural que puede afectar la actividad biológica comprenden: 1) el cambio de un tipo de carga a otro; 2) el cambio de un tipo de carga a no presentar carga; 3) el cambio de residuos de cisteína y la formación de enlaces disulfuro; 4) el cambio de residuos hidrófobos por residuos hidrófilos o el cambio de residuos hidrófilos por residuos hidrófobos; 5) el cambio en el tamaño de los aminoácidos; 6) el cambio por un aminoácido o análogo estructuralmente restrictivo; y 7) el cambio por un aminoácido o análogo sintético. La sustitución específica seleccionada puede depender también de la zona de la posición seleccionada. Por ejemplo, se prefiere que los aminoácidos de la hélice \alpha N-terminal presenten grupos hidroxilo que interactúen con los nitrógenos amídicos expuestos o que se encuentren cargados negativamente para interactuar con la carga positiva parcial presente en extremo N-terminal de la hélice \alpha.

Las toxinas mutantes también pueden comprender mutaciones aleatorias dirigidas a una posición o posiciones específicas. Una vez se ha seleccionado una posición, las toxinas mutantes pueden generarse realizando la sustitución con cada uno de los otros 19 aminoácidos en dicha posición utilizando métodos tales como los descritos por Aiyar et al, Biotechniques 14:366 (1993) o Ho et al., Gene 77: 51-54 (1984). También puede utilizarse la mutagenia in vitro para realizar la sustitución con cada uno de los otros 19 aminoácidos o aminoácidos o análogos sintéticos en una posición particular utilizando un método tal como el descrito por Anthony-Cahlli et al., Trends Biochem. Sci. 14:400 (1989).

Las toxinas mutantes también comprenden toxinas que presentan cambios en una o más posiciones de la molécula que no se han seleccionado específicamente y que presentan un cambio en la secuencia de aminoácido que no se ha seleccionado específicamente pero que puede consistir en la sustitución por cualquiera de los otros 19 aminoácidos o un aminoácido sintético.

Las sustituciones en una posición específica también comprenden, pero no se limitan a ello, las sustituciones con aminoácidos sintéticos tales como la 3-hidroxiprolina, la 4-hidroxiprolina, la homocisteína, el ácido 2-aminoadípico, el ácido 2-aminopimílico, la ornitina, la homoarginina, la N-metil-lisina, la dimetil-lisina, la trimetillisina, el ácido 2,3-diaminopropiónico, el ácido 2,4-diaminobutírico, la hidroxilisina, la fenilalanina sustituida, la norleucina, la norvalina, la (-valina y las tirosinas halogenadas. Las sustituciones en posiciones específicas también pueden comprender la utilización de análogos que utilizan una química no peptídica que comprende, pero no se limita a ella, enlaces éster, éter y fosforilo y boro.

Las toxinas mutantes pueden generarse utilizando diversos métodos. Dichos métodos comprenden la mutagenia de posición específica, los métodos de mutagenia que utilizan productos químicos tal como EMS, o bisulfito sódico o irradiación UV, mediante mutación espontánea, mediante mutagenia in vitro y síntesis química. Los métodos de mutagenia pueden encontrarse en Sambrook et al., A Guide to Molecular Cloning ("Guía de clonación molecular") Cold Spring Harvard, Nueva York (1989). El método especialmente preferido de mutagenia de posición específica consiste en realizar una PCR asimétrica con tres cebadores tal como se describe en Perrin y Gilliland, 1990 Nucleic Acid Res. 18:7433.

La superposición de las estructuras tridimensionales de cuatro superantígenos estafilocócicos (TSST-1, SEA, SEB y SEC-3) y del SPE-C demostró que dichas proteínas comparten 16 aminoácidos conservados estructuralmente (Tabla 1). La utilización de dichos 16 aminoácidos conservados estructuralmente como puntos de referencia permite la superposición de las estructuras de dichas 5 proteínas con unas diferencias de valor cuadrático medio (RMS) iguales o inferiores a los 2 angstroms, que resulta significativa en proteínas con una conservación mínima de la secuencia de aminoácidos. La superposición sobre la base de 16 aminoácidos conservados estructuralmente permite la comparación detallada de la estructura de la SPE-C con los superantígenos estafilocócicos.

La estructura cristalina del complejo del superantígeno estafilocócico SEB y el complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) muestra los aminoácidos del SEB que entran en contacto con el MHC-II y comprende aquellos residuos listados en la Tabla 2. La superposición de la estructura de la SPE-C indica la ubicación de las partes de la SPE-C que entran en contacto con el MHC-II en un complejo formado entre dichas dos proteínas. Dichas posiciones se ilustran en la Figura 4 en forma de esferas.

Específicamente, haciendo referencia a la Figura 4, dichas posiciones comprenden la 1 y 2 de la cadena 3 de la hoja \beta 4 de la subunidad B 5. La posición 1 es la posición del aminoácido 1 pasado un plegamiento de tipo 4 en la cadena 3 y aproximadamente tres residuos desde la unión de la cadena 3 y el giro 6. La posición 1 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Thr-33 de la SPE-C. La posición 2 representa el aminoácido de la cadena 3 que se encuentra más próximo a la unión de la cadena 3 y el giro 6, aunque permanezca en la cadena. La posición 2 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la His-35 de la SPE-C. La posición 7 representa el aminoácido que se encuentra más próximo a la unión de la cadena 3 y el giro 6. El giro 6 consiste en un giro de tipo I o de tipo II. En la posición 7 puede haber un aminoácido hidrófobo, preferentemente la Leu-37 de la SPE-C. La hoja \beta 4 de la subunidad B 5 también comprende un residuo Asn-38.

La posición 8 se encuentra en el giro 6. La posición 8 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Asn-38 de la SPE-C. Las posiciones 10, 11 y 14 se encuentran en la cadena 12. La posición 10 consiste en el aminoácido de la cadena 12 más próximo a la unión con el giro 13. En la posición 10 puede encontrarse un aminoácido con carga, preferentemente la Arg-45 de la SPE-C. La posición 11 se encuentra aproximadamente en el centro de la cadena 12 y puede estar ocupada por un aminoácido con carga, preferentemente la Lys-43 de la SPE-C. La posición 14 se encuentra en la unión de la cadena 12 y el giro 6, pero en la cadena 12. La posición 14 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Thr-41 de la SPE-C. La posición 15 se encuentra en el giro 6. La posición 15 puede estar ocupada por un aminoácido con carga, preferentemente el Asp-40 de la SPE-C.

Las posiciones 17 a 20 se encuentran en la cadena 21. Las posiciones 19 y 20 son adyacentes. Las posiciones 17 a 19 se encuentran separadas por un espacio suficiente para una posición entre ambas. La posición 17 se encuentra aproximadamente a un aminoácido de la unión de la cadena 21 y el giro 13. La posición 17 puede estar ocupada por un aminoácido hidrófobo, preferentemente la Ile-51 de la SPE-C. La posición 18 se encuentra aproximadamente en la zona central de la cadena 21 y puede estar ocupada por un aminoácido neutro o polar, preferentemente el aminoácido Ser-53 de la SPE-C. La posición 19 se encuentra aproximadamente a dos aminoácidos desde la unión entre la cadena 21 y el giro 22. La posición 19 puede estar ocupada por un aminoácido neutro o polar, preferentemente la Met-55 de la SPE-C. La posición 20 se encuentra en la cadena 21 adyacente a la unión de la cadena 21 con el giro 22. La posición 20 puede estar ocupada por un aminoácido neutro o polar, preferentemente la Ser-56 de la SPE-C. La posición 23 se encuentra en la hélice \alpha 24 en el giro y termina con la unión de la hélice 24 y el giro 25. La posición 23 se encuentra en la cara de la hélice 24 opuesta a la posición 20. La posición 23 puede estar ocupada por un aminoácido neutro o polar, preferentemente la Ala-186 de la SPE-C.

La estructura cristalina del complejo del superantígeno estafilocócico SEC-3 y el receptor de los linfocitos T muestra los aminoácidos del SEC-3 que entran en contacto con el receptor de los linfocitos T y comprende aquellos residuos listados en la Tabla 3. La superposición de la estructura de la SPE-C indica la posición de los aminoácidos de la SPE-C que entran en contacto con el receptor de los linfocitos T en un complejo formado entre dichas dos proteínas. Dichas posiciones se ilustran en la Figura 5 en forma de esferas.

Específicamente, haciendo referencia a la Figura 5, dichas posiciones comprenden la posición 26 que se encuentra en la unión entre el giro 13 y la cadena 21. La posición 26 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Tyr-50 de la SPE-C. La posición 27 se encuentra en la cadena 28 aproximadamente a una distancia de tres aminoácidos de la unión de la cadena 28 con el giro 29. La posición 27 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Tyr-85 de la SPE-C. La posición 30 se encuentra en el giro 29 en una situación aproximadamente equidistante entre las cadenas 28 y 32. La posición 30 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la His-81 de la SPE-C. La posición 31 es la unión del giro 29 y la cadena 32. La posición 31 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Asn-79 de la SPE-C. Las posiciones 33 a 36 se encuentran en la cadena 32. La posición 33 consiste en un aminoácido adyacente a la unión entre la cadena 32 y el giro 31. La posición 33 puede estar ocupada por un aminoácido hidrófobo, preferentemente la Leu-78 de la SPE-C. La posición 34 se encuentra a un aminoácido de la posición 33. La posición 34 puede estar ocupada por un aminoácido hidrófobo, preferentemente la Ile-77 de la SPE-C. La posición 35 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Tyr-76 de la SPE-C. La posición 36 puede estar ocupada por un aminoácido hidrófobo, preferentemente la Phe-75 de la SPE-C.

La posición 38 consiste en un residuo de la hélice \alpha irregular 24 en la vuelta de dicha hélice \alpha más próximo a su unión con el giro 39. La posición 38 consiste en una parte del giro más próximo a la cadena 40. La posición 38 puede estar ocupada por un aminoácido con carga, preferentemente el Asp-183 de la SPE-C. La posición 41 se encuentra en el giro 39 aproximadamente a un aminoácido de la unión del giro 39 y la hélice \alpha 24. Una cadena lateral del aminoácido de la posición 41 se orienta hacia la hélice \alpha 42. La posición 41 puede estar ocupada por un aminoácido con carga, preferentemente el Arg-181 de la SPE-C.

El giro 43 comprende las posiciones 44, 45, 46 y 47. Las posiciones 44 a 47 consisten en posiciones adyacentes de la parte del giro 43 más expuesta al solvente. La posición 44 puede estar ocupada por un aminoácido con carga, preferentemente el Glu-178 de la SPE-C. La posición 45 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Tyr-153 de la SPE-C. La posición 46 puede estar ocupada por un aminoácido con carga, preferentemente el Asp-148 de la SPE-C. La posición 47 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Tyr-147 de la SPE-C.

Las posiciones 48 a 50 se encuentran en la hélice \alpha N-terminal 51. Las posiciones 48 y 49 se encuentran en la vuelta de la hélice \alpha 51 más próxima a la unión con el giro 52. La posición 48 puede estar ocupada por un aminoácido neutro o polar, preferentemente la Ser-11 de la SPE-C. La posición 49 puede estar ocupada por un aminoácido cargado, preferentemente la Asp-12 de la SPE-C. Las posiciones 48 y 49 representan las posiciones de unos aminoácidos adyacentes. La posición 50 se encuentra en la vuelta de la hélice \alpha 51 adyacente a su unión con el giro 53. La posición 50 se encuentra en la parte de dicha vuelta más expuesta al solvente. La posición 50 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Tyr-15 de la SPE-C. La hélice N-terminal \alpha 51 también comprende un residuo Tyr-17.

La SPE-C se fija al receptor de las células tubulares renales y hepáticas en una zona que comprende los residuos de la ranura de la "parte trasera" de la SPE-C. Las posiciones 54 a 60 definen la superficie de una ranura en la SPE-C entre la subunidad B 5 y la subunidad A 61 que forma parte de la interacción con el receptor de las células tubulares renales y hepáticas. Las posiciones 54 a 59 se encuentran en la hélice \alpha central 42. La posición 60 se encuentra en el giro 16 adyacente a la unión del giro 16 con la hélice \alpha central 42. La posición 54 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Asn-143 de la SPE-C. La posición 55 puede estar ocupada por un aminoácido con carga, preferentemente el Asp-142 de la SPE-C. La posición 56 puede estar ocupada por un aminoácido polar, preferentemente la Tyr-139 de la SPE-C. La posición 57 puede estar ocupada por un aminoácido con carga, preferentemente la Lys-138 de la SPE-C. La posición 58 puede estar ocupada por un aminoácido con carga positiva, preferentemente la Lys-135 de la SPE-C. La posición 59 puede estar ocupada por un aminoácido con carga, preferentemente el Glu-131 de la SPE-C. La posición 60 puede estar ocupada por un aminoácido neutro o polar, preferentemente la Thr-128 de la SPE-C.

La Tabla 2 lista los residuos del SEB que interactúan con el MHC de clase II en la estructura cristalina del complejo de dichas dos proteínas. La superposición de las estructuras del SEC-3, el SEA y el TSST-1 con la estructura del complejo SEB:MHC-II indica los aminoácidos de dichas proteínas que corresponden a los residuos listados del SEB que interactúan con el MHC-II. Las SPE-C mutantes preferidas presentan la sustitución de un aminoácido en un resido de la SPE-C que corresponde a un residuo del SEB, el SEC-3, el SEA y el TSST-1 que interactúa con el MHC-II. Dichos residuos de las SPE-C preferidas comprenden los aminoácidos de la SPE-C listados en la Tabla 2. Los aminoácidos correspondientes a las distintas proteínas se encuentran listados en las filas de la tabla.

La Tabla 3 lista los residuos del SEC-3 que interactúan con el receptor de los linfocitos T en la estructura cristalina del complejo de dichas dos proteínas. La superposición de las estructuras del SEB, el SEA y el TSST-1 con la estructura del complejo SEC-3B:receptor de los linfocitos T indica los aminoácidos de dichas proteínas que corresponden a los residuos listados del SEC que interactúan con el receptor de los linfocitos T. Las SPE-C mutantes preferidas presentan la sustitución de un aminoácido en un residuo de la SPE-C que corresponde a un residuo del SEB, el SEC-3, el SEA y el TSST-1 que interactúa con el receptor de los linfocitos T. Dichos residuos de las SPE-C preferidas comprenden los aminoácidos de la SPE-C listados en la Tabla 3. Los aminoácidos correspondientes a las distintas proteínas se encuentran listados en las filas de la tabla.

Las SPE-C mutantes preferidas presentan sustituciones en los aminoácidos en al menos una de las posiciones o en al menos uno de los aminoácidos que interactúan con el receptor de los linfocitos T, el MHC-II o el receptor de las células tubulares renales y hepáticas. Dichas sustituciones en los aminoácidos pueden escogerse del modo descrito anteriormente en la presente memoria a fin de interrumpir las interacciones.

TABLA 1 Aminoácidos conservados en los PTSAG

1

TABLA 2 Aminoácidos implicados en las interacciones con el MHC de clase II

2

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TABLA 3 Aminoácidos implicados en las interacciones con los TCR

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Una vez se ha generado la toxina SPE-C mutante presentando al menos un cambio en los aminoácidos en comparación con una proteína que sustancialmente se corresponde con una toxina SPE-C natural, se examina la toxina SPE-C mutante en relación con su no letalidad. Se prefiere que las toxinas SPE-C mutantes seleccionadas mediante dicho examen resulten sustancialmente no letales en conejos cuando se administran utilizando una bomba miniosmótica (tal como se describe en el Ejemplo 4) con una dosis igual o superior a la de la toxina SPE-C natural. Una toxina SPE-C mutante o un fragmento de la misma resulta sustancialmente no letal si cuando se administra a un conejo con una dosis igual a la de la toxina natural mueren entre el 10% y el 20% de los conejos. Las toxinas mutantes no letales resultan útiles en las vacunas y las composiciones farmacéuticas. Aunque no se pretende limitar la invención, se cree que algunos aminoácidos o dominios que afectan la letalidad sistémica se pueden separar de otras actividades biológicas especialmente la mitogenia de los linfocitos T.

En relación con las toxinas útiles para las vacunas, se prefiere que las toxinas SPE-C mutantes se examinen para aquellas que puedan estimular una respuesta inmunitaria que neutralice la actividad de la toxina SPE-C natural a fin de determinar si la toxina mutante provoca una reacción inmunitaria con los anticuerpos policlonales neutralizantes contra la toxina SPE-C natural tales como las obtenidas en Toxin Technologies en Boca Raton, Fla. o Dr. Schlievert. Los métodos de determinación si las toxinas SPE-C mutantes provocan reacciones inmunitarias con los anticuerpos contra la toxina SPE-C natural comprenden la prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA), la inmunotransferencia de tipo Western, el análisis de doble inmunodifusión y similares.

Opcionalmente, las toxinas mutantes también pueden examinarse para determinar si el perfil proteolítico de la toxina mutante es el mismo que la toxina SPE-C natural. En algunos casos, se prefiere que las mutantes generadas no cambien sustancialmente la estructura tridimensional general de la toxina mutante cuando se compara con la toxina SPE-C natural. Un modo de examinar si se ha producido un cambio en la estructura global es observar la inmunorreactividad de los anticuerpos contra la toxina SPE-C natural y/o examinar el perfil proteolítico de las toxinas SPE-C mutantes. El perfil proteolítico puede determinarse utilizando enzimas tales como la tripsina, la quimotripsina, la papaína, la pepsina, la subtilina y la proteasa V8 en métodos conocidos por los expertos en la materia. Se conoce el perfil proteolítico de la SPE-C natural con la secuencia ilustrada en la Figura 3. Se seleccionan las mutantes que presentan un perfil similar al de la SPE-C natural.

Opcionalmente, las toxinas mutantes también pueden examinarse y seleccionarse con respecto a otros cambios en la actividad biológica. Tal como se ha descrito anteriormente, existen diversas actividades biológicas asociadas a la toxina SPE-C natural. Dichas actividades biológicas comprenden: 1) fiebre; 2) STSS; 4) incremento del choque producido por la endotoxina; 5) provocación de pérdidas en los capilares e hipotensión; 6) provocación de la liberación de citocinas tales como la IFN-\gamma, la IL-1, la TNF-\alpha y la TNF-\beta; 7) enlace con las células endoteliales aórticas porcinas; 8) enlace con las moléculas MHC de clase II; 9) enlace con los receptores de los linfocitos T; y 10) mitogenia (superantigenicidad) de los linfocitos T. Dichas actividades pueden determinarse utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia.

Con respecto a las toxinas SPE-C mutantes o fragmentos de las mismas útiles en las composiciones de las vacunas, se prefiera que sean sustancialmente no tóxicas y que produzcan una reacción inmunitaria con los anticuerpos neutralizantes contra la SPE-C natural. Los anticuerpos neutralizantes comprenden aquellos que inhiben la letalidad de la toxina natural cuando se ensaya en animales. Opcionalmente, las toxinas SPE-C mutantes pueden presentar un cambio en una o más actividades biológicas de la toxina SPE-C tal como se ha descrito previamente.

Opcionalmente, las toxinas mutantes de las composiciones de las vacunas pueden examinarse y seleccionarse además con respecto a su falta de potenciación del choque provocado por la endotoxina. El análisis preferido para examinar la falta de incremento del choque producido por la endotoxina se describe en el Ejemplo 3. Los conejos preferentemente no presentan infección alguna de tipo bacteriano o vírico antes del análisis. La falta de potenciación o sustancialmente de incremento del choque provocado por la endotoxina se observa cuando menos de aproximadamente el 25% de los animales presentan el choque cuando la toxina SPE-C mutante se coadministra con la endotoxina en comparación con la actividad de la SPE-C natural con la misma dosis. Más preferentemente, ninguno de los animales presenta el choque.

Opcionalmente, las mutantes preferidas en las composiciones de las vacunas también pueden examinarse y seleccionarse además en relación con un cambio en la mitogenia de los linfocitos T. El cambio en la mitogenia de los linfocitos T puede detectarse al determinar la proliferación de los linfocitos T en un análisis estándar con timidina 3H utilizando linfocitos de conejo tal como se describe en el Ejemplo 3; al determinar los niveles de producción de las citocinas tales como en la IFN-\gamma o la TNF-\beta; al determinar una respuesta de los linfocitos T de tipos V\beta o al determinar la interacción de las moléculas con los receptores del MHC de clase II. El método preferido para detectar una disminución de la mitogenia de las células T consiste en determinar la proliferación celular de los linfocitos T de los conejos en presencia y en ausencia de la toxina mutante. Las respuestas de los linfocitos T a la toxina SPE-C natural aumentan enormemente por encima de una respuesta normal a un antígeno in vitro. Se observa un descenso considerable en la mitogenia de los linfocitos T cuando la toxina SPE-C mutante no estimula una respuesta proliferativa de los linfocitos T superior a la estimulación con un antígeno o control negativo. Preferentemente, se observa un descenso de tal modo que la respuesta de proliferación de los linfocitos T a la toxina mutante SPE-C no es superior al doble de la actividad de fondo cuando se determina utilizando linfocitos de conejo con una misma dosis que con la toxina SPE-C natural.

Opcionalmente, las toxinas SPE-C mutantes que resultan útiles en las composiciones de las vacunas se examinan y se seleccionan además en relación con el descenso de las pérdidas en los capilares de las células endoteliales. El método preferido consiste en utilizar células endoteliales aórticas porcinas tal como se describe en Lee et al., J. Infect. Dis. 164:711 (1991). Puede determinarse un descenso de las pérdidas en los capilares en presencia de las toxinas SPE-C mutantes al determinar un descenso en la liberación de un compuesto marcado radiactivamente o mediante un cambio en el transporte de un compuesto marcado radiactivamente. Se observa un descenso de las pérdidas en los capilares cuando la liberación o el transporte de un compuesto marcado radiactivamente desciende a un valor inferior al doble de la actividad de fondo cuando se compara con la actividad de una toxina natural.

Las toxinas SPE-C mutantes especialmente preferidas útiles en las composiciones de las vacunas no resultan biológicamente activas cuando se comparan con proteínas que presentan la actividad de la toxina SPE-C natural. Por no biológicamente activa se entiende que la toxina mutante presenta poca o ninguna letalidad sistémica, que presenta poca o ninguna intensificación en el choque provocado por la endotoxina y que presenta poca o nula mitogenia en los linfocitos T. Preferentemente, las toxinas SPE-C mutantes se selecciona para composiciones de vacunas que sustancialmente carecen de dichas actividades biológicas, es decir, reaccionan del mismo modo que un control negativo o estimulan una reacción que no superan el doble de la actividad de fondo.

Los cambios en otras actividades biológicas pueden detectarse tal como se expone a continuación. El enlace con las moléculas del MHC de clase II pueden detectarse utilizando métodos tales como los descritos por Jardetzky, Nature 368:711 (1994). Los cambios en la fiebre pueden detectarse realizando el seguimiento de las temperaturas durante el período de administración de las toxinas SPE-C mutantes. Los cambios en los niveles de producción de citocinas en presencia de toxinas SPE-C mutantes puede determinarse utilizando procedimientos tales como los disponibles comercialmente y descritos en protocolos habituales en inmunología (Ed. Coliga, Kruisbeck, Margulies, Shevach y Stroker. National Institutes of Health ("Instituto Nacional de la Salud"), John Wiley and Sons, Inc.).

Las mutantes especialmente preferidas para las composiciones de las vacunas son las toxinas SPE-C mutantes que producen una reacción inmunitaria con los anticuerpos policlonales neutralizantes contra la toxina SPE-C natural, que no resultan tóxicos y que opcionalmente presentan un descenso en la potenciación del choque provocado por la endotoxina y un descenso en la mitogenia de los linfocitos T.

De un modo ventajoso, las toxinas SPE-C mutantes útiles en los métodos de tratamiento pueden generarse de modo que presenten más de un cambio en la secuencia de aminoácidos. Se pretende que presenten cambios en más de una posición para minimizar cualquier posibilidad de reversión a una molécula que presente toxicidad o letalidad. En las composiciones de las vacunas, se pretende que la toxina mutante con múltiples cambios pueda todavía generar una respuesta inmunitaria protectora contra la SPE-C natural y/o realizar una reacción inmunitaria con los anticuerpos policlonales neutralizantes contra la SPE-C natural. En las composiciones farmacéuticas, se pretende que las mutantes con múltiples cambios sean sustancialmente no letales y al mismo tiempo mantengan la mitogenia de los linfocitos T. Resulta especialmente preferible que presenten entre aproximadamente 2 y 6 cambios. En la presente solicitud también se contemplan las mutantes triples.

Las toxinas mutantes de SPE-C resultan útiles para formar las composiciones de las vacunas. Las mutantes preferidas para las composiciones de las vacunas presentan al menos un cambio en la secuencia de aminoácidos, no presentan toxicidad sistémica y realizan una reacción inmunitaria con los anticuerpos policlonales neutralizantes contra la SPE-C natural.

Las toxinas mutantes se combinan con excipientes fisiológicamente aceptables. Los diluyentes fisiológicamente aceptables comprenden las disoluciones salinas isotónicas y las disoluciones salinas amortiguadoras a pH neutro tales como disoluciones salinas amortiguadoras de fosfato. Otro tipo de excipientes fisiológicos comprende los liposomas o polímeros y similares. Opcionalmente, la toxina mutante puede combinarse con un aditivo tal como el aditivo incompleto de Freund, el aditivo completo de Freund, alumbre, lípido A monofosforilado, fosfato o hidróxido de alumbre, QS-21 y similares. Opcionalmente, las toxinas mutantes o fragmentos de las mismas pueden combinarse con sustancias de ajuste de la respuesta inmunitaria tales como las interleucinas, los interferones y similares. Diversas formulaciones de vacunas resultan conocidas por los expertos en la materia.

La toxina SPE-C mutante o fragmento de la misma se añaden a la formulación de la vacuna en una cantidad que resulte eficaz en la estimulación de una respuesta inmunitaria protectora en un animal en relación con al menos una actividad biológica de la toxina SPE-C natural. La generación de la respuesta inmunitaria protectora puede determinarse mediante el desarrollo de anticuerpos, preferentemente anticuerpos que neutralicen la toxina SPE-C natural. La neutralización de la toxina SPE-C natural puede determinarse mediante la inhibición de la letalidad debida a la toxina SPE-C natural. Además, la respuesta inmunitaria protectora puede detectarse determinando un descenso en al menos una actividad biológica de las toxinas SPE-C naturales tales como una mejora o una eliminación de los síntomas de intensificación del choque provocado por la endotoxina o STSS. Las cantidades de toxina mutante que pueden provocar una respuesta inmunitaria protectora se encuentran entre aproximadamente 0,1 \mug y 100 mg por kg de peso corporal, más preferentemente entre aproximadamente 1 \mug y 100 \mug por kg de peso corporal. Aproximadamente 25 \mug/kg de peso corporal de toxina SPE-C natural resultan eficaces en la provocación de una respuesta inmunitaria protectora en los conejos.

Las composiciones de las vacunas se administran a animales tales como conejos, roedores, caballos y humanos. El animal preferido es un ser humano.

Las toxinas SPE-C mutantes también resulta útiles para formar composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas resultan útiles en situaciones terapéuticas en las que se pretende la estimulación de la proliferación de los linfocitos T. Las toxinas SPE-C mutantes preferidas son aquellas que resultan no letales al mismo tiempo que mantienen una mitogenia en los linfocitos T comparable a la toxina SPE-C natural.

La composición farmacéutica se forma al combinar una toxina SPE-C mutante con un excipiente fisiológicamente aceptable tal como una disolución salina isotónica, las disoluciones salinas amortiguadoras a pH neutro tales como disoluciones salinas amortiguadoras de fosfato. La toxina SPE-C mutante se combina en una cantidad eficaz para estimular una proliferación de los linfocitos T comparable a la de la toxina SPE-C natural a una misma dosis. Puede determinarse una intensificación en la respuesta de los linfocitos T utilizando análisis estándar con timidina 3H con linfocitos de conejo así como determinando las poblaciones de linfocitos T in vivo utilizando clasificadores de linfocitos T activados o un análisis tal como un ELISPOT. El intervalo de valores eficaces se encuentra entre los 100 ng y los 100 mg por kg de peso corporal, más preferentemente entre 1 \mug y 1 mg/kg de peso corporal. Por ejemplo, dichas toxinas SPE-C mutantes podrían utilizarse tanto solas como junto con un tratamiento con interleucinas e interferones.

La invención también comprende fragmentos de toxinas SPE-C y fragmentos de toxinas SPE-C mutantes. En las composiciones de las vacunas, los fragmentos son preferentemente suficientemente grandes a fin de estimular la respuesta inmunitaria protectora. El tamaño mínimo para un epítopo de linfocito B es de aproximadamente 4 a 7 aminoácidos y para un epítopo de linfocito T es de aproximadamente 8 a 12 aminoácidos. El tamaño total de una SPE-C natural es de aproximadamente 235 aminoácidos comprendiendo la secuencia guía. Los fragmentos consisten en péptidos de aproximadamente entre 4 y 200 aminoácidos, preferentemente aproximadamente entre 10 y 50 aminoácidos.

Los fragmentos pueden consistir en un único péptido o comprende péptidos de distintas zonas asociados entre sí. Preferentemente, los fragmentos comprenden uno o más de los dominios tal como se identifican en la Figura 1 y tal como se describen en la presente memoria. También se prefiere que los fragmentos de las toxinas SPE-C mutantes presenten al menos un cambio en la secuencia de aminoácidos y más preferentemente de 1 a 6 cambios en la secuencia de aminoácidos cuando se compara con una proteína que corresponde sustancialmente con una toxina SPE-C natural.

Preferentemente, los fragmentos no presentan sustancialmente letalidad sistémica. Los fragmentos se examinan y se seleccionan de modo que presenten poca o ninguna toxicidad en los conejos cuando se utiliza una bomba miniosmótica con una dosis igual o superior a la de la proteína que presenta la actividad de la toxina SPE-C natural tal como se ha descrito previamente. También se prefiere que el fragmento no resulte tóxico para los seres humanos cuando se administra con una dosis comparable a la de la toxina SPE-C natural.

En las composiciones de las vacunas, se prefiere que los fragmentos comprendan residuos de la hélice \alpha central y/o de la hélice \alpha N-terminal. En las composiciones de las vacunas, resulta preferible que un fragmento estimule la respuesta de los anticuerpos neutralizantes para una proteína que presente la actividad de la toxina SPE-C natural. Se puede examinar y seleccionar un fragmento con respecto a su capacidad de provocar una reacción inmunitaria con los anticuerpos policlonales neutralizantes para una toxina SPE-C natural. Los fragmentos también pueden utilizarse para inmunizar animales y los anticuerpos formados pueden analizarse con respecto a su neutralización de la toxina SPE-C natural.

En las composiciones de las vacunas, los fragmentos especialmente preferidos también se examinan y se seleccionan de modo que no sean biológicamente activos. Por no biológicamente activo se entiende que el fragmento no presenta letalidad sistémica, que provoca poca o ninguna intensificación en el choque provocado por la endotoxina y que presenta poca o nula estimulación de los linfocitos T. Opcionalmente, el fragmento puede examinarse y seleccionarse para que presente un descenso en el efecto de pérdidas capilares en las células endoteliales porcinas.

Los fragmentos examinados y seleccionados de las composiciones de las vacunas pueden combinarse en formulaciones farmacéuticas y utilizarse tal como se ha descrito previamente. Opcionalmente, los fragmentos pueden unirse a moléculas de excipientes tales como la seroalbúmina bovina, la seroalbúmina humana, la hemocianina de lapa, la vacuna antitetánica y similares.

En las composiciones farmacéuticas, se prefiere que los fragmentos comprendan aminoácidos en el dominio B N-terminal, hojas \beta solas o en combinación con la hélice \alpha central.

En las composiciones farmacéuticas, se prefiere que los fragmentos se examinen y se seleccionen en relación con su no letalidad sistémica, y opcionalmente en relación con su poca o nula intensificación del choque provocado por la endotoxina tal como se ha descrito previamente. Se prefiere que los fragmentos conserven la mitogenia de los linfocitos T en un nivel similar al de la toxina SPE-C natural. Los fragmentos de la toxina mutante SPE-C pueden constituir las composiciones farmacéuticas tal como se ha descrito previamente.

Los fragmentos de la toxina SPE-C mutante pueden prepararse mediante la PCR, digestión y/o ligación con enzimas de restricción, mutagenia in vitro y síntesis química. En el caso de los fragmentos de menor tamaño puede resultar preferible la síntesis química.

Los fragmentos de las toxinas SPE-C mutantes pueden utilizarse en las mismas composiciones y métodos que se han descrito en relación con las toxinas SPE-C mutantes.

B. Métodos de utilización de las toxinas SPE-C mutantes, composiciones de las vacunas o composiciones farmacéuticas

Las toxinas SPE-C mutantes y/o los fragmentos de las mismas resultan útiles en los métodos de protección de animales contra los efectos de las toxinas SPE-C naturales, la mejora o el tratamiento de animales con STSS, la provocación de la intensificación de la proliferación y respuesta de los linfocitos T, y el tratamiento o mejora de los síntomas de la psoriasis en gotas, la fiebre reumática o las infecciones estreptocócicas invasivas.

Un procedimiento destinado a proteger los animales contra al menos una actividad biológica de la toxina SPE-C natural implica la etapa de administración de una vacuna al animal a fin de provocar una respuesta inmunitaria protectora contra al menos una actividad biológica de la toxina SPE-C natural. Resulta preferible que la respuesta inmunitaria protectora sea neutralizante y proteja contra la letalidad o los síntomas del STSS. La vacuna preferentemente comprende una toxina SPE-C mutante o fragmento de la misma que presenta al menos un cambio en la secuencia de aminoácidos, que realicen una reacción inmunitaria con los anticuerpos policlonales neutralizantes contra la SPE-C natural y no resulte letal.

La vacuna puede administrarse a un animal mediante diversas vías comprendiendo la subcutánea, la intramuscular, la intravenosa, la intradérmica, la oral, la intranasal, la ocular, la intraperitoneal y similares. La vía de administración preferida es la intramuscular.

Las vacunas pueden administrarse a diversos animales que comprenden conejos, roedores, caballos y humanos. El animal preferido es un ser humano.

Las vacunas pueden administrarse en dosis unitarias o únicas hasta que se provoca la respuesta inmunitaria protectora contra al menos una de las actividades biológicas de la SPE-C natural. La respuesta inmunitaria protectora puede detectarse determinando la presencia de anticuerpos neutralizantes contra la SPE-C natural utilizando procedimientos estándar. Se administra una cantidad eficaz a fin de provocar la respuesta inmunitaria protectora sin que se produzca una toxicidad sustancial.

La toxina SPE-C mutante o fragmento de la misma también resulta útil para generar anticuerpos neutralizantes que provoquen una reacción inmunitaria con la toxina SPE-C mutante o la toxina SPE-C natural. Dichos anticuerpos pueden utilizarse como suero inmunitario pasivo para tratar o mejorar los síntomas de aquellos pacientes que presenten los síntomas del STSS. Una vacuna como la descrita anteriormente puede administrarse a un animal tal como un caballo o un ser humano hasta que se genere una respuesta con anticuerpos neutralizantes contra la SPE-C natural. Sin embargo, la SPE-C natural ha de administrarse a unas dosis considerablemente inferiores a las que provocan la toxicidad tales como desde 1/50 hasta 1/100 de la dosis letal media (DL_{50}) de la SPE-C natural en los conejos.

Los anticuerpos neutralizantes se administran a pacientes que presentan síntomas del STSS tales como fiebre, hipotensión, infección por estreptococos del grupo A, miositis, fascitis y lesiones hepáticas en una cantidad eficaz para neutralizar el efecto de la toxina SPE-C. Los anticuerpos neutralizantes pueden administrarse por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea y similares. La vía de administración preferida es la intravenosa o en el caso de infecciones localizadas mediante aplicación tópica en la zona de la lesión tisular con desbridamiento. También se pretende que el anticuerpo neutralizante se administre junto con un tratamiento antibiótico. El anticuerpo neutralizante puede administrarse hasta que se produzca un descenso en el choque o la lesión tisular con una dosis unitaria o múltiples. La cantidad preferida de anticuerpos neutralizantes administrados normalmente se encuentra aproximadamente entre 1 mg y 1000 mg/kg, más preferentemente entre 50 y 200 mg/kg de peso corporal.

C. Casetes de expresión que codifican toxinas SPE-C mutantes y métodos de preparación de dichos casetes de expresión de ADN

La invención también comprende secuencias de ADN y casetes de expresión útiles en la expresión de las toxinas SPE-C mutantes y/o fragmentos de las mismas. Un casete de expresión comprende una secuencia de ADN que codifique una toxina SPE-C mutante y/o fragmento de la misma con al menos un cambio en la secuencia de aminoácidos y al menos un cambio en la función biológica en comparación con una proteína que sustancialmente corresponda a la toxina SPE-C natural unida operativamente a un promotor funcional de la célula anfitriona. Los casetes de expresión se incorporan a vectores de transformación y se producen las toxinas SPE-C mutantes en células transformadas. A continuación pueden purificarse las toxinas mutantes a partir de las células anfitrionas o de los sobrenadantes de las células anfitrionas. Las células anfitrionas transformadas también resultan útiles como composiciones de las vacunas.

Las toxinas SPE-C mutantes o los fragmentos de las mismas también pueden formarse analizando y seleccionando mutantes espontáneas de un modo similar al descrito en relación con la mutagenia de posición específica o aleatoria. Las toxinas SPE-C mutantes pueden generarse utilizando la mutagenia in vitro o semisintéticamente a partir de fragmentos producidos mediante cualquier procedimiento. Finalmente, las toxinas SPE-C mutantes pueden generarse utilizando la síntesis química.

Un métodos de producción de toxinas SPE-C mutantes o fragmentos de las mismas comprende la transformación o la transfección de la célula hospedador con un vector que comprende dicho casete de expresión y el cultivo de las células anfitrionas bajo condiciones que permitan la expresión de dichas toxinas SPE-C mutantes o fragmentos de las mismas por parte de las células anfitrionas.

Secuencias de ADN que codifican las toxinas SPE-C mutantes

Una secuencia de ADN mutante que codifica una toxina SPE-C mutante que presenta al menos un cambio en la secuencia de aminoácidos puede formarse mediante diversos métodos en función del tipo de cambio seleccionado. Una secuencia de ADN que codifica una proteína que corresponde sustancialmente a la toxina SPE-C natural actúa como molde de ADN utilizado para generar secuencias de ADN que codifiquen toxinas SPE-C mutantes. Una secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-C natural se ilustra en la Figura 1.

Para realizar un cambio o cambios específicos en una posición o posiciones específicas se prefiere que la PCR se utilice según el métodos de Perrin et al., citado anteriormente. Para dirigir el cambio en una posición particular, los cebadores internos que comprenden el código de nucleótidos alterado para el cambio en la secuencia de aminoácidos se incluyen en una mezcla que también comprende cebadores flanqueadores 5' y 3'. Un cebador flanqueador 5' consiste en un homólogo de una región de ADN, o que hibrida con la misma, en la dirección 5' en la posición de inicio de la traducción de la secuencia transcrita de la SPE-C natural. Preferentemente, la región flanqueadora 5' se encuentra en la dirección 5' del cebador speC y la región reguladora. Por ejemplo, un cebador flanqueador 5' puede consistir en un homólogo de una región de aproximadamente 760 bases, o que hibride con la misma, en la dirección 5' de la posición de inicio de la traducción. Un cebador flanqueador en dirección 3' consiste en un homólogo de una región de ADN, o que hibride con la misma, en la dirección 3' del codón de terminación de la secuencia transcrita de la SPE-C natural. Se prefiere que el cebador flanqueador 3' proporcione las señales de terminación de la transcripción y de la traducción. Por ejemplo, un cebador flanqueador 3' puede hibridar con una región, o ser un homólogo de dicha región, de 200 pares de bases en la dirección 3' del codón de terminación de la secuencia transcrita de la SPE-C. Los cebadores flanqueadores en las direcciones 5' y 3' se encuentran presentes en cada PCR a fin de garantizar que el producto resultante de la PCR comprenda el promotor del speC y la región reguladora en la dirección 5' y las señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los expertos en la materia pueden construir con facilidad otros cebadores en la dirección 5' y en la dirección 3'. Aunque resulte preferible, no es en absoluto necesario que el promotor speC natural y la región reguladora en la dirección 5' se encuentren comprendidos en el producto de la PCR.

Los cebadores internos pueden diseñarse a fin de generar un cambio en una posición específica utilizando una secuencia de ADN que codifique la SPE- C natural. Los cebadores pueden diseñarse para codificar una sustitución de un aminoácido específico en una posición específica. Los cebadores pueden diseñarse de modo que se produzca una sustitución aleatoria en una posición particular tal como se describe en Rennell et al., J. Mol. Biol. 22:67 (1991). Los cebadores pueden diseñarse de modo que se produzca la eliminación de un aminoácido en una posición particular. Los cebadores también pueden diseñarse a fin de añadir una secuencia transcrita para un aminoácido adicional en una posición particular.

Los cebadores presentan preferentemente entre aproximadamente 15 y 50 nucleótidos de longitud, más preferentemente entre 15 y 30 nucleótidos de longitud. Los cebadores se preparan preferentemente mediante síntesis automática. Los cebadores flanqueadores en la dirección 5' y en la dirección 3' hibridan preferentemente con las secuencias flanqueadoras de ADN que codifican la secuencia transcrita de la toxina SPE-C natural. Dichos cebadores flanqueadores preferentemente comprenden aproximadamente 10 nucleótidos que son homólogos o complementarios al 100% con las secuencias flanqueadoras del ADN. Los cebadores internos no son complementarios al 100% con la secuencia de ADN que codifica los aminoácidos en la posición debido a que codifican un cambio en dicha posición. Un cebador interno puede presentar aproximadamente de 1 a 4 emparejamientos incorrectos en la secuencia de la SPE-C natural en un cebador de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos de longitud. Tanto los cebadores flanqueadores como los cebadores internos pueden también comprender nucleótidos adicionales que codifiquen posiciones de restricción y posiciones de pinzamiento, preferentemente próximas al extremo del cebador. Las condiciones de hibridación pueden modificarse a fin de tomar en consideración el número de emparejamientos incorrectos presentes en el cebador según los principios conocidos tal como se han descrito en Sambrook et al., Molecular Cloning - A laboratory manual ("Clonación molecular - Manual de laboratorio"), Cold Spring Harbor Laboratory Press,
(1989).

Puede utilizarse más de un cebador interno si se pretenden cambios en más de una posición. Un método de la PCR para generar cambios de posición específica en más de una posición se describe en Aiyar et al., citado anteriormente. Otro método se describe en el Ejemplo 5.

En un método, se genera una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-C mutante con un cambio en una posición particular y a continuación se utiliza como molde para generar una secuencia de ADN mutante con un cambio en la segunda posición. En una primera serie de la PCR, se utiliza un primer cebador interno destinado a generar la secuencia de ADN mutante con el primer cambio. La secuencia de ADN mutante con el primer cambio se utiliza a continuación como ADN de molde y se utiliza un segundo cebador interno que codifica un cambio en una posición distinta a fin de formar una secuencia de ADN que codifique una toxina mutante con cambios en la secuencia de aminoácidos en dos posiciones. Los métodos de la PCR pueden utilizarse para generar secuencias de ADN que codifiquen secuencias de aminoácidos que presenten aproximadamente de 2 a 6 cambios.

Un método preferido de PCR se describe en Perrin et al., citado anteriormente. Brevemente, las condiciones de la PCR son las siguientes: se realiza la PCR en una mezcla de reacción de 100 \mul que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH = 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, 200 \muM de cada dNTP, 2 ng de ADN plasmídico de molde, 100 pmol de cebador flanqueador, 5 pmol de cebador interno, y 2,5 unidades Ampli Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer Cetus). En la segunda etapa de amplificación, la composición de la mezcla de reacción es como la anterior excepto en la igualdad de la molaridad (5 pmol de cada) del cebador flanqueador y del megaprimer y 1 \mug de molde. Se realiza la PCR durante 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC X 1 minuto, hibridación a 37ºC o 44ºC X 2 minutos y elongación a 72ºC durante 3 minutos.

Se aíslan los productos de la PCR y a continuación se clonan en un vector transportador (tal como el pMIN 164 tal como se construye mediante el método de Murray et al., J. Immunology 152: 87 (1994) y disponible en Dr. Schlievert, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN. El vector consiste en una quimera del plásmido pBR328 de E. coli que es portador de la resistencia a la ampicilina y el plásmido estafilocócico pE194 que proporciona resistencia a la eritromicina. Las mezclas de los plásmidos ligados se seleccionan en E. coli en relación con la producción de la toxina utilizando anticuerpos policlonales neutralizantes contra la SPE-C natural de Toxin Technologies, Boca Raton, Fla. o Dr. Schlievert. Las toxinas SPE-C mutantes se secuencian mediante el método de Hsiao et al., Nucleic Acid Res. 19:2787 (1991) a fin de confirmar la presencia de la mutación deseada y la ausencia de otras mutaciones.

Los expertos en la materia comprenderán que debido a la degradación del código genético diversas secuencias de ADN pueden codificar los mismos cambios en los aminoácidos. La invención comprende secuencias de ADN que presentan distintas secuencias de nucleótidos pero que codifican los mismos cambios en la secuencia de aminoácidos.

Para la mutagenia aleatoria en una posición particular se diseña una serie de cebadores que producen la sustitución de cada uno de los otros 19 aminoácidos o aminoácidos sintéticos en una posición particular. La PCR se realiza de un modo similar al descrito anteriormente o mediante el método descrito por Rennell et al. citado anteriormente. Los productos de la PCR se subclonan y a continuación puede realizarse el seguimiento de la producción de la toxina mediante la provocación de una reacción inmunitaria con anticuerpos policlonales neutralizantes contra la SPE-C natural. La presencia de un cambio en la secuencia de aminoácidos puede verificarse al secuenciar la secuencia del ADN que codifica la toxina SPE-C mutante. Preferentemente, las toxinas mutantes se examinan y se seleccionan en relación con su no letalidad.

También pueden emplearse otros métodos de mutagenia para generar mutaciones aleatorias en la secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-C natural. Las mutaciones aleatorias o la mutagenia aleatoria tal como se utiliza en el presente contexto significan mutaciones que no se encuentran en una posición seleccionada y/o no consisten en un cambio seleccionado. Puede someterse a mutagenia una célula bacteriana que comprenda una secuencia de ADN que codifique la toxina SPE-C natural utilizando otros métodos estándar tales como la mutagenia química y la irradiación con rayos UV. Las mutantes generadas de este modo pueden seleccionarse con respecto a la producción de toxinas utilizando anticuerpos policlonales neutralizantes contra la SPE-C natural. Sin embargo, resulta necesaria una nueva selección para identificar las toxinas mutantes que presentan al menos un cambio en la actividad biológica, preferentemente que no sean letales. Las mutantes que surgen espontáneamente también pueden seleccionarse con respecto a como mínimo un cambio en la actividad biológica de la SPE-C mutante.

La mutagenia aleatoria también puede realizarse utilizando la mutagenia in vitro tal como describen Anthony-Cahilli et. al., Trends Biochem. Sci. 14:400 (1989).

Además, las toxinas SPE-C mutantes pueden formarse utilizando síntesis química. Un método de síntesis química de una proteína se describe en Wallace, FASEB. J. 7:505 (1993). Se pueden sintetizar partes de una proteína y a continuación unirse utilizando enzimas o mediante condensación química directa. La utilización de la síntesis química resultaría especialmente útil para permitir que los expertos en la materia inserten aminoácidos sintéticos en las posiciones deseadas. Además, la síntesis química resultaría especialmente útil para crear fragmentos de toxinas SPE-C mutantes.

Cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria resultaría útil para formar fragmentos de toxinas SPE-C mutantes. Además, los fragmentos podrían generarse con facilidad utilizando la digestión y/o ligación con enzimas de restricción. El método preferido para generar fragmentos consiste en la síntesis química para fragmentos de 20 aminoácidos o menos o mediante la clonación genética en el caso de fragmentos mayores.

Las secuencias de ADN que codifican las toxinas mutantes, tanto de posición específica como aleatorias, pueden seleccionarse de nuevo con respecto a otros cambios en la actividad biológica de la toxina SPE-C natural. Los métodos de selección de un cambio en como mínimo una actividad biológica tal como se ha descrito anteriormente. Una las secuencias de ADN seleccionadas que codifican las toxinas SPE-C mutantes se han seleccionado con respecto a como mínimo un cambio en la actividad biológica, se utilizan para formar un casete de expresión.

La formación de un casete de expresión implica la combinación de secuencias de ADN que codifican la toxina SPE-C mutante con un promotor que proporciona la expresión de una toxina SPE-C mutante en una célula anfitriona. En aquellas toxinas SPE-C mutantes producidas utilizando la PCR tal como se ha descrito en la presente memoria, se encuentra presente el promotor del speC natural y proporciona la expresión en una célula anfitriona.

Opcionalmente, la secuencia de ADN puede combinarse con un promotor distinto para proporcionar la expresión en un tipo de célula anfitriona particular o aumentar el nivel de expresión en una célula anfitriona. Preferentemente, el promotor proporciona un nivel de expresión de la toxina SPE-C mutante de modo que puede detectarse con anticuerpos contra la SPE-C. Otros promotores que pueden utilizarse en células procariotas comprenden el PLAC, el PTAC, el T7 y similares.

Una vez la secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-C mutante se combina con un promotor apto para formar un casete de expresión, el casete de expresión se subclona en un vector de transformación apto. Los vectores de transformación aptos comprenden al menos un marcador genético seleccionable y preferentemente consisten en vectores transportadores que se pueden amplificar en E. coli y en microorganismos grampositivos. Los ejemplos de vectores transportadores aptos comprenden el pMIN 164 y el pCE 104. Otros tipos de vectores comprenden los vectores víricos tales como el vector del baculovirus, SV40, poxvirus como vacuna, adenovirus y citomegalovirus. El vector preferido es el vector pMIN 164, un vector transformador que se puede amplificar en E. coli y S. aureus.

Una vez se ha formado el vector de transformación siendo portador del casete de expresión que codifica una toxina SPE-C mutante, se introduce en una célula anfitriona apta que permite la expresión de la toxina SPE-C mutante. Las células anfitrionas aptas consisten en células que permiten un nivel de expresión elevado de la toxina mutante al mismo tiempo que minimizan la posibilidad de contaminación con otras moléculas no deseadas tales como las endotoxinas y las proteínas M. Las células anfitrionas aptas comprenden las células de mamíferos, las células bacterianas tales como las de S. aureus, E. coli y Salmonella spp., células de levaduras, y células de insectos.

Los métodos de transformación resultan conocidos por los expertos en la materia y comprenden la transformación de protoplastos, la transformación en la que intervienen liposomas, la precipitación del fosfato cálcico y la electroporación. El método preferido es la transformación de protoplastos.

Las células transformadas resultan útiles para producir grandes cantidades de toxina SPE-C mutante que puede utilizarse en las composiciones de las vacunas. Puede utilizarse un microorganismo transformado en una vacuna elaborada con microbios vivos, en una vacuna atenuada o en una vacuna elaborada con microbios muertos mediante el calor. Un microorganismo transformado comprende la toxina SPE-C mutante en cantidades suficientes que permitan estimular una respuesta inmunitaria protectora contra la SPE-C natural. Preferentemente, se secreta la toxina SPE-C mutante. El microorganismo preferentemente no resulta patógeno para los humanos y comprende una toxina mutante con múltiples cambios en la secuencia de aminoácidos para minimizar la reversión a la forma tóxica. El microorganismo puede administrarse tanto como vacuna elaborada con microbios vivos como en forma de vacuna elaborada con microbios muertos mediante el calor según principios muy conocidos. Los organismos preferidos para las vacunas elaboradas con microbios vivos consisten en células transformadas tales como Salmonella spp.

También puede utilizarse en una composición de una vacuna un vector vírico que comprenda un casete de expresión con una secuencia de ADN que codifique una toxina SPE-C mutante o fragmento de la misma unido operativamente a un promotor funcional en una célula anfitriona tal como se ha descrito en la presente memoria. Preferentemente, el promotor es funcional en una célula de mamífero. Un ejemplo de vector vírico apto comprende los poxvirus tales como el virus de la variolovacuna, adenovirus, citomegalovirus y similares. Los vectores del virus de la variolovacuna podrían utilizarse para inmunizar humanos contra al menos una actividad biológica de la toxina SPE-C natural.

La invención también comprende una composición para una vacuna que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una toxina SPE-C mutante o fragmento de la misma unido operativamente a un promotor funcional en una célula hospedador. El promotor es preferentemente funcional en una célula anfitriona de un mamífero. La secuencia de ácido nucleico puede ser de ADN o de ARN. Las composiciones para las vacunas se administran a una célula o individuo anfitrión para que se exprese la toxina SPE-C mutante o fragmento de la misma en las propias células del individuo. La expresión de las secuencias de ácido nucleico de la toxina SPE-C mutante o de un fragmento de la misma en el individuo proporciona una respuesta inmunitaria protectora contra la toxina SPE-C natural. Opcionalmente, el casete de expresión puede incorporarse a un vector. Una molécula de ácido nucleico puede administrarse tanto directamente como en un vector vírico. La composición de la vacuna puede también comprender opcionalmente un agente de administración que permita la administración de la vacuna por vía intracelular tal como los liposomas o similares. La composición de la vacuna puede también comprender opcionalmente aditivos u otros compuestos moduladores de la respuesta inmunitaria, y compuestos adicionales que aumenten la absorción de los ácidos nucleicos en las células. La composición de la vacuna puede administrarse por diversas vías comprendiendo las vías parenterales tales como la intravenosa, la intraperitoneal o mediante el contacto con las mucosas.

Las condiciones para una producción y proliferación a gran escala de la toxina SPE-C mutante resultan conocidas para los expertos en la materia. Un método de purificación de las toxinas SPE-C mutantes a partir de fuentes microbianas se expone a continuación. Se hace proliferar S. aureus portador de los speCs mutante o natural en el pMIN 164 a 37ºC con aireación en fase estacionaria en un medio de cultivo de corazón bovino dializable que contiene 5 \mug/ml de eritromicina. Se precipitan los cultivos con 4 volúmenes de etanol y proteínas resolubilizadas en agua sin pirógeno. Las preparaciones brutas se someten a separaciones mediante isolectroenfoque en lecho plano a unos gradientes de pH de 3,5 a 10 y de 4 a 6. Las fracciones que resultan positivas a la toxina mediante la reactividad de los anticuerpos se dializan exhaustivamente contra el agua sin pirógeno, y una alícuota de cada se analiza en relación con su pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de SDS en geles al 15% (peso/volumen). Los anticuerpos policlonales neutralizantes contra la SPE-C pueden obtenerse en Toxin Technologies, Boca Raton, Fla. o Dr. Schlievert. Pueden emplearse otros métodos de purificación que comprenden la cromatografía en columna o la HPLC.

La presente invención se podrá comprender mejor mediante los siguientes ejemplos que son representativos de las formas de realización preferidas de la misma, pero que no se interpretan como limitaciones del campo de la invención.

Ejemplo 1 Clonación y expresión de la SPE-C natural Clonación y expresión del speC en E. coli

A fin de evitar la necesidad de detectar la toxina para el aislamiento genético, se sintetizaron y se utilizaron oligonucleótidos específicos del gen SPE-C para seleccionar una genoteca genómica. Se digirió parcialmente ADN estreptocócico purificado a partir de la cepa T18P con la nucleasa de restricción Sau 3A y se separó en un gel de agarosa al 0,7%. Los fragmentos comprendidos entre 4 y 8 kilobases se eluyeron del gel y se ligaron al plásmido vector pBR328, que se había sometido a linearización con BAM HI y se desfosforiló para evitar su autoligación. El ADN ligado se utilizó a continuación para transformar las células competentes de E. coli RR1 con respecto a la resistencia a la ampicilina. Se hizo proliferar las transformantes en filtros de nitrocelulosa revestidos con agar LB que contenía ampicilina. Se prepararon unos filtros de repetición y se examinaron aproximadamente 1500 colonias recombinantes con respecto a la presencia del gen speC mediante la hibridación de las colonias con oligonucleótidos sintéticos marcados radiactivamente. Las dos familias de oligonucleótidos con la secuencia mezclada se obtuvieron a partir de la secuencia hexapeptídica, Asp-Ser-Lys-Lys-Asp-Ile, que corresponde a los seis primeros aminoácidos del extremo amino terminal de la proteína SPE-C madura (Figura 1). Los oligonucleótidos se separaron en dos familiar a fin de controlar la redundancia de las sondas y de ese modo minimizar la hibridación no específica. Se encontraron dos colonias que hibridaban con la familia A de oligonucleótidos. No se encontraron colonias que hibridasen con la familia B. Los clones de hibridación se analizaron con respecto a la expresión de la SPE-C mediante la precipitación con antisuero de SPE-C en pruebas de inmunodifusión mediante la prueba (test) de Ouchterlony. El lisado de uno de los clones seleccionados formó una línea de identidad de precipitina con la SPE-C purificada. El plásmido recombinante que contenía el speC se designó como pUMN 501. En el fluido sobrenadante del medio de cultivo de RR1 pUMN 501 no se encontraron cantidades detectable de SPE-C, sugiriendo que la E. coli era incapaz de secretar la toxina.

Subclonación

El inserto contenido en el pUMN 501 presentaba aproximadamente 4,0 kilobases y limitaba con las posiciones del Sau 3A. La digestión con Xbal produjo un fragmento de 2,4 y uno de 1,6 kilobases, ninguno de los cuales provocaba la expresión del speC cuando se ligaba al pUC13 y se transformaba en E. coli JM 101 (pUMN 512 y pUMN511, respectivamente). El fragmento mayor Sau 3A - Sal I (3,3 kilobases) expresó el speC en la E. coli JM 101 (pUMN 513). El gen se expresó en cualquier orientación con respecto al promotor del plásmido, sugiriendo que el promotor estreptocócico nativo se encontraba presente en el inserto y era funcional en E. coli. El gen speC se localizó además al clonar un fragmento Sau 3A - Sal I de 3,3 kilobases en un bacteriófago M13 y utilizando el procedimiento de Dale et al., Plasmid 13:31 - 40 (1985) para generar subclones de deleción. Un fragmento de 1,7 kilobases aislado a partir de un subclón M13 y ligado al pUC13 (pUMN 521) fue capaz de expresar el speC en E. coli.

Ejemplo 2 Caracterización bioquímica de la SPE-C obtenida a partir de E. coli

La SPE-C codificada por el UMN 501 se purificó parcialmente a partir de extractos de E. coli RR1 mediante la precipitación con etanol y a continuación un isolectroenfoque de preparación en un gradiente de pH de 3,5 a 10. La toxina obtenida a partir de la E. coli migró a aproximadamente la misma posición (entre 6,5 y 7,2) que la toxina obtenida de los estreptococos. La SPE-C obtenida de la E. coli y la obtenida de los estreptococos presentaban unos pesos moleculares idénticos de 24.000 en SDS-PAGE. A pesar de que en la preparación de E. coli se encontraban presentes proteínas adicionales, únicamente las proteínas con pesos moleculares de 24.000 reaccionaron cuando se analizaron mediante una técnica de inmunotransferencia enzimática que utiliza un antisuero específico de la SPE-C.

Ejemplo 3 Caracterización biológica de la SPE-C obtenida a partir de E. coli

La SPE-C obtenida a partir de la E. coli y la obtenida a partir de los estreptococos se compararon con respecto a su mitogenia en los linfocitos. Se expusieron esplenocitos de conejo (2 x 10^{5} células) a aproximadamente 0,01 \mug de SPE-C obtenida de S. pyogenes o de E. coli (pUMN 501). 3 días más tarde, se sometieron a impulsos con 1 uCi [^{3}H]-timidina y se incubaron durante 24 horas, y tras la incorporación de las radiomarcas en el ADN celular, se procedió a la determinación cuantitativa. Ambas preparaciones de toxinas provocaron unas respuestas mitógenas similares. La incubación con antisuero de SPE-C redujo significativamente la respuesta mitógena tanto de la toxina clonada como de la obtenida a partir de los estreptococos.

También se compararon la SPE-C obtenida a partir de los estreptococos y la obtenida a partir de la E. coli con respecto a la pirogenia y la intensificación del choque letal producido por la endotoxina en conejos. La SPE-C obtenida a partir de los estreptococos y la obtenida a partir de la E. coli resultaron igualmente pirógenas; el incremento medio de la temperatura para ambas preparaciones fue de 1,0°C tras 4 h. Las respuestas de fiebre fueron monofásicas, en lugar de bifásicas como resulta característico de la endotoxina. Ello sugiere que la fiebre era atribuible a la SPE-C y no debido a una contaminación por endotoxinas. Los animales tratados tanto con la SPE-C obtenida a partir de la E. coli como con la obtenida a partir de los estreptococos presentaron una intensificación en la susceptibilidad al choque provocado por la endotoxina. Todos los conejos de control, que recibieron únicamente PBS y la endotoxina, sobrevivieron.

Los presentes estudios confirman que la SPE-C expresada en E. coli en forma biológicamente activa, y las actividades atribuidas a la SPE-C no fueron debidas a un contaminante estreptocócico copurificado.

Ejemplo 4 Administración e inmunización de conejos con SPE-C producida mediante recombinación (p)

Se administró la SPE-C producida mediante recombinación a conejos a una dosis total de 200 \mug en 0,2 ml durante un período de 7 días. Los resultados indican que los animales tratados con la SPE-C presentaron los criterios del STSS falleciendo prácticamente todos los animales durante el período de 7 días (no se presentan los datos). Los síntomas del STSS en conejos comprenden la pérdida de peso, diarrea, rostro moteado, fiebre, conjuntivas y mucosas enrojecidas, y orina de un color marrón claro. Tal como se esperaba, los animales de control no tratados con la toxina permanecieron sanos. Se realizaron dos observaciones importantes más: 1) la sustitución de fluidos proporcionó una protección completa a los animales tal como se esperaba, y 2) ninguno de los animales tratados con la toxina presentó fascitis necrosante y miositis, indicando que se requiere otros factores distintos a la SPE-C, o además de ellos, para producir lesiones en los tejidos blandos. El desarrollo de las características clínicas del STSS se correlaciona con la administración de la SPE-C.

Ejemplo 5 Preparación de mutantes dobles o triples de la SPE-C utilizando la PCR

Existen diversos métodos que se utilizan para generar mutantes dobles o triples de las toxinas SPE-C o fragmentos de las mismas.

Las toxinas mutantes SPE-C que presentan dos o más cambios en las secuencias de aminoácidos se preparan utilizando la PCR tal como se ha descrito previamente. En una primera PCR, un primer cebador interno que codifica un primer cambio en una posición seleccionada se combinó con los cebadores flanqueadores en la dirección 5' y en la dirección 3' para formar un primer producto de la PCR. El primer producto de la PCR consistió en una secuencia de ADN que codificaba una toxina SPE-C mutante que presentaba un cambio en la secuencia de aminoácidos. Dicho primer producto de la PCR sirvió a continuación de ADN de molde para generar un segundo producto de la PCR con dos cambios en la secuencia de aminoácidos en comparación con una proteína que presente la actividad de la SPE-C natural. El primer producto de la PCR fue un ADN de molde que se combinó con un segundo cebador interno que codifica un cambio en la secuencia de aminoácidos en una segunda posición. El segundo cebador interno también se combinó con cebadores flanqueadores en la dirección 5' y en la dirección 3' para formar un segundo producto de la PCR. El segundo producto de la PCR consistió en una secuencia de ADN que codificaba una toxina SPE-C mutante que presentaba cambios en dos posiciones de la secuencia de aminoácidos. Dicho segundo producto de la PCR se utilizó a continuación como molde en una tercera reacción para formar una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-C mutante con cambios en tres posiciones de la secuencia de aminoácidos. Dicho método se utiliza para generar secuencias de ADN que codifican toxinas mutantes que presentan más de un cambio en la secuencia de
aminoácidos.

Un método alternativo de preparación de secuencias de ADN que codifiquen más de un cambio consiste en preparar fragmentos de la secuencia de ADN que codifiquen el cambio o cambios de la secuencia de aminoácidos mediante síntesis automática. A continuación se subclonan los fragmentos en la secuencia que codifica la SPE-C natural utilizando diversas posiciones de restricción particulares. Las posiciones de restricción resultan conocidas por los expertos en la materia y se determinan con facilidad a partir de la secuencia de ADN de una toxina SPE-C natural. La clonación se realiza en una única etapa con el método de ligación de tres fragmentos tal como han descrito Revi et al, Nucleic Acid Res. 16:1030 (1988).

Ejemplo 6 Análisis de las mutantes simples y dobles de la SPE-C

Se crearon tres mutantes de la SPE-C con un único cambio en la secuencia de aminoácidos: a) Y15A en el que la tirosina de la posición 15 se cambió por una alanina, b) Y17A en el que la tirosina de la posición 17 se cambió por una alanina, c) N38A en el que la asparagina de la posición 38 se cambió por alanina. Se crearon dos mutantes de la SPE-C con dos cambios en la secuencia de aminoácidos: a) Y15A/N38A, b) Y17A/N38A. Todos los mutantes se construyeron mediante la utilización del método Quick Change (Stratagene, La Jolla, CA) con el plásmido pUMN521 que contiene el speC como molde. El pUMN521 es portador del gen de la SPE-C (speC) en pUC13 (Goshorn et al.).

Las proteínas mutantes con un único cambio en la secuencia de aminoácidos se crearon en Escherichia coli, en cultivos de 100 ml. Tras la proliferación en presencia de 50 \mug/ml de ampicilina, los cultivos de E. coli se trataron con 400 ml de etanol a -20ºC a fin de lisar las células y precipitar las proteínas SPE-C mutantes. El pUMN521 en E. coli se trató de un modo comparable para utilizarlo como control positivo. Se recogieron los precipitados y se restituyeron a 1 ml. Se estimó que las concentraciones de la toxina eran de 25 \mug/ml.

La SPE-C natural obtenida del pUMN521 y las mutantes con tres cambios en la cadena de aminoácidos se analizaron con respecto a su capacidad para provocar la proliferación de esplenocitos en conejos con una dosis de la toxina comprendida entre 0,25 y 2,5 x 10^{-5} ó 2,5 x 10^{-6}. Tal como se indica en la Figura 7, las mutantes Y15A y N38A presentaron aproximadamente la mitad de la actividad mitógena que la natural. La mutante Y17A esencialmente no resultó mitógena (Figura 8).

Las doble mutantes Y15A/N38A y Y17A/N38A también se analizaron con respecto a su capacidad para estimular los esplenocitos de conejo en comparación con la toxina natural (Figura 9). Ambas mutantes estimularon los esplenocitos de conejo únicamente en una cuarta parte de lo que se observaba con cantidades comparables de toxina natural.

Ambas mutantes también se analizaron en relación con su capacidad para intensificar el choque provocado por la endotoxina. Tres conejos/grupo fueron expuestos por vía intravenosa a 5 \mug/kg de las toxinas mutantes o de la toxina natural. Tras 4 horas, los mismos animales fueron expuestos a 10 \mug/kg de la endotoxina de Salmonella typhimurium (1/50 DL_{50}). Se registraron los fallecimientos durante un período de 48 horas (Tabla 4). Tal como se indica, ninguna de las dos mutantes provocó letalidad alguna en los conejos.

TABLA 4 Capacidad de las SPE-C mutantes con dos cambios en la secuencia de aminoácidos para intensificar la susceptibilidad de los conejos al choque provocado por la endotoxina

Proteína del tratamiento		Número de fallecimientos
		Total de conejos analizados
	SPE-C natural	3/3
	Y15A/N38A	0/3
	Y17A/N38A	0/3
Nota: en el estudio presentado en la Tabla 4, se expusieron todos los conejos por vía intravenosa A 5 \mug/kg de
proteína y 4 horas más tarde con la endotoxina (10 \mug/kg).

Una semana después de la exposición de los ratones presentada en la Tabla 4, se procedió a la eutanasia de los animales y se los examinó con respecto a lesiones tisulares importantes. Todos los órganos, comprendiendo el hígado, el bazo, los riñones, los pulmones y el corazón resultaron normales. Ello resulta coherente con la falta de toxicidad de las mutantes dobles.

Dichos ratones/grupo también resultaron inmunizados con dos dosis semanales de 25 \mug de mutantes dobles de SPE-C emulsionadas con el aditivo incompleto de Freund. Se dejó reposar los animales durante 5 días. Se recogieron 0,5 ml de sangre de cada animal y se mezclaron para recoger los sueros de Y15A/N38A y Y17A/N38A. Los sueros de dichas mezclas se compararon con el suero preinmune mezclado mediante ELISA basada en la peroxidasa (referencia Hudson y Hay) para anticuerpos contra la SPE-A natural purificada obtenida a partir de estreptococos. La Tabla 5 resume los resultados de la ELISA.

TABLA 5 Valores ELISA de los anticuerpos de conejos inmunizados contra las mutantes Y15A/N38A y Y17A/N38A de SPE-C *

			Muestra analizada	Valor ELISA
Y15A/N38A	Preinmune	<10*
	Inmune	80
Y17A/N38A	Preinmune	<10*
	Inmune	80
* \begin{minipage}[t]{155mm}Los sueros a analizar en relación con los anticuerpos se diluyeron dos veces empezando a 1:10. El valor del anticuerpo es el recíproco de la última disolución que proporcionó una absorbancia a 490 nm de 0,1 o superior.\end{minipage}

Los animales inmunizados a continuación se expusieron a 5 \mug/kg de SPE-C natural y 4 horas más tarde a 10 \mug/kg de la endotoxina de Salmonella typhimurium como análisis de la capacidad de inmunizar contra la letalidad. La tabla 6 indica el número de animales que resultaron protegidos contra la letalidad de dicha exposición y de este modo resultaron inmunes a la SPE-C.

TABLA 6 Exposición de los animales inmunes a Y15A/N38A y Y17A/N38A con la SPE-C natural y la endotoxina

\hskip1,8cm Grupo de conejos	Número de fallecimientos/Total analizados
No inmune	2/2
Inmune a Y15A/N38A	0/3
Inmune a Y17A/N38A	0/3

Se prepararon también mutantes adicionales de la SPE-C con un único cambio en la cadena de aminoácidos. Éstas comprenden residuos en tres dominios importantes que pueden resultar necesarios en relación con la toxicidad. Éstos comprenden el dominio de enlace con el receptor de los linfocitos T, el dominio de enlace con el MHC de clase II y los residuos que se encuentran a lo largo de la parte posterior de la diagonal central de la hélice \alpha. Los residuos cambiaron y el efecto de la mutación de los linfocitos T se listan en la Tabla 7.

TABLA 7 Efecto de las mutantes de la SPE-C en la mitogenia y la letalidad de los linfocitos T

Mutante		Actividad biológica
		Mitogenia^{a}	Letalidad^{b}
	D12A	no analizada	012
	H35A	100% de la natural	no analizada
	N38D	no analizada	012
	K135D	50% de la natural	no analizada
	K138D	62% de la natural	no analizada
	Y139A	54% de la natural	no analizada
	D142N	52% de la natural	no analizada
^{a} La comparación se realizó a una dosis de 0,1 \mug/pocillo
^{b} \begin{minipage}[t]{140mm}Número de conejos fallecidos/total inyectados debido a una intensificación de la susceptibilidad a la endotoxina; 2/2 animales que recibieron la SPE-C natural fallecieron.\end{minipage}

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Regents of the University of Minnesota

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MUTANTES DE LA TOXINA ESTREPTOCÓCICA C Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA

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(A)

DESTINATARIO: Merchant, Gould, Smith, Edell, Welter & Schmidt

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(B)

CALLE: 3100 Norwest Center, 90 South 7th Street

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(C)

CIUDAD: Mineápolis

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(D)

ESTADO: MN

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 55402

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(v)

FORMA LEÍBLE POR EL ORDENADOR

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(A)

SOPORTE: Disquete

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(B)

ORDENADOR: Compatible IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

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(D)

SOFTWARE: FastSEQ para Windows versión 2.0

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/22125

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 de diciembre de 1997

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 60/033.251

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 de diciembre de 1996

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(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE / ABOGADO:

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(A)

NOMBRE: Skoog, Mark T.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 40.178

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA / RESGUARDO: 600.347WO/1

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES

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(A)

TELÉFONO: 612-332-5300

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(B)

FAX: 612-332-9081

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(C)

TÉLEX:

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(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID. N° 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 936 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE / CLAVE: Secuencia transcrita

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(B)

POSICIÓN: 154...858

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(D)

OTRA INFORMACIÓN:

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID. N° 1:

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\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID. N° 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 235 pares de bases

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID. N° 2:

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5

Claims (18)

1. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C que comprende de una a seis sustituciones en la secuencia de aminoácidos en la que:

la hoja \beta 4 de la subunidad B 5 comprende los aminoácidos treonina 33, histidina 35 o asparagina 38;

el giro 6 comprende los aminoácidos asparagina 38 o ácido aspártico 40;

la cadena 12 comprende los aminoácidos treonina 41, lisina 43 o arginina 45;

la cadena 21 comprende los aminoácidos isoleucina 51, serina 53, metionina 55 o serina 56;

la hélice \alpha 24 comprende el aminoácido alanina 186;

la unión entre el giro 13 y la cadena 21 comprende la tirosina 50;

la cadena 28 comprende el aminoácido tirosina 85;

el giro 29 comprende el aminoácido histidina 81;

la unión entre el giro 29 y la cadena 32 comprende el aminoácido asparagina 79;

la cadena 32 comprende los aminoácidos fenilalanina 75, tirosina 76, isoleucina 77 o leucina 78;

la hélice \alpha irregular 24 comprende el aminoácido ácido aspártico 183;

el giro 39 comprende el aminoácido arginina 181;

el giro 43 comprende los aminoácidos tirosina 147, ácido aspártico 148, tirosina 156 o ácido glutámico 178;

la hélice \alpha N-terminal 51 comprende los aminoácidos serina 11, ácido aspártico 12, tirosina 15 o tirosina 17;

la hélice \alpha central 42 comprende los aminoácidos ácido glutámico 131, lisina 135, lisina 138, tirosina 139, ácido aspártico 142 o asparagina 143; o

el giro 16 comprende el aminoácido treonina 128,

en la que las posiciones de los aminoácidos se consideran con respecto a la Figura 1 en la que la numeración de los aminoácidos se inicia con la referencia numérica 1 para el aspartato 28.

2. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de la reivindicación 1, que comprende la sustitución de la treonina 33, la histidina 35, la leucina 37, la asparagina 38, el ácido aspártico 40, la treonina 41, la isoleucina 51, la serina 53, la metionina 55, la serina 56 o la alanina 186.

3. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de la reivindicación 1, que comprende la sustitución de la serina 11, el ácido aspártico 12, la tirosina 15, la tirosina 17, la tirosina 50, la fenilalanina 75, la tirosina 76, la isoleucina 77, la leucina 78, la asparagina 79, la histidina 81, la tirosina 85, la tirosina 147, el ácido aspártico 148, la tirosina 153, el ácido glutámico 178, la arginina 181 o el ácido aspártico 183.

4. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de la reivindicación 1, que comprende la sustitución de la treonina 128, el ácido glutámico 131, la lisina 135, la lisina 138, la tirosina 139, el ácido aspártico 142 o la asparagina 143.

5. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C, que comprende de una a seis sustituciones en la secuencia de aminoácidos que comprende el ácido aspártico 12, la tirosina 15, la tirosina 17, la histidina 35, la asparagina 38, la lisina 135, la lisina 138, la tirosina 139, el ácido aspártico 142, en la que las posiciones de los aminoácidos se consideran con respecto a la Figura 1 en la que las numeraciones de los aminoácidos se inicia con la referencia numérica 1 para el aspartato 28.

6. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de la reivindicación 5, que comprende la sustitución del ácido aspártico 12 por la alanina, el ácido glutámico, la asparagina, la glutamina, la lisina, la arginina, la serina o la treonina; la sustitución de la tirosina 15 por la fenilalanina, la alanina, la glicina, la serina o la treonina; la sustitución de la tirosina 17 por la fenilalanina, la alanina, la glicina, el ácido glutámico, la lisina, la arginina, el ácido aspártico, la serina o la treonina; la sustitución de la histidina 35 por la fenilalanina, la alanina, la glicina, el ácido glutámico, la lisina, la arginina, el ácido aspártico, la tirosina, la serina o la treonina; la sustitución de la asparagina 38 por la alanina, el ácido aspártico, el ácido glutámico, la lisina o la arginina; la sustitución de la lisina 135 por el ácido glutámico o el ácido aspártico; la sustitución de la lisina 138 por el ácido glutámico o el ácido aspártico; la sustitución de la tirosina 139 por la fenilalanina, la alanina, la glicina, el ácido glutámico, la lisina, la arginina, el ácido aspártico, la serina o la treonina; o la sustitución del ácido aspártico 142 por la alanina, el ácido glutámico, la asparagina, la glutamina, la serina, la treonina, la lisina o la arginina.

7. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de la reivindicación 6, que comprende la sustitución del ácido aspártico 12 por la alanina, la sustitución de la tirosina 15 por la alanina, la sustitución de la tirosina 17 por la alanina, la sustitución de la histidina 35 por la alanina, la sustitución de la asparagina 38 por el ácido aspártico, la sustitución de la lisina 135 por el ácido aspártico, la sustitución de la lisina 138 por el ácido aspártico, la sustitución de la tirosina 139 por la alanina o la sustitución del ácido aspártico 142 por la asparagina.

8. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de la reivindicación 5, que comprende la sustitución de la tirosina 15 y la asparagina 38.

9. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de la reivindicación 8, en la que las sustituciones comprenden la tirosina 15 por la alanina y la asparagina 38 por la alanina.

10. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de la reivindicación 5, que comprende la sustitución de la tirosina 17 y la asparagina 38.

11. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de la reivindicación 10, en la que las sustituciones comprenden la tirosina 17 por la alanina y la asparagina 38 por la alanina.

12. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la toxina no es letal y es antígena.

13. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la toxina no es letal pero conserva un nivel de mitogenia comparable al de la exotoxina pirógena estreptocócica natural de la toxina de tipo C.

14. Exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la toxina no intensifica el choque endotóxico.

15. Secuencia de ADN que codifica una exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

16. Célula anfitriona transformada de modo estable que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 15.

17. Uso de una exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para mejorar o tratar animales que presenten el síndrome de choque tóxico estreptocócico, tratar o mejorar los síntomas de la psoriasis en gotas, la fiebre reumática o las infecciones estreptocócicas invasivas.

18. Uso de una exotoxina pirógena estreptocócica mutante de la toxina de tipo C de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para vacunar un animal contra el síndrome de choque tóxico estreptocócico.