JPH11514844A

JPH11514844A - 連鎖球菌毒素ａの突然変異体および使用方法

Info

Publication number: JPH11514844A
Application number: JP9502265A
Authority: JP
Inventors: シュリバート、パトリック、エム; ロジャーニ、マヌエラ; ストア、ジェニファー; オーレンドルフ、ダグラス
Original assignee: リージェンツオブザユニバーシティーオブミネソタ
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-12-21
Also published as: KR100456594B1; DE69634510D1; ES2239332T3; AU723116B2; AU6278296A; US6632441B2; WO1996040930A1; DK0832241T3; US6870042B1; EP0832241B1; EP1538208A2; ATE291625T1; KR19990022750A; PT832241E; DE69634510T2; EP0832241A1; US20060039925A1; EP1538208A3; CA2221480A1; US20020054887A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメント、ワクチンおよび製剤組成物、ならびに、そのワクチンおよび製剤組成物の使用方法に関する。好適なＳＰＥ−Ａ毒素は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素を比較して、少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、実質的に非致死性である。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の生物活性に対して動物を防護するのに有用なワクチン組成物を形成し得る。

Description

【発明の詳細な説明】連鎖球菌毒素Ａの突然変異体および使用方法発明の背景 β−溶血性Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）としても知られているストレプトコッカスピオゲネス(streptococcus pyogenes)は、咽頭炎および膿痂疹などの軽い感染症の原因となり得るヒトの病原体である。ポスト感染症自己免疫的合併症、すなわち、リューマチ熱および急性糸球体腎炎が起こり得る。ＧＡＳはまた、猩紅熱および連鎖球菌毒素ショック症候群（ＳＴＳＳ）などの重い急性の病気の原因となり得る。重いＧＡＳ感染症は、今世紀初頭、米国および世界中において大きな問題であった。４０年代において、症例の数およびその重症度は、未だ完全には解明されない理由により着実に低下した。しかし、最近、米国において毎年、１万〜２万のＳＴＳＳの症例があるほど、ＧＡＳが原因の重い病気の復活が見られている。これらの患者のうち５０〜６０％もの人が壊死性筋膜炎および筋肉炎にかかり、３０〜６０％が死に至り、生存者の１／２が四肢を切断することになるであろう。１９８６年および１９８７年、ロッキー山脈地方に局所的に大発生した重いＧＡＳ感染症を２つのレポートが報告した。これらのレポートに続き、過去数年間に、類似の臨床症状をもつ病気を報告したレポートが幾つか出ている。この病気において報告された症状は、毒素ショック症候群（ＴＳＳ）において報告されたものと酷似しており、１９９２年、科学者の委員会において、この臨床での症状を正式にＳＴＳＳと名付けた。ＳＴＳＳは、以下の症状によって定義される。１．低血圧およびショック症状２．Ａ群連鎖球菌の単離３．２つ以上の以下の症状：３８．５℃以上の発熱、猩紅熱発疹、嘔吐および下痢、肝臓および腎臓の機能障害、成人呼吸困難症候群、広汎性血管内凝固、壊死性筋膜炎および／または筋肉炎、菌血。ＳＴＳＳ患者からの連鎖球菌の分離菌は、主にＭ型１および３であり、Ｍ１８および類型化できない生物が残りのほとんどを占めている。ＳＴＳＳに伴うＭ１、３、１８および無型の生物の大部分は、発熱性外毒素Ａ（ＳＰＥ−Ａ、猩紅熱毒素Ａ）を生成する。対照的に、一般的な連鎖球菌分離菌のうちこの毒素を生成するのは１５％にすぎない。さらに、ＳＰＥ−Ａのウサギの動物モデルへの投与および２回の人間への偶発的接種が、ＳＴＳＳの症状を再生し得る。ＳＰＥ−Ａは、２５，７８７ドルトンに等しい分子量を有する単一ペプチドであり、そのコード配列は、溶原性バクテリオファージＴ１２に保持される。ＳＰＥ−Ａの遺伝子であるspeＡはクローン化および大腸菌（Ｅscherichia coli）での発現に成功した。ＳＰＥ−Ａは、連鎖球菌およびブドウ状球菌によって生産される外毒素の大きな科のメンバーであり、発熱を起こし、宿主の内毒素への感受性を１０万倍にする能力に基づいて、発熱性毒素と呼ばれている。最近、これらの毒素は、抗原特異性にもかかわらず、Ｔ細胞受容体のβ鎖の可変部分の組成に応じて、Ｔリンパ球の大増殖を誘発する能力のために超抗原と呼ばれている。これらの毒素はまた、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの大放出を刺激する。この科の他のメンバーは、ＢおよびＣ型連鎖球菌発熱性外毒素、ブドウ球菌毒素ショック症候群毒素１、ブドウ状球菌エンテロックストキシン(enteroxtoxin)Ａ、Ｂ、Ｃｎ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨ、ならびに非Ａ群連鎖球菌発熱性外毒素である。これらの毒素は、類似の生化学的特性、生物活性および様々な程度の配列の類似を有する。ＳＴＳＳの最も重い症状は、低血圧およびショック症状であり、死に至る。血管内から組織間腔への液の漏出が、低血圧の決定的な原因であると一般に考えられており、これは液交換療法が上記のＳＴＳＳのウサギのモデルでのショック症状の防止に効くという観察によって裏付けされている。ＳＰＥ−Ａは、この病理学を誘発するために宿主に幾つかの方法で作用し得るという仮説がある。ＳＰＥ−Ａは、肝臓クッパー細胞の活性を犠牲にすることによって、内因性植物由来の内毒素の肝臓クリアランス(clearance)を阻止することが示されてきた。これは、循環している内毒素を有意に増加させるらしく、リポ多糖類結合タンパク質（ＬＢＰ）への結合およびＣＤ１４シグナリングを通して、マクロファージ活性化が起こり、次にＴＮＦ−α、および他のシトキンが放出される。病気での内毒素の役割は、ＳＰＥ−Ａの致死効果が、動物へのポリミクシンＢの投与または病原体のないウサギの使用によって少なくとも部分的に中和され得るという発見によって裏付けられる。ショック症状の誘発の別の様相は、この毒素の毛細管内皮細胞への直接的な活性であり得る。この仮説は、ブドウ状球菌発熱性毒素ＴＳＳＴ−１が、ヒトの臍帯静脈細胞に直接結合し、単離されたブタの大動脈内皮細胞に対し細胞毒素性を有するという発見に由来する。この毒素の作用の別の様相は、その超抗原性を含み、この毒素は、宿主のＴリンパ球と相互作用し、その５０％まで活性化させる。この大きなＴ細胞刺激の結果、マクロファージに直接影響し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１の放出を誘発する、循環シトキンＴＮＦ−βおよびＩＦＮ−γのレベルが異常に高くなる。これらのシトキンはまた、Ｔ細胞が存在しない時、ＭＨＣクラスＩＩ結合およびシグナリングを通して、ＳＰＥ−Ａによってマクロファージから直接誘発され得る。ＴＮＦ−αおよび−βのレベルの上昇は、グラム陰性誘発ショック（その中には、内皮細胞への損傷および毛管リークがある）に典型的に見られる幾つかの効果を起こす。しかし、ＩＬ−２およびＴ細胞の増殖のアップレギュレーションを阻止するサイクロスポリンＡをＳＰＥ−Ａで処置されたウサギへ投与しても、ウサギはショック症状にかかった。これは、毛管リークを起こす上でより重要な別のメカニズムがあることを示唆している。従って、ＳＰＥ−Ａ分子おいて、異なる生物活性を担当する部位を突き止める必要性がある。毒性および細胞分裂促進性などの生物活性において変化を有するＳＰＥ−Ａの変異体を開発する必要性がある。連鎖球菌毒素ショック症候群を防止または改善するためのワクチンに有用な組成物を開発する必要性がある。また、連鎖球菌毒素ショック症候群および他の病気の治療に有用な療法剤を開発する必要性がある。発明の要旨本発明は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素およびそのフラグメント、ワクチンおよび製剤組成物ならびにワクチンおよび製剤組成物の使用方法を含む。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に実質的に対応するタンパク質と比べて、実質的に致死ではない。ワクチン組成物において、突然変異体毒素はまた、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性への防御免疫応答を刺激する。任意には、ワクチン組成物の突然変異体は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に比べて、内毒素ショックの増強の低下およびＴ細胞分裂促進性の低下があるようにさらに選択される。ワクチン組成物の特に好適な突然変異体は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素のアミノ酸２０と等しいアミノ酸に変化があるものである。製剤組成物において、突然変異体毒素は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に匹敵するＴ細胞分裂促進性を維持しながら、実質的に致死ではない。本発明はまた、野生型speＡ毒素のフラグメントおよびspeＡ毒素の突然変異体を含む。野生型ＳＰＥ−Ａ由来のフラグメントおよびペプチドは、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素である。フラグメントは、連結された分子の異なるドメインまたは領域を含み得る。フラグメントは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に比べて実質的に致死ではない。突然変異体毒素において、フラグメントは、野生型ＳＰＥ−Ａアミノ酸配列に比べて、少なくとも１つのアミノ酸変化を有する。フラグメントはまた、ワクチンおよび製剤組成物に有用である。本発明はまた、発現カセット、ベクターおよび形質転換された細胞を含む。発現カセットは、宿主細胞内のプロモーターファンクショナル(functional)に有効に連鎖した突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む。ＤＮＡカセットは、ベクターに挿入されるのが好ましい。ベクターは、プラスミドまたはウイルスを含む。ベクターは、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡを生成するための鋳型ＤＮＡを提供するのに有用である。ＤＮＡカセットおよびベクターはまた、ワクチン組成物に有用である。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントをコードする核酸は、ほ乳類の細胞での発現のために直接送られ得る。プロモーターは、ほ乳類の細胞におけるプロモーターファンクショナルであるのが好ましい。細胞に直接送られた核酸は、個体での突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の発現を提供し得、防御免疫応答は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対して生成され得る。さらなるワクチン組成物は、安定して形質転換した細胞または突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントをコードする発現カセットを含んでいるウイルス性ベクターを含む。ワクチニアなどのウイルス性ベクターは、ヒトに免疫を与えるために用いられ得、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対して防御免疫応答を生成する。形質転換された細胞は、Ｓ．アウレウス(Ｓ.au reus)、大腸菌またはサルモネラ種spp.などの微生物であるのが好ましい。形質転換された微生物は、その表面に突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントを含むか、あるいは突然変異体毒素を隠すことができる。形質転換された微生物は、生の弱毒化されたまたは熱殺菌されたワクチンとして投与され得る。本発明はまた、ワクチンおよび製剤組成物の使用方法を含む。ワクチンは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対する防御免疫応答を生成するのに有効な量を動物に投与する。好ましくは、ワクチン組成物は、ヒトに投与され、ＳＴＳＳの発生に対して防御する。製剤組成物は、Ｔ細胞増殖を刺激する方法において使用される。製剤組成物は、インターロイキン、インターフェロンまたは他の免疫モデュレーターで治療されるがん、Ｔ細胞リンパ腫、卵巣および子宮がんの治療に特に有用である。製剤組成物は、がんを患っている患者に投与される。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素および／またはそのフラグメントならびに他のワクチン組成物は、受動免疫血清を生成するのに有用であり得る。突然変異体ＳＰＥ −Ａ毒素またはそのフラグメント、ＤＮＡ発現カセットまたはベクター、あるいは形質転換された微生物は、動物に免疫を与え、野生型ＳＰＥ−Ａの少なくとも１つの活性への中和抗体を生成するのに用いられ得る。中和抗体は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素および／またはそのフラグメントならびに野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と免疫反応する。受動免疫血清は、Ａ連鎖球菌感染症およびＳＴＳＳの症候群がある動物に対して投与され得る。図面の簡単な説明図１は、連鎖球菌発熱性外毒素Ａの三次元構造モデルのリボン図である。ドメインＡおよびＢが示される。図２は、図１に見られる標準的な図に関して背面から見たＳＰＥ−Ａの図である。数字の付された残基は、全身致死性の低下について評価されたＴＳＳＴ−１の残基と相同のものである。図３は、Ｔ１２からクローン化されたＳＰＥ−Ａ毒素のＤＮＡ配列(配列番号：１２）および予測アミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。図４は、Ｔ細胞増殖アッセイである。ウサギの脾臓細胞が、７２時間、ＳＰＥ −Ａ、Ｋ１６Ｎ−ＳＰＥ−ＡおよびＮ２０Ｄ−ＳＰＥ−Ａとともに９６のウエルミクロタイタープレート４枚でインキュベートされた。細胞は、１８〜２４時間、[³Ｈ]チミジンでパルスされ、フィルターに収集され、[³Ｈ]チミジンのとり込みがシンチレーションカウンターで測定された。結果は、毒素濃度μｇ／ｍｌに対する１分当たりのカウント（ＣＰＭ）として表されている。呈示されたデータは、３つの個別の実験のうち最も代表的なものからのデータである。図５は、Ｔ細胞増殖アッセイである。ウサギの脾臓細胞が、７２時間、ＳＰＥ −Ａ、Ｃ８７Ｓ−ＳＰＥ−Ａ、Ｃ９８Ｓ−ＳＰＥ−ＡおよびＣ９０Ｓ−ＳＰＥ− Ａとともに９６のウエルミクロタイタープレート４枚でインキュベートされた。細胞は、１８〜２４時間、[³Ｈ]チミジンでパルスされ、フィルターに収集され、[³Ｈ]チミジンのとり込みがシンチレーションカウンターで測定された。結果は、毒素濃度μｇ／ｍｌに対する１分当たりのカウント（ＣＰＭ）として表されている。呈示されたデータは、３つの個別の実験のうち最も代表的なものからのデータである。図６は、Ｔ細胞増殖アッセイである。ウサギの脾臓細胞が、７２時間、ＳＰＥ −Ａ、Ｋ１５７Ｅ−ＳＰＥ−ＡおよびＳ１９５Ａ−ＳＰＥ−Ａとともに９６のウエルミクロタイタープレート４枚でインキュベートされた。細胞は、１８〜２４時間、[³Ｈ]チミジンでパルスされ、フィルターに収集され、[³Ｈ]用チミジンのとり込みがシンチレーションカウンターで測定された。結果は、毒素濃度μｇ／ｍｌに対する１分当たりのカウント（ＣＰＭ）として表されている。呈示されたデータは、３つの個別の実験のうち最も代表的なものからのデータである。図７は、単一突然変異体と比較した野生型ＳＰＥＡの超抗原性を示す。ウサギの脾臓細胞が、ＳＰＥＡまたは突然変異体とともに指示された用量で４日間インキュベートされた。４つの複製ウエルがＳＰＥＡおよび突然変異体の各用量において用いられた。３日目に１μＣＩ³Ｈチミジンが各ウエルに添加された。超抗原性指標＝ＳＰＥＡまたは突然変異体の存在下での脾臓細胞による³Ｈチミジンのとり込み÷ＳＰＥＡまたは突然変異体の非存在下での³Ｈチミジンのとり込み。図８は、二重突然変異体と比較した野生型ＳＰＥＡの超抗原性を示す。使用された方法は、図７に記載のものである。図９は、免疫を与えられたウサギの血清によるＳＰＥＡ阻害である。単一および二重突然変異体で免疫を与えられたウサギからのウサギの血清は、血清がＳＰＥＡの存在下で脾臓細胞分裂促進性を中和することができることを示すために用いられた。発明の詳細な説明本発明は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素およびそのフラグメント、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素およびそのフラグメントを含むワクチンおよび製剤組成物、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素およびそのフラグメントの調製方法、ならびに突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素およびそのフラグメントの使用方法に関する。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に実質的に対応するタンパク質と比べて、生物機能において少なくとも１つの変化を有するタンパク質である。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、同じ用量での野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と比較すると、実質的に致死ではないことが好ましい。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、部位指向突然変異生成、ランダム突然変異生成、従来の突然変異生成、インビトロ突然変異生成、自然発生的突然変異生成および化学合成を含む様々な方法を用いて生成され得る。突然変異体ＳＰＥ− Ａ毒素は、１）確実にアミノ酸において少なくとも１つの変化を有し、２）分子の少なくとも１つの生物機能における変化、好ましくは全身致死性の低下または排除を有するように選択されるのが好ましい。突然変異体毒素は、ＳＴＳＳの防止または改善などの、ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対する防御のためのワクチン組成物、ＳＴＳＳの症状がある動物の治療方法、およびＴ細胞増殖の刺激方法ならびにがんの治療に有用である。単一および二重ＳＰＥ−Ａ突然変異体がテストされ、突然変異体に対する抗体がＳＰＥへの細胞応答を阻害した。Ａ．突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメント、ワクチンおよび製組成物本発明は、少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に実質的に対応し、野生型ＳＰＥ−Ａと同様の生物活性を有するタンパク質と比べて、生物活性において少なくとも１つの変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素を含む。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素は、バクテリオファージＴ１２に見出される遺伝子spe Ａによってコードされる。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素は、成熟タンパク質の推定アミノ酸配列から計算すると、２５，７８７ダルトンの分子量を有する。図３は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列および野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の予測アミノ酸配列を示す。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列は、大腸菌およびＳ．ａｕｒｅｕｓにクローン化された。本願のアミノ酸番号指定は、３１位のグルタミンを第１のアミノ酸として指定する図３の配列を参照して行われる。最初の３０のアミノ酸は、成熟タンパク質に現れないリーダー配列を表す。図１は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の構造モデルを示す。この構造モデルは、Ｂio sym Ｃorp.,Ｓan Ｄiego,ＣＡ.から入手可能のＩnsight/Ｈomologyプログラムを用いた相同モデリングによって構成された。このモデルは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素が、数個の明確な構造的特徴を有することを示している。これらの構造的特徴は、らせん２(アミノ酸１１〜１５)、Ｎ末端アルファらせん３(アミノ酸１８〜２６)、らせん４(アミノ酸６４〜７２)、中央アルファらせん５(アミノ酸１４２〜１５８)、らせん６(アミノ酸１９３〜２０２)、鎖１(アミノ酸３０〜３６)、鎖２(アミノ酸４４〜５２)、鎖３(アミノ酸５５〜６２)、鎖４(アミノ酸７５〜８３)、鎖５(アミノ酸９５〜１０６)を含んでいるドメインＢベータ鎖、鎖６(アミノ酸１１７〜１２６)、鎖７(アミノ酸１２９〜１３５)、鎖８(アミノ酸１６９〜１７５)、鎖９（アミノ酸１８０〜１８６）および鎖１０（アミノ酸２１３〜２２０）を含んでいるドメインＡベータ鎖を含んでいる。さらに、残基８７、９０および９８のシステイン残基は、推定ジスルフィド結合の形成または局所三次元コンフォーメーションを維持するのに重要であり得る。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素は、幾つかの生物活性を有する。これらの生物活性は、１）発熱、２）ＳＴＳＳ、３）ＳＴＳＳの発生または内毒素ショックの増強による全身致死性、４）内毒素ショックの増強、５）毛管リークおよび低血圧の誘発、６）ＩＦＮγ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βなどのシトキンの放出の誘発、７）ブタの大動脈内皮細胞への結合、８）ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合、９）Ｔ細胞受容体への結合、および１０）Ｔ細胞分裂促進性（超抗原性）を含む。これらの活性は、アッセイされ得、当業者に公知の方法によって特徴付けられ得る。本明細書中に用いられるように、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の定義は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と同じ生物活性を有する野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の変異体を含む。これらのＳＰＥ−Ａ毒素は、異なるアミノ酸を有するか、あるいは、それらの遺伝子が、図３に示すものと異なるヌクレオチド配列を有し得るが、異なる生物活性を有していない。アミノ酸配列における変化は、表現型に変化をもたらさない。これらの毒素分子は、図３に示す野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と同程度に全身致死性を有し、内毒素ショックを高めることが好ましい。これらの毒素は、Ａltschul,Ｓ. Ｆ,,Ｂull.Ｍath.Ｂio.48:603(1986)に記載されたようなＳＳ2Ａlignment Ａlgo rithmを用いて測定すると、図３に示す野生型ＳＰＥ−Ａ毒素アミノ酸配列と少なくとも６０〜９９％の相同を有するのが好ましい。これらの特性を有するタンパク質は、実質的に野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対応する。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、実質的に野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対応するタンパク質と比べて、アミノ酸において少なくとも１つの変化を有する毒素である。この変化は、アミノ酸置換、欠失または付加であり得る。アミノ酸配列において１つ以上の変化、好ましくは１〜６の変化があり得る。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の全身致死性または毒性を有する野生型ＳＰＥ−Ａ毒素への復帰を最小限にするためにアミノ酸配列の変化が１つ以上あることが好ましい。ワクチンに有用な突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素にとって、毒素のアミノ酸配列の変化の結果、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素を中和し得る抗体応答を刺激するという毒素の能力が変化することにならないことが好ましい。ワクチンに有用な突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素にとって、突然変異体毒素は、Ｂoca Ｒaton,Ｆla.のＴoxin ＴechnologiesまたはＤ r. Ｓchlievert（Ｍinnesota大学,Ｍinneapolis,ＭＮ）からのようなＳＰＥ−Ａ毒素に対するポリクローナル中和抗体によって認識され、タンパク質分解プロフィールが、野生型ＳＰＥ−Ａに比べて変わらないことが特に好ましい。アミノ酸配列における変化は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の１つ以上の選択されたアミノ酸残基での部位特異的変化であり得る。部位特異的変化は、前述の分子の特定のドメインまたはシステイン残基が置かれる位置における残基を同定することによって選択される。任意には、ある位置またはドメイン内のアミノ酸が、一次配列の相同性または三次元コンフォーメーションの比較により、他の相同分子の等しい残基と同一であるか、または類似の特性を有するかどうかを決定することによって、特定の位置における部位特異的変化がさらに選択される。相同分子は、当業者に公知である。相同分子は、上記のＡltschulらのＳＳ2alignment al gorithmまたはＢiosym,Ｓan Ｄiego,ＣＡ.からのＩnsight/Ｈomologyのような相同モデリングプログラムを用いた一次配列の相同性の比較によって同定され得るものである。相同分子は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と比較して、同一のまたは保守的に変化したアミノ酸の有意の数、典型的には３０〜９９％を表示するか、あるいは、類似の三次元構造、典型的には保存領域が＜２オングストロームのＲＭＳエラーを有するものである。特定の部位におけるアミノ酸配列の変化は、ランダムに起こり得るか、または特異変化が選択され得る。特異部位が選択されると、それは、そのアミノ酸番号指定および図３に示す野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の部位に見られるアミノ酸によって言及される。本願において行われるアミノ酸番号指定は、３１位のグルタミンが第１のアミノ酸としてカウントされる図３の配列の参照による。実質的に野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対応するタンパク質の特定部位で同定されたものに対応する等しいアミノ酸は、参照配列に応じて、あるいは、もしそれらがフラグメントであるなら、異なるアミノ酸番号を有し得る。等しい残基はまた、一次アミノ酸構造の比較または図１に示すモデル構造との比較または相同分子の公知の結晶構造との比較のいずれかによって、実質的に野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対応するタンパク質におけるアミノ酸に等しいとして同定され得る相同分子に見出されるものである。本発明は、アミノ酸番号指定にかかわらず、同じまたは類似の位置の等しいアミノ酸への変化を含んでいることが意図されている。特異部位におけるアミノ酸の特異的置換が選択されると、当該位置で置換されるアミノ酸は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素での当該位置でのアミノ酸と比較して、生物活性に影響を与える構造上の変化を含むように選択される。置換は、同類置換または非同類置換であり得る。生物活性に影響を与え得る構造上の変化になる置換は、１）ある電荷型から別の電荷型への変化、２）電荷から非電荷への変化、３）システイン残基およびジスルフィド結合の形成の変化、４）疎水性から親水性残基または親水性から疎水性残基への変化、５）アミノ酸の大きさの変化、６）コンフォーメーションにおいて制限的なアミノ酸または類似体への変化、および７）非自然発生アミノ酸または類似体への変化を含む。選択された特異的置換はまた、選択された部位の位置に依存し得る。例えば、Ｎ末端αらせんにおけるアミノ酸は、爆されたアミド窒素と相互作用するように水酸基を有するか、またはαらせんのＮ末端に存在する部分的な正の電荷と相互作用するように負に電荷されていることが好ましい。突然変異体毒素はまた、１つの特異部位または複数の部位を標的にしたランダム突然変異を含む。部位が選択されると、Ａiyarら、Ｂiotechniques 14:366(19 93)またはＨoらＧene 77:51-54(1984)に記載されるような方法を用いて、他の１９のアミノ酸のそれぞれが当該部位で置換された突然変異体が生成され得る。インビトロ突然変異生成もまた、Ａnthony-Ｃahillら、Ｔrends Ｂiochem.Ｓci.14 :400 (1989)に記載されるような方法を用いて、特定の位置において、他の１９のアミノ酸のそれぞれまたは非自然発生アミノ酸もしくは類似体を置換するために用いられ得る。突然変異体毒素はまた、分子の特異的に選択されていない１つ以上の部位で変化し、かつ、特異的に選択されていないが、他の１９のアミノ酸または非自然発生アミノ酸のいずれか１つであり得るアミノ酸の変化を有する毒素を含む。特異部位での置換はまた、これに限らないが、３−ヒドロキシプロリン、４− ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、２−アミノアジピン酸、２−アミノピニリン酸(aminopimilic acid)、オルニチン、ホモアルギニン、Ｎ−メチルリシン、ジメチルリシン、トリジメチルリシン、２、３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノブトリル酸(2,4-diaminobutryic acid)、ヒドロキシルリシン、置換フェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、γ―バリンおよびハロゲン化チロシンなどの非自然発生アミノ酸での置換を含む。特異部位での置換はまた、これに限らないが、エステル、エーテルならびにホスホリルおよびボロン連鎖を含む非ペプチド化学作用を用いる類似体の使用を含む。突然変異体毒素は、種々の方法を用いて生成され得る。それらの方法は、部位特異性突然変異生成、ＥＭＳまたは亜硫酸水素ナトリウムなどの化学物質あるいはＵＶ照射を用いる方法、自然発生的突然変異、インビトロ突然変異生成および化学合成による突然変異生成方法を含む。突然変異生成の方法は、Ｓambrookら、ＡＧuide to Ｍolecular cloning,Ｃold Ｓpring Ｈarvard,Ｎew Ｙork(1989 )に見出され得る。部位特異性突然変異生成の特に好適な方法は、Ｐerrin and Ｇilliland,1990,Ｎucleic Ａcid Ｒes.18:7433に記載されるような、３つのプライマーを有する非対称のＰＣＲを用いることである。実質的に野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対応するタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素が、生成されると、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、非致死性についてスクリーニングされる。このスクリーニングで選択された突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と同じ用量または多い用量で小型浸透ポンプ（実施例２に記載するような）を用いて投与されたとき、ウサギにおいて実質的に非致死であることが好ましい。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と同じ用量をウサギに投与したとき、約１０〜２０％未満のウサギが死ぬと、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントは実質的に非致死である。非致死の突然変異体毒素は、ワクチンおよび製剤組成物に有用である。本発明を制限しないが、全身致死性に影響を与えるあるアミノ酸残基またはドメインは、他の生物活性、特にＴ細胞分裂促進性と分離可能であると考えられている。ワクチン組成物に有用な突然変異体において、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素活性を中和する抗体応答を刺激し得るものについてスクリーニングされることがさらに好ましい。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素活性を中和する抗体応答を刺激し得る突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の選択方法は、突然変異体毒素が、Ｔoxin Ｔechno-logies,Ｂoca Ｒaton,Ｆla.またはＤr.Ｓchlievertから入手可能なもののような野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対するポリクローナル中和抗体と免疫反応するかどうかを決定することである。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素が、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対する抗体と免疫反応するかどうかの決定方法は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット(Ｗestern Ｂlot)、二重免疫拡散アッセイ(Ｄouble Ｉm munodiffusion Ａssay)などを含む。任意には、突然変異体毒素はまた、突然変異体毒素のタンパク質分解プロフィールが、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と同じであるかでどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。ある場合において、生成された突然変異体は、野生型ＳＰＥ −Ａ毒素に比べて、突然変異体毒素の三次元コンフォーメーション全体を実質的に変化させないことが好ましい。全体コンフォーメーションに変化があったかどうかを調べる１つの方法は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素への抗体の免疫反応性を観察すること、および／または突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素のタンパク質分解プロフィールを調べることである。タンパク質分解プロフィールは、当業者に公知の方法において、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、サブチリシンおよびＶ８プロテアーゼを用いて決定され得る。図３に示す配列を有する野生型ＳＰＥ−Ａのタンパク質分解プロフィールは公知である。野生型ＳＰＥ−Ａと類似のプロフィールを有する突然変異体が選択される。任意には、突然変異体毒素はまた、生物活性における他の変化を有するようにスクリーニングおよび選択され得る。前述のように、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に伴う幾つかの生物活性がある。それらの生物活性は、１）発熱、２）ＳＴＳＳ、４）内毒素ショックの増強、５）毛管リークおよび低血圧、６）ＩＦＮγ、ＩＬ− １、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βなどのシトキンの放出の誘発、７）内皮細胞への結合、８）ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合、９）Ｔ細胞受容体への結合、および１０）Ｔ細胞分裂促進性（超抗原性）を含む。これらの活性は、当業者に公知の方法によって測定され得る。ワクチン組成物に有用な突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントにおいて、それらは、実質的に、野生型ＳＰＥ−Ａへの中和抗体に対し非毒性および免疫反応性を有することが好ましい。中和抗体は、動物テストにおいて、野生型毒素の致死性を阻害するものを含む。任意には、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、上で述べたように、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の他の１つ以上の生物活性において変化を有し得る。任意には、ワクチン組成物に好適な突然変異体毒素は、内毒素ショックの賦活性の欠如についてさらにスクリーニングおよび選択される。内毒素ショックの増強の欠如を調べる好適なアッセイについては、実施例４において述べる。ウサギは、テスト前に明らかなバクテリアまたはウイルス性感染症を有していないことが好ましい。同じ用量での野生型ＳＰＥ−Ａ活性と比較して、突然変異体ＳＰＥ毒素が内毒素と同時投与されたとき、約２５％未満の動物がショックを発生させると、内毒素ショックの賦活性の欠如または実質的な非増強が見られる。より好ましくは、１匹の動物もショックを発生させない。任意には、ワクチン組成物のための好適な突然変異体はまた、Ｔ細胞分裂促進性の変化についてさらにスクリーニングおよび選択される。Ｔ細胞分裂促進性の変化は、実施例４に記載するように、ウサギのリンパ球を用いて標準³ＨチミジンアッセイにおけるＴ細胞増殖を測定することによって、ＩＦＮγまたはＴＮＦ −βなどのシトキンの生成レベルを測定することによって、Ｔ細胞応答のＶβ型を決定することによって、または分子のＭＨＣクラスＩＩ受容体との相互作用を決定することによって検出され得る。Ｔ細胞分裂促進性の低下を検出するための好適な方法は、突然変異体毒素の存在下および非存在下において、ウサギのリンパ球のＴ細胞増殖を測定することである。Ｔ細胞の野生型ＳＰＥ−Ａ毒素への応答は、抗原への正常なインビトロ応答を超えて大きく高められる。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素が、抗原または負の制御での刺激より大きくＴ細胞増殖応答を刺激しない場合、Ｔ細胞分裂促進性の実質的な低下が見られる。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と同じ用量でウサギのリンパ球を用いて測定すると、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素に対するＴ細胞増殖応答が、バックグラウンドの２倍未満であるような低下が見られるのが好ましい。任意には、ワクチン組成物に有用な突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、内皮細胞における毛管リークの低下についてさらにスクリーニングおよび選択される。好適な方法は、Ｌeeら、Ｊ.Ｉnfect.Ｄis.164:711(1991)に記載されるような、ブタの大動脈内皮細胞を用いることである。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の存在下における毛管リークの低下は、放射能標識された化合物の放出の低下を測定することによって、または放射能標識された化合物の輸送における変化よって決定され得る。野生型毒素の活性と比較して、放射能標識された化合物の放出または輸送が、バックグラウンドの約２倍未満に低下する場合、毛管リークの低下が見られる。ワクチン組成物に有用な特に好適な突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素活性を有するタンパク質と比較して、生物学的に活性ではない。非生物活性とは、突然変異体毒素には、全身致死性がほとんどまたは全くなく、内毒素ショックの増強がほとんどまたは全くなく、Ｔ細胞分裂促進性がほとんどまたは全くないことを意味する。ワクチン組成物のために選択された突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、３つの生物活性が実質的に欠如している、すなわち、それらは、負の制御のように反応するか、またはバックグラウンドの２倍未満反応を刺激する。他の生物活性の変化は、以下のように検出され得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合は、Ｊardetzky,Ｎature 368:711(1994)に記載されるような方法を用いて検出され得る。発熱における変化は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の投与後、継続的に温度をモニターすることによって検出され得る。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の存在下でのシトキン生産のレベルにおける変化は、市販の方法および免疫学での現在の実験計画書に記載される方法などを用いて測定され得る。（Ｅd.Ｃolig an,Ｋruisbeck,Ｍargulies,Ｓhevach and Ｓtroker.Ｎational Ｉnstitutes of Ｈealth ,Ｊohn Ｗiley and Ｓons,Ｉnc.）少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、実質的に非毒性である突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の具体例が記載される。ワクチン組成物のための特に好適な突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素へのポリクローナル中和抗体と免疫反応し、非毒性であり、任意には、内毒素ショックの賦活性の低下およびＴ細胞分裂促進性の低下を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素である。特に好適な突然変異体は、成熟毒素の残基２０におけるアスパラギンがアスパラギン酸に置換された突然変異体Ｎ２０Ｄのようなアミノ酸２０におけるアスパラギンの変化を有する（Ｎ２０Ｄ）。Ｎ２０Ｄ突然変異体は、非毒性であり、内毒素ショックの増強がなく、Ｔ細胞分裂促進性が５倍低下することが示されている。さらに、当該位置でのシステイン基の欠如となるアミノ酸９８での変化はまた、内毒素ショックの増強の低下および細胞分裂促進性の４倍低下を有する突然変異体になる。この位置での特に好適な突然変異体は、セリンがシステインに置換されている（Ｃ９８Ｓ）。Ｔ細胞増殖の刺激のためのおよびがん治療における好適な突然変異体は、実質的に非致死である突然変異体毒素である。これらの突然変異体毒素は、Ｔ細胞分裂促進性を少なくとも野生型ＳＰＥ−Ａ毒素のレベルに保持することが好ましい。特に好適な突然変異体は、当該残基のリシンをグルタミン酸に置換するなどの、野生型ＳＰＥ−Ａの残基１５７でのアミノ酸変化を有する（Ｋ１５７Ｅ）。Ｋ１５７Ｅ突然変異体は、非致死であるが、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に匹敵する細胞分裂促進性を保持することが示された。突然変異体は、以下のような分子の特定のドメインにおいてアミノ酸を変化させることによって、機能変化に影響を与えるために生成され得る。図１は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の分子モデルを示す。特に好適なドメインは、Ｎ末端αらせん３(アミノ酸１８〜２６)、中央αらせん５(アミノ酸１４２〜１５８)、ドメインＢベータ鎖(アミノ酸３０〜３６、４４〜５２、５５〜６２、７５〜８３および９５〜１０６)、ならびにドメインＡベータ鎖（アミノ酸１１７〜１２６、１２９〜１３５、１６９〜１７５、１８０〜１８６および２１３〜２２０）を含む。８７、９０および９８位のシステイン残基もまた重要であり得る。本発明を制限しないが、これらのドメインは、野生型ＳＰＥ−Ａ活性の生物機能において重要な特異的な三次元コンフォーメーションを形成すると考えられている。図２に見られるように、Ｎ末端αらせんおよび中央αらせんは、近くに位置しているので、そこでの残基が野生型ＳＰＥ−Ａ毒素分子の毒性に特に重要であり得る。さらに、中央のαらせんに近位の境界のＢ鎖のアミノ酸もまた、毒性において重要であり得る。図１および図２に示すような分子モデルは、構造的ドメインの表面残基および埋めこまれた残基の同定に役立つ。ワクチン組成物において、Ｎ末端αらせん３での残基（残基１８〜２６）が変化することが好ましく、全身致死性または内毒素の増強またはＴ細胞分裂促進性、あるいは、３つすべてを低下させるようにスクリーニングおよび選択される。Ｎ末端αらせん３における変化の具体例は、残基２０でのアミノ酸の変化である。この残基でのアスパラギンからアスパラギン酸での変化は、内毒素ショックの増強の低下、全身致死性の低下および細胞分裂促進性の５倍低下という結果になる。残基２０での他の変化は、表面残基での電荷の分配を変化させるもの、またはＮ末端αらせんの中央αらせんとの相互作用を変化させるものであることが好ましい。アミノ酸２０におけるグルタミン酸、リシン、アルギニンなどの負荷アミノ酸による置換は、同様の効果を有するようである。この領域の変化は、ＳＴＳＳによる全身致死性を低下させるものであるのが好ましい。変化はまた、中央αらせん５残基１４２〜１５８において起こる。少なくとも１つのアミノ酸変化を有するこの領域の突然変異体は、ＳＴＳＳによる全身致死性の低下について選択されることが好ましい。他の毒素分子において同定された類似の中央αらせんは、毒性を伴うことが示された。具体例は、残基１５７での変化である。この残基におけるリシンからグルタミン酸への変化は、ＳＴＳＳによる内毒素ショックの増強および全身致死性を低下させることになる。しかし、Ｔ細胞分裂促進性は、この残基での変化に影響をされない。これらの結果は、毒素性および内毒素ショックの増強は、Ｔ細胞分裂促進性とは分離可能な活性であることを示している。ワクチン組成物において、任意には、このドメインにおける変化を有する他の突然変異体が、Ｔ細胞分裂促進性の低下についてスクリーニングおよび選択される。アミノ酸１５７に存在する電荷の型の変化は、アスパラギン酸のリシンとの置換が、同様の効果を有するらしいことを示している。残基３０〜３６(ベータ鎖１)、残基４４〜５２(ベータ鎖２)、残基５５〜６２ (ベータ鎖３)、残基７５〜８３（ベータ鎖４）および残基９５〜１０６（ベータ鎖５）を含むドメインＢベータ鎖（ドメイン５）は、非致死性、任意には内毒素ショックの増強および／またはＴ細胞分裂促進性の低下についてスクリーニングおよび選択されることが好ましい。ＳＥＢ、ＳＥＡ、ＴＳＳＴ−１などの幾つかの毒素のベータシートのＮ末端バレルを形成する多数の残基は、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合に重要であることが示されている。突然変異体毒素によるＭＨＣクラスＩＩ結合の低下もまた、上記のＪardetzkyらによって記載されたようなアッセイを用いて選択され得る。ベータシートコンフォーメーションを破壊し得る、またはＭＨＣクラスＩＩ分子との接触残基、特にベータバレルの凹面にあるものを変化させ得るこれらの残基への変化が選択される。図１を参照。ワクチン組成物において、局所的なコンフォーメーションを変化させ得る変化が、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素へのポリクローナル中和抗体との突然変異体毒素の免疫反応を変化させないことが好ましい。残基１１７〜１２６(ドメインベータ鎖６)、残基１２９〜１３５(ドメイン７)、残基１６９〜１７５(ドメイン８)、残基１８０〜１８６（ドメイン９）および残基２１３〜２２０（ドメイン１０）を含むドメインＡベータ鎖は、非致死性であり、内毒素ショックの増強が低下し、かつ／またはＴ細胞分裂促進性が低下するように選択されることが好ましい。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素へのポクローナル中和抗体との突然変異体毒素の免疫反応を変化させることなく、ベータシートコンフォーメーションを変化させ得る変化が選択されることが好ましい。非致死性、任意には内毒素ショックの増強および／またはＴ細胞分裂促進性の低下を有する、システイン残基への変化またはジスルフィド結合の導入を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素が、選択され得る。具体例は、システイン残基９８での変化である。この残基でのシステインからセリンへの変化の結果、細胞分裂促進性が約４倍低下し、内毒素ショックの増強が低下し、ＳＴＳＳによる致死性が低下する突然変異体毒素になる。残基９８におけるシステイン基を排除する変化は、セリンでの置換と同様に生物活性に影響を与える。残基９８に起こり得る他の変化は、アラニン、グリシンまたはトレオニンなどの他の小さな脂肪性残基の置換を含む。アミノ酸残基９０および９７での他のシステイン残基での変化の結果、細胞分裂促進性が低下する。アミノ酸配列に１つ以上の変化を有する、治療方法に有用な突然変異体ＳＰＥ −Ａ毒素が生成され得るのが有利である。毒性または致死性を有する分子への復帰の変化を最小限にするために１つ以上の位置で変化を有するのが望ましい。ワクチン組成物において、多数の変化を有する突然変異体毒素は、依然として、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対する防御免疫応答を生成し、かつ／または野生型ＳＰＥ −Ａ毒素への中和ポリクローナル抗体と免疫反応し得る。製剤組成物において、多数の変化を有する突然変異体は、Ｔ細胞の細胞分裂促進性を維持しながら実質的に非致死であることが特に好ましい。約２〜６の変化を有することが特に好ましい。このような突然変異体の例はＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅ、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓのような二重突然変異体、三重突然変異体などを含むＮ２０Ｄ突然変異を有するものを含む。ＳＰＥＡの二重突然変異体は、単一突然変異体より利点あるかもしれない。これは実施例６に詳述する３つの実験において評価される。図７〜図９はその結果を表す。そのデータは、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓ突然変異体は、単一Ｎ２０Ｄ突然変異体より毒性が低く、二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅは、他の２つのタンパク質の中間であることを示した。３種類の突然変異体はすべて、野生型ＳＰＥより毒性が非常に低かった。単一および二重突然変異体で免疫されたウサギの血清は、非突然変異ＳＰＥＡ毒素と応答してリンパ球増殖を阻害した。リンパ球増殖は、毒素の完全毒性に伴い、かつ必要である。実施例７に記載のように、動物がＮ２０Ｄ、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８ＳまたはＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅに対して免疫を与えられた。結果を表９に表す。二重突然変異体で免疫された動物は、発熱および内毒素ショックへの高められた感受性から完全に防護された。三重突然変異体もまた。、本願において考慮されており、一実施形態において、ＳＰＥ−Ａ突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓ／Ｄ４５Ｎが、実施例１〜７の方法およびアッセイならびに本明細書中に記載のプライマーを用いてテストされている。アミノ酸残基２０アスパラギンの欠失および／あるいはアミノ酸１５７リシンまたは９８システインの欠失のような、特異部位で残基を欠失することもまた好ましいことがある。ワクチン組成物において、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素へポリクローナル中和抗体と免疫反応し、かつ／または野生型ＳＰＥ−Ａ活性に対する防御免疫応答を刺激し得る、欠失を有する突然変異体が、選択され得る。ＳＰＥ−Ａの突然変異体毒素は、ワクチン組成物を形成するのに役立つ。ワクチン組成物のための好適な突然変異体は、少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、全身的に非毒性であり、野生型ＳＰＥ−Ａへのポリクローナル中和抗体と免疫反応する。特に好適な突然変異体は、Ｎ２０Ｄ，Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅ、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓのようなアミノ酸２０において変化した突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素および残基２０アルパラギンにおいて欠失した突然変異体を含む。突然変異体毒素は、生理学的に許容可能な担体と組み合わせられる。生理的に許容可能希釈剤は、生理食塩水およびリン酸緩衝食塩水のような中性ｐＨでの緩衝食塩水を含む。他のタイプの生理的担体は、リポソームまたはポリマーなどを含む。任意には、突然変異体毒素は、フロイントの不完全アジュバント、フロイントの完全アジュバント、明礬、モノホスホリル脂質Ａ、明礬ホスフェートまたは水酸化物、ＱＳ−２１などのアジュバントと組み合わせ得る。任意には、突然変異体毒素またはそのフラグメントは、インターロイキン、インターフェロンなどの免疫モデュレーターと組み合わせ得る。ワクチン調剤の多くは当業者に公知である。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性への動物の防御免疫応答を刺激するのに有効な量をワクチン調剤に添加される。防御免疫応答の生成は、抗体、好ましくは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素を中和する抗体の発生によって測定され得る。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の中和は、例えば、動物の野生型ＳＰＥ−Ａによる致死性の阻害によって測定され得る。さらに、防御免疫応答は、内毒素ショックの増強またはＳＴＳＳの症状の改善または排除のような、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性における低下を測定することによって検出され得る。防御免疫応答を形成し得る突然変異体毒素の量は、体重１ｋｇ当たり約０.１μｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１００μｇである。体重１ｋｇにつき約２５μｇの野生型ＳＰＥ−Ａ毒素が、ウサギの防御免疫を誘導するのに有効である。ワクチン組成物は、ウサギ、齧歯動物、ウマおよびヒトなどの動物に投与される。好適な動物はヒトである。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素はまた、製剤組成物を形成するのに有用である。製剤組成物は、がんの治療のようなＴ細胞増殖の刺激を所望する療法状況において有用である。好適な突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に匹敵するＴ細胞分裂促進性を維持しながら非致死であるものである。好適な突然変異体は、Ｋ１５７Ｅのような野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の残基１５７のリシンにおいて変化したものである。製剤組成物は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素を生理食塩水、リン酸緩衝食塩水のような中性ｐＨで緩衝された食塩水などの生理的に許容可能な担体と組み合わせることによって形成される。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、同じ用量で野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に匹敵するＴ細胞増殖を刺激するのに有効な量で組み合わせられる。Ｔ細胞の応答性の増強は、ウサギのリンパ球を用いての標準³Ｈチミジンアッセイを用いたり、蛍光活性したＴ細胞の分類器またはＥＬＩＳＰＯＴのようなアッセイを用いてインビボでのＴ細胞個体群を測定することによって測定し得る。有効量もまた、がん細胞の増殖を改善または低下させるのに有効な量であり得る。これは、がん特異Ｔ細胞の刺激を測定することによって、インビボでがん細胞の増殖に対する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の影響を測定することによって決定され得る。有効量の範囲は、体重１ｋｇ当たり１００ｎｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり１μｇ〜１００μｇである。約２５^-6μｇの野生型ＳＰＥ−Ａ毒素が、高められたＴ細胞応答性を刺激し得る。例えば、これらの突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、単独で、またはインターロイキンもしくはインターフェロン療法との関連して用いられる。本発明はまた、ＳＰＥ−Ａ毒素のフラグメントおよび突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素のフラグメントを含む。ワクチン組成物において、フラグメントは、防御免疫応答を刺激するのに十分に大きいことが好ましい。Ｂ細胞エピトープの最小限の大きさは、約４ないし７個のアミノ酸であり、Ｔ細胞エピトープでは約８〜１２個のアミノ酸である。野生型ＳＰＥ−Ａ全体の大きさは、リーダー配列を含む約２５１個のアミノ酸である。フラグメントは、約４〜２５０個のアミノ酸、より好ましくは、約１０〜５０個のアミノ酸のペプチドである。フラグメントは、単一ペプチドであるか、または連結された異なる位置からのペプチドを含み得る。フラグメントは、図１に示し上に述べたような１つ以上のドメインを含むことが好ましい。また、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素からのフラグメントは、実質的に野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対応するタンパク質と比較して、アミノ酸配列に少なくとも１つの変化、より好ましくはアミノ酸配列に１〜６の変化を有するのが好ましい。フラグメントは、実質的に、全身的に非致死であるのが好ましい。フラグメントは、上記のように、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素活性を有するタンパク質と同じまたはそれより多い用量で小型浸透ポンプモデルを用いて、ウサギにおいてほとんどまたは全く毒性を有さないようにスクリーニングおよび選択される。フラグメントはまた、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の用量と匹敵する量を与えた場合、ヒトにおいて非毒性であることが好ましい。ワクチン組成物にとって、フラグメントは、中央αらせんおよび／またはＮ末端αらせんからの残基を含むことが好ましい。フラグメントは、Ｎ２０Ｄのような野生型ＳＰＥ−Ａ毒素における残基２０に等しいアミノ酸残基での変化、または野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の残基９８システインに等しいアミノ酸残基での変化を含むことが好ましい。ワクチン組成物にとって、フラグメントは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素活性を有するタンパク質への中和抗体応答を刺激することが好ましい。フラグメントは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素へのポリクローナル中和抗体との免疫反応についてスクリーニングおよび選択され得る。フラグメントはまた、動物に免疫を与えるために用いられ得、形成された抗体は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の中和についてテストされる。ワクチン組成物にとって、特に好適なフラグメントは、非生物活性であるようにさらに選択およびスクリーニングされる。非生物活性とは、フラグメントは、全身的に非致死であり、内毒素ショックの増強をほとんどまたは全く誘導せず、Ｔ細胞刺激をほとんどまたは全く誘導しないことを意味する。任意には、フラグメントは、ブタの内皮細胞への毛管リーク効果の低下を有するようにスクリーニングおよび選択され得る。ワクチン組成物のためにスクリーニングおよび選択されたフラグメントは、ワクチン調剤に組み入れられ、上記のように利用され得る。任意には、フラグメントは、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、キーホール(keyhole)カサガイ血青素、破傷風トキソイドなどの担体分子へ付着し得る。製剤組成物にとって、フラグメントは、Ｎ末端ドメインＢβ鎖１〜５だけの、または中央αらせんが加わったアミノ酸残基を含むことが好ましい。フラグメントは、Ｋ１５７Ｅのような、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素のアミノ酸１５７におけるリシンと等しいアミノ酸残基での変化を含むことが特に好ましい。製剤組成物にとって、フラグメントは、前記のように、全身的な非致死、任意には、内毒素ショックの増強がほとんどまたは全くないことについてスクリーニングおよび選択されることが好ましい。フラグメントは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に類似のＴ細胞分裂促進性を保持することが好ましい。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素のフラグメントは、前記のように、製剤組成物を形成し得る。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素のフラグメントは、ＰＣＲ、制限酵素消化および／または連結反応、インビトロ突然変異生成ならびに化学合成を用いて調製され得る。小さめのフラグメントには、化学合成が望ましいかもしれない。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素のフラグメントは、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素について述べたのと同じ組成物および方法において用いられ得る。Ｂ．突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素、ワクチン組成物または製剤組成物の使用方法突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素および／またはそのフラグメントは、動物を野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の影響に対して防御する方法、ＳＴＳＳの動物を改善または治療する方法、Ｔ細胞増殖および応答性の増強を誘導する方法、ならびにがんの症状を治療または改善する方法に有用である。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性から動物を防護する方法は、動物にワクチン組成物を投与しＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対する防御免疫応答を樹立する工程を伴う。防御免疫応答は、中和し、ＳＴＳＳの致死性および症状に対して防御することが好ましい。ワクチン組成物は、少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、野生型ＳＰＥ−Ａへのポリクローナル中和抗体と免疫反応し、非致死である、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントを含むことが好ましい。特に好適な突然変異体は、突然変異体Ｎ２０ＤまたはＮ２０Ｄ／Ｋ１５７ＥまたはＮ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓのようなアミノ酸残基２０アスパラギンでの変化を有する。ワクチン組成物は、皮下、筋肉、静脈、皮内、口、鼻腔、目、腹腔を通してなど種々の方法で動物に投与され得る。投与の好適な経路は、筋肉を通すことである。ワクチン組成物は、ウサギ、齧歯動物、ウマおよびヒトを含む種々の動物に投与され得る。好適な動物はヒトである。ワクチン組成物は、野生型ＳＰＥ−Ａの少なくとも１つの生物活性に対する防御免疫が樹立されるまで、一回または複数の用量で投与され得る。防御免疫は、標準的な方法を用いて野生型ＳＰＥ−Ａ毒素への中和抗体の存在を測定することによって検出され得る。実質的な毒性を引き起こすことなく、防御免疫を樹立するのに有効な量が投与される。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントはまた、突然変異体ＳＰＥ −Ａ毒素および野生型ＳＰＥ−Ａ毒素と免疫反応する中和抗体を生成するのに有用である。これらの抗体は、ＳＴＳＳの症状を有する患者の症状を治療または改善するための受動免疫血清として用いられ得る。上記のようなワクチン組成物は、野生型ＳＰＥ−Ａへの中和抗体応答が生成されるまで、馬またはヒトなどの動物へ投与され得る。次いで、これらの中和抗体は、収集、精製され、ＳＴＳＳの症状を呈する患者を治療するのに用いられ得る。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素への中和抗体はまた、野生型ＳＰＥ−Ａを用いて形成され得る。しかし、野生型ＳＰＥ− Ａは、ウサギの野生型ＳＰＥ−ＡのＬＤ₅₀の１／５０〜１／１００のような毒性を誘導するものよりずっと低い用量で投与されなければならない。中和抗体は、発熱、低血圧、Ａ群連鎖球菌感染症、筋肉炎、筋膜炎および肝臓障害などのＳＴＳＳの症状を呈する患者に、ＳＰＥ−Ａ毒素の影響を中和するのに有効な量が投与される。中和抗体は、静脈、筋肉、皮内、皮下などを通して動物に投与され得る。投与の好適な経路は、静脈を通してであり、または局在的な感染症では、創面切除で組織損傷の部位に局所的に行う。中和抗体は、抗生物質療法に関連して投与されるのが好ましい。中和抗体は、ショックまたは組織損傷の低下が一回のまたは複数の用量で得られるまで投与され得る。典型的に投与される好適な中和抗体は、体重１ｋｇにつき約１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは約５０〜２００ｍｇ／ｋｇである。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素および／またはそのフラグメントはまた、Ｔ細胞増殖の刺激のための製剤組成物、特にがんの治療に有用である。これらの製剤組成物は、インターロイキン、インターフェロンまたは腫瘍壊死因子を用いる現在のがん療法に代わって、またはそれに関連して用いられるのが特に好ましい。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素はまた、Ｔ細胞リンパ腫ならびに卵巣および子宮がんを治療するのに有用である。本発明を制限しないが、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、Ｔリンパ腫細胞に対して選択的に毒性を有し得ると考えられている。製剤組成物は、Ｔ細胞分裂促進性を維持するが非致死である、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素および／またはそのフラグメントを含む。好適な突然変異体ＳＰＥ− Ａ毒素は、Ｋ１５７Ｅのようなアミノ酸残基１５７リシンにおいて変化を有するものである。製剤組成物は、静脈、筋肉、皮内、口、腹腔、皮下経路などを通してがんを有する患者に投与され得る。好適な経路は、静脈を通してである。製剤組成物は、１回または複数の用量で投与され得る。製剤組成物は、高められたＴ細胞増殖応答を刺激し、かつ／または実質的な毒性なしにがんの増殖を低下させるのに有効な量を投与される。好適な量の範囲は、１００ｎｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。突然変異体ＳＰＥ−Ａ製剤組成物は、インターフェロン、インターロイキンまたは腫瘍壊死因子を用いる療法に関連して、またはそれに代わって投与されるのが特に好ましい。Ｃ．突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ発現カセットおよびこのようなＤＮＡ発現カセットの調製方法本発明はまた、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素および／またはそのフラグメントの発現に有用なＤＮＡ配列および発現カセットを含む。発現カセットは、宿主細胞のプロモーターファンクショナルに有効に連鎖した、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に実質的に対応するタンパク質に比べて、少なくとも１つのアミノ酸変化および生物機能における少なくとも１つの変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素および／そのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む。発現カセットは、形質転換ベクターに組み込まれ、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、形質転換された細胞に生産される。次いで、突然変異体毒素は、宿主細胞または宿主細胞上清から精製され得る。形質転換された宿主細胞もまた、ワクチン組成物として有用である。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントはまた、部位特異的またはランダム突然変異生成について述べたのと同様の方法で、自然発生的突然変異体についてスクリーニングおよび選択されることによって形成され得る。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、インビトロ突然変異生成を用いて、または任意の手順によって生産されたフラグメントから半合成的に生成され得る。最後に、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、化学合成を用いて生成され得る。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列アミノ酸配列に少なくとも１つの変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードする突然変異体ＤＮＡ配列は、選択された変化のタイプによって種々の方法によって形成され得る。実質的に野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対応するタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列を生成するのに用いられる鋳型ＤＮＡとして機能する。野生型ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列が図３に示され、ＡＴＴＣ受入れ番号６９８３０の微生物として寄託されている。１つの特異的位置または複数の位置における１つの特異的変化または複数の変化を起こすために、上記のＰerrinらの方法によってＰＣＲを用いることが好ましい。変化を特定の位置に向けるために、アミノ酸変化のための変化したヌクレオチドコードを含む内部プライマーが、５'および３'フランキングプライマーもまた含む混合物に含まれる。５'フランキングプライマーは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素のためのコード配列の翻訳開始部位の上流のＤＮＡ領域と相同であるか、またはハイブリッド形成する。好ましくは、５'フランキング領域は、speＡプロモーターおよび調節領域の上流にある。例えば、５'フランキングプライマーは、図２に示すように、翻訳開始部位より約７６０塩基上流の領域と相同またはハイブリッド形成し得る。上流調節領域のＳＰＥ−Ａプロモーターを含む５'フランキングプライマーは、例えば、以下の配列を有する。下流フランキングプライマーは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素のためのコード配列の停止コドンの下流のＤＮＡ領域と相同であるか、またはハイブリッド形成する。下流フランキングプライマーは、転写および翻訳終結シグナルを与えることが好ましい。例えば、３'フランキングプライマーは、ＳＰＥ−Ａのコード配列の停止コドンの２００塩基対下流の領域とハイブリッド形成するか、または相同であり得る。３'フランキングプライマーは、例えば、以下の配列を有する。上流および下流フランキングプライマーは、すべてのＰＣＲ反応に存在し、得られたＰＣＲ産物は、speＡプロモーターおよび上流調節領域ならびに転写および翻訳終結シグナルを確実に含む。他の上流および下流フランキングプライマーは、当業者によって容易に構成され得る。天然のspeＡプロモーターおよび上流調節領域が、ＰＣＲ産物に含まれることが好ましいが、絶対に必要であるわけではない。特定の部位の各突然変異は、特定の残基での変化のためのＤＮＡ配列コードを含む内部プライマーを用いて行われる。例えば、特異部位でのアミノ酸置換は、以下の内部プライマーを用いて行われる。下線が引かれたヌクレオチドは、ヌクレオチド配列における、図３に示す野生型speＡ遺伝子からの変化を示す。内部プライマーは、図３に示すような野生型ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列を用いて、特異位置での変化を起こすように設計され得る。プライマーは、上に示すような特異位置での特異的なアミノ酸置換をコードするように設計され得る。プライマーは、Ｒennellら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.22:67(1991)に記載されるような特定の部位でのランダム置換となるように設計され得る。特定の部位でのアミノ酸の欠失となるようにプライマーが設計され得る。プライマーはまた、特定の位置での付加的なアミノ酸のためのコード配列を付加するように設計され得る。プライマーは、約１５〜５０のヌクレオチド、より好ましくは１５〜３０のヌクレオチドの長さであるのが好ましい。プライマーは、自動合成によって調製されるのが好ましい。５'および３'フランキングプライマーは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素のためのコード配列をコードするフランキングＤＮＡ配列にハイブリッド形成するのが好ましい。これらのフランキングプライマーは、フランキングＤＮＡ配列と１００％相同または相補的である約１０のヌクレオチドを含むことが好ましい。内部プライマーは、ある位置でのアミノ酸のためのＤＮＡ配列コードと１００％相補的ではない。なぜなら、当該位置での変化をコードするからである。内部プライマーは、約１５〜３０のヌクレオチドの長さであるプライマーでの野生型ＳＰＥ−Ａ毒素配列とは、約１〜４不整合であり得る。フランキングプライマーおよび内部プライマーの両者はまた、制限部位およびクランプ部位、好ましくは、プライマーの末端近傍をコードする付加的なヌクレオチドを含む。ハイブリッド形成条件は、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning-Ａ laboratory manual, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress,(1989)に記載のような公知の原理に従い、プライマーに存在する不整合の数を考慮に入れるように変更され得る。もし、１つ以上の部位での変化が所望であれば、１つ以上の内部プライマーが用いられ得る。例えば、アミノ酸２０アスパラギンでの変化およびアミノ酸１５７リシンでの変化を有する突然変異体を生成するために、上記のような内部プライマーは、実施例５に記載のような２つの別個の反応において用いられ得る、。１つ以上の位置での部位特異的変化を起こすためのＰＣＲ方法は、上記のＡiyar らに記載されている。別の方法が実施例５に記載されている。ある方法において、特定の部位での１つの変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列が生成され、次いで、第２の部位での変化を有する突然変異体ＤＮＡ配列を生成する鋳型として用いられる。第１回のＰＣＲでは、第１の内部プライマーが用いられ、第１の変化を有する突然変異体ＤＮＡ配列を生成する。次いで、第１の変化を有する突然変異体ＤＮＡ配列は、鋳型ＤＮＡとして用いられ、異なる部位での変化のための第２の内部プライマーコードが用いられて、２つの位置でのアミノ酸配列の変化を有する突然変異体毒素をコードするＤＮＡ配列を形成する。ＰＣＲ方法は、約２〜６の変化を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を生成するために用いられ得る。好適なＰＣＲ方法は、上記のＰerrinらに記載されるようなものである。簡潔には、ＰＣＲ反応条件が、１０ｍＭのＴris-ＨＣｌ(pＨ＝8.3)、５０ｍＭのＫＣｌ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ₂、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、２ｎｇの鋳型プラスミドＤＮＡ、１００ｐｍｏｌのフランキングプライマー、５ｐｍｏｌの内部プライマーおよび２.５ユニットのＡmpli Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ(Ｐerkin Ｅlm er Ｃetus)において、ＰＣＲが行われる。第２の増幅工程において、反応混合物の組成は、同じモル濃度（各５ｐｍｏｌ）のフランキングプライマーおよびメガプライマーならびに１ｕｇの鋳型を除いて上記と同様である。ＰＣＲは、９４℃ での変性を３０サイクル×１分、３７℃または４４℃でのアニーリング×２分および７２℃での伸長を３分間行う。ＰＣＲ産物は単離され、次いで、シャトルベクター（Ｍurray et al.、Ｊ.Ｉm munology 152:87(1994)の方法によって構成されるpＭＩＮ 164およびＤr.Ｓchli evert,Ｕniversity of Ｍinnesota,Ｍpls,ＭＮ.から入手可能）にクローン化される。このベクターは、アンピシリン耐性を持つ大腸菌プラスミドｐＢＲ３２８とエリトロマイシン耐性を与えるブドウ状球菌プラスミドｐＥ１９４とのキメラである。連結されたプラスミド混合物は、Ｔoxin Ｔechnologies,Ｂoca Ｒaton, ＦlaまたはＤr.Ｓchlievertからの野生型ＳＰＥ−Ａへのポリクローナル中和抗体を用いて、毒素生産のために大腸菌においてスクリーニングされる。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、所望の突然変異の存在および他の突然変異の非存在に合うように、Ｈsiaoら、Ｎucleic Ａcid Ｒes.19:2787(1991)の方法によって配列決定される。この方法で生成された特異的ＤＮＡ配列は、突然変異体Ｎ２０Ｄをコードし、９３９位でのアデニンがグアニン残基に変化することを除いて、図３に示すものと同一のコード配列を有するＤＮＡ配列を含む。突然変異体Ｃ８７ＳをコードするＤＮＡ配列は、１，１５２位のチミンがアデニンに変化し、１，１５４位のチミンがシトシンに変化することを除いて、図３と同一のコード配列を有する。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素Ｃ９８ＳをコードするＤＮＡ配列は、１，１８５位のグアニンがシトシンに変化し、１，１８６位のチミンがグアニンに変化することを除いて、図３と同一のコード配列を有する。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素Ｃ９０ＳをコードするＤＮＡ配列は、１，１６１位のグアニンがシトシンに変化することを除いて、図３と同一のコード配列を有するＤＮＡ配列を含む。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素Ｋ１５７ＥをコードするＤＮＡ配列は、図３と同一のコード配列を有するが、１，３５１位においてアデニンからグアニンに変化する配列を含む。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素Ｓ１９５ＡをコードするＤＮＡ配列は、１，４６４位のチミンがグアニンに変化することを除いて、図３と同一のコード配列を有するＤＮＡ配列を含む。突然変異体Ｋ１６ＮＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列は、９４１位のアデニンがシトシンに変化することを除いて、図３と同じ配列を含む。遺伝暗号の同義性のため、多くのＤＮＡ配列が、アミノ酸の同様の変化をコードし得ることが当業者に理解されるであろう。本発明は、異なるヌクレオチド配列を有するが、アミノ酸配列の同様の変化をコードするＤＮＡ配列を含む。特定の部位におけるランダムな突然変異生成において、他の１９のアミノ酸のそれぞれまたは非自然発生のアミノ酸もしくは類似体の特定部位での置換になる一連のプライマーが設計される。上記と同様に、または上記のＲennellらに記載の方法によってＰＣＲが行われる。ＰＣＲ産物は、サブクローン化され、次いで毒素生産が、野生型ＳＰＥ−Ａへのポリクローナル中和抗体との免疫反応によってモニターされる。アミノ酸配列での変化の存在は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列の配列決定によって立証され得る。好ましくは、突然変異体毒素は、非致死性についてスクリーニングおよび選択される。突然変異体の他の方法もまた、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列でのランダム突然変異を生成するために用いられ得る。本明細書に用いられるランダム突然変異またはランダム突然変異体生成は、突然変異は、選択された部位においてではなく、かつ／または選択された変化ではない。好ましくはｐＭＩＮ１６４上に、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列を含むバクテリア宿主細胞は、化学的突然変異体生成およびＵＶ照射などの他の標準的な方法を用いて突然変異生成され得る。この方法で生成された突然変異体は、野生型ＳＰＥ− Ａへのポリクローナル中和抗体を用いて、毒素生産についてスクリーニングされ得る。しかし、好適には非致死である生物活性の少なくとも１つの変化を有する突然変異体毒素を同定するには、さらにスクリーニングすることが必要である。自然に発生する突然変異体もまた、野生型ＳＰＥ−Ａからの生物活性の少なくとも１つの変化についてスクリーニングされ得る。ランダム突然変異生成はまた、Ａnthony-Ｃahillら、Ｔrends Ｂiochem,Ｓci. 14:400(1989)に記載されるようなインビトロ突然変異生成を用いて行われ得る。さらに、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、化学合成を用いて形成され得る。化学的にタンパク質を合成する方法は、Ｗallace,ＦＡＳＥＢＪ.7:505(1993)に記載されている。タンパク質の部分が合成され、次いで酵素または直接的な化学縮合を用いて連結され得る。化学合成の使用は、当業者に、所望の位置に非自然発生アミノ酸を挿入させるには、特に有用であろう。さらに、化学合成は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素のフラグメントを作るのに特に有用であろう。本明細書に記載の方法のいずれも、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素のフラグメントを形成するのに有用であろう。さらに、フラグメントは、制限酵素消化および／または連結反応を用いて容易に生成され得る。フラグメントの生成の好適な方法は、直接的な化学合成を用いて２０以下のアミノ酸のフラグメントを得るか、遺伝子クローン化によってより大きなフラグメントを得るかである。突然変異体毒素をコードするＤＮＡ配列は、部位特異的であろうとランダムであろうと、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素からの生物活性における他の変化について更にスクリーニングされ得る。少なくとも１つの生物活性の変化についてのスクリーニングの方法は、上に記載されている。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードする選択されたＤＮＡ配列が、生物活性における少なくとも１つの変化について選択されると、それらは、発現カセットを形成するのに用いられる。発現カセットの形成は、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列を、宿主細胞での突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の発現を提供するプロモーターに組み合わせることを伴う。上記のようなＰＣＲを用いて生産された突然変異体ＳＰＥ− Ａ毒素では、天然のspeＡプロモーターが存在し、宿主細胞での発現を提供する。任意には、ＤＮＡ配列は、宿主細胞の特定の型での発現を提供する、または宿主細胞での発現レベルを高める別のプロモーターと組み合わせ得る。好ましくは、プロモーターは、ＳＰＥ−Ａへの抗体で検出され得るように、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の発現レベルを提供する。原核細胞に用いられ得る他のプロモーターは、Ｐ_Lac、Ｐ_TAc、Ｔ７などを含む。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列が、適切なプロモーターと組み合わさって発現カセットが形成されると、発現カセットは、適切な形質転換ベクターにサブクローン化される。適切な形質転換ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を含み、好ましくは、大腸菌およびグラム陽性微生物に増幅され得るシャトルベクターである。適切なシャトルベクターは、例えば、ｐＭＩＮ１６４、およびｐＣＥ１０４などである。他の型のベクターは、バキュロウイルスベクター、ＳＶ４０、ワクチニアのようなポックスウイルス、アデノウイルスおよびサイトロメガロウイルスなどのウイルス性ベクターを含む。好適なベクターは、ｐＭＩＮ１６４ベクター、大腸菌およびＳ．ａｕｒｅｕｓに増幅され得るシャトルベクターである。形質転換ベクターが突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードする発現カセットを保持して形成されると、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の発現を提供する適切な宿主細胞に導入される。適切な宿主細胞は、内毒素およびＭタンパク質のような他の望ましくない分子の混入の可能性を最小限にしながら、突然変異体の高レベルの発現を提供する細胞である。適切な宿主細胞は、ほ乳類の細胞、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、大腸菌およびサルモネラｓｐｐ．のようなバクテリア細胞、酵母細胞および昆虫の細胞を含む。形質転換方法は、当業者に公知であり、プロトプラスト形質転換、リポソーム仲介形質転換、カルシウムホスフェート沈降反応およびエレクトロポレーションを含む。好適な方法はプロトプラスト形質転換である。好適な形質転換細胞は、アミノ酸２０アスパラギンでの変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードする発現カセットを保持する。このような形質転換された細胞は、Ｒockvill,Ｍarylandにあるthe Ａmerical Ｔype Ｃulture Ｃolle ctionに寄託されている。寄託された微生物の特性は、それは、天然speＡプロモーターおよび他の調節領域と有効に連鎖した突然変異体Ｎ２０ＤをコードするＤＮＡ配列を含むｐＭＩＮ１６４を保持するＳ．ａｕｒｅｕｓであるということである。この微生物は、ブタペスト条約に従って寄託され、受入れ番号６９８３１が与えられた。別の微生物がＡＴＣＣに寄託されている。この微生物は、天然speＡプロモーターおよび調節領域と有効に連鎖した野生型変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列を保持するＳ．ａｕｒｅｕｓである。この微生物は、ブタペスト条約に従って寄託され、受入れ番号６９８３０が与えられた。形質転換細胞は、ワクチン組成物に用いられ得る大量の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素を生産するのに有用である。形質転換された微生物は、生の弱毒化された、または熱殺菌されたワクチンで用いられ得る。形質転換された微生物は、野生型ＳＰＥ−Ａへの防御免疫応答を刺激するのに十分な量の突然変異体ＳＰＥ−Ａ含む。好ましくは、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、隠されている。この微生物は、ヒトに対して非病原性であり、毒素形態への復帰を最小限にするために多数のアミノ酸変化を有する突然変異体毒素を含む。この微生物は、公知の原理に従って、生のまたは熱殺菌されたワクチンのいずれかで投与される。生ワクチン用の好適な微生物は、サルモネラｓｐｐ．のような形質転換細胞である。宿主細胞でのプロモーターファンクショナルに有効に連鎖した突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を有する発現カセットを含んでいるウイルス性ベクターもまた、本明細書中に述べるようなワクチン組成物に用いられ得る。好ましいくは、プロモーターは、ほ乳類においてファンクショナルである。適切なウイルス性ベクターは、例えば、ワクチニアのようなポックスウイルス、アデノウイルスおよびサイトロメガロウイルスなどである。ワクチニアウイルスベクターは、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対してヒトに免疫を与えるために用いられ得る。本発明はまた、宿主細胞でのプロモーターファンクショナルに有効に連鎖した突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントをコードする核酸配列を含むワクチン組成物を含む。プロモーターは、ほ乳類宿主細胞においてファンクショナルであることが好ましい。核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ワクチン組成物は、宿主細胞または個体に運ばれ、個体自身の細胞内で突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメントが発現する。個体での突然変異体ＳＰＥ− Ａ毒素またはそのフラグメントの核酸配列の発現は、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に対しての防御免疫応答を提供する。任意には、発現カセットが、ベクターに組み込まれ得る。核酸分子は、直接またはウイルス性ベクターによって投与され得る。任意には、ワクチン組成物はまた、リポソームなどのような、ワクチンを細胞内を運ぶ輸送剤を含む。任意には、ワクチン組成物はまた、アジュバントまたは他の免疫調節化合物および核酸の細胞へのとり込みを高める付加的な化合物を含む。ワクチン組成物は、静脈、腹腔を通してまたは粘膜表面との接触によるなどの非経口的経路を含む種々の経路で投与され得る。突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の大規模な増殖および生産の条件は、当業者に公知である。微生物源からの突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の精製方法は、以下の通りである。ｐＭＩＮ１６４に突然変異体または野生型speＡを保持するＳ．ａｕｒｅｕｓを、エリスロマイシンを５μｇ／ｍｌ含んでいる、透析可能なウシの心臓培地において、３７℃で通気して定常期まで増殖させる。発熱物質のない水に溶解された４倍体積のエタノールおよびタンパク質で培養を沈降させる。粗製調製物は、ｐＨ勾配が３．５〜１０および４〜６で連続的な平床等電点集中分離に供される。抗体反応性によって毒素に対し陽性である画分は、発熱物質のない水に対し広範に透析され、それぞれのアリコートが、１５％（重量／体積）ゲルにおいてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製についてテストされる。ＳＰＥ−Ａに対するポリクローナル中和抗体は、Ｔoxin Ｔechnologies,Ｂoca Ｒa ton,ＦlaまたはＤr.Ｓchlievertから入手可能である。カラムクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣを含む他の精製方法が用いられ得る。本発明は、代表的な好適な実施形態であるが、本発明の範囲を限定するように解釈されない以下の実施例によってよりよく理解され得る。実施例１ＳＰＥ−Ａ野生型のクローン化および発現野生型ＳＰＥ−Ａ毒素(speＡ)をコードする遺伝子をＪohnson et al.,Ｍol.Ｇ en.Ｇenet.194:52-56(1984)に記載されるように、大腸菌からクローン化した。簡潔には、speＡ遺伝子を、大腸菌ＲＲ１のｐＢＲ３２２におけるファージＴ１２ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化のクローン化によって同定した。Ａ毒素に対するポリクローナル中和抗血清を用いて毒素生産に対し陽性であるものを同定することによって、形質転換細胞を選択した。Ａ毒素のヌクレオチド配列は、Ｗeeks e t al.,Ｉnf.Ｉmm.52:144(1986)に報告されている。 speＡ遺伝子を含むＤＮＡ配列をサブクローン化し、次いで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに発現させた。大腸菌プラスミド上に保持されたspeＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化した。フラグメントを精製し、ｐＭＩＮ１６４（上記のように入手可能）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位に連結した。ベクターｐＭＩＮ１６４は、ブドウ状球菌プラスミドｐＥ１９４（エリスロマイシン耐性を保持している）と大腸菌ベクターｐＢＲ３２８（ＡｍｐおよびＴｅｔ耐性を保持している）とのキメラである。speＡのこのベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位へのクローン化は、Ｔｅｔ耐性を破壊する。クローン化された遺伝子のすぐ上流にあるこのプラスミドに存在するプロモーターは、天然のspeＡプロモーターである。発明者の研究所で調製された毒素からのＳＰＥ−Ａへのポリクローナル中和抗体での二重免疫拡散アッセイにおいて毒素を検出することによって、speＡ遺伝子の発現を立証した。実施例２組換え生産されたＳＰＥ−Ａ（ｗｔ）のウサギへの投与および免疫化組換え生産されたＳＰＥ−Ａの動物への投与は、ＳＴＳＳを誘発する。組換え生産されたＳＰＥ−Ａによる動物の免疫化は、動物がＭ３またはＭ１連鎖球菌を対抗投与されたときの死亡率を低下させ、ＳＴＳＳから動物を防護する。ＳＰＥ−Ａの投与は、ウサギのＳＴＳＳを誘発する。ＳＴＳＳのウサギモデルは、皮下に移植された小型浸透ポンプにおいてＳＰＥ−Ａを投与することによって樹立された。Ｌee et al.,Ｉnfect Ｉmmun.59:879(1991)。これらのポンプは、７日間にわたって、一定の量の毒素を放出するように設計されて、これによって毒素に持続的に曝す。組換え生産されたＳＰＥ−Ａ毒素を、７日間にわたり、０．２ｍｌ当たり２００μｇの全用量でウサギに投与した。その結果は、ＳＰＥ −Ａで処置された動物は、ＳＴＳＳの判定基準を発生し、７日間でほとんどすべての動物が死ぬことを示している(データは示されていない)。ウサギにおけるＳＴＳＳの症状は、体重の減少、下痢、斑点顔面、発熱、赤い結膜および粘膜、および澄んだ茶色の尿を含む。予期されるように、対照の非毒素処置の動物は健康なままである。２つの他の主な観察は、１）予期されるように、液交換が動物への完全防護を提供したこと、２）毒素処置された動物のいずれもが、壊死性筋膜炎および筋肉炎を発生したことであり、これは、ＳＰＥ−Ａ以外の、またはそれに加えて、他の因子が軟組織損傷に必要であることを示している。ＳＴＳＳの臨床特徴の発生は、ＳＰＥ−Ａの投与と相関関係がある。ＳＰＥ− Ａ陽性連鎖球菌を注射されたウサギは、ＳＴＳＳを発生したが、ＳＰＥ−Ａ陰性連鎖球菌を注射されたウサギは、ＳＴＳＳの症状を示さなかった。ＳＰＥ−Ａは、あるＡ群連鎖球菌によって作られる可変の形質であることは公知である。ＳＰＥ−Ａの遺伝子は、バクテリオファージＴ１２によってコードされ、Ｔ１２ファージと呼ばれる、ＳＰＥ−Ａファージが存在するかどうかにおいてのみ区別される、よく特徴付けられた連鎖球菌株が樹立された。連鎖球菌株Ｔ２５₃キュアードＴ１２（Ｔ25₃cured Ｔ12）は、ＳＰＥ−Ａの生産に対し陽性であるが、Ｔ２５₃キュアード（Ｔ25₃cured）は、ＳＰＥ−Ａ陰性である。Ｓcott et al.,Ｉnfect Ｉmmunity 39:383(1983)に記載のように、移植されたホイッフル(Ｗiffie)ゴルフボールでＳＰＥ−Ａ陽性連鎖球菌Ｔ２５₃キュアードＴ１２またはＳＰＥ−Ａ陰性Ｔ２５₃キュアードをウサギに皮下注射した。その結果は、ＳＰＥ−Ａ陽性連鎖球菌を注射されたウサギは、ＳＴＳＳの臨床特徴を発生し、そして６／８が死んだ。２匹の生き残った動物は、ＳＰＥ−Ａへの抗体を発生した。一方、毒素陰性菌株、Ｔ２５₃キュアードは、発熱させただけであり、ずっと高いバクテリア細胞濃度であっても、死は観察されなかった。前記の動物モデル実験においてのように、軟組織壊死の兆候は観察されなかった。さらに、連鎖球菌は、ゴルフボールに局在したままであり、これらの連鎖球菌株は、あまり攻撃的ではないことを示唆した。＊約１×１０⁸細胞 †約１×１０¹¹細胞 ‡２匹の生き残りはＳＰＥ−Ａへの抗体を発生した。組換え生産ＳＰＥ−Ａでの免疫化は、ウサギがＭ１またはＭ３連鎖球菌を対抗投与されたときの死亡率を減少させた。ウサギは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のクローン化されたＳＰＥ−Ａで免疫を与えられ、Ｍタンパク質のような混入している連鎖球菌産物でその動物に免疫を与える可能性を防止した。対照動物には、ＳｐＥ−Ａに対しての免疫を与えなかった。ウサギは、５０μｇの組換え生産ＳＰＥ −Ａをフロイント不完全アジュバントのエマルジョンで皮下に受け入れた。９日後、ウサギは、透析されたウシの心臓培地において増殖した２５ｍｌのＭ３（総数１．４×１０⁹ＣＦＵ）またはＭ１（総数４．２×１０⁹ＣＦＵ）連鎖球菌をウサギの皮下に対抗投与した。Ｍ１およびＭ３連鎖球菌分離菌は、臨床的な分離菌である。Ｍ１分離菌は、ＭＮＳＴと指定され、Ｍ３分離菌は、ＭＮＢＴと指定される。これらの分離菌は、Ｄr.Ｓchlievert,Ｕniversity of Ｍinnesota,Ｍpls. ＭＮ.から入手可能である。表２に表されるデータは、これらの実験の顕著な結果を示している。＊動物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓから調製されたクローン化されたＳＰＥ−Ａに対して免疫を与えられた；ＳＰＥ−Ａに対するＥＬＩＳＡ力価は、１０，０００より大きかった。 †動物は、透析可能なウシの心臓培地における増殖した１．４×１０⁹のＣＦＵＭ３または４．２×１０⁹のＣＦＵＭ１連鎖球菌を皮下に対抗投与された。 ‡ミネソタ大学Ａnimal Ｃare Ｃommitteeのガイダンスによると、Ｍ３連鎖球菌を用いた実験は、２４時間後に終了され、Ｍ１連鎖球菌を用いた実験は、４８時間後に終了された。 §フィッシャーの正確な確率テスト（Ｆisher's Ｅxact Ｐrobability Ｔest ）によって決定されたＰ値示されているように、１９匹のＳＰＥ−Ａ免疫ウサギのうち１６匹が、Ｍ３連鎖球菌の対抗投与から生き延びたが、２０匹の非免疫の動物では、４匹が生き残っただけである。生き残った免疫動物は、軟膿瘍形成が含まれている明らかな兆候を示し、液の検査によるとＰＭＮで満たされていた。Ｍ１の生物は、Ｍ３の生物ほど病毒性がないことを除いて、同様の結果が、Ｍ１連鎖球菌の研究において得られた(表２)。より多くの数のＭ１連鎖球菌が用いられ、非免疫の対照動物においてさえ、ウサギの死亡率は低かった。これは、Ｍ３菌株に比べて、Ｍ１菌株によるＳＰＥ−Ａ生産は約５０倍低いことを反映しているのかもしれない。一方、非免疫の動物では、１匹も膿瘍形成を示さず、２／２動物からの液の検査はＰＭＮ浸入物がなかった。これらの結果は、ＳＰＥ−Ａ免疫と非免疫動物との１つの主な差異は、炎症応答があったか否かであるらしい。先の研究は、他の発熱性毒素超抗原と同様、ＳＰＥ−Ａは、マクロファージを誘導し、高レベルのＴＮＦ−αを生産することを示した。ＴＮＦ−αは、おそらく走化性受容体のダウンレギュレーションによって、ＰＭＮ走化性を大きく減少させる。従って、結果は、ＳＰＥ−Ａ免疫動物（ＥＬＩＳＡによる力価＞１０、０００）における抗体が、ＳＰＥ−Ａを中和することによってマクロファージからのＴＮＦ−αの放出を阻止し、防御炎症応答の発生が可能であることを示すと考えられている。非免疫動物において、ＳＰＥ−Ａは、防御走化応答の発生を防止するＴＮＦ−αの有意の放出を起こし得る。１匹を除く死んだ動物のすべては、全横腹が黒紫色に変わり、多くの場合、腐っていることから明らかなように、広範囲にわたって軟組織の損傷を示したことに注目することが重要である。免疫されたグループでは１匹の動物が、免疫後死んだ。これらの動物の組織での検出可能な炎症の欠如は、連鎖球菌因子であって宿主免疫応答の成分でないものが、壊死性筋膜炎および筋肉炎を起こすことを示唆している。ＳＰＥＢならびにストレプトリジンＯおよびＳのような他の細胞外因子もまた、軟組織損傷に寄与し得る。上記のデータのすべては、ＳＴＳＳの発生において、発熱性毒素超抗原、特にＳＰＥ−Ａ（存在する場合）の原因的な役割の強力な論拠となる。実施例３ＳＰＥ−ＡをコードするＤＮＡ配列の部位指向突然変異生成生物活性に重要なＳＰＥ−Ａ毒素分子の位置を部位指向突然変異生成を用いて同定した。１つのアミノ酸変化を以下のような分子の種々の領域に導入した。ＳＰＥ−Ａ毒素の三次元構造のモデルは、図１に示されている。このモデル構造は、ＢioＳym Ｃorp.,Ｓan Ｄiego,ＣＡ.からのＩnsight/Ｈomology program を用いて相同性により構築されている。この分子は、以下のように同定される幾つかのドメインを有する。ドメイン対応するアミノ酸らせん２１１〜１５Ｎ末端α−らせん、らせん３１８〜２６ドメインＢ − β鎖鎖１３０〜３６鎖２４４〜５２鎖３５５〜６２鎖４７５〜８３鎖５９５〜１０６中央α−せん、らせん５１４２〜１５８ドメインＡ − β鎖鎖６１１７〜１２６鎖７１２９〜１３５鎖８１６９〜１７５鎖９１８０〜１８６鎖１０２１３〜２２０らせん４６４〜７２らせん６１９３〜２０２アミノ酸番号指定は、図３の配列を参照して行われている。それぞれのドメインにおいて、分子のシステイン残基を変化させるようにアミノ酸を選択した。特に好適な領域は、Ｎ末端α−らせん(１８〜２６)、中央α− らせん(１４２〜１５８)、ドメインＡβ鎖およびドメインＢβ鎖である。上記のようなコンピュータープログラムを用いて、一次アミノ酸配列および／または三次元コンフォーメーションの類似性または相同性を比較することによって、発熱性毒素科中の保存されたアミノ酸の中から突然変異生成のための標的残基を選択した。特定の部位での残基のアミノ酸側鎖の特性を変化させるように、アミノ酸のそれぞれに起こる変化を選択した。例えば、３つの残基（８７、９０および９８）において、システインをセリンに置換し、分子のスルフヒドリル基を変化させる。３つの他のアミノ酸残基において、当該部位に存在する電荷に変化を起こした。例えば、リシンをグルタミン（１５７）酸に変え、リシンをアスパラギン（１６）に変え、アルパラギンをアスパラギン酸（２０）に変えた。他のアミノ酸は、毒素のＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用に影響を与え得る。別の分子において、ＴＳＳＴ−１Ｎ末端βバレル鎖は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のαおよびβ鎖との接触に重要であった。したがって、ドメインＡおよびドメインＢβ鎖の変化は、これらの分子のＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を制御するのに重要であり得る。さらに、残基における変化は、ランダム突然変異生成および特定位置での他の１９のアミノ酸のそれぞれの置換を用いて調製され得、次いで、致死性のような生物活性での変化を示す突然変異体を選択する。鋳型ＤＮＡが、ファージＴ１２からのクローン化されたＳＰＥ−Ａ遺伝子である、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いる部位指向突然変異体生成を用いて、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素分子を調製した。これらのプライマーを用いて、各突然変異が起こった。各突然変異体の生成は、以下のような３つのプライマーを用いることを伴う。上流５'フランキングプライマー、アミノ酸での変化をコードするＤＮＡ配列での変化を含む内部プライマーおよび下流フランキングプライマー。上流フランキングプライマーは、すべてのＰＣＲ反応に含まれ、翻訳開始部位から約７６０塩基上流のＤＮＡ領域と相同であり、以下の配列を有する。得られたＰＣＲ産物は、speＡプロモーターおよび可能な上流調節領域を含む。下流フランキングプライマーは、停止コドンから約２７０塩基下流のＤＮＡ領域と相補的であり、以下の配列を有する。下流フランキングプライマーは、すべてのＰＣＲ反応に存在し、プライマーの位置のために、ＰＣＲ産物は、推定転写終結配列を含む。各突然変異は、特定のアミノ酸残基での変化のためのＤＮＡ配列コードを含む内部プライマーを用いて生成される。各突然変異体を生成するために用いられる内部プライマーは、以下の通りである。下線が引かれた残基は、野生型ＳＰＥ−ＡをコードするＤＮＡ配列からのコード配列の変化を示す。ＰＣＲは以下のように行った。簡潔に、下流フランキングプライマーおよび突然変異の部位に渡っておりアミノ酸変化を生成するのに必要なヌクレオチド置換を含むフォワードプライマーを、標準的なＰＣＲ反応において等しくないモル濃度で混合した。得られたＤＮＡ産物は、突然変異を含んでいる鎖に広がっていた。長さが数１００個の塩基であり得る、この産物すなわちメガプライマーを１％アガロースゲルでの電気泳動によって単離し、製造者（Ｂio 101,Ｌa Ｊolla,Ｃ alifornia）が推薦するようなＧeneclean kitの使用によって溶出した。簡潔には、ＰＣＲ反応条件は、１０ｍＭのＴris-ＨＣｌ(pＨ＝8.3)、５０ｍＭのＫＣｌ１.５ｍＭのＭｇＣｌ₂、それぞれ２００ｕＭのｄＮＴＰ、２ｎｇの鋳型プラスミドＤＮＡ、１００ｐｍｏｌのフランキングプライマー、５ｐｍｏｌの内部プライマーおよび２.５ユニットのＡmpli Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ(Ｐerki n Ｅlmer Ｃetus)において、ＰＣＲが行われる。第２の増幅工程において、反応混合物の組成は、同じモル濃度（各５ｐｍｏｌ）のフランキングプライマーおよびメガプライマーならびに１ｕｇの鋳型を除いて上記と同様である。ＰＣＲは、９４℃での変性を３０サイクル×１分、３７℃または４４℃でのアニーリング× ２分および７２℃での伸長を３分間行う。ハイブリッド形成条件は、プライマーの大きさ、不整合性およびＧＣ含有量によって公知の原理に従い変化し得る。 speＡクローン化された遺伝子を含むプラスミドおよびフランキング配列を鋳型として用いた。第２の工程において、メガプライマーおよび上流フランキングプライマーを等モル濃度で反応混合物に混合して、完全な長さの突然変異体spe Ａを生成した。突然変異体speＡを適切な制限酵素で消化し、シャトルベクターpＭＩＮ１６４にクローン化した。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を持つ大腸菌プラスミドｐＢＲ３２８とエリトロマイシン耐性を与えるブドウ状球菌プラスミドｐＥ１９４とのキメラである。連結されたプラスミド混合物は、大腸菌において形質転換、選択およびスクリーニングされた。二重免疫拡散アッセイによって判断すると毒素生産に対して陽性であるクローンを、所望の突然変異の存在および他の突然変異の非存在に合うように、上記のＨsiaoの方法によって配列決定した。次いで、プラスミドは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株ＲＮ４２２０（Ｒichard Ｎovick ,Ｓkirball Ｉnstitute,Ｎew Ｙork,ＮＹから入手可能）において形質転換し、突然変異体毒素を発現および生産した。ｐＭＩＮ１６４における突然変異体または野生型speＡを保持するＳ．ａｕｒｅｕｓを、エリスロマイシンを５μｇ／ｍｌ含んでいる、透析可能なウシの心臓培地において、３７℃で通気して定常期まで増殖させた。発熱物質のない水に溶解された４倍体積のエタノールおよびタンパク質で培養を沈降させた。粗製調製物は、３．５〜１０および４〜６のｐＨ勾配において連続的な平床等電点集中分離に供された。抗体反応性によって毒素に対し陽性である画分は、発熱物質のない水に対し広範に透析され、それぞれのアリコートが、１５％（重量／体積）ゲルにおいてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による精製についてテストされた（データは示されていない）。調製されたすべての突然変異体は、トリプシン（２μｇ／μｇＳＰＥ−Ａ）での６０分間の処置に対して天然の毒素と同じくらい耐性があり、これは、天然ＳＰＥ−Ａに対するポリクローナル抗体への保存された反応性とともに、導入された突然変異は、毒素の全構造変化を起こすことを示している。これらの方法を用いて、ＳＰＥ−Ａのアミノ酸配列における１つのアミノ酸置換を有する７つの突然変異体が生成された。実施例４突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の生物活性プロフィール突然変異体毒素の生物活性を評価し、野生型ＳＰＥ−Ａの生物活性と比較した。Ｔリンパ球の増殖（超抗原性）を刺激し、内毒素ショックへの宿主の感受性を高める能力、毒素ショック症候群の発生および致死性に関して突然変異体毒素をテストした。Ｔリンパ球の増殖を刺激する能力は、ウサギの脾臓細胞の細胞ＤＮＡへの「³ Ｈ」チミジンとり込みとして測定した。標準的な４日間の細胞分裂促進性アッセイを９６のウエルミクロタイタープレートで行った。２×１０⁵個のウサギの脾臓細胞を含む各ウエルを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．０ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２％の熱不活性ＦＣＳで補足された２００μｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｇibco，Ｇrand Ｉsland，ＮＹ）に再懸濁した。外毒素の２０μｌのサンプルを最終量において４倍量となるように添加した。１μｇ〜１０^-5μｇ／ウエル。バックグラウンド細胞増殖を、２０μｌのＲＰＭＩを脾臓細胞に添加することによって、４複製ウエルにおいて測定した。３７℃および７％ＣＯ₂の加湿チャンバーにおいて３日間インキュベートした後、１．０μＣｉ（２０μｌ体積の５−「メチル−³Ｈ」 −チミジン（４６Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａmersham,Ａrlington Ｈeights,ＩＬ）を各ウエルに添加し、１８時間インキュベートした。細胞ＤＮＡをガラスファイバーフィルターに回収し、「メチル−³Ｈ」−チミジンのとり込みを液体シンチレーション計数によって定量した。３つの異なるウサギのドナーを用いて３つの別個のアッセイを行った。外タンパク質濃度を３つのアッセイにおいて４回テストした。結果は、ＣＰＭとして表されている。内毒素ショックに対する宿主の感受性を高める能力を、アメリカダッチベルテッド種（Ａmerican Ｄutch Ｂelted）のウサギにおいてテストした。体重が１〜２ｋｇの動物の耳の辺縁の静脈にＳＰＥ−Ａ毒素を体重１ｋｇにつき５μｇ（１／５０ＬＤ₅₀に相当）を注射し、４時間後、サルモネラチフィムリアム(Ｓalmon ella typhimurium)からの内毒素を体重１ｋｇにつき１〜１０μｇ（約１／１００ＬＤ₅₀）を静脈注射により対抗投与した。対照のウサギは、ＰＢＳを注射された。動物を死について４８時間モニターした。また、アメリカアメリカダッチベルテッド種のウサギの皮下に移植され、２００μｇの毒素を含んでいる小型浸透ポンプを用いて致死性を測定した。個々のタンパク質（２００μｇ）を０．２ｍｌのＰＢＳにおいて小型浸透ポンプ（Ａlzet ,ＡlzaＣo,Ｐalo Ａlto,ＣＡ）に注射した。ポンプは、７日間にわたって一定量の毒素を運ぶように設計されている。下痢、結膜および耳の紅斑、ショックおよび死などの毒素ショック症状の兆候について１日に３回、８日間モニターした。Ｔ細胞分裂促進性研究の結果が、図４、図５および図６に示されている。結果は、突然変異体Ｎ２０Ｄは、超抗原性またはＴ細胞分裂促進性活性において５倍の減少があったことを示している。突然変異体Ｃ８７ＳおよびＣ９８Ｓもまた、Ｔ細胞分裂促進性において４倍の減少があった。従って、突然変異の幾つかは、超抗原性またはＴ細胞分裂促進性という生物活性に影響を与えた。内毒素ショックの増強および致死性の結果を下の表３、４および５に示す。結果は、突然変異体Ｎ２０Ｄで処置された動物は、ＳＴＳＳのいずれかのモデルを用いてテストすると、ＳＴＳＳを発生しなかったことを示している。Ｎ２０Ｄでの突然変異は、毒素の背面の深い溝と接する組織化されたα−らせんに位置する(図１)。この残基は、分子の超抗原性および致死性機能の両方に重要である。スルフヒドリル基を排除し、従って、可能なジスルフィド連鎖に干渉する突然変異は、システイン残基がどこに突然変異するかによって、ＳＰＥ−Ａの生物活性に様々な影響を与える。Ｃ９０Ｓ突然変異体は、完全に致死性のままであり( 表４)、Ｔ細胞刺激活性は、あまり低下しなかった(図５ａ)。一方、Ｃ８７ＳおよびＣ９８Ｓ突然変異は、毒素の細胞分裂促進性を約４倍低下させた(図５ｂ)。しかし、内毒素を起こす能力は、この２つの突然変異による影響は異なり、Ｃ９８Ｓは、弱毒であるが、Ｃ８７Ｓの毒性は強かった(表４)。これらの結果の説明は、一次配列および三次元構造（図１）における３つのシステイン残基の相対位置に基づく。Ｃ９８のスルフヒドリル基の欠如は、ブドウ状球菌腸毒素に見られる推定ジスルフィド架橋の形成を排除し得、従って、ループのコンフォーメーションが失われ得る。これは、もし、このループにおけるアミノ酸が、宿主細胞受容体との接触を引き受けているか、または分子の生物活性の他の機能を有するなら、活性に対し有害効果を有し得る。Ｃ８７Ｓ突然変異の場合、推定ジスルフィド結合は、Ｃ９０とＣ９８との間で起こり得、ほとんどのコンフォーメーション、従って活性を保つ。長い中央α−らせん内に位置する突然変異体Ｋ１５７Ｅは、完全な超抗原性を保持した（図６ｂ）が、ウサギに小型浸透ポンプにより投与すると非致死であった(表６)。 α―５らせんの一部である残基Ｓ１９５Ａは、その突然変異は、これまでテストされた活性に影響しないので、テストされた生物活性にとって重要でないかもしれない。この残基は、環境に曝されないか、または結合に寄与しないかもしれない。これらの結果は、致死性および超抗原性は、幾つかの部位における突然変異によって影響され得ることを示している。致死性は、Ｎ末端α−らせん（Ｎ２０Ｄ）および中央α−らせん（Ｋ１５７Ｅ）における残基での突然変異に影響され得る。細胞分裂促進性は、Ｎ末端α−らせんにおける突然変異およびスルフヒドリル基への変化によって影響され得る。これらの結果はまた、超抗原性に影響を与えることなく致死性に影響を与え( Ｋ１５７Ｅ)、致死性に影響を与えることなく細胞分裂促進性に影響を与える（Ｃ８７Ｓ）突然変異体が生成されたことにより、細胞分裂促進性および致死性は分離可能な活性であることを示している。実施例５ＰＣＲを用いてのＳＰＥ−Ａの二重または三重突然変異体の調製二重または三重突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素あるいはそのフラグメントを生成するために用いられ得る方法は数多い。アミノ酸配列において２つ以上の変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素は、上記のようにＰＣＲを用いて調製され得る。第１のＰＣＲ反応において、選択された第１の部位での第１の変化をコードする第１の内部プライマーは、５'および３'フランキングプライマーと組み合わさり第１のＰＣＲ産物を形成する。第１のＰＣＲ産物は、アミノ酸配列に１つの変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列である。次いで、この第１のＰＣＲ産物は、野生型ＳＰＥ−Ａ活性を有するタンパク質と比べて、アミノ酸配列に２つの変化がある第２のＰＣＲ産物を生成するための鋳型ＤＮＡとして働く。第１のＰＣＲ産物は、第２の部位でのアミノ酸での変化をコードする第２の内部プライマーと組み合わさった鋳型ＤＮＡである。第２の内部プライマーもまた、５'および３'フランキングプライマーと組み合わさり第２のＰＣＲ産物を形成する。第２のＰＣＲ産物は、アミノ酸配列における２つの部位に変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列である。次いで、この第２のＰＣＲ産物は、アミノ酸配列の３つの部位に変化を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードする産物ＤＮＡ配列を形成するために、第３の反応において鋳型として用いられ得る。この方法は、アミノ酸配列において１つ以上の変化を有する突然変異体毒素をコードするＤＮＡ配列を生成するために用いられ得る。１つ以上の変化をコードするＤＮＡ配列を調製する別の方法は、自動合成によって、アミノ酸配列における１つの変化または複数の変化をコードするＤＮＡ配列のフラグメントを調製することである。次いで、フラグメントが、幾つかの独特の制限部位を用いて野生型ＳＰＥ−Ａ毒素コード配列にサブクローン化され得る。制限部位は、当業者に公知であり、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素のＤＮＡ配列から容易に決定され得る。クローン化は、Ｒevi et al.Ｎucleic Ａcid Ｒes.16:103 0(1988)によって記載されるのような３つのフラグメント連結反応方法を用いて１つの工程に行われ得る。実施例６単一および二重突然変異体に関する毒性研究野生型ＳＰＥＡ、ＳＰＥＡＮ２０Ｄ、ＳＰＥＡＫ１５７Ｅ、ＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｃ９８ＳおよびＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅを、ウサギの脾臓細胞増殖を刺激する能力に基づいて超抗原性について評価した（図７および図８を参照）。二重突然変異体ＳＰＥＡ（Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓ、Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅ）を上記の方法を用いてＰＣＲ突然変異によって調製した。突然変異体ＳＰＥＡ遺伝子、speＡＮ２０Ｄは、第２の突然変異の導入のための鋳型ＤＡＮとして働いた。二重突然変異体遺伝子を上記のように配列決定し、指示された変化だけが存在するようにした。所望の変化のみが現れた。ウサギの脾臓の細胞を３日間インビトロでＳＰＥＡおよびＳＰＥＡ突然変異体の存在下で培養し、次いで、１μＣｉ／ウエルの³Ｈチミジンを添加してあと１日おいた。³Ｈチミジンのリンパ球ＤＮＡへのとり込みは、Ｔ細胞増殖の測定として用いられた。刺激された細胞における平均カウント／分³Ｈチミジンとり込みを、ＳＰＥＡまたは突然変異体を添加することなく培養された細胞における平均カウント／分で割ることによって超抗原指標を計算した。野生型ＳＰＥＡは、用量１〜０．００１μｇ／ウエルにおいて大きな超抗原性を有した(図７)。ＳＰＥＡＫ１５７Ｅは、用量０．０１〜０．００１μｇ／ウエルにおいて大きな細胞分裂促進性を有した(図７)。他の３つのＳＰＥＡ突然変異体（ＳＰＥＡＮ２０Ｄ、ＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓ、ＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅ）は、用量１〜０．００１μｇ（ｐ＜０．００１）において野生型ＳＰＥＡに比べて超抗原性はかなり少なかった(図８)。面白いことに、ＳＰＥＡＮ２０Ｄは、用量１〜０．１μｇ（それぞれｐ＜０．０００５、ｐ＜０．００１）においてＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓに比べて超抗原性はずっと大きかった(図８)。さらに、ＳＰＥＡＮ２０Ｄは、１μｇ／ウエル用量（ｐ＜０．０１）においてＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅに比べて細胞分裂促進性は大きかった。従って、データは、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓ突然変異体は、単一Ｎ２０Ｄ突然変異体より毒性が低く、二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅは、他の２つのタンパク質の中間であった。３の突然変異体はすべて、野生型ＳＰＥＡより毒性がかなり低かった。第２の実験において、ウサギ（１グループの３匹）に１０μｇ／ｋｇのＳＰＥＡまたは突然変異体を、次いで、４時間後に内毒素５μｇ／ｋｇ）を静脈に対抗投与した。ＳＰＥおよび内毒素の投与により高められた致死性について４８時間動物をモニターした。このアッセイは、ＳＰＥＡ致死活性の最も感度が高いインビトロ測定である。表６に示すように、野生型ＳＰＥＡおよび内毒素を対抗投与された０／３の動物が生き残った。一方、ＳＰＥＡＮ２０Ｄを対抗投与された動物のうち１匹を除くすべてが生き残り、ＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｃ９８ＳまたはＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅを対抗投与されたすべて動物のが生き残った。注：ＳＰＥＡまたは突然変異体は、０時間において静脈に投与され、内毒素は、４時間で静脈に投与された。動物は致死性について４８時間モニターされた。第３の実験において、ウサギにＳＰＥＡＮ２０Ｄ、ＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｃ９８ＳまたはＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅで免疫を与え、次いで、上記の実験のように、野生型ＳＰＥＡ（１０μｇ／ｋｇ）および内毒素（５μｇ／ｋｇまたは２５μｇ／ｋｇ）を対抗投与した。対照の動物には免疫を与えず、野生型ＳＰＥＡおよび内毒素を対抗投与した。一週間おきに２つの注射により、不完全なアジュバント（フロイントのもの、Ｓigma Ｃhemical Ｃo.,Ｓt.Ｌouis,ＭＯ）において乳化された突然変異体タンパク質（５０μｇ／注射）でウサギに免疫を与え、次いで、１週間休ませてから、野生型毒素を対抗投与した。野生型ＳＰＥＡと内毒素との組み合わせは、１０μｇ／ｋｇのＳＰＥＡおよび５μｇ／ｋｇの内毒素での対抗投与は２０ＬＤ₅₀、そして１０μｇ／ｋｇのＳＰＥＡおよび２５μ ｇ／ｋｇの内毒素での対抗投与は１００ＬＤ₅₀と表す。表７に示すように、１００ＬＤ₅₀のＳＰＥＡおよび内毒素で対抗投与された動物はすべて死んだ。同様に、２０ＬＤ₅₀のＳＰＥＡおよび内毒素で対抗投与されると、ＳＰＥＡＮ２０ＤまたはＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅで免疫された動物はすべて死んだ。一方、二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓで免疫された動物は生き残った。二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅで免疫された動物は、他の動物よりも早く死んだ。上記のデータは、二重突然変異体および特にＳＰＥＡＮ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓは、テスト動物において変性毒素ワクチンとしての有効性を示している。注：この実験中数匹の動物が逃げ出した。これらの動物は上記のデータに含まなかった。実験例７ＳＰＥ−Ａ突然変異体への抗体およびＳＰＥ−Ａ突然変異体免疫によるＳＰＥＡ阻害Ｎ２０Ｄ、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８ＳおよびＮ２０Ｄ／Ｋ１５７ＥＳＰＥＡで免疫されたウサギおよび非免疫対照のそれぞれからの耳の辺縁の静脈から１ｍｌの血液を取り出した。動物は、最後の免疫の６日後（動物が表６の実験に用いられた１日前）に採血された。血液が凝固した後、血清を遠心分離法（１３，０００ｘｇ、１０分）により分離した。各グループからの血清をプールし室温で１時間３３１／３％（最終濃度）の硫酸アンモニウムで処理し、免疫グロブリンを沈降させた。沈降した免疫グロブリンを、遠心分離法（１３，００ｘｇ、１０分）により回収し、リン酸緩衝食塩水（０．００５ＭＮａＰＯ₄ｐＨ７．０、０．１５ＭＮａＣｌ）において当初のボリュームに溶解し、４℃で１リットルの０．１５ＭＮａＣｌに対して２４時間透析した。透析物をフィルター殺菌（孔径０．４５μｍ）し、０．０１μｇＳＰＥＡのウサギの脾臓細胞分裂促進性（超抗原性）を中和するために研究に用いた(図９)。野生型ＳＰＥＡの致死下用量で免疫された１匹のウサギからの血清を比較によって画分し、陽性対照として用いた。血清の各グループからの免疫グロブリン画分（Ｉｇｓ）の２０μｌを完全ＲＰＭＩ１６４０ほ乳類細胞培養培地で１／５および１／５０に希釈し(当初の血清ボリュームについての希釈)、野生型ＳＰＥＡおよび我々の標準的な細胞分裂促進性アッセイにおける２×１０⁵個のウサギの脾臓細胞を含んでいる４つのウエルのそれぞれに添加した。Ｉｇｓおよび野生型毒素の両方を時間０においてリンパ球に添加した。結果は図９に示す。１／５希釈Ｉｇｓは、免疫された動物または非免疫の対照動物からにかかわらず、おそらく、Ｉｇｓ内に硫酸アンモニウムが残っているために、脾臓細胞増殖を阻害した。しかし、ＳＰＥＡ免疫動物からのＩｇｓおよびＮ２０Ｄ、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８ＳおよびＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅ免疫動物からのＩｇｓは、非免疫対照動物より阻害し(正常に分布された対になっていないデータの学生のテスト（Ｓtud ent's test analysis of normally distributed unpaired data）の使用による、ＳＰＥＡ対非免疫ではｐ＝０．００６、Ｎ２０Ｄ対非免疫では[＝０．０３５、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓ対非免疫ではｐ＝０．０００２および、Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅ対非免疫ではｐ＝０．０００１)、これは細胞分裂促進性の特異的な阻害を示した。Ｉｇｓが１／５０希釈液に添加されると、二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓは、非免疫の対照動物に比べて、脾臓細胞増殖の大きな阻害を起こした(Ｐ＝０. ０４６)。このＩｇ濃度において、いずれの画分もリンパ球細胞分裂促進性の非特異的な抑制を起こさなかった。これらのデータは、二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓは、単一突然変異体Ｎ２０Ｄまたは他の二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅより野生型ＳＰＥＡの細胞分裂促進性に対して動物によりよく免疫を与えることができたことを示唆している。しかし、二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅは、単一突然変異体Ｎ２０Ｄに比べて、よりよい免疫原であった。以下のものによって結合されることなく、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓ突然変異体における２つの変化は、致死性、細胞に存在する抗原に対するＴ細胞受容体相互作用および、おそらく間接的に、クラスＩＩＭＨＣの相互作用に必要な宿主細胞受容体部位を干渉することが可能である。クラスＩＩＭＨＣの相互作用は、毒素の標準的な図におけるβバレルドメイン（ドメインＢ）でのアミノ酸残基に依存するので、我々は、この領域（Ｄ４５Ｎなど）での変化はＮ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓの免疫性をさらに向上させ得るということもまた提案する。この仮説の基礎は、野生型毒素（およびおそらくクラスＩＩＭＨＣ相互作用ドメインでの変化がない突然変異体）が、細胞に存在する抗原による正常なプロセシングのための要件なしに、クラスＩＩＭＨＣ分子に直接結合することである。突然変異体はより容易に内部化およびプロセスされるので、この直接のクラスＩＩＭＨＣ相互作用を干渉するアミノ酸変化を含む突然変異体には、より免疫性がある。従って、三重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓ／Ｄ４５Ｎは、他の突然変異体を評価するために用いる方法を用いて評価され得る。非免疫対照動物およびＮ２０Ｄ、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８ＳおよびＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅで免疫されたウサギの各グループから得られた血清を、野生型ＳＰＥＡに対するＥＬＩＳＡ力価について直接テストした(Ｌ.Ｈudson and Ｆ.Ｃ.Ｈay,Ｐrac tical Ｉmmunology 2nd Ｅｄ,1980,Ｂlackwell Ｓcientific Ｐublications,Ｂo ston p 237-239)。各動物からの血清を別々に評価した。得られた抗体力価は平均されて、表８に示されている。非免疫対照動物は、予期されるように、ＳＰＥＡに対する抗体の力価は非常に低かった。一方、突然変異体に対して免疫されたすべての動物は、有意の抗体力価を有した。二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅで免疫された動物は、最高の平均力価を有し、他の２つの突然変異体は同じくらいであった。しかし、Ｎ２０Ｄで免疫された動物の力価の範囲は、いずれの二重突然変異体よりずっと大きかった(６匹の動物はそれぞれ、２０、４０、１６０、６４０、６４０)。このデータは、二重突然変異体がより一貫した免疫を与えることを示唆している。ａ６匹の動物／グループｂ検出可能な最低の力価は１０であった。力価は、正の結果を与えた最終希釈値の逆数である。最後の実験において、一日おきに５回の注射で突然変異体タンパク質を投与し、１日動物を休ませることによって、動物（３／グループ）にＮ２０Ｄ、Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８ＳまたはＮ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅに対して免疫を与えた(５０μｇ／静脈注射)。次いで、動物は、発熱を起こす野生型ＳＰＥＡの能力に対する免疫について評価された[体重１ｋｇにつき、注射の４時間後、最小発熱性用量（ＭＰＤ）の２０倍（２０ＭＰＤ−４）]。ＳＰＥＡは、０．１５μｇ／ｋｇのウサギにおける１ＭＰＤ−４での公知の最も強力な発熱物質の１つである。４時間の時点において、動物は、内毒素（２５μｇ／ｋｇ）を注射され、内毒素ショックへの高まった感受性への免疫を評価した。結果を表９に示す。非免疫動物およびＮ２０ＤＳＰＥＡで免疫された動物は、大きな発熱応答（両グループにおいて０．８℃）および内毒素への感受性が高まったことを（両グループにおいて４８時間で２／３が死んだ）示した。一方、いずれかの二重突然変異体で免疫された動物は、発熱および増強現象から完全に防護された。上記のデータのすべてをまとめると、二重突然変異体が単一突然変異体よりＳＰＥＡの毒性効果に対して動物に免疫をよりよく与えることができるということを示唆している。突然変異体自体のいずれも動物に対して毒性がなかった。二重突然変異体Ｎ２０Ｄ／Ｃ９８Ｓが、Ｎ２０Ｄ／Ｋ１５７Ｅより良好な免疫原であったが、両者とも効果があった。本発明は、特定の実施形態の文脈の中で記載されたが、特許が網羅している範囲は、それらの特定の実施形態に限定されるものではなく、以下の請求の範囲を参照して決定される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月１日【補正内容】特許法第１８４条の５第１項の規定による書面に添付した明細書の翻訳文の２頁２０行目の「この科の他のメンバーは」〜３頁１７行目の「... 由来する。」を以下のように補正する。この科の他のメンバーは、ＢおよびＣ型連鎖球菌発熱性外毒素、ブドウ球菌毒素ショック症候群毒素１、ブドウ状球菌エンテロックストキシン(enteroxtoxin) Ａ、Ｂ、Ｃｎ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＨ、ならびに非Ａ群連鎖球菌発熱性外毒素である。これらの毒素は、類似の生化学的特性、生物活性および様々な程度の配列の類似を有する。ＳＴＳＳの最も重い症状は、低血圧およびショック症状であり、死に至る。血管内から組織間腔への液の漏出が、低血圧の決定的な原因であると一般に考えられており、これは液交換療法が上記のＳＴＳＳのウサギのモデルでのショック症状の防止に効くという観察によって裏付けされている。ＳＰＥ−Ａは、この病理学を誘発するために宿主に幾つかの方法で作用し得るという仮説がある。ＳＰＥ −Ａ分子の中央領域におけるある単一アミノ酸置換が、ＨＬＡクラスＩＩ分子の細胞分裂促進活性およびＳＰＥ−ＡによるＨＬＡクラスＩＩ分子への結合に影響を与えることが示されている(Ｈartwig et al.,Ｉnternational Ｉmmunology 5: 5:,869-875(1993))。ＳＰＥ−Ａは、肝臓クッパー細胞の活性を犠牲にすることによって、内因性植物由来の内毒素の肝臓クリアランス（clearance）を阻止することが示されてきた。これは、循環している内毒素を有意に増加させるらしく、リポ多糖類結合タンパク質（ＬＢＰ）への結合およびＣＤ１４シグナリングを通して、マクロファージ活性化が起こり、次にＴＮＦ−α、および他のシトキンが放出される。病気での内毒素の役割は、ＳＰＥ−Ａの致死効果が、動物へのポリミクシンＢの投与または病原体のないウサギの使用によって少なくとも部分的に中和され得るという発見によって裏付けられる。ショック症状の誘発の別の様相は、この毒素の毛細管内皮細胞への直接的な活性であり得る。この仮説は、ブドウ状球菌発熱性毒素ＴＳＳＴ−１が、ヒトの臍帯静脈細胞に直接結合し、単離されたブタの大動脈内皮細胞に対し細胞毒素性を有するという発見に由来する。請求の範囲１．突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素が、１〜６個のアミノ酸置換を含み、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に実質的に対応するタンパク質と比べて、実質的に非致死性であり、置換されたアミノ酸の少なくとも１つが、Ｎ末端アルファらせん３、ドメインＢベータ鎖１、ドメインＢベータ鎖２、ドメインＢベータ鎖３、ドメインＡベータ鎖６、ドメインＡベータ鎖８、ドメインＡベータ鎖９、ドメインＡベータ鎖１０に位置するか、またはシステインである、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメント。２．突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素が、１〜６個のアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸の少なくとも１つが、アスパラギン−２０、リシン −１５７またはシステイン−９８である、請求項１に記載の突然変異体ＳＰＥ− Ａ毒素。３．少なくとも１つのアミノ酸置換が、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシンまたはアルギニンへのアスパラギン−２０の置換、セリン、アラニン、グリシン、またはトレオニンへのシステイン９８の置換、あるいは、グルタミン酸またはアスパラギン酸へのリシン−１５７の置換を含む、請求項２に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。４．少なくとも１つのアミノ酸置換が、アスパラギン酸へのアスパラギン−２０、セリンへのシステイン９８、グルタミン酸へのリシン−１５７の置換を含む、請求項３に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。５．少なくとも１つのアミノ酸置換が、アスパラギン−２０の置換を含む、請求項２に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。６．置換が、アスパラギン酸へのアスパラギン−２０である、請求項５に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。７．システイン−９８またはリシン−１５７の置換をさらに含む、請求項５に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。８．置換が、セリンへのシステイン−９８またはグルタミン酸へのリシン−１５７である、請求項７に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。９．突然変異体が、少なくとも１つの以下の特性を有する突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素であって、特性とは、突然変異体は、Ｔ細胞ための細胞分裂促進性の低下を有すること、突然変異体は、内毒素ショックを実質的に高めないこと、突然変異体は、致死性でないこと、または突然変異体は、非致死性であるが、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に匹敵する細胞分裂促進性を保持することである、請求項１に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。１０．野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対して動物を防護するワクチンであって、請求項１に記載の少なくとも１つの突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の有効量を含むワクチン。１１．生理学上許容可能な担体と混合された請求項１に記載の突然変異体ＳＰＥ −Ａ毒素を含む製剤組成物。１２．請求項１に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列。１３．請求項１２に記載のＤＮＡ配列を含む安定して形質転換された宿主細胞。１４．野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対して動物を防護する方法であって、請求項１０に記載のワクチンを動物に投与することを含む方法。１５．毒素ショックに伴う症状を軽減する方法であって、請求項１０に記載のワクチンを動物に投与することを含む方法。１６．突然変異体が、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に実質的に対応するタンパク質と比べて、少なくとも２つのアミノ酸変化を有し、実質的に非致死性である、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメント。１７．突然変異体が、少なくとも１つの以下の特性を有する突然変異体ＳＰＥ− Ａ毒素であって、特性とは、突然変異体は、Ｔ細胞ための細胞分裂促進性の低下を有すること、突然変異体は、内毒素ショックを実質的に高めないこと、突然変異体は、致死性でないこと、または突然変異体は、非致死性であるが、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に匹敵する細胞分裂促進性を保持することである、請求項１６に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。１８．野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対して動物を防護するワクチンであって、請求項１６に記載の少なくとも１つの突然変異体ＳＰＥ− Ａ毒素の有効量を含むワクチン。１９．生理学上許容可能な担体と混合された請求項１６に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素を含む製剤組成物。２０．請求項１６に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列。２１．請求項２９に記載のＤＮＡ配列を含む安定して形質転換された宿主細胞。２２．野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１の生物活性に対して動物を防護する方法であって、請求項１８に記載のワクチンを動物に投与することを含む方法。２３．毒素ショックに伴う症状を軽減する方法であって、請求項１８に記載のワクチンを動物に投与することを含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ストア、ジェニファーアメリカ合衆国、ミネソタ州 55127、バドナイアスハイツ、ウッドリッジサークル 3981、 (72)発明者オーレンドルフ、ダグラスアメリカ合衆国、ミネソタ州 55347、イーデンプレーリー、オリンピアドライブ 9397

Claims

【特許請求の範囲】１．突然変異体が、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に実質的に対応するタンパク質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変化を有し、実質的に非致死性である、突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素またはそのフラグメント。２．突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素が、１〜６個のアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸の少なくとも１つが、Ｎ末端アルファらせん３、ドメインＢベータ鎖１、ドメインＢベータ鎖２、ドメインＢベータ鎖３、ドメインＡベータ鎖６、ドメインＡベータ鎖８、ドメインＡベータ鎖９、ドメインＡベータ鎖１０に位置するか、またはシステインである、請求項１に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。３．突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素が、１〜６個のアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸の少なくとも１つが、アスパラギン−２０、リシン −１５７またはシステイン−９８である、請求項１に記載の突然変異体ＳＰＥ− Ａ毒素。４．少なくとも１つのアミノ酸置換が、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシンまたはアルギニンへのアスパラギン−２０の置換、セリン、アラニン、グリシン、またはトレオニンへのシステイン９８の置換、あるいは、グルタミン酸またはアスパラギン酸へのリシン−１５７の置換を含む、請求項３に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。５．少なくとも１つのアミノ酸置換が、アスパラギン酸へのアスパラギン−２０、セリンへのシステイン９８、グルタミン酸へのリシン−１５７の置換を含む、請求項４に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。６．少なくとも１つのアミノ酸置換が、アスパラギン−２０の置換を含む、請求項３に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。７．置換が、アスパラギン酸へのアスパラギン−２０である、請求項６に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。８．システイン−９８またはリシン−１５７の置換をさらに含む、請求項６に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。９．置換が、セリンへのシステイン−９８またはグルタミン酸へのリシン−１５７である、請求項８に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。１０．突然変異体が、少なくとも１つの以下の特性を有する突然変異体ＳＰＥ− Ａ毒素であって、特性とは、突然変異体は、Ｔ細胞ための細胞分裂促進性の低下を有すること、突然変異体は、内毒素ショックを実質的に高めないこと、突然変異体は、致死性でないこと、または突然変異体は、非致死性であるが、野生型ＳＰＥ−Ａ毒素に匹敵する細胞分裂促進性を保持することである、請求項１に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素。１１．野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対して動物を防護するワクチンであって、請求項１に記載の少なくとも１つの突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素の有効量を含むワクチン。１２．生理学上許容可能な担体と混合された請求項１に記載の突然変異体ＳＰＥ −Ａ毒素を含む製剤組成物。１３．請求項１に記載の突然変異体ＳＰＥ−Ａ毒素をコードするＤＮＡ配列。１４．請求項１３に記載のＤＮＡ配列を含む安定して形質転換された宿主細胞。１５．野生型ＳＰＥ−Ａ毒素の少なくとも１つの生物活性に対して動物を防護する方法であって、請求項１１に記載のワクチンを動物に投与することを含む方法。１６．毒素ショックに伴う症状を軽減する方法であって、請求項１１に記載のワクチンを動物に投与することを含む方法。