ES2239332T3 - Mutantes de la toxina de estreptococos a y procedimientos de uso. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A TOXINAS SPE AGMENTOS DE LA MISMAS, VACUNAS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y METODOS DE USO DE LA VACUNA Y DE LAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS. LA TOXINA SPE OACIDO Y NO ES SUSTANCIALMENTE LETAL EN COMPARACION A LA TOXINA SPE FORMAR COMPOSICIONES DE VACUNAS UTILES PARA PROTEGER A LOS ANIMALES CONTRA LAS ACTIVIDADES BIOLOGICAS DE LA TOXINA SPE TIPO SALVAJE.

Description

Mutantes de la toxina de estreptococos A y procedimientos de uso.

Streptococcus pyogenes, también conocido como estreptococo del grupo A \beta-hemolítico (GAS) es un patógeno de seres humanos que puede causar infecciones moderadas tales como faringitis e impétigo. Pueden suceder complicaciones autoinmunes post-infección, concretamente fiebre reumática y glomerulonefritis aguda. GAS también puede causar enfermedades agudas graves tales como fiebre escarlata y el síndrome de choque tóxico por estreptococos (STSS). Las infecciones graves por GAS fueron un gran problema en los Estados Unidos y en todo el mundo en el inicio de este siglo. A mediados de los cuarenta, la cantidad de casos y su gravedad disminuyó a un ritmo constante por razones aún no comprendidas completamente. Sin embargo, más recientemente, se ha visto un resurgimiento de enfermedades serias causadas por GAS de modo que puede haber 10-20.000 casos de STSS cada año en los Estados Unidos. Del 50 al 60% de estos pacientes tendrá fascitis necrotizante y miositis; del 30 al 60% morirá y la mitad de los supervivientes tendrán extremidades amputadas.

En 1986 y 1987 dos informes describieron un brote de infecciones graves por GAS localizadas en el área de Rocky Mountain. Estos informes se han seguido en los últimos años por otros distintos que describen una enfermedad con presentación clínica análoga. Los síntomas descritos para esta enfermedad fueron muy similares a los descritos para el síndrome de choque tóxico (TSS), y en 1992 un comité de científicos dio a esta presentación clínica el nombre formal de STSS, y estableció los criterios para su diagnóstico. STSS se define por la presencia de lo siguiente:

1. hipotensión y conmoción;

2. aislamiento de estreptococo del grupo A;

3. dos o más de los siguientes síntomas: fiebre de 38,5ºC o superior, aparición de fiebre escarlata, vómitos y diarrea, disfunción renal y del hígado, síndrome de distrés respiratorio del adulto, coagulación intravascular diseminada, fascitis necrotizante y/o miositis, bacteremia.

Los aislados de estreptococos de pacientes STSS son predominantemente de tipo M 1 y 3, formando M18 y organismos no tipificables la mayoría del resto. La mayoría de M1, 3, 18, y organismos no tipificables asociados con STSS producen endotoxina A pirogénica (SPE-A, toxina A de la fiebre escarlata). En contraste, sólo el 15% de los aislados de estreptococos general produce esta toxina. Además, la administración de SPE-A a un modelo animal de conejo y en dos inoculaciones humanas accidentales pueden reproducir los síntomas de STSS.

SPE-A es un péptido único de peso molecular igual a 25.787 Dalton, cuya secuencia codificante la lleva el bacteriófago T12 moderado. speA, el gen para SPE-A, se ha clonado exitosamente y se ha expresado en Escherichia coli. SPE-A es un miembro de una gran familia de exotoxinas producidas por estreptococos y estafilococos, mencionadas como toxinas pirogénicas en base a su capacidad de inducir fiebre y potenciar la susceptibilidad del huésped hasta 100.000 veces a endotoxina.

Recientemente, estas toxinas se han mencionado como superantígenos por su capacidad para inducir la proliferación masiva de linfocitos T, independientemente de su especificidad antigénica, y de un modo dependiente de la composición de la parte variable de la cadena \beta del receptor de célula T. Estas toxinas también estimulan la liberación masiva de IFN-\gamma, IL-1, TNF-\alpha y TNF-\beta. Otros miembros de esta familia son exotoxinas pirogénicas de estreptococos tipo B y C, la toxina 1 del síndrome de choque tóxico por estafilococos, las enterotoxinas A, B, Cn, D, E, G y H de estafilococos, y exotoxinas pirogénicas de estreptococos que no son del grupo A. Estas toxinas tienen propiedades bioquímicas similares, actividades biológicas y diversos grados de similitud de secuencia.

Las manifestaciones más graves de STSS son hipotensión y choque, que conducen a la muerte. Generalmente se cree que la filtración de fluido desde el espacio intravascular al espacio intersticial es la causa final de hipotensión, sostenida por la observación de que la terapia de reemplazamiento de fluido es exitosa para prevenir el choque en un modelo de conejo de STSS descrito anteriormente. Se ha hipotetizado que SPE-A puede funcionar de varios modos en el huésped para inducir esta patología.

Se ha mostrado que SPE-A bloquea la eliminación por el hígado de la endotoxina de origen de la flora endógena, comprometiendo la actividad de las células de Kupffer del hígado. Esto parece causar un aumento significativo en la endotoxina en circulación, que a través de la unión a la proteína de unión de lipopolisacáridos (LBP) y la señalización de CD14 conduce a la activación de macrófagos con la liberación posterior de TNF-\alpha y otras citoquinas. El apoyo para el papel de la endotoxina en la enfermedad se da por el descubrimiento de que los efectos letales de SPE-A pueden neutralizarse al menos parcialmente por la administración a animales de polimixina B o por el uso de conejos libres de patógeno.

Otra modalidad de inducción de choque podría ser la actividad directa de la toxina en las células del endotelio capilar. Esta hipótesis es el resultado del descubrimiento de que la toxina TSST-1 pirogénica de estafilococos se une directamente a las células de la vena del cordón umbilical humano y es citotóxica para las células del endotelio aórtico porcino aislado.

Otra modalidad de acción de la toxina incluye su superantigenicidad, en la que la toxina interacciona y activa hasta el 50% de los linfocitos T del huésped. Esta estimulación masiva de células T da como resultado un nivel anormalmente alto de citoquinas TNF-\beta e IFN-\gamma en circulación que tiene efectos directos en los macrófagos para inducir la liberación en TNF-\alpha e IL-1. Estas citoquinas también pueden inducirse directamente de macrófagos por SPE-A a través de la unión de MHC de clase II y la señalización en ausencia de células T. Los niveles elevados de TNF-\alpha y -\beta causan varios efectos típicamente encontrados en choque inducido por Gram negativas, entre los que están el daño a células endoteliales y filtración capilar. Sin embargo, la administración a conejos tratados con SPE-A de ciclosporina A, que bloquea la sobrerregulación de IL-2 y proliferación de células T, no protegió a los animales del choque, sugiriendo que los mecanismos adicionales pueden ser más importantes para causar la filtración capilar.

Por tanto, hay una necesidad de localizar sitios en la molécula SPE-A responsables de las diferentes actividades biológicas. Hay una necesidad de desarrollar variantes de SPE-A que tienen cambios en las actividades biológicas tales como toxicidad y mitogenicidad. Hay una necesidad de desarrollar composiciones útiles en vacunas para prevenir o mejorar el síndrome de choque tóxico por estreptococos. También hay una necesidad de desarrollar agentes terapéuticos útiles en el tratamiento del síndrome de choque tóxico por estreptococos y otras enfermedades.

Sumario de la invención

Esta invención incluye toxinas SPE-A mutantes, vacunas y composiciones farmacéuticas, secuencias de ADN que codifican las toxinas SPE-A mutantes y células huésped transformadas estables que comprenden dichas secuencias de ADN.

Para composiciones de vacuna, las toxinas mutantes estimulan una respuesta inmune de protección frente a al menos una actividad biológica de una toxina SPE-A tipo silvestre. Las toxinas mutantes a las composiciones de vacuna se seleccionan también opcionalmente para que tengan una disminución en la potenciación del choque por endotoxina y una disminución en la mitogenicidad de células T en comparación con la SPE-A tipo silvestre. Para composiciones farmacéuticas, se prefiere que la toxina mutante sea sustancialmente no letal mientras que conserve la mitogenicidad de células T en comparación con la toxina SPE-A tipo silvestre.

La invención también incluye secuencias de ADN y células transformadas. Un casete de expresión comprende una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante unida de manera operativa a un promotor funcional en una célula huésped. Los casetes de ADN se insertan preferiblemente en un vector. Los vectores incluyen plásmidos o virus. Los vectores son útiles para proporcionar un ADN molde para generar ADN que codifica una toxina SPE-A mutante. Los casetes de ADN y vectores también son útiles en composiciones de vacuna. Los ácidos nucleicos que codifican una toxina SPE-A mutante pueden suministrarse directamente para la expresión en células de mamífero. El promotor es preferiblemente un promotor funcional en una célula de mamífero. Los ácidos nucleicos suministrados directamente a células pueden proporcionar la expresión de la toxina SPE-A mutante en un individuo de modo que pueda generarse una respuesta inmune de protección frente a al menos una actividad biológica de una toxina SPE-A tipo silvestre.

La composición de vacuna adicional incluye células transformadas estables o vectores virales que incluyen un casete de expresión que codifica una toxina SPE-A mutante. Los vectores virales tales como vaccinia pueden usarse para inmunizar humanos para generar una respuesta inmune de protección frente a al menos una actividad biológica de una toxina SPE-A tipo silvestre. Las células transformadas son preferiblemente microorganismos tales como S. aureus, E. coli o Salmonella species spp. Los microorganismos transformantes incluyen la toxina SPE-A mutante en su superficie o son capaces de secretar la toxina mutante. Los microorganismos transformados pueden administrarse como vacunas vivas, atenuadas o muertas por calor.

La invención también incluye vacunas y composiciones farmacéuticas. Las vacunas se administran a un animal en una cantidad eficaz para generar una respuesta inmune de protección frente a al menos una actividad biológica de una toxina SPE-A tipo silvestre. Preferiblemente, las composiciones de vacuna se administran a humanos y protegen frente al desarrollo de STSS. Las composiciones farmacéuticas se usan en procedimientos de estimulación de proliferación de células T. Las composiciones farmacéuticas son especialmente útiles en el tratamiento de cánceres que se tratan con interleuquinas, interferones u otros inmunomoduladores, linfomas de células T, cánceres de ovario y útero. Una composición farmacéutica se administra a un paciente que tiene cáncer.

Las toxinas SPE-A mutantes y otras composiciones de vacuna pueden ser útiles para generar un suero inmune pasivo. Las toxinas SPE-A mutantes, los casetes o vectores de expresión de ADN, o los microorganismos transformados pueden usarse para inmunizar un animal para producir anticuerpos neutralizantes frente a al menos una actividad biológica de SPE-A tipo silvestre. Los anticuerpos neutralizantes inmunorreaccionan con una toxina SPE-A mutante y la toxina SPE-A tipo silvestre. El suero inmune pasivo puede administrarse a un animal con síntomas de una infección por estreptococos A y STSS.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 Dibujo en cintas de la estructura tridimensional modelada de la endotoxina A pirogénica de estreptococos. Se indican el Dominio A y B.

Figura 2 Vista de SPE-A como se ve por la parte trasera en referencia a la vista convencional vista en la Figura 1. Los restos enumerados son los homólogos a los restos en TSST-1 evaluados para la letalidad sistémica reducida.

Figura 3 Muestra la secuencia de ADN (SEC ID Nº: 12) y la secuencia de aminoácidos predicha (SEC ID Nº: 13) de la toxina SPE-A clonada de T12.

Figura 4 Ensayo de proliferación de células T. Se incubaron esplenocitos de conejo en placas de microtitulación de 96 pocillos por cuadruplicado con SPE-A, K16N-SPE-A, y N20D-SPE-A durante 72 horas. Las células se pulsaron con [^{3}H] timidina durante 18 a 24 horas, se recogieron en filtros, y la incorporación de [^{3}H] timidina se midió en un contador de centelleo. Los resultados se expresan como cuentas por minuto (CPM) versus concentraciones de toxina en \mug/ml. Los datos presentados son del más representativo de tres experimentos independientes.

Figura 5 Ensayo de proliferación de células T. Se incubaron esplenocitos de conejo en placas de microtitulación de 96 pocillos por cuadruplicado con SPE-A, C87-SPE-A, C98S-SPE-A, y C90S-SPE-A durante 72 horas. Las células se pulsaron con [^{3}H] timidina durante 18 a 24 horas, se recogieron en filtros, y la incorporación de [^{3}H] timidina se midió en un contador de centelleo. Los resultados se expresan como cuentas por minuto (CPM) versus concentraciones de toxina en \mug/ml. Los datos presentados son del más representativo de tres experimentos independientes.

Figura 6 Ensayo de proliferación de células T. Se incubaron esplenocitos de conejo en placas de microtitulación de 96 pocillos por cuadruplicado con SPE-A, K157E-SPE-A, y S195-SPE-A durante 72 horas. Las células se pulsaron con [^{3}H] timidina durante 18 a 24 horas, se recogieron en filtros, y la incorporación de [^{3}H] timidina se midió en un contador de centelleo. Los resultados se expresan como cuentas por minuto (CPM) versus concentraciones de toxina en \mug/ml. Los datos presentados son del más representativo de tres experimentos independientes.

Figura 7 Superantigenicidad de SPE-A tipo silvestre en comparación con un mutante simple. Se incubaron células de bazo de conejo durante 4 días con SPE-A o mutantes a las dosis indicadas. Se usaron cuatro pocillos replicados a cada dosis de SPE-A y mutantes. En el día 3, se añadió 1 \muCl de ^{3}H timidina a cada pocillo. Índice de superantigenicidad = incorporación de ^{3}H timidina por esplenocitos en presencia de SPE-A o mutantes dividida por la incorporación de ^{3}H timidina en ausencia de SPE-A o mutantes.

Figura 8 Superantigenicidad de SPE-A tipo silvestre en comparación con mutantes dobles. Los procedimientos usados son los descritos en la Figura 7.

Figura 9 Inhibición de SPE-A por Sueros de Conejos inmunizados. Los sueros de conejo de conejos inmunizados con mutantes simples y dobles se usaron para demostrar la capacidad de los sueros para neutralizar la mitogenicidad de esplenocitos en presencia de SPE-A.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a toxinas SPE-A mutantes, composiciones de vacuna y farmacéuticas que incluyen toxinas SPE-A mutantes, secuencias de ADN que codifican toxinas SPE-A mutantes, y huéspedes transformados estables que comprenden dichas secuencias de ADN.

Preferiblemente, la toxina SPE-A mutante es sustancialmente no letal en comparación con la toxina SPE-A tipo silvestre a la misma dosis. Las toxinas SPE-A mutantes pueden generarse usando una diversidad de procedimientosincluyendo mutagénesis dirigida de sitio, mutagénesis aleatoria, mutagénesis convencional, mutagénesis in vitro, mutagénesis espontánea y síntesis química. Las toxinas SPE-A mutantes se seleccionan preferiblemente para: 1) asegurar más de uno, pero no más de seis cambios en un aminoácido, como se describe en la reivindicación 1; y 2) tener un cambio en al menos una función biológica de la molécula, como se describe en la reivindicación 1, preferiblemente una disminución o eliminación de la letalidad sistémica. Las toxinas mutantes son útiles en composiciones de vacuna para proteger frente a al menos una actividad biológica de la toxina SPE-A tal como prevención o mejora de STSS, en procedimientos para tratar animales con síntomas de STSS, y en procedimientos para estimular la proliferación de células T y en el tratamiento de cáncer. Los mutantes SPE-A simples y dobles se ensayaron y el anticuerpo para los mutantes inhibió las respuestas celulares frente a SPE-A.

A. Toxinas SPE-A Mutantes o Fragmentos de las Mismas, Composiciones de Vacuna y Farmacéuticas

La invención incluye toxinas SPE-A mutantes que tienen más de uno, pero no más de seis cambios de aminoácidos y que tienen al menos un cambio en una actividad biológica en comparación con proteínas que corresponden sustancialmente a y tienen las mismas actividades biológicas que SPE-A tipo silvestre como se describe en la reivindicación 1.

La toxina SPE-A tipo silvestre está codificada por un gen speA encontrado en el bacteriófago T12. La toxina SPE-A tipo silvestre tiene un peso molecular de 25.787 Dalton calculado de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína madura. Una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A tipo silvestre y la secuencia de aminoácidos predicha para la toxina SPE-A tipo silvestre se muestra en la Figura 3. Una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A tipo silvestre se ha clonado en E. coli y S. aureus. Las denominaciones del número de aminoácidos en esta solicitud se hacen en referencia a la secuencia de la Figura 3 con glutamina en la posición 31 denominada como el primer aminoácido. Los primeros 30 aminoácidos representan una secuencia líder no presente en la proteína
madura.

Un modelo estructural de una toxina SPE-A tipo silvestre se muestra en la Figura 1. El modelo estructural se construyó por modelado de homología usando el programa Insight/Homolgy disponible por BioSym Corp., San Diego, CA. El modelo indica que la toxina SPE-A tipo silvestre tiene varias características estructurales distintas. Estas características estructurales incluyen: hélice 2 (aminoácidos 11-15); alfa hélice 3 N-terminal (aminoácidos 18-26); hélice 4 (aminoácidos 64-72); \alpha-hélice 5 central (aminoácidos 142-158); hélice 6 (aminoácidos 193-202); cadenas beta del Dominio B que incluyen cadena 1 (aminoácidos 30-36), cadena 2 (aminoácidos 44-52), cadena 3 (aminoácidos 55-62), cadena 4 (aminoácidos 75-86), cadena 5 (aminoácidos 95-106); cadena beta del Dominio A que incluyen la cadena 6 (aminoácidos 117-126), cadena 7 (aminoácidos 129-135), cadena 8 (aminoácidos 169-175), cadena 9 (aminoácidos 180-186), y cadena 10 (aminoácidos 213-220). Además, los restos de cisteína en los restos 87, 90, y 98 pueden ser importantes en la formación de enlaces disulfuro putativos o el mantenimiento de la conformación 3-D local.

La toxina SPE-A tipo silvestre tiene varias actividades biológicas. Estas actividades biológicas incluyen: 1) fiebre; 2) STSS; 3) letalidad sistémica debido al desarrollo de STSS o potenciamiento del choque por endotoxina; 4) potenciación del choque por endotoxina; 5) inducción de la filtración capilar e hipotensión; 6) inducción de la liberación de citoquinas tales como IFN-\gamma, IL-1, TNF-\alpha y TNF-\beta; 7) unión a células del endotelio aórtico porcino; 8) unión a moléculas MHC de clase II; 9) unión a receptores de células T; y 10) mitogenicidad de células T (superantigenicidad). Estas actividades pueden ensayarse y caracterizarse por procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica.

Como se usa en este documento, la definición de una toxina SPE-A tipo silvestre incluye variantes de una toxina SPE-A tipo silvestre que tiene la misma actividad biológica de la toxina SPE-A tipo silvestre. Estas toxinas SPE-A pueden tener un aminoácido diferente o sus genes pueden tener una secuencia de nucleótidos diferente de la mostrada en la Figura 3, pero no tienen actividades biológicas diferentes. Los cambios en la secuencia de aminoácidos son fenotípicamente silenciosos. Preferiblemente, estas moléculas de toxina tienen letalidad sistémica y potencian el choque por endotoxina en el mismo grado que la toxina SPE-A tipo silvestre mostrada en la Figura 3. Preferiblemente, estas toxinas tienen al menos un 60-99% de homología con la secuencia de aminoácidos de toxina SPE-A tipo silvestre como se muestra en la Figura 3 determinada usando el Algoritmo de Alineamiento SS2 descrito por Altschul, S. F., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986). Las proteínas que tienen estas características corresponden sustancialmente a una SPE-A tipo silvestre.

Una toxina SPE-A mutante es una toxina que tiene más de uno, pero no más de seis cambios en un aminoácido, como se describe en la reivindicación 1, en comparación con una proteína que corresponde sustancialmente a una toxina SPE-A tipo silvestre. El cambio puede ser una sustitución, deleción, o adición de aminoácido. Puede haber más de un cambio en la secuencia de aminoácidos, preferiblemente de 1 a 6 cambios. Se prefiere que haya más de un cambio en la secuencia de aminoácidos para minimizar la reversión de la toxina SPE-A mutante a la toxina SPE-A tipo silvestre que tiene letalidad o toxicidad sistémica. Para toxinas SPE-A mutantes útiles en vacunas, se prefiere que el cambio en la secuencia de aminoácidos de la toxina no de como resultado un cambio de la capacidad de la toxina para estimular una respuesta de anticuerpo que pueda neutralizar la toxina SPE-A tipo silvestre. Para toxinas SPE-A mutantes útiles en vacunas, se prefiere especialmente que las toxinas mutantes se reconozcan por anticuerpos neutralizantes policlonales frente a toxina SPE-A tal como de Toxin Technologies en Boca Raton, Fla. o Dr. Schlievert (University of Minnesota, Minneapolis, MN) y que el perfil proteolítico no esté alterado en comparación con SPE-A tipo silvestre.

Los cambios en la secuencia de aminoácidos pueden ser cambios específicos de sitio en uno o más restos de aminoácidos seleccionados de una toxina SPE-A tipo silvestre. Los cambios específicos de sitio se seleccionan identificando restos en dominios particulares de la molécula como se ha descrito previamente o en localizaciones donde se localizan restos de cisteína. Los cambios específicos de sitio en una posición particular también pueden seleccionarse opcionalmente determinando si un aminoácido en una posición o en un dominio es idéntico a o tiene propiedades similares a un resto equivalente en otras moléculas homólogas por comparación de homología de secuencia primaria o conformación 3-D. Las moléculas homólogas son conocidas por los especialistas en la técnica. Una molécula homóloga es una que puede identificarse por comparación de homología de secuencia primaria usando el algoritmo de alineamiento SS2 de Altschul y col., citado supra o un programa de modelado de homología tal como Insight/Homology de BioSym, San Diego, CA. Una molécula homóloga es una que presenta una cantidad significativa, típicamente del 30-99%, de aminoácidos cambiados idénticos o de manera conservativa o tiene una estructura tridimensional similar, típicamente un error RMS para regiones conservadas de <2 Angstroms, en comparación con una toxina SPE-A tipo silvestre.

Los cambios en la secuencia de aminoácidos en un sitio particular pueden hacerse aleatoriamente o pueden seleccionarse cambios específicos. Una vez se selecciona un sitio específico se menciona por su denominación numérica de aminoácido y por el aminoácido encontrado en ese sitio en la SPE-A tipo silvestre como se muestra en la Figura 3. Las denominaciones numéricas de aminoácido hechas en esta solicitud son por referencia a la secuencia en la Figura 3 con la glutamina en la posición 31 contándose como el primer aminoácido. Los aminoácidos equivalentes que corresponden a los identificados en un sitio particular en proteínas que corresponden sustancialmente a una toxina SPE-A tipo silvestre pueden tener numeraciones de aminoácidos diferentes dependiendo de la secuencia de referencia. Los restos equivalentes también son los encontrados en moléculas homólogas que pueden identificarse como equivalentes a aminoácidos en proteínas que corresponden sustancialmente a una toxina SPE-A tipo silvestre por comparación de la estructura de aminoácidos primaria o por comparación con una estructura modelada como se muestra en la Figura 1 o por comparación con una estructura cristalina conocida de una molécula homóloga. Se pretende que la invención cubra cambios de aminoácidos equivalentes en la misma posición o similares independientemente de su denominación numérica de aminoácido.

Si se selecciona una sustitución específica para un aminoácido en un sitio específico, el aminoácido a sustituir en esa posición se selecciona para incluir un cambio estructural que pueda afectar a la actividad biológica comparada con el aminoácido en la posición en la SPE-A tipo silvestre. La sustitución puede ser conservativa o no conservativa. Las sustituciones que dan como resultado un cambio estructural que puede afectar a la actividad biológica incluyen: 1) cambio de un tipo de carga a otro; 2) cambio de carga a no cargado; 3) cambio en los restos de cisteína y formación de enlaces disulfuro. 4) cambio de restos hidrófobo a hidrófilo o hidrófilo a hidrófobo; 5) cambio en el tamaño de los aminoácidos; 6) cambio a un aminoácido conformacionalmente restrictivo o análogo; y 7) cambio a un aminoácido de origen no natural o análogo. La sustitución específica seleccionada también puede depender de la posición del sitio seleccionado. Por ejemplo, se prefiere que los aminoácidos en la alfa hélice N-terminal tengan grupos hidroxilo para interaccionar con nitrógenos de amida expuestos o que estén cargados negativamente para interaccionar con la carga positiva parcial presente en el N-terminal de la alfa hélice.

Las toxinas mutantes también pueden incluir mutaciones aleatorias dirigidas a un sitio o sitios específicos. Una vez se selecciona un sitio, los mutantes pueden generarse teniendo cada uno de los otros 19 aminoácidos sustituidos en el sitio usando procedimientos tales como los descritos por Aiyar y col., Biotechniques 14:366 (1993) u Ho y col. Gene 77:51-54 (1984). También puede utilizarse mutagénesis in vitro para sustituir cada uno de los otros 19 aminoácidos o aminoácidos de origen no natural o análogos en una posición particular usando un procedimiento tal como el descrito por Anthony-Cahill y col., Trends Biochem. Sci. 14:400 (1989).

Las toxinas mutantes también incluyen toxinas que tienen más de uno, pero no más de seis cambios en los sitios de la molécula, como se describe en la reivindicación 1. En ciertos restos el cambio en el aminoácido no se selecciona específicamente pero puede ser uno cualquiera de los otros 19 aminoácidos o un aminoácido de origen no natural.

Las sustituciones en un sitio específico pueden incluir, aunque sin limitación, sustituciones con aminoácidos de origen no natural tales como 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, homocisteína, ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminopimílico, ornitina, homoarginina, N-metillisina, dimetillisina, trimetillisina, ácido 2,3-diaminopropiónico, ácido 2,4-diaminobutírico, hidroxilisina, fenilalanina sustituida, norleucina, norvalina, \gamma-valina y tirosinas halogenadas. Las sustituciones en un sitio específico también pueden incluir el uso de análogos que usan química no peptídica incluyendo, aunque sin limitación, éster, éter y fosforilo y enlaces de boro.

Las toxinas mutantes pueden generarse usando una diversidad de procedimientos. Estos procedimientos incluyen mutagénesis específica de sitio, procedimientos de mutagénesis que usan química tal como EMS, o bisulfito sódico o irradiación UV, por mutación espontánea, por mutagénesis in vitro y síntesis química. Los procedimientos de mutagénesis pueden encontrarse en Sambrook y col., A Guide to Molecular Cloning, Cold Spring Harvard, Nueva York (1989). El procedimiento especialmente preferido para mutagénesis específica de sitio es usando PCR asimétrica con tres cebadores como se describe por Perrin y Gilliland, 1990. Nucleic Acid Res. 18:7433.

Una vez se genera una toxina SPE-A mutante que tiene más de uno, pero no más de seis cambios de aminoácidos, como se describe en la reivindicación 1, en comparación con una proteína que corresponde sustancialmente a la toxina SPE-A tipo silvestre, la toxina SPE-A mutante se explora para su no letalidad. Se prefiere que las toxinas SPE-A mutantes seleccionadas de esta exploración sean sustancialmente no letales en conejos cuando se administran usando una bomba miniosmótica (como se describe en el Ejemplo 2) en la misma dosis o en una dosis superior que una toxina SPE-A tipo silvestre. Una toxina SPE-A mutante es sustancialmente no letal si cuando se administra a un conejo en la misma dosis que la toxina tipo silvestre mueren menos del 10-20% de los conejos. Las toxinas mutantes no letales son útiles en composiciones de vacuna y farmacéuticas. Aunque no pretende limitar la invención, se cree que algunos restos de aminoácidos o dominios que afectan a la letalidad sistémica son separables de otras actividades biológicas, especialmente mitogenicidad de células T.

Para toxinas mutantes útiles en composición de vacuna también se prefiere que las toxinas SPE-A mutantes se exploren para las que pueden estimular una respuesta de anticuerpo que neutraliza la actividad de la toxina SPE-A tipo silvestre. Un procedimiento para seleccionar toxinas mutantes que pueden estimular una respuesta de anticuerpo que neutralice la actividad de la toxina SPE-A tipo silvestre es para determinar si la toxina mutante inmunorreacciona con anticuerpos neutralizantes policlonales frente a SPE-A tipo silvestre tal como de Toxin Technologies, Boca Raton, Fla. o Dr. Schlievert. Los procedimientos para determinar si las toxinas SPE-A mutantes inmunorreaccionan con anticuerpos frente a toxina SPE-A tipo silvestre incluyen ELISA, transferencia de Western, Ensayo de Inmunodifusión Doble y similares.

Opcionalmente, las toxinas mutantes también pueden explorarse para determinar si el perfil proteolítico de la toxina mutante es el mismo que el de la toxina SPE-A tipo silvestre. En algunos casos, se prefiere que los mutantes generados no cambien sustancialmente la conformación tridimensional global de la toxina mutante en comparación con la toxina SPE-A tipo silvestre. Un modo de examinar si ha habido un cambio en la conformación global es estudiar la inmunorreactividad de anticuerpos frente a toxina SPE-A tipo silvestre y/o examinar el perfil proteolítico de las toxinas SPE-A mutantes. El perfil proteolítico puede determinarse usando enzimas tales como tripsina, quimiotripsina, papaína, pepsina, subtilisina y proteasa V8 en procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica. Se conoce el perfil proteolítico de SPE-A tipo silvestre con la secuencia mostrada en la Figura 3. Se seleccionan los mutantes que tienen un perfil similar al de SPE-A tipo silvestre.

Opcionalmente, las toxinas mutantes también pueden explorarse y seleccionarse para que tengan otros cambios en la actividad biológica. Como se ha descrito previamente, hay varias actividades biológicas asociadas con la toxina SPE-A tipo silvestre. Esas actividades biológicas incluyen: 1) fiebre; 2) STSS; 4) potenciamiento del choque por endotoxina; 5) filtración capilar e hipotensión; 6) inducción de liberación de citoquinas tales como IFN gamma, IL-1, TNF-\alpha y TNF-\beta; 7) unión a células del endoteliales; 8) unión a moléculas MHC de clase II; 9) unión a receptores de células T; y 10) mitogenicidad de células T (superantigenicidad). Estas actividades biológicas pueden medirse usando procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica.

Para toxinas SPE-A mutantes útiles en composiciones de vacuna, se prefiere que sean sustancialmente no tóxicas e inmunorreactivas con anticuerpos neutralizantes frente a SPE-A tipo silvestre. Los anticuerpos neutralizantes incluyen los que inhiben la letalidad de la toxina tipo silvestre cuando se ensaya en animales. Opcionalmente, las toxinas SPE-A mutantes pueden tener un cambio en una o más actividades biológicas distintas de la toxina SPE-A tipo silvestre como se ha descrito previamente.

Opcionalmente, las toxinas mutantes preferidas para composiciones de vacuna se exploran adicionalmente y se seleccionan para la ausencia de potenciación de choque por endotoxina. El ensayo preferido para examinar una carencia de potenciamiento de choque por endotoxina se describe en el Ejemplo 4. Los conejos preferiblemente no tienen infección bacteriana o viral demostrable antes del ensayo. Una carencia de potenciación o sustancialmente no potenciamiento de choque por endotoxina se ve cuando menos de aproximadamente el 25% de los animales desarrolla choque cuando la toxina SPE-A mutante se coadministra con endotoxina en comparación con la actividad de SPE-A tipo silvestre a la misma dosis. Más preferiblemente, ninguno de los animales desarrolla choque.

Opcionalmente, los mutantes preferidos para composiciones de vacuna también se exploran adicionalmente y se seleccionan para un cambio en la mitogenicidad de células T. Un cambio en la mitogenicidad de células T puede detectarse midiendo la proliferación de células T en un ensayo convencional de ^{3}H timidina usando linfocitos de conejo como se describe en el Ejemplo 4, midiendo los niveles de producción de citoquinas tales como IFN gamma o TNF-\beta; determinando el tipo V\beta de la respuesta de células T o determinando la interacción de las moléculas con receptores MHC de clase II. El procedimiento preferido para detectar una disminución en la mitogenicidad de células T es para medir la proliferación de células T de linfocitos de conejo en presencia y ausencia de la toxina mutante. Las respuestas de las células T frente a la toxina SPE-A tipo silvestre se potencia enormemente por encima de una respuesta in vitro normal frente a un antígeno. Se ve una disminución sustancial en la mitogenicidad células T cuando la toxina SPE-A mutante no estimula una respuesta proliferativa de células T mayor de la estimulación con un antígeno o control negativo. Preferiblemente, se ve una disminución de modo que la respuesta de proliferación de células T frente a la toxina SPE-A mutante no es de más de dos veces sobre la de fondo cuando se mide usando linfocitos de conejo en la misma dosis que la toxina SPE-A tipo silvestre.

Opcionalmente, las toxinas SPE-A mutantes útiles en las composiciones de vacuna se exploran adicionalmente y se seleccionan para una disminución en la filtración capilar en células endoteliales. El procedimiento preferido es usando células del endotelio aórtico porcino como se describe por Lee y col., J. Infect. Dis. 164:711 (1991). Puede determinarse una disminución en la filtración capilar en presencia de las toxinas SPE-A mutantes midiendo una disminución en la liberación de un compuesto marcado de manera radiactiva o por un cambio en el transporte de un compuesto marcado de manera radiactiva. Se ve una disminución en la filtración capilar cuando la liberación o transporte de un compuesto marcado de manera radiactiva se disminuye a menos de aproximadamente dos veces sobre los de fondo cuando se compara con la actividad de una toxina tipo silvestre.

Las toxinas SPE-A mutantes especialmente preferidas útiles en composiciones de vacuna no son biológicamente activas en comparación con proteínas que tienen la actividad de la toxina SPE-A tipo silvestre. Por no biológicamente activo, se entiende que la toxina mutante tiene pequeña letalidad o letalidad no sistémica, tiene poco o no tiene potenciamiento de choque por endotoxina y poca mitogenicidad o no tiene mitogenicidad de células T. Preferiblemente, las toxinas SPE-A mutantes seleccionadas para composiciones de vacuna carecen sustancialmente de estas actividades biológicas, es decir, reaccionan como un control negativo o estimulan una reacción de no más de dos veces sobre la de fondo.

Los cambios en otras actividades biológicas pueden detectarse del siguiente modo. La unión a moléculas MHC de clase II puede detectarse usando los procedimientos descritos por Jardetzky, Nature 368:711 (1994). Los cambios en la fiebre pueden detectarse controlando las temperaturas durante un tiempo después de la administración de las toxinas SPE-A mutantes. Los cambios en los niveles de producción de citoquina en presencia de toxinas SPE-A mutantes puede medirse usando procedimientos tales como los disponibles en el mercado y que se describen por protocolos habituales en inmunología. (Ed. Coligan, Kruisbeck, Margulies, Shevach, and Stroker. National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc.).

Se describen los ejemplos específicos de toxinas SPE-A mutantes que tienen al menos un cambio de aminoácido y que son sustancialmente no tóxicos.

Los ejemplos de mutantes para composiciones de vacuna son toxinas SPE-A mutantes que inmunorreaccionan con anticuerpos neutralizantes policlonales frente a la toxina SPE-A tipo silvestre, son no tóxicos, y opcionalmente tienen una disminución en la potenciación de choque por endotoxina y una disminución en la mitogenicidad de células T. Un grupo de mutantes tiene un cambio en la asparagina del aminoácido 20 tal como el mutante N20D que tiene una asparagina sustituida por ácido aspártico en el resto 20 en la toxina madura (N20D). El mutante N20D se ha mostrado que es no tóxico, que no tiene potenciamiento de choque por endotoxina y una disminución de 5 veces en la mitogenicidad de células T. Además, cambios en el aminoácido 98 que dan como resultado una carencia de un grupo cisteína en esa posición también da como resultado una toxina mutante que tiene una disminución en el potenciamiento de choque por endotoxina y una disminución de cuatro veces en la mitogenicidad. Los mutantes especialmente preferidos en esta posición tienen una cisteína sustituida por una serina (C98S).

Los mutantes preferidos para la estimulación de proliferación de células T y en el tratamiento de cáncer son las toxinas mutantes que son sustancialmente no letales. Se prefiere que estas toxinas mutantes mantengan la mitogenicidad de células T al menos al nivel de la toxina SPE-A tipo silvestre. Los mutantes especialmente preferidos tienen un cambio de aminoácido en el resto 157 de la SPE-A tipo silvestre tal como una sustitución de lisina por ácido glutámico en ese resto (K157E). El mutante K157E se ha mostrado que es no letal pero mantiene la mitogenicidad en comparación con la toxina SPE-A tipo silvestre.

Los mutantes pueden generarse para que afecten a un cambio funcional cambiando aminoácidos en un dominio particular de una molécula del siguiente modo. Se muestra un modelo molecular de la toxina SPE-A tipo silvestre en la Figura 1. Los dominios especialmente preferidos incluyen la \alpha-hélice 3 N- terminal (aminoácidos 18-26), la \alpha-hélice 5 central (aminoácidos 142- 158), las cadenas beta del Dominio B (aminoácidos 30-36; 44-52; 55-62; 75-83; y 95-106), y las cadenas beta del Dominio A (aminoácidos 117-126; 129-135; 169-175; 180- 186; y 213-220). Los restos de cisteína en las posiciones 87, 90 y 98 también pueden ser importantes.

Aunque no se pretende limitar la invención, se cree que estos dominios forman conformaciones 3-D específicas que son importantes en las funciones biológicas de la actividad de SPE-A tipo silvestre. Como se puede ver en la Figura 2, la \alpha-hélice N-terminal y la \alpha-hélice central están situadas muy cerca de modo que los restos aquí pueden ser especialmente importantes en la toxicidad de moléculas SPE-A tipo silvestre. Además, los aminoácidos en las cadenas B contiguas que están en cercana proximidad a la \alpha-hélice central también pueden ser importantes en la toxicidad. Los modelos moleculares como se muestran en las Figuras 1 y 2 ayudan a identificar los restos superficiales y los restos interiores de los dominios estructurales.

Para las composiciones de vacuna, los cambios se hacen preferiblemente a los restos en la alfa hélice 3 N-terminal (restos 18-26), se exploran y se seleccionan para la disminución de la letalidad sistémica o potenciamiento de endotoxina o mitogenicidad de células T o las tres.

Un ejemplo específico de un cambio en la alfa hélice 3 N-terminal es un cambio en el aminoácido en el resto 20. Un cambio en este resto de asparagina a ácido aspártico da como resultado una disminución en el potenciamiento de choque por endotoxina, una disminución en la letalidad sistémica, y una disminución de cinco veces en la mitogenicidad. Otros cambios en el resto 20 son preferiblemente los que cambian la distribución de carga en los restos superficiales o los que cambian la interacción de la \alpha-hélice N-terminal con la \alpha-hélice central. Las sustituciones en el aminoácido 20 con aminoácidos cargados tales como ácido glutámico, lisina, arginina probablemente tienen el mismo efecto. Los cambios hechos en esta región son preferiblemente los que disminuyen la letalidad sistémica debida a STSS.

Preferiblemente, los cambios también se hacen en la \alpha-hélice 5 central, restos 142-158. Los mutantes en esta región que tienen al menos un cambio de aminoácido se seleccionan preferiblemente para una disminución de la letalidad sistémica debida a STSS. Se ha mostrado que una \alpha-hélice central similar identificada en otras moléculas de toxina están asociadas con toxicidad. Un ejemplo específico es un cambio en el resto 157. El cambio en este resto de lisina a ácido glutámico da como resultado una disminución en el potenciamiento de choque por endotoxina y la letalidad sistémica debida a STSS.

Sin embargo, la mitogenicidad de células T no se ve afectada por un cambio en este resto. Estos resultados muestran que la toxicidad y el potenciamiento de choque por endotoxina son actividades separables de la mitogenicidad de células T. Para composiciones de vacuna, se exploran opcionalmente otras toxinas mutantes con cambios en este dominio y se seleccionan para una disminución en la mitogenicidad de células T. Un cambio en el tipo de carga presente en el aminoácido 157 indica que una sustitución de lisina por ácido aspártico probablemente tenga un efecto similar.

Los cambios preferiblemente en las cadenas beta del Dominio B que incluyen los restos 30-36 (cadena beta 1), restos 44-52 (cadena beta 2), restos 55-62 (cadena beta 3), restos 75-83 (cadena beta 4), y restos 95-106 (cadena beta 5) (dominio 5) se exploran y se seleccionan para la no letalidad, y opcionalmente para una disminución en el potenciamiento de choque por endotoxina y/o mitogenicidad de células T. Los restos múltiples que forman el barril N-terminal de lámina beta en varias toxinas tales como SEB, SEA, TSST-1, se ha mostrado que son importantes para la unión a moléculas NHC de clase II. Una disminución en la unión a MHC de clase II por toxinas mutantes también puede seleccionarse usando ensayos tales como los descritos por Jardetzky y col., citado supra. Se seleccionan los cambios de estos restos que podrían interrumpir la conformación de lámina beta o cambiar los restos de contacto con las moléculas MHC de clase II, especialmente los de la superficie cóncava del barril beta. Véase Figura 1. Para composiciones de vacuna, se prefiere que los cambios que pueden cambiar la conformación local no cambien la inmunorreactividad de las toxinas mutantes con anticuerpos neutralizantes policlonales frente a la toxina SPE-A tipo silvestre.

Los cambios preferiblemente de las cadenas beta del Dominio A, que incluyen los restos 117-126 (cadena 6 de dominio beta), restos 129-135 (dominio 7), restos 169-175 (dominio 8), restos 180-186 (dominio 9), y restos 213-220 (dominio 10), se seleccionan para que sean no letales, tengan una disminución en el choque por endotoxina, y/o tengan una disminución en la mitogenicidad de células T. Se seleccionan preferiblemente cambios que podrían alterar la conformación de lámina beta sin cambiar la inmunorreactividad de la toxina SPE-A mutante con anticuerpos neutralizantes policlonales frente a la toxina SPE-A tipo silvestre.

Las toxinas SPE-A mutantes con cambios en los restos de cisteína o introducción de enlaces disulfuro pueden seleccionarse para que tengan una disminución en la letalidad, u opcionalmente una disminución en el potenciamiento de choque por endotoxina, y/o una disminución en la mitogenicidad de células T. Un ejemplo específico es un cambio en la cisteína del resto 98. Un cambio en este resto de cisteína a serina da como resultado una toxina mutante con una disminución en la mitogenicidad de aproximadamente cuatro veces y una disminución en el potenciamiento de choque por endotoxina y una disminución de la letalidad debida a STSS. Los cambios que eliminan el grupo cisteína en el resto 98 pueden provocar la actividad biológica de una manera similar que la sustitución con serina. Otros cambios que podrían hacerse en el resto 98 incluyen la sustitución de los otros restos alifáticos pequeños tales como alanina, glicina o treonina. Los cambios de otros restos de cisteína en los restos de aminoácido 90 y 97 dan como resultado una disminución en la mitogenicidad.

Ventajosamente, pueden generarse toxinas SPE-A mutantes útiles en procedimientos de tratamiento que tienen más de un cambio en la secuencia de aminoácidos. Podría ser deseable tener cambios en más de una posición para minimizar cualquier oportunidad de reversión a una molécula que tenga toxicidad o letalidad. Para composiciones de vacuna, es deseable que una toxina mutante con cambios múltiples pueda aún generar una respuesta inmune de protección frente a SPE-A tipo silvestre y/o inmunorreaccionar con anticuerpos policlonales neutralizantes frente a SPE-A tipo silvestre. Para composiciones farmacéuticas, se prefiere que los mutantes con cambios múltiples sean sustancialmente no letales mientras que conserven la mitogenicidad para células T. Es especialmente preferible tener de 2 a 6 cambios. Los ejemplos de dichos mutantes incluyen aquellos con la mutación N20D que incluyen mutantes dobles tales como N20D/K157E, N20D/C98S, mutantes triples, y similares.

Los mutantes dobles de SPE-A pueden ofrecer ventajas sobre los mutantes simples. Esto se evaluó en tres experimentos detallados en el Ejemplo 6. Los resultados se proporcionan en las Figuras 7-9. Los datos indicaron que el mutante N20D/C98S tiene menos toxicidad que el mutante N20D simple y que el doble mutante N20D/K157E fue intermedio entre las otras dos proteínas. Los tres mutantes fueron significativamente menos tóxicos que SPE-A tipo silvestre. El suero de conejos inmunizados con los mutantes simples y dobles inhibieron la proliferación de linfocitos en respuesta a toxina SPE-A no mutada. La proliferación de linfocitos está asociada con y es necesaria para la toxicidad completa de la toxina.

Los animales se inmunizaron frente a N20D, N20D/C98S, o N20D/K157E, como se describe en el Ejemplo 7. Los resultados se proporcionan en la Tabla 9. Los animales inmunizados con cada mutante doble se protegieron completamente de fiebre y susceptibilidad potenciada a choque por endotoxina.

Los mutantes triples también se contemplan en esta solicitud y en una realización, se ensaya el mutante SPE-A N20D/C98S/D45N, usando los procedimientos y ensayos de los Ejemplos 1-7 y los cebadores descritos en este documento.

También puede ser preferible delecionar restos en sitios específicos tales como deleción de la asparagina del resto del aminoácido 20 y/o deleción de la lisina del aminoácido 157 o cisteína 98. Para composiciones de vacuna, podrían seleccionarse mutantes con deleciones que inmunorreaccionan con anticuerpos neutralizantes policlonales frente a toxina SPE-A tipo silvestre y/o puedan estimular una respuesta inmune de protección frente a la actividad de SPE-A tipo silvestre.

Las toxinas mutantes de SPE-A son útiles para formar composiciones de vacuna. Los mutantes preferidos para composiciones de vacuna tienen al menos un cambio de aminoácido, son sistémicamente no tóxicos, e inmunorreaccionan con anticuerpos neutralizantes policlonales frente a SPE-A tipo silvestre. Los mutantes especialmente preferidos incluyen las toxinas SPE-A mutantes con un cambio en el aminoácido 20 tal como N20D/K157E, N20D/C98S, y mutantes con una deleción en la asparagina del resto 20.

Las toxinas mutantes se combinan con un vehículo fisiológicamente aceptable. Los diluyentes fisiológicamente aceptables incluyen soluciones salinas fisiológicas, y soluciones salinas tamponadas a pH neutro tal como solución salina tamponada con fosfato. Otros tipos de vehículos fisiológicos incluyen liposomas o polímeros y similares. Opcionalmente, la toxina mutante puede combinarse con un adyuvante tal como el adyuvante incompleto de Freund, el adyuvante completo de Freund, alumbre, monofosforil lípido A, fosfato o hidróxido de alumbre, QS-21 y similares. Opcionalmente, las toxinas mutantes o fragmentos de las mismas pueden combinarse con inmunomoduladores tales como interleuquinas, interferones y similares. Muchas formulaciones de vacuna son conocidas por los especialistas en la técnica.

La toxina SPE-A mutante se añade a una formulación de vacuna en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmune de protección en un animal frente a al menos una actividad biológica de la toxina SPE-A tipo silvestre. La generación de una respuesta inmune de protección puede medirse por el desarrollo de anticuerpos, preferiblemente anticuerpos que neutralizan la toxina SPE-A tipo silvestre. La neutralización de la toxina SPE-A tipo silvestre puede medirse incluyendo por inhibición de letalidad debida a SPE-A tipo silvestre en animales. Además, puede detectarse una respuesta inmune de protección midiendo una disminución en al menos una actividad biológica de las toxinas SPE-A tipo silvestre tales como mejora o eliminación de los síntomas de potenciamiento de choque por endotoxina o STSS. Las cantidades de la toxina mutante que pueden formar una respuesta inmune de protección son aproximadamente 0,1 \mug a 100 mg por kg peso corporal, más preferiblemente aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 100 \mug/kg de peso corporal. Aproximadamente 25 \mug/kg de peso corporal de la toxina SPE-A tipo silvestre es eficaz para inducir inmunidad de protección en conejos.

Las composiciones de vacuna se administran a animales tales como conejos, roedores, caballos, y humanos. El animal preferido es un humano.

Las toxinas SPE-A mutantes también son útiles para formar composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas son útiles en situaciones terapéuticas donde puede ser deseable una estimulación de proliferación de células T, tal como en el tratamiento de cáncer. Las toxinas SPE-A mutantes preferidas son las que son no letales mientras que conservan la mitogenicidad de células T en comparación con la toxina SPE-A tipo silvestre. Los mutantes preferidos son los que tienen un cambio en la lisina del resto 157 de las toxinas SPE-A tipo silvestre tal como K157E.

Una composición farmacéutica se forma combinando una toxina SPE-A mutante con un vehículo fisiológicamente aceptable tal como solución salina fisiológica, soluciones salinas tamponadas a pH neutro tal como solución salina tamponada con fosfato. La toxina SPE-A mutante se combina en una cantidad eficaz para estimular la proliferación de células T en comparación con la toxina SPE-A tipo silvestre a la misma dosis. Puede medirse un potenciamiento de la sensibilidad de células T usando ensayos convencionales de ^{3}H timidina con linfocitos de conejo así como midiendo las poblaciones de células T in vivo usando clasificadores de células T activadas fluorescentes o un ensayo tal como ELISPOT. También una cantidad eficaz puede ser una cantidad eficaz para mejorar o disminuir el crecimiento de células de cáncer. Esto puede determinarse midiendo el efecto de la toxina SPE-A mutante en el crecimiento de células de cáncer in vivo o midiendo la estimulación de células T específicas de cáncer. El intervalo de cantidades eficaces es 100 ng a 100 mg por kg de peso corporal, más preferiblemente 1 \mug a 1 mg/kg de peso corporal. Aproximadamente 10^{-6} \mug de toxina SPE-A tipo silvestre puede estimular una sensibilidad de células T potenciada. Por ejemplo, estas toxinas SPE-A mutantes podrían usarse solas o junto con terapia de interleuquinas o interferón.

B. Procedimientos para Usar Toxinas SPE-A Mutantes, Composiciones de Vacuna o Composiciones Farmacéuticas

Las toxinas SPE-A mutantes son útiles en procedimientos para proteger animales frente a los efectos de toxinas SPE-A tipo silvestre, mejorar o tratar animales con STSS, inducir la proliferación de células T potenciada y su sensibilidad, y tratar o mejorar los síntomas de cáncer.

Un procedimiento para proteger animales frente a al menos una actividad biológica de la toxina SPE-A tipo silvestre implica la etapa de administrar una composición de vacuna a un animal para establecer una respuesta inmune de protección frente a al menos una actividad biológica de la toxina SPE-A. Se prefiere que la respuesta inmune de protección sea neutralizante y proteja frente a letalidad o síntomas de STSS. La composición de vacuna preferiblemente incluye una toxina SPE-A mutante que tiene más de uno, pero no más de seis cambios de aminoácido, como se describe en la reivindicación 1, que inmunorreacciona con anticuerpos neutralizantes policlonales frente a SPE-A tipo silvestre, y es no letal. El mutante especialmente preferido tiene un cambio en la asparagina del resto de aminoácido 20 tal como N20D/K157E o N20D/C98S.

La composición de vacuna puede administrarse a un animal en una diversidad de medios incluyendo por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, oral, intranasal, ocular, intraperitoneal y similares. La vía preferida de administración es intramuscular.

Las composiciones de vacuna pueden administrarse a una diversidad de animales incluyendo conejos, roedores, caballos y humanos. El animal preferido es un humano.

La composición de vacuna puede administrarse en una dosis única o múltiple hasta que se establezca una inmunidad de protección frente a al menos una actividad biológica de SPE-A tipo silvestre. La inmunidad de protección puede detectarse midiendo la presencia de anticuerpos neutralizantes frente a SPE-A tipo silvestre usando procedimientos convencionales. Se administra una cantidad eficaz para establecer inmunidad de protección sin causar toxicidad sustancial.

Una toxina SPE-A mutante también es útil para generar anticuerpos neutralizantes que inmunorreaccionan con la toxina SPE-A mutante y la toxina SPE-A tipo silvestre. Estos anticuerpos podrían usarse como suero inmune pasivo para tratar o mejorar los síntomas en los pacientes que tienen los síntomas de STSS. Una composición de vacuna como se ha descrito anteriormente podría administrarse a un animal tal como un caballo o un humano hasta que se genere una respuesta de anticuerpo neutralizante frente SPE-A tipo silvestre. Estos anticuerpos neutralizantes después pueden recogerse, purificarse, y utilizarse para tratar pacientes que muestran síntomas de STSS. Los anticuerpos neutralizantes frente a la toxina SPE-A tipo silvestre también pueden formarse usando SPE-A tipo silvestre. Sin embargo, SPE-A tipo silvestre debe administrarse a una dosis muy inferior de la que induce toxicidad tal como 1/50 a 1/100 del LD_{50} de SPE-A tipo silvestre en conejos.

Los anticuerpos neutralizantes se administran a pacientes que muestran síntomas de STSS tal como fiebre, hipotensión, infección por estreptococos del grupo A, miositis, fascitis, y daño del hígado en una cantidad eficaz para neutralizar el efecto de la toxina SPE-A. Los anticuerpos neutralizantes pueden administrarse por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea, y similares. La vía preferida es intravenosa o para una infección localizada, por vía tópica en el sitio del daño tisular con desbridamiento. También se prefiere que el anticuerpo neutralizante se administre junto con terapia de antibióticos. El anticuerpo neutralizante puede administrarse hasta que se obtenga una disminución en el choque o daño tisular en una dosis única o múltiple. La cantidad preferida de anticuerpos neutralizantes típicamente administrada es aproximadamente 1 mg a 1000 mg/kg, más preferiblemente aproximadamente 50-200 mg/kg de peso corporal.

Las toxinas SPE-A mutantes también son útiles en composiciones farmacéuticas para la estimulación de proliferación de células T, especialmente en el tratamiento de cáncer. Es especialmente preferido que estas composiciones farmacéuticas se usen en lugar o junto con terapias habituales para cáncer usando interleuquinas, interferones o factores de necrosis tumoral. Las toxinas SPE-A mutantes también son útiles en el tratamiento de linfomas de células T, y cáncer de ovario y útero. Aunque no se pretende limitar la invención, se cree que las toxinas SPE-A mutantes pueden ser selectivamente tóxicas para células de linfoma T.

Las composiciones farmacéuticas incluyen una toxina SPE-A mutante que es no letal, mientras que conserve la mitogenicidad de células T. La toxina SPE-A mutante es una que tiene un cambio en la lisina del resto de aminoácido 157 tal como K157E.

La composición farmacéutica se administra a un paciente que tiene cáncer por una vía intravenosa, intramuscular, intradérmica, oral, intraperitoneal, y subcutánea, y similares. La vía preferida es intravenosa. La composición farmacéutica puede administrarse en una dosis única o dosis múltiples. La composición farmacéutica se administra en una cantidad que es eficaz para estimular la respuesta proliferativa de células T potenciada y/o para disminuir el crecimiento del cáncer sin toxicidad sustancial. La cantidad preferida varía de 100 ng a 100 mg/kg, más preferiblemente 1 \mug a 1 mg/kg. Es especialmente preferido que las composiciones farmacéuticas de SPE-A mutante se administren junto con o en lugar de terapias que usan interferones, interleuquinas, o factores de necrosis tumoral.

C. Casetes de Expresión de ADN que Codifican Toxinas SPE-A Mutantes y Procedimientos para la Preparación de Dichos Casetes de Expresión de ADN

La invención también incluye secuencias de ADN útiles en la expresión de toxinas SPE-A mutantes. Un casete de expresión incluye una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante con más de uno, pero más de seis cambios de aminoácidos, como se describe en la reivindicación 1, y al menos un cambio en la función biológica en comparación con una proteína que corresponde sustancialmente a una toxina SPE-A tipo silvestre, como se describe en la reivindicación 1, unida de manera operativa a un promotor funcional en una célula huésped. Los casetes de expresión se incorporan en vectores de transformación y se producen las toxinas SPE-A mutantes en células transformadas. Las toxinas mutantes después pueden purificarse de las células huésped o sobrenadante de células huésped. Las células huésped transformadas también son útiles como composiciones de vacuna.

Las toxinas SPE-A mutantes también pueden formarse por exploración o selección de mutantes espontáneos de un modo similar al descrito para mutagénesis específica de sitio o aleatoria. Las toxinas SPE-A mutantes pueden generarse usando mutagénesis in vitro o semisintéticamente a partir de fragmentos producidos por cualquier procedimiento. Finalmente, las toxinas SPE-A mutantes pueden generarse usando síntesis química.

Secuencia de ADN que Codifica Toxinas SPE-A Mutantes

Puede formarse una secuencia de ADN mutante que codifica una toxina SPE-A mutante que tiene más de uno, pero no más de seis cambios en la secuencia de aminoácidos, como se describe en la reivindicación 1, por una diversidad de procedimientos dependiendo del tipo de cambio seleccionado. Una secuencia que codifica una proteína que corresponde sustancialmente a la toxina SPE-A tipo silvestre funciona como ADN molde usado para generar secuencias de ADN que codifican toxinas SPE-A mutantes. Una secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-A tipo silvestre se muestra en la Figura 3 y se ha depositado en un microorganismo con el número de acceso ATTC 69830.

Para hacer un cambio o cambios específicos en una posición o posiciones específicas se prefiere utilizar PCR de acuerdo con el procedimiento de Perrin y col., citado supra. Para marcar un cambio en una posición particular, se incluyen cebadores internos que incluyen los nucleótidos alterados que codifican el cambio de aminoácido en una mezcla que también incluye cebadores flanqueantes 5' y 3'. Un cebador flanqueante 5' es homólogo a o hibrida con una región de ADN cadena arriba del sitio de inicio de la traducción de la secuencia codificante de SPE-A tipo silvestre. Preferiblemente, la región flanqueante 5' está cadena arriba del promotor speA y la región reguladora. Por ejemplo, un cebador flanqueante 5' puede ser homólogo a o hibridar con una región 760 bases cadena arriba del sitio de inicio de la traducción como se muestra en la Figura 2. Un ejemplo de un cebador flanqueante 5' que incluye el promotor de SPE-A en la región reguladora cadena arriba tiene una secuencia de:

100

Un cebador flanqueante cadena abajo es homólogo a o hibrida con una región de ADN cadena abajo del codón de parada de la secuencia codificante de SPE-A tipo silvestre. Se prefiere que el cebador flanqueante cadena abajo proporcione señales de terminación de la trascripción y la traducción. Por ejemplo, un cebador flanqueante 3' puede hibridar o ser homólogo a una región 200 pares de bases cadena abajo del codón de parada para la secuencia codificante de SPE-A. Un ejemplo de un cebador flanqueante 3' tiene una secuencia:

101

Los cebadores flanqueantes cadena arriba y cadena abajo están presentes en cada reacción de PCR para asegurar que el producto de PCR incluya el promotor speA y la región reguladora cadena arriba y las señales de terminación de la trascripción y la traducción. Otros cebadores cadena arriba y cadena abajo pueden construirse fácilmente por un especialista en la técnica. Aunque se prefiere, no es absolutamente necesario que el promotor speA nativo y la región reguladora cadena arriba se incluyan en el producto de PCR.

Cada mutación en un sitio particular se genera usando un cebador interno que incluye una secuencia de ADN que codifica un cambio en un resto particular. Por ejemplo, pueden generarse sustituciones de aminoácido en un sitio específico usando los siguientes cebadores internos:

\vskip1.000000\baselineskip

102

Los nucleótidos subrayados indican cambios en la secuencia de nucleótidos del gen speA tipo silvestre como se muestra en la Figura 3.

Los cebadores internos pueden diseñarse para generar un cambio en una posición específica utilizando una secuencia de ADN que codifica toxinas SPE-A tipo silvestre tal como se muestra en la Figura 3. Los cebadores puede diseñarse para codificar una sustitución de aminoácido específica en una posición específica tal como se ha mostrado anteriormente. Los cebadores pueden diseñarse para dar como resultado una sustitución aleatoria en un sitio particular como se describe por Rennell y col., J. Mol. Biol. 22:67 (1991). Los cebadores pueden diseñarse de modo que den como resultado una deleción de un aminoácido en un sitio particular. Los cebadores también pueden diseñarse para añadir secuencia codificante para un aminoácido adicional en una posición particular.

Los cebadores son preferiblemente de aproximadamente 15 a 50 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de 15 a 30 nucleótidos de longitud. Los cebadores se preparan preferiblemente por síntesis automática. Los cebadores flanqueantes 5' y 3' preferiblemente hibridan con las secuencias de ADN flanqueantes que codifican la secuencia codificante de la toxina SPE-A tipo silvestre. Estos cebadores flanqueantes preferiblemente incluyen aproximadamente 10 nucleótidos que son 100% homólogos o complementarios con las secuencias de ADN flanqueantes. Los cebadores internos no son 100% complementarios a la secuencia de ADN que codifica los aminoácidos en su posición porque codifican un cambio en esa posición. Un cebador interno puede tener de 1 a 4 desapareamientos de la secuencia de SPE-A tipo silvestre en un cebador de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos de longitud. Tanto los cebadores flanqueantes como los cebadores internos también pueden incluir nucleótidos adicionales que codifican sitios de restricción y sitios de fijación, preferiblemente cerca del extremo del cebador. Las condiciones de hibridación pueden modificarse para tener en cuenta la cantidad de desapareamientos presentes en el cebador de acuerdo con los principios conocidos descritos por Sambrook y col. Molecular Cloning-A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
(1989).

Puede utilizarse más de un cebador interno si se desean cambios en más de un sitio. Por ejemplo, para generar un mutante que tiene un cambio en la asparagina del aminoácido 20 y un cambio en la lisina del aminoácido 157 pueden utilizarse los cebadores internos como se ha mostrado anteriormente en dos reacciones por separado como se describe en el Ejemplo 5. Se describe un procedimiento de PCR para generar cambios específicos de sitio en más de una posición en Aiyar y col. citado supra. Otro procedimiento se describe en el Ejemplo 5.

En un procedimiento, se genera una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante con un cambio en un sitio particular y después se usa como molde para generar una secuencia de ADN mutante con un cambio en un segundo sitio. En la primera ronda de PCR se usa un primer cebador interno para generar la secuencia de ADN mutante con el primer cambio. La secuencia de ADN con el primer cambio después se usa como ADN molde y se usa un segundo cebador interno que codifica un cambio en un sitio diferente para formar una secuencia de ADN que codifica una toxina mutante con cambios en secuencias de aminoácidos en dos posiciones. Los procedimientos de PCR pueden utilizarse para generar secuencias de ADN que codifican secuencias de aminoácidos con aproximadamente 2 a 6 cambios.

El procedimiento de PCR preferido es el descrito por Perrin y col. citado supra. Brevemente, las condiciones de reacción de PCR son: la PCR se realiza en una mezcla de reacción de 100 \mul que contiene Tris-HCl 10 mM (pH = 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, cada dNTP 200 \muM, 2 ng de ADN plasmídico molde, 100 pmoles de cebador flanqueante, 5 pmoles de cebador interno, y 2,5 unidades de Ampli Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer Cetus). En la segunda etapa de amplificación, la composición de la mezcla de reacción es como la anterior excepto para la moralidad igual (5 pmoles cada uno) del cebador flanqueante y el megacebador y el molde de arrastre. La PCR se realiza durante 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC X 1 minuto, hibridación a 37ºC o 44ºC X 2 minutos y elongación a 72ºC durante 3 minutos.

Los productos de PCR se aíslan y después se clonan en un vector lanzadera (tal como pMIN 164 construido por el procedimiento de Murray y col, J. Immunology 152:87 (1994) y disponible por Dr. Schlievert, University of Minnesota, Mpls, MN.). Este vector es una quimera del plásmido pBR328 de E. coli, que lleva resistencia a ampicilina y el plásmido pE194 de estafilococos que confiere resistencia a eritromicina. Las mezclas del plásmido ligado se exploran en E. coli para la producción de toxina usando anticuerpos neutralizantes policlonales frente a SPE-A tipo silvestre de Toxin Technologies, Boca Raton, Fla o de Dr. Schlievert. Las toxinas SPE-A mutantes se secuencian por el procedimiento de Hsiao y col., Nucleic Acid Res. 19:2787 (1991) para confirmar la presencia de la mutación deseada y ausencia de otras mutaciones.

Las secuencias de ADN específicas generadas de este modo incluyen una secuencia de ADN que codifica N20D mutante y tiene la misma secuencia codificante que la mostrada en la Figura 3 excepto en que una adenina en la posición 939 se cambia a un resto de guanina. Una secuencia de ADN que codifica el mutante C87S tiene la misma secuencia codificante de la Figura 3 excepto en que la timina en la posición 1.152 se cambia a adenina y timina en la posición 1.154 se cambia a citosina. Una secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-A mutante C98S tiene la misma secuencia codificante que la Figura 3 excepto en que la guanina en la posición 1.185 se cambia a citosina y la timina en la posición 1.186 se cambia a guanina. Una secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-A mutante C90S incluye una secuencia que tiene la misma secuencia codificante que la Figura 3 excepto en que la guanina en la posición 1.161 se cambia a una citosina. Una secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-A mutante K157E incluye una secuencia que es la misma que la secuencia codificante mostrada en la Figura 3, pero está cambiada en la posición 1.351 de adenina a guanina. Una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante S195A incluye una secuencia de ADN que tiene la misma secuencia codificante que la mostrada en la Figura 3 excepto en que la timina en la posición 1.464 es una guanina. Una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante K16N incluye una secuencia que es la misma que la que la mostrada en la Figura 3 excepto en que la adenina en la posición 941 se cambia a citosina.

Se entenderá por los especialistas en la técnica que debido a la degeneración del código genético varias secuencias de ADN pueden codificar los mismos cambios en aminoácidos. La invención incluye secuencias de ADN que tienen diferentes secuencias de nucleótidos pero que codifican el mismo cambio en la secuencia de aminoácidos.

Para mutagénesis aleatoria en un sitio particular se diseña una serie de cebadores que dan como resultado la sustitución de cada uno de los otros 19 aminoácidos o un aminoácido de origen no natural o análogo en un sitio particular. Se realiza PCR de un modo similar al descrito anteriormente o por el procedimiento descrito por Rennell y col., citado supra. Los productos de PCR se subclonan y después puede controlarse la producción de toxina por inmunorreactividad con anticuerpos neutralizantes policlonales frente a SPE-A tipo silvestre. La presencia de un cambio en la secuencia de aminoácidos puede verificarse por secuenciación de la secuencia de ADN que codifica la toxina SPE- A mutante. Preferiblemente, las toxinas mutantes se exploran y seleccionan para la no letalidad.

También pueden emplearse otros procedimientos de mutagénesis para generar mutaciones aleatorias en la secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-A tipo silvestre. Las mutaciones aleatorias o mutagénesis aleatoria como se usa en este contexto significa que las mutaciones no están en un sitio seleccionado y/o no son un cambio seleccionado. Puede mutagenizarse una célula huésped bacteriana que incluye una secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-A tipo silvestre, preferiblemente en pMIN 164, usando otros procedimientos convencionales tales como mutagénesis química, e irradiación UV. Los mutantes generados de este modo pueden explorarse para la producción de toxinas usando anticuerpos neutralizantes policlonales frente a SPE-A tipo silvestre. Sin embargo, es necesaria exploración adicional para identificar toxinas mutantes que tienen al menos un cambio en una actividad biológica, preferiblemente que son no letales. Los mutantes que surgen de manera espontánea también pueden explorarse para al menos un cambio en una actividad biológica de SPE-A tipo silvestre.

La mutagénesis aleatoria también puede realizarse usando mutagénesis in vitro como se describe por Anthony-Cahill y col., Trends Biochem. Sci. 14:400 (1989).

Además, las toxinas SPE-A mutantes pueden formarse usando síntesis química. Un procedimiento para sintetizar una proteína químicamente se describe en Wallace, FASEB J. 7:505 (1993). Pueden sintetizarse partes de la proteína y después unirse entre sí usando enzimas o condensación química directa. Usar síntesis química podría ser especialmente útil para permitir a un especialista en la técnica insertar aminoácidos que son de origen no natural en posiciones deseadas. Además, la síntesis química podría ser especialmente útil para hacer fragmentos de toxinas SPE-A
mutantes.

Las secuencias de ADN que codifican toxinas mutantes, específicas de sitio o aleatorias, también pueden explorarse para otros cambios en la actividad biológica de la toxina SPE-A tipo silvestre. Los procedimientos para explorar un cambio en al menos una actividad biológica se han descrito previamente. Una vez que las secuencias de ADN seleccionadas que codifican las toxinas SPE-A mutantes se seleccionan para al menos un cambio en la actividad biológica, se utilizan para formar un casete de expresión.

La formación de un casete de expresión implica combinar las secuencias de ADN que codifican la toxina SPE-A mutante con un promotor que proporciona la expresión de una toxina SPE-A mutante en una célula huésped. Para esas toxinas SPE-A mutantes producidas usando PCR como se describe en este documento, el promotor speA nativo está presente y proporciona la expresión en una célula huésped.

Opcionalmente, la secuencia de ADN puede combinarse con un promotor diferente para proporcionar la expresión en un tipo particular de célula huésped o para potenciar el nivel de expresión en una célula huésped. Preferiblemente, el promotor proporciona un nivel de expresión de la toxina SPE-A mutante de modo que puede detectarse con anticuerpos frente a SPE-A. Otros promotores que pueden utilizarse en células procariotas incluyen P_{LAC}, P_{TAC}, T7, y similares.

Una vez que la secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-A mutante se combina con un promotor apropiado para formar un casete de expresión, el casete de expresión se subclona en un vector de transformación apropiado. Los vectores de transformación apropiados incluyen al menos un gen marcador de selección y preferiblemente son vectores lanzadera que pueden amplificarse en E. coli y microorganismos gram positivos. Los ejemplos de vectores lanzadera apropiados incluyen pMIN 164, y pCE 104. Otros tipos de vectores incluyen vectores virales tales como el vector de baculovirus, SV40, poxvirus tales como vaccinia, adenovirus y citomegalovirus. El vector preferido es un vector pMIN 164, un vector lanzadera que puede amplificarse en E. coli y S. aureus.

Una vez se forma un vector de transformación que lleva un casete de expresión que codifica una toxina SPE-A mutante, se introduce en una célula huésped apropiada que proporciona la expresión de la toxina SPE-A mutante. Las células huésped apropiadas son células que proporcionan un nivel alto de expresión de la toxina mutante mientras que minimizan la posibilidad de contaminación con otras moléculas no deseables tales como endotoxina y proteínas M. Las células huésped apropiadas incluyen células de mamífero, células bacterianas tales como S. aureus, E. coli y Salmonella spp., células de levadura, y células de insecto.

Los procedimientos de transformación son conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen transformación del protoplasto, transformación mediada por liposoma, precipitación con fosfato de calcio y electroporación. El procedimiento preferido es transformación del protoplasto.

Las células transformadas preferidas llevan un casete de expresión que codifica una toxina SPE-A mutante con un cambio en la asparagina del aminoácido 20. Dicha célula transformada se ha depositado en la American Type Culture Collection en Rockville, Maryland. Las características del microorganismo depositado son que es S. aureus que lleva pMIN 164 que incluye una secuencia de ADN que codifica el mutante N20D unida de manera operativa al promotor speA nativo y otras regiones reguladoras. Este microorganismo se depositó de acuerdo con el tratado de Budapest y el número de acceso dado 69831.

Se ha depositado otro microorganismo en la ATCC. Este microorganismo es S. aureus que lleva una secuencia de ADN que codifica la toxina SPE-A tipo silvestre unida de manera operativa al promotor speA nativo y regiones reguladoras. Este microorganismo se depositó en la ATCC de acuerdo con el tratado de Budapest y el número de acceso dado 69830.

Las células transformadas son útiles para producir grandes cantidades de toxina SPE-A mutante que pueden utilizarse en composiciones de vacuna. Un microorganismo transformado puede utilizarse en una vacuna viva, atenuada, o muerta por calor. Un microorganismo transformado incluye la toxina SPE-A mutante en cantidades suficientes para estimular una respuesta inmune de protección frente a SPE-A tipo silvestre. Preferiblemente, la toxina SPE-A mutante se secreta. El microorganismo preferiblemente es no patogénico para los humanos e incluye una toxina mutante con múltiples cambios en aminoácidos para minimizar la reversión a la forma tóxica. El microorganismo podría administrarse como vacuna viva o vacuna muerta por calor de acuerdo con principios conocidos. Los microorganismos preferidos para vacunas vivas son células transformadas tales como Salmonella spp.

Un vector viral que incluye un casete de expresión con una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante o fragmento de la misma, unida de manera operativa a un promotor funcional en una célula huésped también puede utilizarse en una composición de vacuna como se describe en este documento. Preferiblemente, el promotor es funcional en una célula de mamífero. Un ejemplo de un vector viral apropiado incluye poxvirus tales como el virus vaccinia, adenovirus, citomegalovirus y similares. Los vectores del virus vaccinia podrían utilizarse para inmunizar humanos frente a al menos una actividad biológica de una toxina SPE-A tipo silvestre.

La invención también incluye una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante. La secuencia de ADN puede estar unida de manera operativa a un promotor funcional en una célula huésped. El promotor es preferiblemente funcional en una célula huésped de mamífero. La secuencia de ADN puede suministrarse a una célula huésped o individuo para la expresión de la toxina SPE-A mutante en las células propias de los individuos. La expresión de las secuencias de ADN de la toxina SPE-A mutante en el individuo proporciona una respuesta inmune de protección frente a la toxina SPE-A tipo silvestre. Opcionalmente, el casete de expresión puede incorporarse en un vector. Una molécula de ácido nucleico puede administrarse directamente o en un vector viral. La composición de vacuna también puede incluir opcionalmente un agente de liberación que proporciona una liberación de la vacuna de manera intracelular tal como liposomas y similares. La composición de vacuna también puede incluir opcionalmente adyuvantes u otros compuestos inmunomoduladores, y compuestos adicionales que potencian la captación de los ácidos nucleicos en las células. La composición de vacuna puede administrarse por una diversidad de vías incluyendo vías parenterales tales como intravenosa, intraperitoneal, o por contacto con superficies mucosas.

Las condiciones para el crecimiento y producción a gran escala de toxina SPE-A mutante son conocidas por los especialistas en la técnica. Un procedimiento para la purificación de toxinas SPE-A mutantes a partir de fuentes microbianas es la siguiente. Se hace crecer S. aureus que lleva speA mutante o de tipo silvestre en pMIN 164 a 37ºC con aireación hasta la fase estacionaria en medio de corazón de ternera dializable, que contiene 5 \mug/ml de eritromicina. Los cultivos se precipitan con cuatro volúmenes de etanol y las proteínas se resolubilizan en agua libre de pirógeno. Las preparaciones en bruto se someten a separaciones por enfoque isoeléctrico en lecho plano sucesivas en gradientes de pH de 3,5 a 10 y 4 a 6. Las fracciones que son positivas para la toxina por reactividad de anticuerpo se dializan considerablemente frente a agua libre de pirógeno, y se ensaya una lipota de cada una para la pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS en geles al 15% (peso/volumen). Los anticuerpos neutralizantes policlonales frente a SPE-A están disponibles por Toxin Technologies, Boca Raton, Fla o Dr. Schlievert. Pueden utilizarse otros procedimientos de purificación incluyendo cromatografía en columna o HPLC.

Esta invención puede entenderse mejor por medio de los siguientes ejemplos que son representativos de las realizaciones preferidas de la misma, pero que no se interpretan como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1 Clonación y Expresión de SPE-A Tipo Silvestre

El gen que codifica la toxina SPE-A tipo silvestre (speA) se clono de E. coli como se describe en Johnson y col., Mol. Gen. Genet. 194:52-56 (1984). Brevemente, el gen speA se identificó clonando una digestión con HindIII del ADN del Fago T12 en pBR322 en RR1 de E. coli. Los transformantes se seleccionaron identificando los positivos para la producción de toxina usando antisuero neutralizante policlonal frente a toxina A. Se informa de una secuencia de nucleótidos para la toxina A en Weeks y col, Inf. Imm. 52:144 (1986).

Una secuencia de ADN que incluye el gen speA se subclonó y después se expresó en S. aureus. Se digirió el plásmido de E. coli que lleva speA con las enzimas de restricción HindIII y SalI. Los fragmentos se purificaron y se ligaron en sitios HindIII-SalI en pMIN 164 (disponible como se ha descrito previamente). El vector pMIN 164 es una quimera del plásmido pE194 de estafilococos (que lleva resistencia a eritromicina) y el vector pBR328 de E. coli (que lleva resistencia a Amp y Tet). La clonación de speA en los sitios HindIII-SalI de este vector interrumpen la resistencia a Tet. El promotor presente en este plásmido inmediatamente cadena arriba del gen clonado es el promotor speA nativo.

La expresión del gen speA se verificó detectando la toxina en un ensayo de inmunodifusión doble con anticuerpos neutralizantes policlonales frente a SPE-A de la Toxina preparada en el laboratorio de la invención.

Ejemplo 2 Administración e Inmunización de Conejos con SPE-A producida de Manera Recombinante (wt)

La administración de SPE-A producida de manera recombinante a animales induce STSS. La inmunización de animales con SPE-A producida de manera recombinante reduce la proporción de muertes cuando los animales se estimulan con estreptococos M3 o M1 y protege a los animales frente a STSS.

La administración de SPE-A induce STSS en conejos. Se ha establecido un modelo de conejo para STSS por la administración de SPE-A en bombas miniosmóticas implantadas por vía subcutánea. Lee y col., Infect Immun. 59:879 (1991). Estas bombas se diseñan para liberar una cantidad constante de toxina durante un periodo de 7 días, proporcionando de este modo una exposición continua a la toxina. Se administró SPE-A producida de manera recombinante a conejos en una dosis total de 200 \mug en 0,2 ml durante un periodo de 7 días. Los resultados indican que los animales tratados con SPE-A desarrollaron los criterios de STSS sucumbiendo casi todos los animales en el periodo de 7 días (datos no mostrados). Los síntomas de STSS en conejos incluyen pérdida de peso, diarrea, cara moteada, fiebre, conjuntiva y mucosa roja, y orina marrón claro. Como se esperaba, los animales no tratados con toxina control permanecieron sanos. Se hicieron dos observaciones principales distintas: 1) el reemplazamiento de fluido proporcionó protección completa a los animales como se esperaba, y 2) ninguno de los animales tratados con toxina desarrolló fascitis necrotizante y miositis, indicando que se requieren factores distintos de, o además de SPE-A para el daño de tejido blando.

El desarrollo de las características clínicas de STSS está correlacionado con la administración de SPE-A. Los conejos inyectados con estreptococos SPE-A positivos desarrollaron STSS mientras que los inyectados con estreptococos SPE-A negativos no mostraron síntomas de STSS.

Se sabe bien que SPE-A es un rasgo variable producido por algunos estreptococos del grupo A. El gen de SPE-A está codificado por el bacteriófago T12, y se establecieron cepas de estreptococos bien caracterizadas que difieren sólo en si está presente o no el fago SPE-A, mencionado como fago T12. La cepa de estreptococos T12 curada con T25_{3} es positiva para la producción de SPE- A, mientras que T25_{3} curada es SPE-A negativa.

Los conejos se inyectaron por vía subcutánea con T12 curada con T25_{3} SPE-A positiva de estreptococos o T25_{3} SPE-A negativa curada en bolas de golf de Wiffle implantadas, como se describe por Scott y col., Infect Immunity 39:383 (1983). Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los resultados muestran que los animales inyectados con estreptococos SPE-A positivos desarrollaron las características clínicas de STSS, y 6/8 sucumbieron. Los dos animales supervivientes desarrollaron anticuerpos frente a SPE-A. En contraste, la cepa negativa a toxina, T25_{3} curada, indujo sólo fiebre, y no se observaron muertes, incluso a concentraciones de células bacterianas mucho más altas. Como en los experimentos del modelo animal previos, no se observó evidencia de necrosis de tejido blando. Además, los estreptococos permanecieron localizados en las bolas de golf, sugiriendo que estas cepas de estreptococos no son altamente invasivas.

103

* Aproximadamente 1 x 10^{8} células

^{+} Aproximadamente 1 x 10^{11} células

^{\ddagger} 2 supervivientes desarrollaron anticuerpos frente a SPE-A.

La inmunización con SPE-A producida de manera recombinante disminuyó las proporciones de muertes cuando los conejos se estimularon con estreptococos M1 o M3. Los conejos se inmunizaron con SPE-A clonada obtenida de S. aureus para evitar la posibilidad de inmunizar los animales con productos de estreptococos contaminantes, tales como proteína M. Los animales de control no se inmunizaron frente a SPE-A. Los conejos recibieron 50 \mug de SPE-A producida de manera recombinante en emulsión en adyuvante incompleto de Freund por vía subcutánea. Después de 9 días, los conejos se estimularon por vía subcutánea con 25 ml de estreptococos M3 (1,4 X 10^{9} CFU total) o M1 (4,2 X 10^{9} CFU total) crecidos en medio de corazón de ternera dializado. Los aislados de estreptococos M1 y M3 son aislados clínicos. El aislado M1 se denomina MNST y el aislado M3 se denomina MNBY. Estos aislados están disponibles por Dr. Schlievert, University of Minnesota, Mpls. MN.

Los datos presentados en la Tabla 2 muestran los resultados sorprendentes de estos experimentos.

104

* \begin{minipage}[t]{150mm} Los animales se inmunizaron frente a SPE-A clonada preparada de S. aureus; los títulos ELISA frente a SPE-A fueron superiores a 10.000. \end{minipage}

^{+} \begin{minipage}[t]{145mm} Los animales se estimularon por vía subcutánea con 1,4 X 10^{9} CFU de estreptococos M3 o 4,2 X 10^{9} CFU de estreptococos M1 en un medio de corazón de ternera dializable. \end{minipage}

^{\ddagger} \begin{minipage}[t]{150mm} De acuerdo con la guía del University of Minnesota Animal Care Committee, el experimento que usó estreptococos M3 se terminó después de 24 horas, y el experimento que usó estreptococos M1 se terminó después de 48 horas. \end{minipage}

\NAK \begin{minipage}[t]{150mm} Valores P determinados por el Ensayo de Probabilidad exacta de Fisher. \end{minipage}

Como se indica, 16 de 19 conejos inmunizados con SPE-A sobrevivieron a la estimulación con estreptococos M3, mientras que sólo 4 de 20 animales no inmunes sobrevivieron. Los animales inmunes supervivientes mostraron una clara evidencia de que la formación de abscesos leves contenidos, según el examen de su fluido, se cargó con PMN. Se obtuvieron resultados similares en estudios de estreptococos M1, excepto que los organismos M1 no eran tan virulentos como los organismos M3 (Tabla 2). Se usaron mayores cantidades de estreptococos M1, y se vio una proporción de muertes reducida en los conejos, incluso en animales control no inmunes. Esto puede reflejar la producción de SPE-A aproximadamente 50 veces más baja por cepas M1 en comparación con cepas M3.

En contraste, ninguno de los animales no inmunes mostró formación de abscesos, y el examen del fluido de 2/2 animales reveló infiltración de PMN. Estos resultados muestran que parece que una diferencia principal entre los animales inmunes SPE-A versus animales no inmunes es si podría o no montarse una respuesta inflamatoria. El trabajo anterior mostró que SPE-A, así como otros superantígenos de toxina pirogénica, induce a los macrófagos a producir niveles altos de TNF-\alpha. TNF-\alpha produce enormemente la quimiotaxis por PMN, aparentemente a través de regulación a la baja de receptores quimiotácticos. Por lo tanto, se cree que los resultados muestran que los anticuerpos en los animales inmunizados con SPE-A (títulos > 10.000 por ELISA) bloquean la liberación de TNF-\alpha de macrófagos neutralizando SPE-A, permitiendo de este modo el desarrollo de una respuesta inflamatoria de protección. En los animales no inmunes, SPE-A podría causar una liberación significativa de TNF-\alpha que a su vez evita el desarrollo de una respuesta quimiotáctica de protección.

Es importante observar que todos los animales que murieron excepto uno mostraron daño extensivo de tejido blando que fue evidente porque sus extremidades completas se volvieron moradas-negras y en muchos casos se desprendieron. Un animal del grupo inmunizado murió después de la inmunización. La ausencia de inflamación detectable en el tejido de estos animales sugiere que los factores de estreptococos y no los componentes de la respuesta inmune del huésped causa fascitis necrotizante y miositis. Otros factores extracelulares también pueden contribuir al daño de tejido blando, tal como SPE B y las estreptolisinas O y S.

Todos los datos anteriores dan un fuerte argumento para el papel causativo de los superantígenos de toxinas pirogénicas, y particularmente SPE-A, cuando está presente, en el desarrollo de STSS.

Ejemplo 3 Mutagénesis Dirigida de Sitio de una Secuencia de ADN que Codifica SPE-A

Las posiciones en la molécula de SPE-A importantes para la actividad biológica se identificaron usando mutagénesis dirigida de sitio. Se introdujeron cambios en aminoácidos únicos en diversas regiones de la molécula como se describe a continuación.

El modelo de la estructura tridimensional de SPE-A se muestra en la Figura 1. Esta estructura modelo se construyó por Homología usando un programa Insight/Homology de BioSym Corp., San Diego, CA. Esta molécula tiene varios dominios identificados como:

Dominio	Aminoácidos correspondientes
Hélice 2	11-15
\alpha-Hélice N-terminal, hélice 3	18-26
Dominio B - cadenas \beta
cadena 1	30-36
cadena 2	44-52
cadena 3	55-62
cadena 4	75-83
cadena 5	95-106
\alpha-Hélice central, hélice 5	142-158
Dominio A - cadena \beta
cadena 6	117-156
cadena 7	129-135
cadena 8	169-175
cadena 9	180-186
cadena 10	210-220
Hélice 4	64-72
Hélice 6	193-202

Las denominaciones numéricas de los aminoácidos se hacen como referencia a la secuencia de la Figura 3.

Los aminoácidos se seleccionaron en cada uno de los dominios y para alterar los restos de cisteína en la molécula. Las regiones especialmente preferidas son la \alpha-hélice N-terminal (18-26); la \alpha-hélice central (142 a 158); las cadenas \beta del Dominio A y las cadenas \beta del Domino B.

Los restos diana para mutagénesis se eligieron entre los aminoácidos conservados de toda la familia de toxinas pirogénicas comparando la secuencia de aminoácidos primaria y/o similitudes conformacionales 3-D u homologías usando programas informáticos como se ha descrito previamente. Los cambios hechos a cada uno de los aminoácidos se seleccionó para cambiar las características de la cadena lateral del aminoácido del resto en un sitio particular. Por ejemplo, se sustituyeron tres de los restos de cisteína (87, 90 y 98) por serina para alterar los grupos sulfhidrilo en la molécula. Se hicieron cambios en otros tres restos de aminoácidos en la carga presente en ese sitio. Por ejemplo, se cambió una lisina a un ácido glutámico (157), se cambió una lisina a asparagina (16) y se cambió una asparagina a ácido aspártico (20).

Otros aminoácidos pueden afectar a la interacción de las toxinas con moléculas MHC de clase II. En otra molécula, las cadenas del barril \beta N-terminal de TSST-1 fueron importantes para contactar con las cadenas \alpha y \beta de las moléculas MHC de clase II. Por lo tanto, cambios en las cadenas \beta del Dominio A y del Domino B pueden ser importantes para controlar la interacción de estas moléculas con las moléculas MHC de clase II. Además, pueden prepararse cambios en los restos usando mutagénesis aleatoria y sustitución de cada uno de los otros 19 aminoácidos en una posición particular, y después seleccionando los mutantes que muestran una alteración en la actividad biológica tal como letalidad.

Las moléculas SPE-A mutantes se prepararon usando mutagénesis dirigida de sitio usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la que el ADN molde fue el gen de SPE-A clonado del fago T12. Estos cebadores se utilizaron para cada mutación generada. La generación de cada mutante implicó usar tres cebadores como los siguientes: un cebador flanqueante 5' cadena arriba, un cebador interno que incluye el cambio en la secuencia de ADN que codifica un cambio en un aminoácido y un cebador flanqueante cadena abajo. El cebador flanqueante cadena arriba se incluyó en cada reacción de PCR y es homólogo a una región de ADN aproximadamente 760 bases cadena arriba del sitio de inicio de la traducción y tiene una secuencia:

105

El producto de PCR resultante incluye el promotor speA y una posible región reguladora cadena arriba. El cebador flanqueante cadena abajo es complementario a una región de ADN aproximadamente 270 bases cadena abajo del codón de parada y tiene una secuencia:

106

El cebador flanqueante cadena abajo está presente en cada reacción de PCR y a causa de la posición del cebador el producto de PCR contiene una secuencia de terminación de la trascripción putativa.

Cada mutación se genera usando un cebador interno que incluye una secuencia de ADN que codifica un cambio en un resto de aminoácido particular. Los cebadores internos usados para generar cada mutante son los siguientes:

107

Los restos subrayados indican cambios en la secuencia codificante hechos de la secuencia de ADN que codifica SPE-A tipo silvestre.

Se realizó la PCR del siguiente modo: Brevemente, se mezclaron un cebador flanqueante cadena abajo y un cebador directo que abarca el sitio de mutación y que contiene las sustituciones de nucleótidos necesarias para generar un cambio de aminoácido en una molaridad no igual en una reacción de PCR convencional. El producto de ADN obtenido fue dominante en la cadena que contenía la mutación. Este producto, o megacebador, que puede ser de varios cientos de bases de longitud, se aisló por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se eluyó por el uso de un kit Geneclean, como se recomienda por el fabricante (Bio 101, La Jolla, California).

Brevemente, las condiciones de la reacción de PCR son: la PCR se realiza en una mezcla de reacción de 100 \mul que contiene Tris-HCl 10 mM (pH = 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, cada dNTP a 200 \muM, 2 ng de ADN plasmídico molde, 100 pmoles de cebador flanqueante, 5 pmoles de cebador interno, y 2,5 unidades de Ampli Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer Cetus). En la segunda etapa de amplificación, la composición de la mezcla de reacción es como la anterior excepto para la moralidad igual (5 pmoles cada uno) del cebador flanqueante y el megacebador y 1 \mug de molde. La PCR se realiza durante 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC X 1 minuto, hibridación a 37ºC o 44ºC X 2 minutos y elongación a 72ºC durante 3 minutos. Las condiciones de hibridación pueden variarse de acuerdo con principios conocidos dependiendo del tamaño del cebador, desapareamientos, y contenido en GC.

Se usó un plásmido que contenía el gen clonado speA y secuencias flanqueantes como molde. En la segunda etapa, se combinaron el megacebador y un cebador flanqueante cadena arriba en la mezcla de reacción en molaridad igual para generar el speA mutante de longitud completa.

Los speA mutantes se digirieron con enzimas de restricción apropiadas y se clonaron en el vector lanzadera pMIN 164. Este vector es una quimera del plásmido pBR328 de E. coli, que lleva un gen de resistencia a ampicilina, y el plásmido PE194 de estafilococos, que confiere resistencia a eritromicina. Las mezclas de plásmidos ligados se transformaron, se seleccionaron, y se exploraron en E. coli. Los clones positivos para producción de toxina, como se juzga por los ensayos de inmunodifusión doble, se secuenciaron por el procedimiento de Hsiao citado supra para confirmar la presencia de la mutación deseada y la ausencia de otras mutaciones. Después, los plásmidos se transformaron en la cepa RN 4220 de S. aureus (obtenidos de Richard Novick, Skirball Institute, Nueva York, NY) para la expresión y producción de toxinas mutantes.

Se hizo crecer S. aureus que llevaba los speA mutantes y de tipo silvestre en pMIN 164 a 37ºC con aireación hasta la fase estacionaria en medio de corazón de ternera dializable, que contenía 5 \mug/ml de eritromicina. Los cultivos se precipitaron con cuatro volúmenes de etanol y se resolubilizaron las proteínas en agua libre de pirógeno. Las preparaciones en bruto se sometieron a separaciones por enfoque isoeléctrico en lechos planos sucesivas en gradientes de pH de 3,5 a 10 y 4 a 6. Las fracciones que fueron positivas para la toxina por reactividad con anticuerpo se dializaron de manera extensiva frente a agua libre de pirógeno, y se ensayó una alícuota de cada una para la pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS en geles al 15% (peso/volumen) (datos no mostrados). Todos los mutantes preparados fueron tan resistentes como la toxina nativa al tratamiento durante 60 minutos con tripsina (2 \mug/\mug de SPE-A), y esto junto con la reactividad conservada frente a los anticuerpos policlonales surgidos frente a SPE-A nativa indica que las mutaciones introducidas no causan cambios estructurales graves en la toxina. Usando estos procedimientos, se generaron 7 mutantes que tienen sustituciones de aminoácidos únicos en la secuencia de aminoácidos de SPE-A.

Ejemplo 4 Perfil de Actividad Biológica de SPE-A Mutante

Las actividades biológicas de las toxinas mutantes se evaluaron y se compararon a las de SPE-A tipo silvestre. Las toxinas mutantes se ensayaron para la capacidad de estimular la proliferación de linfocitos T (superantigenicidad), para potenciar la susceptibilidad del huésped al choque por endotoxina y para el desarrollo del síndrome de choque tóxico y letalidad.

La capacidad para estimular la proliferación de linfocitos T se midió como la incorporación de [^{3}H] timidina en el ADN celular de esplenocitos de conejo. Se realizó un ensayo de mitogenicidad de 4 días convencional en placas de microtitulación de 96 pocillos. Cada pocillo contenía 2 X 10^{5} esplenocitos de conejo resuspendidos en 200 \mul de RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con HEPES 25 mM, L-glutamina 2,0 mM, 100 U de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y FCS inactivado por calor al 2%. Se añadieron 20 \mul de muestras de endotoxinas en cantidades cuadruplicadas en cantidades finales: 1 \mug a 10^{-5} \mug/pocillo. La proliferación celular de fondo se determinó en pocillos por cuadruplicado añadiendo 20 \mul de RPMI a los esplenocitos. Después de 3 días de incubación en una cámara humidificada a 37ºC y CO_{2} al 7%, se añadieron 1,0 \muCi (volumen de 20 \mul de 5-[metil-^{3}H]-timidina (46 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) a cada pocillo y se incubaron durante 18 horas. El ADN celular se recogió en filtros de fibra de vidrio y la incorporación de [metil-^{3}H] timidina se cuantificó por un contador de centelleo líquido. Se realizaron tres ensayos por separado usando tres conejos donantes diferentes. Las concentraciones de exoproteína se ensayaron por cuadruplicado en cada uno de los tres ensayos. Los resultados se presentan como CPM.

La capacidad de potenciar la susceptibilidad del huésped al choque por endotoxina se ensayó en conejos American Dutch Belted. Los animales que pesaban entre 1 y 2 kilos se inyectaron en la vena marginal de la oreja con 5 \mug/kg de peso corporal de SPE-A (igual a 1/50 LD_{50}) y se estimularon 4 horas después por inyección IV de 1 o 10 \mug/kg de peso corporal de endotoxina (aproximadamente 1/100 LD_{50}) de Salmonella typhimurium. Los conejos control recibieron inyecciones con PBS. Los animales se controlaron después de 48 horas para la muerte.

La letalidad también se midió usando bombas miniosmóticas implantadas por vía subcutánea en conejos American Dutch Belted y que contenían 200 \mug de toxina. Las proteínas individuales (200 \mug) se inyectaron en 0,2 ml de PBS en bombas miniosmóticas (Alzet, AlzaCo, Palo Alto, CA). La bomba se diseña para liberar una cantidad constante de toxina durante un periodo de 7 días. Los conejos se controlaron 3 veces al día para los signos de síndrome de choque tóxico tales como diarrea, eritema de la conjuntiva y las orejas, choque y muerte durante hasta 8 días.

Los resultados de los estudios de mitogenicidad de células T se muestran en las figuras 4, 5, y 6. Los resultados muestran que el mutante N20D tiene una disminución de cinco veces en la superantigenicidad o actividad de mitogenicidad de células T. Los mutantes C87S y C98S también tuvieron una disminución de 4 veces en la mitogenicidad para células T. Por tanto, varias de las mutaciones afectaron a la actividad biológica de superantigenicidad o mitogenicidad de células T.

Los resultados de potenciamiento de choque por endotoxina y letalidad se muestran en las Tablas 3, 4, y 5 mostradas a continuación

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

109

110

Los resultados muestran que los animales tratados con el mutante N20D no desarrollaron STSS cuando se ensayaron usando cada modelo de STSS. La mutación en N20D se localiza en una \alpha-hélice contigua surco mayor en la parte trasera de la toxina (Figura 1). Este resto es importante en las funciones de superantigenicidad y letalidad de la molécula.

Las mutaciones que eliminan los grupos sulfhidrilo y, por lo tanto, que interfieren con enlaces disulfuro posibles, tienen efectos variados en las actividades biológicas de SPE-A, dependiendo de qué restos de cisteína se mutaron. El mutante C90S permaneció completamente letal (Tabla 4), y la actividad estimuladora de células T no disminuyó significativamente (Figura 5a). En contraste, las mutaciones C87S y C98S redujeron aproximadamente cuatro veces la mitogenicidad de toxinas (Fig. 5b). Sin embargo, la capacidad de causar choque por endotoxina se vio afectada de manera diferente por las dos mutaciones, siendo C98S sólo ligeramente tóxica, pero siendo C87S fuertemente tóxica (Tabla 4). Una explicación para estos resultados se basa en las posiciones relativas de los tres restos de cisteína en la secuencia primaria y en la estructura tridimensional (Fig. 1). La carencia del grupo sulfhidrilo de C98 puede excluir la formación de un puente disulfuro putativo visto en enterotoxinas de estafilococos, y por lo tanto, la conformación del bucle podría perderse. Esto podría tener efectos perjudiciales para la actividad si los aminoácidos en este bucle son responsables del contacto con los receptores celulares del huésped o tienen alguna otra función en la actividad biológica de la molécula. En el caso de la mutación C87S, el enlace disulfuro putativo podría aún estar creado entre C90 y C98, conservando la mayoría de la conformación, y por lo tanto, la actividad.

El mutante K157E, localizado en la \alpha-hélice central larga, conserva la superantigenicidad completa (Fig. 6b), pero fue no letal cuando se administró en bombas miniosmóticas a conejos. (Tabla 6).

El resto S195A, que es parte de la \alpha-hélice 5, puede no ser importante para las actividades biológicas ensayadas, ya que su mutación no afecta a las actividades ensayadas hasta ahora. Este resto podría no estar expuesto al medio o puede no contribuir a la unión.

Estos resultados muestran que la letalidad y superantigenicidad puede estar afectada por mutaciones en varios sitios. La letalidad puede estar afectada por mutaciones en restos en la \alpha-hélice N-terminal (N20D) y en la \alpha-hélice central (K157E). La mitogenicidad puede estar afectada por mutaciones en la \alpha-hélice N-terminal y cambios a grupos sulfhidrilo.

Estos resultados también muestran que la mitogenicidad y la letalidad son actividades separables ya que se generaron mutantes que afectan a la letalidad sin afectar a la superantigenicidad (K157E) y que afectaron la mitogenicidad sin afectar la letalidad (C87S).

Ejemplo 5 Preparación de Mutantes Dobles o Triples de SPE-A usando PCR

Hay varios procedimientos que pueden usarse para generar toxinas SPE-A mutantes dobles o triples o fragmentos de las mismas.

Las toxinas SPE-A mutantes con dos o más cambios en las secuencias de aminoácidos pueden prepararse usando PCR como se ha descrito previamente. En una primera reacción de PCR, se combina un primer cebador interno que codifica el primer cambio en un sitio seleccionado con cebadores flanqueantes 5' y 3' para formar un primer producto de PCR. El primer producto de PCR es una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante que tiene un cambio en la secuencia de aminoácidos. Este primer producto de PCR después sirve como ADN molde para generar un segundo producto de PCR con dos cambios en la secuencia de aminoácidos en comparación con una proteína que tiene una actividad SPE-A tipo silvestre. El primer producto de PCR es el ADN molde combinado con un segundo cebador interno que codifica un cambio en un aminoácido en un segundo sitio. El segundo cebador interno también se combina con los cebadores flanqueantes 5' y 3' para formar un segundo producto de PCR. El segundo producto de PCR es una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante con cambios en dos sitios en la secuencia de aminoácidos. Este segundo producto de PCR después puede usarse como molde en una tercera reacción para formar un producto de secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante con cambios en tres sitios en la secuencia de aminoácidos. Este procedimiento puede utilizarse para generar secuencias de ADN que codifican toxinas mutantes que tienen más de un cambio en la secuencia de aminoácidos.

Un procedimiento alternativo para preparar secuencias de ADN que codifican más de un cambio es preparar fragmentos de secuencia de ADN que codifica el cambio o cambios en la secuencia de aminoácidos por síntesis automática. Los fragmentos después pueden subclonarse en la secuencia que codifica SPE-A tipo silvestre usando varios sitios de restricción únicos. Los sitios de restricción son conocidos por los especialistas en la técnica y pueden determinarse fácilmente a partir de la secuencia de ADN de una toxina SPE-A tipo silvestre. La clonación puede hacerse en una etapa única con un procedimiento de ligamiento de tres fragmentos como se describe por Revi y col. Nucleic Acid Res. 16: 1030 (1988).

Ejemplo 6 Estudios de Toxicidad relacionados con Mutantes Simples y Dobles

Se evaluaron SPE-A tipo silvestre, SPE-A N20D, SPE-A K157, SPE-A N20/C98S, y SPE-A N20D/K157E para la superantigenicidad en base a su capacidad para estimular la proliferación de esplenocitos de conejo (véanse Figuras 7 y 8).

Se prepararon mutantes SPE-A dobles (N20D/C98S, N20D/K157E) por mutagénesis por PCR usando las técnicas descritas anteriormente. El gen SPE-A mutante, speA N20D, sirvió como ADN molde para la introducción de la segunda mutación. Los genes mutantes dobles se secuenciaron como se ha descrito anteriormente para asegurar que sólo estaban presentes los cambios indicados. Sólo los cambios deseados estaban presentes.

Se cultivaron células de bazo de conejo en presencia de SPE-A y SPE-A mutantes in vitro durante 3 días y después un día adicional después de la adición de 1 \muCi/pocillo de ^{3}H timidina. Se usó la incorporación de ^{3}H timidina en el ADN del linfocito como medida de la proliferación de las células T. Se calculó un índice de superantigenicidad como media de cuentas/minuto de incorporación de ^{3}H timidina en células estimuladas dividido por la media de cuentas/minuto en células cultivadas sin SPE-A o mutantes añadidos.

SPE-A tipo silvestre fue significativamente superantigénico a dosis de 1 a 0,001 \mug/pocillo (Figura 7). SPE-A K157E fue significativamente mitogénico a dosis de 0,01 y 0,001 \mug/pocillo (Figura 7). Los otros tres mutantes SPE-A (SPE-A N20D, SPE-A N20D/C98S, SPE-A N20D/C157E) fueron significativamente menos superantigénicos (Figura 8) que SPE-A tipo silvestre a dosis de 1 a 0,001 \mug (p<0,001). Es interesante observar que SPE-A N20D fue significativamente más superantigénico (Figura 8) que SPE-A N20D/C98S a dosis de 1 y 0,1 \mug (p<0,0005, p<0,001, respectivamente). Además, SPE-A N20D fue más mitogénico que SPE-A N20D/K157E a la dosis de 1 \mug/pocillo (p<0,01). Por tanto, los datos indicaron que el mutante N20D/C98S tuvo menos toxicidad que el mutante N20D simple, y que el mutante doble N20D/K157E fue intermedio entre las otras dos proteínas. Los tres mutantes fueron significativamente menos tóxicos que SPE-A tipo silvestre.

En un segundo experimento se estimularon iv conejos (3/grupo) con 10 \mug/kg de SPE-A o mutantes y después 5 \mug/kg de endotoxina 4 horas después. Los animales se controlaron durante 48 horas para la letalidad potenciada debido a la administración de SPE-A y endotoxina. Este ensayo es la medida in vivo más sensible de la actividad letal de SPE-A. Como se indica en la Tabla 6, 0/3 animales estimulados con SPE-A tipo silvestre y endotoxina sobrevivieron. En contraste, todos salvo un animal estimulado con SPE-A N20D sobrevivieron, y todos los animales estimulados con SPE-A N20D/C98S o SPE-A N20D/K157E sobrevivieron.

TABLA 6 Capacidad de SPE-A (10 \mug/kg) o mutantes (10 \mug/kg) para potenciar la susceptibilidad de conejos a los efectos letales de endotoxina (5 \mug/kg)

111

En un tercer experimento se inmunizaron conejos con SPE-A N20D, SPE-A N20D/C98S, o SPE-A N20D/K157E, y después se estimularon con SPE-A tipo silvestre (10 \mug/kg) y endotoxina (5 \mug/kg o 25 \mug/kg) como en el experimento precedente. Los animales control no se inmunizaron pero se estimularon con SPE-A tipo silvestre más endotoxina. Los conejos se inmunizaron cada semana con dos inyecciones, con proteínas mutantes (50 \mug/inyección) emulsionadas en adyuvante incompleto (de Freund, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y después se dejaron una semana antes de estimular con toxina tipo silvestre. La combinación de SPE-A tipo silvestre y endotoxina representa 20 LD_{50} para estimulación con 100 \mug/kg de SPE-A y 5 \mug/kg de endotoxina, y 100 LD_{50} para estimulación con 100 \mug/kg de SPE-A y 25 \mug/kg de endotoxina.

Como se indica en la Tabla 7, todos los animales estimulados con 100 LD_{50} de SPE-A y endotoxina sucumbieron. De manera similar, todos los animales inmunizados con SPE-A N20D o N2OD/K157E sucumbieron cuando se estimularon con 20 LD_{50} de SPE-A y endotoxina. En contraste, los animales inmunizados con el mutante doble N20D/C98S sobrevivieron. Los animales inmunizados con el doble mutante N20D/K157E sucumbieron antes que los otros animales. Los datos anteriores indican que los dobles mutantes y en particular SPE-A N20D/C98S muestran eficacia como vacuna de toxoide en animales de ensayo.

TABLA 7 Capacidad de mutantes SPE-A para inmunizar conejos frente a la capacidad de SPE-A tipo silvestre de potenciar la susceptibilidad a choque por endotoxina letal

112

Ejemplo 7 Inhibición de SPE-A por Anticuerpos Frente a Mutantes SPE-A e inmunización por mutantes SPE-A

Se sacó un ml de sangre de la vena marginal de la oreja de cada uno de los conejos inmunizados con SPE-A N20D, N20D/C98S, y N20D/K157E y controles no inmunizados. Se extrajo sangre de los animales 6 días antes de la última inmunización (un día antes los animales se usaron en el experimento de la Tabla 6). Después de que la sangre coagulara, los sueros se separaron por centrifugación (13.000 x g, 10 min). Los sueros de cada grupo se combinaron y se trataron con 33 1/3% (concentración final) de sulfato amónico durante 1 hora a temperatura ambiente para precipitar las inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas precipitadas se recogieron por centrifugación (13.000 x g, 10 min), se resolubilizaron al volumen original en solución salina tamponada con fosfato (NaPO_{4} 0,005 M, pH 7,0, NaCl 0,15 M), y se dializaron durante 24 horas frente a 1 litro de NaCl 0,15 M a 4ºC. Los dializados se esterilizaron en filtros (0,45 \mum de tamaño de poro) y se usaron en estudios para neutralizar la mitogenicidad de esplenocitos de conejo (superantigenicidad) de 0,01 \mug de SPE-A (Figura 9). El suero de un conejo inmunizado con dosis subletales de SPE-A tipo silvestre se fraccionó a partes iguales y se usó como control positivo. Se diluyeron 1/5 y 1/50 veinte microlitros de las fracciones de inmunoglobulina (Ig) de cada grupo de suero con medio de cultivo celular de mamífero RPMI 1640 completo (dilución con respecto al volumen de suero original) y se añadió a cada uno de los 4 pocillos que contenían SPE-A tipo silvestre y 2 X 10^{5} esplenocitos de conejo en el ensayo de mitogenicidad convencional. Ig y la toxina tipo silvestre se añadieron ambas a linfocitos en tiempo 0. Los resultados se muestran en la
Figura 9.

Las Ig diluidas 1/5, de animales inmunizados o controles no inmunes fueroninhibitorios para la proliferación de esplenocitos, probablemente a causa del sulfato amónico residual en las Ig. Sin embargo, Ig de animales inmunes SPE-A e Ig de animales inmunes a N20D, N20D/C98S, y N20D/C157E fueron más inhibitorias que Ig de controles no inmunes (p = 0,006 para SPE-A versus no inmune, p = 0,035 para N20D versus no inmune, p = 0,0002 para N20D/C98S versus no inmune, y p = 0,0001 para N20D/K157E versus no inmune por uso del análisis de ensayo t de Student de datos no apareados distribuidos de manera normal), que indican la inhibición específica de la
mitogenicidad.

Cuando se añadieron Ig a la dilución 1/50, el doble mutante N20D/C98S causó inhibición significativa de la proliferación de esplenocitos en comparación con controles no inmunes (p = 0,046). A esta concentración de Ig ninguna de las fracciones causó supresión no específica de la mitogenicidad de linfocitos.

Estos datos sugieren que el doble mutante N20D/C98S fue más capaz para inmunizar animales frente a la mitogenicidad de SPE-A tipo silvestre que el mutante simple N20D o el otro mutante doble N20D/K157E. Sin embargo, el doble mutante N20D/N157E fue mejor inmunogen que el mutante simple N20D. Sin estar unido por lo siguiente, es posible que dos cambios en el mutante N20D/C98S interfiera con los sitios del receptor de la célula huésped requeridos para la letalidad, la interacción con el receptor de células T y, posiblemente indirectamente, la interacción con MCH de clase II en células presentadoras de antígeno. Como la interacción con MCH de clase II depende de los restos de aminoácidos en el dominio de barril \beta (Domino B) en el análisis convencional de la toxina, se propone también que un cambio en esta región (tal como D45N) puede mejorar la inmunogenicidad de N20D/C98S incluso más. La base para esta hipótesis es que la toxina tipo silvestre (y posiblemente mutantes que carecen de cambios en el dominio de interacción con MHC de clase II) se unen directamente a moléculas MCH de clase II sin el requisito del procesamiento normal por las células presentadoras de antígeno. Los mutantes que contienen cambios de aminoácidos que interfieren con esta interacción directa con MCH de clase II pueden ser más inmunogénicos ya que los mutantes podrían internalizarse más fácilmente y procesarse. Por tanto, el triple mutante N20D/C98S/D45N se evaluará usando los procedimientos usados para evaluar los otros mutantes.

Los sueros obtenidos de los controles no inmunes y cada grupo de conejos inmunizados con N20D, N20D/C98S, o N20D/K157E se ensayaron directamente para la titulación ELISA frente a SPE-A tipo silvestre (L. Hudson y F.C. Hay, Practical Immunology 2ª Ed, 1980, Blackwell Scientific Publications, Boston p 237-239.) El suero de cada animal se evaluó por separado. Se calculó la media de los títulos de anticuerpo obtenidos y se muestran en la Tabla 8. Los animales control no inmunes como se esperaba tuvieron títulos muy bajos de anticuerpos frete a SPE-A. En contraste, todos los animales inmunizados frente a los mutantes tuvieron títulos de anticuerpo significativos. Los animales inmunizados con el doble mutante N20D/K157E tuvieron el título medio más alto siendo comparable con los otros dos mutantes. Sin embargo, la proporción de los títulos para los animales inmunizados con N20D fue mucho mayor (20, 40, 160, 640, 640 para cada uno de los 6 animales) que cada uno de los dobles mutantes. Los datos sugieren que los dobles mutantes dieron inmunización más consistente.

TABLA 8 Títulos ELISA de anticuerpo de animales inmunizados frente a SPE-A N20D, N20D/C98S, N20D/K157E y controles no inmunes

Agente Inmunizante	Media de Título de Anticuerpo^{a}	Proporción^{b}
Ninguno	10	<10-20
SPE-A N20D	250	20-640
SPE-A N20D/C98S	80	80
SPE-A N20D/K157E	425	320-640
a 6 animales/grupo
b el título más bajo detectable fue 10. El título es el recíproco de la última dilución que dio un resultado positivo

En un experimento final se inmunizaron animales (3/grupo) frente a N20D, N20D/C98S, o N20D/K157E (50 \mug/inyección iv) administrando la proteína mutante cada día por 5 inyecciones y después dejando los animales durante un día. Los animales después se evaluaron para la inmunidad frente a la capacidad de SPE-A tipo silvestre para causar fiebre [20 veces la dosis pirogénica mínima (MPD) 4 horas después de la inyección/kg de peso corporal (20 MPD-4)]. SPE-A es uno de los pirogenes más potentes conocidos con un MPD-4 en conejos de 0,15 \mug/kg. A tiempo puntual 4 horas los animales se inyectaron con endotoxina (25 \mug/kg) para evaluar la inmunidad para la susceptibilidad potenciada a choque por endotoxina. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Los animales no inmunes y los inmunizados con SPE-A N20D mostraron respuestas de fiebre significativas (0,8ºC para ambos grupos) y susceptibilidad potenciada a endotoxina (2/3 sucumbieron en 48 horas en ambos grupos). En contraste, los animales inmunizados con cada mutante doble se protegieron completamente de fiebre y el fenómeno de potenciamiento.

Colectivamente, todos los datos anteriores sugieren que ambos mutantes dobles son más capaces de inmunizar animales frente a los efectos tóxicos de SPE-A que el mutante simple. Ninguno de los mutantes por sí mismos fueron tóxicos para los animales. El doble mutante N20D/C98S fue mejor inmunogen que N20D/K157E, pero ambos fueron eficaces

TABLA 9 Capacidad de los mutantes SPE-A N20D, N20D/C98S, y N20D/K157E para inmunizar conejos frente a la pirogenicidad de SPE-A y la estimulación letal por SPE-A y endotoxina

Agente Inunizante	Respuesta de Fiebre	Número de Muertos/Total
	Cambio de ºC a las 4 horas
Ninguno	0,8	2/3
SPE-A N20D	0,8	2/3
SPE-A N20D/C98S	0,0	0/3
SPE-A N20D/K157E	0,1	0/3

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Regentes de University of Minnesota

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Morrill Hall, 100 Church Street, S.E.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Minneapolis

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Minnesota

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 55415-1226

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MUTANTES DE LA TOXINA DE ESTREPTOCOCOS A Y PROCEDIMIENTOS DE USO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUN-1996

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/480.261

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-JUN-1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1851 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 828..1583

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 252 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

Claims (14)

1. Una toxina SPE-A mutante que comprende más de un cambio en la secuencia de aminoácidos pero no más de seis cambios; siendo los cambios sustitución de los aminoácidos situados:

en la alfa hélice 3 N-terminal, en la alfa hélice 5 central, en la cadena beta 1 del dominio B, en la cadena beta 2 del dominio B, en la cadena beta 3 del dominio B, en la cadena beta 6 del dominio A, en la cadena beta 8 del dominio A, en la cadena beta 9 del dominio A, en la cadena beta 10 del dominio A; o sustitución de un resto de cisteína en la posición 87, 90, o 98;

en la que al menos uno de los aminoácidos sustituidos es asparagina-20, lisina-157, o cisteína-98; y

en la que el mutante tiene al menos una de las siguientes características: el mutante tiene una disminución en la mitogenicidad para células T, el mutante no potencia el choque por endotoxina, el mutante es no letal, o el mutante es no letal pero conserva la mitogenicidad en comparación con la de la toxina SPE-A tipo silvestre.

2. La toxina SPE-A mutante de la reivindicación 1, en la que la al menos una sustitución de aminoácido comprende la sustitución de asparagina-20 a ácido aspártico, ácido glutámico, lisina o arginina; la sustitución de cisteína-98 a serina, alanina, glicina, o treonina; o la sustitución de lisina-157 a ácido glutámico o ácido aspártico.

3. La toxina SPE-A mutante de la reivindicación 2, en la que la al menos una sustitución de aminoácido comprende asparagina-20 a ácido aspártico, cisteína-98 a serina, o lisina-157 a ácido glutámico.

4. La toxina SPE-A mutante de la reivindicación 1, en la que la al menos una sustitución de aminoácido comprende la sustitución de asparagina-20.

5. La toxina SPE-A mutante de la reivindicación 4, en la que la sustitución es asparagina-20 a ácido aspártico.

6. La toxina SPE-A mutante de la reivindicación 4, que también comprende la sustitución de cisteína-98, o lisina-157.

7. La toxina SPE-A mutante de la reivindicación 6, en la que la sustitución es cisteína-98 a serina, o lisina-157 a ácido glutámico.

8. Un vacuna para proteger animales frente a al menos una actividad biológica de SPE-A tipo silvestre, que comprende una cantidad eficaz de al menos una toxina SPE-A mutante de acuerdo con la reivindicación 1.

9. Una composición farmacéutica que comprende una SPE-A mutante de acuerdo con la reivindicación 1 en mezcla con un vehículo fisiológicamente aceptable.

10. Una secuencia de ADN que codifica una toxina SPE-A mutante de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Un célula huésped transformada estable que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una toxina SPE-A mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso como medicamento.

13. Uso de una toxina SPE-A mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 par la fabricación de una vacuna para proteger un animal frente a al menos una actividad biológica de una SPE-A tipo silvestre.

14. Uso de una toxina SPE-A mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la fabricación de una vacuna para reducir los síntomas asociados con choque tóxico.