ES2273861T3

ES2273861T3 - Inmunizacion de ganado vacuno lechero con proteina gapc frente a infecciones por streptococcus.

Info

Publication number: ES2273861T3
Application number: ES01949115T
Authority: ES
Inventors: Alexandra J. Bolton; Jose Perez-Casal; Michael Fontaine; Andrew A. Potter
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 2000-06-12
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2021-06-11
Also published as: EP1332155B1; DK1332155T3; ATE343593T1; WO2001096381A3; UY26764A1; CA2411927A1; DE60124132D1; AR030292A1; DE60124132T2; CA2411927C; WO2001096381A2; EP1332155A2

Abstract

La utilización de una proteína GapC en la fabrica- ción de la composición de una vacuna de utilidad en el tra- tamiento o la prevención de la mastitis en un sujeto mamí- fero, en la que la proteína GapC se selecciona del grupo formado por: (a) una proteína GapC aislada de Sreptococcus dysga- lactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclu- sive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4) o una se- cuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior; (b) una proteína GapC aislada de Sreptococcus agalac- tiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC. núm.: 6) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior; (c) una proteína GapC aislada de Sreptococcus uberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC. núm.: 8) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior; (d) una proteína GapC aislada de Sreptococcus paraube- ris que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC. núm.: 10) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior; (e) una proteína GapC aislada de Sreptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.: 12) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior.

Description

Inmunización de ganado vacuno lechero con proteína GapC frente a infecciones por Streptococcus.

Ámbito técnico

La presente invención se refiere, en términos generales, a antígenos bacterianos y a los genes que codifican los mismos. Más concretamente, la presente invención se refiere a la clonación, expresión y caracterización de las proteínas GapC de unión a plasmina procedentes de Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus parauberis y Streptococcus inicie, y a la utilización de las mismas en la composición de vacunas.

Antecedentes

La mastitis es una infección de la glándula mamaria provocada generalmente por bacterias y hongos. La respuesta inflamatoria que se produce tras la infección provoca una disminución en el rendimiento y la calidad de la producción de leche y provoca anualmente pérdidas económicas considerables a la industria lechera.

Entre las especies bacterianas que se asocian habitualmente con la mastitis se encuentran 20 especies del género Streptococcus, incluyendo Streptococcus aureus, Streptococcus uberis (sin tipificar), Streptococcus agalactiae (grupo B de Lancefield), Streptococcus dysgalactiae (grupo C de Lancefield), Streptococcus zooepidemicus, y los estreptococos de los grupos de Lancefield D, G, L y N. Algunas de estas especies son enfermedades infecciosas (p. ej. S. agalactiae), mientras que otras se consideran patógenos ambientales (p. ej. S. dysgalactiae y S. uberis).

El patógeno ambiental S. uberis es el responsable de alrededor del 20% de todos los casos clínicos de mastitis (Bramley, A.J. y Dodd, F.H. [1984] J. Dairy Res. 51:481-512; Bramley, A.J. [1987] Animal Health Nutrition 42:12-16; Watts, J.L. [1988] J. Dairy Sci. 71:1616-1624); es el microorganismo aislado predominantemente de las glándulas mamarias durante los periodos no lactantes (Bramley, A.J. [1984] Br. Vet. J. 140:328-335; Bramley y Dodd [1984] J. Dairy Res. 51:481-512; Oliver, S.P. [1988] Am. Vet. Res. 49:1789-1793).

Normalmente, la mastitis que se produce como resultado de una infección por S. uberis es subclínica y se caracteriza por la producción de una leche aparentemente normal pero que presenta un incremento en el recuento de células somáticas debido a la afluencia de leucocitos. La composición química de la leche cambia debido a la supresión de la secreción, con una transferencia de cloruro sódico y bicarbonato de la sangre a la leche que provoca un cambio hacia un pH más alcalino. La mastitis por S. uberis también adopta la forma de un trastorno clínico agudo con signos evidentes de enfermedad como presencia de coágulos y cambio de coloración en la leche e inflamación y endurecimiento de la glándula mamaria. Algunos casos de esta enfermedad con manifestación clínica pueden ser graves y puede presentarse pirexia. Para una revisión de las manifestaciones clínicas de la mastitis por S. uberis consúltense: Bramley (1991) Mastitis: physiology or pathology, pp. 3-9, en C. Burvenich, G. Vandeputte-van Messom y A. W. Hill (ed.), New insights into the pathogenesis of mastitis, Rijksuniversiteit Gent, Bélgica; y Schalm et al. (1971) The mastitis complex - A brief summary, pp. 1-3, en Bovine Mastitis, Lea & Febiger, Philadelphia.

Los métodos convencionales de control antibacteriano como la desinfección de pezones postordeño y el tratamiento con antibióticos son eficaces en el control de muchos tipos de mastitis contagiosa, pero los microorganismos presentes en el ambiente que se encuentran habitualmente en los establos del ganado suelen ser resistentes a esas medidas. Por tanto, la vacunación es una estrategia interesante que previene las infecciones de las glándulas mamarias y ha demostrado ser beneficiosa en el caso de algunos patógenos contagiosos causantes de mastitis.

Existe una literatura limitada en referencia a estudios de vacunación con S. dysgalactiae y S. uberis y se ha observado resultados variables. En algunos casos, la inmunización ha resultado en un aumento de la vulnerabilidad al microorganismo específico y, en otros casos, se ha obtenido protección frente a una cepa específica.

Por ejemplo, en estudios previos se ha demostrado que la infección primaria con S. uberis puede reducir considerablemente la tasa de infección tras una segunda prueba de provocación con la misma cepa (Hill, A.W. [1988] Res. Vet. Sci. 44:386-387). La vacunación local con microorganismos muertos de S. uberis protege a la glándula mamaria frente a la infección con la cepa homóloga (Finch et al. (1994) Infect. Immun. 62:3599-3603). De forma similar, se ha demostrado que la vacunación subcutánea con microorganismos vivos de S. uberis provoca una modificación dramática de la patogenia de la mastitis causada por la misma cepa (Hill et al. [1994] FEMS Immunol. Med. Microbiol. 8:109-118). Los animales vacunados de este modo producen leche con una menor cantidad de bacterias y muchos animales se mantienen libres de infección.

Sin embargo, la vacunación con cepas vivas o atenuadas puede suponer un riesgo para el animal receptor. Además, es evidente que las vacunas convencionales de microorganismos muertos no son, en general, nada efectivas frente a S. uberis y S. agalactiae, o por su falta de antígenos protectores en células in vitro o por el enmascaramiento de dichos antígenos mediante mimetismo molecular.

La falta actual de vacunas para mastitis provocadas por S. agalactiae y cepas infecciosas de estreptococos se debe, al menos en parte, a una falta de conocimientos respecto a los determinantes de virulencia y los antígenos protectores producidos por aquellos microorganismos que están implicados en la invasión y la protección de la glándula mamaria (Collins et al. [1988] J. Dairy Res. 55:25-32; Leigh et al. [1990] Res. Vet. Sci. 49:85-87; Marshall et al. (1986) J. Dairy Res. 53:507-514).

Se sabe que S. dysgalactiae se une a varias proteínas plasmáticas como la fibronectina, el fibrinógeno, el colágeno, la alfa-II-macroglobulina, las IgG, la albúmina y otros compuestos. El microorganismo también produce hialuronidasa y fibrinolisina y es capaz de adherirse a las células epiteliales de las glándulas mamarias e invadirlas. No obstante, no se conocen los papeles exactos desempeñados por estos componentes bacterianos responsables de estos fenotipos en la patogenia.

De forma similar, se conoce muy poco sobre la patogenia de la infección por S. uberis. Además, no está bien definida la influencia de los factores de virulencia de S. uberis en los mecanismos de defensa y en la fisiología de la glándula mamaria. Entre los factores de virulencia asociados con S. uberis se encuentran la cápsula de ácido hialurónico (Hill, A.W. [1988] Res. Vet. Sci. 45:400-404), la hialuronidasa (Schaufuss et al. [1989] Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 271:46-53), la proteína tipo-R (Groschup, M.H. y Timoney, J.F. [1993] Res. Vet. Sci. 54:124-126) y una cohemolisina, el factor CAMP, también conocido como el factor UBERIS (Skalka, B. y Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A 249:190-194), la proteína tipo-R, el activador de plasminógeno y el factor CAMP. Sin embargo, se conoce muy poco de sus funciones en la patogenicidad.

Se ha propuesto la utilización de determinantes de virulencia de Streptococcus como agentes inmunogénicos. Por ejemplo, se ha demostrado que el factor CAMP de S. uberis protege a organismos vertebrados frente a la infección por este microorganismo (Jiang, Patente estadounidense núm. 5 863 543).

El antígeno \gamma de la cepa A909 (núm. ATCC 27591) de estreptococos del grupo B es un componente del complejo marcador de la proteína C, que consta adicionalmente de una subunidad \alpha y una \beta (Boyle, Patente estadounidense núm. 5 721 339). Se ha descrito que subpoblaciones de los serotipos Ia, II y prácticamente todos los tipos celulares del subtipo Ib de los estroptococos del grupo B expresan componentes de la proteína C. Se ha propuesto la utilización de subunidades \gamma como agentes inmunogénicos frente a las infecciones por estreptococos del grupo B de Lancefield. No obstante, no se ha estudiado su uso en la prevención y el tratamiento de infecciones en animales, entre ellas la mastitis en el ganado vacuno.

Se considera a la proteína M de los estreptococos del grupo A como uno de los factores de virulencia principales de este microorganismo debido a su capacidad para impedir el ataque de los fagocitos humanos (Lancefield, R.C. [1962] J. Immunol. 89:307-313). Las bacterias persisten en el tejido infectado hasta que se producen los anticuerpos frente a la molécula M. Los anticuerpos específicos para la proteína M son capaces de revertir el efecto antifagocítico de la molécula y permiten la eliminación del microorganismo invasor.

Las proteínas M son uno de los factores de virulencia clave de Streptococcus pyogenes, debido al papel que desempeñan interviniendo en la resistencia a la fagocitosis (Kehoe, M.A. [1991] Vaccine 9:797-806) y a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias dañinas del huésped a través de su superantigenicidad y su capacidad para inducir reacciones cruzadas entre anticuerpos (Bisno, A.L. [1991] New Engl. J. Med. 325:783-793; Froude et al. [1989] Curr. Top. Microbiol. Immunol. 145:5-26; Stollerman, G.H. [1991] Clin. Immunol. Immunopathol. 61:131-142).

Sin embargo, existen obstáculos en la utilización como vacunas de las proteínas M intactas. Los epítopos opsónicos de la proteína son extremadamente específicos por lo que confieren una protección específica muy acotada. Además, algunas proteínas M contienen epítopos que provocan una reacción cruzada con tejidos del individuo inmunizado, conduciendo a una respuesta autoinmunitaria dañina (Véanse p. ej., Dale, J.L. y Beached, G.H. [1982] J. Exp. Med. 156:1165-1176; Dale, J.L. y Beached, G.H. [1985] J. Exp. Med. 161:113-122; Baird, R.W., Bronze, M.S., Drabs, W., Hill, H.R., Veasey, L.G. y Dale, J.L. [1991] J. Immun. 146:3132-3137; Bronze, M.S. y Dale, J.L. [1993] J. Immun. 151:2820-2328; Cunningham, M.W. y Russell, S.M. [1983] Infect. Immun. 42:531-538).

Se han expresado proteínas quiméricas que contienen tres dominios diferentes de unión a fibronectina derivados de las proteínas de unión a fibronectina de S. dysgalactiae y Staphylococcus aureus en la superficie de células de Staph. carnosus. En el caso de una de esas proteínas, las inmunizaciones intranasales con células vivas de Staph. carnosus recombinantes que expresaban la proteína quimérica en su superficie resultaron en una mejora de la respuesta de anticuerpos frente a un inmunógeno modelo presente en la proteína quimérica de superficie.

Con anterioridad se ha identificado y caracterizado una proteína GapC de unión a plasmina de una cepa del grupo A de Streptococcus y se ha descrito su utilización en tratamientos trombolíticos (Boyle, et al., Patente estadounidense núm. 5 237 050; Boyle, et al., Patente estadounidense núm. 5 328 996).

Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado ni la capacidad protectora de GapC ni se han aislado ni caracterizado las proteínas GapC de Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus parauberis o Streptococcus iniae.

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Resumen de la invención

Por consiguiente, la presente invención proporciona un uso novedoso de la proteína GapC en la fabricación de la composición de una vacuna útil para el tratamiento y la prevención de la mastitis en mamíferos; en este proceso la proteína GapC se selecciona a partir del siguiente grupo:

(a) Una proteína GapC aislada de Streptococcus dysgalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de similitud con la misma.

(b) Una proteína GapC aislada de Streptococcus agalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC. núm.: 6) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de similitud con la misma.

(c) Una proteína GapC aislada de Streptococcus uberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC. núm.: 8) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de similitud con la misma.

(d) Una proteína GapC aislada de Streptococcus parauberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC. núm.: 10) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de similitud con la misma.

(e) Una proteína GapC aislada de Streptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.: 12).

En otra realización, la invención se refiere a la utilización de un polinucleótido que consta de una secuencia de la proteína GapC para la fabricación de la composición de una vacuna útil para el tratamiento y la prevención de mastitis en mamíferos; en la que la proteína GapC se selecciona a partir del siguiente grupo:

(e) Una proteína GapC aislada de Streptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.: 12) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de similitud con la misma.

Además la composición de la vacuna debe contener un adyuvante.

Descripción breve de las figuras

Las Figuras 1A-1B muestran las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC de S. dysgalactiae (ID. de SEC. núm.: 3 e ID. de SEC. núm.: 4).

Las Figuras 2A-2B muestran las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC de S. agalactiae (ID. de SEC. núm.: 5 e ID. de SEC. núm.: 6).

Las Figuras 3A-3B muestran las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC de S. uberis (ID. de SEC. núm.: 7 e ID. de SEC. núm.: 8).

Las Figuras 4A-4B muestran las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC de S. parauberis (ID. de SEC. núm.: 9 e ID. de SEC. núm.: 10).

Las Figuras 5A-5B muestran las secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos deducidas del gen gapC de S. iniae (ID. de SEC. núm.: 11 e ID. de SEC. núm.: 12).

Las Figuras 6A-6E muestran una alineación de DNA creada por PileUp y mostrada por Pretty software (un componente del GCG Wisconsin Package, versión 10, suministrado por el paquete de análisis de secuencias SeqWeb, versión 1.1, de la Canadian Bioinformatics Resource). La figura muestra las secuencias de nucleótidos aisladas de los genes gapC de S. dysgalactiae (DysGapC, Check 9344), S. agalactiae (AgalGapC, Check 2895), S. uberis (UberGapC, Check 5966), S. parauberis (PUberGapC, Check 9672) y S. iniae (IniaeGapC, Check 990). También se incluyen las secuencias previamente conocidas de S. equisimilis (SeqGapC, Check 5841), S. pyogenes (SpyGapC, Check 4037) y una proteína GAPDH bovina (BovGapC, check 5059). Los parámetros de longitud y peso y son los mismos para todas las secuencias (1018 y 1,00; respectivamente). Los parámetros utilizados para la comparación de secuencias de DNA fueron los siguientes: Plurality-2,00; Threshold-1; AveWeight-1,00; AveMatch-1,00; AvMisMatch-0,00; Symbol comparison table-pileupdna.cmp; CompCheck-6876; GapWeight-5; GapLengthWeight-1; PileUp MSF-10l8; Type-N; Check-3804. En la figura, las rayas representan nucleótidos idénticos; los puntos representan gaps introducidos por el software utilizado para generar el diagrama de alineación; y las tildes (\sim) representan regiones no incluidas en la alineación total debido a diferencias en la longitud de la secuencia génica.

Las Figuras 7A-7B muestran una alineación de una secuencia de aminoácidos creada por PileUp y mostrada por Pretty (igual que la Figura anterior) que muestran las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las proteínas GapC de S. dysgalactiae (DysGapC, Check 6731) , S. agalactiae (AgalGapC, Check 1229), S. uberis (UberGapC, Check 8229), S. parauberis (PUberGapC, Check 8889) y S. iniae (IniaeGapC, check 8785). También se incluyen las secuencias ya conocidas de S. equisimilis (SeqGapC, Check 8252), S. pyogenes (SpyGapC, Check 6626) y una proteína GAPDH bovina (BovGapC, Check 8479). En la figura, las rayas representan residuos idénticos de aminoácidos; los puntos representan gaps introducidos por el software PileUp; y las tildes (\sim) representan regiones no incluidas en la alineación total debido a diferencias en la longitud de las secuencias génicas.

La Figura 8 muestra los diagramas de hidropatía en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini, diagramas de flexibilidad de la cadena de Karplus-Schulz, diagramas del índice de antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la estructura secundaria Chou-Fasman y Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada de S. dysgalactiae.

La Figura 9 muestra los diagramas de hidropatía en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini, diagramas de flexibilidad de la cadena de Karplus-Schulz, diagramas del índice de antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la estructura secundaria Chou-Fasman y Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada de S. agalactiae.

La Figura 10 muestra los diagramas de hidropatía en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini, diagramas de flexibilidad de la cadena de Karplus-Schulz, diagramas del índice de antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la estructura secundaria Chou-Fasman y Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada de S. uberis.

La Figura 11 muestra los diagramas de hidropatía en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini, diagramas de flexibilidad de la cadena de Karplus-Schulz, diagramas del índice de antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la estructura secundaria Chou-Fasman y Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada de S. parauberis.

La Figura 12 muestra los diagramas de hidropatía en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini, diagramas de flexibilidad de la cadena de Karplus-Schulz, diagramas del índice de antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la estructura secundaria Chou-Fasman y Garnier-Osguthorpe-Robson para la proteína GapC aislada de S. iniae.

La Figura 13 es una representación gráfica de los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria para la proteína GapC aislada de S. dysgal.

La Figura 14 es una representación gráfica de los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria para la proteína GapC aislada de S. agalactiae.

La Figura 15 es una representación gráfica de los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria para la proteína GapC aislada de S. uberis.

La Figura 16 es una representación gráfica de los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria para la proteína GapC aislada de S. parauberis.

La Figura 17 es una representación gráfica de los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria para la proteína GapC aislada de S. iniae.

La Figura 18 muestra los resultados de una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de la proteína GapC recombinante de S. dysgalactiae producida en E. coli DE3. Carril 1, marcador de peso molecular (20,5 - 103 kDa; BioRad, Emeryville, CA); carril 2, proteína GapC recombinante soluble de S. dysgalactiae purificada por cromatografía de afinidad en Ni-NTA. Los números a la izquierda de la figura indican las posiciones de los marcadores de peso molecular (en KDa).

La Figura 19 es un histograma que compara la actividad enzimática de: la plasmina bovina unida a células intactas de S. dysgalactiae, la plasmina bovina unida a proteína GapC recombinante de S. dysgalactiae purificada por cromatografía de afinidad y de células de S. dysgalactiae intactas, proteína GapC recombinante de S. dysgalactiae purificada por cromatografía de afinidad y plasmina bovina, las tres por separado. La actividad enzimática se midió mediante los aumentos de absorbancia a 405 nm tras la liberación de paranitroanilida de su sustrato sintético Chromozym-PL (Roche Diagnostics, Laval, Quebec, Canadá). Los resultados representan la media de tres ensayos independientes.

En la Figura 20 se comparan los cambios en el porcentaje de cuartos de las ubres infectados por S. dysgalactiae durante un periodo de siete días en tres grupos experimentales: (1) animales control sin vacunar; (2) animales vacunados con proteína Mig de unión a Fc; y (3) animales vacunados con GapC. La infección se definió como la aparición de >500 ufc de S. dysgalactiae por ml en la leche secretada.

La Figura 21 representa el número máximo de S. dysgalactiae en cualquier cuarto de ubre frente a la titulación de anticuerpos anti-GapC séricos (expresada como el recíproco a la dilución que muestra actividad por encima de los niveles basales). Los títulos de anti-GapC se correlacionaron con el número máximo de ufc recuperadas de las glándulas mamarias r^{2}=0,74, calculado con la aplicación informática GraphPadPrism, v. 2.01, de GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

La Figura 22 representa el número acumulado de cuartos mamarios afectados frente a la titulación de anticuerpos (de nuevo expresada como el recíproco a la dilución que muestra actividad por encima de los niveles basales). Se observó una correlación muy buena entre los niveles de anticuerpos séricos anti-GapC y el número total de cuartos infectados.

La Figura 23 ilustra la presencia de bacterias en animales inmunizados con GapC; cada punto representa el número medio de bacterias presentes por ml de leche respecto al tiempo (en días tras la provocación). En la Figura 20, los diamantes (-\blacklozenge-) representan los animales no vacunados; los cuadrados (-\blacksquare-) representan los animales con un título bajo (es decir, los animales que muestran la peor respuesta frente a GapC en función de su título de anticuerpos), y los triángulos (-\Delta-) representan los animales con un título elevado (es decir, el resto de animales).

La Figura 24 muestra la presencia de S. dysgalactiae en animales inmunizados con GapC, representados como el porcentaje de cuartos mamarios infectados frente al tiempo en días tras la provocación. En la figura, las barras punteadas representan los animales no vacunados; las barras con rayas diagonales representan los animales con títulos bajos (es decir, los animales que muestran la peor respuesta frente a GapC en función de su título de anticuerpos); y las barras blancas representan los animales con títulos elevados (es decir, el resto de animales).

La Figura 25 muestra las respuestas inflamatorias observadas causadas por la infección con S. dysgalactiae, representadas como los recuentos medios de células somáticas (RCS) para cada grupo experimental frente al tiempo en días tras la provocación. En la figura, los diamantes (-\blacklozenge-) representan los cuartos sin vacuna ni provocación; los cuadrados (-\blacksquare-) representan animales no vacunados a los que se ha realizado una provocación; los triángulos (-\Delta-) representan los animales vacunados con Mig y sometidos a provocación; y las x (-X-) representan los animales vacunados con GapC y sometidos a provocación.

La Figura 26 ilustra los recuentos de células somáticas por cuarto en el día 1 tras la provocación. En la figura, la barra representa la media para cada grupo. Los cuadrados representan (-\blacksquare-) los animales no vacunados; los triángulos representan (-\ding{115}-) los animales vacunados con GapC; y los triángulos invertidos (-\ding{116}-) los animales vacunados con Mig.

La Figura 27 muestra los recuentos de células somáticas de animales con títulos elevados no vacunados, sin provocación e inmunizados con GapC (es decir, los cuatro animales que presentaron los títulos de anticuerpos más elevados de los ocho animales de cada grupo) durante un periodo de siete días tras la provocación, representado como el log_{10} de los recuentos medios de células somáticas por ml de leche respecto al tiempo en días tras la provocación. los diamantes (-\blacklozenge-) representan los animales sin vacuna ni provocación; los cuadrados (-\blacksquare-) representan los animales no vacunados a los que se ha realizado una provocación; los triángulos (-\Delta-) representan los animales vacunados con GapC y sometidos a provocación.

Descripción detallada de la invención

La puesta en práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología del DNA recombinante e inmunología, que se encuentran entre las técnicas de cada campo. Dichas técnicas se encuentran ampliamente descritas en la literatura. Véanse, p. ej., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II y III, Segunda edición (1989); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); las series, Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).

A lo largo de todo el texto se utilizarán las siguientes abreviaciones de los aminoácidos:

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Alanina: Ala (A)	Arginina: Arg (R)
Asparagina: Asn (N)	Ácido Aspártico: Asp (D)
Cisteína: Cys (C)	Glutamina: Gln (Q)
Ácido Glutámico: Glu (E)	Glicina: Gly (G)
Histidina: His (H)	Isoleucina: Ile (1)
Leucina: Leu (L)	Lisina: Lys (K)
Metionina: Met (M)	Fenilalanina: Phe (F)
Prolina: Pro (P)	Serina: Ser (S)
Treonina: Thr (T)	Triptófano: Trp (W)
Tirosina: Tyr (Y)	Valina: Val (V)

1. Definiciones

En la descripción de la presente invención, se utilizarán los siguientes términos que se definen como se indica más adelante.

Cabe destacar que, tal como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un/una" y "él/la" incluyen referentes plurales a menos que se especifique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a la "proteína GapC de Streptococcus" incluye una mezcla formada por dos o más de dichas proteínas, etcétera.

Los términos "proteína GapC" y "proteína GapC de unión a plasmina" (que se utilizan de forma intercambiable en este documento) o una secuencia de nucleótidos que codifica la misma, se refieren a una proteína o secuencia de nucleótidos, respectivamente, que derivan del gen GapC presente en una variedad de especies de Streptococcus, que incluyen, sin limitación, ciertas cepas de los estreptococos del grupo A (Lottenbery, R., et al. [1987] Infect. Immun. 55:1914-1918). En las figuras se muestra la secuencia de nucleótidos de los genes gapC representativos de Streptococcus y las correspondientes secuencias de aminoácidos de las proteínas GapC que codifican esos genes. En particular, las figuras de la 1 a la 5 muestran las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos aisladas de S. dysgalactiae (ID. de SEC. núm.: 3 e ID. de SEC. núm.: 4, respectivamente), S. agalactiae (ID. de SEC. núm.: 5 e ID. de SEC. núm.: 6, respectivamente), S. uberis (ID. de SEC. núm.: 7 e ID. de SEC. núm.: 8, respectivamente), S. parauberis (ID. de SEC. núm.: 9 e ID. de SEC. núm.: 10, respectivamente) y S. iniae (ID. de SEC. núm.: 11 e ID. de SEC. núm.: 12, respectivamente). No obstante, una proteína GapC tal como se describe en este documento no se limita a las secuencias mostradas, ya que se conocen subtipos de cada una de esas especies de Streptococcus y existirán variaciones entre ellas.

Se encuentran genes gapC representativos, derivados de S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis y S. parauberis, en los plásmidos pETl5bgapC (núm. ATCC), pMF52lc (núm. ATCC), pMF52la (núm. ATCC), pMF52ld (núm. ATCC) y pMF52le (núm. ATCC), respectivamente.

Además, las secuencias proteicas o nucleotídicas derivadas no tienen que proceder necesariamente del gen descrito anteriormente, sino que pueden producirse mediante cualquier otro método como, p. ej., síntesis química, aislamiento (p. ej. de S. dysgalactiae) o por producción en sistemas recombinantes, basados en la información que se presenta en este documento. Además, el término está destinado a proteínas que poseen secuencias de aminoácidos con una homología sustancial (como se define posteriormente) respecto a las secuencias de aminoácidos contiguas codificadas por los genes que proporcionan actividad inmunológica o de unión a plasmina.

Así, los términos están destinados tanto a secuencias completas como a secuencias parciales, truncadas e inmunogénicas; así como a las formas precursoras y los análogos activos de la proteína. También se incluyen en el término fragmentos nucleotídicos del gen que poseen, como mínimo, alrededor de ocho pares de bases contiguas; se prefiere más un mínimo de entre 10 y 20; y, aún más, un mínimo de entre 25 y 50 (o más) pares de bases contiguas del gen, o cualquier entero entre esos valores. Dichos fragmentos son útiles como sondas en los métodos de diagnóstico que se comentarán en detalle más adelante.

Los términos también incluyen aquellas formas que poseen, así como las que no, una secuencia señal si es que esta está presente, además de las secuencias de ácidos nucleicos que la codifican. Además, el término está destinado a las formas proteicas de GapC que no presentan una región de anclaje a la membrana y a las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas con dichas deleciones. Estas deleciones pueden ser apropiadas en sistemas que no permiten la secreción de la proteína. Además, los dominios de unión a plasmina de la proteína pueden estar presentes o no estarlo. Así, por ejemplo, si la proteína GapC de unión a plasmina se usa para purificar plasmina, generalmente se conservará el dominio de unión a plasmina. Si la proteína se utiliza en las composiciones de vacunas, estarán presentes los epítopos inmunogénicos, que pueden incluir los dominios de unión a plasmina o no incluirlos.

Los términos también incluyen proteínas en su forma neutra o en su forma de sales de adición ácidas y básicas dependiendo del modo de preparación. Dichas sales de adición ácidas pueden formarse con grupos amino y dichas sales básicas con carboxilos libres. Más adelante se comentarán en detalle las sales de adición ácidas y básicas farmacéuticamente aceptables. Además, las proteínas se pueden modificar mediante la combinación con otros materiales biológicos, como lípidos (tanto los que aparecen de forma natural con la molécula como otros lípidos que no destruyen la respuesta inmunitaria) y polisacáridos; o mediante modificación de las cadenas laterales, como la acetilación de grupos amino, la fosforilación de cadenas laterales hidroxilo, la oxidación de grupos sulfhidrilo, la glicosilación de residuos de aminoácidos, así como otras modificaciones de la secuencia primaria codificada.

El término, por tanto, está destinado a deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre y cuando el polipéptido sea capaz de producir una respuesta inmunitaria tal como se define en este documento. En ese sentido, las sustituciones que se prefieren especialmente serán, en general, de naturaleza conservadora, es decir, dichas sustituciones tendrán lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos -glutamato y aspartato; (2) básicos -lisina, arginina e histidina; (3) apolares -alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triftófano; y (4) apolares sin carga -glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina y tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican, a veces, como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonable predecir que el remplazo aislado de leucina por isoleucina o valina, y viceversa; un aspartato por glutamato, y viceversa; una treonina por una serina, y viceversa; o un remplazo conservador similar de un aminoácido por otro aminoácido estructuralmente relacionado, no suponga un efecto importante en la actividad biológica. Por tanto, las proteínas que poseen una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones sin importancia de aminoácidos que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad o la afinidad de la proteína para unirse a plasmina, se encuentran dentro de la definición del polipéptido de referencia.

Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta un máximo de entre 5 y 10 sustituciones conservadoras o no conservadoras de aminoácidos, o incluso hasta un máximo de entre 15 y 25 o 20 y 50 sustituciones conservadoras o no conservadoras, o cualquier número entero entre esos valores, siempre y cuando la función de la molécula se mantenga intacta.

En ese sentido, las proteínas GapC aisladas de estreptococos muestran varias regiones variables en sus secuencias de aminoácidos, localizadas en las posiciones de la 62 a la 81; de la 102 a la 112; de la 165 a la 172; de la 248 a la 271; y de la 286 a la 305.

Estas regiones, que en S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae muestran sustituciones en los aminoácidos del 1 al 9, son susceptibles de presentar variación sin que afecte sustancialmente a la función enzimática o inmunogénica.

Asimismo, las sustituciones que suceden en el dominio de unión transmembrana, si está presente, y en la secuencia señal, si está presente, normalmente no afectan a la inmunogenicidad. Un experto en la materia puede determinar fácilmente otras regiones de la molécula de interés que puedan tolerar cambios en referencia a la estructura de la proteína mostrada en las figuras de la 8 a la 17 presentes en este documento.

El término "proteína GapC estreptocócica" está destinado a proteínas de unión a plasmina, tal como se ha definido anteriormente, que derivan de especies de estreptococos que producen la misma. Entre ellas, aunque no están limitadas a las mismas, se encuentran las siguientes especies: S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae. Por ejemplo, una "proteína GapC de S. dysgalactiae" es una proteína GapC de unión a plasmina, tal como se ha definido anteriormente, que deriva de S. dysgalactiae. Asimismo, una "proteína GapC de S. agalactiae" se refiere a una proteína de unión GapC que deriva de S. agalactiae.

Los términos proteínas "salvajes" o "nativas" se refieren a proteínas o polipéptidos aislados de la fuente en la cual las proteínas aparecen de forma natural. Los polipéptidos "recombinantes" son aquellos polipéptidos producidos mediante técnicas del DNA recombinante; es decir, producidas a partir de células transformadas por un constructo de DNA exógeno que codifica el polipéptido deseado. Los polipéptidos "sintéticos" son aquellos que se preparan mediante síntesis química.

El término proteína o polipéptido "aislado" se refiere a una molécula de proteína o polipéptido que está separada y diferenciada del organismo completo en el que se encuentra la molécula de forma natural; o una proteína o polipéptido desprovisto, total o parcialmente, de secuencias normalmente asociadas con él de forma natural; o una secuencia en su forma natural, pero que posee secuencias heterólogas (tal como se definen más adelante) en asociación con ella.

El término "funcionalmente equivalente" se refiere a una secuencia de aminoácidos de una proteína GapC de unión a plasmina que desencadena una respuesta inmunitaria sustancialmente equivalente o mejorada, como se ha definido anteriormente, comparada con la respuesta desencadenada por la proteína GapC de unión a plasmina que sea igual a la proteína GapC de unión a plasmina de referencia o una porción inmunogénica de la misma.

El término "epítopo" se refiere al lugar del antígeno o hapteno al cual los linfocitos B o T específicos responden. El término también es intercambiable por "determinante antigénico" o "sitio antigénico". Se pueden identificar los anticuerpos que se unen al mismo epítopo a través de un inmunoensayo que tenga la capacidad de que un anticuerpo bloquee la unión de otro anticuerpo mediante su unión a un antígeno diana.

El término proteína o polipéptido "inmunogénico" se refiere a una secuencia de aminoácidos que desencadena una respuesta inmunológica tal como se ha descrito anteriormente. Una proteína o un polipéptido "inmunogénico", tal como se usan en el presente documento, incluyen la secuencia completa de la proteína GapC de unión a plasmina en cuestión con cualquiera o ninguno de la secuencia señal, el dominio de unión a membrana, el dominio de unión a plasmina y análogos o fragmentos inmunogénicos de los mismos. El término "fragmento inmunogénico" se refiere a un fragmento de la proteína GapC de unión a plasmina que incluye uno o más epítopos y, así, desencadena la respuesta inmunitaria descrita anteriormente. Se pueden identificar dichos fragmentos utilizando diferentes técnicas muy conocidas en el campo para mapear epítopos. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Monis, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, se pueden determinar los epítopos lineales mediante, p. ej., la síntesis simultánea de un gran número de péptidos en soportes sólidos, siendo péptidos que corresponden a porciones de la molécula proteica, y haciendo reaccionar dichos péptidos con los anticuerpos mientras los primeros se encuentran todavía unidos al soporte. Dichas técnicas se conocen en el campo y están descritas en, p. ej., la Patente estadounidense núm. 4 708 871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De forma similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente a través de la determinación de la conformación espacial de los aminoácidos mediante, p. ej., la cristalografía de rayos X o la resonancia magnética nuclear en dos dimensiones. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols, supra. También se pueden identificar regiones antigénicas de las proteínas utilizando diagramas estándar de antigenicidad e hidropatía, calculados con, p. ej., el programa Omiga versión 1.0 disponible en Oxford Molecular Group. Esta aplicación informática utiliza el método Hopp/Woods (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA [1981] 78:3824-3828) para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica Kyte-Doolittle (Kyte et al, J. Mol. Biol. [1982] 157:105-132) para los diagramas de hidropatía. Las figuras de la 8 a la 12 presentes en este documento muestran los perfiles Kyte-Doolittle de las proteínas representativas incluidas en la invención.

Para los objetivos de la presente invención, los fragmentos inmunogénicos incluirán de forma general al menos tres aminoácidos, preferentemente al menos cinco aminoácidos, más preferentemente un mínimo aproximado de entre 10 y 15 aminoácidos, y, aún más preferentemente, 25 o más aminoácidos de la molécula correspondiente a la proteína parental GapC de unión a plasmina. No existe un límite superior crítico en la longitud del fragmento, que puede comprender cerca de toda la secuencia de la proteína o incluso ser una proteína de fusión que conste de dos o más epítopos de GapC.

Una "composición inmunogénica" es una composición que consta de una molécula antigénica que cuando se administra a un sujeto provoca el desarrollo en dicho sujeto de una respuesta inmunitaria humoral o celular a la molécula antigénica de interés.

El término "composición con subunidades de la vacuna" se refiere a una composición que contiene al menos un polipéptido inmunogénico, pero no todos los antígenos, derivado de un antígeno o de un análogo procedente del patógeno de interés. Dicha composición se encuentra sustancialmente libre de células o partículas intactas del patógeno, o del lisado de dichas células o partículas. Así, una "composición con subunidades de la vacuna" se prepara a partir de polipéptidos purificados al menos parcialmente (de forma preferente, purificados en su totalidad) del patógeno o de análogos recombinantes del mismo. Una composición con subunidades de la vacuna puede contener la subunidad antigénica o los antígenos de interés sustancialmente libres de otros antígenos o polipéptidos del patógeno.

Se entiende por "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" un material que no es biológicamente, ni de ningún otro modo, no deseado; es decir, el material debe administrarse a un individuo en una formulación o composición que no cause ningún efecto biológico no deseado y que no interaccione de una manera dañina con cualquiera de los componentes de la composición que lo contiene.

Una "respuesta inmunitaria" a una composición o vacuna se refiere al desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria celular y mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Generalmente, una "respuesta inmunitaria" incluye uno o más de los siguientes efectos, aunque no está limitada a ellos: producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T colaboradores, linfocitos T supresores y linfocitos T citotóxicos o linfocitos T \gamma\delta; dirigidos específicamente al antígeno o antígenos presentes en la composición de la vacuna de interés. Preferentemente, el huésped desencadenará una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica de modo que se mejorará la resistencia de la glándula mamaria a una nueva infección o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará tanto por la reducción como por la falta de los síntomas que aparecen normalmente en el huésped infectado o mediante una reducción del tiempo necesario para la recuperación.

La "inmunización por ácidos nucleicos" se refiere a la introducción en una célula huésped de una molécula de ácidos nucleicos que codifica uno o más antígenos seleccionados para la expresión in vivo de un antígeno, antígenos, un epítopo o epítopos. La molécula de ácidos nucleicos se puede introducir directamente en el sujeto mediante inyección, inhalación; mediante administración por vía oral, intranasal, mucosal o similar; o puede introducirse ex vivo, en las células que han sido extraídas del huésped. En el último caso, las células transformadas se reintroducen en el sujeto en el que puede desencadenarse una respuesta inmunitaria frente al antígeno codificado en la molécula de ácidos nucleicos.

El término "tratamiento", tal como se usa en este documento, se refiere tanto a la prevención de la infección o de la reinfección (profilaxis), como a la reducción o eliminación de los síntomas de la enfermedad de interés (tratamiento).

El término "mastitis" se refiere a la inflamación de las glándulas mamarias de mamíferos, incluyendo vacas, ovejas, cabras, cerdas, yeguas y similares, causada por la presencia de S. uberis. La infección se manifiesta por la infiltración de células fagocíticas en la glándula. Generalmente, se reconocen cuatro tipos clínicos distintos de mastitis: (1) sobreaguda, asociada con edema, calor, dolor, secreción anormal de la glándula acompañada de fiebre y otros signos de alteración sistémica, como depresión notable, pulso rápido y débil, ojos hundidos, debilidad y anorexia completa; (2) aguda, con cambios en la glándula similares a los descritos anteriormente pero con fiebre, anorexia y depresión entre leve y moderada; (3) subaguda, no se producen cambios sistémicos y los cambios en la glándula y en su secreción son menos marcados; y (4) subclínica, la reacción inflamatoria se detecta únicamente mediante pruebas estándar para la mastitis.

Entre las pruebas estándar para la detección de mastitis se encuentran las siguientes, aunque no se limitan a ellas: el ensayo de California para la detección de mastitis, el ensayo Wisconsin para la detección de mastitis, el ensayo Nagase, el recuento electrónico de células y el recuento de células somáticas utilizados para detectar la persistencia de un contenido elevado de leucocitos en la leche. En general, un recuento de células somáticas de alrededor de entre 300.000 y 500.000 células por ml, o superior, en la leche es indicativo de la presencia de infección. Así, una vacuna se considera efectiva en el tratamiento o la prevención de mastitis cuando, p. ej., el recuento de células somáticas en la leche se mantiene por debajo de 500.000 células por ml. Para una discusión de la mastitis y del diagnóstico de la misma véase, p. ej., The Merck Veterinary Manual: A Handbook of Diagnosis, Therapy, and Disease Prevention and Control for the Veterinarian, Merck and Co., Rahway, New Jersey, 1991.

Los términos "vertebrado", "sujeto" o "sujeto vertebrado" se refieren a cualquier miembro del subfilum de los cordados e incluyen, sin limitación alguna, los siguientes: mamíferos, como vacas, ovejas, cerdos, cabras, caballos, humanos y animales domésticos como perros y gatos; aves, incluyendo las domésticas, las salvajes y las de caza, como gallos, gallinas, patos, pavos y otras aves gallináceas; y peces. El término no denota ninguna edad en particular. Así, se pretende abarcar tanto animales adultos como recién nacidos, así como a fetos.

Una molécula de "ácidos nucleicos" puede incluir, aunque no se limita a ello, lo siguiente: secuencias procarióticas, mRNA eucariótico, cDNA procedente de mRNA eucariótic, secuencias genómicas de DNA eucariótico (p.ej. de mamíferos) o, incluso, secuencias sintéticas de DNA. El término también incluye secuencias que consten de cualquiera de los análogos de bases de DNA o RNA.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleido separada y diferenciada del microorganismo completo en el que se encuentra de forma natural; o un ácido nucleico desprovisto total o parcialmente de las secuencias asociadas normalmente a él de forma natural; o a una secuencia en la forma que existe en la naturaleza, pero que posee secuencias heterólogas (tal como se definirán más adelante) en asociación a ella. El término "aislado" aplicado a los polinucleótidos se refiere a que el polinucleótido se aísla del cromosoma al que se asocia normalmente y se aísla de la secuencia genómica completa en la que aparece normalmente.

Un "polinucleótido purificado" se refiere a un polinucleótido de interés o a un fragmento del mismo que se encuentra esencialmente libre, es decir, contiene menos de alrededor de un 50%, preferentemente menos de alrededor de un 70% y más preferentemente menos de alrededor de un 90% de la proteína a la cual se asocia de forma natural dicho polinucleótido. Las técnicas de purificación de polinucleótidos de interés se conocen ampliamente en el campo e incluyen, por ejemplo, la lisis de la célula que contiene el polinucleótido con un agente caotrópico, y la separación del polinucleótido, o polinucleótidos, y las proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y sedimentación en función de la densidad.

Una "secuencia codificante" o una "secuencia de nucleótidos codificante" de una proteína en particular es una secuencia de nucleótidos que se transcribe y traduce in vivo en un polipéptido cuando se encuentra bajo los elementos reguladores apropiados. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5’ amino terminal y un codón de finalización en el extremo 3’ carboxi terminal. Las secuencias codificantes pueden, entre otros, ser: secuencias procarióticas, cDNA procedente de mRNA eucariótico, secuencias genómicas de DNA eucariótico (p. ej. de mamíferos) o, incluso, secuencias sintéticas de DNA. Una secuencia de finalización de la transcripción se localiza normalmente en el extremo 3’ de la secuencia codificante. Una secuencia "complementaria" es aquella en la que cada base nitrogenada en una posición nucleotídica concreta es la complementaria a la base nitrogenada que aparece en la misma posición de la secuencia de referencia. Para ilustrar esto, la base complementaria de la adenosina es la timina y viceversa; de forma similar, la citosina es la complementaria de la guanina y viceversa. Por tanto, la secuencia complementaria de la secuencia de referencia 5'-ATGCTGA-3' sería 3'-TACGACT-5'.

Una secuencia "salvaje" o "nativa", tal como se utiliza en este documento, se refiere a secuencias codificantes de polipéptidos que fundamentalmente son, como se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, las secuencias que codifican la proteína GapC de S. dysgalactiae mostradas en las figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4).

El término "recombinante", utilizado aquí para describir moléculas de ácidos nucleicos, se refiere a un polinucleótido de origen genómico, de cDNA, semisintético o sintético, que por su origen o su manipulación: (1) no se asocia con el polinucleótido con el que se asocia en la naturaleza o con un fragmento del mismo; y (2) se une a un polinucleótido distinto al que se asocia de forma natural. El término "recombinante", referido a una proteína o polipéptido, significa un polipéptido producido mediante la expresión de un polinucleótido recombinante. "Células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y otros términos de ese tipo que denotan líneas celulares de microorganismos procariotas o células eucariotas como entidades unicelulares, se usan de manera intercambiable y se refiere a células que pueden ser, o han sido, utilizadas como receptoras de vectores recombinantes o de otras transferencias de DNA e incluyen la progenie de las células originales que han sido transfectadas. Se entiende que la progenie de una única célula parental no tiene porqué ser completamente idéntica en su morfología o en el contenido genómico o total a la célula parental original debido a mutaciones accidentales o deliberadas. En esta definición se incluye la progenie que es lo suficientemente similar a la célula parental para mostrar la propiedad relevante, como es la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido deseado, y se encuentra englobada en los términos definidos anteriormente.

El término "homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos dominios de polipéptido. Dos secuencias polipeptídicas o dos secuencias de DNA son "sustancialmente homólogas" entre ellas cuando muestran, al menos aproximadamente, entre el 80 y el 85%, preferentemente al menos aproximadamente un 90%, y más preferiblemente, al menos aproximadamente, entre el 95 y el 98% de similitud en la secuencia a lo largo de la longitud definida de las moléculas. Tal como se usa en este documento, sustancialmente homólogo también se refiere a las secuencias que muestran la identidad completa de la secuencia polipeptídica o de DNA especificada.

En general, el término "identidad" se refiere a la correspondencia exacta, aminoácido a aminoácido o nucleótido a nucleótido, de dos secuencias polipeptídicas o de DNA, respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar a través de la comparación directa de la información de las secuencias de dos moléculas mediante la alineación de estas secuencias, contando el número exacto de correspondencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100. Se pueden utilizar programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff Ed., 5 Supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489 para el análisis de péptidos. Hay programas para determinar la identidad de las secuencias de nucleótidos que están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI); por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Dichos programas son de fácil manejo con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package mencionado anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos respecto a una secuencia de referencia se puede determinar utilizando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por gap de seis posiciones nucleotídicas.

Otro método para el establecimiento del porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es la utilización del paquete informático MPSRCH, cuyos derechos de autor pertenecen a la Universidad de Edinburgo, que fue desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok y está distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Con estos paquetes se puede utilizar el algoritmo Smith-Waterman en el que los parámetros por defecto se utilizan para la tabla de puntuaciones (por ejemplo, penalización de 12 por apertura de gap, penalización de uno por extensión de gap y un gap de seis). De los datos generados el valor de "correspondencia" refleja la "identidad de la secuencia". Se conocen en el campo otros programas apropiados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias como, por ejemplo, BLAST, otro programa de alineación que se utiliza con parámetros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden utilizar empleando los siguientes parámetros por defecto: código genético estándar; sin filtros; hebras = las dos; punto de corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenado por = puntuación más elevada; Bases de datos = no redundantes; GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones de las CDS de GenBank + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles sobre estos programas se pueden encontrar en la siguiente dirección de Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

De manera alternativa, la homología se puede determinar mediante hibridación de polinucleótidos bajo condiciones en las que se forman moléculas bicatenarias entre regiones homólogas, seguida de la digestión con nucleasas específicas de regiones de cadena única y la determinación de la longitud de los fragmentos digeridos. Las secuencias de DNA que son sustancialmente homólogas se pueden identificar mediante un experimento de hibridación Southern bajo, p. ej., condiciones de astringencia tal como se definen para este sistema en particular. La definición de las condiciones apropiadas de hibridación se encuentra dentro de las habilidades del campo. Véase, p. ej., Sambrook et al, supra; DNA cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

El término "variante degenerada" se refiere a un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia de ácidos nucleicos del mismo, y que codifica un polipéptido que posee la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el polinucleótido del cual deriva la variante degenerada.

Las técnicas para determinar la "similitud" de la secuencia de aminoácidos se conocen bien en el campo. En general, "similitud" significa la comparación exacta aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en los lugares apropiados, donde los aminoácidos son idénticos o poseen propiedades físicas o químicas similares, como la carga o la hidrofobicidad. Así, se puede determinar lo que se denomina "porcentaje de similitud" entre las secuencias polipeptídicas comparadas. Las técnicas para determinar las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos también se conocen bien en el campo e incluyen la determinación de la secuencia nucleotídica de mRNA de ese gen (generalmente a través de un intermediario de cDNA) para determinar, de ese modo, la secuencia de aminoácidos codificada y comparar esta con una segunda secuencia de aminoácidos. En general, el término "identidad" se refiere a la correspondencia exacta, nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido, entre dos secuencias nucleotídicas o polipeptídicas, respectivamente.

Una región "heteróloga" de un constructo de DNA es un segmento identificable de DNA situado dentro de otra molécula de DNA, o unido a ella, que de forma natural no se encuentra en asociación con la otra molécula. Así, cuando la región heteróloga codifica un gen bacteriano, el gen generalmente está flanqueado por DNA que no flanquea ese gen bacteriano en el genoma de la bacteria de la que procede. Otro ejemplo de secuencia codificante heteróloga es un constructo donde la secuencia codificante en sí misma no se encuentra de forma natural (p. ej., secuencias sintéticas que poseen codones distintos a los del gen nativo). Las variantes alélicas o las mutaciones que ocurren de forma natural no ocasionan la aparición de regiones heterólogas de DNA, tal como se utilizan en este documento.

Un "vector" es un replicón, como un plásmido, un fago o un cósmido, al cual se une un segmento de DNA para provocar la replicación de ese segmento unido. Un vector es capaz de transferir secuencias génicas a células diana (p. ej., vectores del tipo plásmido bacteriano, vectores víricos, vectores no víricos, transportadores particulados y liposomas).

Típicamente, todos los términos siguientes: "constructo del vector", "vector de expresión", "vector de expresión génica", "vector de liberación de genes", "vector de transferencia génica" y "casete de expresión"; se refieren a un montaje que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia o gen de interés. Así, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores víricos.

Estos montajes constan de un promotor que se encuentra unido funcionalmente a las secuencias o genes de interés. Asimismo, pueden estar presentes otros elementos de control. Los casetes de expresión descritos en este documento pueden estar contenidos en un constructo plasmídico. Además de los componentes del casete de expresión, el constructo plasmídico también puede incluir un origen de replicación bacteriano, uno o más marcadores de selección, una señal que permita al constructo plasmídico existir como DNA monocatenario (p. ej., un origen de replicación M13), un lugar de clonación múltiple y un origen de replicación de "mamífero" (p. ej., un origen de replicación de un adenovirus o de SV40).

Los "elementos de control" del DNA se refieren, en conjunto, a promotores de la transcripción, elementos estimuladores de la transcripción, secuencias de finalización de la transcripción, secuencias de poliadenilación (localizadas en el extremo 3’ del codón de finalización de la traducción), secuencias para la optimización del inicio de la traducción (localizadas en el extremo 5’ de la secuencia codificante), secuencias de finalización de la traducción, dominios de regulación en 5’, sitios de unión de ribosomas y similares; que, en conjunto, permiten la transcripción y traducción de una secuencia codificante en la célula huésped. Véanse, p. ej., McCaughan et al. (1995) PNAS USA 92:5431-5435; o Kochetov et al. (1998) FEBS Letts. 440:351-355. No siempre son necesarias todas esas secuencias de control en el vector recombinante, siempre y cuando sea posible la transcripción y traducción del gen en cuestión.

El término "unido funcionalmente" se refiere a una disposición de los elementos de manera que los componentes así descritos están configurados para realizar sus funciones habituales. Así, los elementos de control unidos funcionalmente a una secuencia codificante son capaces de llevar a cabo la expresión de las secuencias codificantes. No es necesario que los elementos de control sean contiguos a la secuencia codificante, siempre y cuando dirijan la expresión de la misma. Así, por ejemplo, entre el promotor y la secuencia codificante pueden existir secuencias intermedias transcritas pero no traducidas, y el promotor todavía puede considerarse "funcionalmente unido" a la secuencia codificante. De forma similar, "los elementos de control compatibles con la expresión en un sujeto" son aquellos que son capaces de llevar a cabo la expresión de la secuencia codificante en dicho sujeto.

Un elemento de control, como un promotor, "dirige la transcripción" de una secuencia codificante en una célula cuando la RNA polimerasa se une al promotor y transcribe la secuencia codificante en un mRNA, que a su vez se traduce en la secuencia polipeptídica codificada en la secuencia codificante.

Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada, o es capaz de serlo, por una molécula exógena de ácidos nucleicos.

Una célula ha sido "transformada" por un DNA exógeno cuando dicho DNA exógeno se introduce dentro de la membrana celular. El DNA exógeno puede estar integrado (unido covalentemente) o no en el DNA cromosómico y formar parte del genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, se puede mantener el DNA exógeno en un elemento episómico como un plásmido. En cuanto a las células eucariotas, una célula transformada estable es aquella en la que el DNA exógeno se ha integrado en el cromosoma, de manera que las células hijas lo heredan a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de las células eucariotas de establecer líneas celulares o clones con una población de células hijas que contengan el DNA exógeno.

Tal como se utiliza en este documento, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o de fluido aislado de un sujeto, que incluye los siguientes elementos, aunque no se limita a ellos: sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, muestras de piel, secreciones externas de la piel, de las vías respiratorias, del tubo digestivo y del sistema genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro que incluyen, entre otros, los siguiente elementos: medio condicionado resultante del crecimiento celular y tisular en medio de cultivo, p. ej., células recombinantes y componentes celulares.

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Tal como se utiliza en este documento, el término "marcador" o "marcador detectable" se refiere a una molécula capaz de detectarse e incluye las siguientes, aunque sin estar limitado a las mismas: isotopos radiactivos, moléculas fluorescentes, moléculas quimioluminiscentes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, colorantes, iones metálicos, ligandos (p. ej., biotina o haptenos) y similares. El término "molécula fluorescente" se refiere a una sustancia o a una porción de la misma que es capaz de emitir fluorescencia en un rango detectable. Algunos ejemplos particulares de marcadores que pueden utilizarse en esta invención son la fluoresceína, la rodamina, el dansil, la umbeliferona, el rojo de Texas, el luminol, el NADPH y la \alpha-\beta-galactosidasa.

2. Modos de llevar a cabo la invención

Antes de describir la presente invención en detalle, cabe aclarar que esta invención no se limita a una formulación o unos parámetros de proceso particulares dado que los mismos pueden variar. También es importante aclarar que la terminología utilizada en este documento tiene el objetivo de describir únicamente las realizaciones particulares de la invención y no pretende ser limitante.

Aunque ya existen una serie de métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos que se pueden utilizar en la puesta en práctica de la presente invención, en este documento se describen los materiales y métodos preferidos.

Una cuestión muy importante en la presente invención es el descubrimiento de que la proteína GapC es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado. En particular, se han aislado, secuenciado y caracterizado los genes de la proteína GapC en S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae, y a partir de ellas se han deducido las secuencias proteicas de dichos genes. Las secuencias de DNA completas de dichos genes y sus correspondientes secuencias de aminoácidos se muestran en las Figuras de la 1 a la 5.

Tal como se describe en los ejemplos, el gen completo gapC de S. dysgalactiae, que se muestra en las posiciones de la 1 a la 1011, ambas inclusive, de las figuras 1A-1B, codifica la proteína completa GapC de S. dysgalactiae de 336 aminoácidos, mostrada como los aminoácidos del 1 al 336 de la misma figura. La proteína GapC de S. dysgalactiae tiene un peso molecular esperado de unos 36 kDa (calculado mediante el programa Peptide Sort del GCG Wisconsin Package, versión 10, suministrado con el paquete de análisis de secuencias SeqWeb, versión 1.1 de Canadian Bioinformatics Resource). De forma similar, los genes gapC aislados de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae se muestran en las Figuras de la 2 a la 5. Cada uno de ellos codifica una proteína GapC de 336 aminoácidos también con un peso molecular esperado de 36 kDa. Ninguna de las secuencias incluye un péptido señal o una región de anclaje a la membrana.

Las Figuras 6 y 7 presentan la alineación de secuencias de DNA o de aminoácidos, respectivamente, que muestra las regiones de homología y de variabilidad existentes entre las proteínas GapC de diferentes cepas de estreptococos. En particular, en las posiciones de los aminoácidos del 62 al 81, del 102 al 112, del 165 al 172, del 248 al 271 y del 286 al 305 se localizan diversas regiones variables. Dichas regiones variables son típicamente más susceptibles de cambio. Por tanto, es más probable que se toleren los cambios, como sustituciones, adiciones y deleciones, en los aminoácidos de estas regiones.

Las Figuras de la 8 a la 12 muestran los diagramas de las siguientes características para cada una de las proteínas GapC de la presente invención: hidropatía según la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una ventana de 7); probabilidad de superficie según Emini; flexibilidad de la cadena según Karplus-Schulz; índice de antigenicidad según Jameson-Wolf; estructura secundaria según Garnier-Osguthorpe-Robson; estructura secundaria según Chou-Fasman; y lugares de glicosilación esperados. Las figuras de la 13 a la 17 muestran los valores de estructura secundaria según Chou-Fasman para cada una de las proteínas GapC de la presente invención. Cualquier experto en la materia podrá utilizar fácilmente la información presentada en las Figuras de la 8 a la 17 para determinar las regiones inmunogénicas de la proteína con el fin de utilizarlas en la composición de vacunas.

La proteína GapC de unión a plasmina de S. dysgalactiae, fragmentos inmunogénicos de la misma o proteínas quiméricas que la incluyan, pueden suministrarse como composiciones de subunidades de vacuna. Además de su utilización en la composición de vacunas, las proteínas o los anticuerpos de estas pueden utilizarse como reactivos de diagnóstico para detectar la presencia de infección en un sujeto vertebrado. De forma similar, los genes que codifican las proteínas pueden clonarse y utilizarse para diseñar sondas que detecten y aíslen genes homólogos en otras cepas bacterianas. Por ejemplo, los fragmentos que constan de al menos entre 15 y 20 nucleótidos, más preferentemente al menos alrededor de 20 y 50 nucleótidos, y aún más preferentemente alrededor de 60 y 100 nucleótidos, o cualquier entero entre esos valores, podrán ser empleados en estas realizaciones.

Las composiciones de las vacunas de la presente invención se pueden utilizar para tratar o prevenir una amplia variedad de infecciones bacterianas en sujetos vertebrados. Por ejemplo, las composiciones de vacunas que contienen las proteínas GapC de unión a plasmina de S. dysgalactiae, S. uberis, S. parauberis, S. iniae o de los estreptococos del grupo B (SGB) como S. agalactiae, se pueden utilizar para tratar infecciones por estreptococos en sujetos vertebrados que estén causadas por estas u otras especies. En particular, S. uberis y S. agalactiae son patógenos bacterianos comunes asociados a la mastitis en bóvidos, équidos, óvidos y especies caprinas. Adicionalmente, se sabe que el grupo B de los estreptococos, como S. agalactiae, causan un gran número de otras infecciones en vertebrados como septicemia, meningitis, bacteriemia, impétigo, artritis, infecciones del aparato urinario, abscesos, aborto espontáneo, etc. Por tanto, las composiciones de vacunas que contienen proteínas GapC de unión a plasmina estreptocócicas serán útiles en el tratamiento y la prevención de una amplia variedad de infecciones estreptocócicas.

De forma similar, las proteínas GapC de unión a plasmina derivadas de otros géneros bacterianos como Staphylococcus, Mycobacterium, Escherichia, Pseudomonas, Nocardia, Pasteurella, Clostridium y Mycoplasma serán útiles para el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por especies que pertenecen a esos géneros. Así, resulta muy evidente que las proteínas GapC de unión a plasmina se pueden utilizar para tratar o prevenir una amplia variedad de infecciones bacterianas provocadas por numerosas especies.

Las proteínas GapC de unión a plasmina estreptocócicas de la presente invención se pueden utilizar en composiciones de vacunas de forma independiente o en combinación con otros antígenos bacterianos, fúngicos, víricos o de protozoos. Estos antígenos se pueden suministrar por separado o como proteínas de fusión que consten de uno o más epítopos de la proteína GapC de unión a plasmina fusionados con uno o más de dichos antígenos. Por ejemplo, otras proteínas inmunogénicas de S. uberis, como el factor CAMP, la cápsula de ácido hialurónico, la hialuronidasa, la proteína tipo R y el activador de plasminógeno, se pueden administrar con la proteína GapC. Adicionalmente, proteínas inmunogénicas de otros microorganismos implicados en la mastitis, como los del género Staphylococcus, Corynebacterium, Pseudomonas, Nocardia, Clostridium, Mycobacterium, Mycoplasma, Pasteurella, Prototheca, otros estreptococos, bacterias coliformes, así como levaduras, se pueden administrar junto con las proteínas GapC de unión a plasmina descritas en este documento para proporcionar un espectro amplio de protección. Así, por ejemplo, las proteínas inmunogénicas de Staphylococcus aureus, Str. agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. zooepidemicus, Corynebacterium pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Nocardia asteroides, Clostridiunm perfringens, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes y Klebsiella spp. se pueden suministrar junto con las proteínas GapC de unión a plasmina de la presente invención.

Adicionalmente, las proteínas GapC de diferentes especies estroptocócicas se pueden utilizar conjuntamente en composiciones de vacunas de la presente invención. En esta realización, las múltiples proteínas GapC se pueden suministrar como proteínas de fusión o como antígenos discretos, en la misma composición de vacuna o en otra diferente.

Producción de proteínas GapC de unión a plasmina

Las proteínas de unión a plasmina descritas anteriormente y sus fragmentos activos, proteínas análogas o quiméricas derivadas de las mismas, se pueden producir mediante una diversidad de métodos. En particular, las proteínas GapC de unión a plasmina se pueden aislar directamente de las bacterias que la expresan. Esto se consigue, generalmente, mediante la preparación, en primer lugar, de un extracto crudo que no presente componentes celulares ni varias proteínas foráneas. Las proteínas deseadas se pueden purificar posteriormente de la fracción del lisado celular mediante, p. ej., cromatografía en columna, HPLC, técnicas inmunosorbentes u otros métodos convencionales muy conocidos en el campo.

Más concretamente, se han descrito técnicas de aislamiento de proteínas GapC de unión a plasmina. Por ejemplo, la proteína GapC de S. pyogenes se purificó de un extracto celular crudo mediante precipitación con sulfato amónico seguido de dos ciclos de cromatografía a través de una columna Mono FPLC, y ciclos únicos a través de FPLC en superosa 12 y columnas TSK-fenol de HPLC (Pancholi, V. y Fischetti, VA [1992] J. Exptl. Med. 76:415-426). Existe otra técnica que implica la utilización de columnas de afinidad NAD^{+}-agarosa para purificar GapC de protoplastos lisados de la cepa 64/14 de S. pyogenes (Winram, SB y Lottenberg, R [1996] Microbiol. 142:2311-2320).

Alternativamente, las proteínas se pueden producir de forma recombinante como se describe en este documento. Tal como se ha explicado anteriormente, estos productos recombinantes pueden adoptar la forma de secuencias parciales de proteínas, secuencias completas, formas precursoras que incluyen secuencias señal, formas maduras sin secuencias señal, o incluso proteínas de fusión (p. ej., con una secuencia líder apropiada para el huésped recombinante o con secuencias de subunidades antigénicas de Streptococcus o de otro patógeno).

En una realización de la presente invención, las proteínas GapC se fusionan con una cola de histidina producida mediante métodos recombinantes y se purifican, entonces, de la fracción del lisado celular utilizando cromatografía de afinidad. Véase el Ejemplo 1A-E, infra.

Las proteínas GapC de unión a plasmina de la presente invención se pueden aislar, gracias a la capacidad del producto proteico de unirse a plasmina, mediante los ensayos de unión a plasmina descritos más adelante. Véase, p. ej., el método descrito en la sección F.3 del Ejemplo 1, infra. Así, se pueden construir genotecas y se pueden utilizar los clones resultantes para transformar a las células huésped apropiadas. Las colonias se pueden juntar y cribar para la búsqueda de clones que posean actividad de unión a plasmina. Las colonias también se pueden cribar utilizando sueros policlonales o anticuerpos monoclonales frente a la proteína de unión a plasmina.

Alternativamente, una vez que se han determinado las secuencias de aminoácidos, se pueden utilizar sondas de oligonucleótidos que contienen los codones de una porción de la secuencia de aminoácidos determinada para cribar genotecas de cDNA o genotecas de DNA genómico y buscar los genes de las proteínas en cuestión. Las estrategias básicas para la preparación de sondas de oligonucleótidos y genotecas, así como para su cribado mediante hibridación de ácidos nucleicos, son técnicas que los expertos en la materia conocen bien. Véanse, p. ej., DNA Cloning: Vol. 11, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Oligonucleotide Synthesis, supra; Sambrook et al., supra. Una vez que se ha identificado por hibridación positiva un clon de la biblioteca cribada, se puede confirmar que ese inserto en particular de la biblioteca contiene el gen de la proteína GapC de unión a plasmina o un homólogo del mismo mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación de DNA. Los genes pueden aislarse posteriormente utilizando técnicas estándar y, si se desea, técnicas de PCR o de enzimas de restricción utilizadas para eliminar porciones de la secuencia completa.

De forma similar, los genes se pueden aislar directamente de las bacterias utilizando técnicas conocidas, como la extracción con fenol, y posteriormente se puede manipular la secuencia para producir cualquier alteración deseada. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra, para una descripción de las técnicas utilizadas en el aislamiento de DNA.

De forma alternativa, las secuencias de DNA que codifican las proteínas de interés se pueden preparar sintéticamente en vez de clonarlas. Las secuencias de DNA se pueden diseñar con los codones apropiados para cada secuencia de aminoácidos en particular. En general, se seleccionan los codones preferidos para las células huésped si la secuencia va a ser utilizada para su expresión. La secuencia completa se compone de oligonucleótidos solapados preparados mediante métodos estándar y combinados para formar una secuencia codificante completa. Véanse, p. ej., Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; o Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Una vez que las secuencias codificantes para las proteínas deseadas se han preparado o aislado, pueden clonarse en cualquier vector o replicón apropiado. Los expertos en la materia conocen numerosos vectores de clonación y la selección de un vector de clonación apropiado es una cuestión de elección personal. Entre los ejemplos de vectores de DNA recombinante para la clonación, y de células huésped que estos pueden transformar, se encuentran los siguientes: bacteriófago \lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT23O (bacterias gramnegativas), pGV1106 (bacterias gramnegativas), pLAFR1 (bacterias gramnegativas), pME290 (bacterias gramnegativas que no son E. coli), phv14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de mamífero). Véanse, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; o B. Perbal, supra.

El gen se puede colocar bajo el control de un promotor, un lugar de unión a ribosomas (para la expresión en bacterias) y, opcionalmente, un operador (en este documento, todos en conjunto se refieren a elementos de "control"), de manera que la secuencia de DNA que codifica la proteína de interés se transcribe en un RNA en la célula huésped transformada por un vector que contiene esta construcción de expresión de proteínas. La secuencia codificante puede contener un péptido señal y una secuencia líder, o no contenerlos. Si se incluye una secuencia señal, esta puede ser la secuencia nativa homóloga o una secuencia heteróloga. Por ejemplo, la secuencia señal de la proteína GapC de unión a plasmina de S. dysgalactiae se puede utilizar para la secreción de la misma, así como un número de otras secuencias muy conocidas en el campo. El huésped puede eliminar las secuencias líder durante el procesamiento postraduccional. Véanse, p. ej., las Patentes estadounidenses núm. 4 431 739, 4 425 437 y 4 338 397.

Otras secuencias reguladoras también pueden ser de interés cuando permiten la regulación de la expresión de la secuencia proteica en función del crecimiento de la célula huésped. Los expertos en la materia conocen bien esas secuencias reguladoras y entre los ejemplos de dichas secuencias se encuentran aquellas que activan o inhiben la expresión de un gen en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes en el vector otros tipos de elementos reguladores, por ejemplo, secuencias estimuladoras.

Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden unirse a la secuencia codificante antes de su inserción en el vector, como los vectores de clonación descritos anteriormente. De forma alternativa, la secuencia codificante puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contenga las secuencias de control y un lugar de restricción apropiado.

En algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia codificante de manera que se unan a las secuencias control con la orientación apropiada, es decir, para mantener la pauta de lectura apropiada. También sería deseable producir mutantes o análogos de la proteína GapC de unión a plasmina. Es posible preparar mutantes o análogos mediante la deleción de una porción de la secuencia que codifica la proteína, mediante la inserción de una secuencia o mediante la sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la misma secuencia. Las técnicas de modificación de secuencias nucleotídicas, como la mutagénesis dirigida, están descritas, por ejemplo, en Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

A continuación se utiliza el vector de expresión para transformar una célula huésped apropiada. En el campo se conocen una serie de líneas celulares de mamífero que incluyen líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), algunas de las cuales son, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células renales de crías de hámster (BHK), células renales de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej. Hep G2), células de riñón bovino Madin-Darby ("MDBK") y similares. De forma similar, las células bacterianas huésped como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp., también se podrán utilizar con los presentes constructos de expresión. Las levaduras huésped de utilidad en la presente invención incluyen, entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insecto que se pueden utilizar con los vectores de expresión de baculovirus incluyen, entre otros, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y
Trichoplusia ni.

En función del sistema de expresión y del huésped escogidos, las proteínas de la presente invención se producen mediante el cultivo de células huésped transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente bajo las condiciones en que se expresa la proteína de interés. A continuación, se aísla la proteína de las células huésped y se purifica. Si el sistema de expresión secreta la proteína en el medio de cultivo, la proteína puede purificarse directamente del medio. Si la proteína no es secretada, se aísla de los lisados celulares. La selección de las condiciones de cultivo y los métodos de recuperación apropiados se encuentran dentro de las técnicas del ámbito.

Las proteínas de la presente invención también pueden producirse mediante síntesis química, como la síntesis peptídica en fase sólida, utilizando secuencias aminoacídicas conocidas o secuencias aminoacídicas derivadas de la secuencia de DNA de los genes de interés. Estos métodos son conocidos por los expertos en la materia. Véanse, p. ej., J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254, para las técnicas de síntesis peptídica en fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlín (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, para síntesis clásica en solución. La síntesis química de péptidos quizás sea preferible en el caso de que un fragmento pequeño del antígeno en cuestión tenga la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto de interés.

Las proteínas GapC de unión a plasmina de la presente invención, o sus fragmentos, pueden utilizarse para producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Si se escogen los policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado (p. ej. un ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un antígeno de la presente invención, un fragmento del mismo o un antígeno mutado. Se recoge suero del animal inmunizado y se trata de acuerdo con los procedimientos conocidos. Véase, p. ej. Jurgens et al. (1985) J. Chrom. 384:363-370. En caso de utilizar suero que contiene anticuerpos policlonales, los anticuerpos policlonales pueden purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando procedimientos estándar.

Un experto en la materia también puede producir fácilmente anticuerpos monoclonales frente a las proteínas GapC de unión a plasmina y a los fragmentos de estas. La metodología general de producción de anticuerpos monoclonales mediante la tecnología del hibridoma es ampliamente conocida. Se puede crear líneas celulares inmortales productoras de anticuerpos mediante fusión celular, y también mediante otras técnicas como la transformación directa de linfocitos B con DNA oncogénico o la transfección con virus de Epstein-Barr. Véanse, p. ej., M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); véanse también las Patentes Estadounidenses núm. 4 341 761; 4 399 121; 4 427 783; 4 444 887; 4 452 570; 4 466 917; 4 472 500, 4 491 632; y 4 493 890. Se pueden analizar perfiles de anticuerpos monoclonales producidos frente a las proteínas GapC de unión a plasmina, o fragmentos de los mismos, en busca de diversas propiedades; es decir, de isotipo, epítopo, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales sirven para la purificación, mediante técnicas de inmunoafinidad, de los antígenos individuales frente a los que están dirigidos. Tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales también pueden utilizarse para la inmunización pasiva o pueden combinarse con preparaciones con subunidades de vacuna para potenciar la respuesta inmunitaria. Los anticuerpos policonales y los monoclonales también sirven para fines diagnósticos.

Formulaciones y Administración de vacunas

Las proteínas GapC de unión a plasmina de la presente invención se pueden formular en forma de composiciones de vacunas, individualmente o en combinación con otros antígenos, para su uso en la inmunización de sujetos que se describe más adelante. En Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18ª Edición, 1990, por ejemplo, se describen métodos de preparación de formulaciones de este tipo. Normalmente las vacunas de la presente invención se preparan en forma inyectable, como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución o la suspensión en vehículos líquidos previamente a la inyección. También puede emulsionarse la preparación o encapsularse el ingrediente activo en vehículos liposómicos. El ingrediente inmunogénico activo generalmente se mezcla con un vehículo farmacéutico compatible, como por ejemplo agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, o con combinaciones de los mismos. Además, si se desea el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias adyuvantes como agentes humectantes o emulsionantes y agentes tamponadores del pH.

Los adyuvantes que potencian la efectividad de la vacuna también pueden añadirse a la formulación. Estos pueden ser, por ejemplo: muramil dipéptidos, avridina, hidróxido de aluminio, bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDA), aceites, emulsiones de aceite en agua, saponinas, citocinas u otras sustancias conocidas en el ámbito.

La proteína de unión a plasmina puede estar unida a un transportador con el fin de aumentar la inmunogenicidad de la misma. Son transportadores adecuados las moléculas grandes de metabolización lenta como las proteínas. Estos incluyen: albúminas séricas, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la materia; polisacáridos como la sefarosa, agarosa, celulosa, microesferas de celulosa y similares; aminoácidos poliméricos como el ácido glutámico, la polilisina y similares; copolímeros de aminoácidos; y partículas víricas inactivas.

Las proteínas GapC de unión a plasmina pueden utilizarse en su forma nativa o bien puede modificarse el contenido de su grupo funcional mediante, por ejemplo, succinilación de residuos de resina o mediante la reacción con Cys-tiolactona. También es posible incorporar en el transportador (o el antígeno) un grupo sulfhidrilo mediante, por ejemplo, la reacción de las funciones amino con 2-iminotiolano o el N-hidroxisuccinimida éster del propionato de 3-(4-ditiopiridil propionato. También se pueden modificar los transportadores adecuados para incorporar ramas espaciadoras (como diamina de hexametileno u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar) que permitan la unión de los péptidos.

Otros transportadores adecuados para las proteínas GapC de unión a plasmina de la presente invención incluyen polipéptidos VP6 de los rotavirus, o fragmentos funcionales de los mismos, que están descritos en la Patente Estadounidense núm. 5 071 651. También es posible emplear un producto de fusión de una proteína vírica y los inmunógenos del sujeto, llevada a cabo mediante métodos que están descritos en la Patente Estadounidense núm. 4 722 840. Aún otros transportadores incluyen células como los linfocitos, ya que esta forma de presentación imita el modo natural de presentación en el sujeto, lo cual genera el estado inmunizado. Alternativamente, las proteínas de la presente invención pueden estar acopladas a eritrocitos, preferiblemente los eritrocitos propios del sujeto. Los expertos en la materia conocen los métodos de acoplamiento de péptidos a proteínas o células.

Además, las proteínas GapC de unión a plasmina (o complejos de las mismas) se pueden formular en composiciones de vacunas en su forma natural o bien en forma de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos activos) que están formadas con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como el acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres también pueden proceder de bases inorgánicas como, por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.

Las formulaciones para vacunas deben contener una "cantidad terapéuticamente efectiva" del ingrediente activo, que es una cantidad suficiente para proporcionar una respuesta inmunitaria en el sujeto al que se administra la composición. En el tratamiento y la prevención de la mastitis, por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente efectiva" sería preferiblemente una cantidad que mejore la resistencia de la glándula mamaria a una nueva infección o que reduzca la gravedad clínica de la enfermedad. Esta protección quedará demostrada por una reducción o falta de los síntomas mostrados normalmente por un huésped infectado, por un menor tiempo de recuperación o por un menor recuento de células somáticas en la leche del cuarto infectado. A modo de ejemplo, la capacidad de la composición para mantener el recuento de células somáticas (RCS) en la leche en unas 500.000 células por ml o llevarlo hasta esa cifra, el valor umbral determinado por la Federación Internacional de Lechería por encima del cual se considera que los animales padecen mastitis clínica, debe ser indicativo de un efecto terapéutico.

La cantidad exacta puede determinarla un experto en la materia utilizando pruebas estándar. La concentración de proteína GapC de unión a plasmina suele oscilar entre un 1 y un 95% (p/p) de la composición, o incluso valores mayores o menores en los casos que se estime necesario. Con las presentes formulaciones para vacunas, de 5 a 500 \mug de ingrediente activo por ml de solución infectada deben ser suficientes para generar una respuesta inmunitaria cuando se ha administrado una dosis de 1 a 3 ml por animal.

Para inmunizar a un sujeto, la vacuna se administra generalmente por vía parenteral, normalmente mediante inyección intramuscular. Sin embargo, otros modos de administración, como la inyección subcutánea, intraperitoneal e intramuscular, también son aceptables. La cantidad a administrar depende del animal a tratar, de la capacidad del sistema inmunitario del animal para sintetizar anticuerpos y del grado de protección deseado. Las dosis efectivas puede establecerlas cualquier experto en la materia mediante ensayos rutinarios estableciendo curvas de respuesta a la dosis. La inmunización del sujeto se realiza administrando la vacuna en una dosis al menos, y preferiblemente en dos. Además, al animal se le pueden administrar tantas dosis como sea necesario para mantener un estado de inmunidad frente a la infección.

Otras formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, aerosoles, formulaciones de administración intranasal u oral, y formulaciones de liberación controlada. En el caso de los supositorios, la composición del vehículo incluirá aglutinantes tradicionales y transportadores, como glicoles polialcalinos o triglicéridos. Estos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contengan el ingrediente activo en un margen aproximado de entre un 0,5 y un 10% (p/p) o, preferiblemente, entre un 1 y un 2%. Los vehículos orales incluyen excipientes utilizados habitualmente como son, por ejemplo, cantidades farmacéuticamente deseables de: manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, celulosa, sacarina sódica, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones orales para vacunas se pueden administrar en forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación controlada o polvos, y pueden contener entre un 10 y un 95% del ingrediente activo, preferiblemente entre un 25 y un 70%.

Las formulaciones intranasales han de incluir normalmente vehículos que no causen irritación en la mucosa nasal y que no alteren de forma significativa la función ciliar. Con la presente invención es posible utilizar diluyentes como agua, solución salina acuosa u otras sustancias conocidas. Las formulaciones nasales también pueden contener conservantes como, por ejemplo, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Se puede añadir un tensioactivo para mejorar la absorción de las proteínas en cuestión por la mucosa nasal.

Las formulaciones de liberación controlada o sostenida se producen incorporando la proteína a transportadores o vehículos como los siguientes: liposomas, polímeros no reabsorbibles impermeables como copolímeros de acetato de etilenovinilo y copolímeros de Hytrel®, polímeros hinchables como los hidrogeles, o polímeros reabsorbibles como el colágeno y ciertos poliácidos o poliésteres como los utilizados para realizar suturas reabsorbibles. Las proteínas GapC de unión a plasmina también se pueden administrar mediante minibombas implantadas, ampliamente conocidas en el campo.

Las proteínas GapC de unión a plasmina de la invención que nos ocupa también pueden administrase a través de un virus transportador que exprese estas proteínas. Los virus transportadores que son de utilidad en la presente invención incluyen, entre otros, virus vaccinia y otros virus de la viruela, adenovirus y virus del herpes. A modo de ejemplo, se pueden construir recombinantes del virus vaccinia que expresen las nuevas proteínas de la siguiente manera. El DNA que codifica la proteína en particular se inserta, en primer lugar, de forma que esté adyacente a un promotor vaccinia y a secuencias de DNA de vaccinia flanqueantes, como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). Este vector se utiliza a continuación para transfectar células que son infectadas de forma simultánea con vaccinia. La recombinación homóloga sirve para inserir el promotor de vaccinia más el gen que codifica la proteína en cuestión dentro del genoma vírico. El recombinante de TK resultante puede seleccionarse mediante el cultivo de las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y la selección de las calvas víricas resistentes a la misma.

Una vía de administración alternativa implica la terapia génica o la inmunización genética. Por lo tanto, las secuencias nucleotídicas (y los elementos reguladores que las acompañan) que codifiquen las proteínas GapC de unión a plasmina de interés pueden administrarse directamente a un sujeto para la traducción in vivo de las mismas. Contrariamente, la transferencia génica puede realizarse transfectando las células o los tejidos del sujeto ex vivo y reintroduciendo el material transformado dentro del huésped. El DNA puede introducirse directamente en el microorganismo huésped, es decir, mediante inyección (véanse la Publicación Internacional núm. WO/90/11092; y Wolff et al. [1990] Science 247:1465-1468). La transferencia génica mediada por liposomas también puede conseguirse utilizando métodos conocidos. Véanse, por ejemplo, Hazinski et al. (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4:206-209; Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278-281; Canonico et al. (1991) Clin. Res. 39:219A; y Nabel et al. (1990) Science 249:1285-1288. Agentes dirigidos, como anticuerpos dirigidos hacia antígenos de superficie expresados en tipos celulares específicos, pueden conjugarse de forma covalente a la superficie liposómica de modo que el ácido nucleico puede liberarse en tejidos y células específicos vulnerables a la infección.

Ensayos diagnósticos

Tal como se ha explicado anteriormente, las proteínas GapC de unión a plasmina de la presente invención también pueden utilizarse como medio diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos reactivos a estreptococos, por ejemplo a S. dysgalactiae, en una muestra biológica con la finalidad de determinar la existencia de infección por estreptococos. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos reactivos a las proteínas GapC de unión a plasmina puede detectarse mediante técnicas de electroforesis y de inmunodiagnóstico estándar, incluyendo inmunoensayos como los ensayos de tipo competitivo, de reacción directa o de tipo sándwich. Estos ensayos incluyen, entre otros: transferencias Western (Western blots), ensayos de aglutinación, inmunoensayos de marcaje con enzimas o mediados por enzimas (como el ELISA), ensayos de tipo biotina/avidina, radioinmunoensayos, inmunoelectroforesis, inmunoprecipitación, etc. Las reacciones incluyen generalmente la manifestación de marcajes de tipo fluorescente, quimioluminiscente, radiactivo o enzimático, o moléculas de tinción, o bien otros métodos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o anticuerpos con los que reacciona.

Estos ensayos mencionados generalmente implican la separación del anticuerpo no unido en una fase líquida a partir de un soporte en fase sólida al que están unidos los complejos antígeno-anticuerpo. Los soportes sólidos que se pueden utilizar en la práctica de la invención incluyen sustratos como la nitrocelulosa (p. ej. en forma de membrana o pocillo de microtitulación), el cloruro de polivinilo (p. ej. láminas o pocillos de microtitulación), látex de poliestireno (p. ej. microesferas o placas de microtitulación), fluoruro de polivinilidina, papel diazotizado, membranas de nylon, microesferas activadas, microesferas de atracción magnética y similares.

De forma característica, se hace reaccionar en primer lugar un soporte sólido con un componente en fase sólida (p. ej. una o más proteína GapC de unión a plasmina) bajo condiciones de unión adecuadas de forma que el componente esté suficientemente fijo al soporte. En ocasiones se puede potenciar la fijación del antígeno al soporte acoplando primero el antígeno a una proteína con mejores propiedades de unión. Algunas de las proteínas de acoplamiento adecuadas son macromoléculas del tipo: albúminas séricas como la albúmina sérica bovina (BSA), hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina y otras proteínas muy conocidas por los expertos en el campo. Otras moléculas que se pueden utilizar para unir los antígenos al soporte incluyen polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros aminoacídicos y similares. Estas moléculas y métodos de acoplamiento de estas moléculas a los antígenos son bien conocidos por cualquier experto en el ámbito. Véanse, p. ej., Brinkley, M.A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63; y Anjaneyulu and Staros, International J. of Peptide and Protein Res. (1987) 30: 117-124.

Una vez se ha hecho reaccionar el soporte sólido con el componente en fase sólida, se elimina mediante lavado cualquier componente en fase sólida no inmovilizado en el soporte, y a continuación el componente unido al soporte se pone en contacto con una muestra biológica de la que se sospecha contiene fracciones del ligando (p. ej. anticuerpos frente a los antígenos inmovilizados) bajo condiciones de unión adecuadas. Después del lavado para eliminar cualquier ligando no unido, se añade una fracción de unión secundaria bajo las condiciones adecuadas de unión, de modo que el enlazante secundario es capaz de asociarse de forma selectiva con el ligando unido. La presencia del enlazante secundario puede detectarse entonces utilizando las técnicas ampliamente conocidas en el campo.

De forma más concreta, se puede utilizar un método ELISA en el que los pocillos de una placa de microtitulación se recubren con una proteína GapC de unión a plasmina. A continuación se añade a los pocillos recubiertos una muestra biológica que contiene, o de la que se sospecha que contiene, moléculas de inmunoglobulina anti-proteína GapC de unión a plasmina. Transcurrido un periodo de incubación suficiente para permitir la unión del anticuerpo al antígeno inmovilizado, la placa o placas pueden lavarse para eliminar las fracciones no unidas y se puede añadir una molécula de unión secundaria marcada de forma detectable. Se permite a la molécula de unión secundaria reaccionar con cualquier anticuerpo capturado de las muestras, se lava la placa y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria mediante métodos de sobra conocidos en el campo.

Por tanto, en una realización en particular, la presencia de ligandos unidos de antígeno anti-proteína GapC de unión a plasmina procedentes de una muestra biológica se puede detectar fácilmente utilizando un enlazante secundario que contenga un anticuerpo dirigido frente a los ligandos de anticuerpo. En el ámbito se conoce una serie de moléculas de inmunoglobulina (Ig) antibovina que permiten una conjugación rápida con un marcador enzimático detectable, como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina o la ureasa, utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia. Un sustrato enzimático apropiado se utiliza a continuación para generar una señal detectable. Otras realizaciones relacionadas admiten el uso de técnicas ELISA de tipo competitivo utilizando los métodos de sobra conocidos por los expertos.

Los ensayos también se pueden llevar a cabo en solución, de modo que las proteínas y los anticuerpos específicos para estas proteínas formen complejos bajo condiciones de precipitación. En una realización en concreto, las proteínas GapC de unión a plasmina pueden unirse a una partícula en fase sólida (p. ej. una microesfera de agarosa o similar) utilizando las técnicas de acoplamiento estándar, como el acoplamiento químico directo o indirecto. Después se pone en contacto la partícula recubierta con antígenos bajo condiciones de unión con una muestra biológica de la que se sospecha que contiene anticuerpos para las proteínas GapC de unión a plasmina. El enlace cruzado entre anticuerpos unidos causa la formación de agregados de complejos partícula-antígeno-anticuerpo que se pueden precipitar y separar de la muestra mediante lavado o centrifugado. La mezcla de reacción se puede analizar para determinar la presencia o ausencia de complejos anticuerpo-antígeno utilizando cualquiera de los varios métodos estándar, como los métodos de inmunodiagnóstico descritos anteriormente.

En aún otra realización, se puede proporcionar una matriz de inmunoafinidad en la que se inmoviliza en un sustrato una población policlonal de anticuerpos procedentes de una muestra biológica sospechosa de contener moléculas anti-GapC de unión a plasmina. En ese sentido, es posible llevar a cabo una purificación inicial de la muestra por afinidad con antígenos inmovilizados. De este modo, la preparación de muestras resultante solamente contendrá fracciones antiestreptococos, evitando así posibles características de unión inespecíficas en el soporte de afinidad. En el campo se conocen varios métodos de inmovilización de inmunoglobulinas (intactas o en fragmentos específicos) con un rendimiento elevado y una buena retención de la actividad de unión antigénica. Sin estar limitado por cualquier método en particular, se puede utilizar proteína A o proteína G para inmovilizar inmunoglobulinas.

Consecuentemente, una vez estén inmovilizadas las moléculas de inmunoglobulina para proporcionar una matriz de inmunoafinidad, se ponen en contacto las proteínas GapC de unión a plasmina marcadas con los anticuerpos unidos bajo condiciones de unión adecuadas. Una vez se han lavado del soporte de inmunoafinidad todos los anticuerpos unidos de forma inespecífica, se puede determinar la presencia de antígeno unido valorando la presencia del marcador mediante los métodos conocidos.

Además, los anticuerpos generados frente a las proteínas GapC de unión a plasmina, mejor que las propias proteínas GapC de unión a plasmina, pueden utilizarse en los ensayos antes descritos con el fin de detectar la presencia de anticuerpos para las proteínas en una muestra dada. Estos ensayos se realizan fundamentalmente del modo descrito anteriormente y son de conocimiento general en el ámbito.

Los reactivos de los ensayos antes descritos, incluidas las proteínas GapC de unión a plasmina o los anticuerpos de las mismas, se pueden suministrar en equipos que lleven las instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios para llevar a cabo los inmunoensayos antes descritos. El equipo también puede contener, en función del inmunoensayo utilizado en cada caso, marcadores adecuados y otros reactivos y materiales envasados (es decir, tampones de lavado y similares). Los inmunoensayos estándar como los antes descritos se pueden realizar utilizando estos equipos.

Depósitos de las cepas útiles para la práctica de la invención

Se realizó un depósito de cultivos biológicamente puros de las siguientes cepas en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, bajo las directrices del Tratado de Budapest. El número de acceso indicado se asignó tras un análisis positivo de viabilidad, y se abonaron las tarifas requeridas. Los depósitos designados se mantendrán durante un periodo de treinta (30) años desde la fecha de depósito, o durante cinco (5) años después de la última petición para el depósito, el periodo de tiempo que sea más largo. En el caso de que un cultivo sea inviable o sea destruido de forma involuntaria, o que cepas que contengan plásmidos los pierdan, serán sustituidos por un cultivo o cultivos viables de la misma descripción taxonómica.

Si se diera una discrepancia entre la secuencia presentada en la presente solicitud y la secuencia del gen de interés del plásmido depositado debido a errores rutinarios de secuenciación, la secuencia del plásmido depositado será la que prevalezca.

Cepa Bacteriana	Plásmido	Gen	Fecha de Depósito	núm. ATCC

E. coli BL2I DE3	pET15bgapC	gapC (S. dysgalactiae)	31 de mayo de 2000	PTA-1976
E. coli BL21 DE3	pMF521c	gapC (S. agalactiae)	31 de mayo de 2000	PTA-1975
E. coli BL21 DE3	pMF521a	gapC (S. uberis)	31 de mayo de 2000	PTA-1973
E. coli BL21 DE3	pMF521e	gapC (S. iniae)	31 de mayo de 2000	PTA-1972

3. Experimental

A continuación se exponen ejemplos de realizaciones específicas para la realización de la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solamente con una finalidad ilustrativa y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Se han destinado esfuerzos a garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (p. ej. cantidades, temperaturas, etc.), pero cabe la posibilidad de que existan alguna desviación o algún error experimentales.

Materiales y Métodos

Las enzimas se adquirieron de fuentes comerciales y se utilizaron siguiendo las instrucciones de los fabricantes.

Para el aislamiento de fragmentos de DNA, excepto en los casos en los que se especifique lo contrario, todas las manipulaciones de DNA se realizaron según procedimientos estándar. Véase Sambrook et al., supra. Las enzimas de restricción T_{4} DNA ligasa, E. coli, DNA polimerasa II, fragmento Klenow y otros reactivos biológicos pueden adquirirse a partir de proveedores comerciales y utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de DNA de doble cadena se separaron en geles de agarosa.

Las fuentes de reactivos químicos incluyen en general las siguientes: Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; Alrich, Milwaukee, WI; Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN.

Ejemplo 1 Preparación, amplificación, secuenciación, expresión, purificación y caracterización de la proteína GapC de unión a plasmina de S. dysgalactiae A. Preparación del DNA cromosómico de S. dysgalactiae

Un aislado clínico de S. dysgalactiae proveniente de un caso de mastitis bovina (Núm. de Acceso a ATCC ATCC43078) se obtuvo a partir de la Colección Americana de (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209), y se empleó como fuente de DNA. El microorganismo se cultivó de forma rutinaria sobre placas de agar TSA y sangre bovina (PML Microbiologicals, Mississauga, Ontario) a 37ºC durante 18 horas, o en caldo de cultivo Tod&Hewitt (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra) complementado con 0,3% de extracto de levadura (THB-YE) a 37ºC y CO_{2} al 5%.

El DNA cromosómico se preparó a partir de S. dysgalactiae cultivado en 100 ml de THB-YE complementado con glicina 20 mM durante aproximadamente 6 horas, hasta alcanzar una A_{600} de 0,8 a 1,0. Las células se recogieron y se resuspendieron en EDTA 50 mM, Tris-HCl 50 mM y Tween-20® al 0,5% (Sigma, St. Louis, MO), y se complementaron con ribonucleasa A (200 mg/ml), proteinasa K (20 mg/ml), lisozima (100 mg/ml) y mutanolisina (100 mg/ml) (SIGMA, St. Louis, MO). Tras la lisis bacteriana durante 30 minutos a 37ºC con agitación vigorosa, se mezcló hidrocloruro de guanidina y Tween-20® a pH 5,5 con el lisado para conseguir una concentración final de 0,8 M y del 5%, respectivamente. Esta mezcla se incubó a 50ºC durante 30 minutos. Entonces se purificó el DNA cromosómico utilizando un equipo Qiagen genomic-tip 100 g (Qiagen, Santa Clarita, CA) y se precipitó utilizando 0,7 volúmenes de isopropanol. El precipitado resultante se lavó en etanol al 70% y se resuspendió en 0,5 ml de Tris-HCl 10 mM a pH 8,8.

B. Amplificación y clonación del gen gapC de S. dysgalactiae

El gen gapC fue amplificado mediante PCR (véanse Mullis et al., Patente Estadounidense núm. 4 683 195; Mullis, Patente Estadounidense núm. 4 683 202). El cebador directo, gapC1, contenía una diana de restricción NdeI (ID. de SEC. núm.: 1, mostrado en la Tabla 1) y el cebador indirecto, gapC1r, contenía una diana BamHI (ID. de SEC. núm.: 2, mostrado en la Tabla 1). En las anteriores secuencias de cebadores, ilustradas en la Tabla 1, el subrayado indica los nucleótidos añadidos a la secuencia original, y la negrita indica la situación de los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción.

La PCR se llevó a cabo utilizando la Vent DNA polimerasa (New England Biolabs, Mississauga, ON, Canadá). Se incubaron 0,7 \mug de DNA cromosómico de S. dysgalactiae en una mezcla de reacción que contenía 1 \muM de cada uno de los cebadores anteriores; 200 \muM de cada uno de los nucleótidos dATP, dTTP, dCTP y dGTP; MgSO_{4} 3 mM; 1x concentración de tampón Thermopol (New England Biolabs, Mississauga, ON, Canadá); y 2 unidades de Vent DNA polimerasa. Esta mezcla se incubó durante 3 ciclos de amplificación de 1 minuto a 94ºC, 3 minutos a 50ºC y 1 minuto, 10 segundos a 72ºC, luego durante 27 ciclos de amplificación de 15 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC, y finalmente durante 1 ciclo de 5 minutos a 72ºC.

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TABLA 1 Números de identificación de secuencia y secuencias aminoacídicas y nucleotídicas correspondientes

1

2

La gapC producto de PCR se clonó en un vector de expresión pET15B (Novagen, Madison, WI) que había sido digerido con BamHI y NdeI. La clonación del producto de PCR en este lugar provoca la adición a la secuencia codificante de gapC de una secuencia codificante dentro del patrón de lectura para una cola de seis histidinas. La posterior expresión produce una proteína completa que lleva la cola de histidinas, lo que permite la purificación de la proteína bajo condiciones no desnaturalizantes utilizando cromatografía de quelatos metálicos.

Este constructo se utilizó para transformar E. coli BL21 DE3 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Esta cepa transformada se designó BL21 DE3 (PETl5bgapC) (Núm. ATCC).

C. Aislamiento de DNA cromosómico y amplificación y clonación del gen gapC de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae

El gen gapC se preparó a partir de otros aislados siguiendo fundamentalmente el modo antes descrito.

El DNA cromosómico de S. agalactiae, S. uberis y S. parauberis se aisló de cepas obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209; cepas designadas por ATCC 27541, 9927 y 13386, respectivamente). El DNA cromosómico de S. inicie se aisló de una cepa designada 9117 obtenida del Hospital Mount Sinai de Toronto.

Los cebadores utilizados para amplificar los genes gapC de las cepas de Streptococcus antes expuestas fueron los mismos que los utilizados en el caso de S. dysgalactiae, es decir, el cebador gapC1 (ID. de SEC. núm.: 1) y el cebador gapC1r (ID. de SEC. núm.: 2).

Una vez acabada la amplificación, el producto de PCR se clonó en cada caso dentro de un pPCR-Script, utilizando el protocolo de clonación descrito en el equipo PCR-Script Amp Cloning Kit (Stratagene, La Jolla, CA). A continuación, se cortó el inserto de producto de PCR utilizando NdeI y BamHI y se volvió a clonar dentro de esos sitios en pEl5b utilizando los protocolos de clonación convencionales (véase, p. ej., Sambrook et al., supra.). Los plásmidos que contenían S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae fueron designados como pMF521c (núm. ATCC), pMF521a (núm. ATCC), pMF521d (núm. de ATCC) y pMF521e (núm. de ATCC), respectivamente.

D. Secuencia nucleotídica del gen gapC y secuencias aminoacídicas deducidas

Al secuenciar un gen de S. dysgalactiae unido pero no relacionado fue cuando se identificaron por primera vez las secuencias homólogas a gapC del homólogo de S. equisimilis (Gase, et al. [1996] European J. of Biochem. 239:42-51). Para obtener la secuencia completa del gen gapC de S. dysgalactiae, se empleó la PCR con los cebadores antes descritos, es decir, el cebador gapC1 y el cebador gapC1r.

La secuencia se determinó en el Plant Biotechnology Institute (PBI, Saskatoon, Canadá) utilizando terminadores de cola marcados con fluorescencia en un secuenciador de DNA automático ABI 373 (Applied Biosystems, Emeryville, CA).

Las secuencias de las proteínas GapC aisladas de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae se determinaron por el mismo método.

Las figuras de la 1 a la 5 muestran tanto las secuencias nucleotídicas como las secuencias aminoacídicas esperadas de la proteína GapC de S. dysgalactiae (DysgalGapC) (ID. de SEC. núm.: 3 y ID. de SEC. NÚM.: 4), así como las de las proteínas GapC de S. agalactiae (AgalGapC) (ID. de SEC. núm.: 5 e ID. de SEC. núm.: 6), S. uberis (UberGapC) (ID. de SEC. núm.: 7 e ID. de SEC. núm.: 8), S. parauberis (PUberGapC) (ID. de SEC. núm.: 9 e ID. de SEC. núm.: 10) y S. iniae (IniaeGapC) (ID. de SEC. núm.: 11 e ID. de SEC. núm.: 12), respectivamente.

El gen de la proteína GapC de S. dysgalactiae representado en las figuras 1A-1B codifica una proteína de 336 aminoácidos que no parece contener ni una secuencia señal ni un dominio de anclaje a membrana. Una búsqueda en la base de datos del GenBank realizada con el programa BLASTX reveló que el patrón abierto de lectura era homólogo en un 95,5% a la GapC de S. equisimilis (Núm. de acceso en GenBank X97788) y en un 99,4% a la GapC de S. pyogenes (Núm. de acceso en GenBank M95569). La secuencia aminoacídica predicha de la proteína GapC también mostró una identidad aminoacídica del 43% con la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa bovina (Núm. de acceso en GenBank U85042).

De forma similar, no se observa presencia de secuencias señal ni dominios de anclaje a membrana en las secuencias de proteína GapC de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae.

Las homologías de las secuencias aparecen representadas en la Tabla 2.

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TABLA 2 Homologías de secuencia entre diferentes secuencias de la proteína GapC

3

E. Expresión y purificación de la proteína recombinante GapC de unión a plasmina de S. dysgalactiae

La proteína GapC con una cola de polihistidinas (6 His) se expresó y purificó en condiciones no desnaturalizantes mediante cromatografía de afinidad de quelatos metálicos (Ni-NTA).

Se hizo crecer E. coli BL21 DE3 que contenía el plásmido recombinante en medio Luria Broth (LB) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina hasta una A_{600} de aproximadamente 0,5. Entonces, se indujo la expresión de la proteína GapC mediante la adición de isopropil-\betaD-tiogalactósido 1 mM (IPTG) (Sigma, St. Louis, MO). Tras tres horas de incubación a 37ºC, se recogieron las células, se lavaron con el tampón de la columna (solución de fosfato sódico 50 mM, pH 8,0; NaCl 0,3 M; imidazol 10 mM) y se lisaron por sonicación.

Aproximadamente un 40% de la proteína recombinante se encontraba en la fracción soluble del lisado celular con un rendimiento aproximado de 50 mg de proteína recombinante por litro de cultivo, determinado mediante el Equipo de valoración de proteínas DC (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canadá) utilizando albúmina sérica bovina (Pierce, Rockford, IL) como estándar.

Se limpió el lisado mediante centrifugación y la fracción soluble se pasó por una columna Ni-NTA (Qiagen), que se lavó posteriormente con 10 volúmenes de columna de tampón de la columna (igual que el anterior, excepto que contenía imidazol 20 mM). La proteína GapC con la cola de polihistidina se eluyó utilizando el tampón de la columna (igual que el anterior, excepto que contenía imidazol 250 mM) y dio como resultado una fracción homogénea de proteínas con una concentración de GapC de 10 a 15 mg/ml. Dicha fracción se dializó frente a 2000 volúmenes de PBSA (cloruro sódico 136 mM, cloruro potásico 2,6 mM, fosfato sódico dibásico 8,1 mM, fosfato potásico monobásico 1,46 mM).

E. Expresión y purificación de la proteína recombinante GapC de unión a plasmina de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae

La expresión y la purificación de las proteínas recombinantes de esas especies de estreptococos se consigue mediante los mismos procedimientos descritos en el Ejemplo 1E antes mencionado. Las cepas bacterianas transformadas utilizadas para expresar las proteínas GapC recombinantes de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae se designaron como BL21 DE3 (pMF52lc) (núm. ATCC), BL21 DE3 (pMF521a) (núm. ATCC), BL21 DE3 (pMF52ld) (núm. ATCC) y BL21 DE3 (pMF521e) (núm. ATCC), respectivamente.

G. Caracterización de la proteína recombinante GapC de S. dysgalactiae 1. Análisis en gel de poliacrilamida-SDS

La electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS se realizó con una muestra de la proteína eluida mediante el método descrito por Laemli (Laemli, U.K. [1970] Nature 227:680-685). Los resultados se presentan en la Figura 18: carril 1, marcadores de peso molecular (intervalo de 20,5 a 103 kDa; BioRad Laboratories, Emeryville, CA); carril 2, proteína GapC recombinante soluble de S. dysgalactiae, purificada mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA.

Los resultados muestran que la purificación por cromatografía de afinidad en columna Ni-NTA da como resultado una fracción proteica homogénea.

2. Actividad gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de la proteína recombinante GapC y de células enteras de S. dysgalactiae

La enzima GAPDH cataliza la fosforilación oxidativa de D-gliceraldehído-3-fosfato a 1,3-difosfoglicerato en presencia de NAD^{+} y fosfato inorgánico. El elevado grado de homología de GapC con la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa estreptocócica sugiere que GapC podría tener esa actividad enzimática.

La actividad GAPDH de las células enteras de S. dysgalactiae (10^{10} UFC) y de la proteína GapC recombinante se determinó midiendo la reducción de NAD^{+} a NADH. El tampón del ensayo estaba compuesto de trietanolamina 40 mM, Na_{2}HPO_{4} 50 mM y EDTA 5 mM, pH 6,8. Se incubaron células de S. dysgalactiae o 5 mg de proteína recombinante GapC purificada en el tampón del ensayo que contenía gliceraldehído-3-fosfato (49 mg/ml; Sigma Chemical Company), 75 microlitros de NAD^{+} (15 mM; Sigma Chemical Company) hasta un volumen final de 1 ml. Como controles negativos se utilizaron muestras que no contenían gliceraldehído-3-fosfato o moléculas de proteína GapC recombinante/células de S. dysgalactiae. La reducción de NAD^{+} a NADH se controló espectrofotométricamente a una absorbancia de 340 nanómetros.

Los resultados indicaron que tanto la proteína recombinante como las células intactas de S. dysgalactiae de tipo salvaje poseían actividad enzimática (no se muestran estos resultados). Además, cuando se trataron las células de S. dysgalactiae con tripsina para digerir las proteínas de superficie, la actividad GAPDH desapareció. Así, la actividad enzimática observada en las células intactas de tipo salvaje no se debió a la GAPDH intracelular.

Estos datos sugieren que la proteína GapC se localiza en la superficie de la célula a pesar de la aparente falta de secuencias señal o de anclaje a membrana tanto en la secuencia de nucleótidos como en la de aminoácidos.

3. Actividad de unión a plasmina de la proteína recombinante GapC de unión a plasmina de S. dysgalactiae y de las células enteras de S. dysgalactiae

Se utilizó un ensayo en microplaca para determinar si la proteína recombinante GapC tenía la capacidad de unirse a la plasmina bovina, y si dicha unión mantenía la actividad enzimática de la plasmina.

Se sembraron microplacas de 96 pocillos con 5 mg de proteína recombinante GapC purificada, se lavaron tres veces con 0,1% de gelatina-PBSA con 0,05% de TWEEN-20 (PBSGT).

Se bloquearon los pocillos durante una hora a 37ºC en la misma solución y se lavaron y se incubaron con 200 \mul de plasmina bovina (0,25 mg/ml, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) durante una hora a 37ºC. A continuación, se lavaron los pocillos ocho veces con PBSGT. Se añadieron 200 \mul del sustrato sintético Chromazym-PL (Tos-Gly-Pro-Lys-4-NA, 0,3 mg/ml) a los pocillos y se incubaron a 37ºC durante una hora. La presencia de actividad plasmina asociada se determinó mediante la medición de la cantidad de paranitroanilida (4-nitranilina) liberada en los sobrenadantes en función de su absorbancia a 405 nanómetros. Se utilizó un procedimiento similar para medir la actividad de unión a plasmina de las células intactas de S. dysgalactiae, con la excepción de que 10^{10} células se lavaron con PBSGT, se resuspendieron en 400 \mul de Chromazym-PL (0,3 mg/ml) y se incubaron durante una hora a 37ºC.

Los resultados, que se muestran en la Figura 19, demuestran que la proteína recombinante purificada presentó la capacidad de unirse a plasmina bovina enzimáticamente activa. Asimismo, cuando se utilizaron células intactas de S. dysgalactiae, se obtuvieron resultados similares. En la figura, los datos representan la media de tres ensayos independientes.

Así, el receptor de plasmina está localizado en la superficie de S. dysgalactiae y la proteína purificada mantiene su actividad biológica.

Ejemplo 2 Inmunización con GapC de S. dysgalactiae e infección experimental en ganado vacuno

Las vacunas de formularon de tal manera que contenían 50 mg/ml de proteína GapC recombinante purificada por afinidad en adyuvante de base oleosa VSA3 (VIDO, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá). VSA3 es una combinación de Emulsigen Plus^{TM} (MVP Laboratories, Ralston, Nebraska) y bromuro de dimetildioctadecil amonio (Kodak, Rochester, New York). En la Figura 18 se muestra la proteína GapC recombinante purificada por afinidad utilizada para la preparación de la vacuna.

Se obtuvieron 24 Holsteins no lactantes sin antecedentes de infección por S. dysgalactiae a partir de diferentes granjas de Saskatchewan, en Canadá. Una semana antes de la vacunación, se trataron todos los animales con Cepha-dry^{TM} (Ayerst Laboratories, Montreal, Canadá) (300 mg por cuarto) con el objetivo de eliminar cualquier infección de la ubre antes de la vacunación.

Se inmunizaron grupos de ocho animales por vía subcutánea con dos dosis de vacuna que contenían proteína GapC de S. dysgalactiae, Mig (una proteína receptora para Fc aislada de S. dysgalactiae, que fue evaluada simultáneamente) o un placebo, con un intervalo de tres semanas entre inmunizaciones. Dos semanas después de la segunda inmunización, los animales fueron expuestos a 650 unidades formadoras de colonias de S. dysgalactiae administradas en tres de los cuartos con una cánula de infusión para ubres. El cuarto restante de cada animal se utilizó como un control sin infección.

Se examinó diariamente la aparición de signos clínicos de la enfermedad en todos los animales y se recogieron muestras de los cuartos de la ubre cada día. Se analizó la consistencia de las muestras y se realizó el recuento de células somáticas así como la determinación del número de bacterias.

Ejemplo 3 Determinación de anticuerpos específicos frente a GapC

Se determinaron los anticuerpos específicos de GapC en el suero bovino mediante un inmunoensayo en fase sólida (ELISA). Brevemente, se sembraron microplacas (NUNC, Naperville, Illinois) con 1 \mug por pocillo de antígeno recombinante purificado en tampón de carbonato sódico 50 mM, pH 9,6 y se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Se retiró el líquido y se bloquearon los pocillos con una solución de albúmina sérica bovina al 3% durante 1 hora a 37ºC. Entonces, se añadieron diluciones seriadas de suero bovino (de 1:4 a 1:6400) a los pocillos y se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Posteriormente, los pocillos se aspiraron, lavaron e incubaron con 100 \mul de anticuerpos de cabra anti-IgG bovina conjugados con fosfatasa alcalina (Kirkgaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) durante una hora a temperatura ambiente. Se volvieron a lavar los pocillos y se añadieron 100 \mul de p-nitrofenol fosfato (SIGMA, St. Louis, MO) como sustrato para detectar la actividad de la fosfatasa alcalina. Se determinó la absorbancia a 405 nanómetros tras una hora de incubación con el sustrato a temperatura ambiente.

Cuando se refiere a las figuras, el título de anticuerpos específicos como el recíproco de la dilución que mostraba actividad por encima de los niveles basales.

Ejemplo 4 Colonización bacteriana

Se estableció el número de bacterias esparciendo diluciones seriadas (de 10^{0} a 10^{-3}) directamente en placas agar sangre de oveja TSA seguido de la incubación durante toda la noche a 37ºC y CO_{2} al 5%. La colonización se define como la recuperación de >500 ufc/ml del organismo infectado.

Para confirmar que las bacterias recogidas de las secreciones de leche eran de S. dysgalactiae, se seleccionaron colonias recogidas de cada animal y se analizaron utilizando un ensayo API strep-20 (bioMerieux SA, Hazelwood, Missouri) según las instrucciones suministradas por el fabricante. Este ensayo es una técnica estandarizada que combina 20 ensayos bioquímicos para determinar la actividad enzimática y la fermentación de azúcares. Las reacciones se leen en función de una tabla de lectura y la identificación se obtiene tanto por el índice del perfil analítico como por una aplicación informática de identificación.

Tras la entrada en contacto con el microorganismo, los animales de todos los grupos mostraron colonización por S. dysgalactiae (Figura 20). Únicamente las vacas inmunizadas con GapC mostraron una reducción estadísticamente significativa en el número de cuartos infectados y en el número total de bacterias aisladas por cuarto. Por tanto, la inmunización con GapC redujo la colonización bacteriana tras la entrada en contacto con S. dysgalactiae.

La relación entre el título de anti-GapC y la colonización bacteriana se muestra en las Figuras 21 y 22. Se observó una gran correlación entre los niveles séricos de anticuerpos anti-GapC y el número máximo de bacterias (expresado en UFC (log_{10)}/ml de leche) detectado en todos los cuartos (r = 0,74) (Figura 21), así como con el número total de cuartos infectados (r^{2} = 0,74) (Figura 22). La correlación se calculó utilizando el programa GraphPad Prism, versión 2.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, California).

Esta correlación también se ilustra en las Figuras 23 y 24 en las que el grupo inmunizado con GapC se subdivide en individuos con una respuesta elevada e individuos con una respuesta baja. En esas figuras, los "individuos de título bajo" se refiere a los cuatro animales con la peor respuesta frente a GapC, mientras que los "individuos de título elevado" se refiere al resto del grupo. En el grupo de título elevado no se produjo colonización, mientras que incluso el grupo de título bajo mostró un número reducido de bacterias recogidas después de tres días.

Ejemplo 5 Determinación de la respuesta inflamatoria

La respuesta inflamatoria se midió en función del recuento de células somáticas (es decir, linfocitos, neutrófilos y monocitos). Los recuentos de células somáticas se llevaron a cabo en un aparato de recuento Coulter utilizando técnicas estándar, tal como recomienda el Agriculture and Agri-Food Canada Pamphlet IDF50B (1985) "Milk and Milk products-Methods of Sampling". Las muestras siempre se analizaron dentro de las primeras 48 horas tras su recogida y fijación, en los días 1 y 7 tras la provocación.

Se determinó el número de células somáticas presentes en la glándula cada día tras la entrada en contacto con el microorganismo. En el cuarto no infectado, el recuento se mantuvo constante durante el estudio mientras que en el día 1, el grupo tratado con GapC obtuvo unos resultados inferiores que el grupo inmunizado con placebo (Figura 25). La diferencia entre los grupos GapC y placebo fue estadísticamente significativa. Los resultados individuales del día 1 se muestran en la Figura 26; los resultados de los animales tratados con GapC a lo largo de los siete días posteriores a la entrada en contacto con el microorganismo se muestran en la Figura 27. Las muestras de los cuartos de los animales inmunizados con GapC no podían distinguirse de los cuartos sin provocación.

Por lo tanto, la inmunización con GapC redujo la respuesta inflamatoria que sigue a la provocación con S. dysgalactiae.

Ejemplo 6 Protección cruzada frente a la infección por S. uberis

Durante los últimos 3 días del ensayo con las vacunas se recuperó una población mixta bacteriana de las secreciones de la glándula mamaria. Un análisis posterior con el ensayo API 20 Strep confirmó la identidad de las cepas presentes en la mezcla como S. dysgalactiae y S. uberis, representando el segundo de ellos una infección natural que tuvo lugar durante el ensayo. El grupo que fue inmunizado con GapC parecía mostrar una protección cruzada significativa frente a la colonización por S. uberis (véase la Figura 20), indicando que GapC quizás sea un antígeno con una amplia capacidad de protección cruzada frente a la infección por múltiples especies de estreptococos.

De esta forma, la vacunación con GapC de S. dysgalactiae es por tanto capaz de proporcionar protección cruzada frente a la infección por S. uberis.

Así, se describe la clonación, expresión y caracterización de diversas proteínas GapC de unión a plasmina, así como métodos de utilización de las mismas.

<110> University of Saskatchewan

\hskip1cm Bolton, Alexandra J.

\hskip1cm Perez-Casal, Jose

\hskip1cm Fontaine, Michael

\hskip1cm Potter, Andrew A.

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<120> INMUNIZACIÓN DE GANADO VACUNO LECHERO CON PROTEÍNA GapC FRENTE A INFECCIONES POR Streptococcus

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<130> O8-891814WO

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<140>

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<141>

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<160> 12

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 37

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador gapC1

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggcggcggca tatggtagtt aaagttggta ttaacgg

\hfill

37

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 35

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador gapC1r

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcggatcctt atttagcgat tttgcaaag tactc

\hfill

35

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<210> 3

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<211> 1011

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<212> DNA

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<213> Streptococcus dysgalactiae

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1011)

\newpage

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<400> 3

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100

101

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<210> 4

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<211> 336

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<212> PRT

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<213> Streptococcus dysgalactiae

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<400> 4

102

103

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<210> 5

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<211> 1011

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<212> DNA

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<213> Streptococcus agalactiae

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1011)

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<400> 5

104

105

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<210> 6

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<211> 336

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<212> PRT

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<213> Streptococcus agalactiae

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<400> 6

106

107

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<210> 7

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<211> 1011

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<212> DNA

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<213> Streptococcus uberis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1011)

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<400> 7

108

109

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<210> 8

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<211> 336

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<212> PRT

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<213> Streptococcus uberis

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<400> 8

110

111

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<210> 9

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<211> 1011

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<212> DNA

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<213> Streptococcus parauberis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1011)

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<400> 9

112

113

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<210> 10

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<211> 336

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<212> PRT

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<213> Streptococcus parauberis

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<400> 10

114

115

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<210> 11

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<211> 1011

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<212> DNA

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<213> Streptococcus iniae

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1011)

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<400> 11

116

117

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<210> 12

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<211> 336

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<212> PRT

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<213> Streptococcus iniae

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<400> 12

118

119

Claims

1. La utilización de una proteína GapC en la fabricación de la composición de una vacuna de utilidad en el tratamiento o la prevención de la mastitis en un sujeto mamífero, en la que la proteína GapC se selecciona del grupo formado por:

(a) una proteína GapC aislada de Streptococcus dysgalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la anterior;

(b) una proteína GapC aislada de Streptococcus agalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC. núm.: 6) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la anterior;

(c) una proteína GapC aislada de Streptococcus uberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC. núm.: 8) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la anterior;

(d) una proteína GapC aislada de Streptococcus parauberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC. núm.: 10) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la anterior;

(e) una proteína GapC aislada de Streptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.: 12) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la anterior.

2. La utilización de la reivindicación 1, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus dysgalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4).

3. La utilización de la reivindicación 1, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus agalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC. núm.: 6).

4. La utilización de la reivindicación 1, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus uberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC. núm.: 8).

5. La utilización de la reivindicación 1, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus parauberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC. núm.: 10).

6. La utilización de la reivindicación 1, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.: 12).

7. La utilización de un polinucleótido formado por una secuencia codificante de una proteína GapC en la fabricación de la composición de una vacuna de utilidad en el tratamiento o la prevención de la mastitis en un sujeto mamífero, en la que la proteína GapC se selecciona del grupo formado por:

\newpage

8. La utilización de la reivindicación 7, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus dysgalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4).

9. La utilización de la reivindicación 7, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus agalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC. núm.: 6).

10. La utilización de la reivindicación 7, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus uberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC. núm.: 8).

11. La utilización de la reivindicación 7, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus parauberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC. núm.: 10).

12. La utilización de la reivindicación 7, en la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.: 12).

13. La utilización de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, en la que el sujeto mamífero es un sujeto bovino.