ES2273861T3 - Inmunizacion de ganado vacuno lechero con proteina gapc frente a infecciones por streptococcus. - Google Patents
Inmunizacion de ganado vacuno lechero con proteina gapc frente a infecciones por streptococcus. Download PDFInfo
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Abstract
La utilización de una proteína GapC en la fabrica- ción de la composición de una vacuna de utilidad en el tra- tamiento o la prevención de la mastitis en un sujeto mamí- fero, en la que la proteína GapC se selecciona del grupo formado por: (a) una proteína GapC aislada de Sreptococcus dysga- lactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclu- sive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4) o una se- cuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior; (b) una proteína GapC aislada de Sreptococcus agalac- tiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC. núm.: 6) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior; (c) una proteína GapC aislada de Sreptococcus uberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC. núm.: 8) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior; (d) una proteína GapC aislada de Sreptococcus paraube- ris que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC. núm.: 10) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior; (e) una proteína GapC aislada de Sreptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.: 12) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de al menos el 80 % con la anterior.
Description
Inmunización de ganado vacuno lechero con
proteína GapC frente a infecciones por Streptococcus.
La presente invención se refiere, en términos
generales, a antígenos bacterianos y a los genes que codifican los
mismos. Más concretamente, la presente invención se refiere a la
clonación, expresión y caracterización de las proteínas GapC de
unión a plasmina procedentes de Streptococcus dysgalactiae,
Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus
parauberis y Streptococcus inicie, y a la utilización de
las mismas en la composición de vacunas.
La mastitis es una infección de la glándula
mamaria provocada generalmente por bacterias y hongos. La respuesta
inflamatoria que se produce tras la infección provoca una
disminución en el rendimiento y la calidad de la producción de
leche y provoca anualmente pérdidas económicas considerables a la
industria lechera.
Entre las especies bacterianas que se asocian
habitualmente con la mastitis se encuentran 20 especies del género
Streptococcus, incluyendo Streptococcus aureus,
Streptococcus uberis (sin tipificar), Streptococcus
agalactiae (grupo B de Lancefield), Streptococcus
dysgalactiae (grupo C de Lancefield), Streptococcus
zooepidemicus, y los estreptococos de los grupos de Lancefield
D, G, L y N. Algunas de estas especies son enfermedades infecciosas
(p. ej. S. agalactiae), mientras que otras se consideran
patógenos ambientales (p. ej. S. dysgalactiae y S.
uberis).
El patógeno ambiental S. uberis es el
responsable de alrededor del 20% de todos los casos clínicos de
mastitis (Bramley, A.J. y Dodd, F.H. [1984] J. Dairy Res.
51:481-512; Bramley, A.J. [1987] Animal
Health Nutrition 42:12-16; Watts, J.L.
[1988] J. Dairy Sci. 71:1616-1624); es
el microorganismo aislado predominantemente de las glándulas
mamarias durante los periodos no lactantes (Bramley, A.J. [1984]
Br. Vet. J. 140:328-335; Bramley y
Dodd [1984] J. Dairy Res. 51:481-512;
Oliver, S.P. [1988] Am. Vet. Res.
49:1789-1793).
Normalmente, la mastitis que se produce como
resultado de una infección por S. uberis es subclínica y se
caracteriza por la producción de una leche aparentemente normal
pero que presenta un incremento en el recuento de células somáticas
debido a la afluencia de leucocitos. La composición química de la
leche cambia debido a la supresión de la secreción, con una
transferencia de cloruro sódico y bicarbonato de la sangre a la
leche que provoca un cambio hacia un pH más alcalino. La mastitis
por S. uberis también adopta la forma de un trastorno clínico
agudo con signos evidentes de enfermedad como presencia de coágulos
y cambio de coloración en la leche e inflamación y endurecimiento
de la glándula mamaria. Algunos casos de esta enfermedad con
manifestación clínica pueden ser graves y puede presentarse
pirexia. Para una revisión de las manifestaciones clínicas de la
mastitis por S. uberis consúltense: Bramley (1991)
Mastitis: physiology or pathology, pp. 3-9,
en C. Burvenich, G. Vandeputte-van Messom y A. W.
Hill (ed.), New insights into the pathogenesis of mastitis,
Rijksuniversiteit Gent, Bélgica; y Schalm et al. (1971) The
mastitis complex - A brief summary, pp. 1-3, en
Bovine Mastitis, Lea & Febiger, Philadelphia.
Los métodos convencionales de control
antibacteriano como la desinfección de pezones postordeño y el
tratamiento con antibióticos son eficaces en el control de muchos
tipos de mastitis contagiosa, pero los microorganismos presentes en
el ambiente que se encuentran habitualmente en los establos del
ganado suelen ser resistentes a esas medidas. Por tanto, la
vacunación es una estrategia interesante que previene las
infecciones de las glándulas mamarias y ha demostrado ser
beneficiosa en el caso de algunos patógenos contagiosos causantes de
mastitis.
Existe una literatura limitada en referencia a
estudios de vacunación con S. dysgalactiae y S. uberis
y se ha observado resultados variables. En algunos casos, la
inmunización ha resultado en un aumento de la vulnerabilidad al
microorganismo específico y, en otros casos, se ha obtenido
protección frente a una cepa específica.
Por ejemplo, en estudios previos se ha
demostrado que la infección primaria con S. uberis puede
reducir considerablemente la tasa de infección tras una segunda
prueba de provocación con la misma cepa (Hill, A.W. [1988] Res.
Vet. Sci. 44:386-387). La vacunación
local con microorganismos muertos de S. uberis protege a la glándula
mamaria frente a la infección con la cepa homóloga (Finch et
al. (1994) Infect. Immun. 62:3599-3603).
De forma similar, se ha demostrado que la vacunación subcutánea con
microorganismos vivos de S. uberis provoca una modificación
dramática de la patogenia de la mastitis causada por la misma cepa
(Hill et al. [1994] FEMS Immunol. Med. Microbiol.
8:109-118). Los animales vacunados de este
modo producen leche con una menor cantidad de bacterias y muchos
animales se mantienen libres de infección.
Sin embargo, la vacunación con cepas vivas o
atenuadas puede suponer un riesgo para el animal receptor. Además,
es evidente que las vacunas convencionales de microorganismos
muertos no son, en general, nada efectivas frente a S.
uberis y S. agalactiae, o por su falta de antígenos
protectores en células in vitro o por el enmascaramiento de
dichos antígenos mediante mimetismo molecular.
La falta actual de vacunas para mastitis
provocadas por S. agalactiae y cepas infecciosas de
estreptococos se debe, al menos en parte, a una falta de
conocimientos respecto a los determinantes de virulencia y los
antígenos protectores producidos por aquellos microorganismos que
están implicados en la invasión y la protección de la glándula
mamaria (Collins et al. [1988] J. Dairy Res.
55:25-32; Leigh et al. [1990] Res.
Vet. Sci. 49:85-87; Marshall et
al. (1986) J. Dairy Res.
53:507-514).
Se sabe que S. dysgalactiae se une a
varias proteínas plasmáticas como la fibronectina, el fibrinógeno,
el colágeno, la
alfa-II-macroglobulina, las IgG, la
albúmina y otros compuestos. El microorganismo también produce
hialuronidasa y fibrinolisina y es capaz de adherirse a las células
epiteliales de las glándulas mamarias e invadirlas. No obstante, no
se conocen los papeles exactos desempeñados por estos componentes
bacterianos responsables de estos fenotipos en la patogenia.
De forma similar, se conoce muy poco sobre la
patogenia de la infección por S. uberis. Además, no está bien
definida la influencia de los factores de virulencia de S.
uberis en los mecanismos de defensa y en la fisiología de la
glándula mamaria. Entre los factores de virulencia asociados con
S. uberis se encuentran la cápsula de ácido hialurónico
(Hill, A.W. [1988] Res. Vet. Sci.
45:400-404), la hialuronidasa (Schaufuss
et al. [1989] Zentralbl. Bakteriol. Ser. A
271:46-53), la proteína
tipo-R (Groschup, M.H. y Timoney, J.F. [1993]
Res. Vet. Sci. 54:124-126) y una
cohemolisina, el factor CAMP, también conocido como el factor UBERIS
(Skalka, B. y Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A
249:190-194), la proteína
tipo-R, el activador de plasminógeno y el factor
CAMP. Sin embargo, se conoce muy poco de sus funciones en la
patogenicidad.
Se ha propuesto la utilización de determinantes
de virulencia de Streptococcus como agentes inmunogénicos.
Por ejemplo, se ha demostrado que el factor CAMP de S. uberis
protege a organismos vertebrados frente a la infección por este
microorganismo (Jiang, Patente estadounidense núm. 5 863 543).
El antígeno \gamma de la cepa A909 (núm. ATCC
27591) de estreptococos del grupo B es un componente del complejo
marcador de la proteína C, que consta adicionalmente de una
subunidad \alpha y una \beta (Boyle, Patente estadounidense
núm. 5 721 339). Se ha descrito que subpoblaciones de los serotipos
Ia, II y prácticamente todos los tipos celulares del subtipo Ib de
los estroptococos del grupo B expresan componentes de la proteína
C. Se ha propuesto la utilización de subunidades \gamma como
agentes inmunogénicos frente a las infecciones por estreptococos
del grupo B de Lancefield. No obstante, no se ha estudiado su uso en
la prevención y el tratamiento de infecciones en animales, entre
ellas la mastitis en el ganado vacuno.
Se considera a la proteína M de los
estreptococos del grupo A como uno de los factores de virulencia
principales de este microorganismo debido a su capacidad para
impedir el ataque de los fagocitos humanos (Lancefield, R.C. [1962]
J. Immunol. 89:307-313). Las bacterias
persisten en el tejido infectado hasta que se producen los
anticuerpos frente a la molécula M. Los anticuerpos específicos para
la proteína M son capaces de revertir el efecto antifagocítico de
la molécula y permiten la eliminación del microorganismo
invasor.
Las proteínas M son uno de los factores de
virulencia clave de Streptococcus pyogenes, debido al papel
que desempeñan interviniendo en la resistencia a la fagocitosis
(Kehoe, M.A. [1991] Vaccine 9:797-806)
y a su capacidad para inducir respuestas inmunitarias dañinas del
huésped a través de su superantigenicidad y su capacidad para
inducir reacciones cruzadas entre anticuerpos (Bisno, A.L. [1991]
New Engl. J. Med. 325:783-793; Froude
et al. [1989] Curr. Top. Microbiol. Immunol.
145:5-26; Stollerman, G.H. [1991] Clin.
Immunol. Immunopathol. 61:131-142).
Sin embargo, existen obstáculos en la
utilización como vacunas de las proteínas M intactas. Los epítopos
opsónicos de la proteína son extremadamente específicos por lo que
confieren una protección específica muy acotada. Además, algunas
proteínas M contienen epítopos que provocan una reacción cruzada con
tejidos del individuo inmunizado, conduciendo a una respuesta
autoinmunitaria dañina (Véanse p. ej., Dale, J.L. y Beached, G.H.
[1982] J. Exp. Med. 156:1165-1176;
Dale, J.L. y Beached, G.H. [1985] J. Exp. Med.
161:113-122; Baird, R.W., Bronze, M.S.,
Drabs, W., Hill, H.R., Veasey, L.G. y Dale, J.L. [1991] J.
Immun. 146:3132-3137; Bronze, M.S. y
Dale, J.L. [1993] J. Immun.
151:2820-2328; Cunningham, M.W. y Russell,
S.M. [1983] Infect. Immun.
42:531-538).
Se han expresado proteínas quiméricas que
contienen tres dominios diferentes de unión a fibronectina derivados
de las proteínas de unión a fibronectina de S. dysgalactiae
y Staphylococcus aureus en la superficie de células de
Staph. carnosus. En el caso de una de esas proteínas, las
inmunizaciones intranasales con células vivas de Staph.
carnosus recombinantes que expresaban la proteína quimérica en
su superficie resultaron en una mejora de la respuesta de
anticuerpos frente a un inmunógeno modelo presente en la proteína
quimérica de superficie.
Con anterioridad se ha identificado y
caracterizado una proteína GapC de unión a plasmina de una cepa del
grupo A de Streptococcus y se ha descrito su utilización en
tratamientos trombolíticos (Boyle, et al., Patente
estadounidense núm. 5 237 050; Boyle, et al., Patente
estadounidense núm. 5 328 996).
Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado
ni la capacidad protectora de GapC ni se han aislado ni
caracterizado las proteínas GapC de Streptococcus dysgalactiae,
Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus
parauberis o Streptococcus iniae.
\newpage
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un uso novedoso de la proteína GapC en la fabricación
de la composición de una vacuna útil para el tratamiento y la
prevención de la mastitis en mamíferos; en este proceso la proteína
GapC se selecciona a partir del siguiente grupo:
(a) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus dysgalactiae que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC.
núm.: 4) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de
similitud con la misma.
(b) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus agalactiae que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC.
núm.: 6) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de
similitud con la misma.
(c) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus uberis que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC.
núm.: 8) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de
similitud con la misma.
(d) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus parauberis que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC.
núm.: 10) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de
similitud con la misma.
(e) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos
mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos
inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.:
12).
En otra realización, la invención se refiere a
la utilización de un polinucleótido que consta de una secuencia de
la proteína GapC para la fabricación de la composición de una vacuna
útil para el tratamiento y la prevención de mastitis en mamíferos;
en la que la proteína GapC se selecciona a partir del siguiente
grupo:
(a) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus dysgalactiae que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC.
núm.: 4) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de
similitud con la misma.
(b) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus agalactiae que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC.
núm.: 6) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de
similitud con la misma.
(c) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus uberis que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC.
núm.: 8) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de
similitud con la misma.
(d) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus parauberis que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC.
núm.: 10) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de
similitud con la misma.
(e) Una proteína GapC aislada de
Streptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos
mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos
inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.:
12) o una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 80% de
similitud con la misma.
Además la composición de la vacuna debe contener
un adyuvante.
Las Figuras 1A-1B muestran las
secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos
deducidas del gen gapC de S. dysgalactiae (ID. de
SEC. núm.: 3 e ID. de SEC. núm.: 4).
Las Figuras 2A-2B muestran las
secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos
deducidas del gen gapC de S. agalactiae (ID. de SEC.
núm.: 5 e ID. de SEC. núm.: 6).
Las Figuras 3A-3B muestran las
secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos
deducidas del gen gapC de S. uberis (ID. de SEC.
núm.: 7 e ID. de SEC. núm.: 8).
Las Figuras 4A-4B muestran las
secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos
deducidas del gen gapC de S. parauberis (ID. de SEC.
núm.: 9 e ID. de SEC. núm.: 10).
Las Figuras 5A-5B muestran las
secuencias de nucleótidos aisladas y las secuencias de aminoácidos
deducidas del gen gapC de S. iniae (ID. de SEC. núm.:
11 e ID. de SEC. núm.: 12).
Las Figuras 6A-6E muestran una
alineación de DNA creada por PileUp y mostrada por Pretty software
(un componente del GCG Wisconsin Package, versión 10, suministrado
por el paquete de análisis de secuencias SeqWeb, versión 1.1, de la
Canadian Bioinformatics Resource). La figura muestra las secuencias
de nucleótidos aisladas de los genes gapC de S.
dysgalactiae (DysGapC, Check 9344), S. agalactiae
(AgalGapC, Check 2895), S. uberis (UberGapC, Check 5966),
S. parauberis (PUberGapC, Check 9672) y S. iniae
(IniaeGapC, Check 990). También se incluyen las secuencias
previamente conocidas de S. equisimilis (SeqGapC, Check
5841), S. pyogenes (SpyGapC, Check 4037) y una proteína
GAPDH bovina (BovGapC, check 5059). Los parámetros de longitud y
peso y son los mismos para todas las secuencias (1018 y 1,00;
respectivamente). Los parámetros utilizados para la comparación de
secuencias de DNA fueron los siguientes:
Plurality-2,00; Threshold-1;
AveWeight-1,00; AveMatch-1,00;
AvMisMatch-0,00; Symbol comparison
table-pileupdna.cmp; CompCheck-6876;
GapWeight-5; GapLengthWeight-1;
PileUp MSF-10l8; Type-N;
Check-3804. En la figura, las rayas representan
nucleótidos idénticos; los puntos representan gaps introducidos por
el software utilizado para generar el diagrama de alineación; y las
tildes (\sim) representan regiones no incluidas en la alineación
total debido a diferencias en la longitud de la secuencia
génica.
Las Figuras 7A-7B muestran una
alineación de una secuencia de aminoácidos creada por PileUp y
mostrada por Pretty (igual que la Figura anterior) que muestran las
secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las proteínas GapC
de S. dysgalactiae (DysGapC, Check 6731) , S.
agalactiae (AgalGapC, Check 1229), S. uberis (UberGapC,
Check 8229), S. parauberis (PUberGapC, Check 8889) y S.
iniae (IniaeGapC, check 8785). También se incluyen las
secuencias ya conocidas de S. equisimilis (SeqGapC, Check
8252), S. pyogenes (SpyGapC, Check 6626) y una proteína
GAPDH bovina (BovGapC, Check 8479). En la figura, las rayas
representan residuos idénticos de aminoácidos; los puntos
representan gaps introducidos por el software PileUp; y las tildes
(\sim) representan regiones no incluidas en la alineación total
debido a diferencias en la longitud de las secuencias génicas.
La Figura 8 muestra los diagramas de hidropatía
en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una
ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini,
diagramas de flexibilidad de la cadena de
Karplus-Schulz, diagramas del índice de
antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la
estructura secundaria Chou-Fasman y
Garnier-Osguthorpe-Robson para la
proteína GapC aislada de S. dysgalactiae.
La Figura 9 muestra los diagramas de hidropatía
en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una
ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini,
diagramas de flexibilidad de la cadena de
Karplus-Schulz, diagramas del índice de
antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la
estructura secundaria Chou-Fasman y
Garnier-Osguthorpe-Robson para la
proteína GapC aislada de S. agalactiae.
La Figura 10 muestra los diagramas de hidropatía
en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una
ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini,
diagramas de flexibilidad de la cadena de
Karplus-Schulz, diagramas del índice de
antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la
estructura secundaria Chou-Fasman y
Garnier-Osguthorpe-Robson para la
proteína GapC aislada de S. uberis.
La Figura 11 muestra los diagramas de hidropatía
en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una
ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini,
diagramas de flexibilidad de la cadena de
Karplus-Schulz, diagramas del índice de
antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la
estructura secundaria Chou-Fasman y
Garnier-Osguthorpe-Robson para la
proteína GapC aislada de S. parauberis.
La Figura 12 muestra los diagramas de hidropatía
en la escala de Kyte-Doolittle (media sobre una
ventana de 7), diagramas de probabilidad de superficie de Emini,
diagramas de flexibilidad de la cadena de
Karplus-Schulz, diagramas del índice de
antigenicidad de Jameson-Wolf y diagramas de la
estructura secundaria Chou-Fasman y
Garnier-Osguthorpe-Robson para la
proteína GapC aislada de S. iniae.
La Figura 13 es una representación gráfica de
los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria
para la proteína GapC aislada de S. dysgal.
La Figura 14 es una representación gráfica de
los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria
para la proteína GapC aislada de S. agalactiae.
La Figura 15 es una representación gráfica de
los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria
para la proteína GapC aislada de S. uberis.
La Figura 16 es una representación gráfica de
los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria
para la proteína GapC aislada de S. parauberis.
La Figura 17 es una representación gráfica de
los diagramas Chou-Fasman de estructura secundaria
para la proteína GapC aislada de S. iniae.
La Figura 18 muestra los resultados de una
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de la
proteína GapC recombinante de S. dysgalactiae producida en
E. coli DE3. Carril 1, marcador de peso molecular (20,5 -
103 kDa; BioRad, Emeryville, CA); carril 2, proteína GapC
recombinante soluble de S. dysgalactiae purificada por
cromatografía de afinidad en Ni-NTA. Los números a
la izquierda de la figura indican las posiciones de los marcadores
de peso molecular (en KDa).
La Figura 19 es un histograma que compara la
actividad enzimática de: la plasmina bovina unida a células intactas
de S. dysgalactiae, la plasmina bovina unida a proteína GapC
recombinante de S. dysgalactiae purificada por cromatografía
de afinidad y de células de S. dysgalactiae intactas,
proteína GapC recombinante de S. dysgalactiae purificada por
cromatografía de afinidad y plasmina bovina, las tres por separado.
La actividad enzimática se midió mediante los aumentos de
absorbancia a 405 nm tras la liberación de paranitroanilida de su
sustrato sintético Chromozym-PL (Roche Diagnostics,
Laval, Quebec, Canadá). Los resultados representan la media de tres
ensayos independientes.
En la Figura 20 se comparan los cambios en el
porcentaje de cuartos de las ubres infectados por S.
dysgalactiae durante un periodo de siete días en tres grupos
experimentales: (1) animales control sin vacunar; (2) animales
vacunados con proteína Mig de unión a Fc; y (3) animales vacunados
con GapC. La infección se definió como la aparición de >500 ufc
de S. dysgalactiae por ml en la leche secretada.
La Figura 21 representa el número máximo de
S. dysgalactiae en cualquier cuarto de ubre frente a la
titulación de anticuerpos anti-GapC séricos
(expresada como el recíproco a la dilución que muestra actividad por
encima de los niveles basales). Los títulos de
anti-GapC se correlacionaron con el número máximo de
ufc recuperadas de las glándulas mamarias r^{2}=0,74, calculado
con la aplicación informática GraphPadPrism, v. 2.01, de GraphPad
Software, Inc., San Diego, CA).
La Figura 22 representa el número acumulado de
cuartos mamarios afectados frente a la titulación de anticuerpos
(de nuevo expresada como el recíproco a la dilución que muestra
actividad por encima de los niveles basales). Se observó una
correlación muy buena entre los niveles de anticuerpos séricos
anti-GapC y el número total de cuartos
infectados.
La Figura 23 ilustra la presencia de bacterias
en animales inmunizados con GapC; cada punto representa el número
medio de bacterias presentes por ml de leche respecto al tiempo (en
días tras la provocación). En la Figura 20, los diamantes
(-\blacklozenge-) representan los animales no vacunados; los
cuadrados (-\blacksquare-) representan los animales con un título
bajo (es decir, los animales que muestran la peor respuesta frente
a GapC en función de su título de anticuerpos), y los triángulos
(-\Delta-) representan los animales con un título elevado (es
decir, el resto de animales).
La Figura 24 muestra la presencia de S.
dysgalactiae en animales inmunizados con GapC, representados
como el porcentaje de cuartos mamarios infectados frente al tiempo
en días tras la provocación. En la figura, las barras punteadas
representan los animales no vacunados; las barras con rayas
diagonales representan los animales con títulos bajos (es decir,
los animales que muestran la peor respuesta frente a GapC en función
de su título de anticuerpos); y las barras blancas representan los
animales con títulos elevados (es decir, el resto de animales).
La Figura 25 muestra las respuestas
inflamatorias observadas causadas por la infección con S.
dysgalactiae, representadas como los recuentos medios de
células somáticas (RCS) para cada grupo experimental frente al
tiempo en días tras la provocación. En la figura, los diamantes
(-\blacklozenge-) representan los cuartos sin vacuna ni
provocación; los cuadrados (-\blacksquare-) representan animales
no vacunados a los que se ha realizado una provocación; los
triángulos (-\Delta-) representan los animales vacunados con Mig y
sometidos a provocación; y las x (-X-) representan los animales
vacunados con GapC y sometidos a provocación.
La Figura 26 ilustra los recuentos de células
somáticas por cuarto en el día 1 tras la provocación. En la figura,
la barra representa la media para cada grupo. Los cuadrados
representan (-\blacksquare-) los animales no vacunados; los
triángulos representan (-\ding{115}-) los animales vacunados con
GapC; y los triángulos invertidos (-\ding{116}-) los animales
vacunados con Mig.
La Figura 27 muestra los recuentos de células
somáticas de animales con títulos elevados no vacunados, sin
provocación e inmunizados con GapC (es decir, los cuatro animales
que presentaron los títulos de anticuerpos más elevados de los ocho
animales de cada grupo) durante un periodo de siete días tras la
provocación, representado como el log_{10} de los recuentos
medios de células somáticas por ml de leche respecto al tiempo en
días tras la provocación. los diamantes (-\blacklozenge-)
representan los animales sin vacuna ni provocación; los cuadrados
(-\blacksquare-) representan los animales no vacunados a los que
se ha realizado una provocación; los triángulos (-\Delta-)
representan los animales vacunados con GapC y sometidos a
provocación.
La puesta en práctica de la presente invención
utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas
convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología del
DNA recombinante e inmunología, que se encuentran entre las
técnicas de cada campo. Dichas técnicas se encuentran ampliamente
descritas en la literatura. Véanse, p. ej., Sambrook, Fritsch &
Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II
y III, Segunda edición (1989); Perbal, B., A Practical Guide to
Molecular Cloning (1984); las series, Methods In
Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press,
Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Vols.
I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., 1986,
Blackwell Scientific Publications).
A lo largo de todo el texto se utilizarán las
siguientes abreviaciones de los aminoácidos:
\newpage
Alanina: Ala (A) | Arginina: Arg (R) |
Asparagina: Asn (N) | Ácido Aspártico: Asp (D) |
Cisteína: Cys (C) | Glutamina: Gln (Q) |
Ácido Glutámico: Glu (E) | Glicina: Gly (G) |
Histidina: His (H) | Isoleucina: Ile (1) |
Leucina: Leu (L) | Lisina: Lys (K) |
Metionina: Met (M) | Fenilalanina: Phe (F) |
Prolina: Pro (P) | Serina: Ser (S) |
Treonina: Thr (T) | Triptófano: Trp (W) |
Tirosina: Tyr (Y) | Valina: Val (V) |
En la descripción de la presente invención, se
utilizarán los siguientes términos que se definen como se indica
más adelante.
Cabe destacar que, tal como se usa en esta
especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas
singulares "un/una" y "él/la" incluyen referentes
plurales a menos que se especifique claramente lo contrario. Así,
por ejemplo, la referencia a la "proteína GapC de
Streptococcus" incluye una mezcla formada por dos o más de
dichas proteínas, etcétera.
Los términos "proteína GapC" y "proteína
GapC de unión a plasmina" (que se utilizan de forma
intercambiable en este documento) o una secuencia de nucleótidos
que codifica la misma, se refieren a una proteína o secuencia de
nucleótidos, respectivamente, que derivan del gen GapC presente en
una variedad de especies de Streptococcus, que incluyen, sin
limitación, ciertas cepas de los estreptococos del grupo A
(Lottenbery, R., et al. [1987] Infect. Immun.
55:1914-1918). En las figuras se muestra la
secuencia de nucleótidos de los genes gapC representativos
de Streptococcus y las correspondientes secuencias de
aminoácidos de las proteínas GapC que codifican esos genes. En
particular, las figuras de la 1 a la 5 muestran las secuencias de
nucleótidos y las secuencias de aminoácidos aisladas de S.
dysgalactiae (ID. de SEC. núm.: 3 e ID. de SEC. núm.: 4,
respectivamente), S. agalactiae (ID. de SEC. núm.: 5 e ID.
de SEC. núm.: 6, respectivamente), S. uberis (ID. de SEC.
núm.: 7 e ID. de SEC. núm.: 8, respectivamente), S.
parauberis (ID. de SEC. núm.: 9 e ID. de SEC. núm.: 10,
respectivamente) y S. iniae (ID. de SEC. núm.: 11 e ID. de
SEC. núm.: 12, respectivamente). No obstante, una proteína GapC tal
como se describe en este documento no se limita a las secuencias
mostradas, ya que se conocen subtipos de cada una de esas especies
de Streptococcus y existirán variaciones entre ellas.
Se encuentran genes gapC representativos,
derivados de S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis y
S. parauberis, en los plásmidos pETl5bgapC (núm. ATCC),
pMF52lc (núm. ATCC), pMF52la (núm. ATCC), pMF52ld (núm. ATCC) y
pMF52le (núm. ATCC), respectivamente.
Además, las secuencias proteicas o nucleotídicas
derivadas no tienen que proceder necesariamente del gen descrito
anteriormente, sino que pueden producirse mediante cualquier otro
método como, p. ej., síntesis química, aislamiento (p. ej. de S.
dysgalactiae) o por producción en sistemas recombinantes,
basados en la información que se presenta en este documento.
Además, el término está destinado a proteínas que poseen secuencias
de aminoácidos con una homología sustancial (como se define
posteriormente) respecto a las secuencias de aminoácidos contiguas
codificadas por los genes que proporcionan actividad inmunológica o
de unión a plasmina.
Así, los términos están destinados tanto a
secuencias completas como a secuencias parciales, truncadas e
inmunogénicas; así como a las formas precursoras y los análogos
activos de la proteína. También se incluyen en el término
fragmentos nucleotídicos del gen que poseen, como mínimo, alrededor
de ocho pares de bases contiguas; se prefiere más un mínimo de
entre 10 y 20; y, aún más, un mínimo de entre 25 y 50 (o más) pares
de bases contiguas del gen, o cualquier entero entre esos valores.
Dichos fragmentos son útiles como sondas en los métodos de
diagnóstico que se comentarán en detalle más adelante.
Los términos también incluyen aquellas formas
que poseen, así como las que no, una secuencia señal si es que esta
está presente, además de las secuencias de ácidos nucleicos que la
codifican. Además, el término está destinado a las formas proteicas
de GapC que no presentan una región de anclaje a la membrana y a las
secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas con dichas
deleciones. Estas deleciones pueden ser apropiadas en sistemas que
no permiten la secreción de la proteína. Además, los dominios de
unión a plasmina de la proteína pueden estar presentes o no
estarlo. Así, por ejemplo, si la proteína GapC de unión a plasmina
se usa para purificar plasmina, generalmente se conservará el
dominio de unión a plasmina. Si la proteína se utiliza en las
composiciones de vacunas, estarán presentes los epítopos
inmunogénicos, que pueden incluir los dominios de unión a plasmina
o no incluirlos.
Los términos también incluyen proteínas en su
forma neutra o en su forma de sales de adición ácidas y básicas
dependiendo del modo de preparación. Dichas sales de adición ácidas
pueden formarse con grupos amino y dichas sales básicas con
carboxilos libres. Más adelante se comentarán en detalle las sales
de adición ácidas y básicas farmacéuticamente aceptables. Además,
las proteínas se pueden modificar mediante la combinación con otros
materiales biológicos, como lípidos (tanto los que aparecen de forma
natural con la molécula como otros lípidos que no destruyen la
respuesta inmunitaria) y polisacáridos; o mediante modificación de
las cadenas laterales, como la acetilación de grupos amino, la
fosforilación de cadenas laterales hidroxilo, la oxidación de grupos
sulfhidrilo, la glicosilación de residuos de aminoácidos, así como
otras modificaciones de la secuencia primaria codificada.
El término, por tanto, está destinado a
deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre y
cuando el polipéptido sea capaz de producir una respuesta
inmunitaria tal como se define en este documento. En ese sentido,
las sustituciones que se prefieren especialmente serán, en general,
de naturaleza conservadora, es decir, dichas sustituciones tendrán
lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los
aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos
-glutamato y aspartato; (2) básicos -lisina, arginina e histidina;
(3) apolares -alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,
fenilalanina, metionina y triftófano; y (4) apolares sin carga
-glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina y
tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se
clasifican, a veces, como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es
razonable predecir que el remplazo aislado de leucina por
isoleucina o valina, y viceversa; un aspartato por glutamato, y
viceversa; una treonina por una serina, y viceversa; o un remplazo
conservador similar de un aminoácido por otro aminoácido
estructuralmente relacionado, no suponga un efecto importante en la
actividad biológica. Por tanto, las proteínas que poseen una
secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la molécula de
referencia, pero que poseen sustituciones sin importancia de
aminoácidos que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad o
la afinidad de la proteína para unirse a plasmina, se encuentran
dentro de la definición del polipéptido de referencia.
Por ejemplo, el polipéptido de interés puede
incluir hasta un máximo de entre 5 y 10 sustituciones conservadoras
o no conservadoras de aminoácidos, o incluso hasta un máximo de
entre 15 y 25 o 20 y 50 sustituciones conservadoras o no
conservadoras, o cualquier número entero entre esos valores, siempre
y cuando la función de la molécula se mantenga intacta.
En ese sentido, las proteínas GapC aisladas de
estreptococos muestran varias regiones variables en sus secuencias
de aminoácidos, localizadas en las posiciones de la 62 a la 81; de
la 102 a la 112; de la 165 a la 172; de la 248 a la 271; y de la
286 a la 305.
Estas regiones, que en S. dysgalactiae, S.
agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae muestran
sustituciones en los aminoácidos del 1 al 9, son susceptibles de
presentar variación sin que afecte sustancialmente a la función
enzimática o inmunogénica.
Asimismo, las sustituciones que suceden en el
dominio de unión transmembrana, si está presente, y en la secuencia
señal, si está presente, normalmente no afectan a la
inmunogenicidad. Un experto en la materia puede determinar
fácilmente otras regiones de la molécula de interés que puedan
tolerar cambios en referencia a la estructura de la proteína
mostrada en las figuras de la 8 a la 17 presentes en este
documento.
El término "proteína GapC estreptocócica"
está destinado a proteínas de unión a plasmina, tal como se ha
definido anteriormente, que derivan de especies de estreptococos
que producen la misma. Entre ellas, aunque no están limitadas a las
mismas, se encuentran las siguientes especies: S. dysgalactiae,
S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae. Por
ejemplo, una "proteína GapC de S. dysgalactiae" es una
proteína GapC de unión a plasmina, tal como se ha definido
anteriormente, que deriva de S. dysgalactiae. Asimismo, una
"proteína GapC de S. agalactiae" se refiere a una
proteína de unión GapC que deriva de S. agalactiae.
Los términos proteínas "salvajes" o
"nativas" se refieren a proteínas o polipéptidos aislados de la
fuente en la cual las proteínas aparecen de forma natural. Los
polipéptidos "recombinantes" son aquellos polipéptidos
producidos mediante técnicas del DNA recombinante; es decir,
producidas a partir de células transformadas por un constructo de
DNA exógeno que codifica el polipéptido deseado. Los polipéptidos
"sintéticos" son aquellos que se preparan mediante síntesis
química.
El término proteína o polipéptido "aislado"
se refiere a una molécula de proteína o polipéptido que está
separada y diferenciada del organismo completo en el que se
encuentra la molécula de forma natural; o una proteína o
polipéptido desprovisto, total o parcialmente, de secuencias
normalmente asociadas con él de forma natural; o una secuencia en
su forma natural, pero que posee secuencias heterólogas (tal como se
definen más adelante) en asociación con ella.
El término "funcionalmente equivalente" se
refiere a una secuencia de aminoácidos de una proteína GapC de
unión a plasmina que desencadena una respuesta inmunitaria
sustancialmente equivalente o mejorada, como se ha definido
anteriormente, comparada con la respuesta desencadenada por la
proteína GapC de unión a plasmina que sea igual a la proteína GapC
de unión a plasmina de referencia o una porción inmunogénica de la
misma.
El término "epítopo" se refiere al lugar
del antígeno o hapteno al cual los linfocitos B o T específicos
responden. El término también es intercambiable por "determinante
antigénico" o "sitio antigénico". Se pueden identificar los
anticuerpos que se unen al mismo epítopo a través de un inmunoensayo
que tenga la capacidad de que un anticuerpo bloquee la unión de
otro anticuerpo mediante su unión a un antígeno diana.
El término proteína o polipéptido
"inmunogénico" se refiere a una secuencia de aminoácidos que
desencadena una respuesta inmunológica tal como se ha descrito
anteriormente. Una proteína o un polipéptido "inmunogénico",
tal como se usan en el presente documento, incluyen la secuencia
completa de la proteína GapC de unión a plasmina en cuestión con
cualquiera o ninguno de la secuencia señal, el dominio de unión a
membrana, el dominio de unión a plasmina y análogos o fragmentos
inmunogénicos de los mismos. El término "fragmento
inmunogénico" se refiere a un fragmento de la proteína GapC de
unión a plasmina que incluye uno o más epítopos y, así, desencadena
la respuesta inmunitaria descrita anteriormente. Se pueden
identificar dichos fragmentos utilizando diferentes técnicas muy
conocidas en el campo para mapear epítopos. Véase, p. ej.,
Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology,
Vol. 66 (Glenn E. Monis, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New
Jersey. Por ejemplo, se pueden determinar los epítopos lineales
mediante, p. ej., la síntesis simultánea de un gran número de
péptidos en soportes sólidos, siendo péptidos que corresponden a
porciones de la molécula proteica, y haciendo reaccionar dichos
péptidos con los anticuerpos mientras los primeros se encuentran
todavía unidos al soporte. Dichas técnicas se conocen en el campo y
están descritas en, p. ej., la Patente estadounidense núm. 4 708
871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81:3998-4002; Geysen et al.
(1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De
forma similar, los epítopos conformacionales se identifican
fácilmente a través de la determinación de la conformación espacial
de los aminoácidos mediante, p. ej., la cristalografía de rayos X o
la resonancia magnética nuclear en dos dimensiones. Véase, p. ej.,
Epitope Mapping Protocols, supra. También se pueden
identificar regiones antigénicas de las proteínas utilizando
diagramas estándar de antigenicidad e hidropatía, calculados con,
p. ej., el programa Omiga versión 1.0 disponible en Oxford Molecular
Group. Esta aplicación informática utiliza el método Hopp/Woods
(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA [1981]
78:3824-3828) para determinar los perfiles
de antigenicidad, y la técnica Kyte-Doolittle (Kyte
et al, J. Mol. Biol. [1982]
157:105-132) para los diagramas de
hidropatía. Las figuras de la 8 a la 12 presentes en este documento
muestran los perfiles Kyte-Doolittle de las
proteínas representativas incluidas en la invención.
Para los objetivos de la presente invención, los
fragmentos inmunogénicos incluirán de forma general al menos tres
aminoácidos, preferentemente al menos cinco aminoácidos, más
preferentemente un mínimo aproximado de entre 10 y 15 aminoácidos,
y, aún más preferentemente, 25 o más aminoácidos de la molécula
correspondiente a la proteína parental GapC de unión a plasmina. No
existe un límite superior crítico en la longitud del fragmento, que
puede comprender cerca de toda la secuencia de la proteína o incluso
ser una proteína de fusión que conste de dos o más epítopos de
GapC.
Una "composición inmunogénica" es una
composición que consta de una molécula antigénica que cuando se
administra a un sujeto provoca el desarrollo en dicho sujeto de una
respuesta inmunitaria humoral o celular a la molécula antigénica de
interés.
El término "composición con subunidades de la
vacuna" se refiere a una composición que contiene al menos un
polipéptido inmunogénico, pero no todos los antígenos, derivado de
un antígeno o de un análogo procedente del patógeno de interés.
Dicha composición se encuentra sustancialmente libre de células o
partículas intactas del patógeno, o del lisado de dichas células o
partículas. Así, una "composición con subunidades de la vacuna"
se prepara a partir de polipéptidos purificados al menos
parcialmente (de forma preferente, purificados en su totalidad) del
patógeno o de análogos recombinantes del mismo. Una composición con
subunidades de la vacuna puede contener la subunidad antigénica o
los antígenos de interés sustancialmente libres de otros antígenos
o polipéptidos del patógeno.
Se entiende por "farmacéuticamente
aceptable" o "farmacológicamente aceptable" un material que
no es biológicamente, ni de ningún otro modo, no deseado; es decir,
el material debe administrarse a un individuo en una formulación o
composición que no cause ningún efecto biológico no deseado y que no
interaccione de una manera dañina con cualquiera de los componentes
de la composición que lo contiene.
Una "respuesta inmunitaria" a una
composición o vacuna se refiere al desarrollo en el huésped de una
respuesta inmunitaria celular y mediada por anticuerpos a la
composición o vacuna de interés. Generalmente, una "respuesta
inmunitaria" incluye uno o más de los siguientes efectos, aunque
no está limitada a ellos: producción de anticuerpos, linfocitos B,
linfocitos T colaboradores, linfocitos T supresores y linfocitos T
citotóxicos o linfocitos T \gamma\delta; dirigidos
específicamente al antígeno o antígenos presentes en la composición
de la vacuna de interés. Preferentemente, el huésped desencadenará
una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica de modo que se
mejorará la resistencia de la glándula mamaria a una nueva infección
o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha
protección se demostrará tanto por la reducción como por la falta de
los síntomas que aparecen normalmente en el huésped infectado o
mediante una reducción del tiempo necesario para la
recuperación.
La "inmunización por ácidos nucleicos" se
refiere a la introducción en una célula huésped de una molécula de
ácidos nucleicos que codifica uno o más antígenos seleccionados para
la expresión in vivo de un antígeno, antígenos, un epítopo o
epítopos. La molécula de ácidos nucleicos se puede introducir
directamente en el sujeto mediante inyección, inhalación; mediante
administración por vía oral, intranasal, mucosal o similar; o puede
introducirse ex vivo, en las células que han sido extraídas
del huésped. En el último caso, las células transformadas se
reintroducen en el sujeto en el que puede desencadenarse una
respuesta inmunitaria frente al antígeno codificado en la molécula
de ácidos nucleicos.
El término "tratamiento", tal como se usa
en este documento, se refiere tanto a la prevención de la infección
o de la reinfección (profilaxis), como a la reducción o eliminación
de los síntomas de la enfermedad de interés (tratamiento).
El término "mastitis" se refiere a la
inflamación de las glándulas mamarias de mamíferos, incluyendo
vacas, ovejas, cabras, cerdas, yeguas y similares, causada por la
presencia de S. uberis. La infección se manifiesta por la
infiltración de células fagocíticas en la glándula. Generalmente, se
reconocen cuatro tipos clínicos distintos de mastitis: (1)
sobreaguda, asociada con edema, calor, dolor, secreción anormal de
la glándula acompañada de fiebre y otros signos de alteración
sistémica, como depresión notable, pulso rápido y débil, ojos
hundidos, debilidad y anorexia completa; (2) aguda, con cambios en
la glándula similares a los descritos anteriormente pero con
fiebre, anorexia y depresión entre leve y moderada; (3) subaguda, no
se producen cambios sistémicos y los cambios en la glándula y en su
secreción son menos marcados; y (4) subclínica, la reacción
inflamatoria se detecta únicamente mediante pruebas estándar para la
mastitis.
Entre las pruebas estándar para la detección de
mastitis se encuentran las siguientes, aunque no se limitan a
ellas: el ensayo de California para la detección de mastitis, el
ensayo Wisconsin para la detección de mastitis, el ensayo Nagase,
el recuento electrónico de células y el recuento de células
somáticas utilizados para detectar la persistencia de un contenido
elevado de leucocitos en la leche. En general, un recuento de
células somáticas de alrededor de entre 300.000 y 500.000 células
por ml, o superior, en la leche es indicativo de la presencia de
infección. Así, una vacuna se considera efectiva en el tratamiento o
la prevención de mastitis cuando, p. ej., el recuento de células
somáticas en la leche se mantiene por debajo de 500.000 células por
ml. Para una discusión de la mastitis y del diagnóstico de la misma
véase, p. ej., The Merck Veterinary Manual: A Handbook of
Diagnosis, Therapy, and Disease Prevention and Control for the
Veterinarian, Merck and Co., Rahway, New Jersey, 1991.
Los términos "vertebrado", "sujeto" o
"sujeto vertebrado" se refieren a cualquier miembro del
subfilum de los cordados e incluyen, sin limitación alguna, los
siguientes: mamíferos, como vacas, ovejas, cerdos, cabras,
caballos, humanos y animales domésticos como perros y gatos; aves,
incluyendo las domésticas, las salvajes y las de caza, como gallos,
gallinas, patos, pavos y otras aves gallináceas; y peces. El término
no denota ninguna edad en particular. Así, se pretende abarcar
tanto animales adultos como recién nacidos, así como a fetos.
Una molécula de "ácidos nucleicos" puede
incluir, aunque no se limita a ello, lo siguiente: secuencias
procarióticas, mRNA eucariótico, cDNA procedente de mRNA
eucariótic, secuencias genómicas de DNA eucariótico (p.ej. de
mamíferos) o, incluso, secuencias sintéticas de DNA. El término
también incluye secuencias que consten de cualquiera de los
análogos de bases de DNA o RNA.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es
una molécula de ácido nucleido separada y diferenciada del
microorganismo completo en el que se encuentra de forma natural; o
un ácido nucleico desprovisto total o parcialmente de las
secuencias asociadas normalmente a él de forma natural; o a una
secuencia en la forma que existe en la naturaleza, pero que posee
secuencias heterólogas (tal como se definirán más adelante) en
asociación a ella. El término "aislado" aplicado a los
polinucleótidos se refiere a que el polinucleótido se aísla del
cromosoma al que se asocia normalmente y se aísla de la secuencia
genómica completa en la que aparece normalmente.
Un "polinucleótido purificado" se refiere a
un polinucleótido de interés o a un fragmento del mismo que se
encuentra esencialmente libre, es decir, contiene menos de alrededor
de un 50%, preferentemente menos de alrededor de un 70% y más
preferentemente menos de alrededor de un 90% de la proteína a la
cual se asocia de forma natural dicho polinucleótido. Las técnicas
de purificación de polinucleótidos de interés se conocen
ampliamente en el campo e incluyen, por ejemplo, la lisis de la
célula que contiene el polinucleótido con un agente caotrópico, y
la separación del polinucleótido, o polinucleótidos, y las proteínas
mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
afinidad y sedimentación en función de la densidad.
Una "secuencia codificante" o una
"secuencia de nucleótidos codificante" de una proteína en
particular es una secuencia de nucleótidos que se transcribe y
traduce in vivo en un polipéptido cuando se encuentra bajo
los elementos reguladores apropiados. Los límites de la secuencia
codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5’
amino terminal y un codón de finalización en el extremo 3’ carboxi
terminal. Las secuencias codificantes pueden, entre otros, ser:
secuencias procarióticas, cDNA procedente de mRNA eucariótico,
secuencias genómicas de DNA eucariótico (p. ej. de mamíferos) o,
incluso, secuencias sintéticas de DNA. Una secuencia de
finalización de la transcripción se localiza normalmente en el
extremo 3’ de la secuencia codificante. Una secuencia
"complementaria" es aquella en la que cada base nitrogenada en
una posición nucleotídica concreta es la complementaria a la base
nitrogenada que aparece en la misma posición de la secuencia de
referencia. Para ilustrar esto, la base complementaria de la
adenosina es la timina y viceversa; de forma similar, la citosina
es la complementaria de la guanina y viceversa. Por tanto, la
secuencia complementaria de la secuencia de referencia
5'-ATGCTGA-3' sería
3'-TACGACT-5'.
Una secuencia "salvaje" o "nativa",
tal como se utiliza en este documento, se refiere a secuencias
codificantes de polipéptidos que fundamentalmente son, como se
encuentran en la naturaleza, por ejemplo, las secuencias que
codifican la proteína GapC de S. dysgalactiae mostradas en
las figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4).
El término "recombinante", utilizado aquí
para describir moléculas de ácidos nucleicos, se refiere a un
polinucleótido de origen genómico, de cDNA, semisintético o
sintético, que por su origen o su manipulación: (1) no se asocia
con el polinucleótido con el que se asocia en la naturaleza o con un
fragmento del mismo; y (2) se une a un polinucleótido distinto al
que se asocia de forma natural. El término "recombinante",
referido a una proteína o polipéptido, significa un polipéptido
producido mediante la expresión de un polinucleótido recombinante.
"Células huésped recombinantes", "células huésped",
"células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y
otros términos de ese tipo que denotan líneas celulares de
microorganismos procariotas o células eucariotas como entidades
unicelulares, se usan de manera intercambiable y se refiere a
células que pueden ser, o han sido, utilizadas como receptoras de
vectores recombinantes o de otras transferencias de DNA e incluyen
la progenie de las células originales que han sido transfectadas.
Se entiende que la progenie de una única célula parental no tiene
porqué ser completamente idéntica en su morfología o en el contenido
genómico o total a la célula parental original debido a mutaciones
accidentales o deliberadas. En esta definición se incluye la
progenie que es lo suficientemente similar a la célula parental para
mostrar la propiedad relevante, como es la presencia de una
secuencia de nucleótidos que codifica el péptido deseado, y se
encuentra englobada en los términos definidos anteriormente.
El término "homología" se refiere al
porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos dominios de
polipéptido. Dos secuencias polipeptídicas o dos secuencias de DNA
son "sustancialmente homólogas" entre ellas cuando muestran,
al menos aproximadamente, entre el 80 y el 85%, preferentemente al
menos aproximadamente un 90%, y más preferiblemente, al menos
aproximadamente, entre el 95 y el 98% de similitud en la secuencia a
lo largo de la longitud definida de las moléculas. Tal como se usa
en este documento, sustancialmente homólogo también se refiere a las
secuencias que muestran la identidad completa de la secuencia
polipeptídica o de DNA especificada.
En general, el término "identidad" se
refiere a la correspondencia exacta, aminoácido a aminoácido o
nucleótido a nucleótido, de dos secuencias polipeptídicas o de DNA,
respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar a
través de la comparación directa de la información de las secuencias
de dos moléculas mediante la alineación de estas secuencias,
contando el número exacto de correspondencias entre las dos
secuencias alineadas, dividiendo entre la longitud de la secuencia
más corta y multiplicando el resultado por 100. Se pueden utilizar
programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el
análisis, como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence
and Structure M.O. Dayhoff Ed., 5 Supl.
3:353-358, National Biomedical Research
Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología
local de Smith y Waterman (1981) Advances in Appl. Math.
2:482-489 para el análisis de péptidos. Hay
programas para determinar la identidad de las secuencias de
nucleótidos que están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis
Package, Versión 8 (disponible en Genetics Computer Group, Madison,
WI); por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP que también se
basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Dichos programas son de
fácil manejo con los parámetros por defecto recomendados por el
fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package
mencionado anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de identidad
de una secuencia de nucleótidos respecto a una secuencia de
referencia se puede determinar utilizando el algoritmo de homología
de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una
penalización por gap de seis posiciones nucleotídicas.
Otro método para el establecimiento del
porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es
la utilización del paquete informático MPSRCH, cuyos derechos de
autor pertenecen a la Universidad de Edinburgo, que fue
desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok y está
distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Con
estos paquetes se puede utilizar el algoritmo
Smith-Waterman en el que los parámetros por defecto
se utilizan para la tabla de puntuaciones (por ejemplo, penalización
de 12 por apertura de gap, penalización de uno por extensión de gap
y un gap de seis). De los datos generados el valor de
"correspondencia" refleja la "identidad de la secuencia".
Se conocen en el campo otros programas apropiados para calcular el
porcentaje de identidad o similitud entre secuencias como, por
ejemplo, BLAST, otro programa de alineación que se utiliza con
parámetros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden
utilizar empleando los siguientes parámetros por defecto: código
genético estándar; sin filtros; hebras = las dos; punto de corte =
60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50
secuencias; ordenado por = puntuación más elevada; Bases de datos =
no redundantes; GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones de las
CDS de GenBank + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles sobre
estos programas se pueden encontrar en la siguiente dirección de
Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
De manera alternativa, la homología se puede
determinar mediante hibridación de polinucleótidos bajo condiciones
en las que se forman moléculas bicatenarias entre regiones
homólogas, seguida de la digestión con nucleasas específicas de
regiones de cadena única y la determinación de la longitud de los
fragmentos digeridos. Las secuencias de DNA que son sustancialmente
homólogas se pueden identificar mediante un experimento de
hibridación Southern bajo, p. ej., condiciones de astringencia tal
como se definen para este sistema en particular. La definición de
las condiciones apropiadas de hibridación se encuentra dentro de las
habilidades del campo. Véase, p. ej., Sambrook et al,
supra; DNA cloning, supra; Nucleic Acid
Hybridization, supra.
El término "variante degenerada" se refiere
a un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia de ácidos
nucleicos del mismo, y que codifica un polipéptido que posee la
misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el
polinucleótido del cual deriva la variante degenerada.
Las técnicas para determinar la "similitud"
de la secuencia de aminoácidos se conocen bien en el campo. En
general, "similitud" significa la comparación exacta aminoácido
a aminoácido de dos o más polipéptidos en los lugares apropiados,
donde los aminoácidos son idénticos o poseen propiedades físicas o
químicas similares, como la carga o la hidrofobicidad. Así, se
puede determinar lo que se denomina "porcentaje de similitud"
entre las secuencias polipeptídicas comparadas. Las técnicas para
determinar las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos
también se conocen bien en el campo e incluyen la determinación de
la secuencia nucleotídica de mRNA de ese gen (generalmente a través
de un intermediario de cDNA) para determinar, de ese modo, la
secuencia de aminoácidos codificada y comparar esta con una segunda
secuencia de aminoácidos. En general, el término "identidad"
se refiere a la correspondencia exacta, nucleótido a nucleótido o
aminoácido a aminoácido, entre dos secuencias nucleotídicas o
polipeptídicas, respectivamente.
Una región "heteróloga" de un constructo de
DNA es un segmento identificable de DNA situado dentro de otra
molécula de DNA, o unido a ella, que de forma natural no se
encuentra en asociación con la otra molécula. Así, cuando la región
heteróloga codifica un gen bacteriano, el gen generalmente está
flanqueado por DNA que no flanquea ese gen bacteriano en el genoma
de la bacteria de la que procede. Otro ejemplo de secuencia
codificante heteróloga es un constructo donde la secuencia
codificante en sí misma no se encuentra de forma natural (p. ej.,
secuencias sintéticas que poseen codones distintos a los del gen
nativo). Las variantes alélicas o las mutaciones que ocurren de
forma natural no ocasionan la aparición de regiones heterólogas de
DNA, tal como se utilizan en este documento.
Un "vector" es un replicón, como un
plásmido, un fago o un cósmido, al cual se une un segmento de DNA
para provocar la replicación de ese segmento unido. Un vector es
capaz de transferir secuencias génicas a células diana (p. ej.,
vectores del tipo plásmido bacteriano, vectores víricos, vectores no
víricos, transportadores particulados y liposomas).
Típicamente, todos los términos siguientes:
"constructo del vector", "vector de expresión", "vector
de expresión génica", "vector de liberación de genes",
"vector de transferencia génica" y "casete de expresión";
se refieren a un montaje que es capaz de dirigir la expresión de
una secuencia o gen de interés. Así, el término incluye vehículos
de clonación y expresión, así como vectores víricos.
Estos montajes constan de un promotor que se
encuentra unido funcionalmente a las secuencias o genes de interés.
Asimismo, pueden estar presentes otros elementos de control. Los
casetes de expresión descritos en este documento pueden estar
contenidos en un constructo plasmídico. Además de los componentes
del casete de expresión, el constructo plasmídico también puede
incluir un origen de replicación bacteriano, uno o más marcadores de
selección, una señal que permita al constructo plasmídico existir
como DNA monocatenario (p. ej., un origen de replicación M13), un
lugar de clonación múltiple y un origen de replicación de
"mamífero" (p. ej., un origen de replicación de un adenovirus
o de SV40).
Los "elementos de control" del DNA se
refieren, en conjunto, a promotores de la transcripción, elementos
estimuladores de la transcripción, secuencias de finalización de la
transcripción, secuencias de poliadenilación (localizadas en el
extremo 3’ del codón de finalización de la traducción), secuencias
para la optimización del inicio de la traducción (localizadas en el
extremo 5’ de la secuencia codificante), secuencias de finalización
de la traducción, dominios de regulación en 5’, sitios de unión de
ribosomas y similares; que, en conjunto, permiten la transcripción
y traducción de una secuencia codificante en la célula huésped.
Véanse, p. ej., McCaughan et al. (1995) PNAS USA
92:5431-5435; o Kochetov et al. (1998)
FEBS Letts. 440:351-355. No siempre
son necesarias todas esas secuencias de control en el vector
recombinante, siempre y cuando sea posible la transcripción y
traducción del gen en cuestión.
El término "unido funcionalmente" se
refiere a una disposición de los elementos de manera que los
componentes así descritos están configurados para realizar sus
funciones habituales. Así, los elementos de control unidos
funcionalmente a una secuencia codificante son capaces de llevar a
cabo la expresión de las secuencias codificantes. No es necesario
que los elementos de control sean contiguos a la secuencia
codificante, siempre y cuando dirijan la expresión de la misma.
Así, por ejemplo, entre el promotor y la secuencia codificante
pueden existir secuencias intermedias transcritas pero no
traducidas, y el promotor todavía puede considerarse
"funcionalmente unido" a la secuencia codificante. De forma
similar, "los elementos de control compatibles con la expresión en
un sujeto" son aquellos que son capaces de llevar a cabo la
expresión de la secuencia codificante en dicho sujeto.
Un elemento de control, como un promotor,
"dirige la transcripción" de una secuencia codificante en una
célula cuando la RNA polimerasa se une al promotor y transcribe la
secuencia codificante en un mRNA, que a su vez se traduce en la
secuencia polipeptídica codificada en la secuencia codificante.
Una "célula huésped" es una célula que ha
sido transformada, o es capaz de serlo, por una molécula exógena de
ácidos nucleicos.
Una célula ha sido "transformada" por un
DNA exógeno cuando dicho DNA exógeno se introduce dentro de la
membrana celular. El DNA exógeno puede estar integrado (unido
covalentemente) o no en el DNA cromosómico y formar parte del
genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, se
puede mantener el DNA exógeno en un elemento episómico como un
plásmido. En cuanto a las células eucariotas, una célula
transformada estable es aquella en la que el DNA exógeno se ha
integrado en el cromosoma, de manera que las células hijas lo
heredan a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se
demuestra por la capacidad de las células eucariotas de establecer
líneas celulares o clones con una población de células hijas que
contengan el DNA exógeno.
Tal como se utiliza en este documento, una
"muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o de
fluido aislado de un sujeto, que incluye los siguientes elementos,
aunque no se limita a ellos: sangre, plasma, suero, materia fecal,
orina, médula ósea, bilis, líquido cefalorraquídeo, líquido
linfático, muestras de piel, secreciones externas de la piel, de
las vías respiratorias, del tubo digestivo y del sistema
genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas,
órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivo
celular in vitro que incluyen, entre otros, los siguiente
elementos: medio condicionado resultante del crecimiento celular y
tisular en medio de cultivo, p. ej., células recombinantes y
componentes celulares.
\newpage
Tal como se utiliza en este documento, el
término "marcador" o "marcador detectable" se refiere a
una molécula capaz de detectarse e incluye las siguientes, aunque
sin estar limitado a las mismas: isotopos radiactivos, moléculas
fluorescentes, moléculas quimioluminiscentes, enzimas, sustratos
enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos,
cromóforos, colorantes, iones metálicos, ligandos (p. ej., biotina o
haptenos) y similares. El término "molécula fluorescente" se
refiere a una sustancia o a una porción de la misma que es capaz de
emitir fluorescencia en un rango detectable. Algunos ejemplos
particulares de marcadores que pueden utilizarse en esta invención
son la fluoresceína, la rodamina, el dansil, la umbeliferona, el
rojo de Texas, el luminol, el NADPH y la
\alpha-\beta-galactosidasa.
Antes de describir la presente invención en
detalle, cabe aclarar que esta invención no se limita a una
formulación o unos parámetros de proceso particulares dado que los
mismos pueden variar. También es importante aclarar que la
terminología utilizada en este documento tiene el objetivo de
describir únicamente las realizaciones particulares de la invención
y no pretende ser limitante.
Aunque ya existen una serie de métodos y
materiales similares o equivalentes a los aquí descritos que se
pueden utilizar en la puesta en práctica de la presente invención,
en este documento se describen los materiales y métodos
preferidos.
Una cuestión muy importante en la presente
invención es el descubrimiento de que la proteína GapC es capaz de
desencadenar una respuesta inmunitaria en un sujeto vertebrado. En
particular, se han aislado, secuenciado y caracterizado los genes
de la proteína GapC en S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis,
S. parauberis y S. iniae, y a partir de ellas se han
deducido las secuencias proteicas de dichos genes. Las secuencias de
DNA completas de dichos genes y sus correspondientes secuencias de
aminoácidos se muestran en las Figuras de la 1 a la 5.
Tal como se describe en los ejemplos, el gen
completo gapC de S. dysgalactiae, que se muestra en las
posiciones de la 1 a la 1011, ambas inclusive, de las figuras
1A-1B, codifica la proteína completa GapC de S.
dysgalactiae de 336 aminoácidos, mostrada como los aminoácidos
del 1 al 336 de la misma figura. La proteína GapC de S.
dysgalactiae tiene un peso molecular esperado de unos 36 kDa
(calculado mediante el programa Peptide Sort del GCG Wisconsin
Package, versión 10, suministrado con el paquete de análisis de
secuencias SeqWeb, versión 1.1 de Canadian Bioinformatics
Resource). De forma similar, los genes gapC aislados de S.
agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S. iniae se
muestran en las Figuras de la 2 a la 5. Cada uno de ellos codifica
una proteína GapC de 336 aminoácidos también con un peso molecular
esperado de 36 kDa. Ninguna de las secuencias incluye un péptido
señal o una región de anclaje a la membrana.
Las Figuras 6 y 7 presentan la alineación de
secuencias de DNA o de aminoácidos, respectivamente, que muestra
las regiones de homología y de variabilidad existentes entre las
proteínas GapC de diferentes cepas de estreptococos. En particular,
en las posiciones de los aminoácidos del 62 al 81, del 102 al 112,
del 165 al 172, del 248 al 271 y del 286 al 305 se localizan
diversas regiones variables. Dichas regiones variables son
típicamente más susceptibles de cambio. Por tanto, es más probable
que se toleren los cambios, como sustituciones, adiciones y
deleciones, en los aminoácidos de estas regiones.
Las Figuras de la 8 a la 12 muestran los
diagramas de las siguientes características para cada una de las
proteínas GapC de la presente invención: hidropatía según la escala
de Kyte-Doolittle (media sobre una ventana de 7);
probabilidad de superficie según Emini; flexibilidad de la cadena
según Karplus-Schulz; índice de antigenicidad según
Jameson-Wolf; estructura secundaria según
Garnier-Osguthorpe-Robson;
estructura secundaria según Chou-Fasman; y lugares
de glicosilación esperados. Las figuras de la 13 a la 17 muestran
los valores de estructura secundaria según
Chou-Fasman para cada una de las proteínas GapC de
la presente invención. Cualquier experto en la materia podrá
utilizar fácilmente la información presentada en las Figuras de la 8
a la 17 para determinar las regiones inmunogénicas de la proteína
con el fin de utilizarlas en la composición de vacunas.
La proteína GapC de unión a plasmina de S.
dysgalactiae, fragmentos inmunogénicos de la misma o proteínas
quiméricas que la incluyan, pueden suministrarse como composiciones
de subunidades de vacuna. Además de su utilización en la
composición de vacunas, las proteínas o los anticuerpos de estas
pueden utilizarse como reactivos de diagnóstico para detectar la
presencia de infección en un sujeto vertebrado. De forma similar,
los genes que codifican las proteínas pueden clonarse y utilizarse
para diseñar sondas que detecten y aíslen genes homólogos en otras
cepas bacterianas. Por ejemplo, los fragmentos que constan de al
menos entre 15 y 20 nucleótidos, más preferentemente al menos
alrededor de 20 y 50 nucleótidos, y aún más preferentemente
alrededor de 60 y 100 nucleótidos, o cualquier entero entre esos
valores, podrán ser empleados en estas realizaciones.
Las composiciones de las vacunas de la presente
invención se pueden utilizar para tratar o prevenir una amplia
variedad de infecciones bacterianas en sujetos vertebrados. Por
ejemplo, las composiciones de vacunas que contienen las proteínas
GapC de unión a plasmina de S. dysgalactiae, S. uberis, S.
parauberis, S. iniae o de los estreptococos del grupo B (SGB)
como S. agalactiae, se pueden utilizar para tratar
infecciones por estreptococos en sujetos vertebrados que estén
causadas por estas u otras especies. En particular, S. uberis
y S. agalactiae son patógenos bacterianos comunes asociados
a la mastitis en bóvidos, équidos, óvidos y especies caprinas.
Adicionalmente, se sabe que el grupo B de los estreptococos, como
S. agalactiae, causan un gran número de otras infecciones en
vertebrados como septicemia, meningitis, bacteriemia, impétigo,
artritis, infecciones del aparato urinario, abscesos, aborto
espontáneo, etc. Por tanto, las composiciones de vacunas que
contienen proteínas GapC de unión a plasmina estreptocócicas serán
útiles en el tratamiento y la prevención de una amplia variedad de
infecciones estreptocócicas.
De forma similar, las proteínas GapC de unión a
plasmina derivadas de otros géneros bacterianos como
Staphylococcus, Mycobacterium, Escherichia, Pseudomonas,
Nocardia, Pasteurella, Clostridium y Mycoplasma serán
útiles para el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por
especies que pertenecen a esos géneros. Así, resulta muy evidente
que las proteínas GapC de unión a plasmina se pueden utilizar para
tratar o prevenir una amplia variedad de infecciones bacterianas
provocadas por numerosas especies.
Las proteínas GapC de unión a plasmina
estreptocócicas de la presente invención se pueden utilizar en
composiciones de vacunas de forma independiente o en combinación
con otros antígenos bacterianos, fúngicos, víricos o de protozoos.
Estos antígenos se pueden suministrar por separado o como proteínas
de fusión que consten de uno o más epítopos de la proteína GapC de
unión a plasmina fusionados con uno o más de dichos antígenos. Por
ejemplo, otras proteínas inmunogénicas de S. uberis, como el
factor CAMP, la cápsula de ácido hialurónico, la hialuronidasa, la
proteína tipo R y el activador de plasminógeno, se pueden
administrar con la proteína GapC. Adicionalmente, proteínas
inmunogénicas de otros microorganismos implicados en la mastitis,
como los del género Staphylococcus, Corynebacterium,
Pseudomonas, Nocardia, Clostridium, Mycobacterium, Mycoplasma,
Pasteurella, Prototheca, otros estreptococos, bacterias
coliformes, así como levaduras, se pueden administrar junto con las
proteínas GapC de unión a plasmina descritas en este documento para
proporcionar un espectro amplio de protección. Así, por ejemplo,
las proteínas inmunogénicas de Staphylococcus aureus, Str.
agalactiae, Str. dysgalactiae, Str. zooepidemicus, Corynebacterium
pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Nocardia asteroides, Clostridiunm
perfringens, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes y
Klebsiella spp. se pueden suministrar junto con las proteínas
GapC de unión a plasmina de la presente invención.
Adicionalmente, las proteínas GapC de diferentes
especies estroptocócicas se pueden utilizar conjuntamente en
composiciones de vacunas de la presente invención. En esta
realización, las múltiples proteínas GapC se pueden suministrar
como proteínas de fusión o como antígenos discretos, en la misma
composición de vacuna o en otra diferente.
Las proteínas de unión a plasmina descritas
anteriormente y sus fragmentos activos, proteínas análogas o
quiméricas derivadas de las mismas, se pueden producir mediante una
diversidad de métodos. En particular, las proteínas GapC de unión a
plasmina se pueden aislar directamente de las bacterias que la
expresan. Esto se consigue, generalmente, mediante la preparación,
en primer lugar, de un extracto crudo que no presente componentes
celulares ni varias proteínas foráneas. Las proteínas deseadas se
pueden purificar posteriormente de la fracción del lisado celular
mediante, p. ej., cromatografía en columna, HPLC, técnicas
inmunosorbentes u otros métodos convencionales muy conocidos en el
campo.
Más concretamente, se han descrito técnicas de
aislamiento de proteínas GapC de unión a plasmina. Por ejemplo, la
proteína GapC de S. pyogenes se purificó de un extracto
celular crudo mediante precipitación con sulfato amónico seguido de
dos ciclos de cromatografía a través de una columna Mono FPLC, y
ciclos únicos a través de FPLC en superosa 12 y columnas
TSK-fenol de HPLC (Pancholi, V. y Fischetti, VA
[1992] J. Exptl. Med. 76:415-426).
Existe otra técnica que implica la utilización de columnas de
afinidad NAD^{+}-agarosa para purificar GapC de
protoplastos lisados de la cepa 64/14 de S. pyogenes (Winram,
SB y Lottenberg, R [1996] Microbiol.
142:2311-2320).
Alternativamente, las proteínas se pueden
producir de forma recombinante como se describe en este documento.
Tal como se ha explicado anteriormente, estos productos
recombinantes pueden adoptar la forma de secuencias parciales de
proteínas, secuencias completas, formas precursoras que incluyen
secuencias señal, formas maduras sin secuencias señal, o incluso
proteínas de fusión (p. ej., con una secuencia líder apropiada para
el huésped recombinante o con secuencias de subunidades antigénicas
de Streptococcus o de otro patógeno).
En una realización de la presente invención, las
proteínas GapC se fusionan con una cola de histidina producida
mediante métodos recombinantes y se purifican, entonces, de la
fracción del lisado celular utilizando cromatografía de afinidad.
Véase el Ejemplo 1A-E, infra.
Las proteínas GapC de unión a plasmina de la
presente invención se pueden aislar, gracias a la capacidad del
producto proteico de unirse a plasmina, mediante los ensayos de
unión a plasmina descritos más adelante. Véase, p. ej., el método
descrito en la sección F.3 del Ejemplo 1, infra. Así, se
pueden construir genotecas y se pueden utilizar los clones
resultantes para transformar a las células huésped apropiadas. Las
colonias se pueden juntar y cribar para la búsqueda de clones que
posean actividad de unión a plasmina. Las colonias también se
pueden cribar utilizando sueros policlonales o anticuerpos
monoclonales frente a la proteína de unión a plasmina.
Alternativamente, una vez que se han determinado
las secuencias de aminoácidos, se pueden utilizar sondas de
oligonucleótidos que contienen los codones de una porción de la
secuencia de aminoácidos determinada para cribar genotecas de cDNA
o genotecas de DNA genómico y buscar los genes de las proteínas en
cuestión. Las estrategias básicas para la preparación de sondas de
oligonucleótidos y genotecas, así como para su cribado mediante
hibridación de ácidos nucleicos, son técnicas que los expertos en la
materia conocen bien. Véanse, p. ej., DNA Cloning: Vol. 11,
supra; Nucleic Acid Hybridization, supra; Oligonucleotide
Synthesis, supra; Sambrook et al., supra. Una vez
que se ha identificado por hibridación positiva un clon de la
biblioteca cribada, se puede confirmar que ese inserto en
particular de la biblioteca contiene el gen de la proteína GapC de
unión a plasmina o un homólogo del mismo mediante análisis con
enzimas de restricción y secuenciación de DNA. Los genes pueden
aislarse posteriormente utilizando técnicas estándar y, si se desea,
técnicas de PCR o de enzimas de restricción utilizadas para
eliminar porciones de la secuencia completa.
De forma similar, los genes se pueden aislar
directamente de las bacterias utilizando técnicas conocidas, como
la extracción con fenol, y posteriormente se puede manipular la
secuencia para producir cualquier alteración deseada. Véase, p.
ej., Sambrook et al., supra, para una descripción de
las técnicas utilizadas en el aislamiento de DNA.
De forma alternativa, las secuencias de DNA que
codifican las proteínas de interés se pueden preparar sintéticamente
en vez de clonarlas. Las secuencias de DNA se pueden diseñar con
los codones apropiados para cada secuencia de aminoácidos en
particular. En general, se seleccionan los codones preferidos para
las células huésped si la secuencia va a ser utilizada para su
expresión. La secuencia completa se compone de oligonucleótidos
solapados preparados mediante métodos estándar y combinados para
formar una secuencia codificante completa. Véanse, p. ej., Edge
(1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984)
Science 223:1299; o Jay et al. (1984) J.
Biol. Chem. 259:6311.
Una vez que las secuencias codificantes para las
proteínas deseadas se han preparado o aislado, pueden clonarse en
cualquier vector o replicón apropiado. Los expertos en la materia
conocen numerosos vectores de clonación y la selección de un vector
de clonación apropiado es una cuestión de elección personal. Entre
los ejemplos de vectores de DNA recombinante para la clonación, y
de células huésped que estos pueden transformar, se encuentran los
siguientes: bacteriófago \lambda (E. coli), pBR322 (E.
coli), pACYC177 (E. coli), pKT23O (bacterias
gramnegativas), pGV1106 (bacterias gramnegativas), pLAFR1
(bacterias gramnegativas), pME290 (bacterias gramnegativas que no
son E. coli), phv14 (E. coli y Bacillus
subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces),
pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19
(Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de
mamífero). Véanse, Sambrook et al., supra; DNA
Cloning, supra; o B. Perbal, supra.
El gen se puede colocar bajo el control de un
promotor, un lugar de unión a ribosomas (para la expresión en
bacterias) y, opcionalmente, un operador (en este documento, todos
en conjunto se refieren a elementos de "control"), de manera
que la secuencia de DNA que codifica la proteína de interés se
transcribe en un RNA en la célula huésped transformada por un
vector que contiene esta construcción de expresión de proteínas. La
secuencia codificante puede contener un péptido señal y una
secuencia líder, o no contenerlos. Si se incluye una secuencia
señal, esta puede ser la secuencia nativa homóloga o una secuencia
heteróloga. Por ejemplo, la secuencia señal de la proteína GapC de
unión a plasmina de S. dysgalactiae se puede utilizar para la
secreción de la misma, así como un número de otras secuencias muy
conocidas en el campo. El huésped puede eliminar las secuencias
líder durante el procesamiento postraduccional. Véanse, p. ej., las
Patentes estadounidenses núm. 4 431 739, 4 425 437 y 4 338 397.
Otras secuencias reguladoras también pueden ser
de interés cuando permiten la regulación de la expresión de la
secuencia proteica en función del crecimiento de la célula huésped.
Los expertos en la materia conocen bien esas secuencias reguladoras
y entre los ejemplos de dichas secuencias se encuentran aquellas que
activan o inhiben la expresión de un gen en respuesta a un estímulo
químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto
regulador. También pueden estar presentes en el vector otros tipos
de elementos reguladores, por ejemplo, secuencias
estimuladoras.
Las secuencias control y otras secuencias
reguladoras pueden unirse a la secuencia codificante antes de su
inserción en el vector, como los vectores de clonación descritos
anteriormente. De forma alternativa, la secuencia codificante puede
clonarse directamente en un vector de expresión que ya contenga las
secuencias de control y un lugar de restricción apropiado.
En algunos casos, puede ser necesario modificar
la secuencia codificante de manera que se unan a las secuencias
control con la orientación apropiada, es decir, para mantener la
pauta de lectura apropiada. También sería deseable producir
mutantes o análogos de la proteína GapC de unión a plasmina. Es
posible preparar mutantes o análogos mediante la deleción de una
porción de la secuencia que codifica la proteína, mediante la
inserción de una secuencia o mediante la sustitución de uno o más
nucleótidos dentro de la misma secuencia. Las técnicas de
modificación de secuencias nucleotídicas, como la mutagénesis
dirigida, están descritas, por ejemplo, en Sambrook et al.,
supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid
Hybridization, supra.
A continuación se utiliza el vector de expresión
para transformar una célula huésped apropiada. En el campo se
conocen una serie de líneas celulares de mamífero que incluyen
líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC), algunas de las cuales son, entre
otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa,
células renales de crías de hámster (BHK), células renales de mono
(COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej. Hep G2),
células de riñón bovino Madin-Darby ("MDBK") y
similares. De forma similar, las células bacterianas huésped como
E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus
spp., también se podrán utilizar con los presentes constructos
de expresión. Las levaduras huésped de utilidad en la presente
invención incluyen, entre otros, Saccharomyces cerevisiae,
Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha,
Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii,
Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia
lipolytica. Las células de insecto que se pueden utilizar con
los vectores de expresión de baculovirus incluyen, entre otros,
Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila
melanogaster, Spodoptera frugiperda y
Trichoplusia ni.
Trichoplusia ni.
En función del sistema de expresión y del
huésped escogidos, las proteínas de la presente invención se
producen mediante el cultivo de células huésped transformadas por
un vector de expresión descrito anteriormente bajo las condiciones
en que se expresa la proteína de interés. A continuación, se aísla
la proteína de las células huésped y se purifica. Si el sistema de
expresión secreta la proteína en el medio de cultivo, la proteína
puede purificarse directamente del medio. Si la proteína no es
secretada, se aísla de los lisados celulares. La selección de las
condiciones de cultivo y los métodos de recuperación apropiados se
encuentran dentro de las técnicas del ámbito.
Las proteínas de la presente invención también
pueden producirse mediante síntesis química, como la síntesis
peptídica en fase sólida, utilizando secuencias aminoacídicas
conocidas o secuencias aminoacídicas derivadas de la secuencia de
DNA de los genes de interés. Estos métodos son conocidos por los
expertos en la materia. Véanse, p. ej., J. M. Stewart y J. D.
Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical
Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The
Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editores E. Gross and
J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp.
3-254, para las técnicas de síntesis peptídica en
fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis,
Springer-Verlag, Berlín (1984) y E. Gross y J.
Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology,
supra, Vol. 1, para síntesis clásica en solución. La síntesis
química de péptidos quizás sea preferible en el caso de que un
fragmento pequeño del antígeno en cuestión tenga la capacidad de
provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto de interés.
Las proteínas GapC de unión a plasmina de la
presente invención, o sus fragmentos, pueden utilizarse para
producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Si se
escogen los policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado (p.
ej. un ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un antígeno de la
presente invención, un fragmento del mismo o un antígeno mutado. Se
recoge suero del animal inmunizado y se trata de acuerdo con los
procedimientos conocidos. Véase, p. ej. Jurgens et al. (1985)
J. Chrom. 384:363-370. En caso de
utilizar suero que contiene anticuerpos policlonales, los
anticuerpos policlonales pueden purificarse mediante cromatografía
de inmunoafinidad utilizando procedimientos estándar.
Un experto en la materia también puede producir
fácilmente anticuerpos monoclonales frente a las proteínas GapC de
unión a plasmina y a los fragmentos de estas. La metodología general
de producción de anticuerpos monoclonales mediante la tecnología
del hibridoma es ampliamente conocida. Se puede crear líneas
celulares inmortales productoras de anticuerpos mediante fusión
celular, y también mediante otras técnicas como la transformación
directa de linfocitos B con DNA oncogénico o la transfección con
virus de Epstein-Barr. Véanse, p. ej., M. Schreier
et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et
al., Monoclonal Antibodies and T-cell
Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal
Antibodies (1980); véanse también las Patentes Estadounidenses
núm. 4 341 761; 4 399 121; 4 427 783; 4 444 887; 4 452 570; 4 466
917; 4 472 500, 4 491 632; y 4 493 890. Se pueden analizar perfiles
de anticuerpos monoclonales producidos frente a las proteínas GapC
de unión a plasmina, o fragmentos de los mismos, en busca de
diversas propiedades; es decir, de isotipo, epítopo, afinidad, etc.
Los anticuerpos monoclonales sirven para la purificación, mediante
técnicas de inmunoafinidad, de los antígenos individuales frente a
los que están dirigidos. Tanto los anticuerpos policlonales como los
monoclonales también pueden utilizarse para la inmunización pasiva
o pueden combinarse con preparaciones con subunidades de vacuna para
potenciar la respuesta inmunitaria. Los anticuerpos policonales y
los monoclonales también sirven para fines diagnósticos.
Las proteínas GapC de unión a plasmina de la
presente invención se pueden formular en forma de composiciones de
vacunas, individualmente o en combinación con otros antígenos, para
su uso en la inmunización de sujetos que se describe más adelante.
En Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing
Company, Easton, Pennsylvania, 18ª Edición, 1990, por ejemplo, se
describen métodos de preparación de formulaciones de este tipo.
Normalmente las vacunas de la presente invención se preparan en
forma inyectable, como soluciones o suspensiones líquidas. También
se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución o la
suspensión en vehículos líquidos previamente a la inyección.
También puede emulsionarse la preparación o encapsularse el
ingrediente activo en vehículos liposómicos. El ingrediente
inmunogénico activo generalmente se mezcla con un vehículo
farmacéutico compatible, como por ejemplo agua, solución salina,
dextrosa, glicerol, etanol o similares, o con combinaciones de los
mismos. Además, si se desea el vehículo puede contener cantidades
menores de sustancias adyuvantes como agentes humectantes o
emulsionantes y agentes tamponadores del pH.
Los adyuvantes que potencian la efectividad de
la vacuna también pueden añadirse a la formulación. Estos pueden
ser, por ejemplo: muramil dipéptidos, avridina, hidróxido de
aluminio, bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDA), aceites,
emulsiones de aceite en agua, saponinas, citocinas u otras
sustancias conocidas en el ámbito.
La proteína de unión a plasmina puede estar
unida a un transportador con el fin de aumentar la inmunogenicidad
de la misma. Son transportadores adecuados las moléculas grandes de
metabolización lenta como las proteínas. Estos incluyen: albúminas
séricas, hemocianina de lapa californiana, moléculas de
inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina y otras proteínas bien
conocidas por los expertos en la materia; polisacáridos como la
sefarosa, agarosa, celulosa, microesferas de celulosa y similares;
aminoácidos poliméricos como el ácido glutámico, la polilisina y
similares; copolímeros de aminoácidos; y partículas víricas
inactivas.
Las proteínas GapC de unión a plasmina pueden
utilizarse en su forma nativa o bien puede modificarse el contenido
de su grupo funcional mediante, por ejemplo, succinilación de
residuos de resina o mediante la reacción con
Cys-tiolactona. También es posible incorporar en el
transportador (o el antígeno) un grupo sulfhidrilo mediante, por
ejemplo, la reacción de las funciones amino con
2-iminotiolano o el
N-hidroxisuccinimida éster del propionato de
3-(4-ditiopiridil propionato. También se pueden
modificar los transportadores adecuados para incorporar ramas
espaciadoras (como diamina de hexametileno u otras moléculas
bifuncionales de tamaño similar) que permitan la unión de los
péptidos.
Otros transportadores adecuados para las
proteínas GapC de unión a plasmina de la presente invención incluyen
polipéptidos VP6 de los rotavirus, o fragmentos funcionales de los
mismos, que están descritos en la Patente Estadounidense núm. 5 071
651. También es posible emplear un producto de fusión de una
proteína vírica y los inmunógenos del sujeto, llevada a cabo
mediante métodos que están descritos en la Patente Estadounidense
núm. 4 722 840. Aún otros transportadores incluyen células como los
linfocitos, ya que esta forma de presentación imita el modo natural
de presentación en el sujeto, lo cual genera el estado inmunizado.
Alternativamente, las proteínas de la presente invención pueden
estar acopladas a eritrocitos, preferiblemente los eritrocitos
propios del sujeto. Los expertos en la materia conocen los métodos
de acoplamiento de péptidos a proteínas o células.
Además, las proteínas GapC de unión a plasmina
(o complejos de las mismas) se pueden formular en composiciones de
vacunas en su forma natural o bien en forma de sal. Las sales
farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácida
(formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos activos)
que están formadas con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácidos
clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como el acético,
oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a
partir de grupos carboxilo libres también pueden proceder de bases
inorgánicas como, por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, amónico,
cálcico o férrico, y bases orgánicas como isopropilamina,
trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina,
procaína y similares.
Las formulaciones para vacunas deben contener
una "cantidad terapéuticamente efectiva" del ingrediente
activo, que es una cantidad suficiente para proporcionar una
respuesta inmunitaria en el sujeto al que se administra la
composición. En el tratamiento y la prevención de la mastitis, por
ejemplo, una "cantidad terapéuticamente efectiva" sería
preferiblemente una cantidad que mejore la resistencia de la
glándula mamaria a una nueva infección o que reduzca la gravedad
clínica de la enfermedad. Esta protección quedará demostrada por una
reducción o falta de los síntomas mostrados normalmente por un
huésped infectado, por un menor tiempo de recuperación o por un
menor recuento de células somáticas en la leche del cuarto
infectado. A modo de ejemplo, la capacidad de la composición para
mantener el recuento de células somáticas (RCS) en la leche en unas
500.000 células por ml o llevarlo hasta esa cifra, el valor umbral
determinado por la Federación Internacional de Lechería por encima
del cual se considera que los animales padecen mastitis clínica,
debe ser indicativo de un efecto terapéutico.
La cantidad exacta puede determinarla un experto
en la materia utilizando pruebas estándar. La concentración de
proteína GapC de unión a plasmina suele oscilar entre un 1 y un 95%
(p/p) de la composición, o incluso valores mayores o menores en los
casos que se estime necesario. Con las presentes formulaciones para
vacunas, de 5 a 500 \mug de ingrediente activo por ml de solución
infectada deben ser suficientes para generar una respuesta
inmunitaria cuando se ha administrado una dosis de 1 a 3 ml por
animal.
Para inmunizar a un sujeto, la vacuna se
administra generalmente por vía parenteral, normalmente mediante
inyección intramuscular. Sin embargo, otros modos de administración,
como la inyección subcutánea, intraperitoneal e intramuscular,
también son aceptables. La cantidad a administrar depende del animal
a tratar, de la capacidad del sistema inmunitario del animal para
sintetizar anticuerpos y del grado de protección deseado. Las dosis
efectivas puede establecerlas cualquier experto en la materia
mediante ensayos rutinarios estableciendo curvas de respuesta a la
dosis. La inmunización del sujeto se realiza administrando la vacuna
en una dosis al menos, y preferiblemente en dos. Además, al animal
se le pueden administrar tantas dosis como sea necesario para
mantener un estado de inmunidad frente a la infección.
Otras formulaciones adicionales adecuadas para
otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos
casos, aerosoles, formulaciones de administración intranasal u oral,
y formulaciones de liberación controlada. En el caso de los
supositorios, la composición del vehículo incluirá aglutinantes
tradicionales y transportadores, como glicoles polialcalinos o
triglicéridos. Estos supositorios se pueden formar a partir de
mezclas que contengan el ingrediente activo en un margen aproximado
de entre un 0,5 y un 10% (p/p) o, preferiblemente, entre un 1 y un
2%. Los vehículos orales incluyen excipientes utilizados
habitualmente como son, por ejemplo, cantidades farmacéuticamente
deseables de: manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio,
celulosa, sacarina sódica, carbonato de magnesio y similares. Estas
composiciones orales para vacunas se pueden administrar en forma de
soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas,
formulaciones de liberación controlada o polvos, y pueden contener
entre un 10 y un 95% del ingrediente activo, preferiblemente entre
un 25 y un 70%.
Las formulaciones intranasales han de incluir
normalmente vehículos que no causen irritación en la mucosa nasal y
que no alteren de forma significativa la función ciliar. Con la
presente invención es posible utilizar diluyentes como agua,
solución salina acuosa u otras sustancias conocidas. Las
formulaciones nasales también pueden contener conservantes como,
por ejemplo, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Se puede añadir
un tensioactivo para mejorar la absorción de las proteínas en
cuestión por la mucosa nasal.
Las formulaciones de liberación controlada o
sostenida se producen incorporando la proteína a transportadores o
vehículos como los siguientes: liposomas, polímeros no reabsorbibles
impermeables como copolímeros de acetato de etilenovinilo y
copolímeros de Hytrel®, polímeros hinchables como los hidrogeles, o
polímeros reabsorbibles como el colágeno y ciertos poliácidos o
poliésteres como los utilizados para realizar suturas reabsorbibles.
Las proteínas GapC de unión a plasmina también se pueden
administrar mediante minibombas implantadas, ampliamente conocidas
en el campo.
Las proteínas GapC de unión a plasmina de la
invención que nos ocupa también pueden administrase a través de un
virus transportador que exprese estas proteínas. Los virus
transportadores que son de utilidad en la presente invención
incluyen, entre otros, virus vaccinia y otros virus de la viruela,
adenovirus y virus del herpes. A modo de ejemplo, se pueden
construir recombinantes del virus vaccinia que expresen las nuevas
proteínas de la siguiente manera. El DNA que codifica la proteína
en particular se inserta, en primer lugar, de forma que esté
adyacente a un promotor vaccinia y a secuencias de DNA de vaccinia
flanqueantes, como la secuencia que codifica la timidina quinasa
(TK). Este vector se utiliza a continuación para transfectar células
que son infectadas de forma simultánea con vaccinia. La
recombinación homóloga sirve para inserir el promotor de vaccinia
más el gen que codifica la proteína en cuestión dentro del genoma
vírico. El recombinante de TK resultante puede seleccionarse
mediante el cultivo de las células en presencia de
5-bromodesoxiuridina y la selección de las calvas
víricas resistentes a la misma.
Una vía de administración alternativa implica la
terapia génica o la inmunización genética. Por lo tanto, las
secuencias nucleotídicas (y los elementos reguladores que las
acompañan) que codifiquen las proteínas GapC de unión a plasmina de
interés pueden administrarse directamente a un sujeto para la
traducción in vivo de las mismas. Contrariamente, la
transferencia génica puede realizarse transfectando las células o
los tejidos del sujeto ex vivo y reintroduciendo el material
transformado dentro del huésped. El DNA puede introducirse
directamente en el microorganismo huésped, es decir, mediante
inyección (véanse la Publicación Internacional núm. WO/90/11092; y
Wolff et al. [1990] Science
247:1465-1468). La transferencia génica
mediada por liposomas también puede conseguirse utilizando métodos
conocidos. Véanse, por ejemplo, Hazinski et al. (1991) Am.
J. Respir. Cell Mol. Biol. 4:206-209;
Brigham et al. (1989) Am. J. Med. Sci.
298:278-281; Canonico et al. (1991)
Clin. Res. 39:219A; y Nabel et al. (1990)
Science 249:1285-1288. Agentes
dirigidos, como anticuerpos dirigidos hacia antígenos de superficie
expresados en tipos celulares específicos, pueden conjugarse de
forma covalente a la superficie liposómica de modo que el ácido
nucleico puede liberarse en tejidos y células específicos
vulnerables a la infección.
Tal como se ha explicado anteriormente, las
proteínas GapC de unión a plasmina de la presente invención también
pueden utilizarse como medio diagnóstico para detectar la presencia
de anticuerpos reactivos a estreptococos, por ejemplo a S.
dysgalactiae, en una muestra biológica con la finalidad de
determinar la existencia de infección por estreptococos. Por
ejemplo, la presencia de anticuerpos reactivos a las proteínas GapC
de unión a plasmina puede detectarse mediante técnicas de
electroforesis y de inmunodiagnóstico estándar, incluyendo
inmunoensayos como los ensayos de tipo competitivo, de reacción
directa o de tipo sándwich. Estos ensayos incluyen, entre otros:
transferencias Western (Western blots), ensayos de aglutinación,
inmunoensayos de marcaje con enzimas o mediados por enzimas (como
el ELISA), ensayos de tipo biotina/avidina, radioinmunoensayos,
inmunoelectroforesis, inmunoprecipitación, etc. Las reacciones
incluyen generalmente la manifestación de marcajes de tipo
fluorescente, quimioluminiscente, radiactivo o enzimático, o
moléculas de tinción, o bien otros métodos para detectar la
formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o
anticuerpos con los que reacciona.
Estos ensayos mencionados generalmente implican
la separación del anticuerpo no unido en una fase líquida a partir
de un soporte en fase sólida al que están unidos los complejos
antígeno-anticuerpo. Los soportes sólidos que se
pueden utilizar en la práctica de la invención incluyen sustratos
como la nitrocelulosa (p. ej. en forma de membrana o pocillo de
microtitulación), el cloruro de polivinilo (p. ej. láminas o
pocillos de microtitulación), látex de poliestireno (p. ej.
microesferas o placas de microtitulación), fluoruro de
polivinilidina, papel diazotizado, membranas de nylon,
microesferas activadas, microesferas de atracción magnética y
similares.
De forma característica, se hace reaccionar en
primer lugar un soporte sólido con un componente en fase sólida (p.
ej. una o más proteína GapC de unión a plasmina) bajo condiciones de
unión adecuadas de forma que el componente esté suficientemente
fijo al soporte. En ocasiones se puede potenciar la fijación del
antígeno al soporte acoplando primero el antígeno a una proteína
con mejores propiedades de unión. Algunas de las proteínas de
acoplamiento adecuadas son macromoléculas del tipo: albúminas
séricas como la albúmina sérica bovina (BSA), hemocianina de lapa
californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina,
ovoalbúmina y otras proteínas muy conocidas por los expertos en el
campo. Otras moléculas que se pueden utilizar para unir los
antígenos al soporte incluyen polisacáridos, ácidos polilácticos,
ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros
aminoacídicos y similares. Estas moléculas y métodos de acoplamiento
de estas moléculas a los antígenos son bien conocidos por cualquier
experto en el ámbito. Véanse, p. ej., Brinkley, M.A. Bioconjugate
Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et
al., J. Appl. Biochem. (1984)
6:56-63; y Anjaneyulu and Staros,
International J. of Peptide and Protein Res. (1987)
30: 117-124.
Una vez se ha hecho reaccionar el soporte sólido
con el componente en fase sólida, se elimina mediante lavado
cualquier componente en fase sólida no inmovilizado en el soporte, y
a continuación el componente unido al soporte se pone en contacto
con una muestra biológica de la que se sospecha contiene fracciones
del ligando (p. ej. anticuerpos frente a los antígenos
inmovilizados) bajo condiciones de unión adecuadas. Después del
lavado para eliminar cualquier ligando no unido, se añade una
fracción de unión secundaria bajo las condiciones adecuadas de
unión, de modo que el enlazante secundario es capaz de asociarse de
forma selectiva con el ligando unido. La presencia del enlazante
secundario puede detectarse entonces utilizando las técnicas
ampliamente conocidas en el campo.
De forma más concreta, se puede utilizar un
método ELISA en el que los pocillos de una placa de microtitulación
se recubren con una proteína GapC de unión a plasmina. A
continuación se añade a los pocillos recubiertos una muestra
biológica que contiene, o de la que se sospecha que contiene,
moléculas de inmunoglobulina anti-proteína GapC de
unión a plasmina. Transcurrido un periodo de incubación suficiente
para permitir la unión del anticuerpo al antígeno inmovilizado, la
placa o placas pueden lavarse para eliminar las fracciones no unidas
y se puede añadir una molécula de unión secundaria marcada de forma
detectable. Se permite a la molécula de unión secundaria reaccionar
con cualquier anticuerpo capturado de las muestras, se lava la placa
y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria
mediante métodos de sobra conocidos en el campo.
Por tanto, en una realización en particular, la
presencia de ligandos unidos de antígeno
anti-proteína GapC de unión a plasmina procedentes
de una muestra biológica se puede detectar fácilmente utilizando un
enlazante secundario que contenga un anticuerpo dirigido frente a
los ligandos de anticuerpo. En el ámbito se conoce una serie de
moléculas de inmunoglobulina (Ig) antibovina que permiten una
conjugación rápida con un marcador enzimático detectable, como la
peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina o la ureasa,
utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia. Un
sustrato enzimático apropiado se utiliza a continuación para
generar una señal detectable. Otras realizaciones relacionadas
admiten el uso de técnicas ELISA de tipo competitivo utilizando los
métodos de sobra conocidos por los expertos.
Los ensayos también se pueden llevar a cabo en
solución, de modo que las proteínas y los anticuerpos específicos
para estas proteínas formen complejos bajo condiciones de
precipitación. En una realización en concreto, las proteínas GapC
de unión a plasmina pueden unirse a una partícula en fase sólida (p.
ej. una microesfera de agarosa o similar) utilizando las técnicas
de acoplamiento estándar, como el acoplamiento químico directo o
indirecto. Después se pone en contacto la partícula recubierta con
antígenos bajo condiciones de unión con una muestra biológica de la
que se sospecha que contiene anticuerpos para las proteínas GapC de
unión a plasmina. El enlace cruzado entre anticuerpos unidos causa
la formación de agregados de complejos
partícula-antígeno-anticuerpo que
se pueden precipitar y separar de la muestra mediante lavado o
centrifugado. La mezcla de reacción se puede analizar para
determinar la presencia o ausencia de complejos
anticuerpo-antígeno utilizando cualquiera de los
varios métodos estándar, como los métodos de inmunodiagnóstico
descritos anteriormente.
En aún otra realización, se puede proporcionar
una matriz de inmunoafinidad en la que se inmoviliza en un sustrato
una población policlonal de anticuerpos procedentes de una muestra
biológica sospechosa de contener moléculas
anti-GapC de unión a plasmina. En ese sentido, es
posible llevar a cabo una purificación inicial de la muestra por
afinidad con antígenos inmovilizados. De este modo, la preparación
de muestras resultante solamente contendrá fracciones
antiestreptococos, evitando así posibles características de unión
inespecíficas en el soporte de afinidad. En el campo se conocen
varios métodos de inmovilización de inmunoglobulinas (intactas o en
fragmentos específicos) con un rendimiento elevado y una buena
retención de la actividad de unión antigénica. Sin estar limitado
por cualquier método en particular, se puede utilizar proteína A o
proteína G para inmovilizar inmunoglobulinas.
Consecuentemente, una vez estén inmovilizadas
las moléculas de inmunoglobulina para proporcionar una matriz de
inmunoafinidad, se ponen en contacto las proteínas GapC de unión a
plasmina marcadas con los anticuerpos unidos bajo condiciones de
unión adecuadas. Una vez se han lavado del soporte de inmunoafinidad
todos los anticuerpos unidos de forma inespecífica, se puede
determinar la presencia de antígeno unido valorando la presencia
del marcador mediante los métodos conocidos.
Además, los anticuerpos generados frente a las
proteínas GapC de unión a plasmina, mejor que las propias proteínas
GapC de unión a plasmina, pueden utilizarse en los ensayos antes
descritos con el fin de detectar la presencia de anticuerpos para
las proteínas en una muestra dada. Estos ensayos se realizan
fundamentalmente del modo descrito anteriormente y son de
conocimiento general en el ámbito.
Los reactivos de los ensayos antes descritos,
incluidas las proteínas GapC de unión a plasmina o los anticuerpos
de las mismas, se pueden suministrar en equipos que lleven las
instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios para llevar a
cabo los inmunoensayos antes descritos. El equipo también puede
contener, en función del inmunoensayo utilizado en cada caso,
marcadores adecuados y otros reactivos y materiales envasados (es
decir, tampones de lavado y similares). Los inmunoensayos estándar
como los antes descritos se pueden realizar utilizando estos
equipos.
Se realizó un depósito de cultivos
biológicamente puros de las siguientes cepas en la Colección
Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas,
Virginia, bajo las directrices del Tratado de Budapest. El número
de acceso indicado se asignó tras un análisis positivo de
viabilidad, y se abonaron las tarifas requeridas. Los depósitos
designados se mantendrán durante un periodo de treinta (30) años
desde la fecha de depósito, o durante cinco (5) años después de la
última petición para el depósito, el periodo de tiempo que sea más
largo. En el caso de que un cultivo sea inviable o sea destruido de
forma involuntaria, o que cepas que contengan plásmidos los
pierdan, serán sustituidos por un cultivo o cultivos viables de la
misma descripción taxonómica.
Si se diera una discrepancia entre la secuencia
presentada en la presente solicitud y la secuencia del gen de
interés del plásmido depositado debido a errores rutinarios de
secuenciación, la secuencia del plásmido depositado será la que
prevalezca.
Cepa Bacteriana | Plásmido | Gen | Fecha de Depósito | núm. ATCC |
E. coli BL2I DE3 | pET15bgapC | gapC (S. dysgalactiae) | 31 de mayo de 2000 | PTA-1976 |
E. coli BL21 DE3 | pMF521c | gapC (S. agalactiae) | 31 de mayo de 2000 | PTA-1975 |
E. coli BL21 DE3 | pMF521a | gapC (S. uberis) | 31 de mayo de 2000 | PTA-1973 |
E. coli BL21 DE3 | pMF521e | gapC (S. iniae) | 31 de mayo de 2000 | PTA-1972 |
A continuación se exponen ejemplos de
realizaciones específicas para la realización de la presente
invención. Los ejemplos se ofrecen solamente con una finalidad
ilustrativa y no pretenden limitar el alcance de la presente
invención de ninguna manera.
Se han destinado esfuerzos a garantizar la
precisión con respecto a los números utilizados (p. ej. cantidades,
temperaturas, etc.), pero cabe la posibilidad de que existan alguna
desviación o algún error experimentales.
Las enzimas se adquirieron de fuentes
comerciales y se utilizaron siguiendo las instrucciones de los
fabricantes.
Para el aislamiento de fragmentos de DNA,
excepto en los casos en los que se especifique lo contrario, todas
las manipulaciones de DNA se realizaron según procedimientos
estándar. Véase Sambrook et al., supra. Las enzimas
de restricción T_{4} DNA ligasa, E. coli, DNA polimerasa
II, fragmento Klenow y otros reactivos biológicos pueden adquirirse
a partir de proveedores comerciales y utilizarse de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Los fragmentos de DNA de doble cadena
se separaron en geles de agarosa.
Las fuentes de reactivos químicos incluyen en
general las siguientes: Sigma Chemical Company, St. Louis, MO;
Alrich, Milwaukee, WI; Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis,
IN.
Un aislado clínico de S. dysgalactiae
proveniente de un caso de mastitis bovina (Núm. de Acceso a ATCC
ATCC43078) se obtuvo a partir de la Colección Americana de (10801
University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209), y se
empleó como fuente de DNA. El microorganismo se cultivó de forma
rutinaria sobre placas de agar TSA y sangre bovina (PML
Microbiologicals, Mississauga, Ontario) a 37ºC durante 18 horas, o
en caldo de cultivo Tod&Hewitt (Oxoid Ltd., Hampshire,
Inglaterra) complementado con 0,3% de extracto de levadura
(THB-YE) a 37ºC y CO_{2} al 5%.
El DNA cromosómico se preparó a partir de S.
dysgalactiae cultivado en 100 ml de THB-YE
complementado con glicina 20 mM durante aproximadamente 6 horas,
hasta alcanzar una A_{600} de 0,8 a 1,0. Las células se recogieron
y se resuspendieron en EDTA 50 mM, Tris-HCl 50 mM y
Tween-20® al 0,5% (Sigma, St. Louis, MO), y se
complementaron con ribonucleasa A (200 mg/ml), proteinasa K (20
mg/ml), lisozima (100 mg/ml) y mutanolisina (100 mg/ml) (SIGMA, St.
Louis, MO). Tras la lisis bacteriana durante 30 minutos a 37ºC con
agitación vigorosa, se mezcló hidrocloruro de guanidina y
Tween-20® a pH 5,5 con el lisado para conseguir una
concentración final de 0,8 M y del 5%, respectivamente. Esta mezcla
se incubó a 50ºC durante 30 minutos. Entonces se purificó el DNA
cromosómico utilizando un equipo Qiagen genomic-tip
100 g (Qiagen, Santa Clarita, CA) y se precipitó utilizando 0,7
volúmenes de isopropanol. El precipitado resultante se lavó en
etanol al 70% y se resuspendió en 0,5 ml de Tris-HCl
10 mM a pH 8,8.
El gen gapC fue amplificado mediante PCR (véanse
Mullis et al., Patente Estadounidense núm. 4 683 195; Mullis,
Patente Estadounidense núm. 4 683 202). El cebador directo,
gapC1, contenía una diana de restricción NdeI (ID. de
SEC. núm.: 1, mostrado en la Tabla 1) y el cebador indirecto,
gapC1r, contenía una diana BamHI (ID. de SEC. núm.:
2, mostrado en la Tabla 1). En las anteriores secuencias de
cebadores, ilustradas en la Tabla 1, el subrayado indica los
nucleótidos añadidos a la secuencia original, y la negrita indica la
situación de los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de
restricción.
La PCR se llevó a cabo utilizando la Vent DNA
polimerasa (New England Biolabs, Mississauga, ON, Canadá). Se
incubaron 0,7 \mug de DNA cromosómico de S. dysgalactiae en
una mezcla de reacción que contenía 1 \muM de cada uno de los
cebadores anteriores; 200 \muM de cada uno de los nucleótidos
dATP, dTTP, dCTP y dGTP; MgSO_{4} 3 mM; 1x concentración de
tampón Thermopol (New England Biolabs, Mississauga, ON, Canadá); y 2
unidades de Vent DNA polimerasa. Esta mezcla se incubó durante 3
ciclos de amplificación de 1 minuto a 94ºC, 3 minutos a 50ºC y 1
minuto, 10 segundos a 72ºC, luego durante 27 ciclos de amplificación
de 15 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC, y
finalmente durante 1 ciclo de 5 minutos a 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La gapC producto de PCR se clonó en un vector de
expresión pET15B (Novagen, Madison, WI) que había sido digerido con
BamHI y NdeI. La clonación del producto de PCR en este
lugar provoca la adición a la secuencia codificante de gapC
de una secuencia codificante dentro del patrón de lectura para una
cola de seis histidinas. La posterior expresión produce una
proteína completa que lleva la cola de histidinas, lo que permite la
purificación de la proteína bajo condiciones no desnaturalizantes
utilizando cromatografía de quelatos metálicos.
Este constructo se utilizó para transformar
E. coli BL21 DE3 (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Esta
cepa transformada se designó BL21 DE3 (PETl5bgapC) (Núm. ATCC).
El gen gapC se preparó a partir de otros
aislados siguiendo fundamentalmente el modo antes descrito.
El DNA cromosómico de S. agalactiae,
S. uberis y S. parauberis se aisló de cepas obtenidas
de la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University
Boulevard, Manassas, VA 20110-2209; cepas designadas
por ATCC 27541, 9927 y 13386, respectivamente). El DNA cromosómico
de S. inicie se aisló de una cepa designada 9117 obtenida
del Hospital Mount Sinai de Toronto.
Los cebadores utilizados para amplificar los
genes gapC de las cepas de Streptococcus antes
expuestas fueron los mismos que los utilizados en el caso de S.
dysgalactiae, es decir, el cebador gapC1 (ID. de SEC.
núm.: 1) y el cebador gapC1r (ID. de SEC. núm.: 2).
Una vez acabada la amplificación, el producto de
PCR se clonó en cada caso dentro de un pPCR-Script,
utilizando el protocolo de clonación descrito en el equipo
PCR-Script Amp Cloning Kit (Stratagene, La Jolla,
CA). A continuación, se cortó el inserto de producto de PCR
utilizando NdeI y BamHI y se volvió a clonar dentro de
esos sitios en pEl5b utilizando los protocolos de clonación
convencionales (véase, p. ej., Sambrook et al.,
supra.). Los plásmidos que contenían S. agalactiae, S.
uberis, S. parauberis y S. iniae fueron designados como
pMF521c (núm. ATCC), pMF521a (núm. ATCC), pMF521d (núm. de ATCC) y
pMF521e (núm. de ATCC), respectivamente.
Al secuenciar un gen de S. dysgalactiae
unido pero no relacionado fue cuando se identificaron por primera
vez las secuencias homólogas a gapC del homólogo de S.
equisimilis (Gase, et al. [1996] European J. of
Biochem. 239:42-51). Para obtener la
secuencia completa del gen gapC de S. dysgalactiae, se empleó
la PCR con los cebadores antes descritos, es decir, el cebador
gapC1 y el cebador gapC1r.
La secuencia se determinó en el Plant
Biotechnology Institute (PBI, Saskatoon, Canadá) utilizando
terminadores de cola marcados con fluorescencia en un secuenciador
de DNA automático ABI 373 (Applied Biosystems, Emeryville, CA).
Las secuencias de las proteínas GapC aisladas de
S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis y S.
iniae se determinaron por el mismo método.
Las figuras de la 1 a la 5 muestran tanto las
secuencias nucleotídicas como las secuencias aminoacídicas esperadas
de la proteína GapC de S. dysgalactiae (DysgalGapC) (ID. de
SEC. núm.: 3 y ID. de SEC. NÚM.: 4), así como las de las proteínas
GapC de S. agalactiae (AgalGapC) (ID. de SEC. núm.: 5 e ID.
de SEC. núm.: 6), S. uberis (UberGapC) (ID. de SEC. núm.: 7
e ID. de SEC. núm.: 8), S. parauberis (PUberGapC) (ID. de
SEC. núm.: 9 e ID. de SEC. núm.: 10) y S. iniae (IniaeGapC)
(ID. de SEC. núm.: 11 e ID. de SEC. núm.: 12), respectivamente.
El gen de la proteína GapC de S.
dysgalactiae representado en las figuras 1A-1B
codifica una proteína de 336 aminoácidos que no parece contener ni
una secuencia señal ni un dominio de anclaje a membrana. Una
búsqueda en la base de datos del GenBank realizada con el programa
BLASTX reveló que el patrón abierto de lectura era homólogo en un
95,5% a la GapC de S. equisimilis (Núm. de acceso en GenBank
X97788) y en un 99,4% a la GapC de S. pyogenes (Núm. de
acceso en GenBank M95569). La secuencia aminoacídica predicha de la
proteína GapC también mostró una identidad aminoacídica del 43% con
la gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa bovina (Núm. de acceso en GenBank U85042).
De forma similar, no se observa presencia de
secuencias señal ni dominios de anclaje a membrana en las secuencias
de proteína GapC de S. agalactiae, S. uberis, S. parauberis
y S. iniae.
Las homologías de las secuencias aparecen
representadas en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína GapC con una cola de polihistidinas
(6 His) se expresó y purificó en condiciones no desnaturalizantes
mediante cromatografía de afinidad de quelatos metálicos
(Ni-NTA).
Se hizo crecer E. coli BL21 DE3 que
contenía el plásmido recombinante en medio Luria Broth (LB)
que contenía 100 \mug/ml de ampicilina hasta una A_{600} de
aproximadamente 0,5. Entonces, se indujo la expresión de la
proteína GapC mediante la adición de
isopropil-\betaD-tiogalactósido 1
mM (IPTG) (Sigma, St. Louis, MO). Tras tres horas de incubación a
37ºC, se recogieron las células, se lavaron con el tampón de la
columna (solución de fosfato sódico 50 mM, pH 8,0; NaCl 0,3 M;
imidazol 10 mM) y se lisaron por sonicación.
Aproximadamente un 40% de la proteína
recombinante se encontraba en la fracción soluble del lisado celular
con un rendimiento aproximado de 50 mg de proteína recombinante por
litro de cultivo, determinado mediante el Equipo de valoración de
proteínas DC (Bio-Rad Laboratories,
Mississauga, ON, Canadá) utilizando albúmina sérica bovina (Pierce,
Rockford, IL) como estándar.
Se limpió el lisado mediante centrifugación y la
fracción soluble se pasó por una columna Ni-NTA
(Qiagen), que se lavó posteriormente con 10 volúmenes de columna de
tampón de la columna (igual que el anterior, excepto que contenía
imidazol 20 mM). La proteína GapC con la cola de polihistidina se
eluyó utilizando el tampón de la columna (igual que el anterior,
excepto que contenía imidazol 250 mM) y dio como resultado una
fracción homogénea de proteínas con una concentración de GapC de 10
a 15 mg/ml. Dicha fracción se dializó frente a 2000 volúmenes de
PBSA (cloruro sódico 136 mM, cloruro potásico 2,6 mM, fosfato sódico
dibásico 8,1 mM, fosfato potásico monobásico 1,46 mM).
La expresión y la purificación de las proteínas
recombinantes de esas especies de estreptococos se consigue
mediante los mismos procedimientos descritos en el Ejemplo 1E antes
mencionado. Las cepas bacterianas transformadas utilizadas para
expresar las proteínas GapC recombinantes de S. agalactiae,
S. uberis, S. parauberis y S. iniae se
designaron como BL21 DE3 (pMF52lc) (núm. ATCC), BL21 DE3 (pMF521a)
(núm. ATCC), BL21 DE3 (pMF52ld) (núm. ATCC) y BL21 DE3 (pMF521e)
(núm. ATCC), respectivamente.
La electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS se realizó con una muestra de la
proteína eluida mediante el método descrito por Laemli (Laemli,
U.K. [1970] Nature 227:680-685). Los
resultados se presentan en la Figura 18: carril 1, marcadores de
peso molecular (intervalo de 20,5 a 103 kDa; BioRad Laboratories,
Emeryville, CA); carril 2, proteína GapC recombinante soluble de
S. dysgalactiae, purificada mediante cromatografía de
afinidad Ni-NTA.
Los resultados muestran que la purificación por
cromatografía de afinidad en columna Ni-NTA da como
resultado una fracción proteica homogénea.
La enzima GAPDH cataliza la fosforilación
oxidativa de
D-gliceraldehído-3-fosfato
a 1,3-difosfoglicerato en presencia de NAD^{+} y
fosfato inorgánico. El elevado grado de homología de GapC con la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa estreptocócica sugiere que GapC podría tener esa
actividad enzimática.
La actividad GAPDH de las células enteras de
S. dysgalactiae (10^{10} UFC) y de la proteína GapC
recombinante se determinó midiendo la reducción de NAD^{+} a
NADH. El tampón del ensayo estaba compuesto de trietanolamina 40
mM, Na_{2}HPO_{4} 50 mM y EDTA 5 mM, pH 6,8. Se incubaron
células de S. dysgalactiae o 5 mg de proteína recombinante
GapC purificada en el tampón del ensayo que contenía
gliceraldehído-3-fosfato (49 mg/ml;
Sigma Chemical Company), 75 microlitros de NAD^{+} (15 mM; Sigma
Chemical Company) hasta un volumen final de 1 ml. Como controles
negativos se utilizaron muestras que no contenían
gliceraldehído-3-fosfato o moléculas
de proteína GapC recombinante/células de S. dysgalactiae. La
reducción de NAD^{+} a NADH se controló espectrofotométricamente
a una absorbancia de 340 nanómetros.
Los resultados indicaron que tanto la proteína
recombinante como las células intactas de S. dysgalactiae de
tipo salvaje poseían actividad enzimática (no se muestran estos
resultados). Además, cuando se trataron las células de S.
dysgalactiae con tripsina para digerir las proteínas de
superficie, la actividad GAPDH desapareció. Así, la actividad
enzimática observada en las células intactas de tipo salvaje no se
debió a la GAPDH intracelular.
Estos datos sugieren que la proteína GapC se
localiza en la superficie de la célula a pesar de la aparente falta
de secuencias señal o de anclaje a membrana tanto en la secuencia de
nucleótidos como en la de aminoácidos.
Se utilizó un ensayo en microplaca para
determinar si la proteína recombinante GapC tenía la capacidad de
unirse a la plasmina bovina, y si dicha unión mantenía la actividad
enzimática de la plasmina.
Se sembraron microplacas de 96 pocillos con 5 mg
de proteína recombinante GapC purificada, se lavaron tres veces con
0,1% de gelatina-PBSA con 0,05% de
TWEEN-20 (PBSGT).
Se bloquearon los pocillos durante una hora a
37ºC en la misma solución y se lavaron y se incubaron con 200
\mul de plasmina bovina (0,25 mg/ml, Boehringer Mannheim,
Indianapolis, IN) durante una hora a 37ºC. A continuación, se
lavaron los pocillos ocho veces con PBSGT. Se añadieron 200 \mul
del sustrato sintético Chromazym-PL
(Tos-Gly-Pro-Lys-4-NA,
0,3 mg/ml) a los pocillos y se incubaron a 37ºC durante una hora.
La presencia de actividad plasmina asociada se determinó mediante
la medición de la cantidad de paranitroanilida
(4-nitranilina) liberada en los sobrenadantes en
función de su absorbancia a 405 nanómetros. Se utilizó un
procedimiento similar para medir la actividad de unión a plasmina
de las células intactas de S. dysgalactiae, con la excepción
de que 10^{10} células se lavaron con PBSGT, se resuspendieron en
400 \mul de Chromazym-PL (0,3 mg/ml) y se
incubaron durante una hora a 37ºC.
Los resultados, que se muestran en la Figura 19,
demuestran que la proteína recombinante purificada presentó la
capacidad de unirse a plasmina bovina enzimáticamente activa.
Asimismo, cuando se utilizaron células intactas de S.
dysgalactiae, se obtuvieron resultados similares. En la figura,
los datos representan la media de tres ensayos independientes.
Así, el receptor de plasmina está localizado en
la superficie de S. dysgalactiae y la proteína purificada
mantiene su actividad biológica.
Las vacunas de formularon de tal manera que
contenían 50 mg/ml de proteína GapC recombinante purificada por
afinidad en adyuvante de base oleosa VSA3 (VIDO, Saskatoon,
Saskatchewan, Canadá). VSA3 es una combinación de Emulsigen
Plus^{TM} (MVP Laboratories, Ralston, Nebraska) y bromuro de
dimetildioctadecil amonio (Kodak, Rochester, New York). En la
Figura 18 se muestra la proteína GapC recombinante purificada por
afinidad utilizada para la preparación de la vacuna.
Se obtuvieron 24 Holsteins no lactantes sin
antecedentes de infección por S. dysgalactiae a partir de
diferentes granjas de Saskatchewan, en Canadá. Una semana antes de
la vacunación, se trataron todos los animales con
Cepha-dry^{TM} (Ayerst Laboratories, Montreal,
Canadá) (300 mg por cuarto) con el objetivo de eliminar cualquier
infección de la ubre antes de la vacunación.
Se inmunizaron grupos de ocho animales por vía
subcutánea con dos dosis de vacuna que contenían proteína GapC de
S. dysgalactiae, Mig (una proteína receptora para Fc aislada
de S. dysgalactiae, que fue evaluada simultáneamente) o un
placebo, con un intervalo de tres semanas entre inmunizaciones. Dos
semanas después de la segunda inmunización, los animales fueron
expuestos a 650 unidades formadoras de colonias de S.
dysgalactiae administradas en tres de los cuartos con una
cánula de infusión para ubres. El cuarto restante de cada animal se
utilizó como un control sin infección.
Se examinó diariamente la aparición de signos
clínicos de la enfermedad en todos los animales y se recogieron
muestras de los cuartos de la ubre cada día. Se analizó la
consistencia de las muestras y se realizó el recuento de células
somáticas así como la determinación del número de bacterias.
Se determinaron los anticuerpos específicos de
GapC en el suero bovino mediante un inmunoensayo en fase sólida
(ELISA). Brevemente, se sembraron microplacas (NUNC, Naperville,
Illinois) con 1 \mug por pocillo de antígeno recombinante
purificado en tampón de carbonato sódico 50 mM, pH 9,6 y se
incubaron durante toda la noche a 4ºC. Se retiró el líquido y se
bloquearon los pocillos con una solución de albúmina sérica bovina
al 3% durante 1 hora a 37ºC. Entonces, se añadieron diluciones
seriadas de suero bovino (de 1:4 a 1:6400) a los pocillos y se
incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Posteriormente,
los pocillos se aspiraron, lavaron e incubaron con 100 \mul de
anticuerpos de cabra anti-IgG bovina conjugados con
fosfatasa alcalina (Kirkgaard & Perry Laboratories Inc.,
Gaithersburg, MD) durante una hora a temperatura ambiente. Se
volvieron a lavar los pocillos y se añadieron 100 \mul de
p-nitrofenol fosfato (SIGMA, St. Louis, MO) como
sustrato para detectar la actividad de la fosfatasa alcalina. Se
determinó la absorbancia a 405 nanómetros tras una hora de
incubación con el sustrato a temperatura ambiente.
Cuando se refiere a las figuras, el título de
anticuerpos específicos como el recíproco de la dilución que
mostraba actividad por encima de los niveles basales.
Se estableció el número de bacterias esparciendo
diluciones seriadas (de 10^{0} a 10^{-3}) directamente en
placas agar sangre de oveja TSA seguido de la incubación durante
toda la noche a 37ºC y CO_{2} al 5%. La colonización se define
como la recuperación de >500 ufc/ml del organismo infectado.
Para confirmar que las bacterias recogidas de
las secreciones de leche eran de S. dysgalactiae, se
seleccionaron colonias recogidas de cada animal y se analizaron
utilizando un ensayo API strep-20 (bioMerieux SA,
Hazelwood, Missouri) según las instrucciones suministradas por el
fabricante. Este ensayo es una técnica estandarizada que combina 20
ensayos bioquímicos para determinar la actividad enzimática y la
fermentación de azúcares. Las reacciones se leen en función de una
tabla de lectura y la identificación se obtiene tanto por el índice
del perfil analítico como por una aplicación informática de
identificación.
Tras la entrada en contacto con el
microorganismo, los animales de todos los grupos mostraron
colonización por S. dysgalactiae (Figura 20). Únicamente las
vacas inmunizadas con GapC mostraron una reducción estadísticamente
significativa en el número de cuartos infectados y en el número
total de bacterias aisladas por cuarto. Por tanto, la inmunización
con GapC redujo la colonización bacteriana tras la entrada en
contacto con S. dysgalactiae.
La relación entre el título de
anti-GapC y la colonización bacteriana se muestra en
las Figuras 21 y 22. Se observó una gran correlación entre los
niveles séricos de anticuerpos anti-GapC y el número
máximo de bacterias (expresado en UFC (log_{10)}/ml de leche)
detectado en todos los cuartos (r = 0,74) (Figura 21), así como con
el número total de cuartos infectados (r^{2} = 0,74) (Figura 22).
La correlación se calculó utilizando el programa GraphPad Prism,
versión 2.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, California).
Esta correlación también se ilustra en las
Figuras 23 y 24 en las que el grupo inmunizado con GapC se subdivide
en individuos con una respuesta elevada e individuos con una
respuesta baja. En esas figuras, los "individuos de título
bajo" se refiere a los cuatro animales con la peor respuesta
frente a GapC, mientras que los "individuos de título elevado"
se refiere al resto del grupo. En el grupo de título elevado no se
produjo colonización, mientras que incluso el grupo de título bajo
mostró un número reducido de bacterias recogidas después de tres
días.
La respuesta inflamatoria se midió en función
del recuento de células somáticas (es decir, linfocitos, neutrófilos
y monocitos). Los recuentos de células somáticas se llevaron a cabo
en un aparato de recuento Coulter utilizando técnicas estándar, tal
como recomienda el Agriculture and Agri-Food
Canada Pamphlet IDF50B (1985) "Milk and Milk
products-Methods of Sampling". Las muestras
siempre se analizaron dentro de las primeras 48 horas tras su
recogida y fijación, en los días 1 y 7 tras la provocación.
Se determinó el número de células somáticas
presentes en la glándula cada día tras la entrada en contacto con
el microorganismo. En el cuarto no infectado, el recuento se mantuvo
constante durante el estudio mientras que en el día 1, el grupo
tratado con GapC obtuvo unos resultados inferiores que el grupo
inmunizado con placebo (Figura 25). La diferencia entre los grupos
GapC y placebo fue estadísticamente significativa. Los resultados
individuales del día 1 se muestran en la Figura 26; los resultados
de los animales tratados con GapC a lo largo de los siete días
posteriores a la entrada en contacto con el microorganismo se
muestran en la Figura 27. Las muestras de los cuartos de los
animales inmunizados con GapC no podían distinguirse de los cuartos
sin provocación.
Por lo tanto, la inmunización con GapC redujo la
respuesta inflamatoria que sigue a la provocación con S.
dysgalactiae.
Durante los últimos 3 días del ensayo con las
vacunas se recuperó una población mixta bacteriana de las
secreciones de la glándula mamaria. Un análisis posterior con el
ensayo API 20 Strep confirmó la identidad de las cepas presentes en
la mezcla como S. dysgalactiae y S. uberis,
representando el segundo de ellos una infección natural que tuvo
lugar durante el ensayo. El grupo que fue inmunizado con GapC
parecía mostrar una protección cruzada significativa frente a la
colonización por S. uberis (véase la Figura 20), indicando
que GapC quizás sea un antígeno con una amplia capacidad de
protección cruzada frente a la infección por múltiples especies de
estreptococos.
De esta forma, la vacunación con GapC de S.
dysgalactiae es por tanto capaz de proporcionar protección
cruzada frente a la infección por S. uberis.
Así, se describe la clonación, expresión y
caracterización de diversas proteínas GapC de unión a plasmina, así
como métodos de utilización de las mismas.
<110> University of Saskatchewan
\hskip1cm Bolton, Alexandra J.
\hskip1cm Perez-Casal,
Jose
\hskip1cm Fontaine, Michael
\hskip1cm Potter, Andrew A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> INMUNIZACIÓN DE GANADO VACUNO
LECHERO CON PROTEÍNA GapC FRENTE A INFECCIONES POR
Streptococcus
\vskip0.400000\baselineskip
<130> O8-891814WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador gapC1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipggcggcggca tatggtagtt aaagttggta ttaacgg
\hfill37
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador gapC1r
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatcctt atttagcgat tttgcaaag tactc
\hfill35
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1011
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus
dysgalactiae
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1011)
\newpage
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Streptococcus
dysgalactiae
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 1011
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<212> DNA
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<213> Streptococcus agalactiae
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1011)
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 336
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<212> PRT
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<213> Streptococcus agalactiae
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1011
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Streptococcus uberis
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1011)
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Streptococcus uberis
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 1011
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Streptococcus parauberis
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1011)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus parauberis
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1011
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus iniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1011)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 336
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus iniae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
Claims (13)
1. La utilización de una proteína GapC en la
fabricación de la composición de una vacuna de utilidad en el
tratamiento o la prevención de la mastitis en un sujeto mamífero, en
la que la proteína GapC se selecciona del grupo formado por:
(a) una proteína GapC aislada de
Streptococcus dysgalactiae que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC.
núm.: 4) o una secuencia aminoacídica con una identidad de
secuencia de al menos el 80% con la anterior;
(b) una proteína GapC aislada de
Streptococcus agalactiae que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC.
núm.: 6) o una secuencia aminoacídica con una identidad de
secuencia de al menos el 80% con la anterior;
(c) una proteína GapC aislada de
Streptococcus uberis que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC.
núm.: 8) o una secuencia aminoacídica con una identidad de
secuencia de al menos el 80% con la anterior;
(d) una proteína GapC aislada de
Streptococcus parauberis que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC.
núm.: 10) o una secuencia aminoacídica con una identidad de
secuencia de al menos el 80% con la anterior;
(e) una proteína GapC aislada de
Streptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos
mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos
inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.:
12) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de
al menos el 80% con la anterior.
2. La utilización de la reivindicación 1, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
dysgalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada
en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de
las Figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4).
3. La utilización de la reivindicación 1, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
agalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada
en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de
las Figuras 2A-2B (ID. de SEC. núm.: 6).
4. La utilización de la reivindicación 1, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
uberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en
las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las
Figuras 3A-3B (ID. de SEC. núm.: 8).
5. La utilización de la reivindicación 1, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
parauberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada
en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de
las Figuras 4A-4B (ID. de SEC. núm.: 10).
6. La utilización de la reivindicación 1, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
iniae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las
posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las
Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.: 12).
7. La utilización de un polinucleótido formado
por una secuencia codificante de una proteína GapC en la
fabricación de la composición de una vacuna de utilidad en el
tratamiento o la prevención de la mastitis en un sujeto mamífero,
en la que la proteína GapC se selecciona del grupo formado por:
(a) una proteína GapC aislada de
Streptococcus dysgalactiae que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 1A-1B (ID. de SEC.
núm.: 4) o una secuencia aminoacídica con una identidad de
secuencia de al menos el 80% con la anterior;
(b) una proteína GapC aislada de
Streptococcus agalactiae que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 2A-2B (ID. de SEC.
núm.: 6) o una secuencia aminoacídica con una identidad de
secuencia de al menos el 80% con la anterior;
(c) una proteína GapC aislada de
Streptococcus uberis que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 3A-3B (ID. de SEC.
núm.: 8) o una secuencia aminoacídica con una identidad de
secuencia de al menos el 80% con la anterior;
(d) una proteína GapC aislada de
Streptococcus parauberis que consta de la secuencia de
aminoácidos mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336,
ambos inclusive, de las Figuras 4A-4B (ID. de SEC.
núm.: 10) o una secuencia aminoacídica con una identidad de
secuencia de al menos el 80% con la anterior;
\newpage
(e) una proteína GapC aislada de
Streptococcus iniae que consta de la secuencia de aminoácidos
mostrada en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos
inclusive, de las Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.:
12) o una secuencia aminoacídica con una identidad de secuencia de
al menos el 80% con la anterior.
8. La utilización de la reivindicación 7, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
dysgalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada
en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de
las Figuras 1A-1B (ID. de SEC. núm.: 4).
9. La utilización de la reivindicación 7, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
agalactiae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada
en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de
las Figuras 2A-2B (ID. de SEC. núm.: 6).
10. La utilización de la reivindicación 7, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
uberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en
las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las
Figuras 3A-3B (ID. de SEC. núm.: 8).
11. La utilización de la reivindicación 7, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
parauberis que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada
en las posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de
las Figuras 4A-4B (ID. de SEC. núm.: 10).
12. La utilización de la reivindicación 7, en
la que la proteína es una proteína GapC de Streptococcus
iniae que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en las
posiciones de los aminoácidos 1 a 336, ambos inclusive, de las
Figuras 5A-5B (ID. de SEC. núm.: 12).
13. La utilización de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 12, en la que el sujeto mamífero es
un sujeto bovino.
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