ES2228113T3

ES2228113T3 - Polipeptidos basb028 y polinucleotidos que los codifican de moraxella catarrhalis.

Info

Publication number: ES2228113T3
Application number: ES99950354T
Authority: ES
Inventors: Jean-Louis SmithKline Beecham Biologicals RUELLE
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-10
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2019-05-10
Also published as: DE69919693T2; US6706494B1; ATE274582T1; CA2328429A1; EP1078066B1; WO1999058685A2; AU4260299A; DE69919693D1; EP1078066A2; WO1999058685A3

Abstract

La presente invención se refiere a BASB028, en particular polipéptidos BASB028 y polinucleótidos de BASB028, materiales recombinantes y métodos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para usar tales polipéptidos y polinuceótidos, incluida la prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En otro aspecto más, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y dolencias asociadas con tales infecciones, tales como los ensayos para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos de BASBA028. Los expertos en la técnica, a la vista de las descripciones siguientes y la lectura de otras partes de la presente descripción, podrán identificar varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y el ámbito de la invención descrita.

Description

Polipéptidos BASB028 y polinucleótidos que los codifican de Moraxella catarrhalis.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos (denominados aquí "polinucleótido(s) de BASB028"), polipéptidos codificados por ellos (denominados aquí "BASB028" o "polipéptido(s) BASB028"), materiales recombinantes y métodos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluidas vacunas contra infecciones bacterianas. En otro aspecto más, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar infecciones de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

La Moraxella catarrhalis (también denominada Branhamella catarrhalis) es una bacteria gram negativa frecuentemente aislada del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, siendo las más importantes la otitis media en niños y lactantes y las neumonías en personas mayores. Es también responsable de la sinusitis, infecciones nosocomiales y, menos frecuentemente, de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad importante de la niñez tanto por el número de casos como por las potenciales secuelas. En los EE.UU. se registran cada año más de 3,5 millones de casos y se estima que 80% de los niños han tenido al menos un episodio de otitis antes de alcanzar los 3 años de edad (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19:823). Esta enfermedad, si no se trata o se hace crónica, puede conducir a pérdidas de la audición, que pueden ser temporales (en el caso de la acumulación de fluido en el oído medio) o permanentes (si se lesiona el nervio auditivo). En lactantes, tales pérdidas de la audición pueden ser responsables de retrasos en el aprendizaje del habla.

Del oído medio de niños con otitis media se aíslan principalmente tres especies bacterianas: Streptococcus penumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) y M. catarrhalis. Están presentes en el 60 a 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes revela que la S. pneumoniae y la NTHi representan aproximadamente 30% y M. catarrhalis aproximadamente 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996), Microbiol. Rev. 60:167). Del oído medio se pudieron aislar otras bacterias, (H. influenza tipo B, S. pyogenes, etc), pero con una frecuencia mucho más baja (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un requisito absoluto para el desarrollo de una otitis; también se requieren, empero, otras condiciones para que se produzca una enfermedad (Dickinson, DP y otros (1988), J. Inf. Dis., 158:205; Faden HL y otros, (1991), Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612). Éstas son importantes para desencadenar la migración de las bacterias al oído medio a través de las trompas de Eustaquio, a lo que sigue la iniciación de un proceso inflamatorio. Hasta el momento, estos factores son desconocidos. Se ha postulado que una anomalia transitoria del sistema inmune que sigue a una infección vírica, por ejemplo, podría causar una incapacidad para controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, HL y otros (1994), J. Infect. Dis. 169:1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente se hace susceptible de que se desarrolle otitis media a causa de la presencia sostenida de patógenos en el oído medio (Murphy, TF 81996), Microbiol. Rev., 60:267).

La respuesta inmune a M. catarrhalis está mal caracterizada. El análisis de cepas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de criaturas y seguidamente de infantes o niños de 0 a 2 años de edad, indica que reciben y frecuentemente eliminan nuevas cepas. Esto indica que los niños colonizados montan una respuesta inmune eficaz frente a esta bacteria. (Faden, HL y otros, (1994), J. Infec. Dis. 169:1312).

En la mayoría de adultos ensayados, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y otros, (1985), J. Infect. Dis. 151:878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida sérica: por lo general, las aisladas de individuos enfermos son más resistentes que las que están simplemente colonizadas (Hol, C y otros (1993) Lancet 341:1281; Jordan, KI y otros, (1990), Am. J. Med. 88 (supl. 5A): 28S). Por tanto, la resistencia sérica podría considerarse como un factor de virulencia de las bacterias. En suero de niños que se recuperan de una otitis media, se ha observado una actividad opsonificante.

No se ha identificado el antígeno diana de estas respuestas inmunes en personas, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por hierro, y que es reconocida por suero de pacientes con neumonía (Sethi, S y otros (1995), Infect. Immun. 61:1516), y UspA1 y UspA2 (Chen D y otros (1999), Infect. Immnun. 67:1310).

Se han caracterizado algunas otras pocas proteínas presentes en la superficie de M. catarrhalis usando un método bioquímico, o en cuanto su potencial implicación en la inducción de inmunidad protectora (para revisión, véase Murphy, TF (1996), Microbiol. Rev. 60:267). En el modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos producidos frente a algunos de ellos (UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Entre las cepas de M. catarrhalis se conserva altamente otro polipéptido (OMP CD) que presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeroginosa, que ha revelado ser eficaz frente a esta bacteria en modelos de animales.

La frecuencia de las infecciones de Moraxella catarrhalis ha crecido espectacularmente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la emergencia de múltiples cepas resistentes a antibióticos y a una creciente población de personas con sistemas inmunes débiles. No es raro aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad médica y una demanda no satisfechas de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, métodos de exploración de drogas y ensayos diagnósticos para este organismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB028, en particular polipéptidos BASB028 y polinucleótidos de BASB028, materiales recombinantes y métodos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para usar tales polipéptidos y polinuceótidos, incluida la prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En otro aspecto más, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y dolencias asociadas con tales infecciones, tales como los ensayos para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos de BASBA028.

Los expertos en la técnica, a la vista de las descripciones siguientes y la lectura de otras partes de la presente descripción, podrán identificar varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y el ámbito de la invención descrita.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB028 según se describe más detalladamente en lo que sigue. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB028 de Moraxella catarrhalis, que está relacionada por homología de la secuencia de aminoácidos a la proteína de hemaglutinina filamentosa (FHA) de Bordetella pertusis. La invención se refiere especialmente a BASB028 que tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. Se entiende que las secuencias señaladas como "DNA" en el listado de secuencias posterior representan una ejemplificación de una realización de la invención, puesto que los expertos en la técnica apreciarán que tales secuencias se pueden emplear útilmente en polinucleótidos en general, incluidos ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis, que se designan aquí "BASB028" y "polipéptidos BASB028", así como variantes de ellos útiles diagnósticamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención proporciona:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85%, preferiblemente de al menos 90%, más preferiblemente de al menos 95%, muy preferiblemente de al menos 97,99% o una identidad exacta, a la de la SEQ ID NO: 2;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de al menos 85%, preferiblemente de al menos 90%, más preferiblemente de al menos 95%, muy preferiblemente de al menos 97,99% o una identidad exacta, a la de la SEQ ID NO: 1 en la longitud entera de la SEQ ID NO:1, o;

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 85%, preferiblemente de al menos 90%, más preferiblemente de al menos 95%, muy preferiblemente de al menos 97,99% o una identidad exacta, a la de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Los polipéptidos BASB028 proporcionados en la SEQ ID NO: 2 son el polipéptido BASB028 de la cepa MC2931 (ATCC 43617) de Moraxella catarrhalis.

La invención proporciona también un fragmento inmunogénico de polipéptido BASB028, que es una porción contigua de polipéptido BASB028 que tiene la misma, o sustancialmente la misma, actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Esto es, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) es capaz de producir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de BASB028. Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido de BASB028 que carece de una secuencia guía N-terminal, y/o un dominio de transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de BASB028 de acuerdo con la invención comprende sustancialmente la totalidad del dominio extracelular de un polipéptido que tiene una identidad de al menos 85%, preferiblemente de al menos 90%, más preferiblemente de al menos 95%, muy preferiblemente de al menos 97,99% o una identidad exacta, a la de la secuencia SEQ ID NO: 2 en la longitud entera de la SEQ ID NO. 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es enteramente la misma de parte, pero no la totalidad, de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos de BASB028, los fragmentos pueden ser "libres" o pueden estar dentro de un polipéptido mayor del que forman una parte o región, muy preferiblemente como región individual continua en un polipéptido individual mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una variante de ella, tal como una serie continua de restos que incluye una secuencia de aminoácidos amino-terminal y/o carboxilo-terminal. Se prefieren también formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por una célula hospedante o en una célula hospedante. Se prefieren además fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones de hélice alfa y que forman hélice alfa, regiones de forma beta y que forman hoja beta, regiones de giro y que forman giro, regiones de bobina y que forman bobina, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones que forman una superficie, regiones de unión de sustratos y regiones de alto índice antigénico.

Entre otros fragmentos preferidos está incluido u polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 o 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 o 100 aminoácidos truncados o suprimidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención se pueden emplear para producir el polipéptido de longitud entera por síntesis de péptidos; por tanto, estos fragmentos pueden utilizarse como intermedios para producir los polipéptidos de longitud entera de la invención.

En particular son preferidas las variantes en las que están sustituidos, suprimidos o añadidos varios aminoácidos 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 o 1 en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en forma de proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína mayor tal como un precursor o una proteína de condensación. Con frecuencia, es ventajoso incluir una secuencia adicional de aminoácidos que contiene secuencias secretoras o guía, prosecuencias, secuencias que coadyuvan en la purificación tales como restos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de un polipéptido exógeno o una cola lipídica o secuencias de polinucleótidos para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de condensación solubles tratadas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento de él, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina se prefiere la parte constante de la cadena pesada de IgG humano, en particular, IgG1, cuando tiene lugar una condensación en la región de articulación. En una realización particular, la parte de Fc se puede eliminar simplemente por incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor Xa de coagulación de la sangre.

Además, esta invención concierne a procedimientos para la preparación de estas proteínas de condensación por ingeniería genética y a su uso para exploración de drogas, diagnosis y terapia. Otro aspecto más de la invención se refiera también a polinucleótidos que codifican tales proteínas de condensación. Se pueden encontrar ejemplos de la tecnología de proteínas de condensación en las solicitudes de patentes internacionales n^{os}. WO 94/29458 y WO 94/22914.

Las proteínas pueden ser conjugadas químicamente o expresarse como proteínas recombinantes de condensación que permiten que se produzcan unos niveles incrementados en un sistema de expresión en comparación con proteínas no condensadas. El copartícipe de condensación puede coadyuvar proporcionando epitopos T de ayuda (copartícipe inmunológico de condensación), preferiblemente epitopos T de ayuda reconocidos por el hombre, o ayudando a que la proteína se exprese (potenciador de la expresión) a rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente, el copartícipe de condensación será un copartícipe inmunológico de condensación y un copartícipe potenciador de la expresión.

Entre los copartícipes de condensación están incluidas la proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural de influenza virus, NSI (hemaglutinina). Otra proteína de condensación es la conocida como LytA. Preferiblemente se usa la porción C-terminal de la molécula. LytA deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alaninaamidasa LytA (codificada por el gen de lytA {Gene, 43 (1986) págs. 265-272] una autolisina que degrada específicamente ciertas uniones en la cadena principal de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de la colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para desarrollar plásmidos que expresan C-LytA de E. coli, útiles para expresión de proteínas de condensación. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su términal amino (Biotechnology: 10 (1992), págs. 795-798). Es posible usar la porción repetida de la molécula de LytA encontrada en el extremo C-terminal que se inicia en el resto 178, por ejemplo, restos 188-305.

El presente estudio incluye también variantes de los polipéptidos antes mencionados, esto es, polipéptidos que varían de los de referencia por sustituciones conservadoras de aminoácidos en las que un resto es sustituido por otro con características similares. Son típicas de tales sustituciones las que se efectúan entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos Asp y Glu; y entre los restos básicos Lys y Arg; o restos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos naturales aislados, polipéptidos producidos recombinantemente, polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos producidos por combinación de estos métodos. Los medios para preparar tales polipéptidos son bien conocidos en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención derive de Moraxella catarrhalis, aunque puede obtenerse, preferiblemente, de otros organismos del mismo género taxonómico. Se puede obtener también un polipéptido de la invención de, por ejemplo, organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Es un objetivo de la invención proporcionar polinucleótidos que codifican polipéptidos de BASB028, en particular, polinucleótidos que codifican el polipéptido designado aquí BASB028.

En una realización particularmente preferida de la invención, el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB028, que comprende una secuencia puesta de manifiesto en la SEQ ID NO:1 que incluye un gen de longitud entera, o una variante de él.

El polinucleótido de BASB028 proporcionado en la secuencia SEQ ID NO: 1 es el polinucleótido de BASB028 de la cepa MC2931 de Moraxella catarrhalis (ATCC 43617).

Como otro aspecto de la invención se proporcionan moléculas aisladas de ácidos nucleico que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos de BASB028, en particular polipéptidos y polinucleótidos de BASB028 de Moraxella catarrhalis, incluidos, por ejemplo, RNAs no procesados, RNAs de ribozomas, mRNAs, cDNAs, DNAs genómicos, B-DNAs y Z-DNAs. Otras realizaciones de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos útiles biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente, y variantes de ellos, así como composiciones que los comprenden.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluido al menos un gen de longitud entera, que codifica un polipéptido de BASB028 que tiene una secuencia deducida de aminoácidos de SEQ ID NO:2 y polinucleótidos íntimamente relacionados con él, y variantes de ellos.

En otra realización particularmente preferida de la invención, hay un polipéptido de BASB028 de Moraxella catarrhalis que comprende, o que consta de, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o una variante de ella.

Usando la información proporcionada aquí, tal como una secuencia de polinucleótidos puesta de manifiesto en la SEQ ID NO:1, se puede obtener un polinucleótido de la invención que codifica polipéptido de BASB028 usando métodos estándar de clonación y exploración, tales como los métodos para clonar y secuenciar fragmentos cromosómicos de DNA de bacteria usando células Catlin de Moxella catarrhalis como material de partida, a lo que sigue la obtención de un clon de longitud total. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, tal como la secuencia de polinucleótidos dada en la SEQ ID NO:1, típicamente se ensaya como sonda una biblioteca de clones de DNA cromosómico de Moraxella catarrhalis en E. coli u otro huésped adecuado con un oligonucleótido marcado radiactivamente, preferiblemente de 17 mer o más largo, derivado de una secuencia parcial. Los clones que presentan un DNA idéntico al de la sonda se pueden distinguir usando condiciones estrictas de hibridación. Secuenciando los clones individuales identificados así por hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir del polipéptido original o la secuencia del polinucleótido, es posible extender luego la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia de gen de longitud entera. Convenientemente, tal secuenciación se realiza, por ejemplo, usando DNA de doble cadena desnaturalizado, preparado a partir de un clon de plásmido. Maniatis, T:, Fritsch, E.F. y Sambrook y otros, en MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yor (1989) describen técnicas adecuadas (véase en particular Screening By Hybridization 1.90 y Sequencing Denatured Dobule-Stranded DNA Templates 13.70). También se puede realizar la secuenciación directa de DNA genómico para obtener una secuencia de gen de longitud entera. Ilustrativo de la invención, el polinucleótido señalado en la SEQ ID NO:1 se descubrió en una biblioteca de DNA derivada de Moraxella catarrhalis.

Además, la secuencia de DNA señalada en SEQ ID NO:1 contiene un marco de lectura abierta que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de restos de aminoácidos señalado en la SEQ ID NO:2 con un peso molecular deducido que se puede calcular usando los valores del peso molecular de los restos, bien conocidos por los expertos en la técnica.

El polinucleótido de la SEQ ID NO:1, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 5179 de la SEQ ID NO:1, codifica el polipéptido de la secuencia SEQ ID NO:2.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, o consta de:

(a) una secuencia de polinucleótido que tiene una identidad de al menos 85%, preferiblemente una identidad de al menos 90%, más preferiblemente una identidad de al menos 95%, aún más preferiblemente una identidad de al menos 97,99% o una identidad exacta a la de la SEQ ID NO:1, sobre la longitud entera de SEQ ID NO:1; o

(b) una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 85%, preferiblemente una identidad de al menos 90%, más preferiblemente una identidad de al menos 95%, aún más preferiblemente una identidad de al menos 97,99% o una identidad 100% exacta a la de la SEQ ID NO:2, sobre la longitud entera de SEQ ID NO:2.

Se puede obtener un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluidos homólogos y heterólogos de especies diferentes de Moraxella catarrhalis, por un procedimiento que comprende las etapas de explorar una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estricta (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y una concentración de SDS de 0,1-1%) con una sonda marcada o detectable que consiste en la secuencia de SEQ ID NO:1 o la comprende, o un fragmento de ella; y aislar un gen de longitud entera y/o clones genómicos que contienen la secuencia del mencionado polinucleótido.

La invención proporciona una secuencia de polinucleótido idéntica en toda la longitud a una secuencia de codificación (marco de lectura abierta) en la SEQ ID NO:1. La invención proporciona también una secuencia de codificación para un polipéptido maduro o un fragmento de él por sí, así como una secuencia de codificación para un polipéptido maduro o un fragmento en marco de lectura con otra secuencia de codificación, tal como una secuencia que codifica una secuencia guía o secretora, una secuencia preproteínica, o proproteínica o preproproteínica. El polinucleótido de la invención también puede contener al menos una secuencia no codificadora, incluida, por ejemplo, pero no limitativamente, al menos una secuencia 5' y 3' no codificadora, tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como las señales de terminación \rho-dependientes y \rho-independientes), sitios de unión de ribosomas, secuencias de Kozak, secuencias que estabilizan mRNA, intrones y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótido también puede comprender una secuencia adicional de codificación que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido condensado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia de marcador es un péptido hexahistadínico, como el del vector pQE (Qiagen, Inc.) y descrito por Gentz y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), o un identificador de péptido (Wilson y otros, Cell 37: 767 (1084)), pudiendo ser ambos útiles para purificar secuencias de poliéptidos condensadas a ellos. Los polinucleótidos de la invención incluyen también, pero no únicamente, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión de
genes.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipétido de BASB028 de la SEQ ID NO:2 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polipéptido contenido en los nucleótidos 1 a 5178 de la SEQ ID NO:1. Alternativamente, puede ser una secuencia que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, codifica también el polipéptido de la secuencia SEQ ID NO:2.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido", tal como se usa aquí, abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, en particular un polipéptido bacteriano y, más en particular, un polipéptido de la BASB028 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO.2. El término abarca también polinucleótidos que incluyen una región individual continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por fagos integrados, una secuencia integrada de inserción, una secuencia de vector integrada, una secuencia integrada de transposón, o debidos a la edición de RNA o reorganización de DNA genómico) junto con regiones adicionales, que también contienen secuencias codificadoras y no codificadoras.

La invención concierne, además, a variantes de los polinucleótidos descritos aquí que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID NO:2. Se pueden usar fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud entera de la invención.

Otras realizaciones particularmente preferidas de la invención son polinucleótidos que codifican variantes de BASB028, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido de BASB028 de la SEQ ID NO:2 en la que varios restos, unos pocos, de aminoácidos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ninguno, están sustituidos, modificados, suprimidos y/o añadidos, en cualquier combinación. Son especialmente preferidos entre éstas, sustituciones, adiciones o supresiones silenciosas que no alteran propiedades y actividades del polipéptido de BASB028.

Otras realizaciones preferidas de la invención son los polinucleótidos que son como mínimo idénticas en 85% en su longitud entera a un polinucleótido que codifica un polipéptido de BASB028 que tiene una secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:2, y polinucleótidos que son complementarios a tales polinucleótidos. Alternativamente, son muy preferidos polinucleótidos que comprenden una región que es al menos idéntica en 90% de su longitud entera a un polinucleótido que codifica polipéptido de BASB028 y polinucleótidos complementarios a ellos. A este respecto, son particularmente preferidos polinucleótidos que son idénticos a los mismos al menos en 95% sobre la longitud entera. Además, entre los que son idénticos en al menos 95%, son muy preferidos los que son 97% idénticos y, entre éstos, los que son al menos 98% idénticos y, muy particularmente preferidos, los que son al menos 99% idénticos, siendo los más preferidos los que son al menos 99% idénticos.

Son realizaciones preferidas los polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un DNA de la SEQ ID NO:1.

De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas de esta invención, se han proporcionado polinucleótidos que hibridizan, en particular en condiciones restrictivas, a secuencias de polinucleótidos de BASB028, tales como los polinucleótidos de la SEQ ID NO:1.

La invención se refiere además a polinucleótidos que se hibridizan a las secuencias de polinucleótidos proporcionados aquí. A este respecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que se hibridizan en condiciones restrictivas a los polinuceótidos descritos aquí. Tal como se usa aquí, los términos "condiciones restrictivas" y "condiciones restrictivas de hibridación" significan que la hibridación sólo se produce si hay al menos una identidad de 95% y, preferiblemente, de al menos 97% entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones restrictivas de hibridación es la incubación durante la noche a 42ºC en una solución que comprende: 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 micrograms/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado, seguida de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSS a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se dan ejemplos por Sambrook y otros, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, N.Y (1989), en particular el capítulo 11. Con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención se puede usar también la hibridación en solución.

La invención proporciona también un polinucleótido que consta de, o que comprende, una secuencia de polinucleótido obtenida por exploración de una biblioteca apropiada que contiene el gen completo de una secuencia de polinucleótido señalada en la SEQ ID NO:1 en condiciones restrictivas de hibridación con una sonda que tiene la secuencia de la mencionada secuencia de polinucleótido señalada en la SEQ ID NO:1 o un fragmento de ella; y aislando la mencionada secuencia de polinucleótido.

Los fragmentos útiles para obtener un polinucleótido así incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores que se han descrito en otro lugar de esta memoria.

Como se ha discutido en otro lugar de esta memoria en cuanto a los ensayos de polinucleótidos de la invención, los polinucleótidos de la invención se pueden usar, por ejemplo, como sonda de hibridación de RNA, cDNA y DNA genómico para aislar cDNAs de longitud entera y clones genómicos que codifican BASB028 y para aislar cDNA y clones genómicos u otros genes que tienen una alta identidad, en particular una alta identidad de secuencia, con el gen de BASB028. Por lo general, tales sondas comprenderán al menos 15 restos de nucleótido o pares de base. Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 restos de nucleótido o pares de base y pueden tener como mínimo 50 restos de nucleótido o pares de base. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 restos de nucleótido o pares de base y tendrán menos de 30 restos de nucleótido o pares de base.

Una región codificadora de un gen de BASB028 se puede aislar por exploración usando una secuencia de DNA proporcionada en SEQ ID NO:1 para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Luego se usa un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la del gen de la invención para explorar una biblioteca de cDNA, DNA genómico o mRNA para determinar qué miembros de la biblioteca se hibridizan a la sonda.

Hay disponibles varios métodos, bien conocidos por los expertos en la técnica, para obtener DNAs de longitud entera, o DNAs cortos extendidos, por ejemplo, los basados en el método de Amplificación Rápida de Extremos de cDNA (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman y otros, PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, por ejemplo la tecnología Marathon^{MC} (Clontech Laboratories Inc.), han simplificado significativamente la búsqueda de cDNAs más largos. Con la tecnología Marathon^{MC}, se han preparado cDNAs a partir de mRNA extraído de un tejido seleccionado y una secuencia "adaptadora" ligada a cada terminal. Luego se realiza la amplificación de ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "perdido" del DNA usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específica para el gen y específica para el adaptador. La reacción de PCR se repite luego usando cebadores "nido", esto es, cebadores diseñados para anilamiento dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico para el adaptador que anilla más 3' en la secuencia del adaptador y un cebador específico para el gen que anilla más 5' en la secuencia de gen seleccionada). Los productos de esta reacción se pueden analizar luego por secuenciación de DNA y un DNA de longitud completa construido uniendo directamente el producto a DNA existente para que resulte una secuencia completa, o efectuando una PCR separada de longitud entera usando la información de la nueva secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden emplear, por ejemplo, como reactivos de investigación y materiales para descubrir tratamientos y enfermedades y diagnosticarlas, en particular enfermedades humanas, como se describe más adelante en relación a ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de SEQ ID NO:1 se pueden usar en los procedimientos descritos aquí pero, preferiblemente para PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados aquí se transcriben o no se transcriben, total o parcialmente, en bacterias en tejidos infectados. Se conoce que tales secuencias también serán útiles en la diagnosis de la etapa de infección y el tipo de infección que ha alcanzado el patógeno.

La invención proporciona también polinucleótidos que codifican un polipéptido que es una proteína madura más aminoácidos adicionales aminoterminales o carboxilo-terminales, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena de polipéptido, por ejemplo). Tales secuencias pueden desempañar un papel en el procesamiento de una proteína del precursor a una forma madura, pueden permitir el transporte de proteínas, pueden alargar o acortar la semivida de proteínas o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como generalmente es el caso in vivo, los aminoácidos adicionales pueden separarse de la proteína madura por enzimas celulares.

Para cada polinucleótido de la invención, se ha proporcionado un polinucleótido complementario de él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean completamente complementarios de cada polinucleótido del que son complementarios.

Una proteína precursora que tiene una forma madura del polipéptido condensado a una o más presecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las prosecuencias, por lo general se activan tales precursores inactivos. Algunas o todas las prosecuencias se pueden eliminar antes de la activación. Por lo general, tales precursores se denominan proproteínas.

Además de las representaciones estándar A, G, C, T/U de los nucleótidos, se puede usar también el término "N" para describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los 4 nucleótidos de DNA o RNA puede aparecer en una posición así designada en la secuencia de DNA o RNA, excepto que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que, cuando está en combinación con posiciones adyacentes de un nucleótido, cuando se lee en el marco de lectura adecuado, no tenga el efecto de generar un codón de terminación prematura en tal marco de lectura.

En suma, un nucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia guía (que se puede denominar preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son secuencias guía de una preproteína, o una preproteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia guía y una o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención a fines terapéuticos o profilácticos, en particular, para inmunización genética.

Preferiblemente, un polinucleótido de la invención se usará para inmunización genética empleando un método de administración adecuado, tal como inyección directa del DNA de plásmido en músculos (Wolff y otros, Hum. Mol. Genet (1992) 1:363; Manthorpe y otros, Hum. Gene Ther. (1983) 4:419), administración de DNA complejado con vehículos específicos para proteínas (Wu y otros, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985), coprecipitación de DNA con fosfato cálcico (Benvenistry y Resh, PNAS USA, (1986) 83:9551), encapsulación de DNA en varias formas de liposomas (Kaneda y otros, Science (1989) 243:375), bombardeo de partículas (Tang y otros, Nature (1992) 356:152; Eisenbraun y otros, DNA Cell Biol. (1993) 12:791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y otros, PNAS USA (1984) 81:5489).

Vectores, células hospedantes, sistemas de expresión

La invención se refiere también a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células hospedantes que se tratan genéticamente con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. También se pueden emplear sistemas de traducción exentos de células para producir tales proteínas usando RNAs derivadas de las construcciones de DNA de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención se pueden preparar por procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de células hospedantes tratadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. Consecuentemente, en otro aspecto, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células hospedantes que se han tratado por ingeniería genética con tales sistemas de expresión y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, se pueden tratar por ingeniería genética células hospedantes para incorporar sistemas de expresión, o partes de ellos, o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en las células hospedantes se puede efectuar por métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, de Davis y otros, (1986); MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, de Sambrook y otros, 2ª edic., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), métodos tales como transfección de fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección catiónica mediada por lípidos, electroporación, transducción, carga de fragmentos, introducción balística e infección.

Entre los ejemplos representativos de hospedantes adecuados están incluidas células bacterianas tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moroxella catarrhalis; células de hongos, tales como células de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insectos tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; cálulas de animales tales como CHO, COS, HeLa, C127.3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células de plantas tales como células de una gimnosperma o angioesperma.

Se pueden usar una amplia variedad de sistemas de expresión para producir los polipétidos de la invención. Entre tales vectores figuran, entre otros, vectores cromosómicos, episomales y vectores derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteríófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de lavaduras, de virus tales como baculovirus, virus de papova tales como SV40, virus de vacunas, adenovirus, virus de viruela loca, virus de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus y virus alfa, y vectores derivados de combinaciones de ellos, tales como los derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Las construcciones de sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan y engendran la expresión. Por lo general, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o de expresar un polipéptido en un hospedante se puede usar para expresión a este respecto. La secuencia de DNA apropiada puede insertarse en el sistema de expresión por cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, tales como, por ejemplo, las presentadas por Sambrook y otros en MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (citado antes).

En sistemas recombinantes de expresión de eucariotes, para la secreción de una proteína traducida en el lúmen del retículo endoplasmático, en el espacio periplásmico o en medios extracelulares, se pueden incorporar al pelipéptido expresado señales de secreción apropiadas. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden se señales heterólogas.

Los polipétidos de la presente invención se pueden recuperar y purificar de cultivos celulares recombinantes por métodos bien conocidos, incluidos los de precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatito y cromatografía con lecitina. Muy preferiblemente, para purificación se utiliza la cromatografía de iones metálicos, (IMAC). Para regenerar la conformación activa cuando el pelipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, el aislamiento o la purificación, se pueden emplear técnicas bien conocidas para reajustar proteínas.

El sistema de expresión también puede ser un microcorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria viva. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo conducirá a una expresión in vivo del antígeno y la inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usadas para esta finalidad son, por ejemplo: virus de viruela (por ejemplo, vacuna, viruela aviar), virus alfa (virus Sindbis, virus forestal Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), virus del herpes (varicella zoster virus, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos o se pueden atenuar de varias maneras para obtener vacunas. Tales vacunas vivas forman parte, también, de la invención.

Ensayos diagnósticos, prognósticos de serotipificación y mutación

La invención también se refiere al uso de polinucleótidos y polipéptido de BASB028 de la invención como reactivos diagnósticos. La detección de polinucleótidos de BASB028 y/o polipéptidos en un eucariote, en particular un mamífero y, especialmente, un ser humano, proporcionará un método diagnóstico para la diagnosis de enfermedades, el estado de una enfermedad o la respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Los eucariotes, en particular mamíferos y, especialmente, las personas, en particular las infectadas o las que se sospecha que están infectadas con un organismo que comprende gen o proteína de BASB028, se pueden detectar al nivel de ácido nucleico o aminoácido por varias técnicas bien conocidas así como por métodos que se proporcionan aquí.

Los polipéptidos y polinucleótidos para prognosis, diagnosis u otros análisis se pueden obtener de materiales de un individuo putativamente infectado y/o corporalmente infectado. Se pueden usar polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, en particular DNA o RNA, directamente para la detección, o se pueden amplificar enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. De la misma manera se puede usar RNA, en particular mRNA, cDNA y DNA genómico. Usando la amplificación, la caracterización de la especie y la cepa del organismo infeccioso o residente presente en un individuo se puede hacer por análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las supresiones e inserciones se pueden detectar por un cambio del tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada de un organismo afín, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales se pueden identificar por hibridación de DNA amplificado a secuencias de polinucleótidos de BASB028 marcados. Las secuencias que casan perfecta o significativamente se pueden distinguir de parejas que casan imperfectamente, o que significativamente no casan, por digestión con DNasa o Rnasa para DNA o RNA, respectivamente, o detectando diferencias de las temperaturas de fusión o la cinética de renaturalización. Las diferencias de las secuencias de polinucleótidos también se pueden detectar por alteraciones de la movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótidos en geles en comparación con una secuencia de referencia. Esto puede efectuarse con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias de polinucleótidos se pueden detectar también por secuenciación directa de DNA o RNA. Véase, por ejemplo, Myers y otros, Science, 230: 1242 (1985). Los cambios de secuencia en sitios específicos también se pueden revelar por ensayos de protección de nucleasas, tales como RNasa, ensayo de protección de V1 y S1 o el método de escisión química. Véase, por ejemplo, Cotton y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985).

En otra realización, se puede construir una fila de sondas de oligonucleótidos que comprende una secuencia de nucleótido de BASB028, o fragmentos de ella, para realizar una exploración selectiva de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación o identificación taxonómica. Los métodos de la tecnología de filas son bien conocidos y tienen una aplicabilidad general, pudiendo usarse para dirigir una variedad de cuestiones en genética molecular, incluidas expresión de genes, unión genética y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y otros, Science, 274: 610 (1996).

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO:1, o un fragmento de ella;

(b) una secuencia de nucleótido complementaria de la de (a);

(c) un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de él, o

(d) un anticuerpo de un polipéptido de la presente invención, preferiblemente del polipéptido de la SEQ ID NO:2.

Se apreciará que en cualquier kit así, (a), (b), (c) o (d) pueden comprender un componente sustancial. Un kit de este tipo se podrá usar para diagnosticar una enfermedad o la susceptibilidad a una enfermedad, entre otros posibles usos.

La invención se refiere también al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos diagnósticos. La detección de una forma mutada de un nucleótido de la presente invención, preferiblemente SEQ ID NO:1, que está asociado con una enfermedad o patogenia, puede ser una herramienta diagnóstica a añadir a la diagnosis, o que puede definir ésta, de una enfermedad, a la prognosis del transcurso de una enfermedad, la determinación de una etapa de la enfermedad o la susceptibilidad a una enfermedad, que es resultado de una subexpresión, una superexpresión o una expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, en particular los organismos infecciosos, que presentan mutaciones en tales polinucleótidos pueden detectarse a nivel del polinucleótido por varias técnicas, tales como las que se describen aquí en otro lugar.

Las células de un organismo que presenta mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención se pueden detectar también al nivel del polinucleótido o polipéptido por una variedad de técnicas para poder serotipificar, por ejemplo. Por ejemplo, se puede usar RT-PCR para detectar mutaciones en el RNA. Se prefiere particularmente usar RT-PCR junto con sistemas de detección automatizados tales como, por ejemplo, GeneScan. También pueden usarse para lo mismo RNA, cDNA o DNA genómico. Por ejemplo, se pueden usar cebadores dePCR complementarios de un polinucleótido que codifica polipéptido de BASB028 para identificar y analizar mutaciones.

La invención proporciona, además, cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del terminal 5' y/o 3'. Estos cebadores se pueden usar para, entre otras cosas, amplificar DNA de BASB028 y/o RNA aislado de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corpóreo. Los cebadores se pueden usar para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, de manera que el polinucleótido pueda someterse luego a varias técnicas de elucidación de la secuencia de polinucleótido. De esta manera se pueden detectar mutaciones en la secuencia del polinucleótido y usarlas para diagnosticar y pronosticar la infección o su estado o evolución, o para serotipificar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención proporciona, además, un procedimiento para diagnosticar enfermedades, preferiblemente enfermedades infecciosas, más preferiblemente infecciones causadas por Moraxella catarrhalis, que comprende determinar, en una muestra procedente de un individuo, tal como un material corpóreo, un nivel incrementado de expresión de un polinucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:1. La expresión incrementada o disminuida de un polinucleótido de BASB028 se puede medir usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tal como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de RNasa, transferencia Northern, espectrometría y otros métodos de hibridación.

Además, se puede usar un ensayo diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar superexpresión de un polipéptido de BASB028 en comparación con muestras de tejidos normales de control con el fin de detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar niveles de polipéptido de BASB028 en una muestra procedente de un agente hospedante, tal como un material corpóreo. Entre tales métodos de ensayo están incluidos ensayos radioinmunológicos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western, ensayos sandwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como componentes de filas de polinucleótidos, preferiblemente filas o rejillas de alta densidad. Estas filas de alta densidad son particularmente útiles para diagnosticar y pronosticar. Por ejemplo, se puede usar un conjunto de manchas, cada una de las cuales comprende un gen diferente, y que además comprende un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, para sondar empleando, por ejemplo, hibridación o amplificación de ácidos nucleicos, usando una sonda obtenida o derivada de una muestra corpórea, con el fin de determinar la presencia de una secuencia particular de un polinucleótido o una secuencia afín en un individuo. Tal presencia puede indicar la presencia de un patógeno, en particular Moraxella catarrhalis, y puede ser útil para diagnosticar y/o pronosticar una enfermedad o el transcurso de una enfermedad. Se prefiere una rejilla que comprende un número de variantes de la secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO:1. También es preferida una rejilla que comprende un número de variantes de una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia de polipéptido de SEQ ID
NO:2.

Anticuerpos

Se pueden usar como inmunógenos los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o sus variantes, o células que los expresan, para producir anticuerpos inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente.

En ciertas realizaciones preferentes de la invención, se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos de BASB028.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención se pueden obtener administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que presentan un epitopo de cualquiera de ellos o de ambos, análogos de cualquiera de ellos o de ambos, o células que expresan cualquiera de ellos o de ambos, a un animal, preferiblemente no humano, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier método conocido en la técnica que proporciona anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen varias técnicas, tales como las consideradas por Kohler, G. y Milstein, C., en Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor y otros, Immunology Today, 4:72 (1983); Cole y otros, págs. 77-96, en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple (patente U.S. nº. 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena simple a polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. Para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos a los polipéptidos o polinucleótidos de la invención, también se pueden usar ratones transgénicos u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos.

Alternativamente, se puede utilizar tecnología de exposición de fagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión a favor de un polipéptido de la invención, bien de repertorios de v-genes de linfocitos amplificados por PCR de seres humanos explorados en cuanto a la posesión de anti-BASB028, o bien de bibliotecas simples (McCafferty y otros (1990), Nature 348, 552-554; Marks y otros (1992), Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos se puede mejorar mediante, por ejemplo, arrastre de cadena. (Clackson y otros, (1991) Nature 352:628).

Los anticuerpos descritos se pueden emplear para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos, por ejemplo, por cromatografía de afinidad.

Así, entre otras aplicaciones, los anticuerpos frente a polipétidos de BASB028 o polinucleótidos de BASB028 tienen la de su empleo para tratar infecciones, en particular, infecciones bacterianas.

El conjunto de variantes de polipéptidos incluye variantes epitópicamente o inmunológicamente equivalentes, que forman un aspecto particular de la invención.

Preferiblemente, el anticuerpo o su variante se modifica para hacerlo menos inmunógeno en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es una persona, muy preferiblemente, el anticuerpo debe ser "humanizado", habiendo sido transplantadas la región o las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma a un anticuerpo humano monoclonal, por ejemplo, como se describe por Jones y otros (1986) en Nature 321: 522-525, o por Tempest y otros (1991), Biotechnology, 9, 266-273.

Antagonistas y agonistas. Ensayos y moléculas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden usar también para estimar la unión de sustratos y ligandos de moléculas pequeñas, por ejemplo, células, preparaciones exentas de cálulas, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser imitaciones estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y otros, Current Protocols in Immunology 1(2): capítulo 5 (1991).

Los métodos de exploración pueden ser simplemente la medida de la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que presentan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de condensación del polipéptido mediante una marca asociada directa o indirectamente con el compuesto candidato. Alternativamente, el método de exploración puede implicar competición con un competidor marcado. Además, estos métodos de exploración pueden probar si el compuesto candidato da por resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para células que comprenden el polipéptido o nucleótido. Por lo general, los inhibidores de activación se ensayan en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación por el agonista en presencia del compuesto candidato. En los métodos de exploración para agonistas o inhibidores inversos, se pueden emplear polipéptidos constitutivamente activos y/o polipéptidos y polinucleótidos constitutivamente expresados, en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto candidato da por resultado la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, según sea el caso. Además, los métodos de exploración pueden comprender, simplemente, las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención para formar una mezcla, medir la actividad del polipéptido y/o polinucleótido de BASB028 en la mezcla, y comparar con un patrón la actividad del polipéptido y/o polinucleótido de BASB028 en la mezcla. También se pueden usar en ensayos de alta producción, proteínas de condensación tales como las obtenidas a partir de una porción Fc y polipéptido de BASB028, como se ha descrito antes, para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como polipéptidos afines filogenética y/o funcionalmente (véase D. Bennett y otros, J. Mol. Recognition, 8:52-58 (1985); y K. Johanson y otros, J.Biol. Chem., 270 (16): 9459-9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polipéptido de la invención y/o que interaccionan con él también se pueden usar para configurar métodos de exploración para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de mRNA y/o polipéptidos en células. Por ejemplo, se puede construir un ensayo ELISA para medir niveles secretados o asociados a células de polipéptidos usando anticuerpos monoclonales y policlonales por métodos estándar conocidos en la técnica. Esto se puede usar para descubrir agentes que pueden inhibir o intensificar la producción de polipéptidos (también denominados, respectivamente, antagonista y agonista) a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente.

La invención proporciona también un método para explorar compuestos con el fin de identificar los que intensifican (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de polipéptidos o polinucleótidos de BASB028, en particular, aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El método de exploración puede implicar técnicas de alta producción. Por ejemplo, para explorar agonistas o antagonistas, se incuba en ausencia o presencia de una molécula candidato que puede ser un agonista o antagonista de BASB028, una mezcla sintética de reacción, un compartimiento celular tal como una membrana, una envoltura de célula o una pared de célula, o una preparación de cualquiera de ellas, que comprende polipéptido de BASB028 o un sustrato marcado o ligando de tal polipéptido. La capacidad de la molécula candidato para agonizar o antagonizar el polipéptido de BASB028 se refleja en una unión disminuida del ligando marcado o la producción aminorada de producto de tal sustrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, esto es, sin inducir los efectos del polipéptido de BASB028, muy probablemente son buenos antagonistas. Los moléculas que se unen bien y, como puede ser el caso, aumentan la velocidad de producción de producto del sustrato, aumentan la transducción de señal o aumentan la actividad química del canal, son agonistas. La detección de la velocidad o el nivel de producción, según sea el caso, del producto del sustrato, la transducción de señal o la actividad química del canal, puede intensificarse usando un sistema informador. Entre los sistemas informadores que pueden ser útiles a este respecto están incluidos, pero no limitativamente, sustratos colorimétricos marcados convertidos en producto, un gen informador que responde a cambios en la actividad del plinucleótido o polipéptido de BASB028 y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de ensayos de agonistas de BASB028 es un ensayo competitivo que combina BASB028 y un agonista potencial con moléculas que unen BASB028, moléculas de unión de BASB028 recombinantes, sustratos o ligandos naturales, o imitaciones de sustratos o ligandos, en condiciones apropiadas para un ensayo competitivo de inhibición. Los BASB028 se pueden marcar, por ejemplo radiactivamente o con un compuesto colorimétrico, de manera que el número de moléculas de BASB028 unidas a una molécula de unión o convertidas en producto se puede determinar con precisión para estimar la eficacia del potencial antagonista.

Entre los potenciales antagonistas están incluidos, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención e inhiben o extinguen así su actividad o expresión. También pueden ser antagonistas potenciales, moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo íntimamente relacionado que se fija en los mismos sitios de una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB028, impidiendo así la acción o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos de BASB028 por excluir que se unan polipéptidos y/o polinucleótidos de BASB028.

Entre los potenciales antagonistas están incluidas moléculas pequeñas que se unen al sitio de unión del polipéptido y lo ocupan, impidiendo así la unión a moléculas de unión celulares, con lo que se impide la actividad biológica. Entre los ejemplos de moléculas pequeñas están incluidas, entre otras, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas similares a péptidos. Entre otros antagonistas potenciales están moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXINUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) para una descripción de estas moléculas). Entre los antagonistas potenciales preferidos están incluidos compuestos relacionados con BASB028 y variantes.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a proteínas de condensación solubles, de ingeniería genética, que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento de él, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inminoglobulina es preferida la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, en particular IgG1, en la que la condensaciónn tiene lugar en la región de la articulación. En una realización particular, la parte de Fc se puede eliminar simplemente incorporando una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor Xa de coagulación de la sangre. Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de condensación por ingeniería genética y a su uso para exploración de fármacos, diagnosis y terapia. Otro aspecto más de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican tales proteínas de condensación. Se pueden encontrar ejemplos de la tecnología de proteínas de condensación en las solicitudes de patentes internacionales n^{os}. WO 94/29458 y WO 94/22914.

Cada una de las secuencias de polipéptidos proporcionada aquí puede usarse en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, después de expresión, puede usarse como diana para la exploración de fármacos antibacterianos. Además, las secuencias de polinucleótidos que codifican regiones aminoterminales del rMNA respectivo se pueden usar para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificadora de interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, agonista o antagonista de la invención para interferir la interacción inicial física entre el patógeno o los patógenos y un huésped eucariótico, preferiblemente un mamífero, responsable de la infección. En particular, se pueden usar las moléculas de la invención: en la prevención de adherencia de bacterias, en particular gram positivas y/o gram negativas, a proteínas de matriz extracelular eucarióticas, preferiblemente de mamífero, en dispositivos en permanencia o a proteínas de matriz extracelulares en heridas; para bloquear la adherencia bacteriana entre proteínas de matriz extracelulares eucarióticas, preferiblemente de mamífero, y proteínas bacterianas de BASB028 que median la lesión de tejido, y/o para bloquear la progresión normal de la patogénesis en infecciones iniciadas de una manera que no sea la implantación de dispositivos en permanencia o por otras técnicas quirúrgicas.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporcionan agonistas y antagonistas de BASB028, preferiblemente agonistas bacteriostáticos y bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención se pueden emplear, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es una secuencia de péptido, suficientemente similar a la del péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que es capaz de ser reconocida por anticuerpos que reconocen el péptido nativo, o que es capaz de dar origen a anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se acoplan a un vehículo adecuado.

Los minotopos de péptidos se pueden diseñar para una finalidad particular añadiendo, suprimiendo o sustituyendo los aminoácidos elegidos. Los péptidos se pueden modificar con el fin de facilitar la conjugación a un vehículo de proteína. Por ejemplo, para algunos métodos químicos de conjugación puede ser deseable incluir una cisteína terminal. Además, para péptidos conjugados en un vehículo de proteína, puede ser deseable incluir un terminal hidrófobo distal del terminal conjugado del hidroxilo, de manera que el extremo no conjugado libre del péptido permanezca asociado con la superficie de la proteína vehículo. Así, el péptido tiene una conformación que se asemeja muy próximamente a la del péptido como se encuentra en el contexto de la molécula nativa íntegra. Por ejemplo, los péptidos se pueden alterar para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada C-terminal hidrófoba. Alternativamente, se puede efectuar la adición o sustitución de una forma D-estereoisómera de uno o más de los aminoácidos para crear un derivado beneficioso, por ejemplo, para aumentar la estabilidad del péptido.

Alternativamente, los mimotopos de péptidos se pueden identificar usando anticuerpos que son capaces en sí de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como la tecnología de exposición de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias de péptidos que mimetizan la estructura de péptidos nativos y, por tanto, son capaces de unirse a anticuerpos de péptidos no nativos, pero pueden no compartir necesariamente en sí una homología de secuencia significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención concierne a un método para inducir una respuesta imnunológica en un individuo, en particular un mamífero, preferiblemente una persona, que comprende inocular al individuo un polinucleótido o polipéptido de BASB028, o un fragmento o variante de él adecuado para producir un anticuerpo y/o una respuesta inmune a células T para proteger el mencionado individuo de la infección, en particular una infección bacteriana y, muy en particular, una infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan métodos por los que tal respuesta inmunológica ralentiza la respuesta bacteriana. Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, que comprende suministrar a tal individuo un vector, una secuencia o un ribozoma de ácido nucleico para dirigir la expresión del polinucleótido o polipéptido de BASB028, o una variante o un fragmento de él para expresar el polinucleótido y/o polipéptido de BASB028, o un fragmento o una variante de él in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, como puede ser producir un anticuerpo y/o una respuesta inmune a células T, incluidas, por ejemplo, células T productoras de citoquinas o células T citotóxicas, para proteger de la enfermedad el mencionado individuo, preferiblemente una persona, esté establecida ya esa enfermedad en el individuo o no lo esté. Un ejemplo de administración del gen es el de acelerar su incorporación en las células deseadas como revestimiento sobre partículas o de otra forma. Un vector así de ácido nucleico puede comprender DNA, RNA, un ribozoma, un ácido nucleico modificado, un híbrido de DNA/RNA, un complejo de proteína-DNA o un complejo de proteína-RNA.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición inmunológica que, cuando se introduce en un individuo, en particular una persona, capaz de haber inducido dentro de él una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en tal individuo a un polinucleótido y/o polipéptido de BADSB028 codificado a partir de él, composición que comprende un polinucleótido y/o polipéptido de BASB028 recombinante codificado a partir de él y que, o que, comprende DNA y/o RNA que codifica y expresa un antígeno del mencionado polinucleótido o polipéptido de BASB028 codificado a partir de él, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad anticuerpo y/o inmunidad celular, tal como una inmunidad celular que deriva de células CTL o CD4+T.

Un polipéptido de BASB028 o un fragmento de él puede condensarse con una coproteína o resto químico que puede producir o no producir por sí anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína condensada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas y, preferiblemente, propiedades protectoras. Así, una proteína recombinante condensada, preferiblemente comprende además una coproteína antigénica, tal como lipoproteína D de Haemophilus influenzae, glutatina-S-transferasa (GST) o \beta-galatosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubilice la proteína y facilite su producción y purificación. Además, la coproteína puede actuar como coadyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo receptor de la proteína. La coproteína puede unirse al terminal amino o carboxi de la primera
proteína.

Esta invención proporciona composiciones, en particular, composiciones de vacunas, y métodos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de DNA inmunoestimuladoras, tales como las descritas por Sato, Y. y otros, Science, 273: 352 (1996).

También proporciona esta invención métodos en que se usa el polinucleótido descrito, o fragmentos de él, que han revelado que codifican regiones no variables de proteínas bacterianas de la superficie celular, en construcciones de polinucleótidos usados en tales experimentos de inmunización en modelos animales de infección con Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán particularmente útiles para identificar epitopos de proteínas capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que este enfoque permitirá la subsiguiente preparación de anticuerpos monoclonales de un valor particular, derivados del organismo requerido del animal que resiste con éxito a la infección o se libera de ella, para desarrollar agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de la infección bacteriana, en particular una infección por Moraxella catarrhalis, en mamíferos, en particular en personas.

La invención incluye también una formulación de vacuna, que comprende un polipéptido y/o polinucleótido de la invención, recombinante inmunogénico, junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puesto de los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden desintegrar en el estómago, preferiblemente se administran parenteralmente, incluidas, por ejemplo, la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen soluciones estériles acuosas y no acuosas para inyección que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen que las soluciones sean isotónicas con el fluido corporal, preferiblemente sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensivos y agentes espesativos. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de unidosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales cerrados y se pueden almacenar en la condición de secados por liofilización, lo que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso.

La formulación de vacuna de la inyección puede incluir también sistemas coadyuvantes para reforzar la capacidad inmunogénica de la formulación. Preferiblemente, el sistema coadyuvante provoca una respuesta de tipo TH1.

Una respuesta inmune puede diferenciarse grosso modo en dos categorías extremas, siendo una, una respuesta humoral y la otra, una respuesta mediada por células (caracterizadas tradicionalmente por mecanismos de protección por anticuerpo la primera y por células la segunda). Estas categorías de respuesta inmune se han denominado de tipo TH1 (respuesta mediada por células) y TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes extremas de tipo TH1 se pueden caracterizar por la generación de T linfocitos citotóxicos de haplotipo restringido, específicos al antígeno, y respuestas naturales que matan células. Frecuentemente, en ratones, las respuestas de TH-1 se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2, si bien éstas corresponden en el hombre a anticuerpos del tipo IgG1. Las respuestas inmunes del tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplia gama de isotopos de inmunoglobulina, entre las que están incluidos, en ratones, IgG1, IgA e IgM.

Se puede considerar que la fuerza motriz detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuesta inmune es la de las citoquinas. Unos niveles altos de citoquinas del tipo TH-1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células al antígeno dado, mientras que unos niveles altos de citoquinas de tipo TH-2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno.

La distinción entre las repuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmune que se describe que es predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, frecuentemente es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de la descrita en clones de células T de CD4+ve por Mosmann y Coffmann (Mosmann, T.R. y Coffmann, R.L. (1989), TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immnunology, 7, págs. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas del tipo TH1 están asociadas con la producción de citoquinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas, a menudo directamente asociadas con la inducción de respuestas inmunes del tipo TH1, no son producidas por células T, como la IL-12. A diferencia, las respuestas de tipo TH2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se conoce que ciertos coadyuvantes de vacunas son especialmente adecuados para la estimulación de respuestas de citoquinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluyen la medida directa de la producción de citoquinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de reestimulación con antígeno, y/o la medida de la relación IgG1:IgG2 de respuestas de anticuerpos específicos al antígeno.

Así, un coadyuvante de tipo TH1 es uno que estimula preferentemente las poblaciones de células T aisladas para producir niveles altos de citoquinas de tipo TH1 cuando se reestimula con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo de linfocitos T CD+8 citotóxicos y respuestas de inmunoglobulina específicas al antígeno asociadas con isotipo de tipo TH1.

Los coadyuvantes que son capaces de estimular preferentemente la respuesta de células de tipo TH1 se describen en la solicitud de patente internacional nº. WO 94/00153 y nº. WO 95/17209.

El lípido A monofosforilo 3 De-O-acilado (3D-MPL) es uno de tales coadyuvantes. Es conocido como GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de lípido A de monofosforilo 3 De-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y lo produce Ribi Immunochem., Montana. Una forma preferente de lípido A de monofosforilo 3 De-O-acilado se describe en la patente europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals S.A.).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son lo bastante pequeñas para que sean estériles filtradas a través de una membrana de 0,22 micras (patente europea nº. 0 689 454). El 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug-100 \mug, preferiblemente de 25-50 \mug por dosis, estando presente el antígeno en el intervalo de 2-50 \mug por dosis.

Otro coadyuvante preferente comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC, derivada de corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, puede mezclarse con lípido A de monofosforilo 3 De-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente con un vehículo.

El método para producir QS21 se describe en la patente U.S. nº. 5.057.540.

Se han descrito con anterioridad formulaciones no reactogénicas de coadyuvantes que contienen QS21 (documento WO 96/33739). Formulaciones de este tipo que comprenden QS1 y colesterol han revelado ser coadyuvantes satisfactorios de la estimulación de TH1 cuando se formulan junto con un antígeno.

Entre otros coadyuvantes que son estimuladores preferentes de la respuesta de células de tipo TH1 figuran oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias de CpG no metiladas según se describe en el documento WO 96/02555.

También se contemplan combinaciones de diferentes coadyuvantes de estimuladores de TH1, tales como los mencionados aquí antes, que proporcionan un coadyuvante que es un estimulador preferente de la respuestas TH1. Por ejemplo, se puede formular QS21 junto con 3D-MPL. La relación QS21:3D-MPL típicamente será del orden de 1:10 a 10:1, preferiblemente de 1:5 a 5:1 y, frecuentemente, sustancialmente de 1:1. El intervalo preferido de 3D-MPL:QS21 para una sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:1.

Preferiblemente está presente también un vehículo en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, \alpha-tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos de la composición de vacuna de acuerdo con la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en tal emulsión. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente, para administración humana, QS21 y 3D-MPL estarán presente en la vacuna en el intervalo de 1 \mug-200 \mug, como puede ser de 10 a 100 \mug, preferiblemente de 10 \mug a 50 \mug por dosis. Típicamente, el aceite en agua comprenderá de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10% de \alpha-tocoferol y de 0,3 a 3% de tween 80. Preferiblemente, la relación de escualeno a \alpha-tocoferol es igual a 1 o menor, ya que proporciona una emulsión más estable. También puede estar presente span 85 a un nivel de 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan, además, un estabilizador.

Las emulsiones no tóxicas de aceite en agua contienen, preferiblemente, un aceite no tóxico, por ejemplo escualano o escualeno, un emulsivo, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación particularmente potente de coadyuvante que comprende QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La presente invención también proporciona una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular, antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y dolencias afines. Tal composición de vacuna polivante puede incluir un coadyuvante inductor de TH1 como los descritos aquí antes.

Si bien la invención se ha descrito haciendo referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos de BASB028, ha de entenderse que esto cubre fragmentos de polipéptidos y polinucleótidos naturales, y polipéptidos y polinucleótidos similares con variaciones, supresiones o sustituciones que no afectan sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos y polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido de BASB028 y/o un polipéptido de BASB028 para administración a una célula o un organismo multicelular.

La invención se refiere también a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido de los discutidos aquí o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden emplear en combinación con un vehículo (o varios) no estéril o estéril para uso con células, tejidos u organismos, como puede ser un vehículo farmacéutico para administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un medio aditivo o una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. El grupo de tales vehículos puede comprender, aunque no únicamente, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de ellos. La formulación debe acomodarse a la vía de administración.

La invención se refiere, además, a paquetes y kits diagnósticos y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes que contienen uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera efectiva y conveniente, por ejemplo, mediante administración por las vías tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradermal, entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo como composición inyectable, por ejemplo, como dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipétido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, un péptido agonista o antagonista o un compuesto de molécula pequeña, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Entre tales vehículos figuran, aunque no únicamente, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de ellos. La invención se refiere adicionalmente a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de la composiciones de la invención mencionadas. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo, una vía sistémica u oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen la inyección, típicamente por inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías de inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Entre los medios alternativos para administración sistémica están incluidas la administración transmucosal y la transdérmica usando penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido o cualquier otro compuesto de la presente invención se puede formular como formulación entérica o encapsulada, también se posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede efectuarse tópica y/o localizadamente en forma de emplastos, pastas, geles, soluciones, polvos, etc.

Para administración a mamíferos y, especialmente, a personas, se espera que el nivel de la dosis diaria sea de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente en torno a 1 mg/kg. En cualquier caso, el médico determinará la dosis que sea más adecuada para un individuo, que variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo concreto. Las dosis indicadas tienen carácter de ejemplo para un caso medio. Obviamente, puede haber casos en los que son adecuados intervalos de dosificación más altos o más bajos, y tales intervalos están dentro del ámbito de esta invención.

El intervalo de dosis requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza del estado del enfermo y el criterio del médico. Sin embargo, las dosis adecuadas están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg de peso corporal del sujeto.

Una composición de vacuna está, convenientemente, en forma de inyectable. Se pueden emplear coadyuvantes convencionales para acrecer la respuesta inmune. Una dosis adecuada para vacunación es de 0,5-5 microgramos/kg de antígeno y, preferiblemente, tal dosis se administra 1-3 veces con un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observarán, con los compuestos de la invención, efectos tóxicos perjudiciales que obliguen a excluir su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, a la vista de la variedad de compuestos disponibles y las eficiencias diferentes de las varias vías de administración, son de esperar una variaciones grandes en la dosificación necesaria. Por ejemplo, es de esperar que la administración oral requiera dosis de administración más altas que la inyección intravenosa. Las variaciones de estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando prácticas estándar de optimización, como es bien conocido en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos constituyen una valiosa fuente de información para determinar sus estructuras bidimensionales y tridimensionales así como para identificar otras secuencias de similar homología. Estos enfoques se facilitan almacenando la secuencia en un medio legible de ordenador y usando luego los datos archivados en un programa conocido de estructura molecular o para buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tales como el paquete de programas GCG.

La invención también proporciona métodos para el análisis de secuencias de carácter o cadenas, en particular secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Entre los métodos preferidos para el análisis de secuencias están incluidos, por ejemplo, métodos de análisis de homología de secuencias tales como los de análisis de identidad y similaridad, análisis de estructuras de DNA, RNA y proteínas, montaje de secuencias, análisis cladístico, análisis de causas de secuencias, determinación de marcos de lectura abierta, empleo de bases de ácidos nucleicos, análisis del uso de codones, selección de bases de ácidos nucleicos y análisis de secuencia de picos de cromatogramas.

Se proporciona un método basado en ordenador para realizar la identificación de la homología. Este método comprende las etapas de: proporcionar una secuencia de un primer polinucleótido que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible en ordenador; y comparar la mencionada secuencia de un primer polinucleótido con al menos una secuencia de un segundo polinucleótido o polipéptido para identificar la homología.

También se proporciona un método basado en ordenador para realizar la identificación de la homología, método que comprende las etapas de: proporcionar una secuencia de un primer polinucleótido que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible en ordenador; y comparar la mencionada secuencia de un primer polinucleótido con al menos una secuencia de un segundo polinucleótido o polipéptido para identificar la homología.

Todas las publicaciones y referencias, incluidas las patentes y solicitudes de patentes, citadas en esta memoria se incorporan en este documento por referencia en su integridad, como si se indicara específica e individualmente que cada documento o referencia particular se incorpora aquí presentado en su integridad. Cualquier solicitud de patente para la que esta solicitud reivindica prioridad, se incorpora también en su integridad por referencia de la manera descrita antes para publicaciones y referencias.

Definiciones

"Identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según sea el caso, determinada por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de parentesco entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, determinado por el casamiento entre las cadenas de tales secuencias. La "identidad" se puede calcular fácilmente por métodos conocidos, incluidos, aunque no únicamente, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, parte I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, por Heine, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereiux, J., eds., M. Sockton Press, New York, 1991; y Carillo, H y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos diseñados para determinar la identidad están diseñados para obtener el casamiento mayor entre las secuencias ensayadas. Además, los métodos para determinar la identidad se codifican en programas de ordenador asequibles públicamente. Entre los métodos computacionales para determinar la identidad entre dos secuencias están incluidos, entre otros, el programa GAP del paquete de programas GCG (Devereux, J. y otros, Nucleic Acids Research 12 (1) 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. y otros, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) y FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). La familia BLAST de programas se puede obtener públicamente de NCBI y otras fuentes (Blast Manual, Altschul, S. y otros, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. y otros, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Para determinar la identidad se puede usar también el bien conocido algoritmo de Smith Waterman.

Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970),

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992),

Penalización por brecha: 8,

Penalización por longitud de brecha: 2,

Un programa útil con estos parámetros puede obtenerse públicamente como programa "brecha" de Genetics Computer Group, Madison, WI. Los parámetros mencionados son parámetros por defecto para la comparación de péptidos (junto con ausencia de penalidad para brechas terminales).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970),

Matriz de comparación: ajustes = + 10, desajuste = 0,

Penalidad por brecha: 50

Penalidad por longitud de brecha: 3,

Asequible como: Programa "brecha" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para comparaciones de ácidos nucleicos.

Un significado preferente de "identidad" de polinucleótidos y polipéptidos, según sea el caso, se proporciona seguidamente en los apartados (1) y (2).

(1). Las realizaciones de polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótido que tiene identidad de como mínimo 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% con la secuencia de referencia de SEQ ID NO:1, pudiendo la mencionada secuencia de polinucleótido ser idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:1, o pudiendo incluir un cierto número entero de alteraciones del nucleótido en comparación con la secuencia de referencia, alteraciones que se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución, incluidas transición y transversión, o inserción de nucleótido, alteraciones que pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótido de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, interpoladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, determinándose el mencionado número de alteraciones de nucleótido multiplicando el número total de nucleótidos en la SEQ ID NO:1 por el número entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y sustrayendo luego ese producto del mencionado número de nucleótidos en la SEQ ID NO:1, o:

n_{n} \ \leq \ x_{n} - (x_{n} \cdot y),

ecuación en la que n_{n} es el número del alteraciones en el nucleótido, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEQ ID NO:1, y, es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% o 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no íntegro de x_{n} e y se redondea por debajo al número íntegro más próximo antes de sustraerlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:2 pueden crear mutaciones absurdas, erróneas o de desplazamiento de marco en esta secuencia de codificación y, por tanto, alteran el polipéptido codificado por el polinucleótido que sigue tales alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótido de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO:1, esto es, puede ser 100% idéntica, o puede incluir un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos en comparación con la secuencia de referencia, por lo que la identidad porcentual es inferior a 100%. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución, incluidas transición y transversión, o inserción de ácidos nucleicos, alteraciones que pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de polinucleótido de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, interpoladas individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID NO:1 por el número entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y sustrayendo luego ese producto del mencionado número de nucleótidos en la SEQ ID NO:1, o:

n_{n} \ \leq \ x_{n} - (x_{n} \cdot y),

ecuación en la que n_{n} es el número del alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID NO:1, y es, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no íntegro de x_{n} e y se redondea por debajo al número íntegro más próximo antes de sustraerlo de x_{n}.

(2). Las realizaciones de polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende un polipéptido que tiene identidad de como mínimo 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% con la secuencia de referencia de SEQ ID NO:2, pudiendo la mencionada secuencia de polipéptido ser idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:2, o pudiendo incluir un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, alteraciones que se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución, incluidas sustitución conservadora o no conservadora, o inserción de aminoácidos, alteraciones que pueden producirse en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, interpoladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, determinándose el mencionado número de alteraciones de aminoácidos multiplicando el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO:2 por el número entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y sustrayendo luego ese producto del mencionado número de aminoácidos en la SEQ ID NO:2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

ecuación en la que n_{a} es el número del alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO:2, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% o 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no íntegro de x_{a} e y se redondea por debajo al número íntegro más próximo antes de sustraerlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptido de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO:2, esto, es, puede ser 100% idéntica o puede incluir un cierto número entero de alteraciones en comparación con la secuencia de referencia, con lo que la identidad es inferior a 100%. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por, al menos una supresión, sustitución, incluida sustitución conservadora y no conservadora, o inserción de aminoácidos, alteraciones que se pueden producir en las posiciones aminoterminal o carboxiterminal de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualquier punto entre esas posiciones terminales, interpoladas individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO:2 por el número entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y sustrayendo luego ese producto del mencionado número de aminoácidos en la SEQ ID NO:2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

ecuación en la que n_{a} es el número del alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO:2, y es, por ejemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no íntegro de x_{a} e y se redondea por debajo al número íntegro más próximo antes de sustraerlo de x_{a}.

"Individuo(s)", cuando se usa aquí con referencia a un organismo, significa un eucariote individual, incluidos, aunque no únicamente, un metazoano, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" desde su estado natural, esto es, si se presenta en la naturaleza, se ha cambiado o extraído de su medio original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente naturalmente en un organismo vivo, no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural, es "aislado" (o se aísla), tal como se emplea aquí el término. Además, un polinucleótido o olipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o cualquier otro método recombinante es "aislado", incluso si todavía sigue estando presente en el mencionado organismo, organismo que puede ser vivo o no serlo.

"Polinucleótido" se refiere, por lo general, a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser RNA o DNA no modificado, o RNA o DNA modificado que incluye regiones de cadena doble o simple.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia pero que retiene propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de amninoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios del nucleótido pueden dar por resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se discute más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas, siendo globalmente muy similares las secuencias del polipéptido de referencia y la variante y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede ser uno codificado por el código genético, o puede no serlo. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una variante natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que sea natural. Las variantes no presentes naturalmente de polinucleótidos de polipéptidos se pueden obtener por técnicas de mutagenesis o por síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad causada por una bacteria o relacionada con una bacteria, incluidas, por ejemplo, otitis media en criaturas y niños, neumonía en mayores, sinusutis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de fluidos en el oído medio, lesión del nervio auditivo, retraso en el aprendizaje del habla, infección del tracto respiratorio superior e inflamación del oído medio.

Ejemplos

Los ejemplos que se presentan seguidamente se realizan usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la especialidad, excepto cuando se describen detalladamente otras técnicas.

Ejemplo 1 Descubrimiento y secuenciación satisfactoria del gen de BASB028 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis

El gen de BASB028 de la SEQ ID NO: 1 se descubrió primeramente en la base de datos de Incyte PathoSeq que contiene secuencias genómicas de DNA no acabadas de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis (también denominada cepa Mc2931). La translación de la secuencia de polinucleótido de BASB028, expuesta en SEQ ID NO:2, reveló una similaridad significativa (25% de identidad en un solapamiento de 1002 aminoácidos) con la proteína filamentosa de hemaglutinina (FHA) de Bordetella pertussis, así como con proteínas afines de la misma familia en otras proteínas.

La secuencia del gen de BASB028 se confirmó experimentalmente. A este fin, se extrajo DNA genómico de 10^{6} células de las células de M. catarrhalis (cepa ATCC 43617) usando el kit de extracción de DNA genómico QIAGEN (Qiagen GmbH) y 1 \mug de este material se sometió a amplificación de DNA por reacción en cadena de polimerasa usando cebadores E028fw (5'-ATG AAT CGC TTT TGC TAC C-3') [SEQ ID NO:3] y MCA101831bw (5'-GCC AGT TCC ATT TTG AGC-T-3') [SEQ ID NO:4]. Este producto de PCR se purificó en un aparato Biorobot 9600 (Qiagen GmbH) y se sometió a secuenciación de DNA usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin-Elmer) y un secuenciador de DNA ABI377/PRISM. La secuenciación de DNA se realizó en ambas cadenas con una redundancia de 2 y se conjuntó una secuencia de longitud entera usando software Sequencher^{MC} (Applied Biosystems). La secuencia de DNA resultante resultó ser 100% idéntica a SEQ ID NO:1.

Ejemplo 2 Análisis de variabilidad del gen de BASB028 entre varias cepas de Moraxella catarrhalis, por polimorfismo de restricción de longitd del fragmento (RFLP)

Se extrajo DNA genómico de 16 cepas de M. catarrhalis (presentadas en la Tabla 1) como se describe seguidamente. Se rayó M. catarrhalis para colonias individuales en placas de agar BHI y se dejó crecer durante la noche a 37ºC. Se escogieron 3 ó 4 colonias individuales y se usaron para inocular aprox. 1 ml de cultivo de siembra de caldo de BHI (infusión-cerebro-corazón) que se dejó crecer durante la noche en una incubadora de sacudidas, a aprox. 300 rpm, a 37ºC. Se inoculó con el cultivo de siembra un matraz erlenmeyer de 500 ml que contenía aprox. 150 ml de caldo de BHI y se dejó crecer durante aprox. 12-16 h en una incubadora de sacudidas, a aprox. 175 rpm, para generar una masa de células para aislamiento de DNA. Las células se recogieron por centrifugación en un rotor Sorval GSA a aprox. 2000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Se quitó el material sobrenadante y el pélet se puso en suspensión en aprox. 5,0 ml de agua estéril. Se añadió un volumen igual de tampón de lisis (NaCl 200 mM; EDTA 20 mM, Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, 05% (p/v) de SDS, 0,5% (v/v) de 2-mercaptoetanol y 250 \mug/ml de proteinasa K) y las células se pusieron en suspensión por agitación suave y trituración. La suspensión de células se incubó luego durante aprox. 12 h a 50ºC para lisar las bacterias y liberar DNA cromosómico. El material proteináceo se precipitó añadiendo 5,0 ml de solución saturada de NaCl (aprox. 6M en agua estéril) y centrifugando a aprox. 5.500 x g en un rotor Sorvall SS34 a temperatura ambiente. El DNA cromosómico se precipitó del material sobrenadante claro añadiendo dos volúmenes de atanol del 100%. Se recogió el DNA agregado y se lavó, usando una agitación suave, en un volumen pequeño de solución de etanol al 70%. El DNA purificado se puso en suspensión en agua estéril y se dejó que se disolviera/dispersara durante la noche a 4ºC con un suave balanceo. Se determinó espectroscópicamente a 260 nm la concentración de DNA disuelto usando un coeficiente de extinción de 1,0 unidades O.D, aprox. 50 \mug/ml.

Este material se sometió seguidamente a amplificación por PCR usando los oligonucleótidos MC-2/1BamF(5'-AGC TAG CTA GCT GGA TCC GCA CAG GGA AAA TCA GGC AAT TTG GGT GGT GG-3')[SEQ ID NO:5] y MC-2/1-SalRC4(5'-AGC TAG CTA GCT GGA TCC GCA CAG GGA AAA TCA GGC AAT TTG GGT GGT GG-3')[SEQ ID NO:6]. Los correspondientes ampliaciones del gen de BASB028 se sometieron luego, independientemente, a hidrólisis usando enzimas de restricción (HindII, HindIII, MaeIII, NlaIII, Sau3Al, SfaNI) y los productos de restricción se separaron por electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida usando procedimientos estándar de biología molecular descritos en Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2ª edición, eds: Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989. En la Fig. 1 se presentan las fotografías de los geles de electroforesis resultantes. Para cada cepa, se puntuaron y combinaron los modelos de RFLP correspondientes a 6 enzimas de restricción. Se definieron luego grupos de cepas que compartían una combinación idéntica de modelos de RFLP. Usando esta metodología, las cepas ensayadas en este estudio quedaron distribuidas en 6 grupos genómicos (Grupo 1: Mc2910, Mc2912; Grupo 2: Mc2904, Mc2956; Grupo 3: Mc2905, Mc2906, Mc2907, Mc2908, Mc2926; Grupo 4: Mc2909, Mc2931, Mc2960, Mc2969, Mc2975; Grupo 5: Mc2911; Grupo 6: Mc2913). Estos datos revelan que la población de Moraxella catarrhalis usada en este estudio presenta alguna diversidad de secuencia para el gen de BASB028.

TABLA 1 Características de las cepas de Moraxella catarrhalis usadas en este estudio

1

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Ejemplo 3 Eficacia de la vacuna de BASB028: intensificación de la eliminación de M. catarrhalis en pulmones de ratones

Se expresó proteína recombinante de BASB028 en E. coli como proteína de condensación 6xHis tag y se purificó por cromatografía de afinidad Hitrap cargada con Ni2+ (Pharmacia Biotech.). La capacidad protectora de la proteína recombinante de BASB028 se puede evaluar en un modelo de ratón.

El modelo de ratón está basado en el análisis de la invasión de los pulmones por M. catarrhalis siguiendo una provocación intranasal a ratones vacunados.

Grupos de 6 ratones BALB/c (hembras, de 6 semanas) se inmunizan subcutáneamente con 100 \mul de vacuna que corresponden a una dosis de 10 \mug y reciben una inmunización de recuerdo 2 semanas después. Una semana después de la inmunización de recuerdo, los ratones se provocan por instilación de 50 \mul de suspensión de bacterias (+/-10^{6} CFU/50 \mul) en la ventana nasal izquierda bajo anestesia (los ratones se anestesian con una combinación de cetamina y xilazina. 0,24 mg de xilazina (Rompun) y 0,8 mg de cetamina (Imalgene)/100 \mul). Los ratones se sacrifican 4 horas después de la provocación y se extraen asépticamente los pulmones y se homogeneizan individualmente. Se determina el log_{10} del número medio pesado de CFU/pulmón contando las colonias que han crecido en placas de agar de Mueller-Hinton después de cultivar 20 \mul de 5 diluciones seriales del homogeneizado. Se calculan para cada grupo la media aritmética del log_{10} del número medio pesado de CFU/pulmón y las desviaciones estándar.

Los resultados se analizan estadísticamente aplicando ANOVA de 1 vía después de suponer igualdad de la varianza (comprobada por el ensayo de Brown y Forsythe) y la normalidad (comprobada usando el ensayo de Shapiro-Wilk). Las diferencias entre grupos se analizan usando el ensayo de Dunnet, el ensayo de Tukey de intervalo investigado (HSD) y el ensayo de Student-Newman-Keuls.

Materiales depositados

Se ha depositado un depósito que contiene cepa Catlin de Moraxella catarrhalis en la American Type Culture Collection (denominada aquí "ATCC") el 21 de junio de 1997, al que se ha asignado el número de depósito 43617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una biblioteca liofilizad de inserto de 1,5-2,9 kb construida a partir de aislado de M. catarrhalis obtenido de un aspirado transtraqueal de un minero de carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506-508 (1982).

El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se describe aquí como "la cepa depositada" o como "el DNA de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen de BASB028 de longitud entera.

El 12 de febrero de 199 se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) un depósito del vector pMC-ORF1/2 que consta de DNA de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30, y se le ha asignado el número de depósito 207118.

La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa/clon depositados, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado por ellos, sirven de control en el caso de conflicto con cualquier descripción de las secuencias consideradas.

El depósito de las cepas depositadas se ha hecho en los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento de Patentes. Las cepas depositadas estarán abiertas al público, irrevocablemente y sin restricción o condicionamiento alguno, después de expedir una patente. Las cepas depositadas se suministran meramente por conveniencia para los expertos en la técnica y ello no supone que se requiere un depósito para habilitación, tal como el requerido bajo 35 U.S.C. #112.

2

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INDICACIONES REFERENTES A MICROORGANISMO DEPOSITADO U OTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Regla 13 bis de PCT)

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A. Las indicaciones siguientes se refieren al microorganismo depositado u otro material biológico al que se refiere a descripción en la página 54, líneas 1-28.

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Nombre de la institución depositaria: AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION

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Dirección de la institución depositaria: 10801 UNIVERSITY BLVD, MANASSAS, VIRGINIA 20110-2209, EE.UU.

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Fecha de depósito: 21 de junio de 1997 y 12 de febrero de 1999.

Número de acceso: 43617 y 207118.

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INDICACIONES ADICIONALES

En cuanto a las designaciones cuando se solicita una patente europea, estará disponible una muestra del microorganismo depositado hasta la publicación de la mención del otorgamiento de la patente europea o hasta la fecha en que la patente ha sido rehusada o rechazada, sólo por entrega de tal muestra a un experto nombrada por la persona que requiere la muestra.

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Este escrito se recibió con la solicitud internacional.

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Firma el oficial autorizado.

<110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.

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<120> Nuevos compuestos

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<130> BM45319

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<160> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows, versión 3.0

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<210> 1

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<211> 5181

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<212> DNA

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<213> bacteria

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<400>

3

4

5

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<210> 2

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<211> 1726

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<212> PRT

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<213> Bacteria

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<400> 2

6

7

8

9

10

11

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<210> 3

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgaatcgct tttgctacc

\hfill

19

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

gccagttcca ttttgagct

\hfill

19

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<210> 5

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<211> 50

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

agctagctag ctggatccgc acagggaaaa tcaggcaatt tgggtggtgg

\hfill

50

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<210> 6

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<211> 50

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

agctagctag ctggatccgc acagggaaaaa tcaggcaatt tgggtggtgg

\hfill

50

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INFORMACIÓN DE SECUENCIAS

Secuencias de polinucleótido y polipéptido de BQSB028

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SEQ ID NO:1

Secuencia de polinucleótidos de BASB028 de Moraxella catarrhalis de la cepa MC2931

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12

13

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SEQ ID NO:2

Secuencia de polipéptido de BASB028 de Moraxella cAtarrhalis de la cepa MC2931

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14

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SEQ ID NO:3

ATG AAT CGC TTT TGC TAC C

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SEQ ID NO: 4

GCC AGT TCC ATT TTG AGC T

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SEQ ID NO:5

AGC TAG CTA GCT GGA TCC GCA CAG GGA AAA TCA GGC AAT TTG GGT GGT GG

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SEQ ID NO: 6

AGC TAG CTA GCT GGA TCC GCA CAG GGA AAA TCA GGC AAT TTG GGT GGT GG

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 85% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

2. Un polipéptido aislado según se reivindica en la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 95% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

3. El polipéptido según se reivindica en la reividicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

4. Un polipéptido aislado de SEQ ID NO:2.

5. Un fragmento inmunogénico del polipéptido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, fragmento inmunogénico (si es necesario, cuando se acopla a un vehículo) que es capaz de producir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO:2.

6. Un polipéptido o fragmento inmunogénico según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, polipéptido o fragmento inmunogénico que es parte de una proteína de condensación mayor.

7. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 85% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la longitud entera de SEQ ID NO:2; o una secuencia de nucleótidos complementaria al mencionado polinucleótido aislado.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 85% con la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 en la región entera de codificación; o una secuencia de nucleótidos complementaria al mencionado polinucleótido aislado.

9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 85% con la de SEQ ID NO:1 en la región entera de SEQ ID NO:1 y que codifica un polipéptido o fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; o una secuencia de nucleótidos complementaria al mencionado polinucleótido aislado.

10. El polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la identidad es de al menos 95% con SEQ ID NO:1.

11. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2, o el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5 ó 6.

12. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEQ ID NO:1.

13. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, obtenible por exploración de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación restrictivas con una sonda marcada que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 o un fragmento de ella.

14. Un vector de expresión o un microorganismo recombinante vivo que comprende un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13.

15. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 14 o una membrana de la mencionada célula huésped.

16. Un procedimiento para producir un polipéptido o fragmento inmunogénico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 15 en condiciones suficientes para la producción del mencionado polipéptido o fragmento inmunogénico y recuperar del medio de cultivo el polipéptido o fragmento inmunogénico.

17. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, que comprende transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende al menos uno de los mencionados polinucleótidos, y cultivar la mencionada célula huésped en condiciones suficientes para expresión de uno cualquiera de los mencionados polinucleótidos.

18. Una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva del polipéptido o fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. La composición de vacuna de acuerdo con una reivindicaciones 18 ó 19, composición que comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

21. Un anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido o fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

22. Un método para diagnosticar una infección de Moraxella catarrhalis, que comprende identificar un polipéptido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un anticuerpo que es inmunoespecífico para el mencionado polipéptido, presente dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener tal infección.

23. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido o fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para uso con el fin de generar una respuesta inmune en un animal.

24. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido o fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 en la preparación de un medicamento para uso con el fin de generar una respuesta inmune en un animal.

25. Una composición terapéutica útil para tratar seres humanos con una enfermedad producida por Moraxella catarrhalis, que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 21 y un vehículo farmacéutico adecuado.