ES2338294T3

ES2338294T3 - Polipeptido y polinucleotido basb118 de moraxella catarrhalis.

Info

Publication number: ES2338294T3
Application number: ES00956353T
Authority: ES
Inventors: Joelle GlaxoSmithKline Biologicals s.a. THONNARD
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 2000-07-31
Publication date: 2010-05-06
Anticipated expiration: 2020-07-31
Also published as: HK1047956A1; DE60043658D1; EP1206548B1; EP1206548A1; AU6833000A; GB9918208D0; WO2001009334A1; ATE454452T1; CN1391610A; CA2380803A1; JP2003506044A

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2.

Description

Polipéptido y polinucleótido BASB118 de Moraxella catarrhalis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polinucleótidos (en lo sucesivo denominados "polinucleótido(s) BASB118"), a polipéptidos codificados por ellos (en lo sucesivo denominados "BASB118" o "polipéptido(s) BASB118", a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para el uso de dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar la infección por ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

La Moraxella catarrhalis (también denominada Branhamella catarrhalis) es una bacteria gram-negativa aislada frecuentemente en el tracto respiratorio superior de seres humanos. Es responsable de diversas patologías, siendo las principales la otitis media en infantes y niños, y neumonía en ancianos. También es responsable de la sinusitis, infecciones nosocomiales y menos frecuentemente de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad importante de la infancia tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. Cada año se registran más de 3,5 millones de casos en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19:823). Si se deja sin tratar, o se vuelve crónica, esta enfermedad puede dar lugar a pérdidas de la audición que pueden ser temporales (en el caso de la acumulación de fluidos en el oído medio) o permanentes (si el nervio auditivo está dañado). En infantes, esas pérdidas de la audición pueden ser responsables de un retraso en el aprendizaje del habla.

Tres especies de bacterias se aíslan principalmente del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) y M. catarrhalis. Están presentes en el 60 al 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan entre las dos el 30% aproximadamente y M. catarrhalis el 15% aproximadamente de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Se pueden aislar otras bacterias del oído medio (H. influenzae tipo B, S. pyogenes, etc.) pero a una frecuencia muy inferior (2% de los casos o inferior).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un prerrequisito absoluto para el desarrollo de una otitis; no obstante también son necesarios otros para dar lugar a la enfermedad (Dickinson, DP y col. (1988) J. Infect-Dis. 158:205, Faden, HL y col. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612). Estos son importantes para desencadenar la migración de la bacteria hacia el oído medio a través de las trompas de Eustaquio, seguido de la iniciación de un proceso inflamatorio. Estos factores son desconocidos hasta la fecha. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmunitario después de una infección vírica, por ejemplo, podría provocar una incapacidad para controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, HL y col. (1994) J. Infect, Dis. 169:1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente se vuelven susceptibles al desarrollo de otitis media debido a la presencia mantenida de patógenos en el oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).

La respuesta inmunitaria a M. catarrhalis está mal caracterizada. Los análisis de cepas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebes seguidos de entre 0 y 2 años de edad, indica que cogen y eliminan frecuentemente nuevas cepas. Esto indica que se monta una respuesta inmunitaria eficaz por parte de los niños colonizados contra esta bacteria (Faden. HL y col (1994) J. Infect. Dis. 169:1312).

En la mayoría de adultos sometidos a prueba, han sido identificados anticuerpos bacterianos (Chapman. AJ y col. (1985) J. Infect. Dis. 151:878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida del suero: en general, aislados procedentes de individuos enfermos son más resistentes que aquellos que simplemente están colonizados (Hol. C y col, (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL y col. (1990) Am. J. Med. 88 (suppl. 5A):28S). Por tanto la resistencia sérica se podría considerar como un factor de virulencia de la bacteria. Se ha observado una actividad de opsonización en el suero de niños que se recuperan de la otitis media.

Los antígenos dirigidos por estas respuestas inmunitarias diferentes en seres humanos no han sido identificados, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por el hierro, y que es reconocida por el suero de pacientes con neumonía (Sethi, S, y col. (1995) Infect. Immun. 63:1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col. (1999), Infect. Immun. 67:1310).

Se han caracterizado otras pocas proteínas de membrana presentes sobre la superficie de M. catarrhalis usando un procedimiento bioquímico, o por su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para una revisión, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos expandidos contra algunas de ellas (UspA, CopB) favorece un aclaramiento más rápido de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) está altamente conservado entre cepas de M. catarrrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que ha demostrado ser eficaz contra esta bacteria en modelos animales.

La frecuencia de infecciones por Moraxella catarrhalis se ha incrementado drásticamente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a antibióticos y a una mayor población de personas con sistemas inmunitarios debilitados. Ya no es raro aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o todos los antibióticos normales. Este fenómeno ha generado una necesidad médica insatisfecha y una demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos, y pruebas diagnósticas para estos organismos.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a BASB118, en particular a polipéptidos BASB118 y polinucleótidos BASB118, a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para el uso de dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para la detección de enfermedades asociadas a infecciones microbianas y dolencias asociadas a esas infecciones, tales como ensayos para la detección de la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB118.

Diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y del alcance de la invención descrita serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la materia después de la lectura de las siguientes descripciones y de la lectura de otras partes de la presente memoria descriptiva.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB118 como se describe con mayor detalle a continuación. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB118 de Moraxella catarrhalis, que tiene las características de una lipoproteína que incluye una secuencia señal característica de lipoproteínas y por tanto se predice que sea de expresión superficial. La invención se refiere especialmente a BASB118 que tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 respectivamente. Se entiende que las secuencias mencionadas en el Listado de secuencias a continuación como "ADN" representan un ejemplificación de una forma de realización de la invención, puesto que aquellos con conocimientos ordinarios reconocerán que esas secuencias se pueden emplear útilmente en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Los aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones acompañantes.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en el presente documento como "BASB118" y "polipéptidos BASB118" así como sus variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y composiciones que comprenden las mismas.

La presente invención proporciona adicionalmente:

(a): un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%, preferentemente una identidad de al menos el 90%, más preferentemente una identidad de al menos el 95%, lo más preferentemente una identidad de al menos el 97-99% o una identidad exacta, a la de la SEQ ID NO: 2;

(b): un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de al menos el 85%, preferentemente una identidad de al menos el 90%, más preferentemente una identidad de al menos el 95%, incluso más preferentemente una identidad de al menos el 97-99% o una identidad exacta, a la SEQ ID NO: sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 1; o

(c): un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferentemente una identidad de al menos el 90%, más preferentemente una identidad de al menos el 95%, incluso más preferentemente una identidad de al menos el 97-99% o una identidad exacta, a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Los polipéptidos BASB118 proporcionados en la SEQ ID NO: 2 es el polipéptido BASB118 de la cepa MC2931 (ATCC 43617) de Moraxella catarrhalis.

La invención también proporciona un fragmento inmunógeno de un polipéptido BASB118, esto es, una porción contigua del polipéptido BASB118 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunógena que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Es decir, el fragmento (si es necesario cuando está acoplado a un vehículo) es capaz de expandir una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido BASB118. Ese fragmento inmunógeno puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB118 que carece de una secuencia líder N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunógeno de BASB118 según la invención comprende sustancialmente todos los dominios extracelulares de un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferentemente una identidad de al menos el 90%, más preferentemente una identidad de al menos el 95%, lo más preferentemente una identidad de al menos el 97-99% a la de la SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente igual como parte, pero no toda, de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB118, los fragmentos pueden estar "libres", o comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual forman una parte o región, lo más preferentemente como una sola región continua en un único polipéptido más grande.

Fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos truncados que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de una de sus variantes, tal como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxilo-terminal. También se prefieren formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidos por o en una célula hospedadora. Son adicionalmente preferidos fragmentos caracterizados por atributos estructurales funcionales tales como fragmentos que comprenden alfa-hélices y regiones que forman alfa-hélices, láminas beta y regiones que forman láminas beta, giros y regiones que forman giros, espirales y regiones que forman espirales, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones que forman superficies, regiones de unión a substratos, y regiones con un elevado índice antigénico.

Fragmentos adicionalmente preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o delecionados de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Se pueden emplear fragmentos de los polipéptidos de la invención para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos: por tanto, estos fragmentos se pueden emplear como intermedios para la producción de polipéptidos de longitud completa de la invención.

Son particularmente preferidas variantes en las que varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácidos son sustituidos, delecionados o añadidos en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunógenos, de la invención pueden estar en forma de proteína "madura" o pueden ser una parte de una proteína grande tal como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contenga secuencias secretoras o secuencias líder, pro-secuencias, secuencias que ayuden en la purificación tal como múltiples residuos de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de un polipéptido exógeno o una cola de lípidos o secuencias de polinucleótidos para incrementar el potencial inmunógeno de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles manipulables genéticamente que comprenden un polipéptido de la presente invención, o uno de sus fragmentos, y diversas porciones de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina preferida es la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una forma de realización particular, la parte Fc se puede eliminar simplemente con la incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor de coagulación sanguíneo Xa.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y a su uso para la selección de fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican esas proteínas de fusión. Ejemplos de tecnología de proteínas de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente Nº WO94/29458 y WO94/22914.

Las proteínas se pueden conjugar químicamente, o se pueden expresar en forma de proteínas de fusión recombinantes que permiten que se produzcan niveles incrementados en un sistema de expresión comparado con proteínas no fusionadas. El compañero de fusión puede ayudar en la proporción de epítopos para linfocitos T ayudantes (compañero de fusión inmunológico), preferentemente epítopos para linfocitos T ayudantes reconocidos por seres humanos, o puede ayudar en la expresión de la proteína (potenciador de la expresión) a rendimientos superiores que la proteína recombinante nativa. Preferentemente, el compañero de fusión será tanto un compañero de fusión inmunológico como un compañero que potencia la expresión.

Los compañeros de fusión incluyen una proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Otro compañero de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferentemente, se usa la porción C terminal de la molécula. Lyta deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa LytA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) páginas 265-272}) una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en el esqueleto del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de colina tales como el DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LytA en E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su amino-término {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798}. Es posible usar la porción repetida de la molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal que comienza en el residuo 178, por ejemplo los residuos 188-305.

En el presente documento se describen variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, esto es, polipéptidos que varían con respecto a los referentes por sustituciones conservativas de los aminoácidos, por las que un residuo es sustituido por otro con características similares. Esas sustituciones típicas son entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o los residuos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos aislados de origen natural, polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos sintéticamente, o polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos. Los medios para la preparación de dichos polipéptidos son muy conocidos en la materia.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención derive de Moraxella catarrhalis, no obstante, preferentemente se puede obtener de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención también se puede obtener, por ejemplo, a partir de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Es un objeto de la invención proporcionar polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB118, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido designado en el presente documento BASB118.

En una forma de realización particularmente preferida de la invención el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB118 que comprenden una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 que incluye un gen de longitud completa.

El polinucleótido BASB118 proporcionado en la SEQ ID NO: 1 es el polinucleótido BASB118 de la cepa MC2931 (ATCC 43617) de Moraxella catarrhalis.

Como aspecto adicional de la invención se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB118, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB118 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARN sin procesar, ARN de ribozimas, ARNm, ADNc, ADN genómicos, y ADN en banda Z.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, que incluyen al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB118 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID NO: 2.

En otra forma de realización particularmente preferida de la invención hay un polipéptido BASB118 de Moraxella catarrhalis que comprende o consta de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Usando la información proporcionada en el presente documento, tal como la secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, se puede obtener un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido BASB118 usando procedimientos de clonación y selección habituales, tales como aquellos para la clonación y secuenciación de fragmentos de ADN cromosómico de bacterias usando células Catlin de Moraxella catarrhalis como material de partida, seguido por la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, tal como la secuencia de polinucleótidos dada en la SEQ ID NO: 1, normalmente se prueba con un sonda una librería de clones de ADN cromosómico de la cepa Catlin de Moraxella catarrhalis en E. coli o algún otro hospedador adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferentemente un 17-mero o más largo, derivado de la secuencia parcial. Los clones que llevan ADN idéntico al de la sonda se pueden distinguir entonces usando condiciones de hibridación rigurosas. Secuenciando los clones individuales así identificados mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia de polipéptidos o polinucleótidos original es posible extender entonces la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar la secuencia de un gen de longitud completa. De manera conveniente, esa secuenciación se lleva a cabo, por ejemplo, usando ADN de doble cadena desnaturalizado preparado a partir de un clon plasmídico. Técnicas adecuadas se describen por Maniatis, T., Fritsch. E.F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. Nueva York (1989). (Véase en particular Screening By Hybridization 1.90 y Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). También se puede llevar a cabo la secuenciación directa de ADN genómico para obtener una secuencia de un gen de longitud completa. Ilustrativo de la invención, el polinucleótido expuesto en la SEQ ID NO: 1 se descubrió en una librería de ADN derivada de Moraxella catarrhalis.

Además, la secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos aminoácidos expuesto en la SEQ ID NO: 2 con un peso molecular deducido que se puede calcular usando valores de pesos moleculares de residuos aminoácidos muy conocidos por aquellos expertos en la materia.

El polinucleótido de la SEQ ID NO: 1, entre el codón de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de detención que comienza en el nucleótido número 1159 de la SEQ ID NO: 1, codifica el polipéptido de la SEQ ID
NO: 2.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o consta de:

(a) una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de al menos el 85%, preferentemente una identidad de al menos el 90%, más preferentemente una identidad de al menos el 95%, incluso más preferentemente una identidad del 97-99% o una identidad exacta a la SEQ ID NO: 1 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 1; o

(b) una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferentemente una identidad de al menos el 90%, más preferentemente una identidad de al menos el 95%, incluso más preferentemente una identidad del 97-99% o una identidad exacta del 100%, a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies distintas a Moraxella catarrhalis, se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de selección de una librería apropiada en condiciones de hibridación rigurosas (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y una concentración de SDS entre el 0,1-1%) con una sonda marcada o detectable que consta de o que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o uno de sus fragmentos; y el aislamiento de un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos.

La invención proporciona una secuencia de polinucleótidos idéntica a lo largo de su longitud completa a una secuencia codificante (marco de lectura abierto) en la SEQ ID NO: 1. La invención también proporciona una secuencia codificante para un polipéptido maduro o uno de sus fragmentos, por sí mismo así como una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento en el marco de lectura con otra secuencia codificante, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora, una secuencia de una pre-, o pro- o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención también puede contener al menos una secuencia no codificante, incluyendo por ejemplo, pero no limitado a, al menos una secuencia 5' y 3' no codificante, tales como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias de Kozak, secuencias que estabilizan los intrones del ARNm, y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos también puede comprender una secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, puede estar codificada una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas formas de realización de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y que se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989), o una etiqueta del péptido HA (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), ambas que pueden ser útiles en la purificación de una secuencia polipeptídica fusionada a ellas. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no están limitados a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas de forma natural que controlan la expresión del gen.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB118 de la SEQ ID NO: 2 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polipéptido contenida en los nucleótidos 1 a 1158 de la SEQ ID NO: 1. Alternativamente puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa en el presente documento engloba polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido BASB118 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. El término también engloba polinucleótidos que incluyen una única región continúa o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de un vector integrado, una secuencia de un trasposón integrado, o debido a la edición del ARN o la reorganización del ADN genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

Se pueden usar fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de la invención de longitud completa.

Formas de realización adicionales particularmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes de
BASB118, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB118 de la SEQ ID NO: 2 en la que de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo aminoácido están sustituidos, modificados, delecionados y/o añadidos, en cualquier combinación. Especialmente preferidas entre éstas están las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB118.

Formas de realización adicionales preferidas de la invención son polinucleótidos que son al menos el 85% idénticos sobre su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB118 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, y polinucleótidos que son complementarios a esos polinucleótidos. Alternativamente, mucho más preferidos son los polinucleótidos que comprenden una región que es al menos un 90% idéntica sobre su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB118 y polinucleótidos complementarios a ella. En este aspecto, son particularmente preferidos polinucleótidos al menos un 95% idénticos sobre su longitud completa a la misma. Además, aquellos con al menos el 97% son muy preferidos entre aquellos con al menos el 95%, y entre éstos, aquellos con al menos el 98% y al menos el 99% son muy particularmente preferidos, siendo el más preferido aquél con al menos el 99%.

Formas de realización preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de la SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con ciertas formas de realización preferidas de la invención se proporcionan polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas, a secuencias del polinucleótido BASB118, tales como el polinucleótido en la SEQ ID NO: 1.

La invención se refiere adicionalmente a polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a los polinucleótidos descritos en el presente documento. Como se usan en el presente documento, los términos "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas" significan que la hibridación se produce sólo si hay una identidad de al menos el 95% y preferentemente de al menos el 97% entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación rigurosas es la incubación durante toda la noche a 42ºC en una disolución que comprende: formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), disolución de Denhardt 5x, dextranosulfato al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón digerido y desnaturalizado, seguido por el lavado del soporte de hibridación en 0,1x SSC a 65ºC aproximadamente. Las condiciones de hibridación y lavado son muy conocidas y están ejemplificadas en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente en el capítulo 11 de ese manual. También se puede usar hibridación en disolución con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

La invención también proporciona un polinucleótido que consta de o que comprende una secuencia de polinucleótidos obtenida mediante la selección de una librería apropiada que contiene el gen completo para una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o uno de sus fragmentos; y el aislamiento de dicha secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para la obtención de ese polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores descritos en profundidad en el presente documento.

Como se describe en el presente documento en lo que respecta a ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención se pueden usar como sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB118 y para aislar ADN y clones genómicos de otros genes que tienen una elevada identidad, particularmente una elevada identidad de secuencia, con el gen BASB118. Esas sondas generalmente comprenderán al menos 15 residuos nucleótidos o pares de bases. Preferentemente, esas sondas tendrán al menos 30 residuos nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos nucleótidos o pares de bases. Sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 residuos nucleótidos o pares de bases y tendrán menos de 30 residuos nucleótidos o pares de bases.

Se puede aislar una región codificante de un gen BASB118 por selección usando una secuencia de ADN proporcionada en la SEQ ID NO: 1 para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. A continuación se usa un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la del gen de la invención para seleccionar una librería de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de la librería se hibrida la sonda.

Hay varios procedimientos disponibles y muy conocidos por aquellos expertos en la materia para obtener ADN de longitud completa, o ADN cortos extendidos, por ejemplo, aquellos basados en el método de la amplificación rápida de los extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, ejemplificada por la tecnología Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de los ADNc más largos, en la tecnología Marathon^{TM}, los ADNc han sido preparados a partir de ARNm extraído de un tejido seleccionado y se ha ligado una secuencia "adaptadora" a cada extremo. A continuación se lleva a cabo la amplificación de los ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "perdido" del ADN usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos del gen y específicos del adaptador. A continuación se repite la reacción de PCR usando cebadores "anidados", esto es, cebadores diseñados para hibridarse dentro del producto amplificado (normalmente un cebador específico adaptador que se híbrida más allá de 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico del gen que se hibrida más allá de 5' en la secuencia génica seleccionada). A continuación los productos de esta reacción se pueden analizar mediante la secuenciación del ADN y se puede construir un ADN de longitud completa uniendo el producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa, o llevando a cabo una PCR de longitud completa aparte usando la nueva información de la secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden emplear, por ejemplo, como reactivos de investigación y materiales para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos de enfermedades, particularmente enfermedades humanas, como se describe en profundidad en el presente documento en relación a los ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de la SEQ ID NO: 1 se pueden usar en los procedimientos del presente documento como se ha descrito, pero preferentemente para la PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en el presente documento se transcriben completamente o en parte en bacterias en tejido infectado, o no. Se reconoce que esas secuencias también tendrán utilidad en el diagnóstico de la fase de infección que ha alcanzado el patógeno y del tipo de infección.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos amino o carboxilo-terminales, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Estas secuencias pueden desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína a partir de un precursor hasta una forma madura, pueden permitir el transporte de la proteína, pueden alargar o acortar la semi-vida de la proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como generalmente es el caso in vivo, los aminoácidos adicionales se pueden eliminar de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario a él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean completamente complementarios a cada polinucleótido a los que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionado a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando las prosecuencias se eliminan, esos precursores inactivos generalmente se activan. Algunas o todas las prosecuencias se pueden eliminar antes de la activación. Generalmente, esos precursores se denominan proproteínas.

Además de las representaciones normales de A, G, C, T/U para los nucleótidos, también se puede usar el término "N" en la descripción de ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en esa posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con nucleótidos en posiciones adyacentes, cuando se lee en el marco de lectura correcto, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematuro en ese marco de lectura.

En suma, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (que se puede denominar como una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son las secuencias líder de una preproteína, o una preproproteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante las etapas de procesamiento que producen las formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para fines terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética preferentemente empleará un procedimiento de administración adecuado, como inyección directa de un plásmido de ADN en los músculos (Wolff y col., Hum Mol Genet (1992) 1: 363. Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), administración de ADN complejado con portadores de proteínas específicos (Wu y col., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty & Reshef. PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356:152. Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col., PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vectores, células hospedadoras, sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células hospedadoras que están genéticamente modificadas con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. También se pueden emplear sistemas de traducción libres de células para producir esas proteínas usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos muy conocidos por aquellos expertos en la materia a partir de células hospedadoras modificadas genéticamente que comprenden sistemas de expresión. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células hospedadoras que están modificadas genéticamente con esos sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células hospedadoras se pueden modificar genéticamente para que incorporen sistemas de expresión o sus fracciones o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en una célula hospedadora se puede realizar mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio habituales, tales como Davis y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY. (1986) y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. N.Y. (1989), tales como, transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por raspado, introducción balística e infección.

Ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, Streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células de hongos, tales como células de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células de plantas, tales como células de gimnospermas y angiospermas.

Se pueden usar una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Esos vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosomas, de episomas, y de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de trasposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de sus combinaciones, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener regiones control que regulan y originan la expresión. En general, en este aspecto para la expresión se puede usar cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un hospedador. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias muy conocidas, tales como, por ejemplo, aquellas expuestas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL. (supra).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida al lumen del retículo endoplasmático, al espacio periplasmático o al entorno extracelular se pueden incorporar señales de secreción apropiadas al polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden recuperar y purificar de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos muy conocidos que incluyen precipitación con sulfato o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Más preferentemente, se emplea la cromatografía de afinidad con ion-metal (IMAC) para la purificación. Se pueden emplear técnicas muy conocidas para replegar proteínas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, el aislamiento y/o la purificación.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación e infección in vivo con este vector vivo dará lugar a la expresión in vivo del antígeno y la inducción de respuestas inmunitarias. Los virus y bacterias usados para este propósito son, por ejemplo, poxvirus (por ejemplo, virus de la vacuna, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario), alfavirus (virus de Sindbis, virus del bosque de Semliki, virus de la encefalitis equina de Venezuela), adenovirus, virus asociados a adenovirus, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus de la varicela zoster, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o pueden estar atenuados de diversas formas para obtener vacunas vivas. Esas vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos diagnósticos, pronósticos, serotipado y ensayos de mutación

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB118 de la invención para su uso como reactivos diagnósticos. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB118 en una muestra biológica proporcionará un procedimiento diagnóstico para el diagnóstico de la enfermedad, de la fase de la enfermedad o la respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Las muestras biológicas procedentes de eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente seres humanos, particularmente aquellos infectados o que se sospecha que están infectados con un organismo que comprende un gen o proteína BASB118, se pueden detectar a nivel de los ácidos nucleicos o de los aminoácidos mediante una variedad de técnicas muy conocidas, así como mediante procedimientos proporcionados en el presente documento.

Los polipéptidos y polinucleótidos para la prognosis, diagnosis u otro análisis se pueden obtener a partir de materiales corporales infectados putativamente y/o de individuos infectados. Los polinucleótidos procedentes de cualquiera de estas fuentes, particularmente el ADN o el ARN, se pueden usar directamente para la detección o se pueden amplificar enzimáticamente mediante el uso de PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. También se pueden usar ARN, particularmente ARNm, ADNc, y ADN genómico de la misma forma. Usando la amplificación, se puede llevar a cabo la caracterización de la especie y la cepa del organismo infeccioso o residente presente en un individuo, mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las deleciones e inserciones se pueden detectar por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada procedente de un organismo relacionado, preferentemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales se pueden identificar hibridando el ADN amplificado a secuencias de polinucleótidos BASB118 marcadas. Las secuencias perfecta o significativamente apareadas se pueden distinguir de los duplex apareados de manera imperfecta o más significativamente desapareados por digestión con DNasa o RNasa, para el ADN o el ARN respectivamente, o detectando diferencias en las temperaturas de fusión o en las cinéticas de renaturalización. Las diferencias en la secuencia de polinucleótidos también se pueden detectar por alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótidos en geles comparada con una secuencia de referencia. Esto se puede llevar a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias en los polinucleótidos también se pueden detectar por secuenciación directa del ADN o el ARN. Véase, por ejemplo, Myers y col., Science. 230: 1242 (1985). Los cambios de secuencia en localizaciones específicas también se pueden revelar mediante ensayos de protección de nucleasas, tales como el ensayo de protección de la RNasa V1 y S1 o un procedimiento de escisión química. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 85: 4397-4401 (1985).

En otra forma de realización, se puede construir un biochip de sondas de oligonucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos BASB118 o sus fragmentos para realizar una selección eficiente de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de la tecnología con biochips son muy conocidos y tienen aplicabilidad general y se pueden usar para abordar una variedad de cuestiones en genética molecular incluyendo la expresión de genes, la ligazón genética y la variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science. 274: 610 (1996)).

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos diagnósticos. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferentemente, la SEQ ID NO: 1 que está asociada a una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta diagnóstica que se puede añadir a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico del transcurso de una enfermedad, la determinación de una fase de la enfermedad, o la susceptibilidad a una enfermedad, que resulta de la infra-expresión, sobre-expresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente organismos infecciosos, que portan mutaciones en ese polinucleótido se pueden detectar a nivel del polinucleótido mediante una variedad de técnicas, tales como aquellas descritas en el presente documento.

Las células de un organismo que portan mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención también se pueden detectar a nivel del polinucleótido o del polipéptido mediante una variedad de técnicas, para permitir, por ejemplo, el serotipado. Por ejemplo, se puede usar RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Es particularmente preferido usar RT-PCR junto con sistemas de detección automatizados, tales como, por ejemplo, GeneScan. También se puede usar ARN, ADNc o ADN genómico para el mismo propósito. Como ejemplo, se pueden usar cebadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB118 para identificar y analizar mutaciones.

La descripción además proporciona cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3'. Estos cebadores se pueden usar, entre otras cosas, para amplificar ADN y/o ARN de BASB118 aislado a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores se pueden usar para amplificar un polinucleótido aislado procedente de un individuo infectado, de manera que el polinucleótido se pueda someter a continuación a diversas técnicas para la elucidación de la secuencia de polinucleótidos. De esta forma, se pueden detectar las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos y se pueden usar para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su fase o su evolución, o para serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención además proporciona un procedimiento para el diagnóstico de una enfermedad, preferentemente infecciones bacterianas, más preferentemente infecciones provocadas por Moraxella catarrhalis, que comprende la determinación a partir de una muestra procedente de un individuo tal como un material corporal, de un nivel de expresión incrementado del polinucleótido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 1. La expresión incrementada o reducida de un polinucleótido BASB118 se puede medir usando cualquiera de los procedimientos muy conocidos en la materia para la cuantificación de polinucleótidos tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de RNasa, transferencia de Northern, espectrometría y otros métodos de hibridación.

Además, se puede usar un ensayo diagnóstico de acuerdo con la invención para la detección de la sobreexpresión de un polipéptido BASB118 comparada con muestras de tejido control normal para detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar los niveles de un polipéptido BASB118, en una muestra procedente de un hospedador, tal como un material corporal, son muy conocidas por aquellos expertos en la materia. Esos procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western, ensayos de sándwich con anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos de ELISA.

Los polinucleótidos de la invención se pueden usar como componentes de biochips de polinucleótidos, preferentemente biochips o matrices de alta densidad. Estos biochips de alta densidad son particularmente útiles para fines diagnósticos y pronósticos. Por ejemplo, se puede usar para el ensayo con sondas un grupo de puntos, cada uno que comprende un gen diferente, y que comprenden adicionalmente un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, tal como el uso de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos, usando una sonda obtenida o derivada de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia de polinucleótidos particular o una secuencia relacionada en un individuo. Esa presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser útil en el diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad o de la evolución de una enfermedad. Se prefiere una matriz que comprende una serie de variantes de la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1. También se prefiere una matriz que comprende una serie de variantes de una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia del polipéptido de la SEQ ID NO: 2.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o sus variantes o células que los expresan se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para dichos polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen sustancialmente mayor afinidad por los polipéptidos de la invención que su afinidad por otros polipéptidos relacionados de la técnica anterior.

En ciertas formas de realización preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB118.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención se pueden obtener administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención o fragmentos portadores de epítopos de cualquiera de los dos o de ambos, análogos de cualquiera de los dos o de ambos, o células que expresan cualquiera de los dos o ambos, a un animal, preferentemente no humano, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica conocida en la materia que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como aquellas en Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975): Kozbor y col., Immunulogy Today 4: 72 (1983): Cole y col., pg. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss. Inc. (1985).

Se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de EE.UU. Nº 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla para polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. Además, se pueden usar ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Alternativamente, se puede utilizar la tecnología de presentación en fagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos procedentes de seres humanos seleccionados por poseer librerías anti-BASB118 o de librerías naif (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos también se puede mejorar mediante, por ejemplo, intercambio de cadenas (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden emplear para aislar o identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Así, se pueden emplear, entre otros, anticuerpos contra el polipéptido BASB118 o el polinucleótido BASB118 para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes polipeptídicas que incluyen variantes antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalentes forman un aspecto particular de esta invención.

Preferentemente, el anticuerpo o una de sus variantes se modifica para hacerlo menos inmunógeno en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es un ser humano, el anticuerpo puede estar, lo más preferentemente, "humanizado", en el que la región o regiones determinantes de complementaridad del anticuerpo derivado del hibridoma ha sido transplantada a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, como se describe en Jones y col. (1986) Nature 321, 512-525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

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Antagonistas y agonistas - Ensayos y moléculas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención también se pueden usar para valorar la unión de sustratos y ligandos de moléculas pequeñas en, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, librerías químicas y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1(2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que llevan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido por medio de un marcador directa o indirectamente asociado al compuesto candidato. Alternativamente, el procedimiento de selección puede implicar la competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden someter a ensayo si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de la activación generalmente se someten a ensayo en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación por el agonista por la presencia del compuesto candidato. Se pueden emplear polipéptidos constitutivamente activos y/o polipéptidos y polinucleótidos expresados constitutivamente en los procedimientos de selección para agonistas inversos o inhibidores en ausencia de un agonista o un inhibidor, sometiendo a ensayo si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido según sea el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezcla de un compuesto candidato con una disolución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, midiendo la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB118 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB118 de la mezcla con un patrón. Las proteínas de fusión, tales como aquellas preparadas a partir de la porción Fc y el polipéptido BASB118, como se ha descrito anteriormente, también se pueden usar para ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos filogenética y/o funcionalmente relacionados (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); y K. Johanson y col., J Biol Chem. 270(16):949-9471 (1995)).

Los polinucleótidos/polipéptidos y los anticuerpos que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido de la presente invención también se pueden usar para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o del polipéptido en células. Por ejemplo, se puede construir un ensayo ELISA para medir los niveles de polipéptido secretados o asociados a la célula usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos habituales conocidos en la materia. Esto se puede usar para descubrir agentes que puedan inhibir o aumentar la producción de polipéptido (también denominados antagonistas o agonistas, respectivamente) a partir de células o tejidos convenientemente manipulados.

Nosotros describimos un procedimiento de selección de compuestos para identificar aquellos que aumentan (agonista) o bloquean (antagonista) la acción de los polipéptidos o polinucleótidos BASB118, particularmente aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede involucrar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción sintética, un compartimento celular, tal como una membrana, envuelta celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de ellos, que comprende el polipéptido BASB118 y un sustrato o ligando marcado de ese polipéptido se incuba en ausencia o en presencia de una molécula candidato que puede ser un agonista o antagonista de BASB118. La capacidad de la molécula candidato para agonizar o antagonizar el polipéptido BASB118 se refleja en la unión reducida del ligando marcado o la producción reducida de producto a partir de ese sustrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB118 muy probablemente sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, según sea el caso, incrementan la tasa de producción del producto a partir del sustrato, incrementan la transducción de señales, o incrementan la actividad de los canales químicos son agonistas. La detección de la tasa o nivel de, según sea el caso, producción de producto a partir de sustrato, transducción de señales, o actividad de los canales químicos se puede mejorar usando un sistema informador. Los sistemas informadores que pueden ser útiles en este aspecto incluyen, pero no están limitados a, sistemas colorimétricos, sustratos marcados convertidos en producto, un gen informador que sea sensible a cambios en la actividad del polinucleótido o polipéptido BASB118, y ensayos de unión conocidos en la materia.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas BASB118 es un ensayo competitivo que combina BASB118 y un agonista potencial con moléculas que se unen a BASB118, moléculas que se unen a BASB118 recombinante, sustratos o ligandos naturales, o miméticos de sustratos o ligandos, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El BASB118 puede estar marcado, tal como por radiactividad o con un compuesto colorimétrico, tal que el número de moléculas BASB118 unidas a una molécula de unión o convertidas en productos se puede determinar de manera precisa para valorar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otras moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención e inhiben o extinguen de esta forma su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo íntimamente relacionado que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin la inducción de actividades inducidas por BASB118, evitando así la acción o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB118 excluyendo a polipéptidos y/o polinucleótidos BASB118 de la unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido evitando así la unión a moléculas de unión celulares, de manera que se evita una actividad biológica normal. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitadas a, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas de tipo peptídico. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560(1991): OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB118.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles genéticamente modificadas que comprenden un polipéptido de la presente invención, o uno de sus fragmentos, y diversas porciones de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina preferida está la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una forma de realización particular, la parte Fc se puede eliminar simplemente con la incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor de coagulación sanguíneo Xa.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética, y a su uso para la selección de fármacos, el diagnóstico y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión. Ejemplos de la tecnología de proteínas de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente internacional Nº WO94/29458 y WO94/22914.

Cada una de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en el presente documento se puede usar en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, después de la expresión, se puede usar como diana para la selección de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, las secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones aminoterminales de la proteína codificada o las secuencias Shine-Dalgarno u otras secuencias que facilitan la traducción de los respectivos ARNm se pueden usar para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificante de interés.

La descripción también proporciona el uso del polipéptido o polinucleótido de la invención y nosotros describimos agonistas y antagonistas identificados usando dicho polipéptido o polinucleótido para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un hospedador eucariota, preferentemente mamífero, responsable de las secuelas de la infección. En particular, las moléculas de la invención se pueden usar: en la prevención de la adhesión de la bacteria, en particular bacterias gram-positiva y/o gram-negativa, a proteínas de la matriz extracelular de eucariotas, preferentemente de mamíferos, en dispositivos permanentes o a proteínas de la matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de la matriz extracelular de eucariotas, preferentemente de mamíferos, y proteínas BASB118 bacterianas que median en el daño tisular y/o; para bloquear la progresión normal de la patogénesis en infecciones iniciadas por otro motivo distinto a la implantación de dispositivos permanentes o por otras técnicas quirúrgicas.

Nosotros describimos agonistas y antagonistas de BASB118, preferentemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas se pueden emplear, por ejemplo, para evitar, inhibir y/o tratar enfermedades.

La descripción se refiere a mimótopos del polipéptido de la invención. Un mimótopo es una secuencia peptídica, suficientemente similar al péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que puede ser reconocido por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es capaz de expandir los anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se acopla a un vehículo adecuado.

Los mimótopos peptídicos se pueden diseñar para un propósito particular por adición, deleción o sustitución de aminoácidos seleccionados. Así, los péptidos se pueden modificar con el fin de facilitar la conjugación a una proteína portadora. Por ejemplo, para algunos procedimientos de conjugación química puede ser deseable incluir una cisteína terminal. Además, puede ser deseable para péptidos conjugados a una proteína portadora incluir un término hidrófobo distal del término conjugado del péptido, de manera que el extremo libre sin conjugar del péptido permanezca asociado a la superficie de la proteína portadora. El péptido se presenta así en una conformación que se asemeja mucho a la del péptido encontrado en el contexto de la molécula nativa completa. Por ejemplo, los péptidos se pueden alterar para tener una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-terminal. Alternativamente, se puede llevar a cabo la adición o sustitución de una forma del D-esteroisómero de uno o más de los aminoácidos para crear un derivado beneficioso, por ejemplo, para mejorar la estabilidad del péptido.

Alternativamente, se pueden identificar mimótopos peptídicos usando anticuerpos que son capaces por ellos mismos de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como la tecnología de presentación en fagos (documento EP 0552267B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias peptídicas que mimetizan la estructura de los péptidos nativos y son, por tanto, capaces de unirse a anticuerpos anti-péptido nativo, pero ellos mismos no necesariamente comparten una homología de secuencia significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferentemente un ser humano, capaz de tener inducida en él una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en ese individuo a un polinucleótido BASB118 y/o polipéptido codificado a partir de él, en el que la composición comprende un polinucleótido BASB118 recombinante y/o polipéptido codificado a partir de él y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB118, polipéptido codificado a partir de él, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica se puede usar terapéutica o profilácticamente y puede adoptar la forma de inmunidad por anticuerpos y/o inmunidad celular, esa inmunidad celular que se genera en células CTL o células T CD4+.

Un polipéptido BASB118 o uno de sus fragmentos se puede fusionar a una co-proteína o resto químico que puede producir por sí mismo, o no, anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunógenas, y preferentemente propiedades protectoras. Así, la proteína recombinante fusionada, preferentemente comprende de manera adicional una co-proteína antigénica, tal como la lipoproteína D de Haemophilus influenzae, glutatión-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra co-proteína relativamente grande que solubilice la proteína y facilite su producción y purificación. Además, la co-proteína puede actuar como adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmunitario del organismo que recibe la proteína. La co-proteína puede estar unida a cualquiera del amino- o carboxi-término de la primera proteína.

En una composición de vacuna según la invención, un polipéptido y/o polinucleótido BASB118 o un fragmento, o un mimótopo, o una de sus variantes puede estar presente en un vector, tal como los vectores vivos recombinantes descritos anteriormente, por ejemplo, vectores bacterianos vivos.

También son adecuados vectores no vivos para el polipéptido BASB118, por ejemplo, vesículas de la membrana externa bacteriana o "vesículas". Las vesículas del la ME derivan de la membrana externa de la membrana de dos capas de bacterias gram-negativa y han sido documentadas en muchas bacterias gram-negativa (Zhou, L y col. 1998. FEMS Microbiol Lett. 163:223-228) incluyendo C. trachomatis y C. psittaci. Una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos de los que se ha informado que producen vesículas también incluye: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica.

Las vesículas presentan la ventaja de proporcionar proteínas de membrana externa en su conformación nativa y así son particularmente útiles para vacunas. Las vesículas también se pueden mejorar para su uso en vacunas por manipulación genética de la bacteria para así modificar la expresión de una o más moléculas en la membrana externa. Así, por ejemplo, se puede introducir o regular hacia arriba la expresión de una proteína inmunógena deseada en la membrana externa, tal como el polipéptido BASB118 (por ejemplo, alterando el promotor). En vez de esto, o además, se puede regular hacia abajo la expresión de moléculas de la membrana externa que no son relevantes (por ejemplo antígenos no protectores o inmunodominantes, excepto proteínas variables) o perjudiciales (por ejemplo, moléculas tóxicas tales como el LPS o inductores potenciales de una respuesta autoinmunitaria). Estos enfoques se describen con mayor detalle a continuación.

Las regiones flanqueantes no codificantes del gen BASB118 contienen elementos reguladores importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel transcripcional como traduccional. La secuencia de estas regiones aguas arriba o aguas abajo del marco de lectura abierto del gen, y se puede obtener secuenciando el ADN. Esta información de la secuencia permite la determinación de motivos reguladores potenciales tales como los diferentes elementos promotores, secuencias terminadoras, elementos de secuencia inducibles, represores, elementos responsables de la variación de fase, la secuencia Shine-Dalgarno, regiones con estructura secundaria potencial involucradas en la reputación, así como otros tipos de motivos o secuencias reguladoras. Esta secuencia es un aspecto adicional de la invención.

Esta información de la secuencia permite la modulación de la expresión natural del gen BASB118. La regulación hacia arriba de la expresión del gen se puede conseguir alterando el promotor, la secuencia Shine-Dalgarno, elementos represores u operadores potenciales o cualquier otro elemento involucrado. Asimismo, la regulación hacia abajo de la expresión se puede conseguir mediante tipos de modificación similares. Alternativamente, cambiando las secuencias de variación de fase, la expresión del gen se puede poner bajo el control de la variación de fase, o se puede desacoplar de esta regulación. En otra aproximación, la expresión del gen se puede poner bajo el control de uno o más elementos inducibles que permitan una expresión regulada. Ejemplos de esa regulación incluyen, pero no están limitados a, inducción por adición de un desplazamiento de la temperatura de sustratos inductores como carbohidratos seleccionados por sus oligoelementos derivados, vitaminas, cofactores, iones metálicos, etc.

Modificaciones como las descritas anteriormente se pueden introducir por diversos medios diferentes. La modificación de secuencias involucradas en la expresión génica se puede llevar a cabo in vivo por mutagénesis aleatoria seguido de la selección para el fenotipo deseado. Otra aproximación consiste en el aislamiento de la región de interés y su modificación por mutagénesis aleatoria, o sustitución dirigida de sitio, mutagénesis de inserción o de deleción. A continuación la región modificada se puede volver a introducir en el genoma bacteriano por recombinación homóloga, y se puede valorar el efecto sobre la expresión del gen. En otra aproximación, el conocimiento de la secuencia de la región de interés se puede usar para remplazar o eliminar todas o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora dirigida se aísla y se modifica para contener los elementos reguladores de otro gen, una combinación de elementos reguladores de diferentes genes, una región reguladora sintética, o cualquier otra región reguladora, o para eliminar partes seleccionadas de las secuencias reguladoras silvestres. A continuación estas secuencias modificadas se pueden volver a introducir en la bacteria mediante recombinación homóloga en el genoma. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos que se pueden usar para la regulación hacia arriba de la expresión génica incluyen los promotores porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae; ompCD, copB, IbpB, ompE, UspA1; UspA3; TbpB de M. catarrhalis; p1, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 de H. influenzae.

En un ejemplo, la expresión del gen se puede modular intercambiando su promotor con un promotor más fuerte (mediante el aislamiento de la secuencia aguas arriba del gen, la modificación in vitro de esta secuencia, y la reintroducción en el genoma por recombinación homóloga). La expresión regulada hacia arriba se puede obtener tanto en la bacteria como en las vesículas de la membrana externa desprendidas (o preparadas) de la bacteria.

En otros ejemplos, los enfoques descritos se pueden usar para generar cepas bacterianas recombinantes con características mejoradas para sus aplicaciones como vacuna. Éstas pueden ser, pero no están limitadas a, cepas atenuadas, cepas con expresión incrementada de antígenos seleccionados, cepas con knockouts (o expresión reducida) de genes que interfieren con la respuesta inmunitaria, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con desprendimiento modulado de vesículas de la membrana externa.

Así, la descripción también proporciona una región aguas arriba modificada del gen BASB118, cuya región aguas arriba modificada contiene un elemento regulador heterólogo que altera el nivel de expresión de la proteína BASB118 localizada en la membrana externa. La región aguas arriba incluye la secuencia aguas arriba del gen BASB118. La región aguas arriba comienza inmediatamente aguas arriba del gen BASB118 y normalmente continúa hasta una posición no más allá de 1000 pb aproximadamente del gen desde el codón de iniciación ATG. En el caso de un gen localizado en una secuencia policistrónica (operón), la región aguas arriba puede comenzar precediendo inmediatamente el gen de interés, o precediendo el primer gen en el operón. Preferentemente, una región aguas arriba modificada contiene un promotor heterólogo en una posición entre 500 y 700 pb aguas arriba del codón ATG.

La invención proporciona adicionalmente vectores de ácidos nucleicos que comprenden el gen BASB118 que tiene una región aguas arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

La presente invención también proporciona composiciones, particularmente composiciones de vacuna que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como aquellas descritas en Sato, Y. y col., Science 273: 352 (1996).

Además, la descripción proporciona procedimientos que usan el polinucleótido descrito o sus fragmentos particulares, que se ha demostrado que codifican regiones no variables de proteínas de la superficie celular de bacterias, en construcciones de polinucleótidos usados en esos experimentos de inmunización genética en modelos animales de infección con Moraxella catarrhalis. Esos experimentos serán particularmente útiles para la identificación de epítopos de proteínas capaces de provocar una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica. Se cree que esta aproximación permitirá la posterior preparación de anticuerpos monoclonales de valor particular derivados del órgano imprescindible del animal que resiste o aclara con éxito la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección por Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención también incluye una formulación de vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunógeno de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puesto que los polipéptidos y polinucleótidos se pueden degradar en el estómago, cada uno de ellos se administra preferentemente de manera parenteral, incluyendo por ejemplo, la administración por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para la administración por vía parenteral incluyen disoluciones estériles para inyección acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con el fluido corporal, preferentemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores o agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en contenedores de dosificación unitaria o multi-dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados y se pueden almacenar en condiciones de crio-desecación que solamente requieren la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso.

La formulación de vacuna de la invención también puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferentemente, el sistema adyuvante expande preferentemente un tipo de respuesta TH1.

Una respuesta inmunitaria se puede distinguir de manera general en dos categorías extremas, que son respuesta inmunitaria humoral o respuesta inmunitaria mediada por células (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos de protección desempeñados por anticuerpos y por células, respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas tipo TH1 (respuesta mediada por células), y respuestas inmunitarias de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunitarias tipo TH1 extremas se pueden caracterizar por la generación de respuestas con linfocitos T citotóxicos de haplotipo restringido y específicos de antígeno, y con células asesinas naturales. En ratones, las respuestas tipo TH1 a menudo se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en seres humanos éstas corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunitarias del tipo TH2 se caracterizan por la generación de un amplio espectro de isotipos de inmunoglobulinas que incluyen, en ratón, IgG1, IgA, e IgM.

Se puede considerar que la fuerza conductora detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunitarias son las citoquinas. Niveles elevados de citoquinas tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células a un antígeno dado, mientras que niveles elevados de citoquinas tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales al antígeno.

La distinción de respuestas inmunitarias tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo desarrollará una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. No obstante, a menudo es conveniente considerar las familias de citoquinas en los términos descritos en los clones de células T CD4 +ve T murinas por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7. p. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo TH1 están asociadas a la producción de las citoquinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas a menudo directamente asociadas con la inducción de respuestas inmunitarias de tipo TH1 no son producidas por células T, tales como IL-12. En contraste, las respuestas de tipo TH2 están asociadas a la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Es sabido que ciertos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de las respuestas de citoquinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmunitaria después de una vacunación o infección incluyen mediciones directas de la producción de citoquinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de la reestimulación con antígeno, y/o la medición de la relación IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpos específicos de antígeno.

Así, un adyuvante tipo TH1 es uno que estimula preferentemente poblaciones de células T aisladas para producir niveles elevados de citoquinas tipo TH1 cuando se re-estimulan con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuestas de inmunoglobulinas específicas de antígeno asociadas al isotipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de una estimulación preferente de la respuesta celular TH1 se describen en la solicitud de patente internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209.

El monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) es uno de esos adyuvantes. Éste se conoce del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente, es una mezcla de monofosforil lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y es fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida del monofosforil lípido A 3-des-O-acilado se describe en la patente europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Preferentemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para ser esterilizadas por filtración a través de una membrana de 0,22 \mum (patente europea Nº 0 689 454). El 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug-100 \mug, preferentemente de 25-50 \mug por dosis en la que el antígeno normalmente estará presente en un intervalo de 2-50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, éste se puede mezclar con monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.057.540.

Formulaciones adyuvantes no reactógenas que contienen QS21 han sido descritas previamente (documento WO 96/33739). Esas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han demostrado ser adyuvantes que estimulan con éxito la respuesta TH1 cuando se formulan junto con un antígeno.

Adyuvantes adicionales que son estimuladores preferentes de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias CpG sin metilar como se describe en el documento WO 96/02555.

También se contemplan las combinaciones de diferentes adyuvantes que estimulan la respuesta TH1, tales como aquellos mencionados anteriormente, para que proporcionen un adyuvante que sea un estimulador preferente de la respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 se puede formular junto con 3D-MPL. La relación de QS21:3D-MPL normalmente será del orden de 1:10 a 10:1; preferentemente de 1:5 a 5:1 y a menudo de manera sustancial de 1:1. El intervalo preferido para la sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.

Preferentemente, según la invención también está presente un vehículo en la composición de vacuna. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna según la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en esa emulsión. Adicionalmente, la emulsión de aceite en agua puede contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Normalmente, para la administración a seres humanos, QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el intervalo de 1 \mug - 200 \mug, tal como 10 - 100 \mug, preferentemente 10 \mug - 50 \mug por dosis. Normalmente, la emulsión de aceite en agua comprenderá entre el 2 y el 10% de escualeno, entre el 2 y el 10% de alfa-tocoferol y entre el 0,3 y el 3% de Tween 80. Preferentemente la relación de escualeno:alfa-tocoferol es igual o inferior a 1 puesto que esto proporciona una emulsión más estable. El Span 85 también puede estar presente a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan un estabilizante adicional.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas preferentemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo, escualano o escualeno, un emulsionante, por ejemplo, Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, tampón fosfato salino.

Una formulación adyuvante particularmente potente que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La presente invención también proporciona una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para el tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunitarias y dolencias relacionadas. Esa composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante que induzca una respuesta TH1 como se ha descrito anteriormente. En una forma de realización la composición de vacuna comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB118, se debe entender que cubre fragmentos de origen natural de los polipéptidos y polinucleótidos, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones que no afecten sustancialmente a las propiedades inmunógenas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

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Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB118 y/o un polipéptido BASB118 para la administración a una célula o un organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido descrito en el presente documento. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden emplear en combinación con un vehículo o vehículos estériles o no estériles, para su uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Esas composiciones comprenden, por ejemplo, un medio aditivo o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Esos vehículos pueden incluir, pero no están limitados a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y sus combinaciones. La formulación se debe ajustar al modo de administración. La invención se refiere adicionalmente a paquetes y kits diagnósticos y farmacéuticos que comprenden uno o más contenedores rellenos con uno o más de los principios de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier forma eficaz y conveniente que incluye, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo en forma de composición inyectable, por ejemplo, en forma de dispersión acuosa estéril, preferentemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Esos vehículos incluyen, pero no están limitados a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y sus combinaciones. La invención se refiere adicionalmente a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más contenedores rellenos con uno o más de los principios de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo, por vía sistémica o vía oral. Formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, normalmente inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías para inyección, tales como vía subcutánea, intramuscular, o intraperitoneal. Medios alternativos para la administración sistémica incluyen administración transmucosa y transdérmica usando agentes penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos y otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención se pueden formular en una formulación entérica o encapsulada, también puede ser posible la administración por vía oral. La administración de estos compuestos también puede ser por vía tópica y/o localizada, en forma de ungüentos, pastas, geles, disoluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos, y particularmente seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diario del agente activo esté entre 0,01 mg/kg y 10 mg/kg, normalmente en torno a 1 mg/kg. En cualquier caso, el facultativo determinará la dosificación real que será la más adecuada para individuo y variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplos del caso promedio. Naturalmente, puede haber casos individuales en los que se requieren niveles superiores o inferiores de dosificación, y eso está dentro del alcance de esta invención.

El intervalo de dosificación necesaria depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la dolencia del sujeto, y el juicio del facultativo que atiende. No obstante, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg de peso corporal del sujeto.

Una composición de vacuna está de manera conveniente en forma inyectable. Se pueden emplear adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación es de 0,5-5 \mug/kg de antígeno, y esa dosis preferentemente se administra 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de dosificación indicado, no se observarán efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención que impedirían su administración a individuos adecuados.

No obstante, se deben esperar amplias variaciones en las dosificaciones necesitadas en vista de la variedad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, se espera que la administración por vía oral requiera dosificaciones superiores que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas habituales para su optimización, como es bien sabido en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible, y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos forman una fuente de información valiosa con la que determinar sus estructuras bi- y tridimensionales así como para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estos enfoques se facilitan mucho almacenando la secuencia en un medio legible en ordenador y usando a continuación los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para buscar en una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda muy conocidas, tales como el paquete de programas GCG.

Los investigadores describimos procedimientos para el análisis del carácter de secuencias o cadenas, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de la homología de secuencias, tales como análisis de identidad y de similitud, análisis de la estructura del ADN, ARN y proteínas, ensamblaje de secuencias, análisis cladístico, análisis del motivo de secuencias, determinación del marco de lectura abierto, llamada a las bases de ácidos nucleicos, análisis del uso de codones, recorte de bases de ácidos nucleicos, y análisis del pico del cromatograma de secuenciación.

Se proporciona un procedimiento basado en ordenador para llevar a cabo la identificación de la homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia del polinucleótido con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos para identificar su homología.

También se proporciona un procedimiento basado en ordenador para llevar a cabo la identificación de la homología, dicho procedimiento que comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia del polipéptido con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos para identificar su homología.

Definiciones

"Identidad", como es conocido en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según sea el caso, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, como se determina por el emparejamiento entre cadenas de esas secuencias. La "identidad" se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos, incluyendo sin limitación, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data. Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G.; eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine. G., Academic Press. 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman. D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar el emparejamiento más largo entre las secuencias probadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad están codificados en programas de ordenador disponibles para el público. Procedimientos con programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, el programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux. J., y col., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. y col., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente en el NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda. MD 20894; Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). También se puede usar el conocido algoritmo Smith Waterman para determinar la identidad.

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Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch. J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

Penalización de la separación: 8

Penalización de la longitud de separación: 2

Un programa útil con estos parámetros está disponible para el público como programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para la comparación de péptidos (junto con "sin penalización" para la separación de los extremos).

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Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch. J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: emparejamientos = +10, desemparejamientos = 0

Penalización de la separación: 50

Penalización de la longitud de separación: 3

Disponible como: Programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para la comparación de ácidos nucleicos.

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Un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, según sea el caso, se proporciona en (1) y (2) a continuación.

(1) Formas de realización de polinucleótidos adicionales incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o el 100% con la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en las que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, una sustitución, incluyendo transición o transversión, o una inserción de nucleótidos, en las que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en las que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEQ ID NO: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y, restando a continuación ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEQ ID NO: 1, o:

n_{n}\leqx_{n}-(x_{n}\cdoty)

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEQ ID NO: 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de la multiplicación, y en el que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 pueden crear mutaciones sin sentido, de cambio de sentido o de desplazamiento del marco de lectura en esta secuencia codificante y alterar así el polipéptido codificado por el polinucleótido después de esas alteraciones.

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A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 1, esto es, puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad sea inferior a una identidad del 100%. Esas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, una sustitución, incluyendo transición o transversion, o una inserción de ácidos nucleicos, y en las que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID NO: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y, restando a continuación ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID NO: 1, o:

n_{n}\leqx_{n}-(x_{n}\cdoty)

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID NO: 1, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc., y \cdot es el símbolo para el operador de la multiplicación, y en el que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}.

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(2) Formas de realización de polipéptidos adicionales incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o el 100% con la secuencia del polipéptido de referencia de la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia del polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia, en las que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, una sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o una inserción de aminoácidos, y en las que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones amino- o carboxi-terminales de la secuencia del polipéptido de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en las que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y, restando a continuación ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, o:

n_{a}\leqx_{a}-(x_{a}\cdoty)

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de la multiplicación, y en el que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

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A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEQ ID NO: 2, esto es, puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad sea inferior a una identidad del 100%. Esas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, una sustitución, incluyendo sustituciones conservativas y no conservativas, o una inserción de aminoácidos, y en las que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones amino- o carboxi- terminales de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y, restando a continuación ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, o:

n_{a}\leqx_{a}-(x_{a}\cdoty)

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc., y \cdot es el símbolo para el operador de la multiplicación, y en el que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

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"Individuo(s)", cuando se usa en el presente documento en referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero no limitado a, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, ha sido cambiado o extraído de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de manera natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales con los que coexiste en su estado natural está "aislado", según se emplea el término en el presente documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" incluso si aún está presente en dicho organismo, ese organismo que puede ser un organismo vivo o no vivo.

"Polinucleótido(s)" genéricamente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado, incluyendo regiones de cadena sencilla y de doble cadena.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero retiene propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en su secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia.

Cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar, o no, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se describe a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Genéricamente, las diferencias son limitadas, de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y de la variante son, en general, muy similares y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo aminoácido sustituido o insertado puede ser, o no, uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o un polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que se produzca en la naturaleza. Variantes que no se producen de manera natural de los polinucleótidos y polipéptidos se pueden generar mediante técnicas de mutagénesis o síntesis dirigida.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad causada por o relacionada con una infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en infantes y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica y pérdida de la audición, acumulación de fluido en el oído medio, daño en el nervio auditivo, aprendizaje retardado del lenguaje, infección del tracto respiratorio superior e inflamación del oído medio.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1-A muestra un gel de SDS-poliacrilamida teñido con Coomassie de BASB118 purificado; y

la Figura 1-B muestra una transferencia de Western de BASB118 purificado (anticuerpo anti-His).

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos se llevaron a cabo usando técnicas habituales, que son muy conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, excepto cuando se describa en detalle otra cosa. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

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Ejemplo 1

Secuenciación del ADN del gen BASB118 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis

La secuencia de ADN del gen BASB118 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis (también denominada cepa MC2931) se muestra en la SEQ ID NO: 1. La traducción de la secuencia del polinucleótido BASB118 se muestra en la SEQ ID NO: 2.

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Ejemplo 2

Construcción de un plásmido para expresar BASB118 recombinante A: Clonación de BASB118

Los sitios de restricción EcoR1 y StalI introducidos por ingeniería genética en los cebadores de amplificación directo MC-Lip10-Fn/t-RI (5'-AGG CAG AGG GAA TTC ATG CAT AAA ATG TAT CCT ACT AGT A-3') [SEQ ID NO: 3] y MC-Lip10RCh/t-Sal (5'-AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG GCT TAA TCG GTG ACG CTT GGC GGT CG-3') [SEQ ID NO: 4] inverso, respectivamente, permitieron la clonación direccional de un producto de la PCR en el plásmido de expresión pTLZ2 de E. coli de manera que la proteína BASB118 madura se podía expresar en forma de proteína de fusión que contiene un marcador para cromatografía de afinidad (His)6 en el C-término. El producto de la PCR BASB118 se purificó a partir de la reacción de amplificación usando columnas centrífugas basadas en gel de sílice (QiaGen) según las instrucciones del fabricante. Para producir los términos EcoRI y SalI requeridos necesarios para la clonación, el producto purificado de la PCR se digirió secuencialmente hasta su completamiento con las enzimas de restricción EcoRI y SalI según las recomendaciones del fabricante (Life Technologies). Después de la primera digestión de restricción, el producto de la PCR se purificó a través de una columna centrífuga como anteriormente para eliminar las sales y se eluyó en agua estéril antes de la segunda digestión enzimática. El fragmento de ADN digerido se purificó de nuevo usando columnas centrífugas basadas en gel de sílice antes de la ligación con el plásmido pTLZ2.

B: Producción del vector de expresión

Para preparar el plásmido de expresión pTLZ2 para la ligación, se digirió de manera similar hasta su completamiento con ambas EcoRI y SalI y a continuación se trató con fosfatasa intestinal de ternero (CIP, \sim0,02 unidades/pmol de extremo 5', Life Technologies) como indica el fabricante para evitar la autoligación. Se usó un exceso molar de 5 veces aproximadamente del fragmento digerido al vector preparado para programar la reacción de ligación. Se llevó a cabo una reacción de ligación estándar de \sim20 \mul (\sim16ºC, \sim16 horas), usando procedimientos muy conocidos en la materia, y la ADN ligasa de T4 (\sim2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Se usó una alícuota de la ligación (\sim5 \mul) para transformar células JM 109 electro-competentes según procedimientos muy conocidos en la materia. Después de un periodo de expansión de \sim2-3 horas a 37ºC en \sim1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se pusieron en placas de agar LB que contienen ampicilina (100 \mug/ml). Se incluyó antibiótico en la selección. Las placas se incubaron durante toda la noche a 37ºC durante \sim16 horas. Se tomaron colonias ApR individuales con palillos de dientes estériles y se usaron para "pinchar" inoculado fresco en placas LB ApR así como \sim1,0 ml de cultivo en caldo LB ApR. Tanto las placas pinchadas como el cultivo en caldo se incubaron durante toda la noche a 37ºC en una incubadora estándar (placas) o en un baño de agua con agitación. Se empleó un análisis de PCR basado en células enteras para verificar los transformantes contenidos en el inserto de ADN BASB118. Aquí, el caldo LB Ap de \sim1,0 ml cultivado durante toda la noche se transfirió a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y las células se recogieron por centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (\sim3 min., temperatura ambiente, \sim12.000 X g). El sedimento celular se suspendió en \sim200 \mul de agua estéril y se usó una alícuota de \sim10 \mul para programar una reacción de PCR con un volumen final de \sim50 \mul que contiene ambos cebadores de amplificación directo e inverso de BASB118. Las concentraciones finales de los componentes de reacción de la PCR fueron esencialmente las mismas que aquellas especificadas en el ejemplo 2, excepto que se usaron \sim5,0 unidades de Taq polimerasa. La etapa de desnaturalización inicial a 95ºC se prolongó hasta los 3 minutos para asegurar la disrupción térmica de las células bacterianas y la liberación del ADN plasmídico. Se usó un termociclador ABI Model 9700 y un perfil de amplificación térmico de 32 ciclos en tres etapas, es decir, 95ºC, 45 s; 55-58ºC, 45 s, 72ºC, 1 min, para amplificar el fragmento BASB118 a partir de las muestras transformantes lisadas. Después de la amplificación térmica se analizó una alícuota de la reacción de \sim20 \mul por electroforesis en gel de agarosa (0,8% de agarosa en tampón Tris-acetato-EDTA (TAE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron por iluminación UV después de la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Un patrón de tamaños moleculares de ADN (escalera de 1 Kb, Life Technologies) se sometió a electroforesis en paralelo con las muestras de prueba y se usó para estimar el tamaño de los productos de la PCR. Los transformantes que produjeron el producto de la PCR del tamaño esperado se identificaron como cepas que contienen una construcción de expresión de BASB118. A continuación las cepas que contienen el plásmido de expresión se analizaron para la expresión inducible de BASB118 recombinante.

C: Análisis de expresión de transformantes PCR-positivos

Para cada transformante PCR-positivo identificado anteriormente, se inocularon \sim5,0 ml de caldo LB que contienen ampicilina (100 \mug/ml) con células procedentes de la placa pinchada y se creció durante toda la noche a 37ºC con agitación (\sim250 rpm). Se inoculó una alícuota del cultivo sembrado durante toda la noche (\sim1,0 ml) en un matraz Erlenmeyer de 125 ml que contiene \sim25 de caldo LB Ap y se creció a 37ºC con agitación (\sim250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una DO_{600} de \sim0,5, es decir, fase semi-log (normalmente 1,5-2,0 horas aproximadamente). En este momento aproximadamente la mitad del cultivo (\sim12,5 ml) se transfirió a un segundo matraz de 125 ml y se indujo la expresión de proteína BASB118 recombinante con la adición de IPTG (disolución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. La incubación del cultivo inducido por IPTG y el cultivo no inducido se prosiguió durante \sim4 horas más a 37ºC con agitación. Las muestras (\sim1,0 ml) de los cultivos inducido y no inducido se extrajeron después del período de inducción y las células se recogieron por centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante \sim3 minutos. Los sedimentos celulares individuales se suspendieron en \sim50 \mul de agua estéril, a continuación se mezclaron con un volumen igual de tampón de muestra 2X Laemelli SDS-PAGE que contiene 2-mercaptoetanol, y se pusieron en un baño de agua en ebullición durante \sim3 minutos para desnaturalizar las proteínas. Volúmenes iguales (\sim15 \mul) de los lisados celulares inducidos por IPTG en bruto y no inducidos se cargaron por duplicado en gel de poliacrilamida Tris/glicina al 12% (mini-geles de 1 mm de espesor, Novex). Las muestras lisadas inducidas y no inducidas se sometieron a electroforesis junto con marcadores de pesos moleculares preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de carrera SDS/Tris/glicina estándar (BioRad). Después de la electroforesis, un gel se tiñó con azul brillante de Coomassie R250 (BioRad) y a continuación se destiñó para visualizar la nueva proteína(s) BASB118 inducible por IPTG. El segundo gel se electrotransfirió sobre una membrana de PVDF (tamaño de poro de 0,45 \mum, Novex) durante \sim2 horas a 4ºC usando un aparato de transferencia BioRad Mini-Protean II y tampón de transferencia de metanol de Towbin (20%). El bloqueo de la membrana y las incubaciones con anticuerpos se llevaron a cabo según procedimientos muy conocidos en la materia. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)3, seguido por un segundo anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado a HRP (QiaGen), para confirmar la expresión y la identidad de la proteína recombinante BASB118. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His se consiguió usando un sustrato insoluble ABT o usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

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Ejemplo 3

Producción de BASB118 recombinante Cepa bacteriana

Se usó una cepa JM109 de expresión recombinante de E. coli que contiene un plásmido (pTLZ2) que codifica BASB118 de M. catarrhalis, para producir una masa de células para la purificación de proteína recombinante. La cepa de expresión se cultivó sobre placas de agar LB que contienen 100 \mug/ml de ampicilina ("Ap") para asegurarse de que se mantenía el plásmido pTLZ2. Para la criopreservación a -80ºC, la cepa se propagó en caldo LB que contiene la misma concentración de antibióticos, y a continuación se mezcló con un volumen igual de caldo LB que contiene el 30% de glicerol (p/v).

Medio

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante constaba de caldo 2X YT (Difco) que contiene 100 \mug/ml de Ap. Se añadió antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l (Antifoam 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante BASB118, se añadió IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido) al fermentador (concentración final 1 mM).

Fermentación

Un matraz Erlenmeyer de siembra de 500 ml, que contiene un volumen de trabajo de 50 ml, se inoculó con 0,3 ml de cultivo congelado descongelado rápidamente, o varias colonias procedentes de un cultivo en placa de agar selectivo, y se incubó durante 12 horas aproximadamente a 37 \pm 1ºC sobre una plataforma de agitación a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). A continuación este cultivo de siembra se usó para inocular un fermentador con un volumen de trabajo de 5 l que contiene caldo 2X YT y antibióticos Ap. El fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) se hizo funcionar a 37 \pm 1ºC, 0,2-0,4 VVM de aspersión de aire, a 250 rpm en impulsores Rushton. El pH no se controló ni en el cultivo de siembra del matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH osciló entre 6,5 y 7,3 en el fermentador. Se añadió IPTG (disolución madre 1,0 M, preparada en agua estéril) al fermentador cuando el cultivo alcanzó la fase semi-log de crecimiento (\sim0,7 unidades de DO_{600}). Las células se indujeron durante 2-4 horas y a continuación se recogieron por centrifugación usando una centrífuga 28RS Heraeus (Sepatech) o RC5C superspeed (Sorvall Instruments). La pasta de células se almacenó a -20ºC hasta que se procesó.

Productos químicos y materiales

El imidazol, clorhidrato de guanidina, (hidroximetilo), y EDTA (ácido etilendiamintetracético) de grado biotecnológico o mejor se obtuvieron todos en Ameresco Chemical, Solon, Ohio. El Triton X-100 (t-octilfenoxi-polietoxi-etilailol), Triton X-114, y fosfato sódico monobásico son de grado reactivo o mejor y se obtuvieron en Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. El ácido acético glacial y el ácido clorhídrico se obtuvieron en Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey. El metanol se obtuvo en Fisher Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey. El Pefabloc®SC (fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo), los comprimidos del cóctel inhibidor de proteasas completo, y el PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) se obtuvieron en Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. La bestatina, pepstatina A y el inhibidor de proteasas E-64 se obtuvieron en Calbiochem, LaJolla, California. El tampón fosfato salino de Dulbecco (1x PBS) se obtuvo en Quality Biological. Inc., Gaithersburg, Maryland.

El tampón fosfato salino de Dulbecco (10x PBS) se obtuvo en BioWhittaker, Walkersville, Maryland. El anticuerpo Penta-His, exento de BSA se obtuvo en QiaGen, Valencia, California. La IgG de cabra anti-ratón AffiniPure conjugada con peroxidasa se obtuvo en Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. La disolución simple AEC se obtuvo en Zymed, sur de San Francisco, California. Todos los otros productos químicos eran de grado reactivo o mejor.

La resina Ni-Chelating Sepharose Fast Flow se obtuvo en Pharmacia., Sweden, California. Los geles de poliacrilamida Precast Tris-glicina al 4-20% y al 10-20%, todos los tampones de carrera y disoluciones, los patrones pre-teñidos Pre-Stained SeeBlue, los patrones multi-coloreados Multi-Colored MultiMark y las membranas de transferencia de PVDF se obtuvieron en Novex, San Diego, California. Los kits de tinción de plata de SDS-PAGE se obtuvieron en la Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokyo, Japón. La disolución de tinción de Coomassie se obtuvo en BioRad Laboratories, Hercules, California. Los filtros de jeringa Acrodisc® PF 0,2 m se obtuvieron en Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Los filtros de jeringa desechables GD/X 25 mm se obtuvieron en Whatman Inc.. Clifton, Nueva Jersey, los tubos de Dialysis 8.000 MWCO se obtuvieron en BioDesign Inc. Od Nueva York, Carmal NuevaYork. Los reactivos del ensayo de proteínas BCA y los tubos de diálisis Snake Skin 3,500 MWCO se obtuvieron en Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

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Ejemplo 4

Purificación de BASB118 a partir de E. coli Extracción y purificación

La pasta de células se descongeló a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Después de la disrupción de la pasta de células, el extracto se separó con PBS enfriado en hielo que contienen el 1% de TritonX-114.

Los restos celulares se retiraron, el extracto se calentó a 37ºC y las fases se separaron por centrifugación.

A continuación la fracción de interés se pasó sobre una resina Nickel-Chelating Sepharose Fast Flow equilibrada en PBS (pH 7,5) que contiene el 10% de glicerol y el 0,05% de Triton X100. La proteína se eluyó en el mismo tampón que contiene imidazol 200 mM. La fracción que contiene la proteína eluida se diluyó con cuatro volúmenes de tampón Tris 50 mM (pH 7,5) que contiene EDTA 2 mM, cloruro sódico 10 mM y el 0,05% de Triton X100 y se pasó a través de una resina de DEAE-Sepharose FF. El eluido se recogió. El análisis demostró que la preparación contenía 7 proteínas contaminantes importantes. Por tanto, la muestra se pasó de nuevo a través de una resina Nickel-Chelating Sepharose FF equilibrada en PBS (pH 7,5) que contiene el 10% de glicerol y el 0,05% de Triton X100. La proteína se eluyó en el mismo tampón que contiene imidazol 200 mM. Esta preparación se dializó contra PBS (pH 7,4) que contiene el 0,1% de Triton X 100 y a continuación se concentró sobre un concentrador Stir-cell con un límite de 3 kD.

Como se muestra en la Figura 1-A, la proteína BASB118 purificada aparece en el análisis de SDS-PAGE como cinco bandas y dos bandas secundarias adicionales. Las cinco bandas principales eran reactivas contra un anticuerpo monoclonal de ratón expandido contra el motivo 6-Histidina (Figura 1-B). La pureza se estimó en torno al 50%.

Caracterizaciones bioquímicas SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western

La proteína BASB118 purificada recombinante se resolvió sobre geles de poliacrilamida al 4-20% y se transfirió a membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora como se ha descrito previamente (Thebaine y col. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). A continuación las membranas de PVDF se pretrataron con 25 ml de tampón fosfato salino de Dulbecco que contiene el 5% de leche seca no grasa. Todas las incubaciones posteriores se llevaron a cabo usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmune o inmune o suero inmune anti-His durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación las membranas de PVDF se lavaron dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contiene cloruro sódico 150 mM y el 0,05% de Tween-20). Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra anti-conejo o anti-ratón marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación las membranas de PVDF se lavaron 4 veces con tampón de lavado, y se revelaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea como se suministra por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada uno.

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Ejemplo 5

Producción de antisuero para BASB118 recombinante

Se generaron antisueros polivalentes dirigidos contra la proteína BASB118 vacunando dos conejos con la proteína BASB118 recombinante purificada. A cada animal se le administró un total de tres inmunizaciones, subcutáneamente, de 10 \mug de proteína BASB118 por inyección a intervalos de 21 días. Los animales se sangraron antes de la primera inmunización ("pre-sangrado") y los días 49 y 56.

La titulación de proteína anti-BASB118 se midió mediante un ELISA usando proteína BASB118 purificada (4 \mug/pocillo). La titulación se define como los títulos en el punto medio calculado por un modelo logístico de 4 parámetros usando el software XL Fit. Los títulos obtenidos después de la inmunización fueron de 1:2000 para el suero de los conejos.

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Ejemplo 6

Caracterización inmunológica: Exposición superficial de BASB118

Los títulos de proteína anti-BASB118 se determinaron mediante un ELISA usando células completas muertas con formalina de las cepas 14.358.216.2926 (20 \mug/pocillo) de Moraxella catarrhalis. La titulación se define como los títulos en el punto medio calculado por un modelo logístico de 4 parámetros usando el software SoftMax Pro.

Los títulos observados con el suero inmune de conejo (1:312,1:1290,1:284,1:513, respectivamente) demuestran que la proteína BASB118 se detecta en la superficie de células de M. catarrhalis.

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Ejemplo 7

Caracterización inmunológica: Actividad bactericida

Se examinó la actividad citotóxica mediada por el complemento de anticuerpos anti-BASB118 para determinar el potencial del antisuero de la vacuna de la proteína BASB118 que se preparó como se ha descrito anteriormente. Se examinaron las actividades del suero pre-inmune y del antisuero anti-BASB118 en la muerte mediada por el complemento de M. catarrhalis.

Cepas de M. catarrhalis se crecieron en placas de Mueller Hinton durante 24 horas a 36ºC. Se añadieron varias colonias a 15 ml de BHI en el matraz de 125 ml. Los cultivos se crecieron durante 4 horas a 200 rpm hasta una A_{620} = 0,4. Después de una etapa de lavado, el sedimento se suspendió con HBSS y la cepa se diluyó para obtener 28500 CFU por mililitro. Cincuenta (50) \mul de suero preinmune y el suero anti-BASB118 (inactivado a 56ºC durante 30 min) se depositaron en el primer pocillo de una placa de 96 pocillos y dos diluciones seriadas en HBSS se depositaron en los otros pocillos de la misma fila. Veinticinco (25) \mul de M. catarrhalis viva diluida se añadieron posteriormente y la mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió complemento de cría de conejo (Pel freez, clinical systems, Brown Deer, WI, EE.UU.) a cada pocillo a una dilución de trabajo definida de antemano en un ensayo de toxicidad. Las microplacas se cubrieron y se incubaron durante 1 hora a 37ºC a 200 rpm.

Cada prueba incluye un control del complemento (pocillos sin suero que contienen una fuente de complemento activo o inactivado), un control positivo (pocillos que contienen suero con una titulación conocida de anticuerpos bactericidas), un control del cultivo (pocillos sin suero y complemento) y un control del suero (pocillos sin complemento).

La titulación bactericida de antisuero de conejo (50% de muertes de la cepa homóloga) fue de <1:35 (pre-inmune) y > 1:300 (inmune).

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Ejemplo 8

Eficacia de la vacuna BASB118: aumento del aclaramiento pulmonar de M. catarrhalis en ratones

Este modelo de ratón se basa en el análisis de la invasión pulmonar por M. catarrhalis después de una exposición intranasal estándar de ratones vacunados.

Grupos de 6 ratones BALB/c (hembras, 6 semanas de edad) se inmunizaron subcutáneamente con 100 \mul de vacuna correspondiente a una dosis de 10 \mug y se les administró una dosis de refuerzo 2 semanas más tarde. Una semana después de la dosis de refuerzo, los ratones se expusieron por instilación de 50 \mul de suspensión bacteriana (5 x 10^{5} CFU/50 \mul) en la fosa nasal izquierda con anestesia (los ratones se anestesiaron con una combinación de los anestésicos ketamina y xilazina, 0,24 mg de xilazina (Rompun) y 0,8 mg de ketamina (Imalgene)/100 \mul). Los ratones se sacrificaron 4 horas después de la exposición y los pulmones se extrajeron asépticamente y se homogeneizaron individualmente. Se determinó el log 10 del número medio ponderado de CFU/pulmón contando las colonias crecidas sobre placas de agar Mueller-Hinton después de poner en placas 20 \mul de 5 diluciones seriadas del homogeneizado. Se calculó la media aritmética del log 10 del número medio ponderado de CFU/pulmón y la desviación estándar para cada grupo.

Los resultados se analizaron estadísticamente aplicando un análisis ANOVA de 1 vía después de asumir la igualdad de la varianza (comprobada por el test de Brown y Forsythe) y la normalidad (comprobada usando el test de Shapiro-Wilk). Las diferencias entre los grupos se analizaron usando el test de Dunnet, el test de Tukey de tipo Student (HSD) y el test de Student-Newman-Keuls.

En este experimento, grupos de ratones se inmunizaron con BASB118 adsorbido sobre AlPO_{4} (10 \mug de BASB118 sobre 100 \mug de AlPO4) o con una preparación de células completas muertas (kwc) de la cepa ATCC 43617 del Moraxella catarrhalis adsorbida sobre AlPO4 (5 x 10^{8 }células sobre 100 \mug de AlPO_{4}) o con 100 \mug de AlPO_{4} sin antígeno. Los ratones fueron expuestos a 5 x 10^{5} CFU de la cepa ATCC 43617 de la bacteria viva M. catarrhalis. Se calculó el log 10 del número medio ponderado de CFU/pulmón y la desviación estándar para cada grupo 4 horas después de la exposición. Los ratones de Sham inmunizados tenían un log 10 de CFU/pulmón de 5,66 (+/- 0,18) 4 horas después de la exposición.

La preparación kwc indujo un aclaramiento pulmonar significativo comparada con el grupo control (una diferencia de 1,3 unidades logarítmicas). La vacuna BASB118 indujo una diferencia de 0,43 unidades logarítmicas de aclaramiento pulmonar comparada con el grupo control, que era significativamente diferente del control.

Materiales depositados

Un depósito que contiene una cepa Catlin del Moraxella catarrhalis ha sido depositado en la American Type Culture Collection (en el presente documento "ATCC") el 21 de junio de 1997 y se le asignó el número de depósito 43617. El depósito fue descrito como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es un inserto de 1,5-2,9 kb criodesecado de una librería construida a partir de un aislado de M. catarrhalis obtenida de un aspirado transtraqueal de un minero del carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Ghemother. 21: 506-508 (1982).

El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se denomina en el presente documento como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen BASB118 de longitud completa.

Un depósito del vector pMC-ORF1/2 que consta de ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 ha sido depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) el 12 de Febrero de 1999 y se le asignó el número de depósito 207118.

La secuencia de los polinucleótidos contenida en la cepa/clon depositado, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado de esta forma, están controlados en caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias del presente documento.

El depósito de las cepas depositadas se ha realizado bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con el fin del procedimiento en materia de patente. Las cepas depositadas serán liberadas al público irrevocablemente y sin restricción o condición tras la emisión de una patente. Las cepas depositadas se proporcionan únicamente para comodidad de aquellos expertos en la materia y no son una admisión de que se requiere el depósito para su habilitación, tal y como se requiere a tenor de 35 U.S.C. \NAK112.

Información de secuencia

Secuencias del polinucleótido y del polipéptido BASB118

SEQ ID NO: 1

Secuencia del polinucleótido BASB118 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

1

SEQ ID NO: 2

Secuencia del polipéptido BASB118 de Moraxella catarrhalis deducida a partir del polinucleótido de la SEQ ID NO: 1

2

SEQ ID NO: 3

3

SEQ ID NO: 4

4

<110> SmithKline Beecham Biologicals SA

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<120> Nuevos compuestos

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<130> BM45409

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<160> 4

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<170> FastSEQ para Windows Version 3.0

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<210> 1

<211 > 1161

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 1

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5

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<210> 2

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<211> 386

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

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<400> 2

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6

7

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<210> 3

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggcagaggg aattcatgca taaaatgtat cctactagta

\hfill

40

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 62

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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<400> 4

8

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2.

2. El polipéptido según la reivindicación 1 en el que la secuencia de aminoácidos tienen una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 2.

3. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

4. Un polipéptido aislado según la reivindicación 3 que consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

5. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un fragmento inmunógeno del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el fragmento inmunógeno es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEQ ID NO: 2.

7. Un fragmento inmunógeno según la reivindicación 6 en el que dicho fragmento inmunógeno está acoplado a un vehículo.

8. Un polipéptido aislado que comprende un fragmento inmunógeno de la reivindicación 6 ó 7.

9. Una proteína de fusión que comprende el fragmento inmunógeno según la reivindicación 6 ó 7.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, u 8 o un fragmento inmunógeno según la reivindicación 6 ó 7 o una proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 9, o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado sobre su longitud completa.

11. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 10 que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 2 sobre la región codificante completa; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado sobre su longitud completa.

12. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 10 que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con la de la SEQ ID NO: 1 sobre la longitud completa de la SEQ ID NO: 1; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado sobre su longitud completa.

13. El polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en la que la identidad es de al menos el 95% a la SEQ ID NO: 1.

14. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 13 que comprende el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1.

15. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 9 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, que se puede obtener seleccionando una librería apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o uno de sus fragmentos.

16. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15.

17. El vector de expresión de la reivindicación 16 en el que el polinucleótido aislado es recombinante.

18. Un microorganismo vivo recombinante que comprende un vector de expresión según la reivindicación 16 ó 17.

19. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 16 ó 17.

20. Un procedimiento para la producción de un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 8, un fragmento inmunógeno de la reivindicación 6 ó 7, o la proteína de fusión de la reivindicación 5 ó 9 que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 19 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido, de dicho fragmento inmunógeno o de dicha proteína de fusión y la recuperación del polipéptido, del fragmento inmunógeno o de la proteína de fusión del medio de cultivo.

21. Un procedimiento para la producción de una vacuna que comprende las etapas de la reivindicación 20 y que comprende adicionalmente la etapa de formulación de dicho polipéptido recombinante, fragmento inmunógeno o proteína de fusión con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

22. Un procedimiento para la expresión de un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 que comprende la transformación de una célula hospedadora con un vector de expresión de la reivindicación 16 ó 17 y el cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno de dichos polinucleótidos.

23. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 8, el fragmento inmunógeno de la reivindicación 6 ó 7 o la proteína de fusión de la reivindicación 5 ó 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25. La composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24 en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

26. Un anticuerpo generado contra un polipéptido aislado que consta de una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o uno de sus fragmentos inmunógenos en el que el fragmento inmunógeno es capaz de expandir una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de la SEQ ID NO: 2.

27. Un procedimiento de diagnóstico de una infección por Moraxella catarrhalis, que comprende la identificación de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un fragmento inmunógeno según la reivindicación 6 ó 7, o un anticuerpo según la reivindicación 26, presente en una muestra biológica procedente de un animal sospechoso de tener dicha infección.

28. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 8, un fragmento inmunógeno según la reivindicación 6 ó 7 o una proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 9 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por Moraxella catarrhalis.

29. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por Moraxella catarrhalis.

30. Una composición terapéutica útil en el tratamiento de seres humanos con una enfermedad por Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo según la reivindicación 26 y un vehículo farmacéutico adecuado.

31. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 8, un fragmento inmunógeno según la reivindicación 6 ó 7 o una proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 9 para su uso en el diagnóstico, tratamiento o prevención de una infección por Moraxella catarrhalis.

32. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 para su uso en el diagnóstico, tratamiento o prevención de una infección por Moraxella catarrhalis.