ES2283113T3 - Proteinas basb019 y genes de moraxella catarrhalis, antigenos, anticuerpos y usos. - Google Patents
Proteinas basb019 y genes de moraxella catarrhalis, antigenos, anticuerpos y usos. Download PDFInfo
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Abstract
Un polipéptido inmunogénico aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente.
Description
Proteínas BASB019 y genes de Moraxella
catarrhalis, antígenos, anticuerpos y usos.
Esta invención se refiere a polinucleótidos,
(denominados en el presente documento como
"polinucleótido(s) BASB019"), polipéptidos codificados
por ellos (denominados en el presente documento como "BASB019"
o "polipéptido(s) BASB019"), materiales recombinantes y
procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se
refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y
polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de
diagnóstico para detectar la infección por determinados
patógenos.
Moraxella catarrhalis (también llamada
Branhamella catarrhalis) es una bacteria
gram-negativa aislada frecuentemente del aparato
respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías,
siendo las principales otitis media en lactantes y niños, y neumonía
en ancianos. También es responsable de sinusitis, infecciones
nosocomiales y menos frecuentemente de enfermedades invasivas.
La otitis media es una enfermedad infantil
importante tanto por el número de casos como por sus posibles
secuelas. Se registran más de 3,5 millones de casos cada año en los
Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han
experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la
edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19: 823). Si no se
trata, o se vuelve crónica, esta enfermedad puede dar lugar a
pérdidas auditivas que pueden ser temporales (en el caso de
acumulación de líquido en el oído medio) o permanentes (si se daña
el nervio auditivo). En lactantes, tales pérdidas auditivas pueden
ser responsables de un aprendizaje tardío del habla.
Principalmente se aíslan tres especies
bacterianas del oído medio de niños con otitis media:
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza no
tipificable (HiNT) y M. catarrhalis. Están presentes en del
60 al 90% de los casos. Una publicación de estudios recientes
muestra que S. pneumoniae y HiNT representan ambas
aproximadamente el 30%, y M. catarrhalis aproximadamente el
15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev.
60: 267). Pueden aislarse otras bacterias del oído medio (H
influenza tipo B, S. pyogenes, etc.) pero con una
frecuencia mucho menor (2% de los casos o menos).
Los datos epidemiológicos indican que, para los
patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del aparato
respiratorio superior es un requisito previo necesario para el
desarrollo de una otitis; sin embargo también se requieren otros
para dar lugar a la enfermedad (Dickinson, DP et al. (1988)
J. Infect. Dis. 158:205, Faden, HL et al. (1991) Ann.
Otorhinol. Laryngol. 100:612). Éstos son importantes para iniciar la
migración de las bacterias hacia el oído medio a través de las
trompas de Eustaquio, seguido por el inicio de un proceso
inflamatorio. Estos factores se desconocen hasta la fecha. Se ha
postulado que una anomalía transitoria del sistema inmunológico
seguido por una infección vírica, por ejemplo, podría provocar una
incapacidad para controlar la colonización del aparato respiratorio
(Faden, HL et al (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Una
explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales
permite una colonización más importante de algunos niños, que
posteriormente se vuelven susceptibles de desarrollar la
otitis media debido a la presencia sostenida de patógenos del oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).
otitis media debido a la presencia sostenida de patógenos del oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).
La respuesta inmunitaria frente a M.
catarrhalis está mal caracterizada. El análisis de cepas
aisladas secuencialmente a partir de la nasofaringe de bebés seguido
desde los 0 a los 2 años de edad, indica que frecuentemente contraen
y eliminan nuevas cepas. Esto indica que se pone en marcha una
respuesta inmunitaria eficaz contra esta bacteria por los niños
colonizados (Faden, HL et al (1994) J. Infect. Dis.
169:1312).
En la mayoría de los adultos sometidos a prueba,
se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ et
al. (1985) J. Infect. Dis.151:878). Las cepas de M.
catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir
la actividad bactericida sérica: en general, aisladas de individuos
enfermos son más resistentes que los que están simplemente
colonizados (Hol, C et al. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL
et al. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A):28S). La resistencia
sérica puede por tanto considerarse como un factor de virulencia de
las bacterias. Se ha observado una actividad de opsonización en el
suero de niños que se están recuperando de otitis media.
No se han identificado los antígenos
seleccionados por estas respuestas inmunitarias diferentes en seres
humanos, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya
expresión está regulada por hierro, y que se reconoce mediante el
suero de pacientes con neumonía (Sethi, S, et al. (1995)
Infect. Immun. 63:1516).
Se han caracterizado otras proteínas de membrana
presentes en la superficie de M. catarrhalis usando un
procedimiento bioquímico, o para determinar su posible implicación
en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión, véase
Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía
de ratón, la presencia de anticuerpos producida contra algunos de
ellos (UspA, CopB) favorece un aclaramiento más rápido de la
infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) se conserva de manera
importante entre las cepas de M. catarrhalis, y presenta
homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que ha
demostrado ser eficaz contra esta bacteria en modelos animales.
La frecuencia de infecciones por Moraxella
catarrhalis ha aumentado drásticamente en las últimas décadas.
Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a
antibióticos y una población creciente de gente con sistemas
inmunitarios debilitados. Ya no es poco común aislar cepas de
Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o todos
los antibióticos habituales. Este fenómeno ha creado una necesidad
médica no satisfecha y una demanda de nuevos agentes
antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos, y
pruebas de diagnóstico para este microorganismo.
La presente invención se refiere a BASB019, en
particular polipéptidos BASB019 y polinucleótidos BASB019,
materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En
otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar
tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo prevención y
tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En un aspecto
adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para
detectar enfermedades asociadas a infecciones microbianas y estados
asociados a tales infecciones, tales como ensayos para detectar la
expresión o actividad de polipéptidos o polinucleótidos BASB019.
Diversos cambios y modificaciones dentro del
espíritu y alcance de la invención descrita serán fácilmente
evidentes para los expertos en la técnica leyendo las siguientes
descripciones y leyendo las otras partes de la presente
descripción.
La invención se refiere a polinucleótidos y
polipéptidos BASB019 tal como se describen con más detalle a
continuación. En particular, la invención se refiere a polipéptidos
y polinucleótidos de BASB019 de Moraxella catarrhalis, que
está relacionada por homología de secuencia de aminoácidos con el
polipéptido PAL (lipoproteína asociada a peptidoglucano) de H
influenzae. La invención se refiere especialmente a BASB019 que
tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos expuestas en SEQ
ID NO: 1, 3, 5 ó 7 y SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente. Se
entiende que las secuencias enumeradas en la lista de secuencias a
continuación como "ADN" representan una ilustración a modo de
ejemplo de una realización de la invención, dado que los expertos en
la técnica reconocerán que tales secuencias pueden usarse útilmente
en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.
En un aspecto de la invención se proporcionan
polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en el
presente documento como "BASB019" y "polipéptidos BASB019"
así como variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o
terapéuticamente útiles de los mismos, y composiciones que
comprenden los mismos.
La presente invención además proporciona:
(a) un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85%,
preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente
al menos una identidad del 95%, lo más preferiblemente al menos del
97-99% o identidad exacta, a la de SEQ ID NO: 2, 4,
6 u 8;
(b) un polipéptido codificado por un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica
que tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos
una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad
del 95%, incluso más preferiblemente al menos del
97-99% o identidad exacta con SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7
sobre la longitud completa de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 respectivamente;
o
(c) un polipéptido codificado por un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica
que codifica un polipéptido que tiene al menos una identidad del
85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más
preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más
preferiblemente al menos del 97-99% o identidad
exacta, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u
8.
Los polipéptidos BASB019 proporcionados en SEQ
ID NO: 2, 4, 6 u 8 son los polipéptidos BASB019 de las cepas MC2931
(ATCC 43617), MC2911, MC2960 y MC2969 de Moraxella
catarrhalis.
La invención también proporciona un fragmento
inmunogénico de un polipéptido BASB019, es decir, una porción
contigua del polipéptido BASB019 que tiene la misma o
sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8;
es decir, el fragmento (si es necesario cuando está acoplado a un
vehículo) puede provocar una respuesta inmunitaria que reconoce el
polipéptido BASB019. Un fragmento inmunogénico de este tipo puede
incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB019 que carece de una
secuencia líder de extremo N-terminal, y/o un
dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje de extremo
C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento
inmunogénico de BASB019 según la invención comprende sustancialmente
todo el domino extracelular de un polipéptido que tiene al menos una
identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%,
más preferiblemente al menos una identidad del 95%, lo más
preferiblemente al menos una identidad del 97-99%,
con la de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 sobre la longitud completa de SEQ ID
NO:2.
Un fragmento es un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos que es completamente igual que parte pero
no la totalidad de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier
polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB019, los
fragmentos pueden estar "posición libre", o comprendidos dentro
de un polipéptido mayor del cual forman una parte o región, lo más
preferiblemente como una única región continua sencilla en un único
polipéptido mayor.
Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo,
polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 o variantes de la misma, tal
como una serie continua de restos que incluye una secuencia de
aminoácidos de extremo amino y/o carboxilo terminal. También se
prefieren las formas de degradación de los polipéptidos de la
invención producidas por o en una célula huésped. Más preferidos son
los fragmentos caracterizados por atributos estructurales o
funcionales tales como fragmentos que comprenden
alfa-hélice y regiones que forman
alfa-hélice, beta-lámina y regiones
que forman beta-lámina, giro y regiones que forman
giro, espirales y regiones que forman espirales, regiones
hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones
beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones que forman
superficie, regiones de unión a sustrato, y regiones de índice
antigénico alto.
Otros fragmentos preferidos incluyen un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 ú 8, o un polipéptido
aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o
delecionados de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6
u
8.
8.
Los fragmentos de los polipéptidos de la
invención pueden emplearse para producir el polipéptido de longitud
completa correspondiente mediante síntesis peptídica; por tanto,
estos fragmentos pueden emplearse como productos intermedios para
producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.
Se prefieren particularmente las variantes en
las que se sustituyen, delecionan o añaden varios,
5-10, 1-5, 1-3,
1-2 o 1 aminoácidos en cualquier combinación.
Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de
la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura"
pueden ser parte de una proteína mayor tal como una proteína
precursora o de fusión. A menudo resulta ventajoso incluir otra
secuencia de aminoácidos que contiene secuencias secretoras o
líderes, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la
purificación tal como restos de histidina múltiples, u otra
secuencia para lograr estabilidad durante la producción
recombinante. Además, también se considera la adición de polipéptido
exógeno o cola lipídica o secuencias de polinucleótidos para
aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.
En un aspecto, la invención se refiere a
proteínas de fusión solubles modificadas mediante ingeniería
genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o
un fragmento de las mismas, y diversas porciones de las regiones
constantes de inmunoglobulinas de cadenas pesadas o ligeras de
diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como una inmunoglobulina
preferida está la parte constante de la cadena pesada de la IgG
humana, particularmente IgG1, en la que se produce la fusión en la
región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede
eliminarse simplemente mediante incorporación de una secuencia de
ruptura que puede romperse con factor de coagulación sanguínea
Xa.
Además, esta invención se refiere a
procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión
mediante ingeniería genética, y al uso de las mismas para selección
de fármacos, diagnóstico y tratamiento. Otro aspecto de la invención
también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas
de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de la tecnología de proteínas
de fusión en las solicitudes de patente internacionales números
WO94/29458 y WO94/22914.
Las proteínas pueden estar conjugadas
químicamente, o expresarse como proteínas de fusión recombinantes
que permiten producir niveles aumentados en un sistema de expresión
si se compara con proteínas no fusionadas. La pareja de fusión puede
ayudar a proporcionar epítopos cooperadores T (pareja de fusión
inmunológica), preferiblemente epítopos cooperadores T reconocidos
por seres humanos, o ayudar en la expresión de la proteína
(potenciador de expresión) a rendimientos superiores que la proteína
recombinante nativa. Preferiblemente la pareja de fusión será tanto
una pareja de fusión inmunológica y una pareja de potenciación de la
expresión.
Las parejas de fusión incluyen proteína D de
Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus
influenzae, NS 1 (hemaglutinina). Otra pareja de fusión es la
proteína conocida como LYTA. Preferiblemente se usa la porción de
extremo C terminal de la molécula. Lyta proviene de Streptococcus
pneumoniae que sintetiza una
N-acetil-L-alanina
amidasa, amidasa LYTA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986)
páginas 265-272}) una autolisina que degrada
específicamente determinados enlaces en el esqueleto del
peptidoglucano. El dominio de extremo C-terminal de
la proteína LYTA es responsable de la afinidad por la colina o por
algunos análogos de colina tales como DEAE. Se ha explotado esta
propiedad para el desarrollo de plásmidos que expresan
C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de
proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas
híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en su
extremo amino terminal {Biotechnology: 10, (1992) páginas
795-798}. Es posible usar la porción repetida de la
molécula Lyta encontrada en el extremo C terminal empezando en el
resto 178, por ejemplo restos 188-305.
La presente invención también incluye variantes
de los polipéptidos mencionados anteriormente, es decir polipéptidos
que varían de los referentes mediante sustituciones de aminoácidos
conservadoras, mediante lo cual se sustituye un resto por otro con
características similares. Tales sustituciones típicas son entre
Ala, Val, Leu y Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos de Asp
y Glu; entre Asn y Gln; y entre los restos básicos de Lys y Arg; o
restos aromáticos de Phe y Tyr.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
prepararse de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen
polipéptidos aislados que se producen de manera natural,
polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos
producidos sintéticamente, o polipéptidos producidos mediante una
combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales
polipéptidos se entienden bien en la técnica.
Lo que más se prefiere es que un polipéptido de
la invención provenga de Moraxella catarrhalis, sin embargo,
puede obtenerse preferiblemente a partir de otros microorganismos
del mismo género taxonómico. También puede obtenerse un polipéptido
de la invención, por ejemplo, a partir de microorganismos de la
misma familia u orden taxonómico.
Un objeto de la invención es proporcionar
polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB019, particularmente
polinucleótidos que codifican el polipéptido denominado en el
presente documento BASB019.
En una realización particularmente preferida de
la invención el polinucleótido comprende una región que codifica
polipéptidos BASB019 que comprenden una secuencia expuesta en SEQ ID
NO:1, 3, 5 ó 7 que incluye un gen de longitud completa, o una
variante del mismo.
Los polinucleótidos BASB019 proporcionados en
SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 son los polinucleótidos BASB019 de las cepas
MC2931 (ATCC 43617), MC2911, MC2960 y MC2969 de Moraxella
catarrhalis.
Como un aspecto adicional de la invención se
proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican y/o
expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB019, particularmente
polipéptidos y polinucleótidos BASB019 de Moraxella
catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARN no procesados, ARN de
ribozima, ARNm, ADNc, ADN genómicos, ADN-Banda Z.
Otras realizaciones de la invención incluyen polinucleótidos y
polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o
terapéuticamente útiles, y variantes de los mismos y composiciones
que comprenden los mismos.
Otro aspecto de la invención se refiere a
polinucleótidos aislados, que incluyen al menos un gen de longitud
completa, que codifica un polipéptido BASB019 que tiene una
secuencia deducida de SEQ ID NO:2, 4 ,6 u 8 y polinucleótidos
íntimamente relacionados con ellos y variantes de las mismas.
En otra realización particularmente preferida de
la invención existe un polipéptido BASB019 de Moraxella
catarrhalis que comprende o está constituida por una secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 o una variante de las
mismas.
Usando la información proporcionada en el
presente documento, tal como una secuencia de polinucleótido
expuesta en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7, puede obtenerse un polinucleótido
de la invención que codifica polipéptido BASB019 usando
procedimientos de clonación y selección habituales, tales como los
de clonación y secuenciación de fragmentos de ADN cromosómico a
partir de bacterias usando células de Moraxella catarrhalis
Catlin como material de partida, seguido de la obtención de un clon
de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia
polinucleotídica de la invención, tal como una secuencia
polinucleotídica dada en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7, normalmente se trata
con sonda una biblioteca de clones de Moraxella catarrhalis
Catlin de ADN cromosómico en E.coli o algún otro huésped
adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferiblemente un
17-mero o más largo, derivado de una secuencia
parcial. Los clones que portan ADN idéntico al de la sonda pueden
distinguirse usando condiciones de hibridación rigurosas.
Secuenciando los clones individuales así identificados mediante
hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la
secuencia polipeptídica o polinucleótídica original es posible
extender la secuencia polinucleotídica en ambas direcciones para
determinar una secuencia génica de longitud completa.
Convenientemente, se realiza tal secuenciación, por ejemplo, usando
ADN de cadena doble desnaturalizado preparado a partir de un clon de
plásmido. Se describen técnicas adecuadas por Maniatis, T., Fritsch,
E.F. y Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY
MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York (1989). (véase en particular Screening By
Hybridization 1.90 y Sequencing Denatured
Double-Stranded DNA Templates 13.70). También puede
realizarse la secuenciación de ADN genómico directa para obtener una
secuencia génica de longitud completa. Ilustrativo de la invención,
cada polinucleótido expuesto en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 se descubrió
en una biblioteca de ADN derivada de Moraxella catarrhalis
Catlin.
Además, cada secuencia de ADN expuesta en SEQ ID
NO:1, 3, 5 ó 7 contiene un marco de lectura abierto que codifica una
proteína que tiene aproximadamente el número de restos de
aminoácidos expuestos en SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 con un peso molecular
deducido que puede calcularse usando valores de peso molecular de un
resto de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la
técnica.
El polinucleótido de SEQ ID NO:1, entre el codón
de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de terminación
que empieza en el polinucleótido número 517 de SEQ ID NO:1, codifica
el polipéptido de SEQ ID NO:2. El polinucleótido de SEQ ID NO:3,
entre el codón de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de
terminación que empieza en el nucleótido número 517 de SEQ ID NO:3,
codifica el polipéptido de SEQ ID NO:4.
El polinucleótido de SEQ ID NO:5, entre el codón
de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de terminación
que empieza en el nucleótido número 517 de SEQ ID NO:5, codifica el
polipéptido de SEQ ID NO:6. El polinucleótido de SEQ ID NO:7, entre
el codón de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de
terminación que empieza en el nucleótido número 517 de SEQ ID NO:7,
codifica el polipéptido de SEQ ID NO:8.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que comprende o está
constituido por:
- (a)
- una secuencia polinucleotídica que tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más preferiblemente al menos del 97-99% o identidad exacta con SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 sobre la longitud completa de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 respectivamente; o
- (b)
- una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más preferiblemente al menos del 97-99% ó 100% exacta, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8, sobre la longitud completa de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 respectivamente.
Puede obtenerse un polinucleótido que codifica
un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y
ortólogos de especies distintas de Moraxella catarrhalis,
mediante un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar
una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas
(por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de
45-65°C y una concentración de SDS desde
0,1-1%) con una sonda marcada o detectable que está
constituida por o que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó
7 o un fragmento de la misma; y aislar un gen de longitud completa
y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia
polinucleotídica.
La invención proporciona una secuencia
polinucleotídica idéntica sobre su longitud total a una secuencia
codificante (marco de lectura abierto) en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7.
También se proporciona mediante la invención una secuencia
codificante para un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por
si mismo así como una secuencia codificante para un polipéptido
maduro o un fragmento en el marco de lectura con otra secuencia
codificante, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder
o secretora, una secuencia pre, o pro o preproteíca. El
polinucleótido de la invención también puede contener al menos una
secuencia no codificante, incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse
a al menos una secuencia no codificante en 5' y 3', tales como las
secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación
(tales como las señales de terminación dependientes de rho e
independientes de rho), sitios de unión a ribosoma, secuencias
Kozak, secuencias que estabilizan ARNm, intrones, y señales de
poliadenilación. La secuencia polinucleotídica también puede
comprender otras secuencias codificantes que codifican otros
aminoácidos. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora
que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En
determinadas realizaciones de la invención, la secuencia marcadora
es un péptido de hexa-histidina, tal como se
proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz
et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA 86:
821-824 (1989), o una etiqueta de péptido HA (Wilson
et al., Cell 37:767 (1984), de los cuales ambos pueden ser
útiles en la purificación de la secuencia polipeptídica fusionada a
ellos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no
se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y
sus secuencias asociadas de manera natural que controlan la
expresión génica.
La secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido BASB019 de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 puede ser idéntica a la
secuencia que codifica al polipéptido contenida en los nucleótidos 1
a 517 de SEQ ID NO:1, 3, 5, ó 7 respectivamente. Alternativamente
puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia
(degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido
de SEQ ID NO:2, 4, 6 ú 8.
El término "polinucleótido que codifica un
polipéptido" tal como se usa en el presente documento engloba los
polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un
polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido
bacteriano y más particularmente un polipéptido de BASB019 de
Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos
expuesta en SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8.
El término también engloba los polinucleótidos
que incluyen una única región continua o región discontinua que
codifica al polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos
por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una
secuencia de vector integrada, una secuencia de transposón integrada
o debido a edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto
con otras regiones, que también pueden contener secuencias
codificantes y/o no codificantes.
La invención se refiere además a variantes de
los polinucleótidos descritos en el presente documento que codifican
variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
deducida de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8. Pueden usarse fragmentos de
polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar
polinucleótidos de longitud completa de la invención.
\newpage
Otras realizaciones particularmente preferidas
son polinucleótidos que codifican variantes de BASB019, que tienen
la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB019 de SEQ ID NO:2,
4, 6 u 8 en la que se sustituyen, modifican, delecionan y/o añaden
varios, pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún resto de
aminoácido, en cualquier combinación. Entre éstas se prefieren
especialmente las adiciones, deleciones o sustituciones silenciosas,
que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido
BASB019.
Otras realizaciones preferidas de la invención
son polinucleótidos que son idénticos al menos en un 85% sobre su
longitud completa a un polinucleótido que codifica un polipéptido
BASB019 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID
NO:2, 4, 6 u 8, y polinucleótidos que son complementarios a tales
polinucleótidos. Alternativamente, los más sumamente preferidos son
los polinucleótidos que comprenden una región que es idéntica al
menos en un 90% sobre su longitud completa a un polinucleótido que
codifica un polipéptido BASB019 y polinucleótidos complementarios a
estos. En este sentido, se prefieren particularmente los
polinucleótidos idénticos al menos en un 95% sobre su longitud
completa con el mismo. Además, aquellos con al menos el 97% son
sumamente preferidos entre aquellos con al menos el 95%, y entre
éstos aquellos con al menos el 98% y al menos el 99% son
particularmente sumamente preferidos, siendo los más preferidos con
al menos el 99%.
Las realizaciones preferidas son polinucleótidos
que codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma
función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado
por un ADN de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7.
Según determinadas realizaciones preferidas de
esta invención se proporcionan polinucleótidos que se hibridan,
particularmente en condiciones rigurosas, con secuencias de
polinucleótido BASB019, tales como esos polinucleótidos en SEQ ID
NO:1, 3, 5 ó 7.
La invención además se refiere a polinucleótidos
que se hibridan con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas
en el presente documento. En este sentido, la invención se refiere
especialmente a polinucleótidos que se hibridan en condiciones
rigurosas, con los polinucleótidos descritos en el presente
documento. Tal como se usan en el presente documento, los términos
"condiciones rigurosas " y "condiciones de hibridación
rigurosas" quieren decir que la hibridación se produce sólo si
hay al menos una identidad del 95% y preferiblemente al menos del
97% entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de
hibridación rigurosas es la incubación durante la noche a 42°C en
una disolución que comprende: formamida al 50%,5x SSC (NaCl 150 mM,
citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x
disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20
microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado, seguido del
lavado del soporte de hibridación en 0,1x SSC a aproximadamente
65°C. Las condiciones de hibridación y lavado se conocen bien y se
muestran a modo de ejemplo en Sambrook, et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor,
N.Y., (1989), particularmente capítulo 11 del mismo. También puede
usarse la hibridación de la disolución con las secuencias de
polinucleótidos proporcionadas por la invención.
La invención también proporciona un
polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia
polinucleotídica obtenida seleccionando una biblioteca apropiada que
contiene el gen completo para una secuencia polinucleotídica
expuesta en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 en condiciones de hibridación
rigurosas con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia
polinucleotídica expuesta en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 o un fragmento de
la misma; y aislar dicha secuencia polinucleotídica. Los fragmentos
útiles para la obtención de un polinucleótido de este tipo incluyen,
por ejemplo, sondas y cebadores totalmente descritos en otra parte
en el presente documento.
Tal como se discute en otra parte en el presente
documento en relación a ensayos de polinucleótidos de la invención,
por ejemplo, pueden usarse los polinucleótidos de la invención como
una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar
los ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican
BASB019 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que
tienen una alta identidad, particularmente una identidad de
secuencia alta, con el gen de BASB019. Tales sondas generalmente
comprenderán al menos 15 restos de nucleótido o pares de bases.
Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 restos de
nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 restos de
nucleótidos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas
tendrán al menos 20 restos de nucleótidos o pares de bases y tendrán
menos de 30 restos de nucleótidos o pares de bases.
Puede aislarse una región codificante del gen de
BASB019 mediante selección usando una secuencia de ADN proporcionada
en SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7 para sintetizar una sonda
oligonucleotídica. Un oligonucleótido marcado que tiene una
secuencia complementaria a la de un gen de la invención se usa
entonces para seleccionar una biblioteca de ADNc, ADN genómico o
ARNm para determinar con que miembros de la biblioteca se híbrida la
sonda.
Existen varios procedimientos disponibles y bien
conocidos por los expertos en la técnica para obtener ADN de
longitud completa, o ampliar los ADN cortos, por ejemplo los basados
en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc
(RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, et al., PNAS USA 85:
8998-9002, 1988). Las modificaciones recientes de la
técnica, mostradas a modo de ejemplo mediante la tecnología
Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado
significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología
Marathon™, se ha preparado ADNc a partir de ARNm extraído de un
tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada en cada
extremo. Entonces se realiza la amplificación de ácido nucleico
(PCR) para amplificar el extremo 5' "ausente" del ADN usando
una combinación de cebadores específicos de gen y específicos de
adaptador. Luego se repite la reacción PCR usando los cebadores
"anidados", es decir, cebadores diseñados para reasociarse en
el producto amplificado (normalmente un cebador específico de
adaptador que además se reasocia en 3' en la secuencia adaptadora y
un cebador específico de gen que se hibrida en 5' en la secuencia
génica seleccionada). Luego pueden analizarse los productos de esta
reacción mediante secuenciación de ADN y construirse un ADN de
longitud completa o bien uniendo el producto directamente al ADN
existente para dar una secuencia completa, o bien realizando una PCR
de longitud completa aparte usando la información de la nueva
secuencia para el diseño del cebador de 5'.
Los polinucleótidos y polipéptidos de la
invención pueden emplearse, por ejemplo, como materiales y reactivos
de investigación para el descubrimiento de tratamientos y
diagnósticos para enfermedades, particularmente enfermedades
humanas, tal como se discute más adelante en el presente documento
en relación con los ensayos de polinucleó-
tidos.
tidos.
Los polinucleótidos de la invención que son
oligonucleótidos derivados de una secuencia de SEQ ID
NOS:1-8 pueden usarse en el procedimiento tal como
se describe en el presente documento, pero preferiblemente para PCR,
para determinar si los polinucleótidos identificados en el presente
documento están transcritos en su totalidad o en parte en bacterias
en tejido infectado. Se reconoce que tales secuencias también
tendrán utilidad en el diagnóstico del estado de infección y tipo de
infección que el patógeno ha alcanzado.
La invención también proporciona polinucleótidos
que codifican un polipéptido que es la proteína madura más
aminoácidos de extremo amino o carboxilo terminal, o aminoácidos en
el interior del polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más
de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Tales secuencias pueden
desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína desde
precursor hasta una forma madura, puede permitir el transporte
proteico, puede prolongar o acortar la vida media de la proteína o
puede facilitar la manipulación de una proteína para someterla a
ensayo o producción entre otras cosas. Como generalmente es el caso
in vivo, pueden tratarse aminoácidos adicionales lejos de la
proteína madura mediante enzimas celulares.
Para todos y cada uno de los polinucleótidos de
la invención se proporciona un polinucleótido complementario al
mismo. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean
totalmente complementarios a cada polinucleótido al que son
complementarios.
Una proteína precursora, que tiene una forma
madura del polipéptido fusionado a una o más prosecuencias puede ser
una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las
prosecuencias, generalmente se activan tales precursores inactivos.
Pueden eliminarse algunas o todas las prosecuencias antes de la
activación. Generalmente, tales precursores se llaman
proproteínas.
Además de las representaciones habituales A, G,
C, T/U para los nucleótidos, también puede usarse el término
"N" para describir determinados polinucleótidos de la
invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro
nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en tal posición diseñada en
la secuencia de ADN o ARN, excepto que se prefiere que N no sea un
ácido nucleico cuando se toma junto con posiciones de nucleótido
adyacentes, cuando se lee en el marco de lectura correcto, tendrá el
efecto de generar un codón de terminación prematuro en tal marco de
lectura.
En resumen, un polinucleótido de la invención
puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una
secuencia líder (la que puede denominarse como una preproteína), un
precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias
que no son secuencias líder de una preproteína, o una
preproproteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene
una secuencia líder y una o más prosecuencias, que generalmente se
eliminan durante las etapas de procesamiento que producen formas
activas y maduras del polipéptido.
Según un aspecto de la invención, se proporciona
el uso de un polinucleótido de la invención para fines terapéuticos
o profilácticos, en particular inmunización genética.
El uso de un polinucleótido de la invención en
inmunización genética preferiblemente empleará un procedimiento de
administración adecuado tal como una inyección directa de un ADN de
plásmido en los músculos (Wolff et al., Hum Mol Genet (1992)
1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419),
administración de ADN complejado con vehículos de proteína
específicos (Wu et al., J Biol Chem. (1989) 264: 16985),
coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty &
Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en
diversas formas de liposomas (Kaneda et al., Science (1989)
243: 375), bombardeo de partículas (Tang et al., Nature
(1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12:
791) e infección in vivo usando vectores retrovirales
clonados (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).
La invención también se refiere a vectores que
comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención,
células huésped que están modificadas mediante ingeniería genética
con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la
invención mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de
traducción sin células también pueden emplearse para producir tales
proteínas usando ARN derivados de los constructos de ADN de la
invención.
Los polipéptidos recombinantes de la presente
invención pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos
por los expertos en la técnica a partir de células huésped
modificadas mediante ingeniería genética que comprenden sistemas de
expresión. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente
invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un
polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células
huésped que están modificadas mediante ingeniería genética con tales
sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la
invención mediante técnicas recombinantes.
Para la producción recombinante de los
polipéptidos de la invención, pueden modificarse mediante ingeniería
genética células huésped para incorporar sistemas de expresión o
porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La
introducción de un polinucleótido en la célula huésped puede
realizarse mediante procedimientos descritos en muchos manuales de
laboratorio convencionales, tales como Davis, et al., BASIC
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, et al.,
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tales
como, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por
DEAE-dextrano, transvección, microinyección,
transfección mediada por lípido catiónico, electroporación,
transducción, carga raspada, introducción balística e infección.
Los ejemplos representativos de huéspedes
apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de
estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli,
Streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, y
Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como células
de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, una
basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células
de insecto tales como células de Drosophila S2 y
Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS,
HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células Bowes de
melanoma; y células vegetales, tales como células de un gimnosperma
o angiosperma.
Puede usarse una gran variedad de sistemas de
expresión para producir los polipéptidos de la invención. Tales
vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosoma,
episoma y virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos
bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de
levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de
levadura, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como
SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus
de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores
derivados de combinaciones de los mismos, tales como las derivadas
de elementos genéticos de bacteriófago y plásmido, tales como
cósmidos y fágmidos. Los constructos del sistema de expresión pueden
contener regiones de control que regulan así como generan expresión.
Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector adecuado para
mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un
polipéptido en un huésped para la expresión a este respecto. Puede
insertarse la secuencia de ADN apropiada en el sistema de expresión
mediante una variedad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales
como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., MOLECULAR
CLONING, A LABORATORY MANUAL, (citado anteriormente).
En sistemas de expresión recombinantes en
eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en la luz
del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el
entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción
apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser
endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
Pueden recuperarse y purificarse los
polipéptidos de la presente invención a partir de cultivos de
células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos
incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción
con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico,
cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción
hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de
hidroxiapatita y cromatografía de lecitina. Lo más preferiblemente,
para la purificación se emplea cromatografía de afinidad de ion
metálico (IMAC). Pueden emplearse técnicas bien conocidas para
replegar proteínas para regenerar una conformación activa cuando el
polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular,
aislamiento y/o purificación.
El sistema de expresión puede ser también un
microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria.
Puede insertarse el gen de interés en el genoma de un virus o
bacteria recombinante vivo. La inoculación y la infección in
vivo con este vector vivo darán como resultado la expresión del
antígeno y la inducción de respuestas inmunitarias. Los virus y
bacterias usados con este fin son por ejemplo: poxvirus (por
ejemplo; vaccinia, viruela aviar, viruela del canario), alfavirus
(virus Sindbis, Virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina
venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, picomavirus
(poliovirus, rhinovirus), virus herpes (virus de la
varicela-zóster, etc.), Listeria, Salmonella,
Shigella, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o
atenuarse de varias maneras con el fin de obtener vacunas vivas.
Tales vacunas vivas también forman parte de la invención.
Esta invención también se refiere al uso de
polinucleótidos y polipéptidos BASB019 de la invención para su uso
como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o
polipéptidos BASB019 en un eucariota, particularmente un mamífero, y
especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de
diagnóstico para el diagnóstico de enfermedades, determinación del
estadio de una enfermedad o respuesta de un microorganismo
infeccioso ante fármacos. Los eucariotas, particularmente los
mamíferos, y especialmente los seres humanos, particularmente los
infectados o que se sospecha que están infectados por un
microorganismo que comprende la proteína o el gen de BASB019, pueden
detectarse al nivel de ácido nucleico o aminoácidos mediante una
variedad de técnicas bien conocidas así como mediante procedimientos
proporcionados en el presente documento.
Los polipéptidos y polinucleótidos para
pronóstico, diagnóstico u otros análisis pueden obtenerse a partir
de materiales corporales de un individuo supuestamente infectado y/o
infectado. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes,
particularmente ADN o ARN, pueden usarse directamente para la
detección o pueden amplificarse enzimáticamente usando PCR o
cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. También
puede usarse ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico de las
mismas maneras. Usando la amplificación, puede realizarse la
caracterización de la especie y cepa de un microorganismo infeccioso
o residente presentes en un individuo mediante el análisis del
genotipo de un polinucleótido seleccionado del microorganismo.
Pueden detectarse deleciones e inserciones mediante un cambio en el
tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de
una secuencia de referencia seleccionada de un microorganismo
relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género
o una cepa diferente de la misma especie. Pueden identificarse
mutaciones puntuales mediante hibridación de ADN amplificado con
secuencias de polinucleótido BASB019 marcadas. Pueden distinguirse
secuencias apareadas perfecta o significativamente de dúplex con
apareamiento imperfecta o más significativamente erróneo mediante
digestión con ADNasa o ARNasa, para ADN o ARN respectivamente, o
detectando diferencias en las temperaturas de fusión o cinética de
renaturalización. También pueden detectarse diferencias en la
secuencia polinucleotídica mediante alteraciones en la movilidad
electroforética de fragmentos de polinucleótido en geles en
comparación con una secuencia de referencia. Esto puede realizarse
con o sin agentes desnaturalizantes. También pueden detectarse
diferencias en polinucleótidos mediante secuenciación directa de ADN
o ARN. Véase, por ejemplo, Myers et al., Science, 230: 1242
(1985). También pueden revelarse cambios en la secuencia en
ubicaciones específicas mediante ensayos de protección de nucleasa,
tales como un ensayo de protección de ARNasa, V1 y S1 o un
procedimiento de ruptura química. Véase, por ejemplo, Cotton et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401
(1985).
En otra realización, puede construirse una
matriz de sondas de oligonucleótidos que comprenden una secuencia de
nucleótidos de BASB019 o fragmentos de la misma para realizar
selección eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo,
clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de
tecnología de matriz se conocen bien y tienen aplicabilidad general
y pueden usarse para tratar una variedad de cuestiones en genética
molecular incluyendo expresión génica, ligamiento genético y
variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee et al.,
Science, 274: 610 (1996)).
Por tanto en otro aspecto, la presente invención
se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:
- (a)
- un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7, o un fragmento de la misma;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos complementaria con la de (a);
- (c)
- un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 o un fragmento del mismo; o
- (d)
- un anticuerpo frente a un polipéptido de la presente invención, preferiblemente frente al polipéptido de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8.
Se apreciará que en cualquiera de los kit de
este tipo, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente
sustancial. Un kit de este tipo se usará en el diagnóstico de una
enfermedad o propensión a una enfermedad, entre otros.
Esta invención también se refiere al uso de
polinucleótidos de la presente invención como reactivos de
diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido
de la invención, preferiblemente, SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7, que está
asociada con una enfermedad o patogenicidad proporcionará una
herramienta de diagnóstico que puede ayudar a, o definir, un
diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico de un transcurso de una
enfermedad, una determinación de un estadio de enfermedad, o una
propensión a una enfermedad, que da como resultado la subexpresión,
sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Pueden
detectarse los microorganismos, particularmente los microorganismos
infecciosos, que llevan mutaciones en tal polinucleótido al nivel
del polinucleótido mediante una variedad de técnicas, tales como las
descritas en cualquier otro lugar del presente documento.
También pueden detectarse las células de un
microorganismo que lleva mutaciones o polimorfismos (variaciones
alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención al
nivel del polinucleótido o polipéptido mediante una variedad de
técnicas, por ejemplo, para permitir el serotipado. Por ejemplo,
puede usarse RT-PCR para detectar mutaciones en el
ARN. Se prefiere particularmente usar RT-PCR junto
con sistemas de detección automatizados, tales como, por ejemplo,
GeneScan. También pueden usarse ARN, ADNc o ADN genómico con el
mismo fin, PCR. Como un ejemplo, pueden usarse los cebadores de PCR
complementarios a un polinucleótido que codifica un polipéptido
BASB019 para identificar y analizar mutaciones.
La invención proporciona además cebadores con 1,
2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3'. Pueden usarse
estos cebadores, entre otras cosas, para amplificar ADN y/o ARN de
BASB019 aislado a partir de una muestra derivada de un individuo,
tal como un material corporal. Pueden usarse los cebadores para
amplificar un polinucleótido aislado a partir de un individuo
infectado, de manera que el polinucleótido puede someterse entonces
a varias técnicas para la elucidación de la secuencia
polinucleotídica. De esta manera, pueden detectarse las mutaciones
en la secuencia polinucleotídica y usarse para el diagnóstico o
pronóstico de la infección o su estadio o transcurso, o para
serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.
La invención además proporciona un procedimiento
para diagnosticar una enfermedad, preferiblemente infecciones
bacterianas, mas preferiblemente infecciones causadas por
Moraxella catarrhalis, que comprenden determinar a partir de
una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal,
un aumento del nivel de expresión de polinucleótido que tiene una
secuencia de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7. Puede medirse el aumento o la
disminución de la expresión de un polinucleótido BASB019 usando
cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para
la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo,
amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa,
inmunotransferencia de tipo Northern, espectrometría y otros
procedimientos de hibridación.
Además, puede usarse un ensayo de diagnóstico
según la invención para detectar la sobreexpresión de un polipéptido
BASB019 comparado con muestras de tejido control normal, por
ejemplo, para detectar la presencia de una infección. Las técnicas
de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de un
polipéptido BASB019, en una muestra derivada de un huésped, tal como
un material corporal, se conocen bien por los expertos en la
técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos,
ensayos de unión competitiva, análisis de inmunotransferencia de
tipo Western, ensayos de intercalación de anticuerpos, ensayos de
detección de anticuerpos y ELISA.
Los polinucleótidos de la invención pueden
usarse como componentes de matrices de polinucleótidos,
preferiblemente ensayos de redes o matrices de alta densidad. Estas
matrices de alta densidad son particularmente útiles con fines de
diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, puede usarse un conjunto de
manchas, que comprende cada una un gen diferente y que además
comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, para
el tratamiento con sonda, tal como usar una hibridación o
amplificación de ácido nucleico, usando una sonda obtenida o
derivada de una muestra corporal, para determinar la presencia de
una secuencia polinucleotídica particular o secuencia relacionada en
un individuo. Tal presencia puede indicar la presencia de un
patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser
útil en el diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad o un
transcurso de una enfermedad. Se prefiere una red que comprende un
número de variantes de la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:1,
3, 5 ó 7. También se prefiere una red que comprende un número de
variantes de la secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia
polipeptídica de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8.
Pueden usarse los polipéptidos y polinucleótidos
de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan
los mismos como inmunógenos para producir anticuerpos
inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos
respectivamente.
En ciertas realizaciones preferidas de la
invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o
polinucleótidos BASB019.
Pueden obtenerse anticuerpos generados contra
los polipéptidos o polinucleótidos de la invención administrando los
polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que
portan epítopos de cualquiera o ambos, análogos de cualquiera o
ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal,
preferiblemente uno no humano, usando protocolos rutinarios. Para la
preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier
técnica conocida en la técnica que proporcione anticuerpos
producidos mediante cultivos de líneas celulares continuas. Los
ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como las que aparecen en
Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256:
495-497 (1975); Kozbor et al., Inmunology
Today 4: 72 (1983); Cole et al., págs.
77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER
THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).
Pueden adaptarse técnicas para la producción de
anticuerpos de cadena sencilla (patente estadounidense número
4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla frente a
polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. También pueden
usarse ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales
como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados
inmunoespecíficos frente a los polipéptidos o polinucleótidos de la
invención.
Como alternativa, puede utilizarse la tecnología
de presentación en fago para seleccionar genes de anticuerpo con
actividades de unión hacia un polipéptido de la invención o bien a
partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos
de seres humanos seleccionados por poseer
anti-BASB019 o bien a partir de bibliotecas vírgenes
(McCafferty, et al., (1990), Nature 348,
552-554; Marks, et al.,(1992)
Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de
estos anticuerpos también puede mejorarse mediante, por ejemplo,
intercambio de cadenas (Clackson et al., (1991) Nature
352: 628).
Pueden emplearse los anticuerpos anteriormente
descritos para aislar o identificar clones que expresan los
polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los
polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía
de afinidad.
Por tanto pueden emplearse, entre otros, los
anticuerpos contra el polipéptido BASB019 o el polinucleótido
BASB019 para tratar infecciones, particularmente infecciones
bacterianas.
Las variantes de polipéptido incluyen variantes
antigénica, epítopica o inmunológicamente equivalentes a partir de
un aspecto particular de esta invención.
Preferiblemente, el anticuerpo o variante del
mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo.
Por ejemplo, si el individuo es un ser humano, el anticuerpo puede
lo más preferiblemente estar "humanizado", en el que la región
o regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo
derivado de hibridoma se ha trasplantado en un anticuerpo monoclonal
humano, por ejemplo, tal como se describe en Jones et al.
(1986), Nature 321, 522-525 o Tempest et
al., (1991) Biotechnology 9, 266-273.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la
invención también pueden usarse para evaluar la unión de sustratos
de molécula pequeña y ligandos en, por ejemplo, células,
preparaciones libres de células, bibliotecas químicas y mezclas de
productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos
y ligandos naturales o pueden ser miméticos estruc-
turales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan et al., Current Protocols in Inmunology 1 (2): Capítulo 5 (1991).
turales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan et al., Current Protocols in Inmunology 1 (2): Capítulo 5 (1991).
Los procedimientos de selección pueden
simplemente medir la unión de un compuesto candidato con el
polipéptido o polinucleótido, o con células o membranas que portan
el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del
polipéptido por medio de una etiqueta directa o indirectamente
asociada con el compuesto candidato. Como alternativa, el
procedimiento de selección puede implicar competencia con un
competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden
someter a prueba si el compuesto candidato da como resultado una
señal generada por activación o inhibición del polipéptido o
polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las
células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los
inhibidores de la activación generalmente se someten a ensayo en
presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la
activación mediante el agonista por la presencia del compuesto
candidato. Pueden emplearse el polipéptido activo de manera
constitutiva y/o los polipéptidos y polinucleótidos expresados de
manera constitutiva en procedimientos de selección para detectar
agonistas inversos o inhibidores, en ausencia de un agonista o
inhibidor, sometiendo a prueba si el compuesto candidato da como
resultado la inhibición de la activación del polipéptido o
polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los procedimientos
de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un
compuesto candidato con una disolución que contiene un polipéptido o
polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla,
medir la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB019 en la
mezcla y comparar la actividad del polipéptido y/o polinucleótido
BASB019 de la mezcla con un patrón. También pueden usarse proteínas
de fusión, tales como las preparadas a partir de la parte Fc y el
polipéptido BASB019, tal como se describió anteriormente en el
presente documento, para ensayos de selección de alto rendimiento
para identificar antagonistas del polipéptido de la presente
invención, así como de polipéptidos relacionados filogenética y/o
funcionalmente (véase D. Bennett et al., J Mol Recognition,
8:52-58 (1995); y K. Johanson et al., J Biol
Chem, 270(16):9459-9471 (1995)).
Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos
que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido de la presente
invención también pueden usarse para configurar procedimientos de
selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la
producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, puede
construirse un ensayo ELISA para medir los niveles asociados a
células o secretados de polipéptido usando anticuerpos monoclonales
y policlonales mediante procedimientos habituales conocidos en la
técnica. Esto puede usarse para descubrir agentes que pueden inhibir
o potenciar la producción de polipéptido (también denominado
antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o
tejidos manipulados adecuadamente.
La invención también proporciona un
procedimiento para seleccionar compuestos para identificar aquellos
que potencian (agonista) o bloquean (antagonista) la acción de
polipéptidos o polinucleótidos BASB019, particularmente aquellos
compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El
procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto
rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas,
se incuba una mezcla de reacción sintética, un compartimento
celular, tal como una membrana, envoltura celular o pared celular, o
una preparación de cualquiera de las mismas, que comprende
polipéptido BASB019 y un sustrato o ligando marcado de tal
polipéptido, en ausencia o presencia de una molécula candidata que
puede ser un agonista o antagonista de BASB019. La capacidad de la
molécula candidata para agonizar o antagonizar el polipéptido
BASB019 se refleja en la disminución de la unión de un ligando
marcado o la disminución de la producción de producto a partir de
tal sustrato. es más probable que las moléculas que se unen
gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido
BASB019 sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y,
como puede ser el caso, aumentan la tasa de producción de producto a
partir del sustrato, aumentan la transducción de señales, o aumentan
la actividad de canales químicos son agonistas. La detección de la
tasa o nivel de, como puede ser el caso, de la producción de
producto a partir del sustrato, transducción de señales o actividad
de canales químicos puede potenciarse usando un sistema indicador.
Los sistemas indicadores que pueden ser útiles en este sentido
incluyen pero no se limitan a colorimétrico, sustrato marcado
convertido en producto, un gen indicador que es sensible a cambios
en la actividad del polinucleótido o polipéptido BASB019, y ensayos
de unión conocidos en la técnica.
Otro ejemplo de un ensayo para la determinación
de agonistas de BASB019 es un ensayo competitivo que combina BASB019
y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB019, moléculas
de unión a BASB019 recombinante, ligandos o sustratos naturales, o
miméticos de ligando o sustrato, en condiciones apropiadas para un
ensayo de inhibición competitiva. BASB019 puede estar marcado, tal
como por radiactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que
el número de moléculas BASB019 unidas con una molécula de unión o
convertidas en producto puedan determinarse de manera precisa para
evaluar la eficacia del antagonista potencial.
Los antagonistas potenciales incluyen, entre
otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y
anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la
invención y por tanto inhiben o extinguen su actividad o expresión.
Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas
pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como un anticuerpo o una
proteína íntimamente relacionada que se une a los mismos sitios en
una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir
actividades inducidas por BASB019, evitando de esta manera la acción
o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB019 impidiendo
que los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB019 se unan.
Los antagonistas potenciales incluyen una
molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio de unión del
polipéptido evitando así la unión a moléculas de unión celular, de
manera que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de
moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a moléculas orgánicas
pequeñas, péptidos o moléculas tipo péptido. Otros antagonistas
potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J.
Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE
INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton,
FL(1988), para una descripción de estas moléculas). Los
antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados
con y variantes de BASB019.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas mediante
ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente
invención, o un fragmento del mismo, y diversas partes de las
regiones constantes de cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas
de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como
inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG
humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la
región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede
eliminarse simplemente mediante incorporación de una secuencia de
ruptura que puede romperse con el factor de coagulación sanguínea
Xa. Es más, esta invención se refiere a procedimientos para la
preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería
genética, y al uso de las mismas para selección de fármacos,
diagnóstico y tratamiento. Un aspecto adicional de la invención
también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas
de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de
fusión en las solicitudes de patentes internacionales números
WO94/29458 y WO94/22914.
Cada una de las secuencias polinucleotídicas
proporcionadas en el presente documento puede usarse en el
descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La
proteína codificada, tras la expresión, puede usarse como una diana
para la selección de fármacos antibacterianos. Adicionalmente,
pueden usarse las secuencias polinucleotídicas que codifican las
regiones amino terminal de la proteína codificada o
Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la
traducción del ARNm respectivo para construir secuencias antisentido
para controlar la expresión de la secuencia codificante de
interés.
La invención también proporciona el uso del
polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención
para interferir en la interacción física inicial entre un patógeno o
patógenos y un eucariota, preferiblemente mamífero, huésped
responsable de las secuelas de la infección. En particular, las
moléculas de la invención pueden usarse: en la prevención de la
adhesión de bacterias, en particular bacterias
gram-positivas y/o gram-negativas, a
proteínas de la matriz extracelular eucariotas, preferiblemente de
mamíferos, sobre dispositivos permanentes o a proteínas de la matriz
extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre
proteínas de la matriz extracelular eucariotas, preferiblemente de
mamíferos, y proteínas de BASB019 bacterianas que median el daño
tisular y/o; para bloquear la progresión normal de la patogenia en
infecciones iniciadas por otras técnicas distintas a la implantación
de dispositivos permanentes o por otras técnicas quirúrgicas.
Según todavía otro aspecto de la invención, se
proporcionan agonistas y antagonistas de BASB019, preferiblemente
agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.
Los antagonistas y agonistas de la invención
pueden emplearse, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar
enfermedades.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a mimótopos del polipéptido de la invención. Un mimótopo
es una secuencia peptídica, suficientemente similar al péptido
nativo (secuencial o estructuralmente), que puede reconocerse por
anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o puede provocar
anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando está acoplado con
un vehículo adecuado.
Pueden diseñarse mimótopos peptídicos con un fin
particular mediante la adición, deleción o sustitución de
aminoácidos seleccionados. Por tanto, pueden modificarse los
péptidos con fines de facilitar la conjugación con un vehículo
proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos
procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal.
Además puede ser deseable para péptidos conjugados con un vehículo
proteico incluir un extremo terminal hidrófobo distal del extremo
terminal conjugado del péptido, de manera que el extremo sin
conjugar libre del péptido permanezca asociado con la superficie de
la proteína vehículo. Por tanto, presentando el péptido en una
conformación que se parezca lo más estrechamente posible a la del
péptido tal como se encuentra en el contexto de la molécula nativa
completa. Por ejemplo, pueden alterarse los péptidos para que tengan
una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba
C-terminal. Como alternativa, puede realizarse la
adición o sustitución de una forma de estereoisómero D de uno o más
de los aminoácidos para producir un derivado beneficioso, por
ejemplo para aumentar la estabilidad del péptido.
Como alternativa, pueden identificarse los
mimótopos peptídicos usando anticuerpos que pueden unirse ellos
mismos con los polipéptidos de la presente invención usando técnicas
tales como la tecnología de presentación en fago (documento EP 0 552
267 B1). Esta técnica, genera un gran número de secuencias
peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y
pueden, por tanto, unirse a anticuerpos
anti-péptidos nativos, pero no necesariamente
comparten ellos mismos una homología significativa con el
polipéptido nativo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un
individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres
humanos, que comprende inocular al individuo con el polinucleótido
y/o polipéptido BASB019, o un fragmento o variante del mismo,
adecuado para producir anticuerpos y/o una respuesta inmunitaria
frente a células T para proteger a dicho individuo de la infección,
particularmente infección bacteriana y lo más particularmente
infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan
procedimientos mediante los que la respuesta inmunológica ralentiza
la replicación bacteriana. Todavía otro aspecto de la invención se
refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica
en un individuo que comprende administrar a tal individuo una
ribozima, secuencia o vector de ácido nucleico para dirigir la
expresión del polinucleótido y/o polipéptido BASB019,o un fragmento
o variante del mismo, para expresar el polinucleótido y/o
polipéptido BASB019, o un fragmento o una variante del mismo in
vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, tal como,
producir anticuerpos y/o una respuesta inmunitaria frente a células
T, incluyendo, por ejemplo, células T que producen citocinas o
células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo,
preferiblemente un ser humano, de la enfermedad, tanto si esa
enfermedad ya se ha establecido dentro del individuo como si no. Un
ejemplo de administración del gen es acelerándolo hacia las células
deseadas como un recubrimiento sobre partículas o de otra manera.
Tal vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una
ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un
complejo de ADN-proteína o un complejo de
ARN-proteína.
Un aspecto adicional de la invención se refiere
a una composición inmunológica que cuando se introduce en un
individuo, preferiblemente un ser humano, puede inducir dentro de él
una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en tal
individuo frente a un polinucleótido y/o polipéptido BASB019
codificado a partir de él, en el que la composición comprende un
polinucleótido y/o polipéptido BASB019 recombinante codificado a
partir del mismo y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un
antígeno de dicho polinucleótido BASB019, polipéptido codificado a
partir del mismo, u otro polipéptido de la invención. La respuesta
inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede
tomar la forma de inmunidad de anticuerpos y/o inmunidad celular,
tal como inmunidad celular que surge de células T CD4+ o CTL.
Un polipéptido BASB019 o un fragmento del mismo
puede fusionarse con una coproteína o resto químico que puede o no
producir por sí mismo anticuerpos, pero que puede estabilizar la
primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada que
tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente
propiedades protectoras. Así la proteína recombinante fusionada,
preferiblemente comprende además una coproteína antigénica, tal como
lipoproteína D de Haemophilus influenzae,
glutatión-S-transferasa (GST) o
beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína
relativamente grande que solubilice la proteína y facilite la
producción y purificación de la misma. Es más, la coproteína puede
actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una
estimulación generalizada del sistema inmunitario del organismo que
recibe la proteína. La coproteína puede unirse con cualquiera de los
extremos amino o carboxilo-terminal de la primera
proteína.
Se proporcionan mediante esta invención
composiciones, particularmente composiciones de vacuna, y
procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos
de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como
las descritas en Sato, Y. et al. Science 273: 352 (1996).
También, se proporcionan mediante esta invención
procedimientos que usan el polinucleótido descrito o fragmentos
particulares del mismo, que han mostrado que codifican regiones no
variables de proteínas de superficie celular bacterianas, en los
constructos del polinucleótido usados en tales experimentos de
inmunización genética en modelos de animales de infección con
Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán
particularmente útiles para identificar epítopos de proteína que
pueden provocar una respuesta inmunitaria profiláctica o
terapéutica. Se cree que este enfoque permitirá la posterior
preparación de anticuerpos monoclonales de valor particular,
derivados a partir del órgano requerido del animal que resiste o
elimina la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o
tratamientos terapéuticos de la infección bacteriana,
particularmente infección por Moraxella catarrhalis, en
mamíferos, particularmente seres humanos.
La invención también incluye una formulación de
vacuna que comprende una polipéptido y/o polinucleótido recombinante
inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal
como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dado que los
polipéptidos y polinucleótidos pueden degradarse en el estómago, se
administra cada uno preferiblemente por vía parenteral, incluyendo,
por ejemplo, la administración que es subcutánea, intravenosa o
intradérmica. Las formulaciones adecuadas para la administración
parenteral incluyen disoluciones de inyección estéril acuosas y no
acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos
bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con el
fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individuo; y
suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir
agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden
presentarse en envases de dosis unitaria o múltiples dosis, por
ejemplo, ampollas selladas y viales y pueden almacenarse en una
condición liofilizada que sólo requiere la adición del vehículo
líquido estéril inmediatamente antes de su uso.
La formulación de vacuna de la invención también
puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad
de la formulación. Preferiblemente el sistema adyuvante provoca
preferentemente un tipo TH1 de respuesta.
Una respuesta inmunitaria puede diferenciarse
ampliamente en dos categorías extremas, siendo respuestas
inmunitarias humorales o mediadas por célula (tradicionalmente
caracterizadas por mecanismos de protección efectores celulares y de
anticuerpos respectivamente). Estas categorías de respuesta se han
denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células), y
respuestas inmunitarias de tipo TH2 (respuesta humoral).
Pueden caracterizarse las respuestas
inmunitarias de tipo TH1 extremas mediante la generación de
linfocitos T citotóxicos restringidos por haplotipo, específicos de
antígeno y respuestas de linfocitos citolíticos naturales. En
ratones, las respuestas de tipo TH1 a menudo se caracterizan por la
generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en seres
humanos éstas corresponden a anticuerpos de tipo IgGl. Las
respuestas inmunitarias de tipo TH2 se caracterizan por la
generación de una amplia gama de isotipos de inmunoglobulina
incluyendo IgG1, IgA, y IgM de ratones.
Puede considerarse que la fuerza motriz detrás
del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunitarias son las
citocinas. Altos niveles de citocinas de tipo TH1 tienden a
favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por
células frente a un antígeno dado, mientras que altos niveles de
citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas
inmunitarias humorales frente al antígeno.
La distinción entre respuestas inmunitarias de
tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará
una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente TH1
o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente
considerar las familias de citocinas en cuanto a los clones de
células T CD4+ murinas descritos por Mosmann y Coffman (Mosmann,
T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 y TH2 cells: different patterns of
lymphokine secretion lead to different functional properties.
Annual Review of Inmunology, 7, págs.
145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo
TH1 están asociadas con la producción de las citocinas
INF-\gamma e IL-2 por linfocitos
T. Otras citocinas a menudo directamente asociadas con la inducción
de respuestas inmunitarias de tipo TH1 no se producen por células T,
tales como IL-12. Por el contrario, las respuestas
de tipo TH2 están asociadas con la secreción de
IL-4, IL-5, IL-6 e
IL-13.
Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son
particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de
citocinas o bien de tipo TH1 o bien de tipo TH2. Tradicionalmente
los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta
inmunitaria tras una vacunación o infección incluyen la medición
directa de la producción de citocinas TH1 o TH2 por linfocitos T
in vitro tras una nueva estimulación con antígeno, y/o la
medición de la razón IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpos
específicas de antígeno.
Por tanto, un adyuvante de tipo TH1 es uno que
estimula preferentemente poblaciones de células T aisladas para
producir altos niveles de citocinas de tipo TH1 cuando se vuelven a
estimular con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo
tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuestas de
inmunoglobulina específicas de antígeno asociadas con el isotipo de
tipo TH1.
Los adyuvantes que pueden lograr una
estimulación preferente de la respuesta celular TH1 se describen en
las solicitudes de patente internacionales números WO 94/00153 y WO
95/17209.
El monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado
(3D-MPL) es uno de tales adyuvantes. Este se conoce
a partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla
de monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado con
4, 5 ó 6 cadenas aciladas y está fabricado por Ribi Inmunochem,
Montana. Una forma preferida de monofosforil-lípido
A 3-des-O-acilado se
describe en la patente europea 0 689 454 B 1 (SmithKline Beecham
Biologicals SA).
Preferiblemente, las partículas de
3D-MPL son lo suficientemente pequeñas para
filtrarse de manera estéril a través de una membrana de 0,22
micrómetros (patente europea número 0 689 454).
3D-MPL estará presente en el
intervalo de 10 \mug - 100\mug, preferiblemente de
25-50 \mug por dosis en el que el antígeno estará
presente normalmente en un intervalo de 2-50 \mug
por dosis.
Otro adyuvante preferido comprende QS21, una
fracción no tóxica purificada mediante Hplc derivada de la corteza
de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente ésta puede mezclarse con
monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado
(3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.
El procedimiento para la producción de QS21 se
describe en la patente estadounidense número 5.057.540.
Se han descrito anteriormente formulaciones de
adyuvante no reactogénicas que contienen QS21 (documento WO
96/33739). Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han
demostrado ser adyuvantes estimulantes de TH1 satisfactorios cuando
se formulan junto con un antígeno.
Adyuvantes adicionales que son estimulantes
preferentes de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos
inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas tal como
se describen en el documento WO 96/02555.
También se contemplan que combinaciones de
diferentes adyuvantes estimulantes de TH1, tales como las
mencionados anteriormente en el presente documento, proporcionan un
adyuvante que es un estimulador preferente de la respuesta celular
TH1. Por ejemplo, puede formularse QS21 junto con
3D-MPL. La razón de QS21: 3D-MPL
normalmente será del orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente de 1:5 a
5:1 y a menudo sustancialmente de 1:1. El intervalo preferido para
la sinergia óptima es 3D-MPL: QS21 de 2,5:1 a
1:1.
Preferiblemente también está presente un
vehículo en la composición según la invención. El vehículo puede ser
una emulsión de aceite en agua o una sal de aluminio, tal como
fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.
Una emulsión de aceite en agua preferida
comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno,
alfa-tocoferol y Tween 80. En un aspecto
particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna
según la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en
tal emulsión. Adicionalmente, la emulsión de aceite en agua puede
contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.
Normalmente para la administración a seres
humanos QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una
vacuna en el intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal
como 10-100 \mug, preferiblemente 10
\mug-50 \mug por dosis. Normalmente el aceite en
agua comprenderá desde el 2 hasta el 10% de escualeno, desde el 2
hasta el 10% de alfa-tocoferol y desde el 0,3 hasta
el 3% de tween 80. Preferiblemente la razón de escualeno:
alfa-tocoferol es igual o inferior a 1 dado que esto
proporciona una emulsión más estable. También puede estar presente
Span 85 a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que
las vacunas de la presente invención contengan además un
estabilizante.
Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas
contienen preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo escualano
o escualeno, un emulsionante, por ejemplo Tween 80, en un vehículo
acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina
tamponada con fosfato.
Una formulación de adyuvante particularmente
potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una
emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO
95/17210.
La presente invención también proporciona una
composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de
vacuna de la invención junto con otros antígenos, en particular
antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunitarias
y estados relacionados. Tal composición de vacuna polivalente puede
incluir un adyuvante que induce a TH-1 tal como se
describió anteriormente en el presente documento.
Aunque la invención se ha descrito en referencia
a algunos polipéptidos y polinucleótidos BASB019, debe entenderse
que esto cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos que
se producen de manera natural, y polipéptidos y polinucleótidos
similares con adiciones, deleciones o sustituciones que no afectan
sustancialmente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o
polinucleótidos recombinantes.
En un aspecto adicional de la invención se
proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB019 y/o un polipéptido BASB019 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.
BASB019 y/o un polipéptido BASB019 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.
La invención también se refiere a composiciones
que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido tratados en el
presente documento o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos
y polinucleótidos de la invención pueden emplearse junto con un
vehículo o vehículos no estériles o estériles para usar con células,
tejidos u organismos, tal como un vehículo farmacéutico adecuado
para su administración a un individuo. Tales composiciones
comprenden, por ejemplo, un aditivo del medio o una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la
invención y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución
salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol
y combinaciones de los mismos. La formulación debe ajustarse al modo
de administración. La invención además se refiere a paquetes y kits
de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes
llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la
invención anteriormente mencionadas.
Los polipéptidos, polinucleótidos y otros
compuestos de la invención pueden emplearse por separado o junto con
otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas pueden
administrarse de cualquier manera eficaz y conveniente, incluyendo,
por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal,
intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal
o intradérmica entre otras.
En un tratamiento o como un profiláctico, el
principio activo puede administrarse a un individuo como una
composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa
estéril, preferiblemente isotónica.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal
como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la
presente invención, péptido agonista o antagonista o compuesto
molecular pequeño, junto con un excipiente o vehículo
farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero no se
limitan a, solución salina, solución salina tamponada, agua,
glicerol, etanol y combinaciones de las mismas. La invención además
se refiere a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más
recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las
composiciones de la invención anteriormente mencionadas. Los
polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente
invención pueden emplearse por separado o junto con otros
compuestos, tales como compuestos
terapéuticos.
terapéuticos.
La composición se adaptará a la vía de
administración, por ejemplo mediante una vía sistémica u oral. Las
formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección,
normalmente mediante inyección intravenosa. Pueden usarse otras vías
de inyección, tales como subcutánea, intramuscular o
intraperitoneal. Los medios alternativos para la administración
sistémica incluyen administración por vía transmucosa y transdérmica
usando penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u
otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de
la presente invención pueden formularse en una formulación entérica
o encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La
administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o
localizada, en forma de unguentos, pastas, geles, disoluciones,
polvos y similares.
Para la administración a mamíferos, y
particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de
dosificación diaria del principio activo sea de desde 0,01 mg/kg
hasta 10 mg/kg, normalmente alrededor de 1 mg/kg. En cualquier caso
el médico determinará la dosificación real que será la más adecuada
para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta particular
del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son
ejemplares del caso promedio. Puede haber, por supuesto, situaciones
individuales en las que se necesiten intervalos de dosificación
superiores o inferiores, y tales están dentro del alcance de esta
invención.
El intervalo de dosificación requerido depende
de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza
de la formulación, la naturaleza del estado del sujeto, y el juicio
del médico que atiende. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas se
encuentran en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg de
sujeto.
Una composición de vacuna está convenientemente
en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para
potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para
la vacunación es de 0,5-5 microgramo/kg de antígeno,
y tal dosis preferiblemente se administra de 1-3
veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con el
intervalo de dosis indicado, no se observarán efectos toxicológicos
adversos con los compuestos de la invención que impedirían su
administración a individuos adecuados.
Sin embargo, deben esperarse amplias variaciones
en la dosificación necesitada en vista de la variedad de compuestos
disponibles y las distintas eficacias de las diversas vías de
administración. Por ejemplo, se espera que la administración oral
requiera dosificaciones superiores que la administración mediante
inyección intravenosa. Pueden ajustarse las variaciones en estos
niveles de dosificación usando rutinas empíricas habituales para la
optimización, como se entiende bien en la técnica.
Las secuencias de polinucleótido y polipéptido
forman un recurso de información valiosa con el que determinar sus
estructuras de 2- y 3-dimensiones así como para
identificar secuencias adicionales de homología similar. Estos
enfoques se facilitan más fácilmente almacenando la secuencia en un
medio legible por ordenador y luego usando los datos almacenados en
un programa de estructura macromolecular conocido o para buscar una
base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda
conocidas, tales como el paquete del programa GCG.
También se proporcionan por la invención
procedimientos para el análisis de hebras o secuencias de carácter,
particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas
codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencia
incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de
secuencia, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de
estructura de proteínas, ARN y ADN, ensamblaje de secuencias,
análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias,
determinación de marco de lectura abierto, denominación de bases de
ácido nucleico, análisis del uso del codón, recorte de bases de
ácido nucleico, y análisis de picos de cromatogramas de
secuenciación.
Se proporciona un procedimiento basado en
ordenador para realizar la identificación por homología. Este
procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera
secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de un
polinucleótido de la invención en un medio legible por ordenador; y
comparar dicha primera secuencia polinucleotídica con al menos una
segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar
por homología.
También se proporciona un procedimiento basado
en ordenador para realizar identificación por homología,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: proporcionar una
primera secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de un
polipéptido de la invención en un medio legible por ordenador; y
comparar dicha primera secuencia polipeptídica con al menos una
segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar
por homo-
logía.
logía.
Todas las publicaciones y referencias,
incluyendo pero sin limitarse a patentes y solicitudes de patente,
citadas en esta memoria descriptiva, se incorporan al presente
documento en su totalidad como referencia como si cada publicación o
referencia individual estuviesen indicadas específica e
individualmente para incorporarse al presente documento como
referencia tal como se esta exponiendo en detalle. Cualquier
solicitud de patente frente a la que esta solicitud reivindique
prioridad también se incorpora al presente documento como referencia
en su totalidad de la manera descrita anteriormente para
publicaciones y referencias.
\newpage
"Identidad", tal como se conoce en la
técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o
dos o más secuencias polinucleotídicas, como puede ser el caso, tal
como se determina comparando las secuencias. En la técnica,
"identidad" también significa el grado de relación de secuencia
entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, como puede ser
el caso, tal como se determina mediante el apareamiento entre las
hebras de tales secuencias. Puede calcularse fácilmente la
"identidad" mediante procedimientos conocidos, incluyendo pero
sin limitarse a los descritos en (Computational Molecular Biology,
Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988;
Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed.,
Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence
Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press,
Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von
Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer,
Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York,
1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073
(1988). Los procedimientos para determinar la identidad están
diseñados para proporcionar el mayor apareamiento entre las
secuencias sometidas a prueba. Además, los procedimientos para
determinar la identidad están codificados en programas de ordenador
disponibles públicamente. Los procedimientos de programas de
ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias
incluyen, pero no se limitan a, el programa GAP en el paquete del
programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12
(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J.
Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson y
Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA85; 2444-2448
(1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente
de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al.,
NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J Mol.
Biol. 215: 403-410 (1990). También puede usarse el
algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la
identidad.
Los parámetros para la comparación de secuencias
polipeptídicas incluyen los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48:
443-453 (1970)
Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y
Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919
(1992)
Penalización por hueco: 8
Penalización por longitud de hueco: 2
Un programa útil con estos parámetros está
disponible públicamente como el programa "gap" de Genetics
Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados
son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto
con sin penalización para huecos finales).
Los parámetros para la comparación de secuencias
polinucleotídicas incluyen los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48:
443-453 (1970)
Matriz de comparación: apareamientos = +10,
desapareamientos = 0
Penalización por hueco: 50
Penalización por longitud de hueco: 3
Disponible como: el programa "gap" de
Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por
defecto para comparaciones de ácidos nucleicos.
Un significado preferido para "identidad"
para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se
proporcionan en (1) y (2) a continuación.
(1) Las realizaciones de polinucleótido pueden
además incluir un polinucleótido aislado que comprende una secuencia
polinucleotídica que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70,
80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con la secuencia de referencia de SEQ ID
NO:1, en la que dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica
a la secuencia de referencia de SEQ ID NO:1 o puede incluir hasta un
cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la
secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se
seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción,
sustitución de nucleótidos, incluyendo transición y transversión o
inserción, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las
posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de nucleótidos de
referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales,
intercaladas bien individualmente entre los nucleótidos en la
secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro
de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de
alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número
total de nucleótidos en SEQ ID NO:1 por el número entero que define
el porcentaje de identidad dividido por 100 y luego restando ese
producto de dicho número total de nucleótidos en SEQ ID NO:1, o:
n_{n} \leq
x_{n} - (x_{n} \cdot
y),
\newpage
en la que n_{n} es el número de
alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de
nucleótidos en SEQ ID NO:1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%,
0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el
90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y
\cdot es el símbolo para el operador multiplicación, y en la que
cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo
hasta el número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}. Las
alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica el
polipéptido de SEQ ID NO:2 pueden crear mutaciones sin sentido, de
pérdida de sentido o de desplazamiento de marco en esta secuencia
codificante y por tanto alterar el polipéptido codificado por el
polinucleótido tras tales
alteraciones.
A modo de ejemplo, una secuencia
polinucleotídica de la presente invención puede ser idéntica a la
secuencia de referencia de SEQ ID NO: 1, es decir puede ser idéntica
en el 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de
alteraciones de ácido nucleico si se compara con la secuencia de
referencia de manera que el porcentaje de identidad es inferior a
una identidad del 100%. Tales alteraciones se seleccionan del grupo
constituido por al menos una deleción, sustitución de ácido
nucleico, incluyendo transición y transversión o inserción y en la
que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones
terminales 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica de referencia o
en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas
bien individualmente entre los ácido nucleicos en la secuencia de
referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la
secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácido nucleico
para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el
número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO:1 por el número entero
que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y luego
restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en
SEQ ID NO: 1, o:
n_{n} \leq
x_{n} - (x_{n} \cdot
y),
en la que n_{n} es el número
total de alteraciones de ácido nucleico, x_{n} es el número total
de ácidos nucleicos en SEQ ID NO:1, y es, por ejemplo 0,70 para el
70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85% etc., \cdot es el símbolo
para el operador multiplicación, y en la que cualquier producto no
entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero
más próximo antes de restarlo de
x_{n}.
(2) Las realizaciones de polipéptido además
incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que
tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó
100% con una secuencia de referencia polipeptídica de SEQ ID NO:2,
en la que dicha secuencia polipeptídica puede ser idéntica a la
secuencia de referencia de SEQ ID NO:2 o puede incluir hasta un
cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la
secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se
seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción,
sustitución de aminoácidos, incluyendo sustitución conservativa y no
conservativa, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en
las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia
polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas
posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los
aminoácidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos
contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que el
número total de alteraciones de aminoácidos se determina
multiplicando el número total de aminoácidos en SEQ ID NO:2 por el
número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100
y luego restando ese producto de dicho número total de aminoácidos
en SEQ ID NO:2, o:
n_{a} \leq
x_{a} - (x_{a} \cdot
y),
en la que n_{a} es el número de
alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de
aminoácidos en SEQ ID NO:2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%,
0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el
90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y
\cdot es el símbolo para el operador multiplicación, y en la que
cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo
hasta el número entero más próximo ante de restarlo de
x_{a}.
A modo de ejemplo, una secuencia polipeptídica
de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de
referencia de SEQ ID NO:2, es decir puede ser idéntica en un 100%, o
puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de
aminoácidos comparada con la secuencia de referencia de manera que
el porcentaje de identidad es inferior a una identidad del 100%.
Tales alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos
una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no
conservativa, o inserción de aminoácidos, y en la que dichas
alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo
terminal de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier
lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas bien
individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia
o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de
referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de
identidad dado se determina multiplicando el número total de
aminoácidos en SEQ ID NO:2 por el número entero que define el
porcentaje de identidad dividido por 100 y luego restando ese
producto de dicho número total de aminoácidos en SEQ ID NO:2, o:
n_{a} \leq
x_{a} - (x_{a} \cdot
y),
en la que n_{a} es el número de
alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de
aminoácidos en SEQ ID NO:2, y es, por ejemplo 0,70 para el 70%, 0,80
para el 80%, 0,85 para el 85% etc., y \cdot es el símbolo para el
operador multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de
x_{a} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más
próximo ante se restarlo de
x_{a}.
"Individuo(s)", cuando se usa en el
presente documento con referencia a un organismo, significa un
eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitarse a un metazoo,
un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un ser
humano.
"Aislado" significa alterado "por la mano
del hombre" de su estado natural, es decir, si se produce en la
naturaleza, si se ha cambiado o eliminado de su ambiente original, o
ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presentes de
manera natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el
mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales
coexistentes de su estado natural está "aislado", tal como se
emplea el término en el presente documento. Además, un
polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo
mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier
otro procedimiento recombinante está "aislado" incluso si aún
está presente en dicho organismo, pudiendo estar el organismo vivo o
no vivo.
"Polinucleótido(s)" generalmente se
refiere a cualquier poliribonucleótido o polidesoxiribonucleótido,
que puede ser ADN o ARN no modificados o ADN o ARN modificados
incluyendo regiones de cadena sencilla y doble.
"Variante" se refiere a un polinucleótido o
polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de
referencia, pero conserva propiedades esenciales. Una variante
típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos
de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de
nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de
referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado
sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de
aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de
referencia, tal como se trata a continuación. Una variante típica de
un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro,
polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias están
limitadas de manera que las secuencias del polipéptido de referencia
y la variante son estrechamente similares de manera global y, en
muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de
referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o
más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación.
Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede estar codificado
o no por el código genético. Una variante de un polinucleótido o
polipéptido puede producirse de manera natural tal como una variante
alélica, o puede ser un variante que no se sabe que se produce de
manera natural. Las variantes que no se producen de manera natural
de polinucleótidos y polipéptidos pueden prepararse mediante
técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.
"Enfermedad(es)" significa cualquier
enfermedad provocada por o relacionada con una infección por
bacterias, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y
niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y
enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida auditiva,
acumulación de fluido en el oído medio, daño del nervio auditivo,
aprendizaje del habla retrasado, infección del aparato respiratorio
superior e inflamación del oído medio.
Los ejemplos a continuación se realizan usando
técnicas habituales, que son bien conocidas y rutinarias para los
expertos en la técnica, excepto cuando se describa lo contrario en
detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la
invención.
Se descubrió por primera vez el gen de BASB019
en la base de datos Incyte PathoSeq que contenía secuencias de ADN
genómico no completas de la cepa ATCC 43617 (también denominada cepa
MC2931) de Moraxella catarrhalis. La traducción de la
secuencia del polipéptido BASB019 mostró similitud significativa
(43% de identidad en la longitud completa de las proteínas) respecto
a la proteína PAL de Pseudomonas putida, conocida como una
lipoproteína de la membrana externa asociada a peptidoglucano.
Además, se confirmó la secuencia del gen de
BASB019 experimentalmente. Con este fin, se extrajo ADN genómico de
10^{10} células de las células de M catarrhalis (cepa ATCC
43617) usando el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen
Gmbh), y se sometió 1 \mug de este material a amplificación de ADN
mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores
E475765 (5'- CCC TTA TTA ATT GAC AAT CAC -3') [SEQIDNO:9] y E475776
(5'- GGC AGA GTG AAT CTTAAG C-3') [SEQIDNO:10]
ubicados fuera de la región codificante de BASB019. Se purificó este
producto de PCR en un aparato Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) y se
sometió a secuenciación de ADN usando el kit de secuenciación Big
Dye Cycle (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN
ABI 377/PRISM. Se realizó la secuenciación de ADN en ambas cadenas
con una redundancia de 2 y se ensambló la secuencia de longitud
completa usando el software Sequencher™ (Applied Biosytems). La
secuencia de ADN resultante resultó ser un 100% idéntica a SEQ ID
NO:1.
Se extrajo ADN genómico de 16 cepas de M.
catarrhalis (presentadas en la tabla 1) tal como se describe a
continuación. Se cultivó en línea M. catarrhalis para
detectar colonias sencillas sobre placas de agar BHI y se hizo
crecer durante toda la noche a 37°C. Se cogieron tres o cuatro
colonias sencillas y se usaron para inocular un cultivo semilla de
\sim1,5 ml de caldo BHI (infusión cerebro-corazón)
que se hizo crecer durante toda la noche en un incubador con
agitación, \sim300 rpm, a 37°C. Se inoculó un matraz erlenmeyer de
500 ml que contenía \sim150 ml de caldo BHI con el cultivo semilla
y se hizo crecer durante \sim12-16 horas a 37°C en
un incubador con agitación, \sim175 rpm, para generar masa celular
para el aislamiento de ADN. Se recogieron las células mediante
centrifugación en un rotor Sorvall GSA a \sim2000 X g durante 15
minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se
suspendió el sedimento celular en \sim5,0 ml de agua estéril. Se
añadió un volumen igual de tampón de lisis (NaCl 200 mM, EDTA 20
mM, Tris-Hcl 40 mM, pH 8,0, SDS al 0,5% (p/v),
2-mercaptoetanol al 0,5% (v/v), y 250 \mug/ml de
proteinasa K) y se suspendieron las células mediante agitación suave
y trituración. Luego se incubó la suspensión celular \sim12 horas
a 50°C para lisar las bacterias y liberar el ADN cromosómico. Se
precipitó el material proteico mediante la adición de 5,0 ml de NaCl
saturado (\sim6,0 M, en agua estéril) y centrifugación a
\sim5,500 x g en un rotor Sorvall SS34 a temperatura ambiente. Se
precipitó el ADN cromosómico a partir del sobrenadante clarificado
mediante la adición de dos volúmenes de etanol al 100%. Se recogió
el ADN agregado y se lavó usando agitación suave en un volumen
pequeño de una disolución de etanol al 70%. Se suspendió el ADN
cromosómico en agua estéril y se dejó que se disolviese/desembolsase
durante toda la noche a 4°C mediante balanceo suave. Se determinó la
concentración de ADN disuelto espectrofotométricamente a 260 nm
usando un coeficiente de extinción de 1,0 unidad de D.O. \sim50
\mug/ml.
Luego se sometió este material a amplificación
por PCR usando los oligonucleótidos
MC-P6-Bam-F
(5'-AAG GGC CCA ATT ACGCAG AGG GGA TCC AAT AAA TCA
ACA AGT CAA GTT ATG GTT GCT CC) [SEQ ID NO:11] y
MC-P6-Sal-RC
(5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA ATA
AGA CAG TTC AGC ACG ACG ATT TTG TGA CC-3') [SEQ ID
NO:12]. Se sometieron los amplicones del gen de BASB019
correspondientes independientemente a hidrólisis usando enzimas de
restricción (AciI, AluI, BbvI, MaeIII, MseI, RsaI) y se
separaron los productos de restricción mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida o agarosa usando procedimientos de biología
molecular habituales tal como se describe en "Molecular Cloning, a
Laboratory Manual, Segunda Edición, Eds: Sambrook, Fritsch &
Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989". Las fotografías de los
geles de electroforesis resultantes se muestran en la figura 1. Para
cada cepa, se puntuaron y se combinaron los patrones de RFLP
correspondientes a las 6 enzimas de restricción. Luego se definieron
grupos de cepas que compartían idéntica combinación de patrones de
RFLP. Usando esta metodología, las cepas sometidas a prueba en este
estudio se clasificaron en 4 grupos genómicos (Grupo 1: Mc2904, Mc
2911, Mc 2912, Mc2956 y Mc2969; Grupo 2: Mc2905, Mc 2906, Mc2907,
Mc2908, Mc2910, Mc2913, Mc2926, Mc2975; Grupo 3: Mc2909, Mc2931 y
Grupo 4: Mc2960). Estos datos apoyan que la población de
Moraxella catarrhalis usada en este estudio muestra una
diversidad de secuencia de nucleótidos limitada para el gen de
BASB019.
Se clasificó la cepa ATCC 43617 (Mc2931) usada
para determinar la secuencia de BASB019 mediante RFLP en el grupo
número 3. Usando el procedimiento experimental tal como se describió
en el ejemplo 1, también se determinó la secuencia del gen de
BASB019 para cepas de Moraxella catarrhalis representativas
de otros dos grupos genómicos de RFLP (Gr.1 (Mc2911,Mc2969) y Gr.4
(Mc2960)). Las secuencias polinucleotídicas del gen de BASB019 de
las cepas MC2911, MC2960 y MC2969 se muestran en SEQ ID NO:3, 5 y 7,
respectivamente. Se tradujeron estas secuencias polinucleotídicas en
secuencias de aminoácidos, que se muestran en SEQ ID NO:4, 6 y 8,
respectivamente. Usando el programa PILEUP del paquete GCG, se
realizó un alineamiento múltiple de las secuencias polinucleotídicas
de SEQ ID NO:1, 3, 5 y 7, y se muestra en la figura 2. En la tabla 2
se resume una comparación de identidades por parejas, que muestra
que las cuatro secuencias génicas de nucleótidos de BASB019 son
todas similares en un nivel de identidad igual a o superior al 97%.
Usando el mismo programa PILEUP del paquete GCG, se realizó un
alineamiento múltiple de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID
NO:2, 4, 6 y 8, y se muestra en la figura 3. En la tabla 3, se
resume una comparación de identidades por parejas, que muestra que
las cinco secuencias de proteínas BASB019 son todas similares en un
nivel de identidad igual o superior al 97%.
Los sitios de restricción BamHI y SalI
modificados mediante ingeniería en los cebadores de amplificación
directo ([SEQIDNO:11]) e inverso ([SEQIDNO:12]), respectivamente,
permitieron la clonación direccional de las 504 pb del producto de
PCR en el plásmido de expresión pQE30 de E.coli
comercialmente disponible (QiaGen, resistente a ampicilina) de
manera que pueda expresarse una proteína BASB019 madura como una
proteína de fusión que contiene una marca de cromatografía de
afinidad (His)6 en el extremo N-terminal. Se
purificó el producto de PCR de BASB019 de 504 pb a partir de la
reacción de amplificación usando columnas de centrifugación basadas
en gel de sílice (QiaGen) según las instrucciones del fabricante.
Para producir los extremos BamHI y SalI requeridos para la
clonación, se digirió secuencialmente el producto de PCR purificado
hasta la finalización con enzimas de restricción BamHI y SalI tal
como se recomienda por el fabricante (Life Technologies). Tras la
primera digestión de restricción, se purificó el producto de PCR
mediante columna de centrifugación como anteriormente para eliminar
sales y se eluyó en agua estéril antes de la segunda digestión
enzimática. Se purificó de nuevo el fragmento de ADN digerido
usando columnas de centrifugación basadas en gel de sílice antes del
acoplamiento con el plásmido pQE30.
Para preparar el plásmido de expresión pQE30
para el acoplamiento, se digirió similarmente hasta finalización
tanto con BamHI como con SalI y luego se trató con fosfatasa
intestinal de ternero (CIP, \sim0,02 unidades/pmol de extremo 5',
Life Technologies) tal como recomienda el fabricante para evitar el
autoacoplamiento. Se usó un exceso molar de aproximadamente 5 veces
del fragmento digerido con respecto al vector preparado para
programar la reacción de acoplamiento. Se realizó una reacción de
acoplamiento de \sim20 \mul habitual (\sim16°C, \sim16
horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica, usando
una ADN ligasa de T4 (\sim2,0 unidades/reacción, Life
Technologies). Se usó una alícuota del acoplamiento (\sim5 \mul)
para transformar células electrocompetentes M15(pREP4) según
procedimientos bien conocidos en la técnica. Tras un periodo de
sobrecrecimiento de \sim2-3 horas a 37°C en
\sim1,0 ml de caldo LB, se colocaron las células transformadas en
placas de agar LB que contenían kanamicina (50 \mug/ml) y
ampicilina (100 \mug/ml). Se incluyeron ambos antibióticos en el
medio de selección para garantizar que todas las células
transformadas portaban tanto el plásmido pREP4 (KnR), que porta el
gen lacIq necesario para la represión de la expresión para la
expresión inducible por IPTG de proteínas sobre pQE30, como el
plásmido pQE30-MCP6 (ApR). Se incubaron las placas
durante toda la noche a 37°C durante \sim16 horas. Se cogieron
colonias KnR/ApR individuales con palillos estériles y se usaron
para "sembrar por zonas" en placas de LB KnR/ApR frescas
inoculadas así como un caldo de cultivo de LB KnR/ApR de \sim1,0
ml. Tanto las placas sembradas por zonas como el caldo de cultivo se
incubaron durante toda la noche a 37°C bien en un incubador habitual
(placas) o bien en un baño de agua con agitación.
Se empleó un análisis por PCR basado en células
completas para verificar que los transformantes contenían el inserto
de ADN de BASB019. Aquí, se transfirió el \sim1,0 ml de de caldo
de cultivo LB Kn/Ap LB durante toda la noche a un tubo de
polipropileno de 1,5 ml y se recogieron las células mediante
centrifugación en una microcentrífuga de Beckmann (\sim3 min.,
temperatura ambiente, \sim12,000 X g). Se suspendió el sedimento
celular en \sim200 \mul de agua estéril y se usó una alícuota de
\sim10 \mul para programar una reacción PCR de volumen final de
\sim50 \mul que contenía ambos cebadores de amplificación de
BASB019 directo e inverso. Las concentraciones finales de los
componentes de reacción de PCR fueron esencialmente los mismos que
los especificados en el ejemplo 2 excepto que se usaron \sim5,0
unidades de Taq polimerasa. Se aumentó la etapa de desnaturalización
a 95°C inicial hasta 3 minutos para garantizar la alteración térmica
de las células bacterianas y la liberación de ADN del plásmido. Se
usaron un ciclador térmico ABI modelo 9700 y un perfil de
amplificación térmica de tres etapas y de 32 ciclos, es decir 95°C,
45 seg; 55-58°C, 45 seg, 72°C, 1 min., para
amplificar el fragmento de PCR MC-P6 de las muestras
transformantes lisadas. Tras la amplificación térmica, se analizó
una alícuota de \sim20 \mul mediante electroforesis en gel de
agarosa (agarosa al 0,8% en un tampón
Tris-acetato-EDTA (TAE)). Se
visualizaron los fragmentos de ADN mediante iluminación por UV tras
la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se sometió
a electroforesis un patrón de tamaño molecular de ADN (escala de 1
Kb, Life Technologies) en paralelo con las muestras de prueba y se
usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Se identificaron
los transformantes que producían el producto de PCR de 504 pb
esperado como cepas que contenían un constructo de expresión de
BASB019. Luego se analizaron cepas que contenían plásmidos de
expresión para determinar la expresión inducible de BASB019
recombinante.
Para cada transformante positivo para PCR
identificado anteriormente, se inocularon \sim5,0 ml de caldo LB
que contenía kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml)
con células de la placa sembrada por zonas y se hicieron crecer
durante toda la noche a 37°C con agitación (\sim250 rpm). Se
inoculó una alícuota del cultivo semilla durante toda la noche
(\sim1,0 ml) en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía
\sim25 de caldo LB Kn/Ap y se hizo crecer a 37°C con agitación
(\sim250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una
D.O.600 de \sim0,5, es decir fase semilogarítmica (normalmente
aproximadamente 1,5-2,0 horas). En este momento, se
transfirió aproximadamente la mitad del cultivo (\sim12,5 ml) a un
segundo matraz de 125 ml y se indujo la expresión de proteína
MC-P6 recombinante mediante la adición de IPTG
(disolución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una
concentración final de 1,0 mM. La incubación tanto de cultivos
inducidos como no inducidos por IPTG continuó durante unas \sim4
horas adicionales a 37°C con agitación. Se eliminaron muestras
(\sim1,0 ml) tanto de cultivos inducidos como no inducidos tras el
periodo de inducción y se recogieron las células por centrifugación
en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante -3 minutos. Se
suspendieron los sedimentos celulares individuales en \sim50
\mul de agua estéril, luego se mezclaron con un volumen igual de
tampón de muestra Laemelli SDS-PAGE 2X que contenía
2-mercaptoetanol, y se colocaron en un baño de agua
hirviendo durante \sim3 min para desnaturalizar la proteína. Se
cargaron volúmenes iguales (\sim15 \mul) tanto de lisados
celulares crudos inducidos como no inducidos por IPTG sobre gel de
Tris/glicina poliacrilamida duplicado al 12% (1 mm de espesor,
Mini-geles, Novex). Las muestras de lisados
inducidos y no inducidos se sometieron a electroforesis junto con
marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en
condiciones convencionales usando un tampón de elución
SDS/Tris/glicina habitual (BioRad). Tras la electroforesis, se tiñó
un gel con azul brillante de Commassie R250 (BioRad) y luego se
destiñó para visualizar proteína(s) MC-P6
novedosa(s) inducible(s) por IPTG. Se sometió a
electroinmunotransferencia el segundo gel sobre una membrana de PVDF
(tamaño de poro de 0,45 micras, Novex) durante \sim2 hrs a 4°C
usando un aparato de inmunotransferencia BioRad
Mini-Protean II y tampón de transferencia de metanol
de Towbin (20%). Se realizaron bloqueo de la membrana e incubaciones
de anticuerpo según procedimientos bien conocidos en la técnica. Se
usó un anticuerpo anti-RGS (His)3 monoclonal,
seguido por un segundo anticuerpo de conejo
anti-ratón conjugado con HRP (QiaGen), para
confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante
MC-P6. Se logró la visualización del patrón reactivo
del anticuerpo anti-His usando bien un sustrato
insoluble en ABT o bien usando Hyperfilm con el sistema de
quimioluminiscencia ECL de Amersham.
Para verificar adicionalmente que la proteína
BASB019 recombinante inducible por IPTG que se está expresando está
en el marco de lectura abierto correcto y no es una molécula falsa
que surge de un artefacto de clonación (es decir un desplazamiento
de marco), se determinó la secuencia de ADN del inserto clonado. Se
obtuvo la secuencia de ADN para el gen de BASB019 de M. catarrhalis
a partir de una cadena usando metodologías de secuenciación en ciclo
por PCR asimétrica convencional (ABI Prism
Dye-Terminator Cycle Sequencing,
Perkin-Elmer). Se programaron las reacciones de
secuenciación con ADN de plásmido de expresión no digerido
(\sim0,5 \mug/rxn) como molde y cebadores de secuenciación
específicos del vector pQE30 y específicos de ORF apropiados
(\sim3,5 pmol/rxn). Además del molde y el cebador de
secuenciación, cada reacción de secuenciación (\sim20 \mul)
contenía los cuatro dNTP diferentes (es decir A, G, C, y T) y los
cuatro nucleótidos de terminación ddNTP correspondientes (es decir
ddA, ddG, ddC, y ddT); estando cada terminador conjugado con uno de
los cuatro colorantes fluorescentes, Joe, Tam, Rox, o Fam. Se
terminaron los productos de elongación de secuenciación de cadena
sencilla en posiciones aleatorias a lo largo del molde mediante
incorporación de los terminadores ddNTP marcados con colorante. Los
productos de terminación marcados con colorantes fluorescentes se
purificaron usando columnas de cromatografía de exclusión molecular
microcentrífugas (Princeton Genetics), se secaron a vacío, se
suspendieron en un tampón de resuspensión de molde
(Perkin-Elmer) para electroforesis capilar o para
PAGE en formamida desionizada, se desnaturalizaron a 95°C durante
\sim5 min, y se analizaron mediante electroforesis capilar de alta
resolución (secuenciador de ADN automatizado ABI 310,
Perkin-Elmer) o PAGE de alta resolución
(secuenciador de ADN automatizado ABI 377) tal como se recomienda
por el fabricante. Se recogieron los datos de la secuencia de ADN
producidos a partir de reacciones individuales y se analizaron
automáticamente las intensidades de picos fluorescentes relativas en
un ordenador PowerMAC usando el software de análisis de secuencia
ABI (Perkin-Elmer). Se editaron manualmente las
secuencias de ADN autoanalizadas individualmente para precisión
antes de fusionarse en una "hebra" de secuencia de cadena
sencilla consenso usando el software AutoAssembler
(Perkin-Elmer). La secuenciación determinó que el
plásmido de expresión contenía el marco de lectura abierto
correcto.
Se usó una cepa de expresión recombinante M15
(pREP4) de E. coli que contenía un plásmido (pQE30) que
codifica BASB019 de M catarrhalis para producir masa celular
para la purificación de proteína recombinante. Se cultivó la cepa de
expresión sobre placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de
kanamicina ("Kn") y 100 \mug/ml de ampicilina ("Ap")
para garantizar que se mantenían tanto el plásmido de control pREP4
lacIq como el constructo de expresión pQE30-BASB019.
Para conservación criogénica a -80ºC, se propagó la cepa en caldo LB
que contenía la misma concentración de antibióticos, luego se mezcló
con un volumen igual de caldo LB que contenía glicerol al 30%
(p/v).
El medio de fermentación usado para la
producción de proteína recombinante estaba constituido por caldo YT
2X (Difco) que contenía 50 \mug/ml de Kn y 100 \mug/ml de Ap. Se
añadió antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l
(Antiespumante 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína
recombinante BASB019, se añadió IPTG (Isopropil
\beta-D-tiogalactopiranósido) al
fermentador (1 mM, final).
Se inoculó un matraz semilla erlenmeyer de 500
ml, que contenía 50 ml de volumen de trabajo, con 0,3 ml de cultivo
congelado rápidamente descongelado, o varias colonias de un cultivo
en placas de agar selectivas, y se incubó durante aproximadamente 12
horas a 37\pm1°C sobre una plataforma con agitación a 150 rpm
(Innova 2100, New Brunswick Scientific). Luego se usó este cultivo
semilla para inocular un fermentador de 5 l de volumen de trabajo
que contenía caldo YT 2X y ambos antibióticos Kn y Ap. El
fermentador (Bioflo3000, New Brunswick Scientific) funcionó a
37\pm1°C, rociador de aire 0,2-0,4 VVM, 250 rpm en
impulsores Rushton. No se controló el pH ni en el cultivo semilla
del matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH
osciló de 6,5 a 7,3 en el fermentador. Se añadió IPTG (disolución
madre 1,0 M, preparada en agua estéril) al fermentador cuando el
cultivo alcanzó crecimiento semilogarítmico (\sim0,7 unidades de
D.O.600). Se indujeron células durante 2-4 horas,
luego se cultivaron mediante centrifugación usando bien la
centrífuga 28RS Heraeus (Sepatech) o bien la centrífuga de
supervelocidad RC5C (Sorvall Instruments). Se almacenó la pasta
celular a -20ºC hasta que se procesó.
Se obtuvieron imidazol, clorhidrato de
guanidina, Tris (hidroximetil), y EDTA (ácido etilendiamina
tetraacético) de calidad biotecnológica o mejor de Ameresco
Chemical, Solon, Ohio. Triton X-100
(t-Octilfenoxipolietoxi-etanol),
fosfato de sodio, monobásico, y urea eran de calidad para reactivo o
mejor y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis,
Missouri. Se obtuvieron ácido acético glacial y ácido clorhídrico de
Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey. Se obtuvo
metanol de Fisher Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey. Se obtuvieron
Pefabloc®SC (fluoruro de
4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo),
comprimidos combinados de inhibidores de proteasa completos, y PMSF
(fluoruro de fenilmetil-sulfonilo) de Roche
Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. Se obtuvieron
bestatina, pepstatina A, e inhibidor de proteasa
E-64 de Calbiochem, LaJolla, California. Se obtuvo
solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1x PBS) de
Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland. Se obtuvo solución
salina tamponada con fosfato de Dulbecco (10x PBS) de Bio Whittaker,
Walkersville, Maryland. Se obtuvo anticuerpo
penta-His, libre de BSA de QiaGen, Valencia,
California. Se obtuvo IgG de cabra anti-ratón
AffiniPure conjugada con peroxidasa de Jackson Inmuno Research,
WestGrove, Penn. Se obtuvo una disolución sencilla de AEC de Zymed,
San Francisco Sur, California. Todos los demás productos químicos
eran de calidad para reactivo o mejores.
Se obtuvo resina de superflujo
Ni-NTA de QiaGen Inc., Valencia, California. Se
obtuvieron geles de tris-glicina al
4-20% y poliacrilamida al 10-20%
precolados, todos los tampones de elución y disoluciones, patrones
preteñidos SeeBlue, patrones multimarca multicoloreados y membranas
de transferencia PVDF de Novex, San Diego, California. Se obtuvieron
kits de tinción de plata de SDS-PAGE de Daiichi Pure
Chemicals Company Limited, Tokyo, Japon. Se obtuvo disolución de
tinción de Coomassie de Bio-Rad Laboratories,
Hercules, California. Se obtuvieron filtros de jeringa de 0,2 m
Acrodisc® PF de Pall GelmanSciences, Ann Arbor, Michigan. Se
obtuvieron filtros de jeringa desechables de 25 mm GD/X de Whatman
Inc., Clifton, Nueva Jersey. Se obtuvieron tubos de diálisis 8,000
MWCO de BioDesign Inc. Od Nueva York, Carmal Nueva York. Se
obtuvieron reactivos de ensayo de proteína BCA y tubos de diálisis
piel de serpiente 3,500 MWCO de Pierce Chemical Co., Rockford,
Ilinois.
Se descongeló pasta celular a temperatura
ambiente durante 30 a 60 minutos. Se pesaron de cinco a seis gramos
de material en un tubo de centrifugado desechable de 50 ml. A esto
se añadieron cinco ml/gramo de tampón de clorhidrato de guanidina
(Gu-HCl) (clorhidrato de guanidina 6 M, fosfato de
sodio 100 mM, monobásico, Tris 1,0 mM y Triton X-100
al 0,05%, pH 8,0). Se resuspendió la pasta celular usando un
homogeneizador procientífico PRO300D, a 3/4 de potencia durante un
minuto. Luego se colocó la mezcla de extracción a temperatura
ambiente con agitación suave durante 60 a 90 minutos. Después de 60
a 90 minutos se centrifugó la mezcla de extracción a 15.800 x g
durante 15 minutos (centrífuga Sorvall RC5C, 11.500 rpm). Se decantó
el sobrenadante (S1) y se guardó para purificación adicional. Se
guardó el sedimento (P1) para el análisis.
Se añaden al S 1 de tres a cuatro ml de resina
de Ni-NTA. Luego se coloca ésta a temperatura
ambiente con agitación suave durante una hora. Tras una hora se
empaqueta la S1/Ni-NTA en una columna XK16 de
Pharmacia. Luego se lava la columna con tampón
Gu-HCl 1 M (clorhidrato de guanidina 1 M, fosfato de
sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100
al 0,05%, pH 8,0). A esto le sigue un lavado con tampón fosfato
(fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton
X-100 al 0,05%, pH 6,3). Luego se eluye la proteína
de la columna con un tampón de imidazol 250 mM (imidazol 250 mM,
fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton
X-100 al 0,05%, pH 5,9).
Se formuló BASB019 mediante diálisis durante
toda la noche frente a tres cambios de Triton X-100
al 0,1% y PBS 1x, pH 7,4 (pH 12,0 para MC-D15), para
eliminar Gu-HCl e imidazol residual. Se caracterizó
la proteína purificada y se usó para producir anticuerpos tal como
se describe a continuación.
Se resolvió la proteína purificada recombinante
sobre geles de poliacrilamida al 4-20% y se
trasfirió electroforéticamente a membranas de PVDF a 100 V durante 1
hora tal como se describió previamente (Thebaine et al. 1979,
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76:4350-4354). Luego se
pretrataron las membranas PVDF con 25 ml de solución salina
tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía leche seca no grasa
al 5%. Todas las incubaciones posteriores se realizaron usando este
tampón de pretratamiento.
Se incubaron las membranas PVDF con 25 ml de una
dilución 1:500 de suero preinmunitario o suero inmunitario de conejo
anti-His durante 1 hora a temperatura ambiente.
Luego se lavaron las membranas de PVDF dos veces con tampón de
lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro de sodio 150
mM y Tween-20 al 0,05%). Se incubaron las membranas
de PVDF con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra
anti-conejo marcada con peroxidasa (Jackson
InmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Luego se lavaron las membranas PVDF 4 veces
con tampón de lavado y se revelaron con
3-amino-9-etilcarbazol
y peróxido de urea suministrados por Zymed (San Francisco, CA)
durante 10 minutos cada una.
Los resultados de una SDS-PAGE
(figura 4) muestran una proteína de aproximadamente
17-18 kDa purificada a más del 95% y que es reactiva
frente a anticuerpo anti- RGS(His) mediante
inmunotransferencias tipo Western (figura 5) de la
SDS-PAGE.
Se realizó la secuenciación de aminoácidos del
extremo amino terminal de la proteína purificada para confirmar la
producción de la proteína recombinante correcta usando protocolos
químicos bien definidos en un secuenciador
Hewlett-Packard modelo G1000A con un modelo 1090 LC
y un secuenciador Hewlett-Packard modelo 241 con un
modelo 1100 LC.
Se generaron antisueros polivalentes contra la
proteína BASB019 vacunando dos conejos con la proteína BASB019
recombinante purificada. Se le dio a cada animal un total de tres
inmunizaciones por vía intramuscular (i.m.) de aproximadamente 20
\mug de proteína BASB019 por inyección (empezando con adyuvante de
Freund completo y seguido con adyuvante de Freund incompleto) a
aproximadamente intervalos de 21 días. Se sangraron los animales
antes de la primera inmunización
("pre-sangrado") y en los días 35 y 57.
Se midieron los títulos de proteína
anti-BASB019 mediante un ELISA usando proteína
BASB019 recombinante purificada (0,5 \mug/pocillo). Se define el
título como la mayor dilución igual o superior a 0,1 tal como se
calcula con la siguiente ecuación: DO promedio de las dos muestras
de prueba de antisueros - la DO promedio de las dos muestras de
prueba del tampón. Para el primer conejo, el título antes de las
inmunizaciones = 100, el título en el día 35 = 656100 y el título en
el día 57 = 17714700. Para el segundo conejo, el título antes de las
inmunizaciones = 300, el título en el día 35 = 218700 y el título en
el día 57 = 1968300.
Se usaron los antisueros como el primer
anticuerpo para identificar la proteína en una inmunotransferencia
tipo Western tal como se describió en el ejemplo 6 anterior. La
figura 6 muestra los resultados de una inmunotransferencia tipo
Western de BASB019 purificada con anticuerpo
anti-BASB019.
Se hicieron crecer varias cepas de M.
catarrhalis incluyendo ATCC 49143, y ATCC 43617, así como
aislados clínicos de varias regiones geográficas, sobre placas de
agar de chocolate durante 48 horas a 35ºC en CO_{2} al 5%. Se
usaron varias colonias para inocular 25 ml de caldo Muller Hinton en
un matraz de 250 ml. Se hicieron crecer los cultivos durante toda la
noche y se recogieron mediante centrifugación. Luego se
solubilizaron las células suspendiendo 30 \mug de células en 150
\mul de tampón de muestra PAGE (tampón Tris 360 mM, pH 8,8, que
contiene dodecilsulfato de sodio al 4% y glicerol al 20%), e
incubando la suspensión a 100ºC durante 5 minutos. Se resolvieron
las células solubilizadas sobre geles de poliacrilamida al
4-20% y se transfirieron las proteínas separadas a
membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora tal como se describió
previamente (Thebaine et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
76:4350-4354). Luego se pretrataron las membranas de
PVDF con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
que contenía un 5% de leche seca no grasa. Se realizaron todas las
incubaciones posteriores usando este tampón de pretratamiento.
Se incubaron las membranas de PVDF con 25 ml de
una dilución 1:500 de suero preinmunitario o suero inmunitario de
conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavaron las
membranas de PVDF dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM,
pH 7,5, que contenía cloruro de sodio 150 mM y
Tween-20 al 0,05%). Se incubaron las membranas de
PVDF con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra
anti-conejo marcada con peroxidasa (Jackson
InmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Luego se lavaron las membranas de PVDF 4 veces
con tampón de lavado y se revelaron con
3-amino-9-etilcarbazol
y peróxido de urea suministrados por Zymed (San Francisco, CA)
durante 10 minutos cada una.
Los resultados de este análisis por
inmunotransferencia tipo Western usando antisueros descritos en el
ejemplo 5 (dilución 1:2000) se muestran en la figura 7. Se detecta
una proteína de aproximadamente 17-18 kDa
(correspondiente al peso molecular esperado de BASB019) que es
reactiva con los antisueros en todas las cepas de
Moraxella.
Se realizaron análisis por inmunotransferencia
tipo Western de BASB019 recombinante purificada tal como se
describió en los ejemplos 4 y 6 anteriores, excepto que se usó una
reserva de sueros humanos de niños infectados por M
catarrhalis como la primera preparación de anticuerpo. Los
resultados muestran que los antisueros de individuos infectados de
manera natural reaccionan frente a la proteína recombinante
purificada (datos no mostrados).
Se produjeron dos péptidos específicos de
BASB019 de aminoácidos cortos, que tenían las secuencias de
CNEEA
WSQNRRAELSY y YTGVAPLVDNDETV en el laboratorio usando procedimientos generalmente bien conocidos. Se usaron estos péptidos unidos a KLH para producir anticuerpos en conejos hembra de 12 semanas de edad de Nueva Zelanda libres de patógenos específicos. Los conejos recibieron 4 inyecciones a intervalos de aproximadamente 3 semanas de 200 \mug de péptido-KLH en adyuvante de Freund completo (1ª inyección) o incompleto (2ª, 3ª y 4ª inyecciones). Se sangraron los animales antes de la primera inmunización y un mes después de la 4ª inyección.
WSQNRRAELSY y YTGVAPLVDNDETV en el laboratorio usando procedimientos generalmente bien conocidos. Se usaron estos péptidos unidos a KLH para producir anticuerpos en conejos hembra de 12 semanas de edad de Nueva Zelanda libres de patógenos específicos. Los conejos recibieron 4 inyecciones a intervalos de aproximadamente 3 semanas de 200 \mug de péptido-KLH en adyuvante de Freund completo (1ª inyección) o incompleto (2ª, 3ª y 4ª inyecciones). Se sangraron los animales antes de la primera inmunización y un mes después de la 4ª inyección.
Se midieron títulos de punto medio
anti-péptido mediante un ELISA usando péptidos
libres. Los títulos de punto medio anti-péptido un
mes después de la 4ª inmunización fueron superiores a 30000. Se
prepararon inmunotransferencias tipo Western de BASB019 recombinante
purificado, usando anticuerpos anti-péptido como el
primer anticuerpo, tal como se describió en los ejemplos 4 y 6. Los
resultados se presentan en la figura 8.
Se ha depositado un depósito que contiene una
cepa Catlin de Moraxella catarrhalis con la colección
americana de cultivos tipo (en el presente documento "ATCC") el
21 de junio de 1997 y se le ha asignado el número de depósito 43617.
Se describió el depósito como Branhamella catarrhalis (Frosch
y Kolle) y es una biblioteca de inserto de 1,5-2,9
kb secada por congelación construida a partir de aislado de M.
catarrhalis obtenido a partir de un aspirado transcraneal de un
minero del carbón con bronquitis crónica. Se describe el depósito
en Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506-508
(1982).
El depósito de la cepa de Moraxella
catarrhalis se denomina en el presente documento como "la cepa
depositada " o como "el ADN de la cepa depositada".
La cepa depositada contiene un gen de BASB019 de
longitud completa. La secuencia polinucleotídica contenida en la
cepa depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier
polipéptido codificado por el mismo, se están controlando en el caso
de cualquier conflicto con una descripción de las secuencias en el
presente documento.
Se ha realizado el depósito de la cepa
depositada bajo los términos del tratado de Budapest sobre el
reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para
fines de procedimiento de patente. La cepa depositada se liberará
irrevocablemente y sin restricción o condición al público tras la
expedición de una patente. La cepa depositada se proporciona
meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no es
una admisión que se requiera un depósito para permiso, tal como el
requerido bajo la 35 U.S.C. \NAK 112.
<110> SmithKline Beecham Biologicals
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Compuestos Novedosos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BM45311
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 519
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<212> ADN
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<213> Bacterias
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 172
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<212> PRT
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<213> Bacterias
\newpage
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 519
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<212> ADN
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<213> Bacterias
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 172
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<212> PRT
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<213> Bacterias
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<400> 4
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<211> 519
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<212> ADN
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<213> Bacterias
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<212> PRT
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<211> 172
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<212> PRT
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de cebador
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipcccttattaat tgacaatcac
\hfill21
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de cebador
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipggcagagtga atcttaagc
\hfill19
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<210> 11
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<211> 59
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagggcccaa ttacgcagag gggatccaat aaatcaacaa gtcaagttat ggttgctcc
\hfill59
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 659
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagggcccaa ttacgcagag ggtcgactta ttaataagac agttcagcac gacgatttg tgacc
\hfill65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
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<400> 13
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\sa{Cys Asn Glu Glu Ala Trp Ser Gln Asn Arg Arg
Ala Glu Leu Ser Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Gly Val Ala Pro Leu Val Asp Asn Asp
Glu Thr Val}
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de polipéptido y de polinucleótido
BASB019
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:1
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa
MC2931 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:2
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa
MC2931 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa
Mcat 2911 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:4
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat
2911 de Moraxella catarrhalis
\newpage
SEQ ID NO:5
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa
Mcat 2960 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:6
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat
2960 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:7
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa
Mcat 2969 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:8
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat
2969 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCC TTA TTA ATT GAC AAT CAC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGC AGA GTG AAT CTT AAG C
\hfill
\newpage
SEQ ID NO:11
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:12
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCNEEAWSQNRRAELSY
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYTGVAPLVDNDETV
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> SmithKline Beecham Biologicals
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Compuestos Novedosos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BM45311
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccttattaat tgacaatcac
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcagagtga atcttaagc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagggcccaa ttacgcagag gggatccaat aaatcaacaa gtcaagttat ggttgctcc
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagggcccaa ttacgcagag ggtcgactta ttaagac agttcagcac gacgatttg tgacc
\hfill65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Gly Val Ala Pro Leu Val Asp Asn Asp
Glu Thr Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Gly Val Ala Pro Leu Val Asp Asn Asp
Glu Thr Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de polipéptido y de polinucleótido
BASB019
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:1
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa
MC2931 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:2
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa
MC2931 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa
Mcat 2911 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:4
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat
2911 de Moraxella catarrhalis
\newpage
SEQ ID NO:5
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa
Mcat 2960 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:6
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat
2960 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:7
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa
Mcat 2969 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:8
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat
2969 de Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCC TTA TTA ATT GAC AAT CAC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGC AGA GTG AAT CTT AAG C
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:11
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:12
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCNEEAWSQNRRAELSY
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipYTGCAPLVDNDETV
\hfill
Claims (24)
1. Un polipéptido inmunogénico
aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 sobre la longitud completa de SEQ ID NO:
2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente.
2. Un polipéptido aislado según la
reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene al
menos una identidad del 95% con la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 sobre la longitud completa de SEQ ID NO:
2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente.
3. El polipéptido según la
reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.
4. Un polipéptido inmunogénico
aislado que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID
NO: 8.
5. Un fragmento inmunogénico del
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en
el que el fragmento inmunogénico puede provocar una respuesta
inmunitaria, si es necesario cuando está acoplado a un vehículo, que
reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
o SEQ ID NO: 8.
6. Un polipéptido según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, o un fragmento inmunogénico según la
reivindicación 5, en el que dicho polipéptido o dicho fragmento
inmunogénico es parte de una proteína de fusión mayor.
7. Un polinucleótido aislado que
codifica un polipéptido o un fragmento inmunogénico según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
inmunogénico que tiene al menos una identidad del 85% con la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
o SEQ ID NO: 8 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente.
9. Un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una
identidad del 85% con una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido inmunogénico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
o SEQ ID NO: 8 sobre la región codificante completa; o una secuencia
de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.
10. Un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una
identidad del 85% con la de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5
o SEQ ID NO: 7 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 respectivamente; o una secuencia
de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.
11. El polipéptido aislado según una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la identidad es
al menos del 95% con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ
ID NO: 7.
12. Un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido
inmunogénico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID
NO: 8.
13. Un polinucleótido aislado que
comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 5 o SEQ ID NO: 7.
14. Un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico de
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, obtenible
mediante selección de una biblioteca apropiada en condiciones de
hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia
de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 o un
fragmento de las mismas.
15. Un vector de expresión que comprende
un polinucleótido aislado según una cualquiera de las
reivindicaciones 7-14.
16. Una célula huésped que comprende el
vector de expresión según la reivindicación 15, que expresa un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene al menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, o una membrana de la célula huésped que
contiene el polipéptido expresado.
17. Un procedimiento para producir un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un
fragmento inmunogénico según las reivindicaciones 5 a 6, que
comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 16 en
condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o
dicho fragmento inmunogénico y recuperar el polipéptido o fragmento
inmunogénico a partir del medio de cultivo.
18. Un procedimiento para expresar un
polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14,
que comprende transformar una célula huésped con un vector de
expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y
cultivar dicha célula huésped en condiciones suficientes para la
expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.
19. Un sistema de expresión recombinante
que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14.
20. Una composición inmunogénica que
comprende una cantidad eficaz del polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 o fragmento inmunogénico según las
reivindicaciones 5 a 6, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
21. Una composición inmunogénica que
comprende una cantidad eficaz del polinucleótido según una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
22. La composición inmunogénica según una
cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, en la que dicha
composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella
catarrhalis.
23. Un anticuerpo generado contra el
polipéptido constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene
al menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, sobre la longitud completa de SEQ ID
NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente o
un fragmento inmunogénico de las mismas que, si es necesario cuando
está acoplado a un vehículo, puede provocar una respuesta
inmunitaria que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.
24. Un procedimiento para diagnosticar
una infección por Moraxella catarrhalis, que comprende
identificar un polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, o un anticuerpo que es
inmunoespecífico para dicho polipéptido, presente en una muestra
biológica de un animal que se sospecha que tiene una infección de
este tipo.
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