ES2283113T3 - Proteinas basb019 y genes de moraxella catarrhalis, antigenos, anticuerpos y usos. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido inmunogénico aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente.

Description

Proteínas BASB019 y genes de Moraxella catarrhalis, antígenos, anticuerpos y usos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos, (denominados en el presente documento como "polinucleótido(s) BASB019"), polipéptidos codificados por ellos (denominados en el presente documento como "BASB019" o "polipéptido(s) BASB019"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar la infección por determinados patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (también llamada Branhamella catarrhalis) es una bacteria gram-negativa aislada frecuentemente del aparato respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, siendo las principales otitis media en lactantes y niños, y neumonía en ancianos. También es responsable de sinusitis, infecciones nosocomiales y menos frecuentemente de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad infantil importante tanto por el número de casos como por sus posibles secuelas. Se registran más de 3,5 millones de casos cada año en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19: 823). Si no se trata, o se vuelve crónica, esta enfermedad puede dar lugar a pérdidas auditivas que pueden ser temporales (en el caso de acumulación de líquido en el oído medio) o permanentes (si se daña el nervio auditivo). En lactantes, tales pérdidas auditivas pueden ser responsables de un aprendizaje tardío del habla.

Principalmente se aíslan tres especies bacterianas del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza no tipificable (HiNT) y M. catarrhalis. Están presentes en del 60 al 90% de los casos. Una publicación de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y HiNT representan ambas aproximadamente el 30%, y M. catarrhalis aproximadamente el 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Pueden aislarse otras bacterias del oído medio (H influenza tipo B, S. pyogenes, etc.) pero con una frecuencia mucho menor (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del aparato respiratorio superior es un requisito previo necesario para el desarrollo de una otitis; sin embargo también se requieren otros para dar lugar a la enfermedad (Dickinson, DP et al. (1988) J. Infect. Dis. 158:205, Faden, HL et al. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612). Éstos son importantes para iniciar la migración de las bacterias hacia el oído medio a través de las trompas de Eustaquio, seguido por el inicio de un proceso inflamatorio. Estos factores se desconocen hasta la fecha. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmunológico seguido por una infección vírica, por ejemplo, podría provocar una incapacidad para controlar la colonización del aparato respiratorio (Faden, HL et al (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente se vuelven susceptibles de desarrollar la
otitis media debido a la presencia sostenida de patógenos del oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).

La respuesta inmunitaria frente a M. catarrhalis está mal caracterizada. El análisis de cepas aisladas secuencialmente a partir de la nasofaringe de bebés seguido desde los 0 a los 2 años de edad, indica que frecuentemente contraen y eliminan nuevas cepas. Esto indica que se pone en marcha una respuesta inmunitaria eficaz contra esta bacteria por los niños colonizados (Faden, HL et al (1994) J. Infect. Dis. 169:1312).

En la mayoría de los adultos sometidos a prueba, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ et al. (1985) J. Infect. Dis.151:878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida sérica: en general, aisladas de individuos enfermos son más resistentes que los que están simplemente colonizados (Hol, C et al. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL et al. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A):28S). La resistencia sérica puede por tanto considerarse como un factor de virulencia de las bacterias. Se ha observado una actividad de opsonización en el suero de niños que se están recuperando de otitis media.

No se han identificado los antígenos seleccionados por estas respuestas inmunitarias diferentes en seres humanos, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por hierro, y que se reconoce mediante el suero de pacientes con neumonía (Sethi, S, et al. (1995) Infect. Immun. 63:1516).

Se han caracterizado otras proteínas de membrana presentes en la superficie de M. catarrhalis usando un procedimiento bioquímico, o para determinar su posible implicación en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos producida contra algunos de ellos (UspA, CopB) favorece un aclaramiento más rápido de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) se conserva de manera importante entre las cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que ha demostrado ser eficaz contra esta bacteria en modelos animales.

La frecuencia de infecciones por Moraxella catarrhalis ha aumentado drásticamente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a antibióticos y una población creciente de gente con sistemas inmunitarios debilitados. Ya no es poco común aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o todos los antibióticos habituales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y una demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos, y pruebas de diagnóstico para este microorganismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB019, en particular polipéptidos BASB019 y polinucleótidos BASB019, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas a infecciones microbianas y estados asociados a tales infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de polipéptidos o polinucleótidos BASB019.

Diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica leyendo las siguientes descripciones y leyendo las otras partes de la presente descripción.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polinucleótidos y polipéptidos BASB019 tal como se describen con más detalle a continuación. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB019 de Moraxella catarrhalis, que está relacionada por homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido PAL (lipoproteína asociada a peptidoglucano) de H influenzae. La invención se refiere especialmente a BASB019 que tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7 y SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 respectivamente. Se entiende que las secuencias enumeradas en la lista de secuencias a continuación como "ADN" representan una ilustración a modo de ejemplo de una realización de la invención, dado que los expertos en la técnica reconocerán que tales secuencias pueden usarse útilmente en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en el presente documento como "BASB019" y "polipéptidos BASB019" así como variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención además proporciona:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, lo más preferiblemente al menos del 97-99% o identidad exacta, a la de SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más preferiblemente al menos del 97-99% o identidad exacta con SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 sobre la longitud completa de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 respectivamente; o

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más preferiblemente al menos del 97-99% o identidad exacta, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8.

Los polipéptidos BASB019 proporcionados en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 son los polipéptidos BASB019 de las cepas MC2931 (ATCC 43617), MC2911, MC2960 y MC2969 de Moraxella catarrhalis.

La invención también proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB019, es decir, una porción contigua del polipéptido BASB019 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8; es decir, el fragmento (si es necesario cuando está acoplado a un vehículo) puede provocar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido BASB019. Un fragmento inmunogénico de este tipo puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB019 que carece de una secuencia líder de extremo N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje de extremo C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de BASB019 según la invención comprende sustancialmente todo el domino extracelular de un polipéptido que tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, lo más preferiblemente al menos una identidad del 97-99%, con la de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 sobre la longitud completa de SEQ ID NO:2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente igual que parte pero no la totalidad de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB019, los fragmentos pueden estar "posición libre", o comprendidos dentro de un polipéptido mayor del cual forman una parte o región, lo más preferiblemente como una única región continua sencilla en un único polipéptido mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 o variantes de la misma, tal como una serie continua de restos que incluye una secuencia de aminoácidos de extremo amino y/o carboxilo terminal. También se prefieren las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula huésped. Más preferidos son los fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden alfa-hélice y regiones que forman alfa-hélice, beta-lámina y regiones que forman beta-lámina, giro y regiones que forman giro, espirales y regiones que forman espirales, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones que forman superficie, regiones de unión a sustrato, y regiones de índice antigénico alto.

Otros fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 ú 8, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o delecionados de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u
8.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención pueden emplearse para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis peptídica; por tanto, estos fragmentos pueden emplearse como productos intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Se prefieren particularmente las variantes en las que se sustituyen, delecionan o añaden varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 o 1 aminoácidos en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura" pueden ser parte de una proteína mayor tal como una proteína precursora o de fusión. A menudo resulta ventajoso incluir otra secuencia de aminoácidos que contiene secuencias secretoras o líderes, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la purificación tal como restos de histidina múltiples, u otra secuencia para lograr estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de polipéptido exógeno o cola lipídica o secuencias de polinucleótidos para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas mediante ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento de las mismas, y diversas porciones de las regiones constantes de inmunoglobulinas de cadenas pesadas o ligeras de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como una inmunoglobulina preferida está la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente IgG1, en la que se produce la fusión en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente mediante incorporación de una secuencia de ruptura que puede romperse con factor de coagulación sanguínea Xa.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de las mismas para selección de fármacos, diagnóstico y tratamiento. Otro aspecto de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de la tecnología de proteínas de fusión en las solicitudes de patente internacionales números WO94/29458 y WO94/22914.

Las proteínas pueden estar conjugadas químicamente, o expresarse como proteínas de fusión recombinantes que permiten producir niveles aumentados en un sistema de expresión si se compara con proteínas no fusionadas. La pareja de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos cooperadores T (pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos cooperadores T reconocidos por seres humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (potenciador de expresión) a rendimientos superiores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente la pareja de fusión será tanto una pareja de fusión inmunológica y una pareja de potenciación de la expresión.

Las parejas de fusión incluyen proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus influenzae, NS 1 (hemaglutinina). Otra pareja de fusión es la proteína conocida como LYTA. Preferiblemente se usa la porción de extremo C terminal de la molécula. Lyta proviene de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa, amidasa LYTA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) páginas 265-272}) una autolisina que degrada específicamente determinados enlaces en el esqueleto del peptidoglucano. El dominio de extremo C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad por la colina o por algunos análogos de colina tales como DEAE. Se ha explotado esta propiedad para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en su extremo amino terminal {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798}. Es posible usar la porción repetida de la molécula Lyta encontrada en el extremo C terminal empezando en el resto 178, por ejemplo restos 188-305.

La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos mencionados anteriormente, es decir polipéptidos que varían de los referentes mediante sustituciones de aminoácidos conservadoras, mediante lo cual se sustituye un resto por otro con características similares. Tales sustituciones típicas son entre Ala, Val, Leu y Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos de Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los restos básicos de Lys y Arg; o restos aromáticos de Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos aislados que se producen de manera natural, polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos sintéticamente, o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos se entienden bien en la técnica.

Lo que más se prefiere es que un polipéptido de la invención provenga de Moraxella catarrhalis, sin embargo, puede obtenerse preferiblemente a partir de otros microorganismos del mismo género taxonómico. También puede obtenerse un polipéptido de la invención, por ejemplo, a partir de microorganismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Un objeto de la invención es proporcionar polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB019, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido denominado en el presente documento BASB019.

En una realización particularmente preferida de la invención el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB019 que comprenden una secuencia expuesta en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 que incluye un gen de longitud completa, o una variante del mismo.

Los polinucleótidos BASB019 proporcionados en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 son los polinucleótidos BASB019 de las cepas MC2931 (ATCC 43617), MC2911, MC2960 y MC2969 de Moraxella catarrhalis.

Como un aspecto adicional de la invención se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB019, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB019 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARN no procesados, ARN de ribozima, ARNm, ADNc, ADN genómicos, ADN-Banda Z. Otras realizaciones de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y variantes de los mismos y composiciones que comprenden los mismos.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, que incluyen al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB019 que tiene una secuencia deducida de SEQ ID NO:2, 4 ,6 u 8 y polinucleótidos íntimamente relacionados con ellos y variantes de las mismas.

En otra realización particularmente preferida de la invención existe un polipéptido BASB019 de Moraxella catarrhalis que comprende o está constituida por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 o una variante de las mismas.

Usando la información proporcionada en el presente documento, tal como una secuencia de polinucleótido expuesta en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7, puede obtenerse un polinucleótido de la invención que codifica polipéptido BASB019 usando procedimientos de clonación y selección habituales, tales como los de clonación y secuenciación de fragmentos de ADN cromosómico a partir de bacterias usando células de Moraxella catarrhalis Catlin como material de partida, seguido de la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia polinucleotídica de la invención, tal como una secuencia polinucleotídica dada en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7, normalmente se trata con sonda una biblioteca de clones de Moraxella catarrhalis Catlin de ADN cromosómico en E.coli o algún otro huésped adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferiblemente un 17-mero o más largo, derivado de una secuencia parcial. Los clones que portan ADN idéntico al de la sonda pueden distinguirse usando condiciones de hibridación rigurosas. Secuenciando los clones individuales así identificados mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia polipeptídica o polinucleótídica original es posible extender la secuencia polinucleotídica en ambas direcciones para determinar una secuencia génica de longitud completa. Convenientemente, se realiza tal secuenciación, por ejemplo, usando ADN de cadena doble desnaturalizado preparado a partir de un clon de plásmido. Se describen técnicas adecuadas por Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). (véase en particular Screening By Hybridization 1.90 y Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). También puede realizarse la secuenciación de ADN genómico directa para obtener una secuencia génica de longitud completa. Ilustrativo de la invención, cada polinucleótido expuesto en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 se descubrió en una biblioteca de ADN derivada de Moraxella catarrhalis Catlin.

Además, cada secuencia de ADN expuesta en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de restos de aminoácidos expuestos en SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 con un peso molecular deducido que puede calcularse usando valores de peso molecular de un resto de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la técnica.

El polinucleótido de SEQ ID NO:1, entre el codón de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que empieza en el polinucleótido número 517 de SEQ ID NO:1, codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2. El polinucleótido de SEQ ID NO:3, entre el codón de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que empieza en el nucleótido número 517 de SEQ ID NO:3, codifica el polipéptido de SEQ ID NO:4.

El polinucleótido de SEQ ID NO:5, entre el codón de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que empieza en el nucleótido número 517 de SEQ ID NO:5, codifica el polipéptido de SEQ ID NO:6. El polinucleótido de SEQ ID NO:7, entre el codón de iniciación en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que empieza en el nucleótido número 517 de SEQ ID NO:7, codifica el polipéptido de SEQ ID NO:8.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o está constituido por:

(a)

una secuencia polinucleotídica que tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más preferiblemente al menos del 97-99% o identidad exacta con SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 sobre la longitud completa de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 respectivamente; o

(b)

una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más preferiblemente al menos del 97-99% ó 100% exacta, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8, sobre la longitud completa de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 respectivamente.

Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies distintas de Moraxella catarrhalis, mediante un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45-65°C y una concentración de SDS desde 0,1-1%) con una sonda marcada o detectable que está constituida por o que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 o un fragmento de la misma; y aislar un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia polinucleotídica.

La invención proporciona una secuencia polinucleotídica idéntica sobre su longitud total a una secuencia codificante (marco de lectura abierto) en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7. También se proporciona mediante la invención una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por si mismo así como una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento en el marco de lectura con otra secuencia codificante, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora, una secuencia pre, o pro o preproteíca. El polinucleótido de la invención también puede contener al menos una secuencia no codificante, incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse a al menos una secuencia no codificante en 5' y 3', tales como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como las señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a ribosoma, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan ARNm, intrones, y señales de poliadenilación. La secuencia polinucleotídica también puede comprender otras secuencias codificantes que codifican otros aminoácidos. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En determinadas realizaciones de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA 86: 821-824 (1989), o una etiqueta de péptido HA (Wilson et al., Cell 37:767 (1984), de los cuales ambos pueden ser útiles en la purificación de la secuencia polipeptídica fusionada a ellos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas de manera natural que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB019 de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 puede ser idéntica a la secuencia que codifica al polipéptido contenida en los nucleótidos 1 a 517 de SEQ ID NO:1, 3, 5, ó 7 respectivamente. Alternativamente puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2, 4, 6 ú 8.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" tal como se usa en el presente documento engloba los polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de BASB019 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8.

El término también engloba los polinucleótidos que incluyen una única región continua o región discontinua que codifica al polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrada, una secuencia de transposón integrada o debido a edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con otras regiones, que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

La invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos en el presente documento que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8. Pueden usarse fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención.

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Otras realizaciones particularmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes de BASB019, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB019 de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 en la que se sustituyen, modifican, delecionan y/o añaden varios, pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún resto de aminoácido, en cualquier combinación. Entre éstas se prefieren especialmente las adiciones, deleciones o sustituciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB019.

Otras realizaciones preferidas de la invención son polinucleótidos que son idénticos al menos en un 85% sobre su longitud completa a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB019 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8, y polinucleótidos que son complementarios a tales polinucleótidos. Alternativamente, los más sumamente preferidos son los polinucleótidos que comprenden una región que es idéntica al menos en un 90% sobre su longitud completa a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB019 y polinucleótidos complementarios a estos. En este sentido, se prefieren particularmente los polinucleótidos idénticos al menos en un 95% sobre su longitud completa con el mismo. Además, aquellos con al menos el 97% son sumamente preferidos entre aquellos con al menos el 95%, y entre éstos aquellos con al menos el 98% y al menos el 99% son particularmente sumamente preferidos, siendo los más preferidos con al menos el 99%.

Las realizaciones preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7.

Según determinadas realizaciones preferidas de esta invención se proporcionan polinucleótidos que se hibridan, particularmente en condiciones rigurosas, con secuencias de polinucleótido BASB019, tales como esos polinucleótidos en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7.

La invención además se refiere a polinucleótidos que se hibridan con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en el presente documento. En este sentido, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas, con los polinucleótidos descritos en el presente documento. Tal como se usan en el presente documento, los términos "condiciones rigurosas " y "condiciones de hibridación rigurosas" quieren decir que la hibridación se produce sólo si hay al menos una identidad del 95% y preferiblemente al menos del 97% entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación rigurosas es la incubación durante la noche a 42°C en una disolución que comprende: formamida al 50%,5x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado, seguido del lavado del soporte de hibridación en 0,1x SSC a aproximadamente 65°C. Las condiciones de hibridación y lavado se conocen bien y se muestran a modo de ejemplo en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente capítulo 11 del mismo. También puede usarse la hibridación de la disolución con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

La invención también proporciona un polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia polinucleotídica obtenida seleccionando una biblioteca apropiada que contiene el gen completo para una secuencia polinucleotídica expuesta en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia polinucleotídica expuesta en SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7 o un fragmento de la misma; y aislar dicha secuencia polinucleotídica. Los fragmentos útiles para la obtención de un polinucleótido de este tipo incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores totalmente descritos en otra parte en el presente documento.

Tal como se discute en otra parte en el presente documento en relación a ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, pueden usarse los polinucleótidos de la invención como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar los ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB019 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen una alta identidad, particularmente una identidad de secuencia alta, con el gen de BASB019. Tales sondas generalmente comprenderán al menos 15 restos de nucleótido o pares de bases. Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 restos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 restos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 restos de nucleótidos o pares de bases y tendrán menos de 30 restos de nucleótidos o pares de bases.

Puede aislarse una región codificante del gen de BASB019 mediante selección usando una secuencia de ADN proporcionada en SEQ ID NO: 1, 3, 5 ó 7 para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención se usa entonces para seleccionar una biblioteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar con que miembros de la biblioteca se híbrida la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos por los expertos en la técnica para obtener ADN de longitud completa, o ampliar los ADN cortos, por ejemplo los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Las modificaciones recientes de la técnica, mostradas a modo de ejemplo mediante la tecnología Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon™, se ha preparado ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada en cada extremo. Entonces se realiza la amplificación de ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "ausente" del ADN usando una combinación de cebadores específicos de gen y específicos de adaptador. Luego se repite la reacción PCR usando los cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para reasociarse en el producto amplificado (normalmente un cebador específico de adaptador que además se reasocia en 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que se hibrida en 5' en la secuencia génica seleccionada). Luego pueden analizarse los productos de esta reacción mediante secuenciación de ADN y construirse un ADN de longitud completa o bien uniendo el producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa, o bien realizando una PCR de longitud completa aparte usando la información de la nueva secuencia para el diseño del cebador de 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden emplearse, por ejemplo, como materiales y reactivos de investigación para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos para enfermedades, particularmente enfermedades humanas, tal como se discute más adelante en el presente documento en relación con los ensayos de polinucleó-
tidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de SEQ ID NOS:1-8 pueden usarse en el procedimiento tal como se describe en el presente documento, pero preferiblemente para PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en el presente documento están transcritos en su totalidad o en parte en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que tales secuencias también tendrán utilidad en el diagnóstico del estado de infección y tipo de infección que el patógeno ha alcanzado.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos de extremo amino o carboxilo terminal, o aminoácidos en el interior del polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Tales secuencias pueden desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína desde precursor hasta una forma madura, puede permitir el transporte proteico, puede prolongar o acortar la vida media de la proteína o puede facilitar la manipulación de una proteína para someterla a ensayo o producción entre otras cosas. Como generalmente es el caso in vivo, pueden tratarse aminoácidos adicionales lejos de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario al mismo. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido al que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionado a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las prosecuencias, generalmente se activan tales precursores inactivos. Pueden eliminarse algunas o todas las prosecuencias antes de la activación. Generalmente, tales precursores se llaman proproteínas.

Además de las representaciones habituales A, G, C, T/U para los nucleótidos, también puede usarse el término "N" para describir determinados polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en tal posición diseñada en la secuencia de ADN o ARN, excepto que se prefiere que N no sea un ácido nucleico cuando se toma junto con posiciones de nucleótido adyacentes, cuando se lee en el marco de lectura correcto, tendrá el efecto de generar un codón de terminación prematuro en tal marco de lectura.

En resumen, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (la que puede denominarse como una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son secuencias líder de una preproteína, o una preproproteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

Según un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para fines terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética preferiblemente empleará un procedimiento de administración adecuado tal como una inyección directa de un ADN de plásmido en los músculos (Wolff et al., Hum Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), administración de ADN complejado con vehículos de proteína específicos (Wu et al., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda et al., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vectores, células huésped, sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células huésped que están modificadas mediante ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de traducción sin células también pueden emplearse para producir tales proteínas usando ARN derivados de los constructos de ADN de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de células huésped modificadas mediante ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que están modificadas mediante ingeniería genética con tales sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, pueden modificarse mediante ingeniería genética células huésped para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula huésped puede realizarse mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tales como, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, carga raspada, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, Streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como células de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, una basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células Bowes de melanoma; y células vegetales, tales como células de un gimnosperma o angiosperma.

Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosoma, episoma y virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como las derivadas de elementos genéticos de bacteriófago y plásmido, tales como cósmidos y fágmidos. Los constructos del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como generan expresión. Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un huésped para la expresión a este respecto. Puede insertarse la secuencia de ADN apropiada en el sistema de expresión mediante una variedad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (citado anteriormente).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Pueden recuperarse y purificarse los polipéptidos de la presente invención a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lecitina. Lo más preferiblemente, para la purificación se emplea cromatografía de afinidad de ion metálico (IMAC). Pueden emplearse técnicas bien conocidas para replegar proteínas para regenerar una conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, aislamiento y/o purificación.

El sistema de expresión puede ser también un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. Puede insertarse el gen de interés en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo darán como resultado la expresión del antígeno y la inducción de respuestas inmunitarias. Los virus y bacterias usados con este fin son por ejemplo: poxvirus (por ejemplo; vaccinia, viruela aviar, viruela del canario), alfavirus (virus Sindbis, Virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, picomavirus (poliovirus, rhinovirus), virus herpes (virus de la varicela-zóster, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuarse de varias maneras con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, pronóstico, serotipado y mutación

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB019 de la invención para su uso como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB019 en un eucariota, particularmente un mamífero, y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico para el diagnóstico de enfermedades, determinación del estadio de una enfermedad o respuesta de un microorganismo infeccioso ante fármacos. Los eucariotas, particularmente los mamíferos, y especialmente los seres humanos, particularmente los infectados o que se sospecha que están infectados por un microorganismo que comprende la proteína o el gen de BASB019, pueden detectarse al nivel de ácido nucleico o aminoácidos mediante una variedad de técnicas bien conocidas así como mediante procedimientos proporcionados en el presente documento.

Los polipéptidos y polinucleótidos para pronóstico, diagnóstico u otros análisis pueden obtenerse a partir de materiales corporales de un individuo supuestamente infectado y/o infectado. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, pueden usarse directamente para la detección o pueden amplificarse enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. También puede usarse ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico de las mismas maneras. Usando la amplificación, puede realizarse la caracterización de la especie y cepa de un microorganismo infeccioso o residente presentes en un individuo mediante el análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del microorganismo. Pueden detectarse deleciones e inserciones mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada de un microorganismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Pueden identificarse mutaciones puntuales mediante hibridación de ADN amplificado con secuencias de polinucleótido BASB019 marcadas. Pueden distinguirse secuencias apareadas perfecta o significativamente de dúplex con apareamiento imperfecta o más significativamente erróneo mediante digestión con ADNasa o ARNasa, para ADN o ARN respectivamente, o detectando diferencias en las temperaturas de fusión o cinética de renaturalización. También pueden detectarse diferencias en la secuencia polinucleotídica mediante alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótido en geles en comparación con una secuencia de referencia. Esto puede realizarse con o sin agentes desnaturalizantes. También pueden detectarse diferencias en polinucleótidos mediante secuenciación directa de ADN o ARN. Véase, por ejemplo, Myers et al., Science, 230: 1242 (1985). También pueden revelarse cambios en la secuencia en ubicaciones específicas mediante ensayos de protección de nucleasa, tales como un ensayo de protección de ARNasa, V1 y S1 o un procedimiento de ruptura química. Véase, por ejemplo, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985).

En otra realización, puede construirse una matriz de sondas de oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos de BASB019 o fragmentos de la misma para realizar selección eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de tecnología de matriz se conocen bien y tienen aplicabilidad general y pueden usarse para tratar una variedad de cuestiones en genética molecular incluyendo expresión génica, ligamiento genético y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee et al., Science, 274: 610 (1996)).

Por tanto en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a)

un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7, o un fragmento de la misma;

(b)

una secuencia de nucleótidos complementaria con la de (a);

(c)

un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8 o un fragmento del mismo; o

(d)

un anticuerpo frente a un polipéptido de la presente invención, preferiblemente frente al polipéptido de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8.

Se apreciará que en cualquiera de los kit de este tipo, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Un kit de este tipo se usará en el diagnóstico de una enfermedad o propensión a una enfermedad, entre otros.

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente, SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7, que está asociada con una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede ayudar a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico de un transcurso de una enfermedad, una determinación de un estadio de enfermedad, o una propensión a una enfermedad, que da como resultado la subexpresión, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Pueden detectarse los microorganismos, particularmente los microorganismos infecciosos, que llevan mutaciones en tal polinucleótido al nivel del polinucleótido mediante una variedad de técnicas, tales como las descritas en cualquier otro lugar del presente documento.

También pueden detectarse las células de un microorganismo que lleva mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención al nivel del polinucleótido o polipéptido mediante una variedad de técnicas, por ejemplo, para permitir el serotipado. Por ejemplo, puede usarse RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente usar RT-PCR junto con sistemas de detección automatizados, tales como, por ejemplo, GeneScan. También pueden usarse ARN, ADNc o ADN genómico con el mismo fin, PCR. Como un ejemplo, pueden usarse los cebadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB019 para identificar y analizar mutaciones.

La invención proporciona además cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3'. Pueden usarse estos cebadores, entre otras cosas, para amplificar ADN y/o ARN de BASB019 aislado a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Pueden usarse los cebadores para amplificar un polinucleótido aislado a partir de un individuo infectado, de manera que el polinucleótido puede someterse entonces a varias técnicas para la elucidación de la secuencia polinucleotídica. De esta manera, pueden detectarse las mutaciones en la secuencia polinucleotídica y usarse para el diagnóstico o pronóstico de la infección o su estadio o transcurso, o para serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención además proporciona un procedimiento para diagnosticar una enfermedad, preferiblemente infecciones bacterianas, mas preferiblemente infecciones causadas por Moraxella catarrhalis, que comprenden determinar a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un aumento del nivel de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7. Puede medirse el aumento o la disminución de la expresión de un polinucleótido BASB019 usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, inmunotransferencia de tipo Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, puede usarse un ensayo de diagnóstico según la invención para detectar la sobreexpresión de un polipéptido BASB019 comparado con muestras de tejido control normal, por ejemplo, para detectar la presencia de una infección. Las técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de un polipéptido BASB019, en una muestra derivada de un huésped, tal como un material corporal, se conocen bien por los expertos en la técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de inmunotransferencia de tipo Western, ensayos de intercalación de anticuerpos, ensayos de detección de anticuerpos y ELISA.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como componentes de matrices de polinucleótidos, preferiblemente ensayos de redes o matrices de alta densidad. Estas matrices de alta densidad son particularmente útiles con fines de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, puede usarse un conjunto de manchas, que comprende cada una un gen diferente y que además comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, para el tratamiento con sonda, tal como usar una hibridación o amplificación de ácido nucleico, usando una sonda obtenida o derivada de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia polinucleotídica particular o secuencia relacionada en un individuo. Tal presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser útil en el diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad o un transcurso de una enfermedad. Se prefiere una red que comprende un número de variantes de la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7. También se prefiere una red que comprende un número de variantes de la secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:2, 4, 6 u 8.

Anticuerpos

Pueden usarse los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos respectivamente.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB019.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que portan epítopos de cualquiera o ambos, análogos de cualquiera o ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal, preferiblemente uno no humano, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como las que aparecen en Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Inmunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., págs. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Pueden adaptarse técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente estadounidense número 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla frente a polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. También pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos frente a los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Como alternativa, puede utilizarse la tecnología de presentación en fago para seleccionar genes de anticuerpo con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención o bien a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos seleccionados por poseer anti-BASB019 o bien a partir de bibliotecas vírgenes (McCafferty, et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, et al.,(1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos también puede mejorarse mediante, por ejemplo, intercambio de cadenas (Clackson et al., (1991) Nature 352: 628).

Pueden emplearse los anticuerpos anteriormente descritos para aislar o identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Por tanto pueden emplearse, entre otros, los anticuerpos contra el polipéptido BASB019 o el polinucleótido BASB019 para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes de polipéptido incluyen variantes antigénica, epítopica o inmunológicamente equivalentes a partir de un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es un ser humano, el anticuerpo puede lo más preferiblemente estar "humanizado", en el que la región o regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma se ha trasplantado en un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, tal como se describe en Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 o Tempest et al., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas y agonistas - ensayos y moléculas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención también pueden usarse para evaluar la unión de sustratos de molécula pequeña y ligandos en, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estruc-
turales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan et al., Current Protocols in Inmunology 1 (2): Capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden simplemente medir la unión de un compuesto candidato con el polipéptido o polinucleótido, o con células o membranas que portan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido por medio de una etiqueta directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Como alternativa, el procedimiento de selección puede implicar competencia con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden someter a prueba si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de la activación generalmente se someten a ensayo en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación mediante el agonista por la presencia del compuesto candidato. Pueden emplearse el polipéptido activo de manera constitutiva y/o los polipéptidos y polinucleótidos expresados de manera constitutiva en procedimientos de selección para detectar agonistas inversos o inhibidores, en ausencia de un agonista o inhibidor, sometiendo a prueba si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una disolución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, medir la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB019 en la mezcla y comparar la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB019 de la mezcla con un patrón. También pueden usarse proteínas de fusión, tales como las preparadas a partir de la parte Fc y el polipéptido BASB019, tal como se describió anteriormente en el presente documento, para ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos relacionados filogenética y/o funcionalmente (véase D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); y K. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido de la presente invención también pueden usarse para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, puede construirse un ensayo ELISA para medir los niveles asociados a células o secretados de polipéptido usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos habituales conocidos en la técnica. Esto puede usarse para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también denominado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente.

La invención también proporciona un procedimiento para seleccionar compuestos para identificar aquellos que potencian (agonista) o bloquean (antagonista) la acción de polipéptidos o polinucleótidos BASB019, particularmente aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, se incuba una mezcla de reacción sintética, un compartimento celular, tal como una membrana, envoltura celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de las mismas, que comprende polipéptido BASB019 y un sustrato o ligando marcado de tal polipéptido, en ausencia o presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASB019. La capacidad de la molécula candidata para agonizar o antagonizar el polipéptido BASB019 se refleja en la disminución de la unión de un ligando marcado o la disminución de la producción de producto a partir de tal sustrato. es más probable que las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB019 sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, como puede ser el caso, aumentan la tasa de producción de producto a partir del sustrato, aumentan la transducción de señales, o aumentan la actividad de canales químicos son agonistas. La detección de la tasa o nivel de, como puede ser el caso, de la producción de producto a partir del sustrato, transducción de señales o actividad de canales químicos puede potenciarse usando un sistema indicador. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles en este sentido incluyen pero no se limitan a colorimétrico, sustrato marcado convertido en producto, un gen indicador que es sensible a cambios en la actividad del polinucleótido o polipéptido BASB019, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para la determinación de agonistas de BASB019 es un ensayo competitivo que combina BASB019 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB019, moléculas de unión a BASB019 recombinante, ligandos o sustratos naturales, o miméticos de ligando o sustrato, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. BASB019 puede estar marcado, tal como por radiactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que el número de moléculas BASB019 unidas con una molécula de unión o convertidas en producto puedan determinarse de manera precisa para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y por tanto inhiben o extinguen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como un anticuerpo o una proteína íntimamente relacionada que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB019, evitando de esta manera la acción o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB019 impidiendo que los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB019 se unan.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido evitando así la unión a moléculas de unión celular, de manera que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL(1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB019.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas mediante ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas partes de las regiones constantes de cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente mediante incorporación de una secuencia de ruptura que puede romperse con el factor de coagulación sanguínea Xa. Es más, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de las mismas para selección de fármacos, diagnóstico y tratamiento. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las solicitudes de patentes internacionales números WO94/29458 y WO94/22914.

Cada una de las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en el presente documento puede usarse en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras la expresión, puede usarse como una diana para la selección de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, pueden usarse las secuencias polinucleotídicas que codifican las regiones amino terminal de la proteína codificada o Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del ARNm respectivo para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificante de interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir en la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un eucariota, preferiblemente mamífero, huésped responsable de las secuelas de la infección. En particular, las moléculas de la invención pueden usarse: en la prevención de la adhesión de bacterias, en particular bacterias gram-positivas y/o gram-negativas, a proteínas de la matriz extracelular eucariotas, preferiblemente de mamíferos, sobre dispositivos permanentes o a proteínas de la matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de la matriz extracelular eucariotas, preferiblemente de mamíferos, y proteínas de BASB019 bacterianas que median el daño tisular y/o; para bloquear la progresión normal de la patogenia en infecciones iniciadas por otras técnicas distintas a la implantación de dispositivos permanentes o por otras técnicas quirúrgicas.

Según todavía otro aspecto de la invención, se proporcionan agonistas y antagonistas de BASB019, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención pueden emplearse, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimótopos del polipéptido de la invención. Un mimótopo es una secuencia peptídica, suficientemente similar al péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que puede reconocerse por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o puede provocar anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando está acoplado con un vehículo adecuado.

Pueden diseñarse mimótopos peptídicos con un fin particular mediante la adición, deleción o sustitución de aminoácidos seleccionados. Por tanto, pueden modificarse los péptidos con fines de facilitar la conjugación con un vehículo proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además puede ser deseable para péptidos conjugados con un vehículo proteico incluir un extremo terminal hidrófobo distal del extremo terminal conjugado del péptido, de manera que el extremo sin conjugar libre del péptido permanezca asociado con la superficie de la proteína vehículo. Por tanto, presentando el péptido en una conformación que se parezca lo más estrechamente posible a la del péptido tal como se encuentra en el contexto de la molécula nativa completa. Por ejemplo, pueden alterarse los péptidos para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-terminal. Como alternativa, puede realizarse la adición o sustitución de una forma de estereoisómero D de uno o más de los aminoácidos para producir un derivado beneficioso, por ejemplo para aumentar la estabilidad del péptido.

Como alternativa, pueden identificarse los mimótopos peptídicos usando anticuerpos que pueden unirse ellos mismos con los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como la tecnología de presentación en fago (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica, genera un gran número de secuencias peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y pueden, por tanto, unirse a anticuerpos anti-péptidos nativos, pero no necesariamente comparten ellos mismos una homología significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres humanos, que comprende inocular al individuo con el polinucleótido y/o polipéptido BASB019, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir anticuerpos y/o una respuesta inmunitaria frente a células T para proteger a dicho individuo de la infección, particularmente infección bacteriana y lo más particularmente infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan procedimientos mediante los que la respuesta inmunológica ralentiza la replicación bacteriana. Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo que comprende administrar a tal individuo una ribozima, secuencia o vector de ácido nucleico para dirigir la expresión del polinucleótido y/o polipéptido BASB019,o un fragmento o variante del mismo, para expresar el polinucleótido y/o polipéptido BASB019, o un fragmento o una variante del mismo in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, tal como, producir anticuerpos y/o una respuesta inmunitaria frente a células T, incluyendo, por ejemplo, células T que producen citocinas o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de la enfermedad, tanto si esa enfermedad ya se ha establecido dentro del individuo como si no. Un ejemplo de administración del gen es acelerándolo hacia las células deseadas como un recubrimiento sobre partículas o de otra manera. Tal vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo de ADN-proteína o un complejo de ARN-proteína.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, puede inducir dentro de él una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en tal individuo frente a un polinucleótido y/o polipéptido BASB019 codificado a partir de él, en el que la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB019 recombinante codificado a partir del mismo y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB019, polipéptido codificado a partir del mismo, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpos y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de células T CD4+ o CTL.

Un polipéptido BASB019 o un fragmento del mismo puede fusionarse con una coproteína o resto químico que puede o no producir por sí mismo anticuerpos, pero que puede estabilizar la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras. Así la proteína recombinante fusionada, preferiblemente comprende además una coproteína antigénica, tal como lipoproteína D de Haemophilus influenzae, glutatión-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubilice la proteína y facilite la producción y purificación de la misma. Es más, la coproteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmunitario del organismo que recibe la proteína. La coproteína puede unirse con cualquiera de los extremos amino o carboxilo-terminal de la primera proteína.

Se proporcionan mediante esta invención composiciones, particularmente composiciones de vacuna, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como las descritas en Sato, Y. et al. Science 273: 352 (1996).

También, se proporcionan mediante esta invención procedimientos que usan el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, que han mostrado que codifican regiones no variables de proteínas de superficie celular bacterianas, en los constructos del polinucleótido usados en tales experimentos de inmunización genética en modelos de animales de infección con Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopos de proteína que pueden provocar una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica. Se cree que este enfoque permitirá la posterior preparación de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados a partir del órgano requerido del animal que resiste o elimina la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de la infección bacteriana, particularmente infección por Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención también incluye una formulación de vacuna que comprende una polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dado que los polipéptidos y polinucleótidos pueden degradarse en el estómago, se administra cada uno preferiblemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, la administración que es subcutánea, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones de inyección estéril acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales y pueden almacenarse en una condición liofilizada que sólo requiere la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso.

La formulación de vacuna de la invención también puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema adyuvante provoca preferentemente un tipo TH1 de respuesta.

Una respuesta inmunitaria puede diferenciarse ampliamente en dos categorías extremas, siendo respuestas inmunitarias humorales o mediadas por célula (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos de protección efectores celulares y de anticuerpos respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células), y respuestas inmunitarias de tipo TH2 (respuesta humoral).

Pueden caracterizarse las respuestas inmunitarias de tipo TH1 extremas mediante la generación de linfocitos T citotóxicos restringidos por haplotipo, específicos de antígeno y respuestas de linfocitos citolíticos naturales. En ratones, las respuestas de tipo TH1 a menudo se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en seres humanos éstas corresponden a anticuerpos de tipo IgGl. Las respuestas inmunitarias de tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplia gama de isotipos de inmunoglobulina incluyendo IgG1, IgA, y IgM de ratones.

Puede considerarse que la fuerza motriz detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunitarias son las citocinas. Altos niveles de citocinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células frente a un antígeno dado, mientras que altos niveles de citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales frente al antígeno.

La distinción entre respuestas inmunitarias de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en cuanto a los clones de células T CD4+ murinas descritos por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 y TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Inmunology, 7, págs. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 están asociadas con la producción de las citocinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas a menudo directamente asociadas con la inducción de respuestas inmunitarias de tipo TH1 no se producen por células T, tales como IL-12. Por el contrario, las respuestas de tipo TH2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citocinas o bien de tipo TH1 o bien de tipo TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmunitaria tras una vacunación o infección incluyen la medición directa de la producción de citocinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro tras una nueva estimulación con antígeno, y/o la medición de la razón IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpos específicas de antígeno.

Por tanto, un adyuvante de tipo TH1 es uno que estimula preferentemente poblaciones de células T aisladas para producir altos niveles de citocinas de tipo TH1 cuando se vuelven a estimular con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuestas de inmunoglobulina específicas de antígeno asociadas con el isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que pueden lograr una estimulación preferente de la respuesta celular TH1 se describen en las solicitudes de patente internacionales números WO 94/00153 y WO 95/17209.

El monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) es uno de tales adyuvantes. Este se conoce a partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y está fabricado por Ribi Inmunochem, Montana. Una forma preferida de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado se describe en la patente europea 0 689 454 B 1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son lo suficientemente pequeñas para filtrarse de manera estéril a través de una membrana de 0,22 micrómetros (patente europea número 0 689 454).

3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug - 100\mug, preferiblemente de 25-50 \mug por dosis en el que el antígeno estará presente normalmente en un intervalo de 2-50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada mediante Hplc derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente ésta puede mezclarse con monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento para la producción de QS21 se describe en la patente estadounidense número 5.057.540.

Se han descrito anteriormente formulaciones de adyuvante no reactogénicas que contienen QS21 (documento WO 96/33739). Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han demostrado ser adyuvantes estimulantes de TH1 satisfactorios cuando se formulan junto con un antígeno.

Adyuvantes adicionales que son estimulantes preferentes de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas tal como se describen en el documento WO 96/02555.

También se contemplan que combinaciones de diferentes adyuvantes estimulantes de TH1, tales como las mencionados anteriormente en el presente documento, proporcionan un adyuvante que es un estimulador preferente de la respuesta celular TH1. Por ejemplo, puede formularse QS21 junto con 3D-MPL. La razón de QS21: 3D-MPL normalmente será del orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente de 1:5 a 5:1 y a menudo sustancialmente de 1:1. El intervalo preferido para la sinergia óptima es 3D-MPL: QS21 de 2,5:1 a 1:1.

Preferiblemente también está presente un vehículo en la composición según la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna según la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en tal emulsión. Adicionalmente, la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Normalmente para la administración a seres humanos QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal como 10-100 \mug, preferiblemente 10 \mug-50 \mug por dosis. Normalmente el aceite en agua comprenderá desde el 2 hasta el 10% de escualeno, desde el 2 hasta el 10% de alfa-tocoferol y desde el 0,3 hasta el 3% de tween 80. Preferiblemente la razón de escualeno: alfa-tocoferol es igual o inferior a 1 dado que esto proporciona una emulsión más estable. También puede estar presente Span 85 a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizante.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas contienen preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo escualano o escualeno, un emulsionante, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La presente invención también proporciona una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención junto con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunitarias y estados relacionados. Tal composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante que induce a TH-1 tal como se describió anteriormente en el presente documento.

Aunque la invención se ha descrito en referencia a algunos polipéptidos y polinucleótidos BASB019, debe entenderse que esto cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos que se producen de manera natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones que no afectan sustancialmente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB019 y/o un polipéptido BASB019 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido tratados en el presente documento o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse junto con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para usar con células, tejidos u organismos, tal como un vehículo farmacéutico adecuado para su administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo del medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe ajustarse al modo de administración. La invención además se refiere a paquetes y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención pueden emplearse por separado o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier manera eficaz y conveniente, incluyendo, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras.

En un tratamiento o como un profiláctico, el principio activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o compuesto molecular pequeño, junto con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, agua, glicerol, etanol y combinaciones de las mismas. La invención además se refiere a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención pueden emplearse por separado o junto con otros compuestos, tales como compuestos
terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo mediante una vía sistémica u oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, normalmente mediante inyección intravenosa. Pueden usarse otras vías de inyección, tales como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Los medios alternativos para la administración sistémica incluyen administración por vía transmucosa y transdérmica usando penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en forma de unguentos, pastas, geles, disoluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del principio activo sea de desde 0,01 mg/kg hasta 10 mg/kg, normalmente alrededor de 1 mg/kg. En cualquier caso el médico determinará la dosificación real que será la más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta particular del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso promedio. Puede haber, por supuesto, situaciones individuales en las que se necesiten intervalos de dosificación superiores o inferiores, y tales están dentro del alcance de esta invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza del estado del sujeto, y el juicio del médico que atiende. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas se encuentran en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg de sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación es de 0,5-5 microgramo/kg de antígeno, y tal dosis preferiblemente se administra de 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observarán efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención que impedirían su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, deben esperarse amplias variaciones en la dosificación necesitada en vista de la variedad de compuestos disponibles y las distintas eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, se espera que la administración oral requiera dosificaciones superiores que la administración mediante inyección intravenosa. Pueden ajustarse las variaciones en estos niveles de dosificación usando rutinas empíricas habituales para la optimización, como se entiende bien en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias de polinucleótido y polipéptido forman un recurso de información valiosa con el que determinar sus estructuras de 2- y 3-dimensiones así como para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estos enfoques se facilitan más fácilmente almacenando la secuencia en un medio legible por ordenador y luego usando los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda conocidas, tales como el paquete del programa GCG.

También se proporcionan por la invención procedimientos para el análisis de hebras o secuencias de carácter, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencia incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencia, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de estructura de proteínas, ARN y ADN, ensamblaje de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de marco de lectura abierto, denominación de bases de ácido nucleico, análisis del uso del codón, recorte de bases de ácido nucleico, y análisis de picos de cromatogramas de secuenciación.

Se proporciona un procedimiento basado en ordenador para realizar la identificación por homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia polinucleotídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar por homología.

También se proporciona un procedimiento basado en ordenador para realizar identificación por homología, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: proporcionar una primera secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia polipeptídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar por homo-
logía.

Todas las publicaciones y referencias, incluyendo pero sin limitarse a patentes y solicitudes de patente, citadas en esta memoria descriptiva, se incorporan al presente documento en su totalidad como referencia como si cada publicación o referencia individual estuviesen indicadas específica e individualmente para incorporarse al presente documento como referencia tal como se esta exponiendo en detalle. Cualquier solicitud de patente frente a la que esta solicitud reivindique prioridad también se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad de la manera descrita anteriormente para publicaciones y referencias.

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Definiciones

"Identidad", tal como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, como puede ser el caso, tal como se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, como puede ser el caso, tal como se determina mediante el apareamiento entre las hebras de tales secuencias. Puede calcularse fácilmente la "identidad" mediante procedimientos conocidos, incluyendo pero sin limitarse a los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar el mayor apareamiento entre las secuencias sometidas a prueba. Además, los procedimientos para determinar la identidad están codificados en programas de ordenador disponibles públicamente. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el programa GAP en el paquete del programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA85; 2444-2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). También puede usarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

Penalización por hueco: 8

Penalización por longitud de hueco: 2

Un programa útil con estos parámetros está disponible públicamente como el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto con sin penalización para huecos finales).

Los parámetros para la comparación de secuencias polinucleotídicas incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: apareamientos = +10, desapareamientos = 0

Penalización por hueco: 50

Penalización por longitud de hueco: 3

Disponible como: el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para comparaciones de ácidos nucleicos.

Un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se proporcionan en (1) y (2) a continuación.

(1) Las realizaciones de polinucleótido pueden además incluir un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con la secuencia de referencia de SEQ ID NO:1, en la que dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO:1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución de nucleótidos, incluyendo transición y transversión o inserción, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en SEQ ID NO:1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y luego restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en SEQ ID NO:1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

\newpage

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en SEQ ID NO:1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2 pueden crear mutaciones sin sentido, de pérdida de sentido o de desplazamiento de marco en esta secuencia codificante y por tanto alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido tras tales alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia polinucleotídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 1, es decir puede ser idéntica en el 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácido nucleico si se compara con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es inferior a una identidad del 100%. Tales alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución de ácido nucleico, incluyendo transición y transversión o inserción y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia polinucleotídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los ácido nucleicos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácido nucleico para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO:1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y luego restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número total de alteraciones de ácido nucleico, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO:1, y es, por ejemplo 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85% etc., \cdot es el símbolo para el operador multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptido además incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con una secuencia de referencia polipeptídica de SEQ ID NO:2, en la que dicha secuencia polipeptídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO:2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución de aminoácidos, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que el número total de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en SEQ ID NO:2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y luego restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en SEQ ID NO:2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en SEQ ID NO:2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo ante de restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia polipeptídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO:2, es decir puede ser idéntica en un 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es inferior a una identidad del 100%. Tales alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminal de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en SEQ ID NO:2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y luego restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en SEQ ID NO:2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en SEQ ID NO:2, y es, por ejemplo 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85% etc., y \cdot es el símbolo para el operador multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más próximo ante se restarlo de x_{a}.

"Individuo(s)", cuando se usa en el presente documento con referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitarse a un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, si se ha cambiado o eliminado de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presentes de manera natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", tal como se emplea el término en el presente documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" incluso si aún está presente en dicho organismo, pudiendo estar el organismo vivo o no vivo.

"Polinucleótido(s)" generalmente se refiere a cualquier poliribonucleótido o polidesoxiribonucleótido, que puede ser ADN o ARN no modificados o ADN o ARN modificados incluyendo regiones de cadena sencilla y doble.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, tal como se trata a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias están limitadas de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares de manera global y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede estar codificado o no por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede producirse de manera natural tal como una variante alélica, o puede ser un variante que no se sabe que se produce de manera natural. Las variantes que no se producen de manera natural de polinucleótidos y polipéptidos pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad provocada por o relacionada con una infección por bacterias, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida auditiva, acumulación de fluido en el oído medio, daño del nervio auditivo, aprendizaje del habla retrasado, infección del aparato respiratorio superior e inflamación del oído medio.

Ejemplos

Los ejemplos a continuación se realizan usando técnicas habituales, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, excepto cuando se describa lo contrario en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Descubrimiento y secuenciación de ADN confirmatoria del gen de BASB019 de la cepa ATCC43617 de Moraxella catarrhalis

Se descubrió por primera vez el gen de BASB019 en la base de datos Incyte PathoSeq que contenía secuencias de ADN genómico no completas de la cepa ATCC 43617 (también denominada cepa MC2931) de Moraxella catarrhalis. La traducción de la secuencia del polipéptido BASB019 mostró similitud significativa (43% de identidad en la longitud completa de las proteínas) respecto a la proteína PAL de Pseudomonas putida, conocida como una lipoproteína de la membrana externa asociada a peptidoglucano.

Además, se confirmó la secuencia del gen de BASB019 experimentalmente. Con este fin, se extrajo ADN genómico de 10^{10} células de las células de M catarrhalis (cepa ATCC 43617) usando el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen Gmbh), y se sometió 1 \mug de este material a amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores E475765 (5'- CCC TTA TTA ATT GAC AAT CAC -3') [SEQIDNO:9] y E475776 (5'- GGC AGA GTG AAT CTTAAG C-3') [SEQIDNO:10] ubicados fuera de la región codificante de BASB019. Se purificó este producto de PCR en un aparato Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) y se sometió a secuenciación de ADN usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 377/PRISM. Se realizó la secuenciación de ADN en ambas cadenas con una redundancia de 2 y se ensambló la secuencia de longitud completa usando el software Sequencher™ (Applied Biosytems). La secuencia de ADN resultante resultó ser un 100% idéntica a SEQ ID NO:1.

Ejemplo 2 Análisis de variabilidad del gen de BASB019 entre varias cepas de Moraxella catarrhalis. 2A: Análisis de longitud del fragmento de restricción (RFLP)

Se extrajo ADN genómico de 16 cepas de M. catarrhalis (presentadas en la tabla 1) tal como se describe a continuación. Se cultivó en línea M. catarrhalis para detectar colonias sencillas sobre placas de agar BHI y se hizo crecer durante toda la noche a 37°C. Se cogieron tres o cuatro colonias sencillas y se usaron para inocular un cultivo semilla de \sim1,5 ml de caldo BHI (infusión cerebro-corazón) que se hizo crecer durante toda la noche en un incubador con agitación, \sim300 rpm, a 37°C. Se inoculó un matraz erlenmeyer de 500 ml que contenía \sim150 ml de caldo BHI con el cultivo semilla y se hizo crecer durante \sim12-16 horas a 37°C en un incubador con agitación, \sim175 rpm, para generar masa celular para el aislamiento de ADN. Se recogieron las células mediante centrifugación en un rotor Sorvall GSA a \sim2000 X g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se suspendió el sedimento celular en \sim5,0 ml de agua estéril. Se añadió un volumen igual de tampón de lisis (NaCl 200 mM, EDTA 20 mM, Tris-Hcl 40 mM, pH 8,0, SDS al 0,5% (p/v), 2-mercaptoetanol al 0,5% (v/v), y 250 \mug/ml de proteinasa K) y se suspendieron las células mediante agitación suave y trituración. Luego se incubó la suspensión celular \sim12 horas a 50°C para lisar las bacterias y liberar el ADN cromosómico. Se precipitó el material proteico mediante la adición de 5,0 ml de NaCl saturado (\sim6,0 M, en agua estéril) y centrifugación a \sim5,500 x g en un rotor Sorvall SS34 a temperatura ambiente. Se precipitó el ADN cromosómico a partir del sobrenadante clarificado mediante la adición de dos volúmenes de etanol al 100%. Se recogió el ADN agregado y se lavó usando agitación suave en un volumen pequeño de una disolución de etanol al 70%. Se suspendió el ADN cromosómico en agua estéril y se dejó que se disolviese/desembolsase durante toda la noche a 4°C mediante balanceo suave. Se determinó la concentración de ADN disuelto espectrofotométricamente a 260 nm usando un coeficiente de extinción de 1,0 unidad de D.O. \sim50 \mug/ml.

Luego se sometió este material a amplificación por PCR usando los oligonucleótidos MC-P6-Bam-F (5'-AAG GGC CCA ATT ACGCAG AGG GGA TCC AAT AAA TCA ACA AGT CAA GTT ATG GTT GCT CC) [SEQ ID NO:11] y MC-P6-Sal-RC (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA ATA AGA CAG TTC AGC ACG ACG ATT TTG TGA CC-3') [SEQ ID NO:12]. Se sometieron los amplicones del gen de BASB019 correspondientes independientemente a hidrólisis usando enzimas de restricción (AciI, AluI, BbvI, MaeIII, MseI, RsaI) y se separaron los productos de restricción mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa usando procedimientos de biología molecular habituales tal como se describe en "Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edición, Eds: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989". Las fotografías de los geles de electroforesis resultantes se muestran en la figura 1. Para cada cepa, se puntuaron y se combinaron los patrones de RFLP correspondientes a las 6 enzimas de restricción. Luego se definieron grupos de cepas que compartían idéntica combinación de patrones de RFLP. Usando esta metodología, las cepas sometidas a prueba en este estudio se clasificaron en 4 grupos genómicos (Grupo 1: Mc2904, Mc 2911, Mc 2912, Mc2956 y Mc2969; Grupo 2: Mc2905, Mc 2906, Mc2907, Mc2908, Mc2910, Mc2913, Mc2926, Mc2975; Grupo 3: Mc2909, Mc2931 y Grupo 4: Mc2960). Estos datos apoyan que la población de Moraxella catarrhalis usada en este estudio muestra una diversidad de secuencia de nucleótidos limitada para el gen de BASB019.

2B: Secuenciación de ADN en otras cepas

Se clasificó la cepa ATCC 43617 (Mc2931) usada para determinar la secuencia de BASB019 mediante RFLP en el grupo número 3. Usando el procedimiento experimental tal como se describió en el ejemplo 1, también se determinó la secuencia del gen de BASB019 para cepas de Moraxella catarrhalis representativas de otros dos grupos genómicos de RFLP (Gr.1 (Mc2911,Mc2969) y Gr.4 (Mc2960)). Las secuencias polinucleotídicas del gen de BASB019 de las cepas MC2911, MC2960 y MC2969 se muestran en SEQ ID NO:3, 5 y 7, respectivamente. Se tradujeron estas secuencias polinucleotídicas en secuencias de aminoácidos, que se muestran en SEQ ID NO:4, 6 y 8, respectivamente. Usando el programa PILEUP del paquete GCG, se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:1, 3, 5 y 7, y se muestra en la figura 2. En la tabla 2 se resume una comparación de identidades por parejas, que muestra que las cuatro secuencias génicas de nucleótidos de BASB019 son todas similares en un nivel de identidad igual a o superior al 97%. Usando el mismo programa PILEUP del paquete GCG, se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8, y se muestra en la figura 3. En la tabla 3, se resume una comparación de identidades por parejas, que muestra que las cinco secuencias de proteínas BASB019 son todas similares en un nivel de identidad igual o superior al 97%.

TABLA 1 Características de las cepas de Moraxella catarrhalis usadas en este estudio

1

TABLA 2 Identidades por parejas de las secuencias de polinucleótidos BASB019 (en %)

3

TABLA 3 Identidades por parejas de las secuencias de polinucleótidos BASB019 (en %)

4

Ejemplo 3 Construcción de plásmido para expresar BASB019A recombinante A: Clonación de BASB019

Los sitios de restricción BamHI y SalI modificados mediante ingeniería en los cebadores de amplificación directo ([SEQIDNO:11]) e inverso ([SEQIDNO:12]), respectivamente, permitieron la clonación direccional de las 504 pb del producto de PCR en el plásmido de expresión pQE30 de E.coli comercialmente disponible (QiaGen, resistente a ampicilina) de manera que pueda expresarse una proteína BASB019 madura como una proteína de fusión que contiene una marca de cromatografía de afinidad (His)6 en el extremo N-terminal. Se purificó el producto de PCR de BASB019 de 504 pb a partir de la reacción de amplificación usando columnas de centrifugación basadas en gel de sílice (QiaGen) según las instrucciones del fabricante. Para producir los extremos BamHI y SalI requeridos para la clonación, se digirió secuencialmente el producto de PCR purificado hasta la finalización con enzimas de restricción BamHI y SalI tal como se recomienda por el fabricante (Life Technologies). Tras la primera digestión de restricción, se purificó el producto de PCR mediante columna de centrifugación como anteriormente para eliminar sales y se eluyó en agua estéril antes de la segunda digestión enzimática. Se purificó de nuevo el fragmento de ADN digerido usando columnas de centrifugación basadas en gel de sílice antes del acoplamiento con el plásmido pQE30.

B: Producción del vector de expresión

Para preparar el plásmido de expresión pQE30 para el acoplamiento, se digirió similarmente hasta finalización tanto con BamHI como con SalI y luego se trató con fosfatasa intestinal de ternero (CIP, \sim0,02 unidades/pmol de extremo 5', Life Technologies) tal como recomienda el fabricante para evitar el autoacoplamiento. Se usó un exceso molar de aproximadamente 5 veces del fragmento digerido con respecto al vector preparado para programar la reacción de acoplamiento. Se realizó una reacción de acoplamiento de \sim20 \mul habitual (\sim16°C, \sim16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica, usando una ADN ligasa de T4 (\sim2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Se usó una alícuota del acoplamiento (\sim5 \mul) para transformar células electrocompetentes M15(pREP4) según procedimientos bien conocidos en la técnica. Tras un periodo de sobrecrecimiento de \sim2-3 horas a 37°C en \sim1,0 ml de caldo LB, se colocaron las células transformadas en placas de agar LB que contenían kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml). Se incluyeron ambos antibióticos en el medio de selección para garantizar que todas las células transformadas portaban tanto el plásmido pREP4 (KnR), que porta el gen lacIq necesario para la represión de la expresión para la expresión inducible por IPTG de proteínas sobre pQE30, como el plásmido pQE30-MCP6 (ApR). Se incubaron las placas durante toda la noche a 37°C durante \sim16 horas. Se cogieron colonias KnR/ApR individuales con palillos estériles y se usaron para "sembrar por zonas" en placas de LB KnR/ApR frescas inoculadas así como un caldo de cultivo de LB KnR/ApR de \sim1,0 ml. Tanto las placas sembradas por zonas como el caldo de cultivo se incubaron durante toda la noche a 37°C bien en un incubador habitual (placas) o bien en un baño de agua con agitación.

Se empleó un análisis por PCR basado en células completas para verificar que los transformantes contenían el inserto de ADN de BASB019. Aquí, se transfirió el \sim1,0 ml de de caldo de cultivo LB Kn/Ap LB durante toda la noche a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se recogieron las células mediante centrifugación en una microcentrífuga de Beckmann (\sim3 min., temperatura ambiente, \sim12,000 X g). Se suspendió el sedimento celular en \sim200 \mul de agua estéril y se usó una alícuota de \sim10 \mul para programar una reacción PCR de volumen final de \sim50 \mul que contenía ambos cebadores de amplificación de BASB019 directo e inverso. Las concentraciones finales de los componentes de reacción de PCR fueron esencialmente los mismos que los especificados en el ejemplo 2 excepto que se usaron \sim5,0 unidades de Taq polimerasa. Se aumentó la etapa de desnaturalización a 95°C inicial hasta 3 minutos para garantizar la alteración térmica de las células bacterianas y la liberación de ADN del plásmido. Se usaron un ciclador térmico ABI modelo 9700 y un perfil de amplificación térmica de tres etapas y de 32 ciclos, es decir 95°C, 45 seg; 55-58°C, 45 seg, 72°C, 1 min., para amplificar el fragmento de PCR MC-P6 de las muestras transformantes lisadas. Tras la amplificación térmica, se analizó una alícuota de \sim20 \mul mediante electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 0,8% en un tampón Tris-acetato-EDTA (TAE)). Se visualizaron los fragmentos de ADN mediante iluminación por UV tras la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se sometió a electroforesis un patrón de tamaño molecular de ADN (escala de 1 Kb, Life Technologies) en paralelo con las muestras de prueba y se usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Se identificaron los transformantes que producían el producto de PCR de 504 pb esperado como cepas que contenían un constructo de expresión de BASB019. Luego se analizaron cepas que contenían plásmidos de expresión para determinar la expresión inducible de BASB019 recombinante.

C: Análisis de la expresión de transformantes positivos para PCR

Para cada transformante positivo para PCR identificado anteriormente, se inocularon \sim5,0 ml de caldo LB que contenía kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml) con células de la placa sembrada por zonas y se hicieron crecer durante toda la noche a 37°C con agitación (\sim250 rpm). Se inoculó una alícuota del cultivo semilla durante toda la noche (\sim1,0 ml) en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía \sim25 de caldo LB Kn/Ap y se hizo crecer a 37°C con agitación (\sim250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una D.O.600 de \sim0,5, es decir fase semilogarítmica (normalmente aproximadamente 1,5-2,0 horas). En este momento, se transfirió aproximadamente la mitad del cultivo (\sim12,5 ml) a un segundo matraz de 125 ml y se indujo la expresión de proteína MC-P6 recombinante mediante la adición de IPTG (disolución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. La incubación tanto de cultivos inducidos como no inducidos por IPTG continuó durante unas \sim4 horas adicionales a 37°C con agitación. Se eliminaron muestras (\sim1,0 ml) tanto de cultivos inducidos como no inducidos tras el periodo de inducción y se recogieron las células por centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante -3 minutos. Se suspendieron los sedimentos celulares individuales en \sim50 \mul de agua estéril, luego se mezclaron con un volumen igual de tampón de muestra Laemelli SDS-PAGE 2X que contenía 2-mercaptoetanol, y se colocaron en un baño de agua hirviendo durante \sim3 min para desnaturalizar la proteína. Se cargaron volúmenes iguales (\sim15 \mul) tanto de lisados celulares crudos inducidos como no inducidos por IPTG sobre gel de Tris/glicina poliacrilamida duplicado al 12% (1 mm de espesor, Mini-geles, Novex). Las muestras de lisados inducidos y no inducidos se sometieron a electroforesis junto con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de elución SDS/Tris/glicina habitual (BioRad). Tras la electroforesis, se tiñó un gel con azul brillante de Commassie R250 (BioRad) y luego se destiñó para visualizar proteína(s) MC-P6 novedosa(s) inducible(s) por IPTG. Se sometió a electroinmunotransferencia el segundo gel sobre una membrana de PVDF (tamaño de poro de 0,45 micras, Novex) durante \sim2 hrs a 4°C usando un aparato de inmunotransferencia BioRad Mini-Protean II y tampón de transferencia de metanol de Towbin (20%). Se realizaron bloqueo de la membrana e incubaciones de anticuerpo según procedimientos bien conocidos en la técnica. Se usó un anticuerpo anti-RGS (His)3 monoclonal, seguido por un segundo anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado con HRP (QiaGen), para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante MC-P6. Se logró la visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His usando bien un sustrato insoluble en ABT o bien usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

D: Confirmación de la secuencia

Para verificar adicionalmente que la proteína BASB019 recombinante inducible por IPTG que se está expresando está en el marco de lectura abierto correcto y no es una molécula falsa que surge de un artefacto de clonación (es decir un desplazamiento de marco), se determinó la secuencia de ADN del inserto clonado. Se obtuvo la secuencia de ADN para el gen de BASB019 de M. catarrhalis a partir de una cadena usando metodologías de secuenciación en ciclo por PCR asimétrica convencional (ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Se programaron las reacciones de secuenciación con ADN de plásmido de expresión no digerido (\sim0,5 \mug/rxn) como molde y cebadores de secuenciación específicos del vector pQE30 y específicos de ORF apropiados (\sim3,5 pmol/rxn). Además del molde y el cebador de secuenciación, cada reacción de secuenciación (\sim20 \mul) contenía los cuatro dNTP diferentes (es decir A, G, C, y T) y los cuatro nucleótidos de terminación ddNTP correspondientes (es decir ddA, ddG, ddC, y ddT); estando cada terminador conjugado con uno de los cuatro colorantes fluorescentes, Joe, Tam, Rox, o Fam. Se terminaron los productos de elongación de secuenciación de cadena sencilla en posiciones aleatorias a lo largo del molde mediante incorporación de los terminadores ddNTP marcados con colorante. Los productos de terminación marcados con colorantes fluorescentes se purificaron usando columnas de cromatografía de exclusión molecular microcentrífugas (Princeton Genetics), se secaron a vacío, se suspendieron en un tampón de resuspensión de molde (Perkin-Elmer) para electroforesis capilar o para PAGE en formamida desionizada, se desnaturalizaron a 95°C durante \sim5 min, y se analizaron mediante electroforesis capilar de alta resolución (secuenciador de ADN automatizado ABI 310, Perkin-Elmer) o PAGE de alta resolución (secuenciador de ADN automatizado ABI 377) tal como se recomienda por el fabricante. Se recogieron los datos de la secuencia de ADN producidos a partir de reacciones individuales y se analizaron automáticamente las intensidades de picos fluorescentes relativas en un ordenador PowerMAC usando el software de análisis de secuencia ABI (Perkin-Elmer). Se editaron manualmente las secuencias de ADN autoanalizadas individualmente para precisión antes de fusionarse en una "hebra" de secuencia de cadena sencilla consenso usando el software AutoAssembler (Perkin-Elmer). La secuenciación determinó que el plásmido de expresión contenía el marco de lectura abierto correcto.

Ejemplo 4 Producción de BASB019 Cepa bacteriana

Se usó una cepa de expresión recombinante M15 (pREP4) de E. coli que contenía un plásmido (pQE30) que codifica BASB019 de M catarrhalis para producir masa celular para la purificación de proteína recombinante. Se cultivó la cepa de expresión sobre placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de kanamicina ("Kn") y 100 \mug/ml de ampicilina ("Ap") para garantizar que se mantenían tanto el plásmido de control pREP4 lacIq como el constructo de expresión pQE30-BASB019. Para conservación criogénica a -80ºC, se propagó la cepa en caldo LB que contenía la misma concentración de antibióticos, luego se mezcló con un volumen igual de caldo LB que contenía glicerol al 30% (p/v).

Medios

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante estaba constituido por caldo YT 2X (Difco) que contenía 50 \mug/ml de Kn y 100 \mug/ml de Ap. Se añadió antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l (Antiespumante 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante BASB019, se añadió IPTG (Isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido) al fermentador (1 mM, final).

Fermentación

Se inoculó un matraz semilla erlenmeyer de 500 ml, que contenía 50 ml de volumen de trabajo, con 0,3 ml de cultivo congelado rápidamente descongelado, o varias colonias de un cultivo en placas de agar selectivas, y se incubó durante aproximadamente 12 horas a 37\pm1°C sobre una plataforma con agitación a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Luego se usó este cultivo semilla para inocular un fermentador de 5 l de volumen de trabajo que contenía caldo YT 2X y ambos antibióticos Kn y Ap. El fermentador (Bioflo3000, New Brunswick Scientific) funcionó a 37\pm1°C, rociador de aire 0,2-0,4 VVM, 250 rpm en impulsores Rushton. No se controló el pH ni en el cultivo semilla del matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH osciló de 6,5 a 7,3 en el fermentador. Se añadió IPTG (disolución madre 1,0 M, preparada en agua estéril) al fermentador cuando el cultivo alcanzó crecimiento semilogarítmico (\sim0,7 unidades de D.O.600). Se indujeron células durante 2-4 horas, luego se cultivaron mediante centrifugación usando bien la centrífuga 28RS Heraeus (Sepatech) o bien la centrífuga de supervelocidad RC5C (Sorvall Instruments). Se almacenó la pasta celular a -20ºC hasta que se procesó.

Purificación Productos químicos y materiales

Se obtuvieron imidazol, clorhidrato de guanidina, Tris (hidroximetil), y EDTA (ácido etilendiamina tetraacético) de calidad biotecnológica o mejor de Ameresco Chemical, Solon, Ohio. Triton X-100 (t-Octilfenoxipolietoxi-etanol), fosfato de sodio, monobásico, y urea eran de calidad para reactivo o mejor y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Se obtuvieron ácido acético glacial y ácido clorhídrico de Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey. Se obtuvo metanol de Fisher Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey. Se obtuvieron Pefabloc®SC (fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo), comprimidos combinados de inhibidores de proteasa completos, y PMSF (fluoruro de fenilmetil-sulfonilo) de Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. Se obtuvieron bestatina, pepstatina A, e inhibidor de proteasa E-64 de Calbiochem, LaJolla, California. Se obtuvo solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1x PBS) de Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland. Se obtuvo solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (10x PBS) de Bio Whittaker, Walkersville, Maryland. Se obtuvo anticuerpo penta-His, libre de BSA de QiaGen, Valencia, California. Se obtuvo IgG de cabra anti-ratón AffiniPure conjugada con peroxidasa de Jackson Inmuno Research, WestGrove, Penn. Se obtuvo una disolución sencilla de AEC de Zymed, San Francisco Sur, California. Todos los demás productos químicos eran de calidad para reactivo o mejores.

Se obtuvo resina de superflujo Ni-NTA de QiaGen Inc., Valencia, California. Se obtuvieron geles de tris-glicina al 4-20% y poliacrilamida al 10-20% precolados, todos los tampones de elución y disoluciones, patrones preteñidos SeeBlue, patrones multimarca multicoloreados y membranas de transferencia PVDF de Novex, San Diego, California. Se obtuvieron kits de tinción de plata de SDS-PAGE de Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokyo, Japon. Se obtuvo disolución de tinción de Coomassie de Bio-Rad Laboratories, Hercules, California. Se obtuvieron filtros de jeringa de 0,2 m Acrodisc® PF de Pall GelmanSciences, Ann Arbor, Michigan. Se obtuvieron filtros de jeringa desechables de 25 mm GD/X de Whatman Inc., Clifton, Nueva Jersey. Se obtuvieron tubos de diálisis 8,000 MWCO de BioDesign Inc. Od Nueva York, Carmal Nueva York. Se obtuvieron reactivos de ensayo de proteína BCA y tubos de diálisis piel de serpiente 3,500 MWCO de Pierce Chemical Co., Rockford, Ilinois.

Protocolo de extracción

Se descongeló pasta celular a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Se pesaron de cinco a seis gramos de material en un tubo de centrifugado desechable de 50 ml. A esto se añadieron cinco ml/gramo de tampón de clorhidrato de guanidina (Gu-HCl) (clorhidrato de guanidina 6 M, fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 1,0 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 8,0). Se resuspendió la pasta celular usando un homogeneizador procientífico PRO300D, a 3/4 de potencia durante un minuto. Luego se colocó la mezcla de extracción a temperatura ambiente con agitación suave durante 60 a 90 minutos. Después de 60 a 90 minutos se centrifugó la mezcla de extracción a 15.800 x g durante 15 minutos (centrífuga Sorvall RC5C, 11.500 rpm). Se decantó el sobrenadante (S1) y se guardó para purificación adicional. Se guardó el sedimento (P1) para el análisis.

Unión de BASB019 a resina de Níquel-NTA

Se añaden al S 1 de tres a cuatro ml de resina de Ni-NTA. Luego se coloca ésta a temperatura ambiente con agitación suave durante una hora. Tras una hora se empaqueta la S1/Ni-NTA en una columna XK16 de Pharmacia. Luego se lava la columna con tampón Gu-HCl 1 M (clorhidrato de guanidina 1 M, fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 8,0). A esto le sigue un lavado con tampón fosfato (fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 6,3). Luego se eluye la proteína de la columna con un tampón de imidazol 250 mM (imidazol 250 mM, fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 5,9).

Formulación final

Se formuló BASB019 mediante diálisis durante toda la noche frente a tres cambios de Triton X-100 al 0,1% y PBS 1x, pH 7,4 (pH 12,0 para MC-D15), para eliminar Gu-HCl e imidazol residual. Se caracterizó la proteína purificada y se usó para producir anticuerpos tal como se describe a continuación.

Caracterizaciones bioquímicas Análisis de SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western

Se resolvió la proteína purificada recombinante sobre geles de poliacrilamida al 4-20% y se trasfirió electroforéticamente a membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora tal como se describió previamente (Thebaine et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76:4350-4354). Luego se pretrataron las membranas PVDF con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía leche seca no grasa al 5%. Todas las incubaciones posteriores se realizaron usando este tampón de pretratamiento.

Se incubaron las membranas PVDF con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmunitario o suero inmunitario de conejo anti-His durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavaron las membranas de PVDF dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro de sodio 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Se incubaron las membranas de PVDF con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra anti-conejo marcada con peroxidasa (Jackson InmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se lavaron las membranas PVDF 4 veces con tampón de lavado y se revelaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea suministrados por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada una.

Los resultados de una SDS-PAGE (figura 4) muestran una proteína de aproximadamente 17-18 kDa purificada a más del 95% y que es reactiva frente a anticuerpo anti- RGS(His) mediante inmunotransferencias tipo Western (figura 5) de la SDS-PAGE.

Secuenciación de proteínas

Se realizó la secuenciación de aminoácidos del extremo amino terminal de la proteína purificada para confirmar la producción de la proteína recombinante correcta usando protocolos químicos bien definidos en un secuenciador Hewlett-Packard modelo G1000A con un modelo 1090 LC y un secuenciador Hewlett-Packard modelo 241 con un modelo 1100 LC.

Ejemplo 5 Producción de antisueros frente a BASB019 recombinante

Se generaron antisueros polivalentes contra la proteína BASB019 vacunando dos conejos con la proteína BASB019 recombinante purificada. Se le dio a cada animal un total de tres inmunizaciones por vía intramuscular (i.m.) de aproximadamente 20 \mug de proteína BASB019 por inyección (empezando con adyuvante de Freund completo y seguido con adyuvante de Freund incompleto) a aproximadamente intervalos de 21 días. Se sangraron los animales antes de la primera inmunización ("pre-sangrado") y en los días 35 y 57.

Se midieron los títulos de proteína anti-BASB019 mediante un ELISA usando proteína BASB019 recombinante purificada (0,5 \mug/pocillo). Se define el título como la mayor dilución igual o superior a 0,1 tal como se calcula con la siguiente ecuación: DO promedio de las dos muestras de prueba de antisueros - la DO promedio de las dos muestras de prueba del tampón. Para el primer conejo, el título antes de las inmunizaciones = 100, el título en el día 35 = 656100 y el título en el día 57 = 17714700. Para el segundo conejo, el título antes de las inmunizaciones = 300, el título en el día 35 = 218700 y el título en el día 57 = 1968300.

Se usaron los antisueros como el primer anticuerpo para identificar la proteína en una inmunotransferencia tipo Western tal como se describió en el ejemplo 6 anterior. La figura 6 muestra los resultados de una inmunotransferencia tipo Western de BASB019 purificada con anticuerpo anti-BASB019.

Ejemplo 6 Caracterización inmunológica Análisis de inmunotransferencia tipo Western

Se hicieron crecer varias cepas de M. catarrhalis incluyendo ATCC 49143, y ATCC 43617, así como aislados clínicos de varias regiones geográficas, sobre placas de agar de chocolate durante 48 horas a 35ºC en CO_{2} al 5%. Se usaron varias colonias para inocular 25 ml de caldo Muller Hinton en un matraz de 250 ml. Se hicieron crecer los cultivos durante toda la noche y se recogieron mediante centrifugación. Luego se solubilizaron las células suspendiendo 30 \mug de células en 150 \mul de tampón de muestra PAGE (tampón Tris 360 mM, pH 8,8, que contiene dodecilsulfato de sodio al 4% y glicerol al 20%), e incubando la suspensión a 100ºC durante 5 minutos. Se resolvieron las células solubilizadas sobre geles de poliacrilamida al 4-20% y se transfirieron las proteínas separadas a membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora tal como se describió previamente (Thebaine et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). Luego se pretrataron las membranas de PVDF con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía un 5% de leche seca no grasa. Se realizaron todas las incubaciones posteriores usando este tampón de pretratamiento.

Se incubaron las membranas de PVDF con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmunitario o suero inmunitario de conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavaron las membranas de PVDF dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro de sodio 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Se incubaron las membranas de PVDF con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra anti-conejo marcada con peroxidasa (Jackson InmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se lavaron las membranas de PVDF 4 veces con tampón de lavado y se revelaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea suministrados por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada una.

Los resultados de este análisis por inmunotransferencia tipo Western usando antisueros descritos en el ejemplo 5 (dilución 1:2000) se muestran en la figura 7. Se detecta una proteína de aproximadamente 17-18 kDa (correspondiente al peso molecular esperado de BASB019) que es reactiva con los antisueros en todas las cepas de Moraxella.

Ejemplo 7 Presencia de anticuerpo frente a BASB019 en sueros convalescentes humanos

Se realizaron análisis por inmunotransferencia tipo Western de BASB019 recombinante purificada tal como se describió en los ejemplos 4 y 6 anteriores, excepto que se usó una reserva de sueros humanos de niños infectados por M catarrhalis como la primera preparación de anticuerpo. Los resultados muestran que los antisueros de individuos infectados de manera natural reaccionan frente a la proteína recombinante purificada (datos no mostrados).

Ejemplo 8 Producción de péptidos BASB019, antisueros y reactividad de los mismos

Se produjeron dos péptidos específicos de BASB019 de aminoácidos cortos, que tenían las secuencias de CNEEA
WSQNRRAELSY y YTGVAPLVDNDETV en el laboratorio usando procedimientos generalmente bien conocidos. Se usaron estos péptidos unidos a KLH para producir anticuerpos en conejos hembra de 12 semanas de edad de Nueva Zelanda libres de patógenos específicos. Los conejos recibieron 4 inyecciones a intervalos de aproximadamente 3 semanas de 200 \mug de péptido-KLH en adyuvante de Freund completo (1ª inyección) o incompleto (2ª, 3ª y 4ª inyecciones). Se sangraron los animales antes de la primera inmunización y un mes después de la 4ª inyección.

Se midieron títulos de punto medio anti-péptido mediante un ELISA usando péptidos libres. Los títulos de punto medio anti-péptido un mes después de la 4ª inmunización fueron superiores a 30000. Se prepararon inmunotransferencias tipo Western de BASB019 recombinante purificado, usando anticuerpos anti-péptido como el primer anticuerpo, tal como se describió en los ejemplos 4 y 6. Los resultados se presentan en la figura 8.

Materiales depositados

Se ha depositado un depósito que contiene una cepa Catlin de Moraxella catarrhalis con la colección americana de cultivos tipo (en el presente documento "ATCC") el 21 de junio de 1997 y se le ha asignado el número de depósito 43617. Se describió el depósito como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una biblioteca de inserto de 1,5-2,9 kb secada por congelación construida a partir de aislado de M. catarrhalis obtenido a partir de un aspirado transcraneal de un minero del carbón con bronquitis crónica. Se describe el depósito en Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506-508 (1982).

El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se denomina en el presente documento como "la cepa depositada " o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen de BASB019 de longitud completa. La secuencia polinucleotídica contenida en la cepa depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado por el mismo, se están controlando en el caso de cualquier conflicto con una descripción de las secuencias en el presente documento.

Se ha realizado el depósito de la cepa depositada bajo los términos del tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para fines de procedimiento de patente. La cepa depositada se liberará irrevocablemente y sin restricción o condición al público tras la expedición de una patente. La cepa depositada se proporciona meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no es una admisión que se requiera un depósito para permiso, tal como el requerido bajo la 35 U.S.C. \NAK 112.

5

<110> SmithKline Beecham Biologicals

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<120> Compuestos Novedosos

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<130> BM45311

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<160> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Version 3.0

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<210> 1

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<211> 519

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<212> ADN

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<213> Bacterias

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<400> 1

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7

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<210> 2

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<211> 172

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<212> PRT

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<213> Bacterias

\newpage

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<400> 2

8

9

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<210> 3

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<211> 519

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<212> ADN

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<213> Bacterias

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<400> 3

10

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<210> 4

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<211> 172

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<212> PRT

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<213> Bacterias

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<400> 4

11

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<210> 5

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<211> 519

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<212> ADN

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<213> Bacterias

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<400> 5

12

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<210> 6

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<211> 172

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<212> PRT

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<213> Bacterias

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<400> 6

13

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<210> 7

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<211> 519

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<212> ADN

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<213> Bacterias

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<400> 7

14

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<210> 8

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<211> 172

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<212> PRT

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<213> Bacterias

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<400> 8

15

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<210> 9

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de cebador

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

cccttattaat tgacaatcac

\hfill

21

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<210> 10

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de cebador

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggcagagtga atcttaagc

\hfill

19

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<210> 11

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<211> 59

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagggcccaa ttacgcagag gggatccaat aaatcaacaa gtcaagttat ggttgctcc

\hfill

59

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<210> 12

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<211> 659

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagggcccaa ttacgcagag ggtcgactta ttaataagac agttcagcac gacgatttg tgacc

\hfill

65

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<210> 13

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido

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<400> 13

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\sa{Cys Asn Glu Glu Ala Trp Ser Gln Asn Arg Arg Ala Glu Leu Ser Tyr}

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<210> 14

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido

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<400> 14

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\sa{Tyr Thr Gly Val Ala Pro Leu Val Asp Asn Asp Glu Thr Val}

\newpage

INFORMACIÓN DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencias de polipéptido y de polinucleótido BASB019

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:1

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa MC2931 de Moraxella catarrhalis

16

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:2

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa MC2931 de Moraxella catarrhalis

17

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:3

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa Mcat 2911 de Moraxella catarrhalis

18

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:4

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat 2911 de Moraxella catarrhalis

19

\newpage

SEQ ID NO:5

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa Mcat 2960 de Moraxella catarrhalis

20

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:6

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat 2960 de Moraxella catarrhalis

21

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:7

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa Mcat 2969 de Moraxella catarrhalis

22

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:8

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat 2969 de Moraxella catarrhalis

23

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCC TTA TTA ATT GAC AAT CAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGC AGA GTG AAT CTT AAG C

\hfill

\newpage

SEQ ID NO:11

24

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:12

25

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CNEEAWSQNRRAELSY

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

YTGVAPLVDNDETV

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> SmithKline Beecham Biologicals

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Compuestos Novedosos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BM45311

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Version 3.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 519

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 519

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 519

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 519

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccttattaat tgacaatcac

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcagagtga atcttaagc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagggcccaa ttacgcagag gggatccaat aaatcaacaa gtcaagttat ggttgctcc

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagggcccaa ttacgcagag ggtcgactta ttaagac agttcagcac gacgatttg tgacc

\hfill

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Thr Gly Val Ala Pro Leu Val Asp Asn Asp Glu Thr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Thr Gly Val Ala Pro Leu Val Asp Asn Asp Glu Thr Val}

\vskip1.000000\baselineskip

INFORMACIÓN DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencias de polipéptido y de polinucleótido BASB019

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:1

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa MC2931 de Moraxella catarrhalis

36

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:2

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa MC2931 de Moraxella catarrhalis

37

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:3

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa Mcat 2911 de Moraxella catarrhalis

38

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:4

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat 2911 de Moraxella catarrhalis

39

\newpage

SEQ ID NO:5

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa Mcat 2960 de Moraxella catarrhalis

40

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:6

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat 2960 de Moraxella catarrhalis

41

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:7

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polinucleótido BASB019 de la cepa Mcat 2969 de Moraxella catarrhalis

42

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:8

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de polipéptido BASB019 de la cepa Mcat 2969 de Moraxella catarrhalis

43

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCC TTA TTA ATT GAC AAT CAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGC AGA GTG AAT CTT AAG C

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:11

44

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:12

45

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CNEEAWSQNRRAELSY

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO:14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

YTGCAPLVDNDETV

\hfill

Claims (24)

1. Un polipéptido inmunogénico aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos una identidad del 95% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente.

3. El polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.

4. Un polipéptido inmunogénico aislado que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.

5. Un fragmento inmunogénico del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fragmento inmunogénico puede provocar una respuesta inmunitaria, si es necesario cuando está acoplado a un vehículo, que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

6. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un fragmento inmunogénico según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico es parte de una proteína de fusión mayor.

7. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido o un fragmento inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico que tiene al menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente.

9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 85% con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunogénico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 sobre la región codificante completa; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos una identidad del 85% con la de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

11. El polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la identidad es al menos del 95% con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

13. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7.

14. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido inmunogénico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, obtenible mediante selección de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 o un fragmento de las mismas.

15. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 7-14.

16. Una célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 15, que expresa un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, o una membrana de la célula huésped que contiene el polipéptido expresado.

17. Un procedimiento para producir un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un fragmento inmunogénico según las reivindicaciones 5 a 6, que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 16 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico y recuperar el polipéptido o fragmento inmunogénico a partir del medio de cultivo.

18. Un procedimiento para expresar un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, que comprende transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

19. Un sistema de expresión recombinante que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14.

20. Una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o fragmento inmunogénico según las reivindicaciones 5 a 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. La composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

23. Un anticuerpo generado contra el polipéptido constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 respectivamente o un fragmento inmunogénico de las mismas que, si es necesario cuando está acoplado a un vehículo, puede provocar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

24. Un procedimiento para diagnosticar una infección por Moraxella catarrhalis, que comprende identificar un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o un anticuerpo que es inmunoespecífico para dicho polipéptido, presente en una muestra biológica de un animal que se sospecha que tiene una infección de este tipo.