ES2290056T3

ES2290056T3 - Polipeptidos de moraxella (branhamella) catarrhalis.

Info

Publication number: ES2290056T3
Application number: ES00975853T
Authority: ES
Inventors: Joelle GlaxoSmithKline Biologicals s.a. THONNARD
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1999-09-14
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2008-02-16
Anticipated expiration: 2020-09-14
Also published as: DE60035788D1; WO2001019862A2; ATE368686T1; AU1383901A; EP1214339A2; WO2001019862A3; DE60035788T2; EP1214339B1; CA2383081A1

Abstract

Un fragmento inmunogénico de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en la longitud completa de la SEC ID Nº 2, en la que el fragmento inmunogénico comprende más de 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y que es capaz de producir una respuesta inmune en caso necesario, cuando se acopla a un vehículo que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2, y en la que el fragmento inmunogénico no es la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

Description

Polipéptidos de Moraxella (branhamella) catarrhalis.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos, (denominados en la presente memoria descriptiva "polinucleótido(s) BASB 129)" polipéptidos codificados por ellos (denominados en la presente memoria descriptiva "BASB 129" ó "polipéptido(s) BASB 129"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (también llamada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram-negativa aislada frecuentemente a partir del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías siendo las principales otitis media en lactantes y niños, y neumonía en ancianos. También es responsable de sinusitis, infecciones nosocomiales y menos frecuentemente de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad importante de la infancia tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. Más de 3,5 millones de casos se registran cada año en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19: 823). Si se deja sin tratar, o convirtiéndose en crónica, esta enfermedad puede conducir a pérdidas de audición que podrían ser temporales (en el caso de acumulación de fluidos en el oído medio) o permanentes (si se daña el nervio auditivo). En lactantes tales pérdidas de audición pueden ser responsables del retraso en el aprendizaje del habla.

Tres especies bacterianas se aíslan principalmente del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi), y M. catarrhalis. Están presentes en el 60% al 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NHTi representan ambos aproximadamente el 30%, y M. catarrhalis aproximadamente el 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Otras bacterias se podrían aislar del oído medio (H. influenzae tipo B, S. pyogenes etc.) pero en mucho menor frecuencia (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un prerrequisito absoluto para el desarrollo de una otitis; sin embargo también se requieren otros para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col., (1988) J. Infect. Dis. 158: 205, Faden, HL y col., (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Éstos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias en el oído medio a través de la trompa de Eustaquio, seguido del inicio de un proceso inflamatorio. Estos factores son actualmente desconocidos. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmune después de una infección viral, por ejemplo, podría provocar una incapacidad de controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, HL y col., (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Una explicación alternativa es que la exposición a los factores ambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente serán susceptibles de desarrollar otitis media debido a la presencia sustancial de patógenos en el oído medio (Murphy, TF (1996) MIcobiol. Rev. 60: 267).

La respuesta inmune a M. catarrhalis está deficientemente caracterizada. El análisis de cepas aisladas secuencialmente a partir de la nasofaringe de bebés de 0 a 2 años de edad, indica que adquieren y eliminan frecuentemente nuevas cepas. Esto indica que incrementan una respuesta inmune eficaz contra esta bacteria los niños colonizados (Faden, HL y col., (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

En la mayoría de los adultos ensayados, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y col., (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida en suero: en general, los aislamientos de individuos enfermos son más resistentes que los que están simplemente colonizados (Hol, C y col., (1993) Lancet 341: 1281, Jordan, KL y col., (1990) Am. J. Med 88 (supl. 5A): 28S). Por lo tanto la resistencia en suero se puede considerar como un factor de virulencia de las bacterias. Una actividad opsonizante se ha observado en los sueros de niños que se recuperan de otitis media.

No se han identificado los antígenos dirigidos por estas diferentes respuestas inmunes en seres humanos, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por hierro, y que se reconoce por el suero de pacientes con neumonía (Sethi S, y col., (1995) Infect. Immun. 63: 1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col., (1999), Infect. Inmun. 67: 1310).

Unas otras pocas proteínas de membrana presentes en la superficie de M. catarrhalis se han caracterizado usando un procedimiento bioquímico, o por su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos originados contra alguno de ellos (UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) se conserva en gran medida entre cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con un porin de Pseudomonas aeruginosa, que ha demostrado ser eficaz contra esta bacteria en modelos de animales.

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El documento WO 00/78968 describe secuencias de nucleótidos e identifica fases abiertas de lectura a partir del genoma de Moraxella catarrhalis.

La frecuencia de infecciones por Moraxella catarrhalis ha aumentado espectacularmente en las pasadas últimas décadas. Esto se ha atribuido a la emergencia de múltiples cepas resistentes a antibióticos y a un incremento en la población de personas con sistemas inmunes debilitados. Ya no es inusual aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o todos los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica insatisfecha y demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos, y ensayos de diagnóstico para este organismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB 129, en particular a polipéptidos BASB 129 y polinucleótidos BASB 129, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. Se describen procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. También se describen ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas a infecciones microbianas y afecciones asociadas a tales infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB 129.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de la SEC ID Nº 2, en la que el fragmento inmunogénico comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y que es capaz de inducir una respuesta inmune en caso necesario, cuando se acopla a un vehículo que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2, y en la que el fragmento inmunogénico no es la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado que codifica el fragmento inmunogénico de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un microorganismo recombinante vivo que comprende el vector de expresión de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una fracción subcelular aislada o una membrana aislada de la célula hospedadora de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una membrana de un microorganismo recombinante vivo que tiene la expresión regulada de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de la SEC ID Nº 2, o el fragmento inmunogénico de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para producir el fragmento inmunogénico de la invención que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la invención en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y la recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para expresar un polinucleótido de la invención que comprende la transformación de una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y el cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de cualquiera de dichos polinucleótidos.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una vesícula bacteriana de la membrana externa obtenida a partir de una célula hospedadora que comprende un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de SEC ID Nº 2; una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 83% de identidad a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de SEC ID Nº 2 sobre la región codificadora entera; una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad a la de SEC ID Nº 1 sobre la longitud total de SEC ID Nº 1; o un polinucleótido que codifica un fragmento inmunogénico de la invención que tiene una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo de la presente invención que tiene una región cadena arriba modificada que contiene un elemento heterólogo.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de SEC ID Nº 2, o el fragmento inmunogénico de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

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De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva de la vesícula bacteriana de la membrana externa de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un anticuerpo generado contra el fragmento inmunológico de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para diagnosticar una infección por Moraxella catarrhalis, que comprende la identificación de un fragmento inmunogénico o un anticuerpo de la invención, presente dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener tal infección.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de SEC ID Nº 2, o un fragmento inmunogénico de la presente invención en la preparación de un medicamento para usar en la generación de una respuesta inmune en un animal.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de SEC ID Nº 2 ó una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado; un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de SEC ID Nº 2 sobre la región codificadora entera o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado; un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad a la de la SEC ID Nº 1 sobre la longitud total de SEC ID Nº o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado; o un polinucleótido de la invención en la preparación de un medicamento para usar en la generación de una respuesta inmune en un animal.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición terapéutica útil en el tratamiento de humanos con la enfermedad de Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéutico adecuado.

Descripción de la invención

Se revelan polipéptidos y polinucleótidos BASB129 como se describe en más detalle más adelante. En particular, se describen polipéptidos y polinucleótidos de BASB129 de Moraxella catarrhalis que están relacionados con la homología de la secuencia de aminoácidos con la proteína P2 principal de la membrana externa de Haemophilus influenzae. También se describe BASB129 que tiene las secuencias de aminoácidos y nucleótidos expuestas en la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2 respectivamente. Se entiende que las secuencias citadas en la Lista de Secuencias más adelante como "ADN" representan una ejemplificación de una realización de la invención, ya que los expertos en la técnica reconocerán que tales secuencias se pueden emplear de manera útil en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

Se describen polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en la presente memoria descriptiva "BASB129" y "polipéptidos BASB129" así como variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

Además se proporciona:

(a): un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos el 97%-99% de identidad o identidad exacta a la de la SEC ID Nº 2;

(b): un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97%-99% de identidad o identidad exacta a la de la SEC ID Nº 1 en la longitud entera de la SEC ID Nº 1; o

(c): un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97%-99% de identidad o identidad exacta, a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

El polipéptido BASB 129 proporcionado en la SEC ID Nº 2 es el polipéptido BASB 129 de la cepa de Moraxella catarrhalis Mc2931 (ATCC 43617).

La invención también proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB 129, es decir, una porción contigua del polipéptido BASB 129 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2; es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) es capaz de originar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido BASB 129. Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB 129 que carece de una secuencia guía N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido el fragmento inmunogénico de BASB 129 de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todos los dominios extracelulares de un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos el 97%-99% de identidad, a la de la SEC ID Nº 2 en la longitud entera de la SEC ID Nº 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma que parte pero no toda la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido descrito. Como con los polipéptidos BASB 129, los fragmentos pueden estar "aislados" o comprendidos dentro de un polipéptido mayor de los que forman una parte o región, lo más preferiblemente como una única región continua en un único polipéptido mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o de variantes de la misma, tal como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxilo terminal. También se prefieren las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula hospedadora. Se prefieren además fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones hélice alfa y formadoras de hélice alfa, regiones de hoja beta y formadoras de hoja beta, regiones de giro y formadoras de giro, regiones de espiral o formadoras de espiral, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones antifáticas alfa, regiones antifáticas beta, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie, regiones de unión a sustrato, y regiones de alto índice antigénico.

Además los fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o suprimidos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

Los fragmentos de la invención se pueden emplear para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, estos fragmentos se pueden emplear como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Se prefieren particularmente variantes en las que varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o añadidos en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína mayor tal como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o guía, prosecuencias, secuencias que ayudan a la purificación tales como residuos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción de recombinantes. Además, también se considera la adición de secuencias de polipéptidos exógenos o de colas de lípidos o de polinucleótidos para incrementar el potencial inmunogénico de la molécula final.

También se describen proteínas de fusión soluble solubles modificadas genéticamente que comprenden el polipéptido descrito, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como una inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG 1, en la que tiene lugar fusión en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc se puede retirar simplemente mediante la incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor Xa de coagulación de sangre.

Además, también se describen procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de los mismos para seleccionar fármacos, diagnosis y terapia. También se describen polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de tecnología de proteína de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente internacional Números WO 94/29458 y WO 94/22914.

Las proteínas pueden estar químicamente conjugadas, o expresadas como proteínas de fusión recombinantes que permiten que se produzca un incremento de niveles en un sistema de expresión cuando se compara con la proteína no condensada. La pareja de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos de células T auxiliares (pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos de células T auxiliares reconocidos por los seres humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (potenciador de expresión) a rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente la pareja de fusión será tanto una pareja de fusión inmunológica como una pareja potenciadora de expresión.

Las parejas de fusión incluyen la proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Otra pareja de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente se usa la porción C terminal de la molécula. LytA se deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa LytA, (codificada por el gen LytA {Gene, 43 (1986) páginas 265-272}) una autolisina que específicamente degrada ciertos enlaces en la estructura central del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algún análogo de colina tal como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LytA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su extremo amino {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798}. Es posible usar la porción repetida de la molécula de LytA encontrada en el extremo C terminal que comienza en el residuo 178, por ejemplo los residuos 188-305.

También se describen variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir polipéptidos que varían entre los referentes en sustituciones conservadoras de aminoácidos, en las que un residuo se sustituye por otro con características similares. Tales sustituciones típicas son entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos descritos se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos de origen natural aislados, polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos de manera sintética, o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos se comprenden bien en la técnica.

Lo más preferido es que el polipéptido se derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo, se puede obtener preferiblemente a partir de otros organismos del mismo género taxonómico. El polipéptido también se puede obtener, por ejemplo, a partir de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Se describen polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB 129, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido denominado en la presente memoria descriptiva BASB 129.

Se describen polinucleótidos que comprenden una región que codifica polipéptidos BASB 129 que comprenden una secuencia expuesta en la SEC ID Nº 1 que incluye un gen de longitud completa, o una variante del mismo.

El polinucleótido BASB 129 proporcionado en la SEC ID Nº 1 es el polinucleótido BASB 129 de la cepa de Moraxella catarrhalis MC2931 (ATCC 43617).

Se describen moléculas de ácido nucleico aislado que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB 129, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB 129 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, los ARN no procesados, los ARN de ribozima, los ARNm, los ADNc, los ADN genómicos, los ADN B- y Z. Realizaciones adicionales de la invención incluyen, polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y las variantes de los mismos, y las composiciones que los comprenden.

También se describen polinucleótidos aislados, que incluyen al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB 129 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº 2 y polinucleótidos relacionados estrechamente con ellas y las variantes de las mismas.

También se describe un polipéptido BASB 129 de Moraxella catarrhalis que comprende o está constituido por una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o una variante de la misma.

Usando la información proporcionada en la presente memoria descriptiva, tal como una secuencia de polinucleótidos expuesta la SEC ID Nº 1, un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB 129 se puede obtener usando procedimientos de clonación y selección convencionales, tales como aquellos para clonar y secuenciar fragmentos de ADN cromosómico a partir de bacterias que usan células de Moraxella catarrhalis Catlin como material de partida, seguido de la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, tal como una secuencia de polinucleótidos proporcionada en la SEC ID Nº 1, típicamente una genoteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella catarrhalis Catlin en E. coli o algún otro hospedador adecuado se sonda con un oligonucleótido marcado radiactivamente, preferiblemente un 17 mero o más largo, derivado de una secuencia parcial. Los clones que llevan ADN idéntico al de la sonda se puede después distinguir usando condiciones restrictivas de hibridación. Secuenciando los clones individuales así identificados mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia original de polipéptidos o polinucleótidos es posible después extender la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia de genes de longitud completa. De manera conveniente, tal secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN de doble hebra desnaturalizado preparado a partir de un clon de plásmido. Las técnicas adecuadas las describen Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª Edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). (Véase en particular, Screening By Hybridization 1.90 and SECuencing Denutared Double-Stranded DNA Templates 13.70). La secuenciación directa de ADN genómico también se puede realizar para obtener una secuencia génica de longitud completa. Como ilustración de la invención, cada polinucleótido expuesto en la SEC ID Nº 1 se descubrió en una genoteca de ADN derivada de Moraxella catarrhalis.

Además, la secuencia de ADN expuesta en la SEC ID Nº 1 contiene una fase abierta de lectura que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácidos expuesto en la SEC ID Nº 2 con un peso molecular deducido que se puede calcular usando valores de peso molecular de residuos de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la técnica.

El polinucleótido de la SEC ID Nº 1, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 1033 de la SEC ID Nº 1, codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2.

Se describe un polinucleótido aislado que comprende o está constituido por:

(a): una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97%-99% o identidad exacta a la SEC ID Nº 1 en la longitud entera de las SEC ID Nº 1; ó

(b): una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97%-99% de identidad ó el 100% exacta a la secuencia da aminoácidos de la SEC ID Nº 2, en la longitud entera de las SEC ID Nº 2.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies diferentes de Moraxella catarrhalis, se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar una genoteca apropiada en condiciones restrictivas de hibridación (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo entre 45ºC-65ºC y una concentración de SDS entre 0,1% y 1%) con una sonda marcada o detectable que está constituida por o que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 1 o un fragmento de la misma; y aislar un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos.

Se describe una secuencia de polinucleótidos idéntica en su longitud completa a una secuencia codificadora (fase abierta de lectura) en la SEC ID Nº 1. También se describe una secuencia codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí mismo así como una secuencia codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento en fase de lectura con otra secuencia codificadora, tal como una secuencia que codifica una secuencia guía o secretora, una secuencia de pre- , o pro- o prepro-proteína. El polinucleótido descrito también puede contener al menos una secuencia no codificadora, que incluye por ejemplo, pero no se limita a al menos una secuencia 5' y 3' no codificadora, tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como señales de terminación dependientes de rho o independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan ARNm, intrones, y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos también puede comprender una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia de marca que facilita la purificación del polipéptido condensado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia con marca es un péptido hexa histidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen , Inc) y descrita en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), o un péptido marca de HA (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), los cuales pueden ser útiles en la purificación de la secuencia de polipéptidos condensados a ellos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB 129 de la SEC ID Nº 2 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polipéptido contenido en los nucleótidos 1 a 1033 de la SEC ID Nº 1. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB 129 puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa en la presente memoria descriptiva abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polinucleótido descrito en la presente memoria descriptiva, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de la Moraxella catarrhalis BASB 129 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2. El término también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas quecodifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrado, una secuencia de transposón integrado, o debido a la edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificadoras y/o no codificadoras.

También se describen variantes de los polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº 2.

Los fragmentos de los polinucleótidos descritos se pueden usar, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención.

También se describen polinucleótidos que codifican variantes de BASB 129, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB 129 de la SEC ID Nº 2 en la que varios, unos pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácido están sustituidos, modificados, suprimidos y/o añadidos, en cualquier combinación. Especialmente preferidas entre éstas están las sustituciones silenciosas, adiciones y supresiones, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB 129.

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También se describen polinucleótidos que son al menos el 85% idénticos en su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB 129 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2, y polinucleótidos que con complementarios a tales polinucleótidos. Como alternativa, los más preferidos son polinucleótidos que comprenden una región que es al menos el 90% idéntica en su longitud entera a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB 129 y polinucleótidos complementarios a los mismos. En lo que se refiere a esto, se prefieren particularmente los polinucleótidos que son al menos el 95% idénticos en su longitud completa a los mismos. Además, aquellos con al menos el 97% se prefieren en gran medida entre aquellos con al menos el 95%, y entre éstos aquellos con al menos el 98% y al menos el 99% son en gran medida particularmente preferidos, siendo los más preferidos con al menos 99%.

También se describen polinucleótidos que codifican polipéptidos que mantienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de la SEC ID Nº 1.

También se describen polinucleótidos que se hibridan, particularmente en condiciones restrictivas, a secuencias de polinucleótidos de BASB 129, tales como los polinucleótidos en la SEC ID Nº 1. También se describen además polinucleótidos que se hibridan a las secuencias de polinucleótidos proporcionados en la presente memoria descriptiva. En lo que se refiere a esto, se describen polinucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas a los polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva. Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos "condiciones restrictivas" y "condiciones restrictivas de hibridación" significan hibridación que se produce solamente si existe al menos el 95% y preferiblemente al menos el 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones restrictivas de hibridación es la incubación durante toda una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5 x de SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma fragmentado de salmón, seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de lavado e hibridación se conocen bien y se ilustran en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), particularmente el capítulo 11 en ese documento. La hibridación en solución también se puede usar con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

También se describe un polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia de polinucleótidos obtenida mediante selección de una genoteca apropiada que contiene el gen completo de una secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 1 en condiciones restrictivas de hibridación con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia de polinucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 1 o un fragmento de la misma; y aislamiento de dicha secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener tal polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores totalmente descritas en su totalidad en otra parte de la presente memoria descriptiva.

Como se describe en otra parte de la presente memoria descriptiva con relación a los ensayos de polinucleótidos, por ejemplo, los polinucleótidos descritos, se pueden usar como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar los ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB 129 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen una identidad alta, particularmente una alta identidad de secuencia, al gen BASB 129. Tales sondas generalmente comprenderán al menos 15 residuos de nucleótidos o pares de bases. Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 residuos de nucleótidos o pares de bases y tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases.

Una región codificadora de un gen de BASB 129 se puede aislar mediante selección usando una secuencia de ADN proporcionada en la SEC ID Nº para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención se usa después para seleccionar una genoteca de ADNc, ADN o ARNm genómico con el fin de determinar qué miembros de la genoteca se hibridan a la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos por los expertos en la técnica para obtener los ADN de longitud completa, o los ADN de extensión corta, por ejemplo los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Recientes modificaciones de la técnica, ilustradas por ejemplo por la tecnología de Marathon ^{TM} (Clontech Laboratories Inc.), han simplificado significativamente la investigación de los ADN más largos. En la tecnología de Marathon ^{TM}, los ADN se han preparado a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia 'de adaptador' ligada a cada extremo. Después la amplificación de ácido nucleico (PCR) se lleva a cabo para amplificar el extremo 5' "ausente" del ADN usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos de genes y específicos de adaptadores. La reacción de PCR se repite después usando cebadores "encajados", es decir, cebadores diseñados para hibridarse dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico de adaptador que hibrida además el extremo 3' en la secuencia de adaptador y un cebador específico del gen que hibrida además el extremo 5' en al secuencia génica seleccionada). Después los productos de esta reacción se pueden analizar mediante secuenciación de ADN y un ADN de longitud completa construido o bien uniendo el producto directamente al ADN existente proporcionando una secuencia completa, o llevando a cabo una PCR separada de longitud completa usando la información de la secuencia nueva para el diseño del cebador en 5'.

Se pueden emplear los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, por ejemplo, como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos de y diagnosis para enfermedades, particularmente enfermedades humanas, como se describe posteriormente en la presente memoria descriptiva con relación a ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de la SEC ID Nº 1 se pueden usar en los procedimientos de la presente memoria descriptiva como se ha descrito, pero preferiblemente para PCR, con el fin de determinar si o no los polinucleótidos identificados en esta memoria descriptiva en conjunto o en parte se transcriben en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que tales secuencias también tendrán utilidad en diagnosis de la fase de infección y tipo de infección que ha alcanzado el patógeno.

También se describen polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales amino o carboxilo terminal, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (por ejemplo, cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica). Tales secuencias pueden desempeñar una función en el procesamiento de una proteína del precursor a una forma madura, puede permitir transporte de proteínas, puede alargar o acortar la semivida de las proteínas o puede facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in vivo, los aminoácidos adicionales se pueden procesar a partir de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para cada y todo polinucleótido descrito en la presente invención existe un polinucleótido complementario a él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido con los que son complementarios.

Una proteína precursora que tiene una forma madura del polipéptido condensado a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando las prosecuencias se retiran tales precursores inactivos generalmente se activan. Algunas o todas las prosecuencias se pueden retirar antes de la activación. En general, tales precursores se llaman proproteínas.

Además de las representaciones A, G, C, T/U convencionales para nucleótidos, el término "N" también se puede usar para describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en tal posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótidos adyacentes, cuando se lee en la fase correcta de lectura, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematura en tal fase de lectura.

En resumen, un polinucleótido descrito en la presente invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia guía (que se puede denominar una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que son las secuencias guía de una preproteína, o una proteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia guía y una o más prosecuencias, que generalmente se retiran durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

Se describe el uso del polinucleótido descrito para propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso del polinucleótido descrito en inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento de distribución adecuado tal como inyección directa de ADN de plásmido en músculos (Wolff y col., Hum. Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), distribución de ADN complejado con vehículos proteicos específicos (Wu y col., J. Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenistry y Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col, PNAS USA, (1984) 81: 5489).

Vectores, células hospedadoras, sistemas de expresión

También se describen vectores que comprenden el polinucleótido o los polinucleótidos descritos, células hospedadoras que están modificadas por ingeniería genética con estos vectores y la producción de polipéptidos descritos mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de traducción libres de células también se pueden emplear para producir tales proteínas usando ARN derivado de construcciones de ADN descritas.

Los polipéptidos recombinantes descritos en la presente memoria descriptiva se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. También se describen sistemas de expresión que comprenden el polinucleótido o los polinucleótidos descritos, células hospedadoras que están modificadas por ingeniería genética con tales sistemas de expresión, y la producción de los polipéptidos descritos mediante técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos descritos, las células hospedadoras se pueden modificar por ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o los polinucleótidos descritos. La introducción de un polinucleótido en la célula hospedadora se puede efectuar mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis, y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), tal como, transfección por fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por legrado, introducción balística e infección.

Ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como células de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus;células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células de plantas, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Se puede usar una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos descritos. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosomas, epitomas y de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmicos y fagémidos. Las construcciones de sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como generan expresión. Por lo general, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un hospedador se puede usar para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (anteriormente).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, se pueden incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos descritos se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación por sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónica o catiónica, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatita y cromatografía sobre lecitina. Más preferiblemente, la cromatografía de afinidad por iones metálicos (IMAC) se emplea para purificación. Las técnicas bien conocidas para replegar proteínas se pueden emplear para regenerar conformación activa cuando se desnaturaliza el polipéptido durante la síntesis intracelular, aislamiento y o purificación.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación e infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo del antígeno e inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usados para este propósito son por ejemplo; poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar, viruela de canarios), alfavirus (virus Sindbis, virus del bosque Semiliki, virus de encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus asociado a adeno, picornavirus (virus de la polio, rinovirus), herpesvirus (virus zoster de varicela, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Esos virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuados de diversas maneras con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, pronóstico, serotipo y mutación

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB 129 para uso como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB 129 en un eucariota, particularmente un mamífero, y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico para diagnosis de enfermedad, determinación de la fase de enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente seres humanos, particularmente los infectados o sospechosos de estar infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB 129, se pueden detectar en el nivel de ácidos nucleicos o aminoácidos mediante una diversidad de técnicas bien conocidas así como los procedimientos proporcionados en la presente memoria descriptiva.

Los polipéptidos y polinucleótidos para prognosis, diagnosis u otro análisis se pueden obtener a partir de materiales corporales de individuos supuestamente infectados y/o infectados. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, se pueden usar directamente para detección o se puede amplificar enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes de análisis. El ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico también se puede usar de las mismas maneras. Usando amplificación, caracterización de la especie y cepa de organismo infeccioso o residente presente en un individuo, se puede preparar mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las supresiones e inserciones se pueden detectar mediante un cambio en tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada entre un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales se pueden identificar mediante hidridación de ADN amplificado a secuencias de polinucleótidos BASB 129 marcados. Secuencias coincidentes perfecta o significativamente se pueden distinguir de dúplex no coincidentes imperfecta o más significativamente mediante digestión con ADNasa o ARNasa, para ADN o ARN respectivamente, o mediante la detección de diferencias en temperaturas de fusión o cinética de renaturalización. Las diferencias de secuencias de polinucleótidos también se pueden detectar mediante alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótidos en geles comparados con una secuencia de referencia. Esto se puede llevar a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias de polinucleótidos también se pueden detectar mediante secuenciación de ADN o ARN directa. Véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230: 1242 (1985). Los cambios de secuencia en localizaciones específicas también se pueden revelar mediante ensayos de protección de nucleasa, tales como ARNasa, ensayo de protección de V1 y S1 o un procedimiento de escisión química. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985).

Una disposición de sondas de oligonucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos BASB 129 o fragmentos de la misma se pueden construir para llevar a cabo la selección eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de tecnología de disposición se conocen bien y tienen aplicabilidad general y se pueden usar para dirigir una diversidad de cuestiones en genética molecular incluyendo expresión génica, unión genética, y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science, 274: 610 (1996)).

Se describe un kit de diagnóstico que comprende:

(a): un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1, o un fragmento de la misma;

(b): una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c): un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la SEC ID Nº 2 o un fragmento del mismo; o

(d): un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, preferiblemente para el polipéptido de la SEC ID Nº 2.

Se apreciará que en cualquiera de dichos kits, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Tal kit se usará en diagnosis de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, entre otros.

Esta invención también se refiere al uso de los polinucleótidos descritos como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido descrito, preferiblemente, la SEC ID Nº 1, que está asociada a una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta de diagnóstico que se puede añadir a, o definir, una diagnosis de una enfermedad, una prognosis de un curso de enfermedad, una determinación de una fase de enfermedad, o una susceptibilidad a una enfermedad, que se produce por infraexpresión, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente organismos infecciosos, que llevan mutaciones en dicho polinucleótido se pueden detectar a nivel de polinucleótido mediante una diversidad de técnicas, tales como las descritas en otra parte de la presente memoria descriptiva.

Las células de un organismo que llevan mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido descrito en la presente invención también se pueden detectar a nivel del polinucleótido o polipéptido mediante una diversidad de técnicas, que permiten, por ejemplo, la formación de serotipos. Por ejemplo, RT-PCR se puede usar para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente usar RT-PCR junto con sistemas de detección automatizada, tales como, por ejemplo, GeneScan. También se pueden usar ARN, ADNc o ADN genómico para el mismo propósito, PCR. Como ejemplo, los cebadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB 129 se puede usar para identificar y analizar mutaciones.

También se describen cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos retirados del extremo 5' y/o el 3'. Estos cebadores se pueden usar para, entre otras cosas, amplificar ADN y/o ARN de BASA 129 aislados de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores se pueden usar para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, de manera que el polinucleótido se puede someter después a diversas técnicas para elucidación de la secuencia de polinucleótidos. De esta forma, las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos se pueden detectar y usar para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su fase o curso, o determinar serotipo y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención además proporciona un procedimiento para diagnosticar infecciones provocadas por Moraxella catarrhalis, que comprende la determinación de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un nivel aumentado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia de SEC ID Nº 1. La expresión aumentada o disminuida de un polinucleótido BASB 129 se puede medir usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, transferencia de Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, un ensayo diagnóstico para detectar la sobreexpresión del polipéptido BASB 129 comparado con muestras de tejidos de control normales se pueden usar, por ejemplo, para detectar la presencia de una infección. Las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar niveles de un polipéptido BASB 129, en una muestra derivada de un hospedador, tal como un material corporal, son bien conocidas para los expertos en la técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen, radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western, ensayos sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polipéptidos descritos se pueden usar como componentes de disposiciones de polinucleótidos, preferiblemente disposiciones o retículas de alta densidad. Estas disposiciones de alta densidad son particularmente útiles para propósitos de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, un conjunto de manchas cada una comprendiendo un gen diferente, y comprendiendo además un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, se puede usar para sondar, tal como el uso de hibridación o amplificación de ácidos nucleico, usando una sonda obtenida o derivada a partir de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia de polinucleótidos particular o secuencia relacionada en un individuo. Tal presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser útil en el diagnóstico y/o pronóstico de un curso de la enfermedad. Se prefiere una retícula que comprende un número de variantes de la secuencia de polinucleótidos de la SEC ID Nº 1. También se prefiere una que comprenda un número de variantes de una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de la SEC ID Nº 2.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos descritos o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos respectivamente. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen afinidad sustancialmente mayor para los polipéptidos de la invención que su afinidad para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra fragmentos de polipéptidos BASB 129.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos descritos se pueden obtener administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos, o fragmentos que llevan epítopes de cualquiera o ambos, análogos de cualquiera o ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal, preferiblemente uno no humano, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica conocida en la técnica que proporciona anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como las descritas en Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., pág. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla a polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. También, ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para los polipéptidos o polinucleótidos descritos.

Como alternativa, la tecnología de exposición de proteínas y péptidos en la cápsida de fagos se puede utilizar para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido descrito bien a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos seleccionados por poseer anti-BASB 129 o de genotecas inactivas (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos también se puede mejorar mediante, por ejemplo, arrastre de cadenas (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden emplear para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos descritos para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

De este modo, entre otros, los anticuerpos contra el polipéptido BASB 129 o polinucleótido BASB 129 se pueden emplear para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes de polipéptidos incluyen variantes, antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalentes.

Preferiblemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano el anticuerpo puede lo más preferiblemente estar "humanizado", donde la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma se ha transplantado en un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo como se describe en Jones y col., (1986), Nature 321, 522-525 ó Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Ensayos y moléculas de antagonistas y agonistas

Los polipéptidos y polinucleótidos descritos también se pueden usar para valorar la unión de sustratos de pequeñas moléculas y ligandos en, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, genotecas químicas, y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1 (2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que llevan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido mediante una marca directa o indirectamente asociada al compuesto candidato. Como alternativa, el procedimiento de selección puede implicar competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de activación se ensayan generalmente en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación mediante el agonista por la presencia del compuesto candidato. El péptido constitutivamente activo y/o polipéptidos y polinucleótidos constitutivamente expresados se pueden emplear en procedimientos de selección para agonistas o inhibidores inversos, en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezclado de un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido descrito, para formar una mezcla, midiendo la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB 129 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB 129 de la mezcla con un patrón. Las proteínas de fusión, tales como las realizadas a partir de la porción Fc y el polipéptido BASB 129, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria descriptiva, también se pueden usar para ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido descrito, así como de polipéptidos relacionados filogenética y/o funcionalmente relacionados (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8: 52-58 (1995); y K. Johanson y col., J Biol Chem, 270 (16): 9459-9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen y/o interactúan con un polipéptido descrito en la presente invención también se pueden usar para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, se puede construir un ensayo ELISA para medir los niveles secretados o asociados a células de polipéptido que usa anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Éste se puede usar para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente.

También se describe un procedimiento de selección de compuestos para identificar aquellos que potencian (agonista) o bloquean (antagonista) la acción de polipéptidos o polinucleótidos BASB 129, particularmente los compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción de síntesis, un compartimiento celular, tal como una membrana, envuelta celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de los mismos, que comprende el polipéptido BASB 129 y un sustrato o ligando marcado de tal polipéptido se incuba en ausencia o presencia de una molécula candidato que puede ser un agonista o antagonista de BASB 129. La capacidad de la molécula candidato de agonizar o antagonizar el polipéptido BASB 129 se refleja en una disminución de la unión del ligando marcado o disminución de la producción del producto de tal sustrato. Las moléculas que se unen de forma gratuita, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB 129 van a ser los más probablemente buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien, y como puede ser el caso, incrementan la velocidad de producción del producto a partir del sustrato, incrementan la transducción de la señal, o incrementan la actividad de los canales químicos, son agonistas. La detección de la velocidad o nivel de, como puede ser el caso, la producción del producto a partir del sustrato, transducción de señal, o actividad de los canales químicos se puede potenciar usando un sistema indicador. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen pero no se limitan a colorimétricos, sustrato marcado convertido en producto, un gen indicador que es responsable de cambios en la actividad de polinucleótido o polipéptido BASB 129, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas de BASB 129 en un ensayo competitivo que combina BASB 129 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB 129, moléculas de unión a BASB 129 recombinantes, sustratos o ligandos naturales, miméticos de sustratos o ligandos, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. BASB 129 se puede marcar, tal como mediante radiactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que el número de moléculas de BASB 129 unidas a una molécula de unión o convertidas en producto se puede determinar exactamente para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido descrito en la presente memoria descriptiva y por lo tanto inhiben o suprimen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo estrechamente relacionado que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB 129, evitando por lo tanto la acción o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB 129 excluyendo los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB 129 de la unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una pequeña molécula que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido evitando por lo tanto la unión a moléculas de unión celular, de manera que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de pequeñas moléculas incluyen pero no se limitan a pequeñas moléculas orgánicas, péptidos o moléculas de tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas de polaridad opuesta (véase Okano, J. Neurochem 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GEN EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB 129.

También se describen proteínas de fusión solubles modificadas por ingeniería genética que comprende un polipéptido descrito en la presente memoria descriptiva, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina se prefiere la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. La parte Fc se puede retirar simplemente mediante incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor de coagulación de la sangre Xa.

También se describen procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniaría genética, y al uso de los mismos para seleccionar fármacos, diagnosis y terapia. También se describen polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de tecnología de proteínas de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente internacional números WO 94/29458 y WO 94/22914.

Cada una de las secuencias de polinucleótidos descritas en la presente memoria descriptiva se pueden usar en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras expresión, se puede usar como una diana para la selección de fármacos antibacterianos. De manera adicional, las secuencias de polinucleótidos que codifican regiones aminoterminales de la proteína codificada o Shine-Delgarno u otra traducción que facilita las secuencias del ARNm respectivo se pueden usar para construir secuencias de polaridad opuesta para controlar la expresión de la secuencia codificadora de interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para intervenir en la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un hospedador eucariótico, preferiblemente mamífero, hospedador responsable de una secuela de infección. En particular, las moléculas de la invención se pueden usar: en la prevención de adhesión de bacterias, en particular bacterias Gram positivas y/o Gram negativas, a proteínas de matriz extracelular de eucarióticos, preferiblemente de mamíferos en dispositivos permanentes o a proteínas de matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de matriz extracelular de eucarióticos, preferiblemente de mamíferos y proteínas BASB 129 bacterianas que median el daño en tejido y/o; bloquear la progresión normal de patogénesis en infecciones iniciadas distintas de la implantación de dispositivos permanentes o mediante otras técnicas quirúrgicas.

Se describen agonistas y antagonistas de BASB 129, incluyendo agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas descritos se pueden emplear, por ejemplo, para evitar, inhibir y/o tratar enfermedades.

También se describen mimotopos del polipéptido descrito. Un mimotopo es una secuencia peptídica, suficientemente similar al péptido nativo (secuencialmente o estructuralmente), que es capaz de ser reconocida por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es capaz de originar anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se acopla a un vehículo adecuado.

Los mimotopos de péptidos se pueden diseñar para un propósito particular mediante la adición, supresión o sustitución de aminoácidos elegidos. De este modo, los péptidos se pueden modificar a efectos de fácil conjugación a un vehículo proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además puede ser deseable para los péptidos conjugados a un vehículo proteico incluir un terminal hidrófobo distal del terminal conjugado del péptido, de tal forma que el extremo no conjugado libre del péptido permanece asociado con la superficie de la proteína del vehículo. Por lo tanto presentando el péptido en una conformación que se parece lo más estrechamente posible a la del péptido como se encuentra en el contexto de la molécula entera nativa. Por ejemplo, los péptidos se pueden alterar para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-terminal. Como alternativa, la adición o sustitución de una forma de estereoisómero D de uno o más de los aminoácidos se puede realizar para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para potenciar la estabilidad del péptido.

Como alternativa los mimotopos de péptidos se pueden identificar usando anticuerpos que son capaces ellos mismos de unirse a los polipéptidos descritos usando técnicas tales como tecnología de exposición de proteínas y péptidos en la cápsida de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica, genera un gran número de secuencias peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces de unirse a anticuerpos peptídicos anti-nativos, pero pueden ellos mismos no compartir homología de secuencias significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres humanos, que comprende la inoculación del individuo con polinucleótidos y/o polipéptidos BASB 129, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir el anticuerpo y/o la respuesta inmune de células T para proteger dicho individuo de la infección, particularmente la infección bacteriana y lo más particularmente infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan procedimientos en los que tal respuesta inmunológica retrasa la replicación bacteriana. Incluso otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de inducción de una respuesta inmunológica en un individuo que comprende la distribución a tal individuo de un vector, secuencia o ribozima de ácido nucleico para dirigir la expresión del polinucleótido y/o polipéptido BASB 129, o un fragmento o una variante del mismo in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, de manera que produzca el anticuerpo y/o la respuesta inmune de células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de citocinas o células T citotóxicas, para proteger dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de una enfermedad, bien la enfermedad esté ya establecida dentro del individuo o no. Un ejemplo de administrar el gen es acelerándolo en las células deseadas como un revestimiento sobre partículas o de otra manera. Tal vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo ADN-proteína o un complejo ARN-proteína.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, capaz de haber inducido dentro de él una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en tal individuo a un polinucleótido y/o polipéptido BASB 129 codificado a partir de ellos, en la que la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB 129 recombinante codificado a partir de ellos y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido, polipéptido BASB 129 codificado a partir de ellos, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica se puede usar terapéuticamente o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad del anticuerpo y/o inmunidad celular, tal como la inmunidad celular que surge de células CTL o T CD4+.

Un polipéptido BASB 129 o un fragmento del mismo se puede condensar con una coproteína o resto químico que puede o no puede producir por él mismo anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína condensada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras. De este modo, la proteína recombinante condensada comprende preferiblemente una coproteína antigénica, tal como la lipoproteína D de Haemophilus influenzae, Glutation-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar en forma de un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La coproteína se puede unir a o bien el terminal amino o carboxi de la primera proteína.

En una composición de vacuna de acuerdo con la invención, un polipéptido y/o polinucleótido BASB 129, o un fragmento, o un mimotopo, o una variante del mismo puede estar presente en un vector, tal como los vectores recombinantes vivos descritos anteriormente, como por ejemplo, vectores bacterianos vivos.

También son adecuados los vectores no vivos para el polipéptido BASB 129, como por ejemplo vesículas o "ampollas" bacterianas de la membrana externa. Las ampollas de la membrana externa se derivan de la membrana externa de la membrana de dos fases de la bacteria Gram-negativa y se han documentado en muchas bacterias Gram-negativas (Zhou, L y col. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228) que incluyen C. trachomatis y C. psittaci. Una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos que producen ampollas también incluye: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Esherichia coli, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica.

Las ampollas tienen la ventaja de proporcionar proteínas de la membrana externa en su conformación nativa y de ese modo son particularmente útiles para las vacunas. Las ampollas también se pueden mejorar para el uso de vacunas modificando la bacteria por ingeniería genética, de tal forma que se modifica la expresión de una o más moléculas en la membrana externa. De ese modo, por ejemplo la expresión de una proteína inmunogénica deseada en la membrana externa, tal como el polipéptido BASB 129, se puede introducir o regular hacia arriba (por ejemplo por alteración del promotor). En su lugar o además, la expresión de moléculas de la membrana externa que no son relevantes (por ejemplo antígenos no protectores o proteínas inmunodominantes pero variables) ni perjudiciales (por ejemplo moléculas tóxicas tales como LPS o inductores potenciales de una respuesta autoinmune) se puede regular hacia abajo. Estos planteamientos se discuten a continuación en más detalle.

Las regiones flanqueadoras no codificadoras del gen BASB 129 contienen elementos reguladores importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel de la transcripción como de la traducción. La secuencia de estas regiones, tanto cadena arriba como cadena abajo de la fase abierta de lectura del gen, se puede obtener por secuenciación del ADN. Esta información de la secuencia permite la determinación de motivos reguladores potenciales, tales como los diferentes elementos promotores, secuencias terminadoras, elementos de secuencia inducibles, represores, elementos responsables de la variación de fase, secuencia de shine-dalgamo, regiones con estructura secundaria potencial implicada en la regulación, así como otros tipos de motivos reguladores o secuencias. Esta secuencia es otro aspecto de la invención.

Esta información de la secuencia permite la modulación de la expresión natural del gen BASB 129. La regulación hacia arriba de la expresión del gen se puede llevar a cabo alterando el promotor, la secuencia shine-dalgamo, los elementos represores u operadores potenciales, o cualquier otro elemento implicado. De igual modo, la regulación hacia debajo de la expresión se puede conseguir mediante tipos similares de modificación. De forma alternativa, cambiando las secuencias de variación de fase, la expresión del gen se puede poner bajo control de variación de fase, o se puede desacoplar de esta regulación. En otro planteamiento, la expresión del gen se puede poner bajo el control de uno o más elementos inducibles que permiten la expresión regulada. Ejemplos de tal regulación incluyen, pero no se limitan a, la inducción por cambio de temperatura, adición de sustratos inductores como hidratos de carbono seleccionados o sus derivados, oligoelementos, vitaminas, co-factores, iones metálicos, etc.

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Tales modificaciones, como se describen anteriormente, se pueden introducir mediante varios medios diferentes. La modificación de las secuencias implicadas en la expresión del gen se puede llevar a cabo in vivo por mutagénesis aleatoria seguida de la selección del fenotipo deseado. Otro planteamiento consiste en aislar la región de interés y modificarla por mutagénesis aleatoria, o sustitución dirigida al sitio, mutagénesis de inserción o supresión. La región modificada se puede volver a introducir en el genoma bacteriano por recombinación homóloga, y se puede evaluar el efecto sobre la expresión génica. En otro planteamiento, el conocimiento de la secuencia de la región de interés se puede usar para sustituir o suprimir todas o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora fijada como diana se aísla y se modifica de tal forma que contenga los elementos reguladores de otro gen, una combinación de elementos reguladores de genes diferentes, una región reguladora sintética, o cualquier otra región reguladora, o suprimir partes seleccionadas de las secuencias reguladoras de tipo salvaje. Estas secuencias modificadas se pueden volver a introducir después en la bacteria a través de la recombinación homóloga en el genoma. Una lista no exhaustiva de los promotores preferidos que se podrían usar para la regulación hacia arriba de la expresión génica incluye los promotores porA, porB, 1bpB, tbpB, p110, Ist, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae; ompCD, copB, IbpB, ompE, UspA1; UspA2; TbpB de M Catarrhalis; p1, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 de H. influenzae.

En un ejemplo, la expresión del gen se puede modular intercambiando su promotor con un promotor más fuerte (a través del aislamiento de la secuencia cadena arriba del gen, modificación in vitro de esta secuencia y reintroducción en el genoma por recombinación homóloga). La expresión regulada hacia arriba se puede obtener tanto en la bacteria como en las vesículas de la membrana externa cubierta (o hecha) de la bacteria.

En otros ejemplos, los planteamientos descritos se pueden usar para generar cepas bacterianas recombinantes con características mejoradas para aplicaciones de vacunas. Estas pueden ser, pero no se limitan a, cepas atenuadas, cepas con expresión aumentada de antígenos seleccionados, cepas con inactivaciones (o expresión disminuida) de genes que interfieren con la respuesta inmune, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con cobertura modulada de vesículas de la membrana externa.

Así pues, la invención también proporciona una región cadena arriba modificada del gen BASB 129, cuya región cadena arriba modificada contiene un elemento regulador heterólogo que altera el nivel de expresión de la proteína BASB 129 situada en la membrana externa. La región cadena arriba de acuerdo con este aspecto de la invención incluye la secuencia cadena arriba del gen BASB 129. La región cadena arriba comienza inmediatamente cadena arriba del gen BASB 129 y normalmente continúa hasta una posición no más de aproximadamente 1.000 bp cadena arriba del gen del codón de partida ATG. En el caso de un gen situado en una secuencia policistrónica (operón) la región cadena arriba puede comenzar inmediatamente antes del gen de interés, o antes del primer gen en el operón. Preferiblemente, una región cadena arriba modificada de acuerdo con este aspecto de la invención contiene un promotor heterólogo en una posición entre 500 y 700 bp cadena arriba del ATG.

Así pues, la invención proporciona un polipéptido BASB 129, en una ampolla bacteriana modificada. Además, la invención proporciona células hospedadoras modificadas capaces de producir los vectores no vivos de la ampolla basados en la membrana externa. La invención además proporciona vectores de ácido nucleico que comprenden el gen BASB 129 que tiene una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

Además, la invención proporciona los procedimientos para preparar las células hospedadoras y ampollas bacterianas de acuerdo con la invención.

Esta invención también proporciona composiciones, particularmente composiciones de vacuna, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como las descritas en Sato, Y. y col., Science 273: 352 (1996).

También, esta invención proporciona procedimientos que usan el polinucleótido o fragmentos particulares de los mismos, que se ha mostrado que codifican regiones no variables de las proteínas de la superficie celular bacteriana, en construcciones de polinucleótidos usados en tales experimentos de inmunización genética en modelos animales de infección con Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopos de proteínas capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que este planteamiento permitirá la preparación posterior de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivado del órgano requerido del animal que resiste con éxito o eliminan la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección por Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención también incluye una formulación de vacunas que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico descrito junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como los polipéptidos y polinucleótidos se pueden descomponer en el estómago, cada uno se administra preferiblemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, la administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyecciones estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosificación unitaria o de dosificación múltiple, por ejemplo, ampollas y viales sellados y se pueden almacenar en una condición de secado por congelación que requiere solamente la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de uso.

La formulación de vacuna de la invención también puede incluir sistemas de adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema de adyuvante origina preferiblemente una respuesta de tipo TH1 inmune.

Una respuesta inmune se puede distinguir ampliamente en dos categorías extremas, siendo una humoral o respuestas mediadas por células (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos efectores de anticuerpos y celulares de protección respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células), y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes extremas de tipo TH1 se pueden caracterizar por la generación de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno, restringido de haplotipo, y respuestas de células asesinas naturales. En ratones las respuestas de tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en el ser humano éstos corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de un amplio intervalo de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en IgG1, IgA e IgM de ratones.

Se puede considerar que la fuerza de conducción detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son citocinas. Altos niveles de citocinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células para el antígeno dado, mientras que altos niveles de citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales para el antígeno.

La distinción de respuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune que se describe por ser predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de la descrita en clones de células T CD4 +ve de tipo murino por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: diffrent patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 están asociadas a la producción de las citocinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas asociadas a menudo directamente a la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no están producidas por células T, tales como IL-12. Por el contrario, las respuestas de tipo TH2 están asociadas a la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citocinas o bien de TH1 o TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluye la medición directa de la producción de citocinas TH1 ó TH2 mediante linfocitos T in vitro después de la reestimulación con antígeno, y/o la medición de la relación IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpo específica de antígeno.

De este modo, un adyuvante de tipo TH1 es uno que preferentemente estimula poblaciones de células T aisladas para producir altos niveles de citocinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo de tanto linfocitos T citotóxicos CD8+ como respuestas de inmunoglobulina específica de antígeno asociadas al isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de estimulación preferencial de la respuesta celular TH1 se describen en la solicitud de patente internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209.

El monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL) es uno de tales adyuvantes. Éste se conoce a partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y está fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado se describe en la patente europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para que se filtren de manera estéril a través de una membrana de 0,22 micrones (patente europea número 0 689 454). 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug-100 \mug preferiblemente 25-50 \mug por dosis en el que el antígeno estará típicamente presente en un intervalo 2-50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente éste se puede mezclar con monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.057.540.

Las formulaciones de adyuvantes no reactogénicos que contienen QS21 se han descrito previamente (documento WO 96/33739). Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol se ha mostrado que son adyuvantes estimulantes de TH1 exitosos cuando se formulan junto con un antígeno.

Adyuvantes adicionales que son estimuladores preferenciales de respuesta de células TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se describe en el documento WO 96/02555.

Las combinaciones de diferentes adyuvantes estimuladores de TH1, tales como las mencionadas anteriormente en la presente memoria descriptiva, también se contemplan por proporcionar un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta de células TH1. Por ejemplo, QS21 se puede formular junto con 3D-MPL. La relación de QS21 : 3D-MPL típicamente será del orden de 1 : 10 a 10 : 1; preferiblemente 1 : 5 a 5 : 1 y a menudo sustancialmente 1 : 1. El intervalo preferido para sinergia óptima es 2,5 : 1 a 1 : 1 de 3D-MPL : QS21.

Preferiblemente un vehículo también está presente en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El vehículo puede ser una emulsión aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, tocoferol alfa y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos en la composición de vacuna de acuerdo con la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en tal emulsión. Adicionalmente la emulsión aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente para la administración a seres humanos QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el intervalo 1 \mug-200 \mug, tal como 10-100 \mug, preferiblemente 10 \mug-50 \mug por dosis. Típicamente la emulsión aceite en agua comprenderá entre el 2% y el 10% de escualeno, entre el 2% y el 10% de tocoferol alfa y entre el 0,3% y el 3% de Tween 80. Preferiblemente la relación de escualeno : tocoferol alfa es igual o menor que 1 ya que esto proporciona una emulsión más estable. Span 85 también puede estar presente a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizador.

Las emulsiones aceite en agua no tóxicas preferiblemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo, escualano o escualeno, un emulgente, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La presente invención también proporciona una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y afecciones relacionadas. Tal composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante que induce TH-1 como se ha descrito anteriormente en la presente memoria descriptiva.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB 129, se ha de entender que ésta cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos de origen natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, supresiones o sustituciones que no afectan sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido BASB 129 y/o un polipéptido BASB 129 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido descrito en la presente memoria descriptiva o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden emplear en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para usar con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo del medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. La formulación debería satisfacer el modo de administración. La invención además se refiere a envases y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones anteriormente mencionadas de la invención.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos descritos se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera eficaz, conveniente incluyendo, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo en forma de una composición inyectable, por ejemplo en forma de una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido descrito en la presente memoria descriptiva, péptido agonista o antagonista o un compuesto de moléculas pequeñas, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. También se describen envases y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones anteriormente mencionadas de la invención. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo mediante una vía sistémica o una oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente mediante inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías de de inyección, tales como subcutánea, intramuscular, o intraperitoneal. Medios alternativos para la administración sistémica incluyen la administración transmucosal o transdérmica que usa penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención se pueden formular en una formulación entérica o una encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en forma de ungüentos, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del agente activo esté entre 0,01 mg/kg y 10 mg/kg, típicamente aproximadamente 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la dosificación real que será la más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso medio. Pueden, por supuesto, ser casos individuales en los que son necesarios intervalos de dosificación más altos o más bajos y tales están dentro del alcance de esta invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la condición del sujeto, y el juicio del facultativo asistente. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en una forma inyectable. Se pueden emplear adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmune. Una dosis unitaria adecuada para vacunación es 0,5-5 microgramos/kg de antígeno, y tal dosis se administra preferiblemente 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observará ningún efecto toxicológico indicado con los compuestos de la invención que impediría su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, se esperaran variaciones amplias en la dosificación necesaria, en vista de la diversidad de compuestos disponibles y las eficacias diferentes de diversas vías de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral requiera dosificaciones más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas habituales para optimización, como se entiende bien en la técnica.

Bases de datos de las secuencias, secuencias en un medio tangible, y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos forman una fuente de información valiosa con la que determinar sus estructuras en 2 y 3 dimensiones así como para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estos planteamientos se facilitan más fácilmente mediante almacenamiento de la secuencia en un medio legible de ordenador y después usando los datos almacenados en un programa de estructura molecular conocido o buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tal como el paquete de programas GCG.

La invención también proporciona procedimientos para el análisis de secuencias de caracteres o cadenas, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen , por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencias, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de estructura de ADN, ARN y proteínas, ensamblaje de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de la fase abierta de lectura, llamada de bases de ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, recortes de bases de ácidos nucleicos, y análisis de picos de cromatogramas de secuenciación.

Se proporciona un procedimiento basado en ordenador para realizar la identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible de ordenador; y comparando dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar la homología.

También se proporciona un procedimiento basado en ordenador para realizar la identificación de homología, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de proporcionar una primera secuencia de polipéptidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible de ordenador; y comparando dicha primera secuencia de polipéptidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar la homología.

Todas las publicaciones y referencias, que incluyen pero no se limitan a las patentes y a las solicitudes de patente, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad como si cada publicación individual o referencia estuviera indicada específica e individualmente para incorporarse por referencia en el presente documento como si se expusiera completamente. Cualquier solicitud de patente para la que esta solicitud reivindica prioridad también se incorpora por referencia en esta memoria descriptiva en su totalidad de la manera descrita anteriormente para las publicaciones y referencias.

Definiciones

"Identidad" como se sabe en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, como puede ser el caso, como se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también se refiere al grado de relación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, como puede ser el caso, como se determina mediante la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos, que incluyen pero sin limitación, los descritos en (Computacional Molecular Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of SECuence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; SECuence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y SECuence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carrillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988). Se diseñan procedimientos para determinar la identidad para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad se codifican en programas de ordenador disponibles públicamente. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP BLASTN (Altschul, S. F. y col., J Molec. BIol. 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 2444-2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. y col., NCBI NLM Bethesda. MD 20894: Altschul, S., y col., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El algoritmo bien conocido de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.

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Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970).

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992)

Penalización de huecos: 8

Penalización de longitud de huecos: 2

Un programa útil con estos parámetros está públicamente disponible como el programa de "huecos" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto con no penalización para los huecos extremos).

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Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970).

Matriz de comparación: coincidencias = + 10, no coincidencia = 0 Penalización de huecos: 50

Penalización de longitud de huecos: 3

Disponible como: El programa de "huecos" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para las comparaciones de los ácidos nucleicos.

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Un significado preferido de "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se proporcionan en (1) y (2) más adelante.

(1) Las realizaciones de polinucleótidos además incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ó 100% de identidad con la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID. Nº: 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de nucleótidos, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, ó

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifican el polipéptido de la SEC ID. Nº: 2 puede crear mutaciones sin sentido, sentido erróneo, o de desplazamiento de fase en esta secuencia codificadora y por lo tanto alterar el polipéptido codificado por los polinucleótidos después de tales alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 1, es decir puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es menor del 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de ácidos nucleicos que incluye transición, transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1, o

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID. Nº: 1, y es, por ejemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptidos además incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ó 100% de identidad a la secuencia de polipéptidos de referencia de la SEC ID. Nº: 2, en la que dicha secuencia de polipéptidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por la menos una supresión, sustitución de aminoácidos, incluyendo sustitución, conservadora y no conservadora, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones amino- o carboxi terminales de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº 2, ó

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y).

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 2, es decir puede ser el 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia de tal forma que el porcentaje de identidad es inferior al 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de aminoácidos que incluye sustitución conservadora y no conservadora, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones amino- o carboxi- terminales de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2, o

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2, y es, por ejemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85 etc., y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

"Individuo(s)" cuando se usa en la presente memoria descriptiva con referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitación a metazoano, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente natural, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en la presente memoria descriptiva. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante la transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante se "aísla" incluso si todavía está presente en dicho organismo, dicho organismo puede ser vivo o no vivo.

"Polinucleótido(s)" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado incluyendo regiones de una sola o doble hebra.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que se diferencia de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante puede o no puede alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se describe más adelante. Una variante típica de un polipéptido se diferencia en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de tal forma que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean estrechamente similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y el polipéptido de referencia se puede diferenciar en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácidos sustituido o insertado puede o no puede estar codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que sea de origen natural. Las variantes de origen no natural de polinucleótidos y polipéptidos se pueden preparar mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad (es)" se refiere a cualquier enfermedad producida por o relacionada con la infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de fluido en el oído medio, daño en el nervio auditivo, retraso en el aprendizaje del habla, infección del tracto respiratorio superior e infección del oído medio.

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Ejemplos

Los ejemplos de abajo se llevan a cabo usando técnicas convencionales, que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la técnica, excepto donde se describe de otra manera en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

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Ejemplo 1 Secuenciación de ADN del gen BASB 129 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis

El gen BASB 129 de la SEC ID Nº: 1 es de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis. La traducción de la secuencia de polinucleótidos BASB 129 se muestra en la SEC ID Nº: 2.

Ejemplo 2 Construcción de plásmido para expresar BASB 129 recombinante A: Clonación de BASB 129

Los sitios de restricción EcoRI y SalI modificados por ingeniería genética en los cebadores de amplificación inversos permiten la clonación direccional de un producto de PCR en el plásmido pTLZ2 de expresión de E. coli de tal forma que una proteína BASB 129 madura se puede expresar como una proteína de fusión que contiene una marca de cromatografía por afinidad (His)6 en el extremo C-terminal. El producto de PCR de BASB 129 se purifica a partir de la reacción de amplificación usando columnas giratorias basadas en gel de sílice (QiaGen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Para producir los extremos EcoRI y SalI requeridos necesarios para la clonación, el producto de PCR purificado se digiere secuencialmente hasta finalización con enzimas de restricción EcoRI y SalI como se recomienda por el fabricante (Life Technologies). Después de la primera digestión de restricción, el producto de PCR se purifica mediante una columna giratoria como se ha indicado anteriormente para retirar las sales y se eluye en agua estéril antes de la segunda digestión por enzimas. El fragmento de ADN digerido se purifica de nuevo usando columnas giratorias basadas en gel de sílice antes de la ligadura con el plásmido pTLZ2.

B. Producción de vector de expresión

Para preparar el plásmido pTLZ2 de expresión, se digiere de manera similar hasta finalización con tanto EcoRI como SalI y después se trata con fosfatasa de intestino de ternera (CIP, aproximadamente 0,02 unidades/pmol del extremo 5', Life Technologies) siguiendo las indicaciones del fabricante para evitar la auto ligadura. Se usa un exceso aproximadamente 5 veces molar del fragmento digerido para el vector preparado con el fin de programar la reacción de ligadura. Se realiza un patrón de aproximadamente 20 \mul de reacción de ligadura (aproximadamente 16ºC, aproximadamente 16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica usando la T4 ADN ligasa (aproximadamente 2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Una alícuota de la ligadura (aproximadamente 5 \mul) se usa para transformar células JM109 electrocompetentes de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Después de un período de crecimiento de aproximadamente 2-3 horas a 37ºC en aproximadamente 1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se siembran en placas de agar LB que contienen ampicilina (100 pg/ml). En la selección se incluye antibiótico. Las placas se incuban durante toda una noche a 37ºC durante aproximadamente 16 horas. Se recogen colonias individuales de ApR con mondadientes estériles y se usan para inocular "parches" de placas de ApR en LB reciente así como aproximadamente 1,0 ml de un caldo de cultivo LB de ApR. Tanto las placas de parche como el cultivo en caldo de incuban durante toda una noche a 37ºC en o bien un incubador habitual (placas) o baño de agua con agitación. Se emplea un análisis de PCR basado en células enteras para verificar que los transformantes contienen la inserción de ADN de BASB 129. Aquí, el caldo de cultivo en LB de Ap de aproximadamente 1,0 ml durante toda una noche se transfiere a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y las células se recogen mediante centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (aproximadamente 3 minutos, temperatura ambiente, aproximadamente 12.000 x g). El sedimento celular se suspende en aproximadamente 200 \mul de agua estéril y se usa una alícuota de aproximadamente 10 \mul para programar una reacción de PCR de aproximadamente 50 \mul de volumen final que contiene cebadores de amplificación tanto directos como inversos de BASB 129. Las concentraciones finales de los componentes de reacción de PCR son esencialmente las mismas que las especificadas en el ejemplo 2 excepto que se usan aproximadamente 5,0 unidades de Taq polimerasa. La etapa de inicial de desnaturalización a 95ºC se incrementa hasta 3 minutos para asegurar el rompimiento térmico de las células bacterianas y la liberación del ADN del plásmido. Un ciclador térmico modelo 9700 de ABI y un perfil de amplificación térmica de tres etapas y 32 ciclos, es decir 95ºC, 45 segundos; 55ºC-58ºC, 45 segundos, 72ºC 1 minuto, se usan para amplificar el fragmento de BASB 129 a partir de las muestras transformantes lisadas. Después de la amplificación térmica, una alícuota de aproximadamente 20 \mul de la reacción se analiza mediante electroforesis sobre gel de agarosa (agarosa al 0,8% en un tampón Tris-acetato-EDTA (TAE)). Los fragmentos de ADN se visualizan mediante iluminación con UV después de la electroforesis sobre gel y tinción con bromuro de etidio. Un patrón de tamaño molecular de ADN (escala de 1 Kb, Life Technologies) se somete a electroforesis en paralelo con las muestras de ensayo y se usa para estimar el tamaño de los productos de PCR. Los transformantes que producían el producto de PCR del tamaño esperado se identifican como cepas que contienen una construcción de expresión de BASB 129. Las cepas que contienen el plásmido de expresión se analizan después para la expresión inducible de BASB 129 recombinante.

C. Análisis de expresión de transformantes PCR-positivos

Para cada transformante PCR-positivo identificado anteriormente, se inoculan aproximadamente 5,0 ml de caldo LB que contiene ampicilina (100 \mug/ml) con células de la placa de parches y se cultivan durante toda una noche a 37ºC con agitación (aproximadamente 250 rpm). Una alícuota del cultivo de siembra durante toda una noche (aproximadamente 1,0 ml) se inocula en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contiene aproximadamente 25 de caldo LB de Ap y se cultiva a 37ºC con agitación (aproximadamente 250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanza una D. O. a 600 de aproximadamente 0,5, es decir, fase semilogarítmica (usualmente aproximadamente 1,5-2,0 horas). En este momento aproximadamente la mitad del cultivo (aproximadamente 12,5 ml) se transfiere a un segundo matraz de 125 ml y la expresión de la proteína BASB 129 recombinante se induce mediante la adición de IPTG (solución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. La incubación de los cultivos tanto inducidos por IPTG como no inducidos continúa durante aproximadamente 4 horas adicionales a 37ºC con agitación. Las muestras (aproximadamente 1,0 ml) de cultivos tanto inducidos como no inducidos se retiran después del período de inducción y las células se recogen mediante centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 minutos. Los sedimentos celulares individuales se suspenden en aproximadamente 50 \mul de agua estéril, después se mezclan con un volumen igual de 2 x de tampón de muestra SDS-PAGE de Laemelli que contiene 2-mercaptoetanol, y se colocan en un baño de agua en ebullición durante aproximadamente 3 minutos para desnaturalizar la proteína. Se cargan volúmenes iguales (aproximadamente 15 ml) de los lisados celulares brutos tanto inducidos por IPTG como no inducidos en gel de poliacrilamida Tris al 12%/glicina por duplicado (minigeles de 1 mm de espesor, Novex). Las muestras de lisados inducidos y no inducidos se someten a electroforesis junto con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de desarrollo SDS/Tris/glicina (Bio Rad) convencional. Después de electroforesis, se tiñe un gel con azul brillante commassie R250 (BioRad) y después se destiñe para visualizar la(s) proteína(s) BASB 129 inducible(s) por IPTG nueva(s). El segundo gel se somete a electrotransferencia sobre una membrana PVDF (tamaño de poro 0,45 micrones, Novex) durante aproximadamente 2 horas a 4ºC usando un aparato de transferencia Mini-Protean II de BioRad y tampón de transferencia de metanol (20%) de Towbin. El bloqueo de las incubaciones de membrana y de anticuerpos se realiza de acuerdo con los procedimientos bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo anti-RGS (His)3 monoclonal, seguido de un segundo anticuerpo anti-ratón de conejo conjugado a HPR (QiaGen), se usa para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante BASB 129. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His se logra usando o bien un sustrato insoluble en ABT o usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

Ejemplo 3 Producción de BASB 129 recombinante Cepa bacteriana

Una cepa de expresión recombinante de E. coli JM 109 que contiene un plásmido (pTLZ2) que codifica BASB 129 de M. catarrhalis, se usa para producir masa celular para la purificación de la proteína recombinante. La cepa de expresión se cultiva sobre placas de agar LB que contienen 100 \mug/ml de ampicilina ("Ap") para asegurar que el pTLZ2 se mantenía. Para la crioconservación a -80ºC, la cepa se propaga en caldo LB que contiene la misma concentración de antibióticos, después se mezcla con un volumen igual de caldo LB que contiene glicerol al 30% (p/v).

Medios

El medio de fermentación usado para la producción de la proteína recombinante está constituido por 2X de caldo YT (Difco) que contiene 100 \mug/ml de Ap. Se añade antiespumante al medio del fermentador a 0,25 ml/l (antiespumante 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante BASB 129, se añade IPTG (Isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido) al fermentador (final, 1 mM).

Fermentación

Un matraz de siembra erlenmeyer de 500 ml, que contiene 50 ml de volumen de trabajo, se inocula con 0,3 ml de cultivo congelado descongelado rápidamente, o varias colonias de un cultivo en placa de agar selectivo, y se incuba durante aproximadamente 12 horas a 37ºC \pm 1ºC en una plataforma oscilante a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Este cultivo de siembra se usó después para inocular un fermentador de volumen de trabajo de 5 l que contiene 2 X de caldo YT y los antibióticos Ap. Se hace funcionar el fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) a 37ºC \pm 1ºC, 0,2-0,4 de aspersión de aire VVM, 250 rpm en impulsores Rushton. El pH no se controla ni en el cultivo de siembra del matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH varía entre 6,5 y 7,3 en el fermentador. Se añade IPTG (solución madre 1,0 M, preparada en agua estéril) al fermentador cuando el cultivó alcanza el crecimiento semilogarítmico (aproximadamente 0,7 unidades a 600 de D. O.). Las células se inducen durante 2-4 horas después se recogen mediante centrifugación usando o bien un Heraeus 28RS (Sepatech) o centrífuga de supervelocidad RC5C (Sorvall Instruments). La pasta celular se almacena a -20ºC hasta su procesamiento.

Ejemplo 4 Purificación de BASB 129 recombinante a partir de Extracción-Purificación de E. coli

La pasta celular del cultivo inducido por IPTG se vuelve a suspender en 60 ml de tampón fosfato, pH 7,5, que contiene AEBSF 1 mM y Aprotinina 1 mM como inhibidores de proteasa. Las células se desintegran en un disgregador celular, se centrifugan, se lavan y se vuelven a centrifugar. El sedimento se suspende en NaH2PO4 100 mM, tampón Tris-HCl 10 mM pH 8 que contiene cloruro de guanidina (tampón A) y se deja durante una hora a temperatura ambiente. El extracto total se centrifuga a 27.000g durante 20 minutos. El sobrenadante se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con resina Ni-NTA Superflow equilibrada en el tampón A. La resina se lava dos veces con NaH2PO4 100 mM, tampón Tris-HCl 10 mM pH 6,3, que contiene Urea 8M (tampón B). La elución se realiza sucesivamente con el tampón B ajustado a pH 5,9, después pH 4,5. Las fracciones que contienen el antígeno BASB 121 se neutralizan con el 25% de volumen de tampón fosfato 0,2 M, pH 7,5. Las fracciones reservadas se dializan sucesivamente contra NaH2PO4 100 mM que contiene Urea 8 M, después Urea 4 M, después Urea 2 M y finalmente contra PBS pH 7,4 que contiene Triton X-100 al 0,1%.

El antígeno BASB 129 purificado se cuantifica usando el reactivo de ensayo Micro BCA.

Ejemplo 5 Producción de antisuero para BASB 129 recombinante

Se genera antisuero polivalente dirigido contra la proteína BASB 129 vacunando conejos con la proteína BASB 129 recombinante purificada. Se extrajo sangre de los animales antes de la primera inmunización ("presangrado") y después de la última inmunización.

Los títulos de la proteína anti-BASB 129 se miden mediante un ELISA usando la proteína BASB 129 recombinante purificada. El título se define como las titulaciones medias calculadas mediante el modelo logístico de 4 parámetros usando el software XL Fit.

Los antisueros también se usan como el primer anticuerpo para identificar la proteína en una transferencia de Western como se describe en el ejemplo 7 más abajo. La transferencia de Western se usa para mostrar la presencia del anticuerpo anti-BASB 129 en el suero de animales inmunizados.

Ejemplo 6 Caracterización inmunológica: Exposición a la superficie de BASB 129

Los títulos de la proteína anti-BASB 129 se determinan mediante un ELISA usando células enteras asesinadas con formalina de Moraxella catarrhalis. El título se define como las titulaciones medias calculadas mediante el modelo logístico de 4 parámetros usando el software XL Fit.

El título observado con el suero inmune de conejo o ratón demuestra que la proteína BASB 129 está presente en la superficie de las células de M. catarrhalis.

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Ejemplo 7 Caracterización inmunológica: Análisis de transferencia de Western

Se cultivaron varias cepas de M. catarrhalis incluyendo ATCC 43617, así como aislamientos clínicos de diversas regiones geográficas, en placas de agar Muller Hinton durante 24 horas a 36ºC. Se usaron varias colonias para inocular el caldo. Los cultivos se cultivan hasta que A620 es aproximadamente 0,6 y las células se recogen mediante centrifugación. Las células se concentran y se solubilizan después en tampón de muestra PAGE. Después, las células solubilizadas se resuelven en geles de poliacrilamida al 4%-20% y las proteínas separadas se transfieren electroforéticamente a membranas PVDF. Las membranas de PVDF se pretratan después con tampón de saturación. Todas las incubaciones posteriores se llevan a cabo usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas PVDF se incuban con suero preinmune o suero inmune de conejo o ratón. Después, las membranas PVDF se lavan.

Las membranas PVDF se incuban con Ig anti-conejo o ratón de oveja marcada con biotina. Después, las membranas PVDF se lavan 3 veces con tampón de lavado, y se incuban con estreptavidina-peroxidasa. Después, las membranas PVDF se lavan 3 veces con tampón de lavado y se desarrollan con 4-cloro-1-naftol.

La detección de un proteína que corresponde al peso molecular esperado de BASB 129 que es reactiva con el antisuero se usa para demostrar que esta proteína se produce por y se conserva en todas las cepas de Moraxella analizadas.

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Ejemplo 8 Caracterización inmunológica: Actividad bactericida

Se examina la actividad citotóxica mediada por complemento de los anticuerpos anti-BASB 129 para determinar el potencial de la vacuna del antisuero de la proteína BASB 129 que se prepara como se indica anteriormente. Se examinan las actividades del suero preinmune y el antisuero anti-BASB 129 en la medicación del complemento asesino de M. catarrhalis. Las cepas de M. catarrhalis se cultivan en placas. Varias colonias se añaden al medio líquido. Los cultivos se cultivan y se recogen hasta que A620 es aproximadamente 0,4. Después de una etapa de lavado, el sedimento se suspende y se diluye.

El suero preinmune y el suero anti-BASB 129 se deposita en el primer pocillo de una placa de 96 pocillos y las diluciones en serie se depositan en los otros pocillos del mismo carril. Posteriormente se añade la M. catarrhalis viva diluida y se incuba la mezcla. Se añade el complemento en cada pocillo a una dilución de trabajo definida de antemano en un ensayo de toxicidad.

Cada análisis incluye un control del complemento (pocillos sin suero que contiene la fuente del complemento activo o inactivado), un control positivo (pocillos que contienen suero con un título conocido de anticuerpos bactericidas), un control de cultivo (pocillos sin suero ni complemento) y un control de suero (pocillos si complemento).

Se mide la actividad bactericida del antisuero de conejo o de ratón (50% asesino de la cepa homóloga).

Ejemplo 9 Presencia de anticuerpo a BASB 129 en suero convaleciente humano

El análisis de transferencia de Western de BASB 129 purificado recombinante se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 7 anterior, salvo que se usa un acúmulo de suero humano de niños infectados por M. catarrhalis como la primera preparación de anticuerpos. Esto se usa para mostrar que el antisuero de individuos infectados de forma natural reaccionan a la proteína purificada recombinante.

Ejemplo 10 Eficacia de vacuna de BASB 129: potenciación de eliminación del pulmón de M. catarrhalis en ratones

Este modelo de ratón se basa en el análisis de la invasión de pulmón por M. catarrhalis siguiendo una exposición intranasal convencional para ratones vacunados.

Se inmunizan grupos de ratones con la vacuna de BASB 129. Después del refuerzo, los ratones se vuelven a exponer mediante instilación de suspensión bacteriana en el orificio nasal bajo anestesia.

Los ratones se sacrifican entre 30 minutos y 24 horas después de la exposición y se retiran los pulmones asépticamente y se homogeneizan individualmente. El log10 del número medio ponderado de UFC/pulmón se determina contando las colonias cultivadas en placas de agar después de sembrar diluciones del homogeneneizado. Se calculan la media aritmética del log10 del número medio ponderado de UFC/pulmón y las desviaciones estándar para cada grupo.

Los resultados se analizan estadísticamente.

En este experimento se inmunizan grupos de ratones o bien con BASB 129 o con una preparación de células completas matadas (kwc) de M. catarrhalis o inmunizados en falso.

Esto se usa para mostrar que la preparación kwc y la vacuna de BASB 129 inducen la eliminación significativa del pulmón en comparación con el grupo de control.

Ejemplo 11 Inhibición de la adhesión de M. catarrhalis en células por antisuero anti-BASB 129

Este ensayo mide la capacidad del suero anti BASB 129 para inhibir la adhesión de la bacteria Moraxella a las células epiteliales. Esta actividad podría evitar la colonización de la nasofaringe por Moraxella.

Un volumen de la bacteria se incuba en hielo con un volumen de dilución de suero preinmune o anti-BASB 129 inmune. Posteriormente esta mezcla se añade en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contiene un cultivo de células confluentes que se lava una vez con el medio de cultivo para retirar los restos de antibiótico. La placa se centrifuga y se incuba.

Después cada pocillo se lava con delicadeza. Después del último lavado, se añade glicocolato de sodio a los pocillos. Después de la incubación, la fase celular se desprende y se homogeniza. Las diluciones del homogenato se siembran en placas de agar y se incuban. Se cuenta el número de colonias en cada placa y se calcula el número de bacterias presentes en cada pocillo.

Esto se usa para mostrar que las bacterias incubadas con antisuero anti-BASB 129 se inhiben en su capacidad de adherencia a las células Hep-2.

Materiales depositados

Un depósito que contiene una cepa Catlin de Moraxella catarrhalis se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (en la presente memoria descriptiva "ATCC") el 21 de junio de 1997 y número de depósito asignado 43617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una genoteca insertada de 1,5-2,9 kb liofilizada, construida a partir del aislamiento de M. catarrhalis obtenido a partir de un aspirado transtraqueal de un minero de carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506-508 (1982).

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El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se denomina en la presente memoria descriptiva como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen BASB 129 de longitud completa.

Un depósito del vector pMC-D15 constituido por ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y número de depósito asignado 207105.

La secuencia de polinucleótidos contenida en la cepa/clon depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado en ellos, se controla en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de las secuencias en la presente memoria descriptiva.

El depósito de las cepas depositadas se ha hecho bajo los términos del Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patente. Las cepas depositadas se liberarán irrevocablemente y sin restricción o condición al público tras la expedición de una patente. Las cepas depositadas se proporcionan meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no son una admisión que requiere un depósito para habilitación, tal como la requerida bajo 35 U. S. C. \NAK 112.

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Información de secuencias

Secuencias de polinucleótidos y polipéptidos BASB 129, BASB 130 y BASB 131

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SEC ID Nº: 1

Secuencia de polinucleótidos BASB 129 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

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1

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SEC ID Nº: 2

Secuencia de polipéptidos BASB 129 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de la SEC ID Nº: 1

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2

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SEC ID Nº: 3

Secuencia de polinucleótidos BASB 130 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

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3

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4

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SEC ID Nº: 4

Secuencia de polipéptidos BASB 130 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de la SEC ID Nº: 3

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5

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SEC ID Nº: 5

Secuencia de polinucleótidos BASB 131 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

6

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SEC ID Nº: 6

Secuencia de polipéptidos BASB 131 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de la SEC ID Nº: 5

7

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<110> SmithKline Beecham Biologicals S. A.

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<120> Compuestos novedosos

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<130> BM45414

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<160> 6

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<170> FastSEC para la versión 3,0 de Windows

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<210> 1

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<211> 1035

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 1

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8

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<210> 2

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<211> 344

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 2

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9

10

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<210> 3

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<211> 2037

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 3

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11

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<210> 4

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<211> 678

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

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<400> 4

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12

13

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<210> 5

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<211> 1410

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 5

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14

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<210> 6

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<211> 469

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 6

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15

16

Claims

1. Un fragmento inmunogénico de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en la longitud completa de la SEC ID Nº 2, en la que el fragmento inmunogénico comprende más de 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y que es capaz de producir una respuesta inmune en caso necesario, cuando se acopla a un vehículo que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2, y en la que el fragmento inmunogénico no es la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

2. El fragmento inmunogénico como se reivindica en la reivindicación 1 en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, en la longitud completa de la SEC ID Nº 2.

3. El fragmento inmunogénico como se reivindica en la reivindicación 1, en el que polipéptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

4. El fragmento inmunogénico como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el polipéptido aislado estáconstituido por la secuencia de SEC ID Nº 2.

5. Un fragmento inmunogénico como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polipéptido es parte de una proteína de fusión mayor.

6. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Un microorganismo recombinante vivo que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7.

9. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7.

10. Una fracción subcelular aislada o una membrana aislada de la célula hospedadora de la reivindicación 9.

11. Una membrana de un microorganismo recombinante que tiene expresión regulada por incremento de un polipéptido asilado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en la longitud entera de la SEC ID Nº 2, o el fragmento inmunogénico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12. Un procedimiento para producir el fragmento inmunogénico de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 9 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

13. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de la reivindicación 6 que comprende transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

14. Una vesícula bacteriana de la membrana externa obtenida a partir de una célula hospedadora que comprende un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de la SEC ID Nº 2; una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de SEC ID Nº 2 sobre la región codificadora entera; una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con la de la SEC ID Nº 1 sobre la longitud total de la SEC ID Nº o un polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 6, que tiene una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

15. Una composición de vacunas que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de la SEC ID Nº 2; o el fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Una composición de vacunas que comprende una cantidad eficaz de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de la SEC ID Nº 2 ó una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado; un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº 2 sobre la región codificadora entera o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado; un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con la de la SEC ID Nº 1 sobre la longitud total de la SEC ID Nº 1 ó una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado; o un polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Una composición de vacunas que comprende una cantidad eficaz de una vesícula bacteriana de la membrana externa de la reivindicación 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. La composición de vacunas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

19. Un anticuerpo generado contra el fragmento inmunológico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

20. Un procedimiento de diagnosis de una infección por Moraxella catarrhalis, que comprende la identificación de un fragmento inmunogénico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 19, presente dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener tal infección.

21. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de la SEC ID Nº 2, o un fragmento inmunogénico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en la preparación de un medicamento para uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

22. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 sobre la longitud total de la SEC ID Nº 2 ó una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado; un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº 2 sobre la región codificadora entera o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado; un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con la de la SEC ID Nº 1 sobre la longitud total de la SEC ID Nº 1 ó una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado; o un polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 6 en la preparación de un medicamento para uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

23. Una composición terapéutica útil en el tratamiento de seres humanos con enfermedad de Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19 y un vehículo farmacéutico adecuado.