ES2240136T3 - Antigeno basb120 de moraxella catarrhalis. - Google Patents
Antigeno basb120 de moraxella catarrhalis.Info
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Abstract
Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo
Description
Antígeno BASB120 de Moraxella
catarrhalis.
La invención se refiere a polinucleótidos
(referidos aquí como "polinucleótido(s) BASB120"),
polipéptidos codificados por ellos (referidos en el presente
documento como "BASB120" o "polipéptidos BASB120",
materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En
otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar
tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra
infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se
refiere a ensayos de diagnóstico para detectar infección de ciertos
patógenos.
Moraxella catarrhalis (también llamada
Branhamella catarrhalis) es una bacteria
gram-negativa aislada frecuentemente del tracto
respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías,
las principales son otitis media en infantes y niños, y neumonía en
mayores. También es responsable de sinusitis, infecciones
nosocomiales y, menos frecuentemente, de enfermedades invasivas.
La otitis media es una importante enfermedad
infantil tanto por el número de casos como por sus secuelas
potenciales. Más de 3,5 millones de casos se registran cada año en
los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han
experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la
edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis. 19:823).
Dejada sin tratar, o llegando a ser crónica, esta enfermedad puede
conducir a pérdidas de oído que pueden ser temporales (en el caso de
acumulación de fluido en el oído medio) o permanentes (si el nervio
auditivo se daña). En infantes, tales pérdidas de oído pueden ser
responsables de un retraso en el aprendizaje del habla.
Tres especies bacterianas se aíslan primariamente
del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae no identificada (NTHi)
y M. catarrhalis. Están presentes en el
60-90% de los casos. Una revisión de estudios
recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan ambos
aproximadamente 30% y M. catarrhalis aproximadamente 15% de
los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev.
60: 267). Se pueden aislar otras bacterias del oído medio (H.
influenzae de tipo B, S. pyogenes, etc.) pero a mucha menor
frecuencia (2% de los casos o menos).
Los datos epidemiológicos indican que, para los
patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto
respiratorio superior es un prerrequisito absoluto para el
desarrollo de una otitis; sin embargo se requieren otros también
para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col. (1988) J.
Infect. Dis. 158: 205, Faden, HL y col. (1991) Ann.
Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Éstos son importantes para
activar la migración de las bacterias dentro del oído medio por
medio de las trompas de Eustaquio, seguidas por la iniciación de un
procedimiento inflamatorio. Estos factores son desconocidos hasta la
fecha. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema
inmune seguida de una infección viral, por ejemplo, pudo causar una
incapacidad para controlar la colonización del tracto respiratorio
(Faden, HL, y col. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Una
explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales
permite una colonización muy importante de algunos niños, quienes
llegan a ser subsiguientemente susceptibles del desarrollo de otitis
media debido a la presencia sostenida de patógenos del oído medio
(Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267).
La respuesta inmune a M. catarrhalis está
pobremente caracterizada. El análisis continuado de cadenas aisladas
secuencialmente de la nasofaringe de bebés de 0 a 2 años de edad,
indica que consiguen y eliminan frecuentemente nuevas cepas. Esto
indica que una se monta respuesta inmune eficaz contra estas
bacterias por los niños colonizados (Faden, HL y col. (1994) J.
Infect. Dis. 169: 1312).
En la mayoría de los adultos probados, se han
identificado los anticuerpos bactericidas (Chapman AJ y col. (1985)
J. Infect. Dis. 151: 878). Las cepas de M. catarrhalis
presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad
bactericida del suero: en general, los aislados de individuos
enfermos son más resistentes que aquellos de quienes están
simplemente colonizados (Hol, C y col. (1993) Lancet 341: 1281, KL y
col. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A): 28S). La resistencia
al suero se puede considerar por lo tanto como un factor de
virulencia de las bacterias. Se ha observado una actividad de
opsonización en los sueros de niños que se recuperan de otitis
media.
Los antígenos marcados mediante estas respuestas
inmunes diferentes en humanos no se han identificado, con la
excepción de OMP B1, una proteína 84 kDa cuya expresión se regula
por hierro, y que se reconoce mediante los sueros de los pacientes
con neumonía (SEIT, S, y col. (1995) Infect. Immun. 63:
1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col. (1999), Infect. Immun.
67: 1310).
Unas pocas proteínas de membrana diferentes
presentes en la superficie de M. catarrhalis se han
caracterizado usando procedimiento bioquímico, o durante su
implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora
(para revisar, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). En
un modelo de neumonía en ratón, la presencia de anticuerpos
dirigidos contra algunos de ellos (UspA, CopB) favorece una
eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido
(OMP CD) se conserva altamente entre las cepas de M.
catarrhalis, y presenta homologías con una porina de
Pseudomonas aeruginosa, la cual se ha demostrado eficaz
contra esta bacteria en modelos animales. El documento WO97/32980
describe proteínas del receptor de transferina de
Moraxella.
La frecuencia de las infecciones por Moraxella
catarrhalis se han elevado dramáticamente en las últimas décadas
pasadas. Esto se ha atribuido a la aparición de cepas resistentes a
múltiples antibióticos y una población creciente de gente con
sistemas inmunes debilitados. Ya no es poco común aislar cepas de
Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o todos
los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad y
demanda médica de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas,
procedimientos de rastreo de fármacos, y pruebas de diagnóstico para
este organismo.
La presente invención se refiere a BASB120, en
particular a polipéptidos BASB120 y polinucleótidos BASB120,
materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En
otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar
tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y
tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En un aspecto
adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para
detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y
afecciones asociadas con tales infecciones, tales como ensayos para
detectar expresión o actividad de polinucleótidos BASB120 o
polipéptidos.
Diversos cambios y modificaciones dentro del
espíritu y el alcance de la invención discutida llegarán a ser
patentes para los expertos en la técnica a partir de la lectura de
las siguientes descripciones y de la lectura de las otras partes de
la presente discusión.
La invención se refiere a polipéptidos y
polinucleótidos BASB120 según se describen en detalle más abajo. En
particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos
de BASB120 de Moraxella catarrhalis, los cuales no están
relacionados por homología de secuencia de aminoácidos con ninguna
de las proteínas conocidas. Se predice que es una lipoproteína por
que tiene una secuencia señal característica de lipoproteínas. La
invención se refiere especialmente a BASB120 que tiene el nucleótido
y las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID Nº.:1 y SEQ ID
Nº.:2 respectivamente. Se entiende que las secuencias expuestas en
detalle en el listado de secuencias más adelante como "DNA"
representan una ejemplificación de una realización de la invención,
dado que aquellos de habilidad ordinaria reconocerán que tales
secuencias se pueden usar útilmente en polinucleótidos en general,
incluyendo polirribonucleótidos.
En un aspecto de la invención hay polipéptidos
proporcionados de Moraxella catarrhalis referidas en el
presente documento como "BASB120" y "polipéptidos
BASB120", así como variantes de los mismos útiles biológicamente,
diagnósticamente, profilácticamente, clínicamente o
terapéuticamente, y composiciones que comprenden los mismos.
La presente invención proporciona
adicionalmente:
a) un polipéptido aislado el cual comprende una
secuencia de aminoácidos el cual tiene al menos una identidad del
85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más
preferiblemente al menos una identidad del 95%, lo más preferible
una identidad del 97-99% o identidad exacta, a aquel
de la SEQ ID Nº.: 2.
b) un polipéptido codificado por un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica
la cual tiene al menos una identidad del 85%, preferiblemente al
menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una
identidad del 95%, incluso más preferiblemente una identidad del
97-99% o identidad exacta, a aquel de la SEQ ID Nº.:
1; o
c) un polipéptido codificado por un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica
que codifica un polipéptido el cual tiene al menos una identidad del
85%, preferiblemente al menos una identidad del 90%, más
preferiblemente al menos una identidad del 95%, incluso más
preferiblemente una identidad del 97-99% o identidad
exacta, a aquel de la SEQ ID Nº.: 2.
El polipéptido de BASB120 proporcionado en SEQ ID
Nº.:2 es el polipéptido BASB120 de la cepa Moraxella catarrhalis
MC2931 (ATCC 43617).
La invención proporciona también un fragmento
inmunogénico de un polipéptido BASB120, es decir, una porción
contigua del polipéptido BASB120 la cual tiene la misma o
sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.:2; es decir,
el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un transportador)
es capaz de estimular una respuesta inmune la cual reconoce el
polipéptido BASB120. Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por
ejemplo, el polipéptido BASB120 careciendo de una secuencia líder
N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un
dominio ancla C-terminal. En un aspecto preferido el
fragmento inmunogénico de BASB120 de acuerdo con la invención
comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un
polipéptido con al menos una identidad del 85%, preferiblemente al
menos una identidad del 90%, más preferiblemente al menos una
identidad del 97-99%, a aquel de SEQ ID Nº.:2 a lo
largo de la longitud entera de la SEQ ID Nº.:2.
Un fragmento es un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos que es enteramente la misma que parte, pero
no que toda, de cualquier secuencia de cualquier polipéptido de la
invención. Como con los polipéptidos BASB120, los fragmentos pueden
ser "de permanencia libre", o comprendidos con un polipéptido
mayor del cual forman una parte o región, más preferiblemente como
una región continua individual en un polipéptido individual
mayor.
Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo,
polipéptidos truncados que tienen una función de una secuencia de
aminoácidos de SEQ ID Nº.:2 o de una variante de la misma, tal como
una serie continua de residuos que incluye una secuencia de
aminoácidos aminoterminal y/o carboxiterminal. Se prefieren también
las formas de degradación de los polipéptidos de la invención
producidos por o en una célula hospedadora. Se prefieren
adicionalmente fragmentos caracterizados por atributos estructurales
o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones de
hélice alfa y regiones formadoras de hélice alfa, regiones de lámina
beta y regiones formadoras de lámina beta, giros y regiones
formadoras de giros, bucles y regiones formadoras de regiones
formadoras de bucles, regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas,
regiones alfa antipáticas, región de unión a sustrato, y regiones de
alto índice antigénico.
Fragmentos adicionalmente preferidos incluyen un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la
secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100
aminoácidos contiguos truncados o eliminados de la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID Nº.:2.
Los fragmentos de los polipéptidos de la
invención se pueden emplear para producir el polipéptido en su
entera longitud mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, estos
fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los
polipéptidos en su entera longitud de la invención.
Particularmente preferidas son las variantes en
las cuales varias, 5-10, 1-5,
1-3, 1-2 ó 1 aminoácidos se
sustituyen, eliminan, o añaden en cualquier combinación.
Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de
la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura" o
ser una parte de una proteína mayor tal como un precursor o una
proteína de fusión. Es a menudo ventajoso incluir una secuencia de
aminoácidos adicional la cuan contiene secuencias de secreción o
secuencias líder, pro-secuencias, secuencias las
cuales ayudan a la purificación tales como múltiples residuos de
histidina, o una secuencia adicional para estabilidad durante la
producción recombinante. Además, también se considera la adición de
polipéptido exógeno o cola de lípidos o secuencias de
polinucleótidos para incrementar el potencial inmunogénico de la
molécula final.
En un aspecto, la invención se refiere a
proteínas de fusión solubles modificadas mediante ingeniería
genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o
un fragmento de la misma, y diversas partes de las regiones
constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de
varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Preferida como una
inmunoglobulina es la parte constante de la cadena pesada de la IgG
humana, particularmente la IgG1, donde la fusión tiene lugar en la
región de articulación. En una realización particular, la parte Fc
se puede eliminar simplemente mediante incorporación de una
secuencia de escisión la cual se puede escindir con el factor de
coagulación de la sangre Xa.
Además, esta invención se refiere a
procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión
mediante ingeniería genética, y para el uso de la misma para el
rastreo de fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la
invención se refiere también a polinucleótidos que codifican tales
proteínas de fusión. Ejemplos tecnología de proteínas de fusión se
pueden encontrar en las solicitudes internacionales de patentes
Nº^{s}. WO94/29458 y WO94/22914.
Las proteínas se pueden conjugar químicamente, o
expresar como proteínas de fusión recombinante permitiendo que se
produzcan niveles incrementados en un sistema de expresión comparado
con la proteína no fusionada. El compañero de fusión puede ayudar en
proporcionar epítopos T-ayudantes (compañeros de
fusión inmunológica), preferiblemente epítopos T ayudantes
reconocidos por humanos o ayudar en expresar la proteína
(potenciador de expresión) a producciones más elevadas que la
proteína recombinante nativa. Preferiblemente el compañero de fusión
será tanto un compañero de fusión inmunológico y un compañero
potenciador de expresión.
Los socios de fusión incluyen proteína D de
Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus
de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Otro socio de fusión es la
proteína conocida como LytA. Se usa preferiblemente la parte
C-terminal de la molécula Lyta se deriva de
Steptococcus pneumoniae, el cual sintetiza una
N-acetil-L-alanina
amidasa LytA (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) página
265-272}) una autolisina que degrada específicamente
ciertos enlaces en el armazón del peptidoglicano. El dominio
C-terminal de la proteína Lyta es responsable de la
afinidad a la colina o a algunos análogos de colina tales como DEAE.
Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de los plásmidos
que expresan Lyta en E. coli útiles para la expresión de
proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas
híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su
extremo aminoterminal {Biotecnología: 10, (1992) página
795-798}. Es posible usar la parte repetida de la
molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal
que comienza en el residuo 178, por ejemplo residuos
188-305.
La presente invención también incluye variantes
de los polipéptidos mencionados, que son polipéptidos que varían a
partir de los referentes mediante sustituciones de aminoácidos
conservativos, como resultado de lo cual un residuo se sustituye por
otro con características similares. Tales sustituciones típicas
están entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr, entre los residuos
ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; entre Asn y Gln; y entre los
residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.
Los polipéptidos de la presente invención se
pueden preparar en cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos
incluyen polipéptidos que se dan en la naturaleza aislados,
polipéptidos que se producen recombinantemente, polipéptidos que se
producen sintéticamente, o polipéptidos que se producen mediante una
combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales
polipéptidos son bien comprendidos en la técnica.
Lo más preferido es que un polipéptido de la
invención se derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo, se
puede obtener preferiblemente a partir de otros organismos del mismo
género taxonómico. Un polipéptido de la invención se puede obtener,
por ejemplo, de organismos de la misma familia u orden
taxonómico.
Es un objeto de esta invención proporcionar
polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB120, particularmente
polinucleótidos que codifican el polipéptido designado en el
presente documento como BASB120.
En una realización particularmente preferida de
esta invención el polinucleótido comprende una región que codifica
polipéptidos BASB120 que comprenden una secuencia expuesta en SEQ ID
Nº.: 1 la cual incluye un gen en su entera longitud, o una variante
de la misma.
El polinucleótido BASB120 proporcionado en la SEQ
ID Nº.: 1 es el polinucleótido BASB120 de la cepa MC2931
Moraxella catarrhalis (ATCC 43617).
Como en un aspecto adicional de la invención se
han proporcionado moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican
y/o expresan polipéptidos BASB120 y polinucleótidos, que incluyen,
por ejemplo, RNA no procesados, RNA de ribozimas, mRNA, cDNA, DNA
genómicos, B-DNA y Z-DNA.
Realizaciones adicionales de la invención incluyen polinucleótidos y
polipéptidos útiles biológicamente, diagnósticamente,
profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente, y variantes de
los mismos, y composiciones que comprenden la misma.
Otro aspecto de la invención se refiere a
polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen en su entera
longitud, que codifica un polipéptido BASB120 que tiene una
secuencia de aminoácido reducida de SEQ ID Nº.:2 o una variante del
mismo.
En otra realización particularmente preferida de
la invención hay un polipéptido BASB120 de Moraxella
catarrhalis que comprende o consta de una secuencia de
aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 o una variante de los mismos.
Usando la información proporcionada en el
presente documento, tal como una secuencia de polinucleótidos
expuesta en SEQ ID Nº.: 1, un polinucleótido de la invención que
codifica polipéptido BASB120 se puede obtener usando clonación
estándar y procedimientos de rastreo, tales como para clonar y
secuenciar fragmentos de DNA cromosómico a partir de bacterias
usando células de Moraxella catarrhalis Catlin como material
de partida, seguidos por obtener un clon en su entera longitud. Por
ejemplo, para obtener una secuencia polinucleotídica de la
invención, tal como una secuencia polinucleotídica dada en SEQ ID
Nº. 1, típicamente una biblioteca de clones de DNA cromosómico de
Moraxella catarrhalis Catlin en E. coli o algún otro
hospedador adecuado se sondea mediante un oligonucleótido marcado
radiactivamente, preferiblemente uno de 17 mer o más largo, derivado
de una secuencia parcial. Los clones que llevan DNA idéntico a al de
la sonda se pueden distinguir usando condiciones astringentes de
hibridación. Secuenciando los clones individuales así identificados
mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñados de
polipéptido original en ambas direcciones es entonces posible
extender la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para
determinar una secuencia génica en su entera longitud.
Convenientemente, tal secuenciación se lleva a cabo, por ejemplo,
usando DNA desnaturalizado de doble cadena preparado a partir de un
clon plasmídico. Las técnicas adecuadas se describen en Maniatis T.,
Fritsch, E.F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY
MANUAL, 2º edición; Cloe Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, Nueva York (1989) (véase en particular Screening By
Hibridation 1.90 y Sequencing Denatured
Double-Stranade DNA Templates 13.70). La
secuenciación directa del DNA puede también llevarse a cabo para
obtener una secuencia génica en su entera longitud. Lo ilustrativo
de la invención, el polinucleótido expuesto en SEQ ID Nº.: 1 se
descubrió en una biblioteca de DNA derivada de Moraxella
catarrhalis.
Además, la secuencia de DNA expuesta en la SEQ ID
Nº.: 1 contiene una fase de lectura abierta que codifica una
proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de
aminoácido expuesto en SEQ ID Nº.: 2 con un peso molecular deducido
que se puede calcular usando residuo aminoácido de valores de peso
molecular bien conocidos para los expertos en la técnica.
El polinucleótido de SEQ ID Nº: 1, entre el codón
de iniciación y el nucleótido Nº. 1 y el codón de parada el cual
empieza en el número de nucleótidos 751 de SEC ID Nº:1, que codifica
el polipéptido de SEQ ID Nº.: 2.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que comprende o consta de:
a) una secuencia de polinucleótido la cual tiene
al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de
identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, incluso
más preferiblemente al menos 97-99% o exacta, a la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 a lo largo de la longitud
entera de SEQ ID Nº.: 1; o
b) una secuencia de polinucleótido la cual
codifica un polipéptido el cual tiene al menos un 85% de identidad,
preferiblemente al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al
menos un 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos
97-99% o exacta al 100%, a la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ
ID Nº.: 2.
Un polinucleótido que codifica un polipéptido de
la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies
distintas de Moraxella catarrhalis, se puede obtener mediante
un procedimiento que comprende las etapas de escanear una librería
apropiada bajo condiciones restrictivas de hibridación (por ejemplo,
usando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y
una concentración de SDS de 0,1-1%) con una sonda
marcada o detectable que consta de o comprende la secuencia de SEQ
ID Nº.: 1 o un fragmento de la misma, por sí misma igual que una
secuencia codificante para polipéptido maduro o un fragmento en fase
de lectura con otra región codificante, tal como una secuencia
codificante líder o secretora, una secuencia pre, o pro, o
prepro-proteína. El polinucleótido de la invención
puede contener al menos una secuencia no codificante, incluyendo por
ejemplo, pero no limitada a al menos una secuencia no codificante 5'
y 3', tal como las secuencias transcritas pero no traducidas,
señales de terminación (tales como señales de terminación
rho-dependientes y
rho-independientes), sitios de unión a ribosoma,
secuencias Kozak, secuencias que estabilizan el RNAm, intrones, y
señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos puede
comprender también una secuencia codificadora adicional que codifica
aminoácidos adicionales. Por ejemplo, se puede codificar una
secuencia marcadora que facilita purificación del polipéptido
fusionado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia
marcadora es un polipéptido hexa-histidina, como se
proporciona en el vector pQE (QiaGen, Inc.) como se describe en
Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:
821-824 (1989), o un péptido tag HA (Wilson, y
col., Cell 37: 767 (1984), ambos de los cuales pueden ser útiles en
purificar secuencia de polipéptidos fusionada a ellos. Los
polinucleótidos de la invención incluyen también, pero no se limitan
a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus
secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión
génica.
La secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido BASB120 de SEQ ID Nº.: 2 puede ser idéntica al
polipéptido que codifica la secuencia contenida en nucleótidos del 1
al 750 de SEQ ID Nº.: 1. Alternativamente puede ser una secuencia, a
cual como resultado de la redundancia (degeneración) del código
genético, también codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:2.
El término "polinucleótido que codifica un
polipéptido" como se usa en el presente documento abarca
polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un
polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido
bacteriano y más particularmente un polipéptido de la BASB120 de
Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos
presentada en SEQ ID Nº.: 2. El término comprende también
polinucleótidos que incluyen una región individual continua o
regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo,
polinucleótidos interrumpidos por fago integrado, una región de
inserción integrada, un vector de secuencia integrada, una secuencia
de trasposón integrada, o debido a la edición de RNA o
reorganización del DNA genómnico) conjuntamente con regiones
adicionales, que también pueden contener secuencias codificantes o
no codificantes.
La invención se refiere adicionalmente a
variaciones de los polinucleótidos descritos en el presente
documento que codifican variantes de un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID Nº:2.
Se pueden usar fragmentos de polinucleótidos de
la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de la
invención en su entera longitud.
Realizaciones adicionales particularmente
preferidas son polinucleótidos que codifican variantes de BASB120,
que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB120 de la
SEQID Nº.: 2 en la cual varios, unas pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2,
1, o ningún residuo aminoácido está sustituido, modificado,
eliminado y/o añadido, en cualquier combinación. Especialmente
preferidas entre estas son sustituciones, adiciones o deleciones
silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del
polipéptido BASB120.
Realizaciones adicionales particularmente
preferidas de la invención son polinucleótidos que son al menos
idénticos en un 85% a lo largo de toda su longitud a un
polinucleótido que codifica polipéptido BASB120 que tiene una
secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Nº:2, y polinucleótidos
que son complementarios a tales polinucleótidos. Alternativamente,
los más altamente preferidos son polinucleótidos que comprenden una
región que es al menos idéntica en un 90% a lo largo de toda su
longitud a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB120 y
polinucleótidos que son complementarios a los mismos. A este
respecto, los polinucleótidos al menos idénticos en un 95% a lo
largo de toda su longitud al mismo son particularmente preferidos.
Además, aquellos con al menos un 97% son altamente preferidos entre
aquellos con al menos un 95%, y entre ellos aquellos con al menos un
98% y al menos un 99% son particularmente altamente preferidos, con
al menos un 99% siendo los más preferidos.
Las realizaciones preferidas son polinucleótidos
que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma
función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado
mediante un DNA de SEQ ID Nº.:1.
De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas
de esta invención se proporcionan polinucleótidos que se hibridan,
particularmente bajo condiciones restrictivas, a las secuencias de
polinucleótidos BASB120, tales como los polinucleótidos en la SEQ ID
Nº.: 1.
La invención se refiere adicionalmente a
polinucleótidos los cuales se hibridan a las secuencias de
polinucleótidos proporcionadas en el presente documento. A este
respecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos
que se hibridan bajo condiciones restrictivas a los polinucleótidos
descritos en el presente documento. Como se usa en el presente
documento, los términos "condiciones restrictivas" y
"condiciones de hibridación restrictiva" significan que la
hibridación ocurre sólo si hay al menos un 95% y preferiblemente al
menos un 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo
específico de las condiciones de hibridación restrictiva es la
incubación durante toda la noche a 42ºC en una disolución que
comprende: 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico
15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), disolución de Denhardt 5x,
sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de DNA de esperma de
salmón troceado, seguida por lavar el soporte de de hibridación en
SCC 0,1x a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de hibridación y
lavado son bien conocidas y ejemplificadas en Sambrook, y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold
Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente el capítulo 11 en éste.
La disolución de hibridación se puede usar también con las
secuencias polinucleotídicas proporcionadas mediante la
invención.
La invención proporciona también un
polinucleótido que consta de una secuencia de polinucleótidos
obtenida rastreando una biblioteca apropiada que contiene el gen
completo para una secuencia de polinucleótidos expuesta en SEQ ID
Nº: 1 bajo condiciones de hibridación restrictiva con una sonda que
tiene la secuencia de dicha secuencia polinucleotídica expuesta en
la SEQ ID Nº: 1 o un fragmento de la misma; y aislar dicha secuencia
de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener un
polinucleótido tal incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores
descritos en el presente documento en otra parte.
Como se discute en el presente documento en otra
parte con respecto a los ensayos de polinucleótidos de esta
invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, se
pueden usar como una sonda de hibridación para RNA, cDNA y DNA
genómico para aislar cDNA en su entera longitud y clones genómicos
que codifican BASB120 y para aislar cDNA y clones genómicos de otros
genes que tienen una identidad elevada, particularmente alta
identidad de secuencia, al gen BASB120. Tales sondas generalmente
comprenderán al menos 15 residuos nucleotídicos de pares de bases.
Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 residuos de
nucleótidos de pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de
nucleótidos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas
tendrán al menos 20 residuos nucleotídicos o pares de bases y
tendrán menos de 30 residuos nucleotídicos o pares de bases.
Una región codificante de un gen BASB120 se puede
aislar mediante rastreo usando una secuencia de DNA proporcionada en
SEQ ID Nº 1 para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Un
oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a
aquella de un gen de la invención se usa después para rastrear una
librería de cDNA, DNA genómico o mRNA para determinar cuales
miembros de la biblioteca hibrida la sonda.
Hay varios procedimientos disponibles y bien
conocidos para los expertos en la técnica para obtener cDNA en su
entera longitud, o DNA cortos extendidos, por ejemplo aquellos
basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de
cDNA (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85:
8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de la
técnica, ejemplificadas mediante la tecnología de Marathon™
(Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado
significativamente la búsqueda de cDNA más largos. En la tecnología
de Marathon™, los cDNA se han preparado a partir de mRNA extraído a
partir de un tejido elegido y una secuencia "adaptador" ligada
sobre cada extremo. La amplificación de ácidos nucleicos (PCR) se
lleva a cabo después para amplificar el extremo 5' "perdido"
del DNA usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos
específicos de adaptadora y específicos de gen. La reacción de PCR
se repite después usando cebadores "anidados", es decir,
bebedores diseñados para fusionarse en el producto amplificado
(típicamente un cebador específico de adaptador que se fusiona más
hacia el extremo 3' en la secuencia adaptador y un cebador
específico de gen que se fusiona más hacia el extremo 5' en la
secuencia génica seleccionada). Los productos de la reacción se
pueden analizar después mediante secuenciación de DNA y un DNA en su
entera longitud construida construido tanto uniéndose al producto
directamente al DNA existente para dar una secuencia completa, o
llevando a cabo una PCR de toda la longitud usando la información de
la nueva secuencia para el diseño del cebador 5'.
Los polinucleótidos y polipéptidos de la
invención se pueden emplear, por ejemplo, como agentes de la
investigación y materiales para el descubrimiento de tratamientos de
y diagnósticos de enfermedades, particularmente enfermedades
humanas, como se discute adicionalmente en el presente documento en
relación a ensayos con polinucleótidos.
Los polinucleótidos de la invención que son
oligonucleótidos derivados de una secuencia de la SEQ ID Nº: 1 se
pueden usar en los procedimientos como se describen en el presente
documento, pero preferiblemente para PCR, para determinar si los
polinucleótidos identificados en el presente documento en todo o en
parte se transcriben o no en bacterias en tejidos infectados. Se
reconoce que tales secuencias también tendrán utilidad en la
diagnosis del estado de la infección o tipo de la infección que el
patógeno ha alcanzado.
La invención también proporciona polinucleótidos
que codifican un polipéptido que es la proteína madura más
aminoácidos adicionales aminoterminales o carboxiterminales, o
aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura
tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Tales
secuencias pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína
a partir de una forma precursora a una forma madura, pueden permitir
el transporte de proteína, pueden alargar o acortar la vida media de
una proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para
ensayo o producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso
in vivo, los aminoácidos adicionales se pueden procesar más a
partir de la proteína madura mediante enzimas celulares.
Para todos y cada uno de los polinucleótidos de
la invención se proporciona un polinucleótido complementario a
ellos. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean
totalmente complementarios a cada polinucleótido con el cual son
complementarios.
Una proteína precursora, que tiene un forma
madura del polipéptido fusionada a una o más prosecuencias puede ser
una forma inactiva del polipéptido. Cuando las prosecuencias se
eliminan tales precursores inactivos generalmente se activan.
Algunas o todas las prosecuencias se pueden eliminar antes de la
activación. Generalmente, tales precursores se llaman
proproteínas.
Además de las representaciones para nucleótidos
estándar A, G, C, T/U, el término "N" puede usarse también en
describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N"
significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de DNA o RNA
pueden aparecer en una posición tal designada en la secuencia de DNA
o RNA, excepto si se prefiere que N no sea un ácido nucleico que
cuando se toma en combinación con posiciones adyacentes de
polinucleótidos, cuando se lee en la fase de lectura correcta,
tendría el efecto de generar un codón de terminación prematuro en
tal fase de
lectura.
lectura.
En suma, un polinucleótido de la invención puede
codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia
líder (la cual puede referirse como una preproteína), o una
preproteína, la cual es un precursor para una proproteína, que tiene
una secuencia líder y una o más prosecuencias, las cuales
generalmente se eliminan durante las etapas de procesamiento que
producen formas activas y maduras del polipéptido.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se
proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para
propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización
genética.
El uso de un polinucleótido en la invención en
inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento
adecuado de administración tal como inyección directa de DNA
plasmídico en músculos (Wolf y col, Hum. Mol. Genet. (1992)
1: 363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419),
administración de DNA formando un complejo con proteínas
transportadoras específicas (Wu y col., J. Biol. Chem. (1989)
264: 16985), coprecipitación del DNA con fosfato de calcio
(Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551),
encapsulación de DNA en diversas formas de liposomas (Kaneda y col.,
Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y
col., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y col., DNA Cell
Biol. (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores
retrovirales clonados (Seeger y col., PNAS USA, (1984) 81:
5849).
La invención también se refiere a vectores que
comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, las
células hospedadoras que se modifican mediante ingeniería genética
con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la
invención mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de
traducción libres de células se pueden emplear también para producir
tales proteínas usando RNA derivados de las construcciones de la
invención.
Los polipéptidos recombinantes de la presente
invención se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos
por los expertos en la técnica a partir de células modificadas
mediante ingeniería genética con tales sistemas de expresión. De
acuerdo con ello, en un aspecto adicional, la presente invención se
refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o
polinucleótidos de la presente invención, para las células
hospedadoras las cuales están modificadas mediante ingeniería
genética con tales sistemas de expresión, y a la producción de
polipéptidos de la invención con técnicas recombinantes.
Para la producción recombinante de los
polipéptidos de la invención, las células hospedadoras se pueden
modificar mediante ingeniería genética para incorporar sistemas de
expresión o partes de los mismos o polinucleótidos de la invención.
La introducción de un polinucleótido dentro de la célula hospedadora
se puede llevar a cabo mediante procedimientos descritos en muchos
manuales estándar de laboratorio, tales como Davis y col., BASIC
METHODS IN MOLECUALR BIOLOGY, (1986) Y Sambrook y col.,
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª EDICIÓN, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989),
tales como, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada
por DEAE-dextrano, transvección, microinyección,
transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación,
transducción, carga mediante raspado, introducción balística e
infección.
Ejemplos representativos de hospedadores
apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de
streptococos, estafilicocos, enterococos, E. coli,
estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis,
Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis;
células fúngicas tales como células de una levadura, Kluveromyces,
Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y
Aspergillus; células de insecto tales como células de
Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células animales tales
como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK-293,
CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células
vegetales, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.
Una gran variedad de sistemas de expresión se
puede usar para producir los polipéptidos de la invención. Tales
vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosomas,
episomas y virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos
bacterianos, de bacteriófagos, de trasposones, de epitomas
bacterianos, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de
levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como
SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus
de la pseudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores
derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos
derivados de elementos genéticos plasmídicos y bacteriofágicos,
tales como cósmicos y fagémidos. Las construcciones del sistema de
expresión pueden contener regiones de control que se regulan igual
que la expresión originada. Generalmente, cualquier sistema o vector
adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para
expresar un polipéptido en una forma de huésped se usa para la
expresión a este respecto. La secuencia apropiada de DNA se puede
insertar dentro del sistema de expresión mediante cualquiera de una
diversidad de técnicas de rutina, tales como, por ejemplo, aquellas
expuestas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL (supra).
En sistemas de expresión recombinantes en
eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en el lúmen
del retículo endoplásmico, dentro del espacio periplásmico o dentro
del ambiente extracelular, se pueden incorporar señales de secreción
apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser
endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
Los polipéptidos de la presente invención se
pueden recuperar y purificar a partir de cultivos celulares mediante
procedimientos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato
de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio
aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía
de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía
de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Lo más preferible, la
cromatografía de afinidad de iones metálicos (IMAC) se emplea para
purificación. Las técnicas bien conocidas para replegar proteínas se
pueden emplear para regenerar conformación activa cuando el
polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis, aislamiento y
purificación intracelular.
El sistema de expresión puede ser también un
microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. El
gen de interés se puede insertar dentro del genoma de un virus o
bacteria vivo recombinante. La inoculación y la infección in
vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in
vivo del antígeno e inducción de respuestas inmunes. Los virus o
bacterias usados para este propósito son por ejemplo: poxvirus (por
ejemplo, vaccinia, virus de la viruela aviar, virus de la viruela
del canario), alfavirus (virus Sindbis, virus del bosque de Semliki,
virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus
adenoasociado, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus
(virus varicela-zóster), Listeria,
Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos
virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuados en diversas
formas con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas
también forman parte de la invención.
Esta invención se refiere también al uso de
polinucleótidos y polipéptidos BASB120 de la invención para usar
como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o
polipéptidos en un eucariota, particularmente un mamífero, y
especialmente un humano, proporcionará un procedimiento diagnóstico
para la diagnosis de enfermedad, permaneciendo en enfermedad o en
enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Los
eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente humanos,
particularmente aquellos infectados o sospechosos de estar
infectados con un organismos que comprende el gen o la proteína
BASB120, se puede detectar a nivel del ácido nucleico o nivel de
aminoácido mediante una variedad de técnicas bien conocidas igual
que mediante procedimientos proporcionados en el presente
documento.
Los polipéptidos y polinucleótidos para
pronóstico, diagnóstico u otro análisis se pueden obtener a partir
de unos materiales corporales de individuos teóricamente infectados
y/o infectados. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes,
particularmente DNA o RNA, se pueden usar directamente para
detección o se pueden amplificar enzimáticamente usando PCR o
cualquier otra técnica de amplificación previa al análisis. RNA, en
particular mRNA, cDNA y DNA genómico se pueden usar también de las
mismas formas. Usando amplificación, la caracterización de las
especies y las cepas de organismos infecciosos o residentes
presentes en un individuo, se pueden hacer mediante un análisis del
genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las
deleciones e inserciones se pueden detectar mediante un cambio en
tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de
una secuencia de referencia seleccionada a partir de un organismo
relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismos género
o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales
se pueden identificar hibridando DNA amplificado con secuencias de
polinucleótido BASB120 marcadas. Las secuencias que se aparean
perfectamente o significativamente se pueden distinguir de los
duplicados imperfectamente apareadas o más significativamente mal
apareadas mediante digestión con DNasa o RNasa, para DNA o RNA
respectivamente, o detectando diferencias en temperaturas de fusión
o cinéticas de renaturalización. Las diferencias de secuencia de
polinucleótido también se pueden detectar mediante alteraciones en
la movilidad electroforética de fragmentos polinucleotídicos en
geles según se comparan con una secuencia de referencia. Esto se
puede llevar a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las
diferencias de polinucleóticos se pueden detectar también mediante
secuenciación directa de DNA o RNA. Véase, por ejemplo, Myers y
col., Science, 230: 1242 (1985). Los cambios en secuencia en
localizaciones específicas también se pueden revelar mediante
ensayos de protección de nucleasas, tales como ensayo de protección
de RNasa, V1 y S1, o un ensayo de escisión química. Véase, por
ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:
4397-4401
(1985).
(1985).
En otra realización, una disposición de sondas de
oligonucleótidos que comprenden secuencia de nucleótidos BABS120 o
fragmentos de la misma se puede construir para dirigir
eficientemente el rastreo de, por ejemplo, mutaciones genéticas,
serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los
procedimientos de disposición de la tecnología se conocen bien y
tienen aplicabilidad general y se pueden usar para dirigir una
diversidad de cuestiones en genética molecular incluyendo expresión
génica, ligazón genética, y variabilidad genética (véase, por
ejemplo, Chee y col., Science, 274: 610 (1996).
Así, en otro aspecto, la presente invención se
refiere a un kit diagnóstico que comprende:
(a) un polinucleótido de la presente invención,
preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 1, o un
fragmento de la misma;
(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a
aquella de (a);
(c) un polipéptido de la presente invención,
preferiblemente el polipéptido de la SEQ ID Nº.: 2 o un fragmento
del mismo; o
(d) un anticuerpo contra un polipéptido de la
presente invención, preferiblemente al polipéptido de SEQ ID Nº:
2.
Se apreciará que en cualquier kit tal, (a), (b),
(c) o (d) pueden comprender un componente sustancial. Un kit tal
será de uso en diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad a una
enfermedad, entre otras cosas.
Esta invención también se refiere al uso de
polinucleótidos de la presente invención tales como reactivos
diagnósticos. La detección de una forma mutada de un polinucleótido
de la invención, preferible SEQ ID Nº.: 1, la cual está asociada con
una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta
diagnóstica que se puede añadir a, o definir, un diagnóstico de una
enfermedad, una prognosis de una fuente de enfermedad, una
determinación de un estado morboso, o una susceptibilidad a una
enfermedad, lo cual resulta de infraexpresión, sobreexpresión o
expresión alterada del polinucleótido. Los organismos,
particularmente los organismos infecciosos, llevando mutaciones en
tal polinucleótido se pueden detectar al nivel de polinucleótido o
polipéptido mediante una diversidad de técnicas, tales como aquellas
descritas en otro lugar en el presente documento.
Las células de un organismo que lleva mutaciones
o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o
polipéptido de la invención se pueden detectar también a nivel de
polinucleótido o polipéptido mediante una diversidad de técnicas,
para permitir el serotipado, por ejemplo. Por ejemplo,
RT-PCR se puede usar para detectar mutaciones en el
RNA. Se prefiere particularmente usar RT-PCR en
conjunción con sistemas de detección automática, tales como, por
ejemplo, GeneScan. RNA, cDNA, o DNA genómico se pueden usar también
para el mismo propósito, PCR. Como un ejemplo, los cebadores de PCR
complementarios a un polinucleótido que codifican polipéptido
BASB120 se pueden usar para identificar y analizar mutaciones.
La invención proporciona adicionalmente cebadores
con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o del 3'.
Estos cebadores se pueden usar para, entre otras cosas, amplificar
el DNA y/o RNA de BASB120 aislado de una muestra derivada de un
material individual, tal como un material corporal. Los cebadores se
pueden usar para amplificar un polinucleótido aislado de un
individuo infectado, tal que el polinucleótido puede estar sujeto
después a varias técnicas de elucidación de la secuencia de
polinucleótidos. De esta forma, las mutaciones en la secuencia del
polinucleótido se pueden detectar y usar para diagnosticar y/o
pronosticar la infección o su estado o curso, o para serotipar y/o
clasificar el agente infeccioso.
La invención proporciona adicionalmente un
procedimiento para diagnosticar enfermedad, preferiblemente
infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones causadas
por Moraxella catarrhalis, comprendiendo determinar a partir de una
muestra derivada de un individuo, tal como una material corporal, un
nivel incrementado de expresión de polinucleótido que tiene una
secuencia de SEQ ID Nº: 1. La expresión incrementada o disminuida de
un polinucleótido BASB120 se puede medir usando cualquiera de los
procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación
de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR,
RT-PCR, protección de RNasa, prueba de manchas de
Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.
Además, se puede usar un ensayo diagnóstico de
acuerdo con la invención para detectar la sobreexpresión de
polipéptido BASB120 comparado con las muestras de tejido control
normales para detectar la presencia de una infección, por ejemplo.
Las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar niveles de
un polipéptido BASB120, en una muestra derivada de un hospedador,
tal como un material corporal, se conocen bien por los expertos en
la técnica. Tales procedimientos de ensato incluyen
radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de
manchas de western, ensayos sándwich de anticuerpos, detección de
anticuerpos y ensayos ELISA.
Los polinucleótidos de la invención se pueden
usar como componentes de disposiciones polinucleotídicas,
preferiblemente disposiciones de alta densidad o rejillas. Estas
disposiciones de alta densidad son particularmente útiles para
propósitos de diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, un grupo de
manchas comprendiendo cada una un gen diferente, y comprendiendo
adicionalmente un polinucleótido o polinucleótidos de la invención,
se puede usar para sondear, tal como usando hibridación o
amplificación de ácido nucleico, usando sondas obtenidas o derivadas
de una muestra corporal, para determinar la presencia de un
polinucleótido particular secuenciado o secuencia relacionada en un
individuo. Una presencia tal puede indicar la presencia de un
patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser
útil en diagnosticar y/o pronosticar enfermedad o un curso de
enfermedad. Se prefiere una rejilla que comprenda un número de
variantes de la secuencia polinucleotídica SEQ ID Nº: 1. También se
prefiere una rejilla que comprenda un número de variantes de la
secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica
de SEQ ID Nº.: 2.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la
invención o variantes de la misma, o células que expresan la misma
se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos
inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos
respectivamente. El término "inmunoespecífico" significa que
los anticuerpos tienen sustancialmente mayor afinidad por los
polipéptidos de la invención que su afinidad por otros polipéptidos
relacionados en la técnica previa.
En ciertos polipéptidos preferidos de la
invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos BASB120 o
polinucleótidos.
Los anticuerpos generados contra los polipéptidos
o polinucleótidos de la invención se pueden obtener administrando
los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o epítopos que
llevan fragmentos de cualquiera de los dos o de ambos, análogos de
cualquiera de los dos o de ambos, o células que expresan cualquiera
de los dos o ambos, a un animal no humano, usando procedimientos de
rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede
usar cualquier técnica conocida en la técnica que proporciona
anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares
continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como
aquellas en Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256:
495-497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today
4: 72 (1983); Cole y col., páginas 77-96 en
MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc.
(1985).
Las técnicas para la producción de anticuerpos de
cadena simple (patente de los Estados Unidos Nº.: 4.946.778) se
pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena simple a
polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. Además, los
ratones transgénicos, u otros organismos no humanos o animales no
humanos, tales como otros mamíferos no humanos, se pueden usar para
expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos a los
polipéptidos o polinucleótidos de la invención.
Alternativamente, la tecnología de mostrar fagos
se puede utilizar para seleccionar genes de anticuerpos con
actividades de unión a un polipéptido de la invención tanto a partir
de repertorios de genes v de linfocitos de humanos rastreados acerca
de la posesión de anti-BASB120 o de bibliotecas no
modificadas amplificados por PCR (McCafferty, y col., (1990),
Nature 348, 552-554; Marks y col., (1992)
Biotecnology 10, 779-783). La afinidad de
estos anticuerpos se pueden incrementar también mediante, por
ejemplo, mezclando cadenas (Clackson y col., (1991) Nature
352: 628).
Los anticuerpos anteriormente descritos se pueden
emplear parar aislar o para identificar clones que expresan los
polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los
polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía
de afinidad.
Así, entre otros, los anticuerpos frente al
polipéptido BASB120 o al polinucleótido BASB120 se pueden emplear
para tratar infecciones, particularmente infecciones
bacterianas.
Las variantes polipeptídicas incluyen variantes
antigénicamente, epitópicamente o inmunológicamente equivalentes que
forman un aspecto particular de esta invención.
Preferiblemente, el anticuerpo o variante del
mismo se modifica para hacerlo menos inmunógeno en el individuo. Por
ejemplo, si el individuo es humano lo más preferible puede ser
"humanizar" el anticuerpo, del anticuerpo derivado de hibridoma
se ha trasplantado dentro de un anticuerpo monoclonal humano, por
ejemplo como se describe en Jones y col. (1986), Nature 321,
522-525 o Tempest y col., (1991)
Biotechnology 9, 266-273.
Los polipéptidos y los polinucleótidos de la
invención se pueden usar también para valorar la unión de sustratos
y ligandos moleculares pequeños por ejemplo, en células,
preparaciones libres de células, bibliotecas químicas, y mezclas de
productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos
y ligandos naturales o pueden ser imitadores estructurales o
funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current
Protocols in Inmunology 1(2): capítulo 5 (1991).
Los procedimientos de rastreo pueden medir
simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o
polinucleótido, o a células o membranas que llevan el polipéptido o
polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido por medio
de una marca directamente o indirectamente asociada con el compuesto
candidato. Alternativamente, el procedimiento de escaneo puede
implicar competición con un competidor marcado. Adicionalmente,
estos procedimientos de rastreo pueden probar si el compuesto
candidato da como resultado una señal generada mediante activación o
inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de
detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido
o polinucleótido. Los inhibidores de activación se ensayan
generalmente en la presencia de un agonista conocido y se observa el
efecto sobre la activación mediante el agonista mediante la
presencia del compuesto candidato. El polipéptido constitutivamente
activo y/o los polipéptidos y polinucleótidos expresados
constitutivamente se pueden emplear en procedimientos de rastreo
para inhibidores o agonistas inversos, en la ausencia de un agonista
o inhibidor, probando si el compuesto candidato da como resultado
inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, como
puede ser el caso. Adicionalmente, los procedimientos de rastreo
pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto
candidato con una disolución que contienen un polipéptido o
polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla,
midiendo la actividad del polipéptido BASB120 y/o del polinucleótido
BASB120 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido
BASB120 y/o del polinucleótido BASB120 de la mezcla con un estándar.
Las proteínas de fusión, tales como aquellas hechas a partir de la
parte Fc y el polipéptido BASB120, como se describe anteriormente en
el presente documento, se puede usar también para ensayos de rastreo
de salida elevada con respecto a la entrada para identificar
antagonistas del polipéptido de la presente invención, igual que de
polipéptidos filogenéticamente y/o funcionalmente relacionados
(véase D. Bennett y col., J. Mol. Recognition, 8:
52-58 (1995); y K. Johanson y col., J. Biol. Chem.,
270 (16): 9459-9471 (1995)).
Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos
que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido de la presente
invención pueden también usarse para configurar procedimientos de
rastreo para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la
producción de RNAm y/o polipéptidos en células. Por ejemplo, un
ensayo de ELISA se puede construir para medir niveles de polipéptido
segregados o asociados a células que usan anticuerpos monoclonales o
policlonales mediante procedimientos estándar conocidos en la
técnica. Esto puede ser para descubrir agentes los cuales pueden
inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamado
antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o
tejidos manipulados adecuadamente.
La invención también proporciona un procedimiento
de rastrear compuestos para identificar aquellos los cuales
potencian (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de
polipéptidos BASB120 o polinucleótidos BASB120, particularmente
aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El
procedimiento de rastrear puede implicar técnicas de salida elevada
con respecto a la entrada. Por ejemplo para rastrear en busca de
agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción sintética, un
compartimento celular, tal como una membrana, envoltura celular o
pared celular, o una preparación de cualquiera de ellas, que
comprende polipéptido BASB120 y un sustrato o ligando marcado de tal
polipéptido se incuba en la ausencia o la presencia de una molécula
candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASF120. La
capacidad de la molécula candidato para agonizar o antagonizar el
polipéptido BASB120 se refleja en la unión disminuida del ligando
marcado o producción disminuida del producto a tal sustrato. Las
moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los
efectos del polipéptido BASB120 son las más probables para ser
buenas antagonistas. Las moléculas que unen bien y, como puede ser
el caso, incrementan la velocidad de producción de producto a partir
de sustrato, transducción de señales, o actividad química de de los
canales son agonistas. La detección de la velocidad o nivel de, como
puede ser el caso, producción de producto a partir de sustrato,
transducción de señales, o actividad de química de canales se pueden
potenciar usando un sistema notificador. Los sistemas notificadores
que pueden ser útiles a este respecto incluyen pero no se limitan a
sustrato colorimétrico marcado usado convertido en producto, un gen
notificador que es responsable de los cambios en el polinucleótido
BASB120 o actividad polipétídica, y ensayos de unión conocidos en la
técnica.
Otro ejemplo de un ensayo para agonistas BASB120
es un ensayo competitivo que combina BASB120 y un agonista potencial
con moléculas de unión a BASB120, moléculas recombinantes de unión a
BASB120, sustratos o ligandos naturales, o imitadores de sustrato o
ligando, bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición
competitiva. El BASB120 puede marcarse tal como mediante un
compuesto de radiactividad o colorimétrico, tal como el número de
moléculas de BASB120 unidas a una molécula de unión o convertidas en
producto se puede determinar con seguridad para valorar la eficacia
del agonista potencial.
Los antagonistas potenciales incluyen, entre
otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos, y
antibióticos que unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la
invención y por lo tanto inhiben o extinguen su actividad o
expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas
orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína
o anticuerpo cercanamente relacionado que une los mismos sitios en
una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir
actividades inducidas por BASB120, previniendo de este modo la
acción o expresión de polipéptidos BASB120 y/o polinucleótidos
BASB120 excluyendo los polipéptidos BASB120 y/o polinucleótidos
BASB120 de la unión.
Los antagonistas potenciales incluyen una
molécula orgánica pequeña que une y ocupa el sitio de unión del
polipéptido previniendo de este modo la unión de moléculas de unión
celular, de tal forma que se previene la actividad biológica normal.
Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a
pequeñas moléculas orgánicas, péptidos o moléculas similares a
péptidos. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas
antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991);
OLIGODEOXINUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE
EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), para una
descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales
incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB120.
En un aspecto adicional, la presente invención se
refiere a proteínas de fusión solubles modificadas genéticamente que
comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento
del mismo, y diversas partes de las regiones constantes de las
cadenas pesadas o ligeras de las inmunoglobulinas de diversas
subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). La parte constante de la cadena
pesada de la IgG humana, particularmente la IgG1, donde la fusión
tiene lugar en la región de articulación, se prefiere como
inmunoglobulina. En una realización particular, la parte Fc se puede
eliminar simplemente mediante la incorporación de una secuencia de
escisión la cual se puede escindir con el factor de coagulación de
la sangre Xa.
Además, esta invención se refiere a
procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión
mediante ingeniería genética, y al uso de la misma para rastreo de
fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención
se refiere también a polinucleótidos que codifican tales proteínas
de fusión. Ejemplos de proteínas de fusión se pueden encontrar en
las solicitudes de patente internacional Nº^{s}. WO94/29458 y
WO94/22914.
Cada una de las secuencias polinucleotídicas
proporcionadas en el presente documento se pueden usar en el
descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La
proteína codificada, en la expresión, se puede usar como una diana
para el rastreo de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, las
secuencias polinucleotídicas codifican las regiones aminoterminales
de la proteína codificada o Shine-Delgarno u otras
secuencias que facilitan la traducción del RNAm respectivo se pueden
usar para construir secuencias antisentido para controlar la
expresión de la secuencia codificante de interés.
La invención también proporciona el uso del
polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención
para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno
o patógenos y un hospedador eucariota, preferiblemente mamífero,
responsable de secuela o infección. En particular, las moléculas de
la invención se pueden usar: en la prevención de la adhesión de
bacterias, en particular bacterias gram positivas y/o gram
negativas, a las proteínas de la matriz extracelular o dispositivos
de fijación en ellos o a proteínas de la matriz extracelular en
heridas, de eucariotas, preferiblemente de mamífero; para bloquear
la adhesión bacteriana entre las proteínas de la matriz extracelular
eucariota, preferiblemente de mamífero, y las proteínas bacterianas
BASB120 que median el daño de los tejidos y/o; para bloquear la
progresión normal de la patogénesis en infecciones iniciados
diferentes que mediante implantación de dispositivos de fijación en
ellos o mediante otras técnicas quirúrgicas.
De acuerdo con aún otro aspecto adicional de la
invención se han proporcionado agonistas y antagonistas de BASB120,
preferiblemente agonistas o antagonistas bacteriostáticos o
bactericidas.
Los antagonistas y agonistas de la invención se
pueden emplear, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar
enfermedades.
En un aspecto adicional, la presente invención se
refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es
una secuencia peptídico, suficientemente similar al péptido sin
modificar (secuencialmente o estructuralmente), la cual es capaz de
reconocerse por los anticuerpos los cuales reconocen el péptido
sencillo cuando se acopla a un transportador apropiado.
Los mimotopos de péptidos se pueden diseñar para
un propósito particular mediante adición, deleción o sustitución de
aminoácidos elegidos. Así, los péptidos se pueden modificar para los
propósitos de facilidad de conjugación a una proteína
transportadora. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos
procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal.
Además, puede ser deseable para péptidos conjugados a una proteína
transportadora incluir un término distal hidrofóbico, tal que el
extremo no conjugado libre del péptido permanece asociado con la
superficie de la proteína transportadora. De este modo el péptido se
presenta en una conformación la cual es la que más cercanamente se
asemeja al péptido como se encuentra en el contexto de la molécula
nativa completa. Por ejemplo, los péptidos se pueden alterar para
tener una cisterna N-terminal y una cola amidada
hidrofóbica C-terminal. Alternativamente, la adición
o sustitución de una forma D-estereoisómero de uno o
más de los aminoácidos se puede llevar a cabo para crear un derivado
benéfico, por ejemplo para potenciar la estabilidad del péptido.
Alternativamente, los mimotopos del péptido se
pueden identificar usando anticuerpos los cuales son capaces por sí
mismos de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando
técnicas tales como tecnología para mostrar fagos (EP 0 552 267 B1).
Esta técnica, genera un gran número de secuencias de péptidos las
cuales imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo
tanto, capaces de unir a los anticuerpos contra péptidos nativos,
pero no necesariamente pueden por sí mismos abundar en homología de
secuencia al polipéptido nativo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un
individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente humanos, los
cuales comprenden inocular al individuo con polinucleótido y/o
polipéptido BASB120, o un fragmento o una variante del mismo,
adecuada para producir anticuerpo y/o respuesta inmune de células T
para proteger a dicho individuo contra la infección, particularmente
infección bacteriana y más particularmente infección con
Moraxella catarrhalis. También se proporcionan procedimientos
por los cuales tal respuesta inmunológica ralentiza la replicación
bacteriana. Aún otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento de inducir respuesta inmunológica en un individuo el
cual comprende administrar a tal individuo un vector de ácido
nucleico, secuencia o ribozima para la expresión directa de
polinucleótido y/o polipéptido BASB120, o un fragmento o una
variante del mismo in vivo con el fin de inducir una
respuesta inmunológica tal como para producir anticuerpo y/o
respuesta inmune de células T, incluyendo, por ejemplo, células T
que producen citoquinas o células T citotóxicas, para proteger a
dicho individuo, preferiblemente un humano, de la enfermedad, si esa
enfermedad está ya establecida en el individuo o no. Un ejemplo de
administrar el gen es acelerándolo dentro de las células deseadas
como un recubrimiento de partículas o de otro modo. Tal vector de
ácido nucleico puede comprender DNA, RNA, una ribozima, un ácido
nucleico modificado, un híbrido DNA/RNA, un complejo
proteína-DNA o un complejo
proteína-RNA.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a
una composición inmunológica que cuando se introduce en un
individuo, preferiblemente un humano, capaz de haber inducido en el
una respuesta inmune, induce una respuesta inmunológica en tal
individuo frente a un polinucleótido y/o polipéptido BASB120
codificado de ahí, en el que la composición comprende un
polinucleótido y/o polipéptido BASB120 recombinante codificado de
ahí y/o comprende DNA y/o RNA los cuales codifican y expresan un
antígeno de dicho polinucleótido BASB120, polipéptido codificado de
ahí, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica
se puede usar terapéuticamente o profilácticamente y puede tomar la
forma de inmunidad de anticuerpos y/ inmunidad celular, tal como
inmunidad celular que surge de las células T CTL o CD4^{+}.
Un polipéptido BASB120 o un fragmento del mismo
se puede fusionar con co-proteína o resto químico el
cual puede o no puede producir anticuerpos por sí mismo, pero el
cual es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una
proteína fundida o modificada la cual tendrá propiedades antigénicas
y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras. Así la
proteína recombinante fusionada, preferiblemente comprende
adicionalmente una coproteína antigénica, tal como lipoproteína D a
partir de Haemophilus influenzae,
glutation-S-transferasa (GST) o
beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína
relativamente grande la cual solubiliza la proteína y facilita la
producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede
actuar como un coadyuvante en el sentido de proporcionar una
estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que
recibe la proteína. La coproteína se puede anclar bien al extremo
aminoterminal como al extremo carboxiterminal de la primera
proteína.
En una composición de vacuna de acuerdo con la
invención, un polipéptido y/o polinucleótido BASB120, o un fragmento
o un mimotopo o una variante del mismo se puede presentar en un
vector, tal como vectores recombinantes vivos descritos
anteriormente, por ejemplo vectores bacterianos vivos.
También son adecuados vectores no vivos para el
polipéptido BASB120, por ejemplo vesículas bacterianas de la
membrana externa o "ampollas". Las ampollas OM se derivan de la
membrana externa de la membrana de dos capas de membrana de
bacterias gram-negativas y se ha documentado en
muchas bacterias gram-negativas (Zhou, L. y col.,
1998, FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228)
incluyendo C. trachomatis y C. psittaci. Una lista no
exhaustiva de patógenos bacterianos que se han notificado que
producen ampollas incluyen también: Bordetella pertussis,
Borrelia bugdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Escherichia
coli, Haemophilus Influenzae, Legionella pneumophila,
Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria
meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia
enterocolitica.
Las ampollas tienen la ventaja de proporcionar
proteínas de membrana externa en su conformación nativa y son así
particularmente útiles para vacunas. Las burbujas pueden también
mejorarse para uso en vacunas alterando la bacteria tal como para
modificar la expresión de una o más moléculas en la membrana
externa. Así por ejemplo la expresión de una proteína inmunógena en
la membrana externa, tal como el polipéptido BASB120, se puede
introducir o sobrerregularse (por ejemplo, alterado el promotor). En
cambio o además, la expresión de las moléculas de la membrana
externa las cuales son bien no relevantes (por ejemplo antígenos no
protectores o proteínas inmunodominantes pero variables) o
decrementantes (por ejemplo, moléculas tóxicas tales como LPS, o
inductores potenciales de una respuesta autoinmune) se pueden
regular a la baja. Estas aproximaciones se discuten en más detalle
más adelante.
Las regiones no codificantes flanqueantes del gen
BASB120 contienen elementos regulatorios importantes en la expresión
del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel transcripcional
como a nivel traduccional. La secuencia de estas regiones, bien
cadena arriba o cadena debajo de la fase de lectura abierta del gen,
se puede obtener mediante secuenciación del DNA. Esta información de
secuencia permite la determinación de motivos regulatorios
potenciales tales como los diferentes elementos promotores,
secuencias de terminación, elementos de secuencia inducible,
represores, elementos responsables de la variación de fase, la
secuencia de shine-dalgarno, regiones con estructura
secundaria potencial implicada en regulación, igual que otros tipos
de restos regulatorios o secuencias. Esta secuencia es un aspecto
adicional de la invención.
La información de secuencia permite la modulación
de la expresión natural del gen BASB120. La sobrerregulación de la
expresión génica se puede acomplejar alterando el promotor, la
secuencia de shine-dalgarno, los elementos
potenciales represor y operados, o cualesquiera otros elementos
implicados. Asimismo, la regulación a la baja de la expresión se
puede poner bajo control de variación de fase, o se puede desacoplar
de esta regulación. En otra aproximación, la expresión del gen se
puede poner bajo el control de uno o más elementos inducibles que
permiten la expresión regulada. Ejemplos de tal regulación incluyen,
pero no se limitan a, inducción mediante variación de temperatura,
adición de sustratos inductores como carbohidratos seleccionados o
sus derivados, elementos traza, vitaminas, cofactores, iones
metálicos, etc.
Tales modificaciones como se describen
anteriormente se pueden introducir mediante varios medios
diferentes. La modificación de secuencias implicadas en expresión
génica se puede llevar a cabo in vivo mediante mutagénesis
aleatoria seguida por selección para el fenotipo deseado. Otra
aproximación consiste en aislar la región de interés y modificarla
mediante mutagénesis aleatoria, o mutagénesis mediante
reemplazamiento, inserción o deleción dirigidos a sitio. La región
modificada se puede reintroducir entonces dentro del genoma
bacteriano mediante combinación homóloga, y se puede desear el
efecto de una expresión génica. En otra aproximación, el
conocimiento de secuencia de la región de interés se puede usar para
reemplazar o eliminar todas o parte de las secuencias regulatorias
naturales. En este caso, la región regulatoria diana se aísla y
modifica tal como para contener los elementos regulatorios de otro
gen, una combinación de elementos regulatorios de genes diferentes,
una región reguladora sintética, o cualquier otra región
regulatoria, o para borrar partes seleccionadas de las secuencias
regulatorias de tipo natural. Estas secuencias modificadas se pueden
reintroducir dentro de la bacteria por medio de recombinación
homóloga dentro del genoma. Una lista no exhaustiva de promotores
preferidos que se pueden usar para la sobrerregulación de expresión
génica incluye los promotores porA, porB, lbpB, tbpB, p110, 1st,
hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae; ompCD,
copB, lbpB, ompE, UspA1, UspA2, TbpB de M. catarrhalis; p1,
p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 de H.
influenzae.
En un ejemplo, la expresión del gen se puede
modular intercambiando su promotor con un promotor más fuerte (a
través de aislar la secuencia cadena arriba del gen, modificación
in Vitro de esta secuencia, y reintroducción dentro del
genoma mediante recombinación homóloga). La expresión sobrerregulada
se puede obtener tanto en la bacteria como en las vesículas de la
membrana externa esparcidas (o elaboradas) a partir de la
bacteria.
En otros ejemplos, las aproximaciones descritas
se pueden usar para generar cepas bacterianas recombinantes con
características incrementadas para aplicaciones de vacunas. Estas
pueden ser, pero no limitarse a, cepas atenuadas, cepas con
expresión incrementada de antígenos seleccionados, cepas con
expresión anulada de genes (knock-outs de genes) (o
expresión disminuida) de genes que interfieren con la respuesta
inmune, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes,
cepas con esparcimiento modulado de vesículas de membrana
externa.
Así, se proporciona también por la invención una
región cadena arriba modificada del gen BASB120, la cual región
cadena arriba modificada contiene un elemento regulatorio heterólogo
el cual altera el nivel de expresión de la proteína BASB120
localizada en la membrana externa. La región cadena arriba de
acuerdo con este aspecto de la invención incluye la secuencia cadena
arriba del gen BASB120. La región cadena arriba comienza
inmediatamente cadena arriba del gen BASB120 y continua usualmente
hasta una posición no más de aproximadamente 1.000 pares de bases
cadena arriba del gen a partir del codón de iniciación ATG. En el
caso de un gen situado en una secuencia policistrónica (operón) las
región cadena arriba puede empezar precediendo inmediatamente el gen
de interés, o precediendo el primer gen en el operón.
Preferiblemente, una región cadena arriba modificada de acuerdo con
este aspecto de la invención contiene un promotor heterólogo en una
posición entre 500 y 700 pares de bases cadena arriba del ATG.
Así, la invención proporciona un polipéptido
BASB120, en una ampolla de bacteria modificada. La invención
proporciona adicionalmente células hospedadoras capaces de producir
los vectores de ampollas basadas en membrana no vivos. La invención
proporciona adicionalmente vectores de ácidos nucleicos que
comprenden el gen BASB120 que tiene una región modificada corriente
arriba que contiene un elemento regulador heterólogo.
Se proporcionan adicionalmente por la invención
procedimientos para preparar las células hospedadoras y ampollas de
bacterias de acuerdo con la invención.
También se proporcionan por esta invención
composiciones, particularmente composiciones de vacunas, y
procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos
de la invención y secuencias inmunoestimulatorias de DNA, tales como
aquellas descritas en Sato, Y. y col., Science 273: 352
(1996).
Además, hay procedimientos proporcionados por
esta invención que usan el polinucleótido descrito o fragmentos
particulares del mismo, el cual ha mostrado codificar regiones no
variables de proteínas de la superficie de las células bacterianas,
en construcciones polinucleotídicas usadas en tales experimentos de
inmunización genética en modelos animales de infección con
Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán
particularmente útiles para identificar epítopos de proteína capaces
de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree
que esta aproximación permitirá la subsiguiente preparación de
anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados del órgano
requerido del animal que resiste o elimina exitosamente la
invención, para el desarrollo de agentes preventivos o tratamientos
terapéuticos de la infección bacteriana, en particular infección con
Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente
humanos.
La invención también incluye una formulación de
vacuna la cual comprende un polipéptido y/o polinucleótido
inmunogénico recombinante de la invención junto con un transportador
adecuado, tal como un transportador farmacéuticamente aceptable.
Dado que los polipéptidos y polinucleótidos se pueden romper en el
estómago, cada vez es preferible administrar parenteralmente,
incluyendo, por ejemplo, administración que es subcutánea,
intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones
adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones de
inyección estériles acuosas o no acuosas las cuales pueden contener
antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos los
cuales vuelven a la formulación isotónica con el fluido corporal,
preferiblemente la sangre, del individual; y suspensiones estériles
acuosas o no acuosas las cuales pueden incluir agentes de suspensión
o agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en
recipientes de una dosis o recipientes multidosis, por ejemplo,
ampollas selladas y viales y se pueden almacenar en condiciones de
secado en frío requiriendo sólo la adición del transportador líquido
estéril inmediatamente antes de usar.
La formulación de vacunas de la invención puede
incluir también sistemas coadyuvantes para potenciar la
inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema
coadyuvante sube preferencialmente un tipo de respuesta TH1.
Una respuesta inmune se puede distinguir
ampliamente en dos categorías extremas, siendo una respuesta inmune
humoral o una respuesta inmune mediada por células (caracterizadas
tradicionalmente por anticuerpos y mecanismos efectores celulares de
protección respectivamente). Estas categorías de respuesta pueden
llamarse respuestas inmunes de tipo TH1 (respuesta mediada por
células) y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).
Las respuestas inmunes de tipo TH1 extremas se
pueden caracterizar mediante la generación de respuestas de
linfocitos T citotóxicos de haplotipo restringido específicas de
antígeno, y respuestas de células natural killer. En ratones las
respuestas tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de
anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras en los humanos estas
corresponden al tipo de anticuerpos IgG1, Las respuestas inmunes de
tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplio rango de
isotipos de inmunoglobulina incluyendo en las IgG1, IgA, e IgM de
ratón.
Se puede considerar que la fuerza directora
detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son
las citoquinas. Altos niveles de citoquinasa de tipo TH1 tienden a
favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células
para dar antígeno, mientras que altos niveles de citoquinas de tipo
TH2 tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes
humorales al antígeno.
La distinción de las respuestas inmunes TH1 y TH2
no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta
inmune la cual se describe como que es predominantemente TH1 o
predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente
considerar las familias de citoquinas en términos de lo que se
describe de clones de células T CD4+ve murinas por Mosmann y Coffman
(Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells:
different patterns of limphokine secretion lead to different
functional properties. Annual Review of Immunology, 7, páginas
145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo
TH1 están asociadas con la producción de las citoquinas
INF-\gamma e IL-2 por linfocitos
T. Otras citoquinas a mentido asociadas directamente con la
inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no se producen por
células T, tales como IL-12. En contraste, las
respuestas de tipo TH2 están asociadas con la secreción de
IL-4, IL-5, IL-6 e
IL-13.
Se sabe que ciertos coadyuvantes de vacunas son
particularmente adecuados para la estimulación bien de respuestas
inmunes de tipo TH1 o bien de respuestas inmunes de tipo TH2.
Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de
la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluye
medida directa de la producción de citoquinas de TH1 o TH2 mediante
linfocitos T in vitro después de reestimulación con antígeno,
y/o la medida de la razón IgG1:IgG2a de las respuestas de anticuerpo
específicas de antígeno.
Así, un coadyuvante de tipo TH1 es uno el cual
estimula preferencialmente las poblaciones aisladas de células T
para producir altos niveles de citoquinas de tipo TH1 cuando se
reestimulan con antígeno in vitro y promueve el desarrollo
tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ y respuestas de
inmunoglobulinas antígenos específicas asociadas con el isotipo del
tipo TH1.
Los coadyuvantes los cuales son capaces de
estimulación preferencial de la respuesta celular TH1 se describen
en la solicitud de patente internacional N^{os}. WO 94/00153 y WO
95/17209.
El
3-de-O-acilado-monofosforil-lípido
A (D-MPL) es un coadyuvante tal. Este se conoce a
partir de GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de
3-de-O-acilado-monofosforil-lípido
A con cadenas aciladas 4, 5 ó 6 y se elabora por Ribi Inmunochem,
Montana. Una forma preferida de
3-de-O-acilado-monofosforil-lípido
A se describe en la patente europea 0 689 454 B1 (SmithKline
Beecham Biologicas, S.A.).
Preferiblemente, las partículas de
3D-MPL son suficientemente pequeñas para filtrarse
de forma estéril a través de una membrana de 0,22 micrones (patente
europea nº. 0 689 454). ED-MPL estará presente en el
intervalo de 10 \mug-100 \mug preferiblemente
25-50 \mug por dosis en el que el antígeno estará
típicamente presente en un intervalo 2-50 \mug por
dosis.
Otro coadyuvante preferido comprende QS21, una
fracción no tóxica purificada de Hplc derivada de corteza de
Quijalla saponaria Molina. Opcionalmente esto se puede
mezclar con
3-de-O-aciladomonofosforil-lípido
A (3D-MPL), opcionalmente de forma conjunta con un
transportador.
El procedimiento de producción de QS21 se
describe en la patente de los Estados Unidos Nº. 5.057.540.
El procedimiento de producción de QS21 se ha
descrito previamente (documento WO 96/3379). Tales formulaciones que
comprenden QS21 y colesterol han mostrado ser exitosas estimulando
coadyuvantes cuando se formulan conjuntamente con un antígeno.
Los coadyuvantes adicionales los cuales son
estimuladores preferenciales de la respuesta celular TH1 incluyen
oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias no
metiladas CpG como se describe en el documento WO 96/02555.
Las combinaciones de diferentes coadyuvantes
estimuladores TH1, tales como aquellos mencionados anteriormente en
el presente documento, se contemplan también como que proporcionan
un coadyuvante el cual es un estimulador preferencial de la
respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 se puede formular
conjuntamente con 3D-MPL. La razón de QS21:
3D-MPL será típicamente del orden de 1: 10 a 10: 1;
preferiblemente de 1: 5 a 5: 1 y a menudo sustancialmente 1: 1. El
intervalo preferido para la sinergia óptima es 2,5: 1 a 1: 1 de
3D-MPL: QS21.
Preferiblemente un transportador también está
presente en la composición de la vacuna de acuerdo con la invención.
El transportador puede ser un aceite en emulsión acuosa, o una sal
de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de
aluminio.
Una emulsión de
aceite-en-agua preferida comprende
un aceite metabolizable, tal como escualeno,
alfa-tocoferol y tween 80. En un aspecto
particularmente preferido los antígenos en la composición de la
vacuna de acuerdo con la invención se combinan con QS21 y
3D-MPL en una emulsión tal. Adicionalmente la
emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o
tricaprylina.
Típicamente para administración humana QS21 y
3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el
intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal como
10-100 \mug, preferiblemente 10
\mug-50 \mug por dosis. Típicamente el aceite en
agua comprenderá de un 2 a un 10% de escualeno, de un 2 a un 10% de
alfa-tocoferol y de un 0,3 a un 3% de tween 80.
Preferiblemente la razón de escualeno:
alfa-tocoferol es igual a o menor de 1 según esto
proporciona una emulsión más estable. Span 85 puede también estar
presente a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que
las vacunas de la presente invención contengan adicionalmente un
estabilizador.
El aceite no tóxico en emulsiones acuosas
contiene preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo escualano
o escualeno, un emulsificador, por ejemplo tween 80, en un
transportador acuoso. El transportador acuoso puede ser, por
ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato.
Una formulación coadyuvante particularmente
potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una
emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO
95/17210.
La presente invención también proporciona una
composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de
vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en
particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades
autoinmunes y afecciones relacionadas. Tal composición polivalente
de de vacuna puede incluir un coadyuvante que induce
TH-1 como se describe anteriormente en este
documento.
Mientras la invención se ha descrito con
referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB120, se
entiende que esto cubre fragmentos de los polipéptidos y
polinucleótidos que se dan en la naturaleza, y polipéptidos y
polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones
los cuales no afectan sustancialmente las propiedades inmunogénicas
de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.
En un aspecto adicional de la invención se
proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB120 y/o un polipéptido BASB120 para administración a una célula o a un organismo pluricelular.
BASB120 y/o un polipéptido BASB120 para administración a una célula o a un organismo pluricelular.
La invención se refiere también a composiciones
que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido discutido en el
presente documento o sus agonistas y antagonistas. Los polipéptidos
y polinucleótidos de la invención se pueden emplear en combinación
con un transportador o transportadores no estéril(es) o
estéril(es) para usar con células, tejidos u organismos,
tales como un transportador farmacéutico adecuado para
administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por
ejemplo, medios aditivos o una cantidad terapéuticamente efectiva de
un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un transportador
o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales transportadores
pueden incluir, pero no se limitan a, disolución salina, disolución
salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones
de los mismos. La formulación se adecuaría al modo de
administración. La invención se refiere adicionalmente a lotes de
elementos y kits diagnósticos y farmacéuticos que comprenden uno o
más recipientes rellenados con uno o más de los ingredientes de las
composiciones de la invención anteriormente mencionadas.
Los polipéptidos, polinucleótidos y otros
compuestos de la invención se pueden emplear solos o en conjunción
con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
administrar en cualquier manera efectiva, conveniente, incluyendo,
por ejemplo, administración por las vías tópica, oral, anal,
vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular subcutánea,
intranasal o intradérmica, entre otras.
En terapia o como un profiláctico, el agente
activo se puede administrar a un individuo como una composición
inyectable, por ejemplo como una dispersión estéril acuosa,
preferiblemente isotónica.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad
terapéuticamente efectiva de un polipéptido y/o polinucleótido, tal
como la forma soluble de un polipéptido y/o un polinucleótido de la
presente invención, péptido agonista o antagonista o pequeño
componente molecular, en combinación con un transportador o
excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales transportadores
incluyen, pero no se limitan a, disolución salina, disolución salina
tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los
mismos. La invención se refiere adicionalmente a lotes de elementos
y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenados
con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la
invención anteriormente mencionadas. Polipétidos, polinucleótidos y
otros compuestos de la presente invención se pueden solos o en
combinación con otros compuestos, tales como compuestos
terapéuticos.
La composición se adaptará a la vía de
administración, por ejemplo mediante una vía sistémica u oral. Las
formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección,
típicamente mediante inyección intravenosa. Se pueden usar otras
vías de inyección tales como subcutánea, intramuscular o
intraperitoneal. Medios alternativos para administración sistémica
incluyen administración transmucosal y transdérmica usando agentes
penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros
detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la
presente invención se pueden formular en una formulación entérica o
encapsulada, la administración oral puede también ser posible. La
administración de estos compuestos puede ser también tópica y/o
localizada, en la forma de pomadas balsámicas, pastas, geles,
disoluciones, polvos y similares.
Para administración a mamíferos, y
particularmente humanos, se espera que el nivel de dosificación
diaria del agente activo será de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente
alrededor de 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la
dosificación real la cual será más adecuada para un individuo y
variará con la edad, peso y respuesta del individuo en particular.
Las dosificaciones anteriores son ejemplares en el caso promedio.
Puede haber, por supuesto, ejemplos individuales donde intervalos de
dosis mayores o menores sean de calidad, y tales están dentro del
alcance de esta invención.
El intervalo de dosificación dependerá de la
elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la
formulación, la naturaleza de la afección del sujeto y el juicio del
practicante que atiende. Las dosis adecuadas, sin embargo, están en
el intervalo de 0,1-100 \mug/kg del sujeto.
Una composición de vacuna está convenientemente
en forma inyectable. Los coadyuvantes convencionales se pueden
emplear para potenciar la respuesta inmune. Una unidad de
dosificación adecuada para la vacunación des de 0,5 a 5
microgramos/kg de antígeno, y tal dosis se administra
preferiblemente 1-3 veces y con un intervalo de
1-3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no
se observarán efectos adversos toxicológicos que se observarán con
los compuestos de la invención los cuales precluirían su
administración a individuos adecuados.
Variaciones amplias en la dosificación
necesitada, sin embargo, se esperan en vista de la variedad de los
compuestos disponibles y las eficiencias diferentes de diversas vías
de administración. Por ejemplo, la administración oral se esperará
que requiera dosificaciones mayores que administración mediante
inyección intravenosa. Variaciones en estos niveles de dosificación
se pueden ajustar usando rutinas empíricas estándar para
optimización, como se conoce bien en la técnica.
Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas
forman un recurso de información valioso con el cual determinar sus
estructuras de 2 y 3 dimensiones igual que para identificar
secuencias adicionales de homología similar. Estas aproximaciones se
facilitan con la mayor facilidad almacenando la secuencia en un
medio legible mediante ordenador y usando después los datos
empleados en un programa conocidos de estructura macromolecular o
para buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de
búsqueda bien conocidas, tales como el programa de empaquetamiento
GCC.
También se proporcionan mediante la invención
procedimientos para el análisis de secuencias o cadenas distintivas,
particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas
codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencia
incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de
secuencia, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de
estructura de DNA, RNA y proteínas, ensamblaje de secuencia,
análisis cladístico, secuencia de análisis de restos, determinación
de fase de lectura abierta, realización de un listado de bases de
ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, puesta en orden de
bases de ácidos nucleicos, y análisis de picos de cromatograma de
secuenciación.
Un procedimiento basado en ordenador se
proporciona también para llevar a cabo identificación de homología.
Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera
secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un
polinucleótido de la invención en un medio legible por ordenador; y
comparar dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos una
segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar
homología.
Un procedimiento basado en el ordenador se
proporciona también para llevar a cabo la identificación de
homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar
una primera secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de
un polipéptido de la invención en un medio legible por ordenador; y
comparar dicha primera secuencia polipeptídica con al menos una
segunda secuencia polinucleotídica o polipétídica para identificar
homología.
Todas las publicaciones y referencias, incluyendo
pero no limitadas a las patentes y solicitudes de patente, citadas
en esta memoria descriptiva se incorporan en el presente documento
por referencia en su totalidad como si cada publicación o referencia
individual se indicara específicamente e individualmente para
incorporarse por referencia en el presente documento como se expone
en su totalidad. Cualquier solicitud de patente a la cual esta
solicitud reivindique prioridad se incorpora también por referencia
en el presente documento en su totalidad en la manera anteriormente
descrita para publicaciones y referencias.
"Identidad" como se conoce en la técnica, es
una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más
secuencias polinucleotídicas, como puede ser el caso, según se
determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad"
significa también el grado de relación de secuencia entre secuencias
polipeptídicas o polinucleotídicas, como puede ser el caso, según se
determina mediante la combinación entre cadenas de tales secuencias.
La "identidad" se puede calcular fácilmente mediante
procedimientos conocidos, incluyendo pero no limitados a aquellos
descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.,
ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing:
Informatics and Genome Projects, Smith D.W., ed., Academia
Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data,
Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press,
Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology,
von Heine, G., Academia Press, 1987; y Sequence Análisis
Primer, Gribskov, M. y Deveroux, J., eds., M. Stockton Press,
Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D. SIAM J. Applied
Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos para determinar
identidad se diseñan para dar la combinación entre las secuencias
probadas. Además, los procedimientos para determinar identidad se
diseñan para dar el ajuste más largo entre las secuencias probadas.
Además, los procedimientos para determinar identidad se codifican en
programas de ordenador públicamente disponibles. Los procedimientos
de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos
secuencias incluyen, pero no se limitan a, el programa GAP en el
paquete de programas GCG (Deveraux, J., y col, Nucleics Acids
Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTIN (Altschul
S.F., y col., J. Molec. Biol. 215: 403-410
(1990), y FASTA (Pearson y Limpian Proc. Matl. Acad. Sci. USA 85;
2444-2448 (1998). La familia BLAST de programas está
públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST
Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;
Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215:
403-410 (1990). El algoritmo bien conocido Smith
Waterman se puede usar para determinar identidad.
Los parámetros para comparación de secuencias de
polipéptidos incluyen lo siguiente:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:
443-453 (1970)
Matriz de comparación: BLOSSUM62 a partir de
Henikoff y Henikoff,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:
10915-10919 (1992).
Penalización de discontinuidad: 8
Penalización de longitud de discontinuidad: 2
Un programa útil con estos parámetros está
disponible públicamente como el programa "de discontinuidad" de
Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros citados son los
parámetros por defecto de las comparaciones de péptidos (junto con
ninguna penalización para las discontinuidades de los extremos).
Los parámetros para la comparación de
polinucleótidos incluyen lo siguiente:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:
443-453 (1970)
Matriz de comparación: apareamientos = +10,
desapareamientos = 0
Penalización de discontinuidad: 50
Penalización de longitud de discontinuidad: 3
Disponible como: el programa "de
discontinuidad" de Genetics Computer Group, Madison WI. Éstos son
los parámetros por defecto de las comparaciones de ácidos
nucleicos.
Un significado preferido para "identidad"
para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se
proporciona en (1) y (2) más adelante.
(1) Las realizaciones polinucleotídicas incluyen
adicionalmente un polinucleótido aislado que comprende una secuencia
de polinucleótidos que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95,
97 0 100% de identidad a la secuencia de referencia de SEQ ID Nº.:
1, en las que dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a
la secuencia de referencia de SEQ ID Nº.: 1 o puede incluir hasta un
cierto número entero de alteraciones de nucleótidos según se
comparan con la secuencia de referencia, en la que dichas
alteraciones se seleccionan del grupo que consta de a menos una
deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o
inserción nucleotídica, y en la que dichas alteraciones pueden
ocurrir en las posiciones 5' terminal y 3' terminal de la secuencia
del nucleótido de referencia o en cualquier parte entre esas
posiciones terminales, interdispersas bien individualmente entre los
nucleótidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos
contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en el que dicho
número de alteraciones nucleotídicas se determina multiplicando el
número total de nucleótidos en la SEQ ID Nº.: 1 mediante el número
entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y después
restando ese producto del número total de nucleótidos en SEQ ID Nº.:
1, o:
n_{n} \leq
x_{n} - (x_{n} \cdot
y),
en la que n_{n} es el número de
alteraciones nucleotídicas, x_{n} es el número total de
nucleótidos en la SEQ ID Nº.: 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el
60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,90 para el 90%, 0,95 para
el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el
símbolo para el operador de multiplicación, y en el que cualquier
producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo al número
entero más cercano antes de sustraerlo de x_{n}. Las alteraciones
de una secuencia polinucleotídica que codifican el polipéptido de la
SEQ ID Nº.: 2 pueden crear mutaciones sin sentido, con sentido
erróneo o que cambian la fase de lectura en esta secuencia
codificante y por lo tanto alteran el polipéptido codificado por el
polinucleótido siguiendo tales
alteraciones.
A modo de ejemplos, una secuencia de
polinucleótido de la presente invención puede ser idéntica a la
secuencia de referencia de SEQ ID Nº.: 1, es decir que puede ser
100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de
alteraciones de ácidos nucleicos comparadas con la secuencia de
referencia de tal forma que el porcentaje de identidad es menos que
el 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan del grupo
que consta de al menos una deleción, sustitución, incluyendo
transición y transversión, o inserción de ácido nucleico, y en la
que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones 5' terminal
y 3' terminal de la secuencia del polinucleótido de referencia o en
cualquier parte entre esas posiciones terminales, interdispersas
bien individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de
referencia o bien en uno o más grupos contiguos con la secuencia de
referencia. El número de alteraciones de los ácidos nucleicos en la
SEQ ID Nº.: 1 se determina mediante el número entero que define el
porcentaje de identidad dividido por 100 y después sustrayendo ese
producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.:
1 mediante el número entero que define el porcentaje de identidad
dividido por 100 y después sustrayendo ese producto de dicho número
total de ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.: 1, o:
n_{n} \leq
x_{n} - (x_{n} \cdot
y),
en la que n_{n} es el número de
alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de
ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.: 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60
para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 85 para el 85%,
etc., \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en
el que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia
abajo al número entero más cercano antes de sustraerlo de
x_{n}.
(2) Las realizaciones de polipéptidos incluyen
adicionalmente un polipéptido aislado que comprende un polipéptido
que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% de
identidad a una secuencia polipéptídica de referencia de SEQ ID Nº.:
2, en las que dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a
la secuencia de referencia de SEQ ID Nº.: 2 o puede incluir hasta un
cierto número entero de alteraciones de aminoácidos según se compara
con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se
seleccionan del grupo que consta de al menos una deleción,
sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de
aminoácido, incluyendo sustitución, o inserción, conservadora o no
conservadora, y en el que dichas alteraciones pueden ocurrir en las
posiciones aminoterminal o carboxiterminal de la secuencia del
polipéptido de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones
terminales, interdispersas bien individualmente entre los
aminoácidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos
contiguos con la secuencia de referencia, y en la que dicho número
de alteraciones aminoacídicas se determina multiplicando el número
total de aminoácidos en la SEQ ID Nº.: 2 por el número entero que
define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después
sustrayendo ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos
en la SEQ ID Nº.: 2, o:
n_{a} \leq
x_{a} - (x_{a} \cdot
y),
en la que n_{a} es el número de
alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de
aminoácidos en la SEQ ID Nº: 2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el
60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,90 para el 90%, 0,95 para
el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el
símbolo para el operador de multiplicación, y en el que cualquier
producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número
entero más cercano antes de sustraerlo de
x_{a}.
A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptidos
de la presente invención pueden ser idéntica a la secuencia de
referencia de SEQ ID Nº: 2; es decir que puede ser 100% idéntica, o
puede incluir hasta un cierto número de alteraciones aminoacídicas
según se compara con la secuencia de referencia tal que el
porcentaje de identidad es menos del 100%. Tales alteraciones se
seleccionan del grupo que consta de al menos una deleción,
sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de
aminoácido, incluyendo sustitución, o inserción, conservadora o no
conservadora, y en el que dichas alteraciones pueden ocurrir en las
posiciones aminoterminal o carboxiterminal de la secuencia del
polipéptido de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones
terminales, interdispersas bien individualmente entre los
aminoácidos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos
contiguos con la secuencia de referencia. El número de alteraciones
aminoacídicas para una identidad porcentual dada se determina
multiplicando el número total de aminoácidos en la SEQ ID Nº.: 2 por
el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por
100 y después sustrayendo ese producto de dicho número total de
ácidos nucleicos en la SEQ ID Nº.: 2, o:
n_{a} \leq
x_{a} - (x_{a} \cdot
y),
en la que n_{a} es el número de
alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de
aminoácidos en la SEQ ID Nº: 2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el
60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc., y
\cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en el
que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia
abajo al número entero más cercano antes de sustraerlo de
x_{a}.
"Individuo(s)", cuando se usa en el
presente documento en referencia a un organismo, significa un
eucariota pluricelular, incluyendo, pero no limitado a, un metazoo,
un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un
humano.
"Aislado" significa alterado "por la mano
del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si se da en
la naturaleza, ha sido cambiado o retirado de su ambiente original,
o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido
presente de forma natural en un organismo vivo no está
"aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado
de sus materiales coexistentes de su estado natural está
"aislado", según se emplea el término en este documento.
Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce dentro de
un organismo en transformación, manipulación genética o mediante
otro procedimiento recombinante está "asilado" incluso si está
todavía presente en dicho organismo, organismo el cual puede estar
vivo o no vivo.
"Polinucleótido(s)" generalmente se
refiere a cualquier poliribonucleótido o polidesoxirribonucleótido,
el cual puede ser RNA o DNA no modificado o RNA o DNA modificado
incluyendo regiones de cadena simple y de cadena doble.
"Variante" se refiere a un polinucleótido o
polipéptido que se difererencia de un polinucleótido o polipéptido
de referencia, pero retiene propiedades esenciales. Una variante
típica de un polinucleótido se diferencia en la secuencia de
nucleótidos de otro, polinucleótido de referencia.
Cambios en la secuencia de nucleótidos de la
variante pueden o no pueden alterar la secuencia de aminoácidos de
un polipéptido de un polipéptido codificado por el polinucleótido de
referencia. Los cambios en el nucleótido pueden resultar en
sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncaciones de
aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de
referencia, como se discute más adelante. Una variante típica de un
polipéptido se diferencia en la secuencia de aminoácidos de otro,
polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan
a que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son
cercanamente similares en general y, en muchas regiones, idénticas.
Una variante y el polipéptido de referencia se pueden diferenciar
mediante una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier
combinación. Un residuo aminoácido sustituido o insertado puede o no
puede ser uno codificado por el código genético. Una variante de un
polinucleótido o polipéptido puede ser una que se dé naturalmente
tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se
conoce que se dé en la naturaleza. Las variantes que ocurren de
forma no natural de polinucleótidos y polipéptidos pueden hacerse
mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.
"Enfermedad(es)" significa cualquier
enfermedad causada por o relativa a infección mediante una bacteria,
incluyendo, por ejemplo, otitis media en infantes y niños, neumonía
en personas mayores, sinusitis, infecciones nosocomiales y
enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de
audición, acumulación de fluidos en el oído medio, daño en el nervio
auditivo, aprendizaje del habla retrasado, infección del tracto
respiratorio superior e inflamación del oído medio.
Los ejemplos dados a continuación se llevan a
cabo usando técnicas estándar, las cuales son bien conocidas y
rutinarias para los expertos en la técnica, excepto donde se
describa lo contrario en detalle. Los ejemplos son ilustrativos,
pero no se limitan a la invención.
La secuencia de DNA del gen BASB120 de la cepa
ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis (referida también como
cepa MC2931) se muestra en SEQ ID Nº.: 1. La traducción de la
secuencia del polinucleótido BASB120 se muestra en la SEQ ID Nº.:
2.
Los sitios de restricción EcoRI y
SalI modificados en los cebadores de amplificación inversa
MC-Lip 12-Fn/t-RI
(5'-AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAA AAT TTT AAT CAA TAC
TTT A-3') [SEQ ID Nº:3] en sentido correcto y
MC-Lip12RCh/t-Sal
(5'-AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG
TAG CTT ATT TTT TGG TAA GAC ATG-3') [SEQ ID Nº: 4],
respectivamente, permitieron la clonación direccional de un producto
de PCR dentro del plásmido de expresión de E. coli pTLZ2 tal
que una proteína madura BASB120 se pudo expresar como una proteína
de fusión que contiene una marca de cromatografía de afinidad
(His)6 en el extremo C-terminal. El producto
de PCR BASB120 se purificó a partir de la reacción de amplificación
usando columnas giratorias de gel de sílice (QiaGen) de acuerdo a
las instrucciones de los fabricantes. Para producir los extremos
requeridos EcoRI y SalI necesarios para la clonación,
el producto purificado de PCR se digirió secuencialmente por
completo con enzimas de restricción EcoRI y SalI como
se recomienda por el fabricante (Life Technologies).
Siguiendo la primera digestión de restricción, el
producto de PCR se purificó por medio de columna giratoria como
anteriormente para eliminar sales y se eluye en agua estéril antes
de la digestión con la segunda enzima. El fragmento de DNA digerido
se purificó de nuevo usando columnas giratorias de gel de sílice
antes de la ligazón con el plásmido pTZ2.
Para preparar el plásmido de expresión pTZ2 para
ligazón, se digirió de forma similar por completo tanto con
EcoRI como con SalI y después se trató con fosfatasa
intestinal de ternero (CIP, \simeq 0,02 unidades/pmol del extremo
5', Life Technologies) como se dirige por el fabricante para
prevenir autoligazón. Un exceso molar de aproximadamente 5 veces del
fragmento digerido con respecto al vector preparado se usó para
programar la reacción de ligazón. Una reacción de ligazón estándar
\simeq 20 \mul (\simeq 16ºC, \simeq 16 horas), usando
procedimientos bien conocidos en la técnica, se llevó a cabo usando
DNA ligasa T4 (\simeq 2,0 unidades/reacción, Life Technologies).
Una alícuota de la ligazón (\simeq 5 \mul) se usó para
transformar células JM109 electrocompetentes de acuerdo con
procedimientos bien conocidos en la técnica. Siguiendo un periodo de
sobrecrecimiento de \simeq 2-3 horas a 37ºC en
\simeq 1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se plaquearon
en placas de agar LB que contienen ampicilina (100 \mug/ml). Los
antibióticos se incluyeron en la selección. Las placas se incubaron
durante toda una noche a 37ºC bien en un incubador estándar (placas)
o bien en un baño de agua con agitación. Se empleó un análisis de
PCR basado en la célula entera para verificar que los transformantes
contenían el inserto de DNA BASB120. Aquí, el cultivo en \simeq
1,0 ml de caldo LB Ap durante toda una noche se transfirió a un tubo
de polipropileno de 1,5 ml y las células se recolectaron mediante
centrifugación en una microcentrífuga de Beckmann (\simeq 3
minutos, temperatura ambiente, \simeq 12.000 X g). El sedimento
celular se suspendió en \simeq 200 \mul de agua estéril y una
alícuota de \simeq 10 \mul usada para programar un volumen final
de reacción de PCR de \simeq 50 \mul conteniendo tanto BASF120
en sentido correcto como cebadores de amplificación inversa. Las
concentraciones finales de los componentes de la reacción de PCR
fueron esencialmente los mismos que aquellos especificados en el
ejemplo 2 excepto que se usaron \simeq 5,0 unidades de Taq
polimerasa. La etapa de desnaturalización inicial a 95ºC se
incrementó a 3 minutos para asegurar la disrupción técnica de las
células bacterianas y liberación de DMNA plasmídico. Un ciclador
térmico ABI modelo 9700 y un ciclo 32, perfil de amplificación
térmica de tres etapas, es decir 95ºC, 45 segundos;
55-58ºC, 45 segundos, 72ºC, 1 minuto, se usaron para
amplificar el fragmento BASB120 a partir de las muestras
transformantes lisadas. Tras la amplificación térmica, una alícuota
de \simeq 20 \mul de la reacción se analizó mediante
electroforesis en gel de azarosa (0,8% de azarosa en un tampón de
tris-acetato-EDTA (TAE)). Los
fragmentos de DNA se visualizaron mediante iluminación UV después de
la electroforesis en gel y la tinción con bromuro de etidio. Un DNA
molecular de tamaño estándar (1 Kb en la escala, Life Technologies)
se sometió a electroforesis en paralelo con las muestras prueba y se
usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Los
transformantes que produjeron el producto de PCR de tamaño esperado
se identificaron como cepas que contienen una construcción de
expresión de BSASB120. Las cepas que contienen plásmido de expresión
se analizaron después para la expresión inducible de BASB120
recombinante.
Para cada transformante
PCR-positivo anteriormente identificado, se
inocularon \simeq 5,0 ml de caldo LB conteniendo ampicilina (100
\mug/ml) con células a partir de la placa de mancha y crece
durante toda la noche a 37ºC con agitación (\simeq 250 rpm). Una
alícuota del cultivo sembrado durante toda una noche (\simeq 1,0
ml) se inoculó dentro de un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía
\simeq 25 de caldo LB Ap y se dejó crecer a 37ºC con agitación
(\simeq 250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó D.O.
600 de \simeq 0,5, es decir, fase logarítmica media (usualmente
aproximadamente 1,5-2,0 horas). En este momento
aproximadamente la mitad del cultivo (\simeq 12,5 ml) se
transfirió a un segundo matraz de 125 ml y la expresión de la
proteína recombinante BASB120 inducida por la adición de IPTG (1,0 M
de reserva preparado en agua estéril, Sigma) a una concentración
final de 1,0 mM. La incubación de tanto los cultivos inducidos por
IPTG y no inducidos por IPTG continuados por unas 4 horas
adicionales a 37ºC con agitación. Muestras (\simeq 1,0 ml) de
ambos cultivos inducidos o no inducidos se eliminaron después del
periodo de inducción y las células se recogieron por centrifugación
en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante \simeq 3
minutos. Los sedimentos de células individuales se suspendieron en
\simeq 50 \mul de agua estéril, se mezclaron después con un
volumen igual de tampón de muestra SDS-PAGE
Laernelli 2X que contenía 2-mercaptoetanol, y se
situaron en baño de agua hirviendo durante \simeq 3 minutos para
desnaturalizar la proteína. Los volúmenes iguales (\simeq 15
\mul) tanto de los lisados de células inducidos por los lisados de
células en bruto como de los lisados de células no inducidos se
cargaron sobre gel de poliacrilamida con tris/glicina al 12%
duplicado (mini-geles de 1 mm de espesor, Novex).
Las muestras de lisados inducidas y no inducidas se sometieron a
electroforesis juntas con marcadores de peso molecular preteñidos
(SeeBlue, Novex) bajo condiciones convencionales que usan un tampón
para correr SDS/tris/glicina estándar (BioRad). Continuando con la
electroforesis un gel se tiñó con azul brillante de Coomasie R250
(BioRad) y después se destiñó para visualizar proteína o proteínas
inducibles por IPTG de BASB120 novedosas. El segundo gel se sometió
a una prueba de manchas eléctrica en una membrana PVDF (tamaño de
poro 0,45 micrones, Novex) durante \simeq 2 horas a 4ºC usando un
aparato de prueba de manchas MiniProtean II de BioRad y un tampón de
transferencia de metanol de Towbin (20%). El bloqueo de la membrana
y las incubaciones con anticuerpos se llevaron a cabo de acuerdo con
procedimientos bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo
monoclonal anti-RGS (His)3, seguido por un
segundo anticuerpo antirratón de conejo conjugado con HRP (QiaGen),
se usó para confirmar la expresión e identidad de la proteína
recombinante. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo
anti-His se logró usando bien un sustrato de ABT
insoluble o bien usando Hyperfilm con el sistema de
quimioluminiscencia de Amersham ECL.
Una cepa de expresión recombinante de E.
coli JM109 conteniendo un plásmido (pTLZ2) que codifica BASB120
de Moraxella catarrhalis, se usó para producir masa celular
para la purificación de proteína recombinante. La cepa de expresión
se cultivó en placas de agar que contenían 100 \mug/ml de
ampicilina ("Ap") para asegurar que la pTLZ2 se mantuvo. Para
la criopreservación a -80ºC, la cepa se propagó en caldo LB
conteniendo la misma concentración de antibióticos mezclada después
con un volumen equivalente de caldo LB conteniendo 30% (p/v) de
glicerol.
El medio de fermentación usado para la producción
de proteína recombinante consta de caldo 2X YT (Disco) conteniendo
100 \mug/ml de Ap. Se añadió antiespumante al medio para el
fermentador a 0,25 ml/l (Antiespumante 204, sigma). Para inducir
expresión de la proteína recombinante BASB120, se añadió IPTG
(\beta-D-tiogalactopiranósido de
isopropilo) al fermentador (1 mM, final).
Un matraz de siembra erlenmeyer de 500 ml,
conteniendo 50 ml de volumen de trabajo, se inoculó con 0,3 ml de
cultivo congelado rápidamente descongelado, o diversas colonias a
partir de un cultivo en placa de agar selectivo, e incubadas durante
aproximadamente 12 horas a 37\pm 1ºC en un plataforma de agitación
a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Este cultivo de
siembra se usó para inocular un fermentador de volumen de trabajo de
5 l conteniendo caldo 2X YT y ambos antibióticos Ap. El fermentador
(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) se operó a 37\pm 1ºC, con
chorro de aire 0,2-0,4 VVM, a 250 rpm en impulsores
de Rushton. El pH no se controló bien en el cultivo de siembra en
matraz o bien en el fermentador. Durante la fermentación, el pH
varió de 6,5 a 7,3 en el fermentador. IPTG (reserva 1,0 M, preparado
en agua estéril) se añadió al fermentador cuando el cultivo alcanzó
el logaritmo medio de crecimiento (\simeq 0,7 D.O. 600 unidades).
Las células se indujeron durante 2-4 horas después
se recogieron mediante centrifugación usando bien una centrífuga
superrrápida 28RS Heraeus (Sepatech) o bien una centrífuga
superrrápida RC5C (Sorvall Instruments). La pasta celular se
almacenó a -20ºC hasta que se procesó.
Imidazol, clorhidrato de guanidina,
tris(hidroximetilo), y EDTA (etilendiamina del ácido
tetraacético) de calidad biotecnológica o mejor se obtuvieron todos
de Ameresco Chemical, Solon, Ohio. El tritón X-100
(t-octilfenoxipolietoxietanol), el
tritón-114, y el fosfato de sodio, monobásicos,
fueron de calidad reactiva o mejor y se obtuvieron de Sigma Chemical
Company, San Luís, Missouri. El ácido acético glacial y el ácido
clorhídrico se obtuvieron a partir de Mallincrodt Baker Inc.,
Phillisburg, Nueva Jersey. El metanol se obtuvo a partir de Fisher
Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey. El Pefabloc®SC
(4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilfluoruro),
comprimidos de cóctel inhibidores de proteasa completa, y PMSF
(sulfonilfluoruro de fenilmetilo) se obtuvieron de Roche Diagnostics
Corporation, Indianápolis, Indiana. La Bestatina, Pepstatina A, e
inhibidor de proteasa E-64 se obtuvieron de
Calbiochem, Lajolla, California. La disolución salina tamponada con
fosfato de Dulbecco (1 x PBS) se obtuvo de Quality Biologial, Inc.,
Gaithersburg, Maryland. . La disolución salina tamponada con fosfato
de Dulbecco (10 x PBS) se obtuvo de BioWhittaker, Walkersville,
Maryland. El anticuerpo penta-His, libre de BSA, se
obtuvo de QiaGen, Valencia, California. La IgG antirratón de cabra
AffiniPure conjugada con peroxidasa se obtuvo de Jackson Immuno
Research, West Grove, Penn. La disolución individual AEC se obtuvo a
partir de Zymed, San Francisco Sur, California. Todos los otros
productos químicos fueron de calidad reactiva o mejor.
La resina de flujo rápido de sefarosa quelada con
Ni se obtuvo de Pharmacia, Suecia, California. Los geles de
poliacrilamida al 10-20% y al 4-20%
premoldeados, todos los tampones y disoluciones para correr geles,
los estándares preteñidos con SeeBlue, los estándares
multicoloreados multimarca y las membranas de transferencia de PVDF
se obtuvieron a partir de Novex, San Diego, California. Los kits de
tinción con plata SDS-PAGE se obtuvieron de Daiichi
Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japón. La disolución de
tinción de Coomasie se obtuvo de BioRad laboratorios, Hércules,
California. Los filtros de jeringuilla Acrodisc® PF 0,2 m se
obtuvieron de Pall Gelman Sciences, Ann. Arbor, Michigan. Los
filtros de jeringuilla disponibles de 25 mm GD/X se obtuvieron a
partir de BioDesign Inc. Od Nueva York, Carmal Nueva York. Los
reactivos de ensayo de proteína BCA y la funda de diálisis Snake
Skin de 3.500 MWCO se obtuvieron a partir de Pierce Chemical Co.,
Rockford, Ilinois.
La pasta celular se descongeló a temperatura
ambiente durante 30-60 minutos. Tras la disrupción
de la pasta celular, el extracto se fraccionó con PBS enfriado con
hielo que contenía tritón X-114 al 1%.
Los restos celulares se eliminaron, el extracto
se calentó a 37ºC y las fases se fraccionaron mediante
centrifugación.
La fracción de interés se hizo pasar después a
través de una resina de flujo rápido de sefarosa quelada con níquel
equilibrada en PBS (pH 7,5) que contiene glicerol al 19% y tritón
X100 al 0,05%. La proteína se eluyó en el mismo tampón que contiene
200 mM de imidazol. La fracción que contiene la proteína eluída se
diluyó con 4 volúmenes de tampón tris 50 mM (pH 7,5) conteniendo
EDTA 2 mM, cloruro de sodio 10 mM y tritón X100 al 0,05% y se corrió
a través de una resina DEAE-sefarosa FF. El flujo a
través de ella se recogió y concentró en una celdilla de agitación
aislante de 3 KDa, después se dializó frente a PBS (pH 7,4)
conteniendo tritón X100 al 0,1%.
Como se muestra en la figura 1-A,
la proteína BASB120 purificada apareció en el análisis de
SDS-PAGE como una banda principal que migra a
alrededor de 30 kDa (masa molecular relativa estimada). La pureza se
estimó en más del 90%. La banda de la proteína BASB120 fue reactiva
frente a un anticuerpo monoclonal de ratón estimulado contra el
resto 6-histidina (figura 1-B).
La proteína recombinante purificada BASB120 se
redisolvió en geles de poliacrilamida al 4-20% y se
transfirió electroforéticamente a membranas PVDF a 100 V durante 1
hora como se describe previamente (Thebaine y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76: 4350-4354). Las membranas PVDF se
pretrataron después con 25 ml de disolución salina tamponada con
fosfato de Dulbecco que contiene 5% de leche desnatada seca. Todas
las incubaciones subsiguientes se llevaron a cabo usando este tampón
de pretratamiento.
Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de
una dilución 1:500 de suero preinmune o inmune o un suero inmune
anti-His durante 1 hora a temperatura ambiente. Las
membranas PVDF se lavaron después dos veces con tampón de lavado (20
mM de tampón tris, pH 7,5, que contiene cloruro de sodio 150 mM y
tween-20 al 0,05%). Las membranas PVDF se lavaron
después dos veces con tampón de lavado (tampón tris 20 mM, pH 7,5,
que contienen cloruro de sodio a 150 mM y tween 20 al 0,05%). Las
membranas PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG
de cabra antirratón o anticonejo marcada con peroxidasa (Jackson
Immunoresearch Laboratories, West Grove. PA) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Las membranas PVDF se lavaron después 4 veces
con tampón de lavado, y se desarrollaron con
3-amino-9-etilcarbazol
y peróxido de urea como se suministraron por Zymed (San Francisco,
CA) durante 10 minutos cada una.
Los antisueros polivalentes dirigidos contra la
proteína BASB120 se generaron vacunando dos conejos con la proteína
purificada recombinante BASB120. A cada animal se dieron un total de
tres inmunizaciones subcutáneamente de aproximadamente 10 \mug de
proteína BASB120 por inyección con aproximadamente un intervalo de
21 días. Los animales se sangraron antes de la primera inmunización
("pre-sangrado") y en los días 49 y 56.
Los antisueros polivalentes dirigidos contra la
proteína BASB120 se generaron también vacunado seis ratones con la
proteína purificada recombinante BASB120. A cada animal se dieron un
total de tres inmunizaciones subcutáneamente de aproximadamente 10
\mug de proteína BASB120 por inyección con aproximadamente un
intervalo de 14 días. Los animales se sangraron antes de la primera
inmunización ("pre-sangrado") y una semana
después de la última inmunización.
Las valoraciones de la proteína
anti-BASB120 se midieron mediante un ELISA usando
proteína BASB120 purificada recombinante (4 \mug/pocillo). La
valoración se define como valoraciones del punto medio calculadas
mediante un modelo logístico de 4 parámetros usando el software de
ajuste XL. Los títulos obtenidos tras la inmunización fueron 1:9800
y 1:27800 para los sueros de conejos y ratones, respectivamente. Los
antisueros se usaron como el primer anticuerpo para identificar la
proteína en una prueba de bandas de western. La prueba de bandas de
western muestra la presencia de un anticuerpo
anti-BASB120 en los sueros de animales inmunizados
(figuras 2a y 2b, vías indicadas mediante una flecha).
Las valoraciones de proteína
anti-BASB120 se determinan mediante un ELISA usando
células completas de Moraxella catarrhalis matadas con
formalina. La valoración se define como valoraciones de punto medio
calculadas mediante modelo lógicos de 4 parámetros usando el
software de ajuste XL.
La valoración observada con los sueros inmunes de
conejo o ratón demuestra que la proteína BASB120 está presente en la
superficie de las células de M. catarrhalis.
Diversas cepas de M. catarrhalis que
incluyen la ATCC 43617, igual que aislados clínicos de diversas
regiones geográficas, se dejan crecer en placas de agar Muller
Hinton durante 24 horas a 36ºC. Se usan diversas colonias para
inocular caldo. Los cultivos se dejaron crecer hasta que el A620 es
aproximadamente 0,6 y las células se recogieron mediante
centrifugación. Las células se concentraron y solubilizaron después
en el tampón de ensayo PAGE. Las células solubilizadas se
disolvieron después en geles de poliacrilamida al
4-20% y las proteínas separadas se transfirieron
electroforéticamente a las membranas PVDF. Las membranas PVDF se
pretrataron después con tampón de saturación. Todas las incubaciones
subsiguientes se llevaron a cabo usando este tampón de
pretratamiento.
Las membranas de PVDF se incubaron con suero
preinmune o suero inmune de conejo o de ratón. Se lavaron las
membranas PVDF.
Las membranas PVDF se incubaron con Ig antirratón
o anticonejo de oveja marcada con biotina. Las membranas PVDF se
lavaron después tres veces con tampón de lavado, y se incubaron con
estreptavidina-peroxidasa. Las membranas PDF se
lavaron después 3 veces con tampón de lavado y se desarrollaron con
4-cloro-1-naftol.
La detección de una proteína que corresponde a un
peso molecular esperado de BASB120 que es reactivaron los
antisueros se usa para demostrar que esta proteína se produce por y
se conserva en todas las cepas probadas de Moraxella.
La actividad citotóxica mediada por complemento
de los anticuerpos anti-BASB120 se examina para
determinar el potencial de vacuna de la proteína antisuero BASB120
que se prepara como se describe anteriormente. Se examinan las
actividades del suero preinmune y el antisuero
anti-BASB120 en mediar la matanza por el complemento
de M. catarrhalis. Las cepas de M. catarrhalis se
dejan crecer en placas. Diversas colonias se añaden al medio
líquido. Los cultivos de dejan crecer y se recogen hasta que la A260
es aproximadamente 0,4. Después de una etapa de lavado, el sedimento
se pone en suspensión y se diluye.
Los sueros preinmunes y los sueros
anti-BASB120 se depositan dentro del primer pocillo
de una placa de 96 pocillos y las diluciones seriadas se depositan
en los otros pocillos de la misma línea. La M. catarrhalis
diluida in vivo se añadió subsiguientemente y la mezcla se
incubó. Se añadió complemento en cada pocillo a una disolución de
trabajo diferente por adelantado en un ensayo de toxicidad. Cada
prueba incluye un control de complemento (pocillos sin suero
conteniendo fuente de complemento activa o inactivada), un control
positivo (pocillos que contienen suero con una valoración conocida
de anticuerpos bactericidas), un control de cultivo (pocillos sin
suero ni complemento) y un control de suero (pocillos sin
complemento).
Se midió la actividad bactericida de antisuero de
conejo o ratón (50% de matanza de la cepa homóloga).
El análisis de bandas de western de BASB120
recombinante purificada se lleva a cabo como se describe en el
ejemplo 7 anterior, excepto que se usó una reserva de sueros humanos
de niños infectados con M. catarrhalis como la primera
preparación de anticuerpos. Ésta se usó para mostrar que los
antisueros de individuos infectados de forma natural reaccionan
frente a la proteína purificada recombinante.
Este modelo de ratón se basa en el análisis de la
invasión del pulmón por M. catarrhalis seguido de una prueba
estándar intranasal a ratones vacunados.
Grupos de ratones se inmunizaron con vacuna
BASB120. Después del amplificador, los ratones se probaron mediante
instilación de suspensión bacteriana dentro del orificio nasal bajo
anestesia. Los ratones se mataron entre 30 minutos y 24 horas
después de la prueba y los pulmones se eliminaron asépticamente y se
homogeneizaron individualmente. El logaritmo decimal de la media
ponderada del número de CFU/pulmón se determina contando las
colonias crecidas en placas de agar después del plaqueado de las
diluciones del homogenado. La media aritmética del logaritmo decimal
de la media ponderada del número de CFU/pulmón y las desviaciones
estándar se calcularon para cada grupo. Los resultados se analizaron
estadísticamente.
En estos grupos experimentales de ratones se
inmunizaron bien con BASB120 o bien con una preparación de células
completas matadas (kwc) de M. catarrhalis o se inmunizaron
simuladamente.
Esto se usó para mostrar que la preparación kwc y
la vacuna BASB120 inducen limpieza significativa del pulmón en
comparación con el grupo control.
Este ensayo mide la capacidad de antisueros
anti-BASB120 para inhibir la adhesión de bacterias
de Moraxella a células epiteliales. Esta actividad pudo
prevenir la colonización de f.i. la nasofaringe mediante
Moraxella.
Un volumen de bacterias se incubaron sobre hielo
con un volumen de dilución en suero preinmune o inmune
anti-BASB120. Esta mezcla se añade subsiguientemente
en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contiene un cultivo
de células confluentes que se lavó una vez con medio de cultivo para
eliminar los rastros de antibiótico. La placa se centrifugó e
incubó.
Cada pocillo se lavó con cuidado. Después del
último lavado, se añadió glicocolato de sodio a los pocillos.
Después de la incubación, la capa de células se recoge mediante
raspado y se homogeniza. Las diluciones del homogenado se plaquean
en placas de agar y se incuban. Se contó el número de colonias en
cada placa y se calculó el número de bacterias presentes en cada
pocillo.
Esto se usó para mostrar que las bacterias
incubadas con antisuero anti-BASB120 se inhiben en
su capacidad de adherencia a las células Hep-2.
Un depósito que contiene una cepa Catlin de
Moraxella catarrhalis se ha depositado en la American Type
Culture Collection (en el presente documento "ATCC") el 21 de
junio de 1997, y se le asignó número de depósito 43617. El depósito
se describió como Banhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y
es una biblioteca de insertos de 1,5-2,9 kb, secada
en frío, construida a partir de un aislado de M. catarrhalis
obtenido a partir de un aspirado transtraqueal de un minero del
carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en
Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506-508
(1982).
El depósito de la cepa de Moraxella
catarrhalis se refiere en el presente documento como "la cepa
depositada" o como "el DNA de la cepa depositada".
La cepa depositada contiene un gen BASB120 en su
entera longitud.
Un depósito de un vector
pMC-ORF1/2 que consiste en DNA de Moraxella
catarrhalis insertado en pQE30 se ha depositado en la American
Type Culture Collection (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y se le
asignó número de depósito 207118.
La secuencia de los polinucleótidos contenidos en
la cepa/clon depositado, igual que la secuencia de aminoácidos de
cualquier polipéptido codificado de este modo, se controlan en el
caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias
en el presente documento.
El depósito de las cepas depositadas se ha hecho
bajo los términos del tratado de Budapest en el Internacional
Recognition of the Deposito f Micro-organisms for
Purposes of Patent Procedure. Las cepas depositadas serán
irrevocablemente y sin restricción o condición expuestas libremente
al público en la expedición de una patente. Las cepas depositadas se
proporcionan meramente como conveniencia para los expertos en la
técnica y no son una admisión de que se requiera un depósito para la
capacitación, tal como se requiere a tenor del 35 U.S.C. \oint
112.
\newpage
Secuencias del polinucleótido y polipéptido
BASB120
SEQ ID Nº.: 1
Secuencia del polinucleótido BASB120 de la cepa
ATCC43617 de Moraxella catarrhalis
SEQ ID Nº.: 2
Secuencia del polipéptido BASB120 deducida del
polinucleótido de la SEQ ID Nº.: 1
SEQ ID Nº.: 3
AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAA AAT TTT AAT CAA TAC
TTT A
SEQ ID Nº.: 4
AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG
TAG CTT ATT
TTT TGG TAA GAC ATG
<110> SmithKline Beecham Biologicals
S.A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Compuestos Novedosos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BM45411
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 753
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggcagaggg aattcatgaa aaattttaat caatacttta
\hfill40
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggcagaggg tcgacttaat ggtgatggtg atggtgtagc ttattttttg gtaagacatg
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 85% de identidad
con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la
longitud entera de SEQ ID Nº.: 2.
2. Un polipéptido aislado según se reivindica en
la reivindicación 1 en el cual la secuencia de aminoácidos tiene al
menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2.
3. El polipéptido que se reivindica en la
reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
Nº.: 2.
4. Un polipéptido aislado que consta de SEQ ID
Nº.: 2.
5. Un fragmento inmunogénico del polipéptido
según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
fragmento el cual (si es necesario cuando se acopla en un
transportador) es capaz de estimular una respuesta inmune la cual
reconoce el polipéptido de la SEQ ID Nº.: 2.
6. Un polipéptido o un fragmento inmunogénico
según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en
el que dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico es parte de
una proteína de fusión mayor.
7. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido o un fragmento inmunogénico como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al
menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2; o una
secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido
aislado.
9. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia nucleotídica que tiene al menos un 85% de identidad con la
secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID
Nº.: 2 a lo largo de la región codificante entera; o una secuencia
de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.
10. Un polinucleótido aislado el cual comprende
una secuencia nucleotídica la cual tiene al menos un 85% de
identidad con aquella de SEQ ID Nº.: 1 a lo largo de la longitud
completa de SEQ ID Nº.: 1; o una secuencia de nucleótidos
complementaria a dicho polinucleótido aislado.
11. El polinucleótido aislado según se reivindica
en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en el cual la
identidad es al menos el 95% de la SEQ ID Nº.: 1.
12. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID
Nº.: 2, o el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5 ó 6.
13. Un polinucleótido aislado que comprende el
polinucleótido de SEQ ID Nº: 1.
14. Un polinucleótido aislado de acuerdo a la
reivindicación 12 obtenible rastreando una biblioteca apropiada bajo
condiciones restrictivas de hibridación con una sonda etiquetada que
tiene la secuencia de SEQ ID Nº: 1 o un fragmento de la misma.
15. Un vector de expresión o un microorganismo
vivo recombinante que comprende un polinucleótido aislado de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 7-14.
16. Una célula hospedadora que comprende el
vector de expresión de la reivindicación 15 o una fracción
subcelular de dicha célula hospedadora cuya fracción subcelular
comprende un péptido aislado que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos una identidad del 85% a la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de
SEQ ID Nº.: 2; o una membrana de dicha célula hospedadora, membrana
la cual comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia
de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo largo de la longitud
entera de SEQ ID Nº.: 2.
17. Un procedimiento para producir un polipéptido
o un fragmento inmunogénico de las reivindicaciones 1 a 6 que
comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 16
bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido
o dicho fragmento inmunogénico y recuperar el polipéptido o el
fragmento inmunogénico a partir del medio de cultivo.
18. Un procedimiento para expresar un
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones
7-14 que comprende transformar una célula
hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de
dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula hospedadora bajo
condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de
dichos polinucleótidos.
19. Una composición de vacuna que comprende una
cantidad efectiva del polipéptido o el fragmento inmunogénico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un transportador
farmacéuticamente aceptable.
20. Una composición de vacuna que comprende una
cantidad efectiva del polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14 y un transportador farmacéuticamente
aceptable.
21. La composición de vacuna de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 en la que dicha
composición comprende al menos un antígeno diferente de Moraxella
catarrhalis.
22. Un anticuerpo generado contra un polipéptido
que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de
identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2 a lo
largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2 o un fragmento
inmunogénico de la misma, fragmento el cual (si es necesario cuando
se acopla a un hospedador) es capaz de estimular una respuesta
inmune la cual reconoce el polipéptido de SEQ ID Nº.: 2.
23. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 22 en el que la secuencia de aminoácidos tiene al
menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
Nº.: 2 a lo largo de la longitud entera de SEQ ID Nº.: 2.
24. El anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 22 en el que el polipéptido tiene la secuencia de SEQ
ID Nº.: 2.
25. El anticuerpo de una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24 en el que el polipéptido o fragmento
inmunogénico del mismo es parte de una proteína de fusión mayor.
26. Un procedimiento de diagnosticar una
infección con Moraxella catarrhalis, que comprende
identificar un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se
reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un
anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22
a 25, presentes en una muestra biológica para aislarse a partir de
un animal sospechoso de tener una infección tal.
27. Uso de una composición que comprende una
cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido o un
fragmento inmunogénico del mismo según se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la
preparación de un medicamento para usar en generar una respuesta
inmune en un animal.
28. Uso de una composición que comprende una
cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido según se
reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones
7-14 en la preparación de un medicamento para usar
en la generación de una respuesta inmune en un animal.
29. Una composición terapéutica útil en tratar
humanos con enfermedad causada por Moraxella catarrhalis que
comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 22 a 25 y un transportador farmacéutico
adecuado.
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