ES2232144T3

ES2232144T3 - Proteinas pilq de moraxella catarrhalis.

Info

Publication number: ES2232144T3
Application number: ES99927845T
Authority: ES
Inventors: Jean-Louis Ruelle; Carlota Vinals-Bassols
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2005-05-16
Anticipated expiration: 2019-05-31
Also published as: AU4504999A; DE69921649D1; EP1082436B1; WO1999064448A2; EP1082436A2; DE69921649T2; WO1999064448A3; US6706269B1; ATE281524T1; GB9812163D0; CA2330240A1

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 8 respecto a la totalidad de las SEC Nº ID 4, 6 y 8, respectivamente.

Description

Proteínas PilQ de Moraxella catarrhalis.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos (designados en la presente memoria como "polinucleótido(s) BASB031"), a polipéptidos codificados por ellos (designados en la presente memoria como "BASB031" o "polipéptido(s) BASB031"), a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para utilizar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar la infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (denominada también Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, siendo las principales otitis media en infantes y niños, y neumonía en ancianos. Es también responsable de sinusitis, infecciones nosocomiales y menos frecuentemente de enfermedades invasivas.

La otitis media es una importante enfermedad de la infancia tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. Se registran más de 3,5 millones de casos cada año en los Estados Unidos, y se estima que un 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, J.O. (1994) Clin. Inf. Dis. 19: 823). Si se deja sin tratar, o se vuelve crónica, esta enfermedad puede conducir a pérdidas de audición que podrían ser temporales (en el caso de acumulación de fluido en el oído medio) o permanentes (si el nervio auditivo está dañado). En infantes, dichas pérdidas de audición pueden ser responsables de un aprendizaje retardado del habla.

Se aislan principalmente tres especies bacterianas del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) y M. catarrhalis. Están presentes en un 60 a un 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan ambos aproximadamente un 30%, y M. catarrhalis aproximadamente un 15% de los casos de otitis media (Murphy, T.F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Podían aislarse otras bacterias del oído medio (H. influenza tipo B, S. pyogenes, etc.), pero con una frecuencia mucho más baja (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un prerrequisito absoluto para el desarrollo de una otitis; sin embargo se requieren también otros para conducir a la enfermedad (Dickinson, D.P. et al. (1988) J. Infect. Dis., 158: 205, Faden, H.L. et al. (1991) Ann. Otorhinil. Laryngol. 100: 612). Estos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias al oído medio por las trompas de Eustaquio, seguido de la iniciación del proceso inflamatorio. Estos factores son desconocidos hasta la fecha. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmune después de una infección viral, por ejemplo, podría causar una incapacidad de controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, H.L., et al. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores medioambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que en consecuencia se vuelven susceptibles de desarrollo de otitis media debido a la presencia continuada de patógenos en el oído medio (Murphy, T.F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267).

La respuesta inmune ante M. catarrhalis está mal caracterizada. El análisis de cepas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebés seguidos desde 0 a 2 años de edad, indica que captan y eliminan frecuentemente nuevas cepas. Esto indica que está montada una respuesta inmune eficaz contra esta bacteria en los niños colonizados (Faden, H.L. et al. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

En la mayoría de los adultos ensayados, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, A.J. et al. (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad de resistir la actividad bactericida sérica: en general, los aislamientos de individuos enfermos son más resistentes que los que están simplemente colonizados (Hol, C. et al. (1993) Lancet 341: 1281, Jordan, K.L. et al. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A): 28S). La resistencia al suero podría considerarse por lo tanto como un factor de virulencia de las bacterias. Se ha observado una actividad opsonizante en los sueros de niños que se recuperan de otitis media.

Los antígenos diana para estas diferentes respuestas inmunes en seres humanos no se han identificado, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por hierro y que es reconocida por los sueros de pacientes con neumonía (Sethi, S. et al. (1995) Infect. Immun. 63: 1516) y de UspA1 y UspA2 (Chen, D. et al. (1999) Infect. Immun. 67: 1310).

Se han caracterizado otras pocas proteínas de membranas presentes en la superficie de M. catarrhalis utilizando procedimientos bioquímicos, o por su potencial implicación en la introducción de una inmunidad protectora (para revisión, véase Murphy, T.F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos creados contra algunos de ellos (UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) está altamente conservado entre cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que se ha demostrado eficaz contra esta bacteria en modelos animales.

Martin P.R. et al. "Characterization of pilQ, a new gene required for the biogenesis of type 4 fimbrial in Pseudomonas aeruginosa", Molecular Microbiology, vol. 9, nº 4, agosto de 1993, páginas 857-868, da a conocer el nucleótido pilQ y la de Pseudomonas aeruginosa.

La frecuencia de infecciones por Moraxella catarrhalis ha aumentado drásticamente en las pasadas décadas. Esto se ha atribuido a la emergencia de cepas resistentes múltiples a antibióticos y a una creciente población de gente con sistemas inmunes debilitados. Ya no es infrecuente aislar cepas de Moraxella catarrhalis que sean resistentes a algunos o a todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad médica y una demanda insatisfechas de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de examen de fármacos y ensayos de diagnóstico para este organismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB031, en particular a polipéptidos BASB031 y a polinucleótidos BASB031, a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y el tratamiento de infección por Moraxella. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas a infecciones por Moraxella catarrhalis y a afecciones asociadas con dichas infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB031.

Con más detalle, según un aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 8 respecto a la totalidad de las SEC Nº ID 4, 6 y 8, respectivamente.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido aislado de SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 8.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento inmunogénico del polipéptido de la presente invención, en el que el fragmento inmunogénico es capaz de crear una respuesta de anticuerpo (si es necesario cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce específicamente el polipéptido de SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 o SEC Nº ID 8.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC Nº ID 4, 6 ó 8 respecto a la totalidad de las SEC Nº ID 4, 6 ó 8, respectivamente; o una secuencia nucleotídica complementaria de dicho polinucleótido aislado.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 95% de identidad con una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de SEC Nº ID 4, 6 ó 8 respecto a la región de codificación completa; o una secuencia nucleotídica complementaria de dicho polinucleótido aislado.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 85% de identidad con la de las SEC Nº ID 3, 5 ó 7 respecto a la totalidad de la SEC Nº ID 3, 5 ó 7, respectivamente; o una secuencia nucleotídica complementaria de dicho polinucleótido aislado.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 8.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEC Nº ID 1, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5 o SEC Nº ID 7.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 o SEC Nº ID 8, obtenible mediante selección de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia SEC Nº ID 1, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5 o SEC Nº ID 7, o un fragmento de la misma.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión o un microorganismo vivo recombinante que comprende un polinucleótido aislado según la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la presente invención o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula hospedadora que expresa un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 o SEC Nº ID 8, o que es la SEC Nº ID 2.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la producción de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 o SEC Nº ID 8, o que es la SEC Nº ID 2, que comprende cultivar una célula hospedadora de la presente invención en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la expresión de un polinucleótido de la presente invención que comprende transformar una célula hospedadora con el vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos, y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo inmunoespecífico del polipéptido de SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8 o un fragmento inmunogénico del mismo, en el que el fragmento inmunogénico es capaz de crear una respuesta de anticuerpo (si es necesario cuando está acoplado a un portador) que reconoce específicamente el polipéptido de SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de diagnóstico de una infección por Moraxella que comprende la identificación de un polipéptido de la presente invención, o un anticuerpo que es inmunoespecífio de dicho polipéptido, presente en una muestra biológica de un animal sospechoso de tener dicha infección.

En aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o polinucleótido de la presente invención en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una infección por Moraxella.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición terapéutica útil para tratar seres humanos con una infección por Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra el polipéptido de la presente invención y un vehículo adecuado.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB031 como se describe con más detalle a continuación. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB031 de Moraxella catarrhalis, que está relacionado mediante homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de proteína de ensamblaje fimbrial PilQ de P. aeruginosa. La invención se refiere específicamente a BASB031 que tiene las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos indicadas en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7 y las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8, respectivamente. Se entiende que las secuencias enumeradas en el listado de secuencias siguiente como "ADN" representan una ejemplificación de una realización de la invención, puesto que los expertos en la técnica reconocerán que dichas secuencias pueden emplearse útilmente en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis designados en la presente memoria como "BASB031" y "polipéptidos BASB031" así como variantes biológicas, de diagnóstico, profilácticas, clínicas o terapéuticas útiles de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención proporciona adicionalmente:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos un 97-99%, con las SEC Nº ID 4, 6 ó 8, o una identidad exacta a las SEC Nº ID 2, 4, 6, o 8;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, aún más preferiblemente al menos un 97-99% con las SEC Nº ID 3, 5 ó 7, o una identidad exacta a las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7 con respecto a la totalidad de las SEC Nº ID 1, 2, 5 ó 7, respectivamente; o

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, aún más preferiblemente al menos un 97-99% con la secuencia de aminoácidos de SEC Nº ID 4, 6 ó 8, o una identidad exacta a las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8.

\vskip1.000000\baselineskip

Los polipéptidos BASB031 proporcionados en las SEC Nº ID 2, 4, 6, o 8 son los polipéptidos BASB031 de las cepas Mc2931 (ATCC 43617), Mc2911 y Mc2969 de Moraxella catarrhalis.

La invención proporciona también un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB031, es decir, una parte contigua del polipéptido BASB031 que tiene la misma actividad inmunogénica, o sustancialmente la misma, que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8; es decir, el fragmento (si es necesario cuando está acoplado a un vehículo) es capaz de crear una respuesta inmune que reconoce el polipéptido BASB031. Dicho fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB031 que carece de la secuencia líder N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de BASB031 según la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos un 97-99% de identidad con las SEC Nº ID 4, 6 ó 8 respecto a la totalidad de las SEC Nº ID 4, 6 ó 8, respectivamente.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es enteramente igual a parte pero no a toda la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB031, los fragmentos pueden ser "libres" o estar comprendidos en un polipéptido mayor del que forman una parte o región, lo más preferiblemente en forma de una región continua individual en un polipéptido individual mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8 o variantes de la misma, tales como una serie continua de restos que incluyen una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxi-terminal. Se prefieren también las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidos por o en una célula hospedadora. Se prefieren adicionalmente fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones de alfa-hélice y que forman alfa-hélice, regiones de lámina beta y que forman lámina beta, regiones de giros y que forman giros, regiones de espiral y que forman espiral, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa-anfipáticas, regiones beta-anfipáticas, regiones flexibles, regiones que forman la superficie, región de unión de sustrato y regiones de alto índice antigénico.

Los fragmentos preferidos adicionalmente incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o eliminados de la secuencia de aminoácidos de las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención pueden emplearse para producir el correspondiente polipéptido completo mediante síntesis peptídica; por lo tanto estos fragmentos pueden emplearse como intermedios para producir los polipéptidos completos de la invención.

Se prefieren particularmente variantes en las que varios aminoácidos, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 se sustituyen, eliminan o añaden en cualquier combinación.

Los polipéptidos o fragmentos inmunogénicos de la invención pueden estar en forma de la proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína mayor tal como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o líder, prosecuencias, secuencias que ayudan a la purificación tales como restos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para estabilidad durante la producción recombinante. Además, se considera también la adición de polipéptido exógeno o cola lipídica o secuencias polinucleótidicas para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede retirarse simplemente mediante la incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con el factor de coagulación sanguínea Xa.

Además, esta invención se refiere a procesos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de las mismas para examen de fármacos, diagnóstico y terapia. Un aspecto adicional de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las solicitudes de patente internacional nº WO 94/29458 y WO 94/22914.

Las proteínas pueden conjugarse químicamente o expresarse en forma de proteínas de fusión recombinantes que permiten producir niveles aumentados en un sistema de expresión en comparación con proteína no fusionada. El asociado de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos auxiliares de T (asociado de fusión inmunológico), preferiblemente epítopos auxiliares de T reconocidos por seres humanos, o ayudar a expresar la proteína (potenciador de la expresión) con rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente, el asociado de fusión será tanto un asociado de fusión inmunológico como un asociado potenciador de la expresión.

Los asociados de fusión incluyen la proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural NS1 del virus de la gripe (hemaglutinina). Es otra proteína de fusión la proteína conocida como LytA. Preferiblemente, se utiliza la porción C terminal de la molécula. LytA deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa, la LytA amidasa (codificada por el gen lytA [Gene, 43 (1986), página 265-272]), una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la cadena principal de peptidoglicano. El domino C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad por la colina o por algunos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LytA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su terminación amino [Biotechnology 10 (1992), páginas 795-798]. Es posible utilizar la porción repetida de la molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal partiendo del residuo 178, por ejemplo los residuos 188-305.

La presente invención incluye también variantes de los péptidos anteriormente citados, es decir, polipéptidos que varían de las referencias por sustituciones de aminoácidos conservativas, mediante las que se sustituye un resto por otro con características similares. Son típicas dichas sustituciones entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln y entre los restos básicos Lys y Arg; o los restos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos de origen natural aislados, polipéptidos producidos recombinantemente, polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar dichos polipéptidos son bien conocidos en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo puede ser preferible obtenerlo a partir de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención puede obtenerse también, por ejemplo, a partir de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Es un objetivo de la invención proporcionar polinucleótidos que codifiquen polipéptidos BASB031, particularmente polinucleótidos que codifiquen el polipéptido designado en la presente memoria como BASB031.

En una realización particularmente preferida de la invención, el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB031 que comprende una secuencia indicada en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7 que incluye un gen completo, o una variante del mismo.

Los polinucleótidos BASB031 proporcionados en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7 son los polinucleótidos BASB031 de las cepas Mc2931 (ATCC 43617), Mc2911 y Mc2969 de Moraxella catarrhalis.

Como aspecto adicional de la invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB031, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB031 de Moraxella catarrhalis incluyendo, por ejemplo, ARN no procesados, ARN de ribozima, ARNm, ADNc, ADN genómicos, ADN B y Z. Realizaciones adicionales de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y variantes de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen completo, que codifican un polipéptido BASB031 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8 y polinucleótidos estrechamente relacionados con el mismo y variantes del mismo.

En otra realización particularmente preferida de la invención, existe un polipéptido BASB031 de Moraxella catarrhalis que comprende o está constituido por una secuencia de aminoácidos de las SEC Nº ID 2, 4, 6, o 8 o una variante de las mismas.

Utilizando la información proporcionada en la presente memoria, tal como una secuencia polinucleotídica indicada en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7, puede obtenerse un polinucleótido de la invención que codifica el polipéptido BASB031 utilizando procedimientos de clonación y examen estándar, tales como aquellos para clonar y secuenciar fragmentos de ADN cromosómicos a partir de bacterias utilizando células de Moraxella catarrhalis Catlin como material de partida, seguido de la obtención de un clon completo. Por ejemplo, para obtener una secuencia polinucleotídica de la invención, tal como una secuencia polinucleotídica dada en las SEC Nº ID 1, 3, 5, o 7, se sondea típicamente una biblioteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella catarrhalis Catlin en E. coli o algún otro hospedador adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferiblemente de 17 unidades o más, derivado de una secuencia parcial. Los clones que portan ADN idéntico al de la sonda pueden distinguirse utilizando condiciones de hibridación rigurosas. Al secuenciar los clones individuales así identificados mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia polipeptídica o polinucleotídica original, es entonces posible extender la secuencia polinucleotídica en ambas direcciones para determinar una secuencia génica completa. Convenientemente, dicha secuenciación se realiza, por ejemplo, utilizando ADN bicatenario desnaturalizado preparado a partir de un clon de plásmido. Se describen técnicas adecuadas por Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) (véase en particular "Screening by Hibridization 1.90" y "Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70"). Puede realizarse también la secuenciación directa de ADN genómico para obtener una secuencia génica completa. Es ilustrativo de la invención que cada polinucleótido indicado en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7 se descubrió en una biblioteca de ADN derivada de Moraxella catarrhalis.

Además, cada secuencia de ADN indicada en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7 contiene un marco abierto de lectura que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de restos de aminoácidos indicados en las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8, con un peso molecular deducido que puede calcularse utilizando los valores de peso molecular de los restos de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la técnica.

El polinucleótido de SEC Nº ID 1, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que empieza en el nucleótido número 1420 de la SEC Nº ID 1, codifica el polipéptido de SEC Nº ID 2.

El polinucleótido de SEC Nº ID 3, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que empieza en el nucleótido número 1420 de la SEC Nº ID 3, codifica el polipéptido de SEC Nº ID 4.

El polinucleótido de SEC Nº ID 5, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que empieza en el nucleótido número 1420 de la SEC Nº ID 5, codifica el polipéptido de SEC Nº ID 6.

El polinucleótido de SEC Nº ID 7, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que empieza en el nucleótido número 1420 de la SEC Nº ID 7, codifica el polipéptido de SEC Nº ID 8.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o está constituido por:

(a) una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, aún más preferiblemente al menos un 97-99% con las SEC Nº ID 3, 5 ó 7, o una identidad exacta a las SEC Nº ID 1, 3, 5, o 7; o

(b) una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad, preferiblemente al menos un 90% de identidad, más preferiblemente al menos un 95% de identidad, aún más preferiblemente al menos un 97-99% con las SEC Nº ID 4, 6 ó 8, o una identidad un 100% exacta a las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8, respectivamente.

Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos, de especies distintas de Moraxella catarrhalis mediante un proceso que comprende las etapas de seleccionar de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas (por ejemplo utilizando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y una concentración de SDS de 0,1-1%) con una sonda marcada o detectable constituida por o que comprende las secuencias SEC Nº ID 1, 3, 5, o 7 o un fragmento de las mismas; y aislar un gen completo y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia polinucleotídica.

La invención proporciona una secuencia polinucleotídica idéntica a lo largo de toda su longitud a una secuencia de codificación (marco abierto de lectura) en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7. Se proporciona también por la invención una secuencia de codificación de un polipéptido maduro o un fragmento del mismo por sí misma, así como una secuencia de codificación de un polipéptido maduro o un fragmento en marco abierto de lectura con otra secuencia de codificación, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora, una secuencia pre- o pro- o preproproteína. El polinucleótido de la invención puede contener también al menos una secuencia no de codificación, incluyendo por ejemplo, pero sin limitación, al menos una secuencia 5' y 3' no de codificación, tales como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como las señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a ribosoma, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan el ARNm, intrones y señales de poliadenilación. La secuencia polinucleotídica puede comprender también una secuencia de codificación adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, puede codificar una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), o una cola peptídica HA (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984), pudiendo ser ambas útiles en la purificación de la secuencia polipeptídica fusionada con ella. Los polinucleótidos de la invención incluyen también, pero sin limitación, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión génica.

La secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido BASB031 de SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polipéptido contenida en los nucleótidos 1 a 1419 de SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7, respectivamente. Como alternativa, puede ser una secuencia que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético codifique también el polipéptido de las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se utiliza en la presente memoria abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de BASB031 de Moraxella catarrhalis que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8. La expresión abarca también polinucleótidos que incluyen una región continua individual o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrada, una secuencia de transposón integrada, o debido a la corrección de ADN o reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales que pueden contener también secuencias de codificación y/o no codificación.

La invención se refiere también a variantes de los polinucleótidos descritos en la presente memoria que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8. Los fragmentos de polinucleótidos de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos completos de la invención.

Son realizaciones particularmente preferidas adicionales polinucleótidos que codifican variantes de BASB031 que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB031 de las SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8, en los que varios, unos pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún resto de aminoácido está sustituido, modificado, eliminado y/o añadido, en cualquier combinación. Son especialmente preferidas entre éstas las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB031.

Son realizaciones preferidas adicionales de la invención polinucleótidos que son al menos un 85% idénticos a lo largo de su totalidad a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB031 que tiene una secuencia de aminoácidos indicada en las SEC Nº ID 4, 6 ó 8, y polinucleótidos que son complementarios de dichos polinucleótidos. Como alternativa, los más altamente preferidos son polinucleótidos que comprenden una región que es al menos un 90% idéntica a lo largo de su totalidad a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB031 y polinucleótidos complementarios del mismo. A este respecto, son particularmente preferidos polinucleótidos al menos un 95% idénticos a lo largo de su totalidad al mismo. Además, aquellos con al menos un 97% son altamente preferidos entre aquellos con al menos un 95%, y entre esos aquellos con al menos un 98% y al menos un 99% son particularmente altamente preferidos, siendo los más preferidos con al menos un 99%.

Son realizaciones preferidas polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función biológica o actividad que el polipéptido maduro codificado por un ADN de SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7.

Según ciertas realizaciones preferidas de esta invención, se proporcionan polinucleótidos que hibridan, particularmente en condiciones rigurosas, con secuencias polinucleotídicas BASB031, tales como los polinucleótidos en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7.

La invención se refiere también a polinucleótidos que hibridan con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en la presente memoria. A este respecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Como se utiliza en la presente memoria, "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas" significa hibridación que ocurre sólo si hay al menos un 95%, y preferiblemente al menos un 97% de identidad entre las secuencias. Es un ejemplo específico de condiciones de hibridación rigurosas la incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende: 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado del soporte de hibridación con 0,1x SSC aproximadamente a 65ºC. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ejemplifican en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor, NY, (1989), particularmente el capítulo 11 del mismo. Puede utilizarse también la hibridación en solución con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas por la invención.

La invención proporciona también un polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia polinucleotídica obtenida mediante selección de una biblioteca apropiada que contiene el gen completo de una secuencia polinucleotídica indicada en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7 en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia polinucleotídica indicada en las SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7 o un fragmento de la misma; y aislamiento de dicha secuencia polinucleotídica. Los fragmentos útiles para obtener dicho polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores descritos con detalle en otro lugar de la presente memoria.

Como se discute en otro lugar de la presente memoria respecto a los ensayos de polinucleótidos de la invención, pueden utilizarse por ejemplo los polinucleótidos de la invención en forma de una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc completos y clones genómicos que codifican BASB031 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen una alta identidad, particularmente una alta identidad de secuencia, con el gen BASB031. Dichas sondas comprenderán generalmente al menos 15 restos nucleotídicos o pares de bases. Preferiblemente, dichas sondas tendrán al menos 30 restos nucleotídicos o pares de bases y pueden tener al menos 50 restos nucleotídicos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 restos nucleotídicos o pares de bases y tendrán menos de 30 restos nucleotídicos o pares de bases.

Puede aislarse una región de codificación de un gen BASB031 mediante examen utilizando una secuencia de ADN proporcionada en las SEC Nº ID 1, 3, 5, o 7 para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Se utiliza entonces un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la del gen de la invención para examinar una biblioteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar cuáles miembros de la biblioteca hibridan con la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos por los expertos en la técnica para obtener ADN completos o extender ADN cortos, por ejemplo los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Recientes modificaciones de la técnica, ejemplificadas por ejemplo por la tecnología Marathon™ (Clontec Laboratories Inc.), han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon™, se han preparado ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y se ha ligado una secuencia "adaptadora" en cada extremo. Se lleva a cabo después una amplificación de ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "ausente" del ADN utilizando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos de gen y específicos de adaptador. La reacción PCR se repite después utilizando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para asociarse con el producto amplificado (típicamente un cebador específico de adaptador que se asocia a 3' adicional en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que se asocia a 5' adicional en la secuencia génica seleccionada). Los productos de esta reacción pueden analizarse después mediante secuenciación de ADN y construirse un ADN completo uniendo directamente el producto con el ADN existente, proporcionando una secuencia completa, o llevando a cabo PCR completas separadas utilizando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden emplearse, por ejemplo, como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos de enfermedades, particularmente de enfermedades humanas, como se discute adicionalmente en la presente memoria respecto a ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de SEC Nº ID 1-8 pueden utilizarse en los procedimientos en la presente memoria como se ha descrito, pero preferiblemente en PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en la presente memoria se transcriben o no total o parcialmente en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que dichas secuencias tendrán también utilidad en el diagnóstico de la etapa de la infección y el tipo de infección que ha alcanzado el patógeno.

La invención proporciona también polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales amino- o carboxi-terminales, o aminoácidos interiores en el polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Dichas secuencias pueden desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína desde el precursor hasta la forma madura, pueden permitir el transporte de proteína, pueden alargar o acortar la semivida de la proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in vivo, los aminoácidos adicionales pueden procesarse aparte de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario de él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios de cada polinucleótido del que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionada con una o más prosecuencias, puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las prosecuencias, generalmente se activan dichos precursores inactivos. Algunas o todas las presecuencias pueden eliminarse antes de la activación. Generalmente, dichos precursores se denominan proproteínas.

Además de las representaciones estándar de A, G, C, T/U para los nucleótidos, el término "N" puede utilizarse también para describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en dicha posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto porque se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones nucleotídicas adyacentes, al leer en el marco de lectura correcto, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematura en dicho marco de lectura.

En suma, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (que puede designarse como una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son las secuencias líder de una preproteína, o una preproproteína, que es un precursor de una proproteína que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante las etapas de procesamiento que producen forman activas y maduras del polipéptido.

Según un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención con fines terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento de suministro adecuado tal como inyección directa de ADN de plásmido en músculos (Wolff et al., Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), suministro de ADN complejado con vehículos proteicos específicos (Wu et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty & Reshef, PNAS USA (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda et al., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang et al., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) e infección in vivo utilizando vectores retrovirales clonados (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vectores, células hospedadoras, sistemas de expresión

La invención se refiere también a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, a células hospedadoras que se modifican por ingeniería genética con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Pueden emplearse también sistemas de traducción exentos de células para producir dichas proteínas utilizando ARN derivados de constructos de ADN de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención pueden prepararse mediante procesos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. En consecuencia, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células hospedadoras que se modifican mediante ingeniería genética con dichos sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, pueden modificarse mediante ingeniería genética células hospedadoras para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula hospedadora puede efectuarse mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) y Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), tales como transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por rascado, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli., Streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas tales como células de levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células de plantas tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Pueden utilizarse una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosomas, episomas y virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus tales como SV40, virus Vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia, picornavirus, retrovirus y alfavirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmido y bacteriófago, tales como cósmidos y fagémidos. Los constructos de sistema de expresión pueden contener regiones control que regulan así como generan la expresión. Generalmente, puede utilizarse a este respecto para expresión cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un hospedador. La secuencias de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas y rutinarias tales como, por ejemplo, las indicadas en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra).

En sistemas de expresión recombinante en eucariontes, para la secreción de una proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas al polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatito y cromatografía en lectina. Lo más preferiblemente, se emplea para purificación cromatografía de afinidad por metal iónico (IMAC). Pueden emplearse técnicas bien conocidas de replegamiento de proteínas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, el aislamiento y/o la purificación.

El sistema de expresión puede ser también un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o bacteria vivo recombinante. La inoculación e infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias utilizados con este fin son por ejemplo: poxvirus (por ejemplo: Vaccinia, viruela aviar, viruela del canario), alfavirus (virus Sindbis, virus del bosque Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus de la varicela zóster, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos o atenuarse de diversos modos para obtener vacunas vivas. Dichas vacunas vivas forman también parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, pronóstico, serotipado y mutación

Esta invención se refiere también al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB031 de la invención para uso como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB031 en un eucarionte, particularmente un mamífero y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico para el diagnóstico de enfermedades, la determinación de la etapa de enfermedades o la respuesta de un organismo infectado a fármacos. Los eucariontes, particularmente mamíferos y especialmente seres humanos, particularmente aquellos infectados o sospechosos de estar infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB031, pueden detectarse al nivel de ácido nucleico o aminoácido mediante una variedad de técnicas bien conocidas, así como mediante procedimientos proporcionados en la presente memoria.

Los polipéptidos y polinucleótidos para pronóstico, diagnóstico u otro análisis pueden obtenerse a partir de materiales corporales de individuos supuestamente infectados y/o infectados. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, pueden utilizarse directamente para detección o pueden amplificarse enzimáticamente utilizando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. El ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico, puede utilizarse también del mismo modo. Utilizando amplificación, puede realizarse la caracterización de la especie y cepa del organismo infeccioso o residente presente en un individuo mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las deleciones e inserciones pueden detectarse mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada a partir de un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales pueden identificarse hibridando ADN amplificado con secuencias polinucleotídicas BASB031 marcadas. Las secuencias perfecta o significativamente coincidentes pueden distinguirse de los dúplex imperfectos o más significativamente desapareados mediante digestión con ADNasa o ARNasa, para ADN o ARN respectivamente, o detectando las diferencias en las temperaturas de fusión o la cinética de renaturalización. Las diferencias en la secuencia polinucleotídica pueden detectarse también mediante alteraciones en la movilidad electroforética de los fragmentos polinucleotídicos en geles en comparación con una secuencia de referencia. Esto puede llevarse a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias polinucleotídicas pueden detectarse también mediante secuenciación directa de ADN o ARN. Véase por ejemplo Myers et al., Science, 230: 1242 (1985). Los cambios de secuencia en localizaciones específicas pueden revelarse también mediante ensayos de protección de nucleasa, tales como ARNasa, ensayo de protección V1 y S1 o un procedimiento de escisión química. Véase por ejemplo Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985).

En otra realización, puede construirse una matriz de sondas oligonucleotídicas que comprenden la secuencia nucleotídica BASB031 o fragmentos de la misma para realizar un examen eficaz, por ejemplo, de mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de tecnología de matriz son bien conocidos y tienen aplicabilidad general y pueden utilizarse para dirigirse a una serie de temas en genética molecular, incluyendo expresión génica, ligamiento genético y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee et al., Science, 274: 610 (1996)).

Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia nucleotídica de SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7, o un fragmento de la misma;

(b) una secuencia nucleotídica complementaria de la de (a);

(c) un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8 o un fragmento del mismo; o

(d) un anticuerpo contra un polipéptido de la presente invención, preferiblemente contra el polipéptido de SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8.

Se apreciará que en cualquiera de dichos kit, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Dicho kit será de uso en el diagnóstico de una enfermedad o la sensibilidad a una enfermedad, entre otros.

Esta invención se refiere también al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente de SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7, que está asociada a una enfermedad o patogenicidad, proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede añadirse a o definir un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico del transcurso de una enfermedad, una determinación de la etapa de una enfermedad o una sensibilidad a una enfermedad, que resulta de la subexpresión, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente organismos infecciosos, que portan mutaciones en dicho polinucleótido pueden detectarse al nivel de polinucleótido mediante una variedad de técnicas tales como las descritas en otro lugar de la presente memoria.

Las células de un organismo que porta mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención pueden detectarse también al nivel de polinucleótido o polipéptido mediante una variedad de técnicas, para permitir por ejemplo el serotipado. Por ejemplo, puede utilizarse RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Es particularmente preferido utilizar RT-PCR junto con sistemas de detección automatizada, tales como por ejemplo GeneScan. Pueden utilizarse también ARN, ADNc o ADN genómico con el mismo fin, la PCR. Como ejemplo, los cebadores de PCR complementarios de un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB031 pueden utilizarse para identificar y analizar mutaciones.

La invención proporciona además cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3'. Estos cebadores pueden utilizarse para, entre otras cosas, amplificar ADN y/o ARN de BASB031 aislado de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores pueden utilizarse para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo afectado, de tal modo que el polinucleótido puede someterse después a diversas técnicas para la elucidación de la secuencia polinucleotídica. De este modo, pueden detectarse mutaciones en la secuencia polinucleotídica y utilizarse para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su etapa o su transcurso, o serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención proporciona además un procedimiento para diagnosticar infecciones causadas por Moraxella catarrhalis, que comprende determinar a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un nivel aumentado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7. La expresión aumentada o reducida de un polinucleótido BASB031 puede medirse utilizando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como por ejemplo amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, transferencia Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, puede utilizarse un ensayo de diagnóstico según la invención para detectar la sobreexpresión de polipéptido BASB031 comparado con muestras de tejido control normal para detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que pueden utilizarse para determinar los niveles de un polipéptido BASB031 en una muestra derivada de un hospedador, tal como un material corporal, son bien conocidas por los expertos en la técnica. Dichos procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western, ensayos de sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse como componentes de matrices polinucleotídicas, preferiblemente matrices de alta densidad o retículas. Estas matrices de alta densidad son particularmente útiles con fines de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, puede utilizarse un conjunto de puntos que comprende cada uno un gen diferente, y que comprende además un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, para sondear, tal como utilizando hibridación o amplificación de ácido nucleico, utilizando sondas obtenidas o derivadas de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia polinucleotídica particular o secuencia relacionada en un individuo. Dicha presencia puede indicar la presencia de un patógeno de Moraxella catarrhalis y puede ser útil para diagnosticar y/o pronosticar enfermedades o el transcurso de enfermedades. Se prefiere una retícula que comprende una serie de variantes de la secuencia polinucleotídica de SEC Nº ID 1, 3, 5 ó 7. Se prefiere también aquella que comprende una serie de variantes de una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de SEC Nº ID 2, 4, 6 ó 8.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos, pueden utilizarse como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos de dichos polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB031.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención pueden obtenerse administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que portan epítopos de cualquiera o de ambos, análogos de cualquiera o de ambos o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal, preferiblemente no humano, utilizando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede utilizarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de línea celular continua. Los ejemplos incluyen varias técnicas, tales como las de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pág. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss. Inc. (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EE.UU. nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios contra polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. Además, pueden utilizarse ratones transgénicos, u otros organismos o animales tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos de los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Como alternativa, puede utilizarse la tecnología de contenido de fagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención a partir de los repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos examinados por poseer actividad anti-BASB031 o a partir de bibliotecas no expuestas (McCafferty et al., (1990) Nature 348, 552-554; Marks et al, (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos puede mejorarse también, por ejemplo, mediante transposición de cadenas (Clakson et al., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos anteriormente descritos pueden emplearse para aislar o identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.

Por tanto, entre otros, pueden emplearse anticuerpos contra polipéptidos BASB031 o polinucleótidos BASB031 para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes polipeptídicas, incluyendo variantes antigénicas, epitópicas o inmunológicas equivalentes, forman un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano, el anticuerpo puede estar lo más preferiblemente "humanizado", cuando la región o regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma se han transplantado a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo como se describe en Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 o Tempest et al. (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas y agonistas- Ensayos y moléculas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden utilizarse también para evaluar la unión de sustratos y ligandos de molécula pequeña, por ejemplo, a células, preparaciones exentas de células, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que portan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido, mediante un marcaje asociado directa o indirectamente al compuesto candidato. Como alternativa, este procedimiento de selección puede implicar la competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden ensayar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por la activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, utilizando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de activación se ensayan generalmente en presencia de un agonista conocido, y se observa el efecto sobre la activación por el agonista en presencia del compuesto candidato. Pueden emplearse péptidos constitutivamente activos y/o polipéptidos y polinucleótidos constitutivamente expresados en procedimientos de examen de agonistas inversos o inhibidores, en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, según sea el caso. Además, los procedimientos de examen pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención para formar una mezcla, medir la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB031 en la mezcla, y comparar la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB031 de la mezcla con un patrón. Pueden utilizarse también proteínas de fusión, tales como las preparadas a partir de la porción Fc y polipéptido BASB031, como se describen anteriormente en la presente memoria, para ensayos de examen de alto volumen para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como polipéptidos filogenética y/o funcionalmente relacionados (véase D. Bennett et al., J. Mol. Recognition, 8: 52-58 (1995); y K. Johanson et al., J. Biol. Chem., 270(16): 9459-9471
(1995)).

Pueden utilizarse también polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido de la presente invención para configurar procedimientos de examen para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, puede construirse un ensayo ELISA para medir niveles secretados o celulares asociados de polipéptido utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica. Esto puede utilizarse para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también denominados antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados.

La invención proporciona también un procedimiento de examen de compuestos para identificar aquellos que potencian (agonista) o bloquean (antagonista) la acción de polipéptidos o polinucleótidos BASB031, particularmente aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de examen puede implicar técnicas de alto volumen. Por ejemplo, para examinar agonistas o antagonistas, se incuba una mezcla de reacción sintética, un compartimiento celular tal como una membrana, cubierta celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de los mismos que comprende un polipéptido BASB031 y un sustrato o ligando marcado de dicho polipéptido en ausencia o en presencia de una molécula candidato que puede ser un agonista o antagonista de BASB031. La capacidad de la molécula candidato de agonizar o antagonizar el polipéptido BASB031 se refleja en una unión reducida del ligando marcado o una producción reducida del producto a partir de dicho sustrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, concretamente sin inducir los efectos del polipéptido BASB031, es más probable que sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, según el caso, que aumentan la velocidad de producción de producto a partir del sustrato, aumentan la transducción de señal o aumentan la actividad del canal químico, son agonistas. La detección de la velocidad o el nivel, según el caso, de producción de producto a partir del sustrato, de transducción de señal o de actividad de canal químico puede potenciarse utilizando un sistema informador. Los sistemas informadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen, pero sin limitación, sustrato colorimétrico marcado convertido en producto, un gen informador que es sensible a cambios en la actividad del polinucleótido o polipéptido BASB031, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo de agonistas de BASB031 es un ensayo competitivo que combina BASB031 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB031, moléculas de unión a BASB031 recombinante, sustratos o ligandos naturales o miméticos de sustratos o ligandos en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. BASB031 puede marcarse, tal como mediante radiactividad o un compuesto colorimétrico, de tal modo que el número de moléculas de BASB031 unidas a una molécula de unión o convertidas en producto puede determinarse exactamente para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y antibióticos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención e inhiben o anulan así su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales pueden ser también moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo estrechamente relacionados que se unen a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB031, evitando así la acción o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB031 al excluir a polipéptidos y/o polinucleótidos BASB031 de la unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido, evitando así la unión a moléculas de unión celular, de tal modo que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitación, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas de tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas sin sentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados y variantes de BASB031.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y varias porciones de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente mediante la incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con el factor de coagulación sanguínea Xa. Además, esta invención se refiere a procesos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso de las mismas para examen de fármacos, diagnóstico y terapia. Un aspecto adicional de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las solicitudes internacionales de patente nº WO 94/29458 y WO 94/22914.

Cada una de las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en la presente memoria puede utilizarse en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras la expresión, puede utilizarse como diana para el examen de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, pueden utilizarse secuencias polinucleotídicas que codifican las regiones amino-terminales de la proteína codificada o secuencias Shine-Dalgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del ARNm respectivo para construir secuencias sin sentido para controlar la expresión de la secuencia de codificación de interés.

La invención proporciona también el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un hospedador eucariótico, preferiblemente mamífero, responsable de las secuelas de la infección. En particular, las moléculas de la invención pueden utilizarse: en la prevención de la adhesión de bacterias, en particular bacterias Gram positivas y/o Gram negativas, a proteínas de matriz extracelular eucarióticas, preferiblemente de mamífero o a dispositivos internos o a proteínas de matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de matriz extracelular eucarióticas, preferiblemente de mamífero, y proteínas BASB031 bacterianas que median la lesión de tejido; y/o para bloquear la progresión normal de la patogénesis en infecciones iniciadas de otro modo que mediante la implantación de dispositivos internos o mediante otras técnicas quirúrgicas.

Según aún otro aspecto de la invención, se proporcionan agonistas y antagonistas de BSAB031, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención pueden emplearse, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es una secuencia peptídica suficientemente similar al péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que puede ser reconocida por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o puede crear anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando está acoplado a un portador adecuado.

Los mimotopos peptídicos pueden diseñarse para un fin particular mediante la adición, deleción o sustitución de aminoácidos seleccionados. Por tanto, los péptidos pueden modificase con fines de facilidad de conjugación con un portador proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además, puede ser deseable para los péptidos conjugados con un portador proteico incluir una terminación hidrófoba distal de la terminación conjugada del péptido, de tal modo que el extremo libre no conjugado del péptido permanece asociado a la superficie de la proteína portadora. Así, se presenta el péptido en una conformación que se parece lo más estrechamente a la del péptido como se encuentra en el contexto de la molécula nativa entera. Por ejemplo, los péptidos pueden alterarse para tener una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-terminal. Como alternativa, puede realizarse la adición o sustitución de una forma D-estereoisomérica de uno o más de los aminoácidos para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para potenciar la estabilidad del péptido.

Como alternativa, pueden identificarse mimotopos peptídicos utilizando anticuerpos que son capaces de unirse por sí mismos a los polipéptidos de la presente invención utilizando técnicas tales como la tecnología de contenido de fagos (documento EP 0552267B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces de unirse a anticuerpos anti-péptido nativo, pero pueden no compartir necesariamente una homología de secuencia significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres humanos, que comprende inocular al individuo polinucleótido y/o polipéptido BASB031, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir una respuesta inmune de anticuerpo y/o célula T para proteger a dicho individuo de la infección, particularmente de infección bacteriana y lo más particularmente de infección por Moraxella catarrhalis. Se proporcionan también procedimientos mediante los que dicha respuesta inmunológica retarda la replicación bacteriana. Aún otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de inducción de respuesta inmunológica en un individuo que comprende suministrar a dicho individuo un vector de ácido nucleico, secuencia o ribozima para expresión directa de un polinucleótido y/o polipéptido BASB03, o un fragmento o una variante del mismo, in vivo para inducir una respuesta inmunológica tal como para producir una respuesta inmune de anticuerpo y/o célula T, incluyendo por ejemplo células T productoras de citocina o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de la enfermedad, tanto si la enfermedad está ya establecida en el individuo como si no. Es un ejemplo de administración del gen su aceleración en las células deseadas en forma de un recubrimiento sobre partículas o de otro modo. Dicho vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido ADN/ARN, un complejo de ADN-proteína o un complejo de ARN-proteína.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, capaz de tener inducida una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en dicho individuo contra un polinucleótido y/o polipéptido BASB031 codificado por el mismo, comprendiendo la composición un polinucleótido y/o polipéptido BASB031 recombinante codificado por el mismo y/o comprendiendo ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB031, un polipéptido codificado por el mismo u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede utilizarse terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpo y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de células CTL o T CD4+.

Un polipéptido BASB031 o un fragmento del mismo puede condensarse con una coproteína o resto químico que puede producir o no por sí mismo anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras. Por tanto, la proteína recombinante fusionada comprende preferiblemente además una coproteína antigénica, tal como lipoproteína D de Haemophilus influenzae, glutation-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubilice la proteína y facilite la producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar como coadyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La coproteína puede unirse a la terminación amino o carboxi de la primera proteína.

Se proporcionan por esta invención composiciones, particularmente composiciones de vacuna, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, y secuencias de ADN inmunoestimulatorias, tales como las descritas por Sato, Y. et al., Science 273: 352 (1996).

También se proporcionan en esta invención procedimientos que utilizan el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, que se ha mostrado que codifican regiones no variables de proteínas de superficie celular bacteriana en constructos polinucleotídicos utilizados en dichos experimentos de inmunización genética en modelos de infección animal con Moraxella catarrhalis. Dichos experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopos de proteína capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que este enfoque permitirá la posterior preparación de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados de los órganos necesarios del animal que resistan o eliminen exitosamente la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección por Moraxella catarrhalis en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención incluye también una formulación de vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puesto que los polipéptidos y polinucleótidos pueden degradarse en el estómago, se administra cada uno preferiblemente por vía parenteral, incluyendo por ejemplo la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estéril acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que vuelven la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse como envases monodosis o multidosis, por ejemplo ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en estado liofilizado que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso.

La formulación de vacuna de la invención puede incluir también sistemas coadyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente, el sistema coadyuvante crea preferiblemente un tipo TH1 de respuesta.

Una respuesta inmune puede distinguirse ampliamente en dos categorías extremas, siendo una respuesta inmune humoral o mediada por célula (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos de protección efectores por anticuerpos y células, respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por célula) y respuestas de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes de tipo TH1 extremo pueden caracterizarse por la generación de linfocitos T citotóxicos de haplotipo limitado específicos de antígeno, y respuestas celulares de células asesinas naturales. En ratones, las respuestas de tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos de subtipo IgG2a, mientras que en el ser humano éstas corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplia gama de isotipos de inmunoglobulina, incluyendo en ratones IgG1, IgA e IgM.

Puede considerarse que la fuerza impulsora detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citocinas. Altos niveles de citocinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por célula contra el antígeno dado, mientras que altos niveles de citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes de tipo humoral contra el antígeno.

La distinción de respuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmune que puede describirse como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de lo descrito en clones de células T CD4+ ve por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) "TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties", Annual Review of Immunology, 7, pág. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 están asociadas a la producción de las citocinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas a menudo asociadas directamente a la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no se producen mediante células T, tales como IL-12. En contraposición, las respuestas de tipo TH2 están asociadas a la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Es conocido que ciertos coadyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citocina de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluyen la producción de citocinas TH1 o TH2 mediante linfocitos T in vitro después de la reestimulación con antígeno, y/o la medida de la relación IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpo específicas de antígeno.

Por tanto, un coadyuvante de tipo TH1 es aquel que estimula preferiblemente poblaciones de células T aisladas a producir altos niveles de citocinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con antígeno in vitro, y que promueve el desarrollo tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuestas de inmunoglobulina específicas de antígeno asociadas a isotipo de tipo TH1.

Se describen coadyuvantes que son capaces de estimulación preferida de la respuesta celular TH1 en las solicitudes internacionales de patente nº WO 94/00153 y WO 95/17209.

El monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) es uno de dichos coadyuvantes. Éste es conocido a partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente, es una mezcla de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y se fabrica por Ribi Immunochem, Montana. Se da a conocer una forma preferida de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado en la patente europea 0689454B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para esterilizarse por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros (patente europea número 0689454). El 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug-100 \mug, preferiblemente de 25-50 \mug por dosis, estando el antígeno típicamente presente en un intervalo de 2-50 \mug por dosis.

Otro coadyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, éste puede mezclarse con monofosforil-lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se da a conocer en la patente de EE.UU. nº 5.057.540.

Se han descrito anteriormente formulaciones coadyuvantes no reactogénicas que contienen QS21 (documento WO 96/33739). Dichas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han mostrado ser exitosos coadyuvantes estimulantes de TH1 cuando se formulan conjuntamente con un antígeno.

Los coadyuvantes adicionales que son estimulantes preferidos de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se dan a conocer en el documento WO 96/02555.

Las combinaciones de diferentes coadyuvantes estimulantes de TH1, tales como los citados anteriormente en la presente memoria, están también contempladas por proporcionar un coadyuvante que es un estimulante preferido de respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 puede formularse conjuntamente con 3D-MPL. La relación de QS21:3D-MPL será típicamente del orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente de 1:5 a 5:1, y a menudo sustancialmente de 1:1. El intervalo preferido de sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.

Preferiblemente, está también presente un vehículo en la composición de vacuna según la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna según la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en dicha emulsión. Adicionalmente, la emulsión de aceite en agua puede contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente, para administración humana estarán presentes QS21 y 3D-MPL en una vacuna en el intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal como de 10-100 \mug, preferiblemente de 10 \mug-50 \mug por dosis. Típicamente, el aceite en agua comprenderá de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10% de alfa-tocoferol y de 0,3 a 3% de Tween 80. Preferiblemente, la relación de escualeno:alfa-tocoferol es igual o menor a 1, ya que esto proporciona una emulsión más estable. El Span 85 puede estar también presente a un nivel de un 1%. En algunos casos, puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizante.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas contienen preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo escualano o escualeno y un emulsionante, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato.

Se describe una formulación coadyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua en el documento WO 95/17210.

La presente invención proporciona también una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígeno, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y afecciones relacionadas. Dicha composición de vacuna polivalente puede incluir un coadyuvante inductor de TH1 como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB031, ha de entenderse que esto cubre fragmentos de polipéptidos y polinucleótidos de origen natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares, con adiciones, deleciones o sustituciones que no afecten sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido BASB031 y/o un polipéptido BASB031 para administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención se refiere también a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido discutido en la presente memoria o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para administración a un individuo. Dichas composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo al medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe ajustarse al modo de administración. La invención se refiere además a paquetes y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más envases llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones anteriormente citadas de la invención.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención pueden emplearse solos o en combinación con otros compuestos, tal como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en cualquier manera eficaz y conveniente incluyendo, por ejemplo, administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras.

En terapia o profilácticamente, el agente activo puede administrarse a un individuo en forma de una composición inyectable, por ejemplo en forma de una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, un compuesto peptídico o molécula pequeña agonista o antagonista, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos incluyen, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La invención se refiere además a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más envases llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones anteriormente citadas de la invención. Pueden emplearse polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención solos o en combinación con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo una vía sistémica u oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente inyección intravenosa. Pueden utilizarse otras vías de inyección, tales como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Los medios alternativos de administración sistémica incluyen administración transmucosa y transdérmica utilizando penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o encapsulada, puede ser también posible la administración oral. La administración de estos compuestos puede ser también tópica y/o localizada, en forma de pomadas, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para administración a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diario del agente activo sea de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente de aproximadamente 1 mg/kg. El médico determinará en cualquier caso la dosificación real que será la más adecuada para un individuo, y variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso promedio. Puede haber, por supuesto, casos individuales en los que se necesiten intervalos de dosificación mayores o menores.

El intervalo de dosificación necesario depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la afección del sujeto y el criterio del médico a cargo. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse coadyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmune. Es una dosis unitaria adecuada para vacunación de 0,5-5 \mugn de antígeno/kg, y dicha dosis se administra preferiblemente en 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observarán efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención que impedirían su administración a individuos adecuados.

Han de esperarse amplias variaciones en la dosificación necesaria, sin embargo, a la vista de la variedad de compuestos disponibles y a las diferentes eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, la administración oral sería de esperar que requiriera dosificaciones mayores que la administración mediante inyección intravenosa. Pueden ajustarse variaciones en estos niveles de dosificación utilizando rutinas empíricas estándar para optimización, como es bien entendido en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas forman una valiosa fuente de información con la que determinar sus estructuras bi- y tridimensionales, así como para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estos enfoques se facilitan en gran medida almacenando la secuencia en un medio de lectura informática y utilizando después los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para buscar en una base de datos de secuencias utilizando herramientas de búsqueda bien conocidas, tales como el paquete informático GCG.

Se proporcionan también por la invención procedimientos para el análisis de secuencias o conjuntos de caracteres, particularmente secuencias genéticas o secuencias proteicas codificadas. Los procedimientos de análisis de secuencia preferidos incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencia tales como análisis de identidad y similitud, análisis de estructura de ADN, ARN y proteína, ensamblaje de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencia, determinación del marco abierto de lectura, reconocimiento de bases de ácido nucleico, análisis del uso de codón, compensación de bases de ácido nucleico y análisis del pico de cromatograma de secuenciación.

Se proporciona un procedimiento basado en la informática para realizar la identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio de lectura informática; y comparar dicha primera secuencia polinucleotídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar la homología.

Se proporciona también un procedimiento basado en la informática para realizar la identificación de homología, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: proporcionar una primera secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio de lectura informática; y comparar dicha primera secuencia polipeptídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar la homología.

Todas las publicaciones y referencias, incluyendo pero sin limitación patentes y solicitudes de patente, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la misma como referencia en su totalidad como si estuviera específica e individualmente indicado que cada publicación o referencia individual se incorpora como referencia a la presente memoria como si se hubiese expuesto en su totalidad. Cualquier solicitud de patente de la que reivindique prioridad esta solicitud se incorpora también como referencia a la presente memoria en su totalidad de la manera descrita anteriormente para publicaciones y referencias.

Definiciones

"Identidad", como es conocido en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, según sea el caso, determinada comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, determinado por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente mediante procedimientos conocidos, incluyendo pero sin limitación los descritos en ("Computational Molecular Biology", Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; "Biocomputing: Informatics and Genome Projects", Smith, D.W., ed. Academic Press, Nueva York, 1993; "Computer Analysis of Sequence Data", parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; "Sequence Analysis in Molecular Biology", von Heine, G., Academic Press, 1987; y "Sequence Analysis Primer", Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991: y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM, J. Applied. Math. 48: 1073 (1988). Los procedimientos para determinar la identidad se diseñan para dar la coincidencia más larga entre las secuencias ensayadas. Además, se codifican procedimientos para determinar la identidad en programas informáticos públicamente disponibles. Los procedimientos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)); BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988). La familia BLAST de programas está públicamente disponible en NCBI y otras fuentes ("BLAST Manual", Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El bien conocido algoritmo Smith Waterman puede utilizarse también para determinar la identidad.

Los parámetros para comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992).

Penalización por hueco: 8.

Penalización por longitud de hueco: 2.

Está públicamente disponible un programa útil con estos parámetros como el programa "Gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente citados son los parámetros por defecto de comparaciones peptídicas (además de sin penalización por huecos terminales).

Los parámetros para comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).

Matriz de comparación: coincidencias: +10, desapareamientos: 0.

Penalización por hueco: 50.

Penalización por longitud de hueco: 3.

Disponible como: El programa "Gap" de Genetics Computer Group, Madison, WI. Estos son los parámetros por defecto para comparaciones de ácidos nucleicos.

Se proporciona un significado preferido para "identidad" de polinucleótidos y polipéptidos, según sea el caso, en (1) y (2) a continuación.

(1) Las realizaciones de polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad con la secuencia de referencia SEC Nº ID 1, pudiendo ser dicha secuencia polinucleotídica idéntica a la secuencia de referencia SEC Nº ID 1 o pudiendo incluir hasta un cierto número entero de alteraciones nucleotídicas en comparación con la secuencia de referencia, seleccionándose dichas alteraciones del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución incluyendo transición y transversión, o inserción nucleotídica, y pudiendo aparecer dichas alteraciones en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia nucleotídica de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia, y estando determinado dicho número de alteraciones nucleotídicas multiplicando el número total de nucleótidos de la SEC Nº ID 1 por el número entero que define la identidad porcentual dividido entre 100, y restando después ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC Nº ID 1, o:

n_{n}\leq x_{n}-(x_{n}\cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones nucleotídicas, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEC Nº ID 1, y es 0,50 para un 50%, 0,60 para un 60%, 0,70 para un 70%, 0,80 para un 80%, 0,85 para un 85%, 0,90 para un 90%, 0,95 para un 95%, 0,97 para un 97% o 1,00 para un 1,00% y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea al número entero más cercano antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de SEC Nº ID 2 pueden crear mutaciones sin sentido, sin sentido invertidas o con desplazamiento de marco en esta secuencia de codificación, y alterar así el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia polinucleotídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia SEC Nº ID 1, es decir, puede ser un 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácido nucleico en comparación con la secuencia de referencia, de tal modo que la identidad porcentual sea menor de un 100% de identidad. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución incluyendo transición y transversión, o inserción de ácido nucleico, pudiendo aparecer dichas alteraciones en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia polinucleotídica de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácido nucleico para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEC Nº ID 1 por el número entero que define la identidad porcentual dividido entre 100, y restando después ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEC Nº ID 1, o:

n_{n}\leq x_{n}-(x_{n}\cdot y),

en la que n_{n} es el número total de alteraciones de ácido nucleico, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEC Nº ID 1, y es por ejemplo 0,70 para un 70%, 0,80 para un 80%, 0,85 para un 85%, etc., \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea al número entero más cercano antes de restarlo de x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptidos incluyen además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos una identidad de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con una secuencia polipeptídica de referencia SEC Nº ID 2, pudiendo ser dicha secuencia polipeptídica idéntica a la secuencia de referencia SEC Nº ID 2, o pudiendo incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, estando seleccionadas dichas alteraciones del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, y pudiendo aparecer dichas alteraciones en la posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia, y estando determinado dicho número de alteraciones de aminoácidos multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC Nº ID 2 por el número entero que define la identidad porcentual dividido entre 100, y restando después ese producto del número total de aminoácidos en la SEC Nº ID 2, o:

n_{a}\leq x_{a}-(x_{a}\cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEC Nº ID 2, y es 0,50 para un 50%, 0,60 para un 60%, 0,70 para un 70%, 0,80 para un 80%, 0,85 para un 85%, 0,90 para un 90%, 0,95 para un 95%, 0,97 para un 97% ó 1,00 para un 100%, y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea al número entero más cercano antes de restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia polipeptídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia SEC Nº ID 2, es decir, puede ser un 100% idéntica o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, de tal modo que la identidad porcentual sea menor de 100% de identidad. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, pudiendo aparecer dichas alteraciones en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC Nº ID 2 por el número entero que define la identidad porcentual dividido entre 100, y restando después ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEC Nº ID 2; o:

n_{a}\leq x_{a}-(x_{a}\cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEC Nº ID 2, y es por ejemplo 0,70 para un 70%, 0,80 para un 80%, 0,85 para un 85%, etc., y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea al número entero más cercano antes de restarlo de x_{a}.

"Individuo(s)", cuando se utiliza en la presente memoria con referencia a un organismo, significa un eucarionte multicelular, incluyendo pero sin limitación, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural, concretamente, si aparece en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente naturalmente en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en la presente memoria. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante, está "aislado" incluso si sigue presente en dicho organismo, pudiendo estar dicho organismo vivo o no vivo.

"Polinucleótido(s)" designa generalmente cualquier polinucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado, incluyendo regiones mono- y bicatenarias.

"Variante" designa un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero que retiene propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia polinucleotídica de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia nucleotídica de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios nucleotídicos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se discute a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas, de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones o deleciones en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede estar o no codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no es conocida por aparecer naturalmente. Las variantes de origen no natural de polinucleótidos y polipéptidos pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad causada por o relacionada con la infección por una bacteria, incluyendo por ejemplo otitis media en infantes y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de fluido en el oído medio, lesión del nervio auditivo, aprendizaje retardado del habla, infección del tracto respiratorio superior e inflamación del oído medio.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se llevan a cabo utilizando técnicas estándar que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, excepto cuando se describen de otro modo con detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Descubrimiento y secuenciación confirmatoria de ADN del gen BASB031 de Moraxella catarrhalis cepa ATCC 43617

Se descubrió en primer lugar el gen de BASB031 de SEC Nº ID 1 en la base de datos Incyte PathoSeq que contiene secuencias de ADN genómico no finalizadas de cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis (también designada como la cepa Mc2931). La traducción de la secuencia polinucleotídica BASB031, mostrada en la SEC Nº ID 2, mostró una similitud significativa (35% de identidad en una superposición de 446 aminoácidos) con la proteína PilQ de Pseudomonas aeruginosa.

La secuencia del gen BASB031 se confirmó además experimentalmente. Con este fin, se extrajo ADN genómico de 10^{10} células de Moraxella catarrhalis (cepa ATCC 43167) utilizando el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen GmbH), y se sometió 1 \mug de este material a amplificación de ADN por reacción en cadena con polimerasa utilizando cebadores E475783 (5'-AAA TTA CCC ATA TTG ACA GTC-3') [SEC Nº ID 9] y E475484 (5'-CAA ACC GTT AAA CAA TGG TC-3') [SEC Nº ID 10]. Este producto de PCR se purificó en un aparato Biorobot 9600 (Qiagen GmbH) y se sometió a secuenciación de ADN utilizando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 377/PRISM. Se realizó la secuenciación de ADN en ambas cadenas con una redundancia de 2 y se ensambló la secuencia completa utilizando software Sequencher™ (Applied Biosystems). La secuencia de ADN resultante y la secuencia polipeptídica deducida se muestran como SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 4, respectivamente. Se encontró un nucleótido en la SEC Nº ID 3 (en la posición 1254) diferente de su contrapartida en la SEC Nº ID 1, como se muestra en la Fig. 2.

Ejemplo 2 Análisis de variabilidad del gen BASB031 entre varias cepas de Moraxella catarrhalis 2A: Análisis de la longitud del fragmento de restricción (RFLP)

Se extrajo ADN genómico de 16 cepas de M. catarrhalis (presentadas en la Tabla 1) como se describe a continuación. Se inoculó en sólido M. catarrhalis en colonias individuales en placas de agar BHI, y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se recogieron 3 ó 4 colonias individuales y se utilizaron para inocular un cultivo simiente de caldo BHI (infusión de cerebro-corazón) de \sim1,5 ml, que se dejó crecer durante una noche en un incubador agitado a \sim300 rpm a 37ºC. Se inoculó un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contenía \sim150 ml de caldo BHI con el cultivo simiente y se dejó crecer durante \sim12-16 horas a 37ºC en un incubador agitado a \sim175 rpm para generar masa celular para el aislamiento de ADN. Se recogieron las células mediante centrifugación en un rotor Sorvall GSA a \sim2000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el sobrenadante y se suspendió el sedimento celular en \sim5,0 ml de agua estéril. Se añadió un volumen igual de tampón de lisis (NaCl 200 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, 0,5% (p/v) de SDS, 0,5% (p/v) de 2-mercaptoetanol y 250 \mug/ml de proteinasa K), y se suspendieron las células mediante agitación suave y trituración. Se incubó después la suspensión celular durante \sim12 horas a 50ºC para lisar las bacterias y liberar el ADN cromosómico. Se precipitó el material proteico mediante la adición de 5,0 ml de NaCl saturado (\sim6,0 M en agua estéril) y la centrifugación a \sim5.500 x g en un rotor Sorvall SS34 a temperatura ambiente. Se precipitó el ADN cromosómico del sobrenadante clarificado mediante la adición de dos volúmenes de 100% de etanol. Se recogió el ADN agregado y se lavó utilizando agitación suave con un pequeño volumen de una solución de etanol al 70%. Se suspendió el ADN cromosómico purificado en agua estéril y se dejó disolver/dispersar durante una noche a 4ºC mediante agitación suave. Se determinó la concentración de ADN disuelto espectrofotométricamente a 260 nm utilizando un coeficiente de extinción de 1,0 unidades de DO, \sim50 \mug/ml.

Se sometió a continuación este material a amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos MC-PilQ-BamF (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC GAT ACT CAT ATC GAT CAT GTG TCT GTT ACC CA-3') [SEC Nº ID 11] y MC-PiQ-SalRC (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA CTA TCT TAC CAA TTT GGG TGT AAT AAA AAT CAA AA-3') [SEC Nº ID 12]. Los correspondientes amplicones del gen BASB031 se sometieron después independientemente a hidrólisis utilizando enzimas de restricción (Sau3AI, MseI, MaeIII, NlaIII, AciI, RsaI) y se separaron los productos de restricción mediante electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida utilizando procedimientos estándar de biología molecular como se describen en "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2ª edición, Eds. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989. Las fotografías de los geles de electroforesis resultantes se presentan en la Figura 1. Para cada cepa, se evaluaron patrones de RFLP correspondientes a las 6 enzimas de restricción y se combinaron. Se definieron después grupos de cepas que compartían idéntica combinación de patrones de RFLP. Utilizando esta metodología, las cepas ensayadas en este estudio cayeron dentro de 4 grupos genómicos (grupo 1: Mc2904, Mc2905, Mc2907, Mc2908, Mc2910, Mc2911, Mc2912, Mc2926, Mc2931, Mc2956, Mc2960, Mc2969, Mc2975; grupo 2: Mc2906; grupo 3: Mc2909; grupo 4: Mc2913). Estos datos apoyan que la población de Moraxella catarrhalis utilizada en este estudio presenta una diversidad de secuencia nucleotídica limitada para el gen BASB031.

2B: Secuenciación de ADN en otras cepas

Utilizando el procedimiento experimental como se describe en el ejemplo 1, se determinó también la secuencia del gen BASB031 para otras dos cepas de Moraxella catarrhalis (Mc2911 y Mc2969). Las secuencias polinucleotídicas del gen BASB031 de las cepas Mc2911 y Mc2969 se muestran en las SEC Nº ID 5 y 7, respectivamente. Estas secuencias polinucleotídicas se tradujeron en secuencias de aminoácidos, que se muestran en las SEC Nº ID 6 y 8, respectivamente. Utilizando el programa MegAlign de paquete Lasergene de DNASTAR, se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias polinucleotídicas de SEC Nº ID 1, 3, 5 y 7, y se presenta en la Figura 2. Se resumen una comparación de identidades por parejas en la Tabla 2, mostrando que las cuatro secuencias génicas nucleotídicas de BASB031 son todas similares a un nivel de identidad mayor de un 98,0%. Utilizando el mismo programa, se realizó una alineación múltiple de las secuencias polipeptídicas de SEC Nº ID 2, 3, 6 y 8, y se presenta en la Figura 3. Se resume una comparación de identidades por parejas en la Tabla 3, mostrando que las cuatro secuencias proteicas de BASB031 son todas similares a un nivel de identidad mayor de un 99,0%.

TABLA Rasgos de las cepas de Moraxella catarrhalis utilizadas en este estudio

1

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Identidades por parejas de secuencias polinucleotídicas BASB031 (en %)

3

TABLA 3 Identidades por parejas de secuencias polipeptídicas BASB031 (en %)

4

Ejemplo 3 Construcción del plásmido para expresar BASB031 recombinante A: Clonación de BASB031

Los sitios de restricción BamHI y SalI modificados por ingeniería genética en los cebadores de amplificación directo ([SEC Nº ID 11]) e inverso complementario (SEC Nº ID 12]), respectivamente, permitieron la clonación direccional de un producto de PCR de \sim1400 pb en el plásmido de expresión de E. coli comercialmente disponible pQ30 (QiaGen, resistente a ampicilina), de tal modo que una proteína BASB031 madura pudiera expresarse en forma de una proteína de fusión que contuviera un marcador de cromatografía de afinidad His(6) en la terminación N. Se purificó el producto PCR BASB031 a partir de la reacción de amplificación utilizando columnas con centrifugación basadas en gel de sílice (QiaGen) según las instrucciones del fabricante. Para producir las terminaciones BamHI y SalI necesarias para clonación, se digirió secuencialmente el producto de PCR hasta terminación con las enzimas de restricción BamHI y SalI como recomienda el fabricante (Life Technologies). Después de la primera digestión de restricción, se purificó el producto PCR mediante columna con centrifugación como anteriormente para eliminar las sales y se eluyó con agua estéril antes de la segunda digestión enzimática. Se purificó de nuevo el fragmento de ADN digerido utilizando columnas con centrifugación basadas en gel de sílice antes del ligamiento con el plásmido
pQE30.

B: Producción del vector de expresión

Para preparar el plásmido de expresión pQE30 para ligamiento, se digirió similarmente hasta terminación tanto con BamHI como con SalI, y se trató después con fosfatasa intestinal de ternera (CIP, \sim0,02 unidades/pmol del extremo 5', Life Technologies) como indica el fabricante para evitar el autoligamiento. Se utilizó aproximadamente un exceso molar de 5 veces del fragmento digerido al vector preparado para programar la reacción de ligamiento. Se realizó una reacción de ligamiento estándar de \sim20 \mul (\sim16ºC, \sim16 horas) utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, utilizando ADN ligasa T4 (\sim2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Se utilizó una alícuota del ligamiento (\sim5 \mul) para transformar células M15(pRPE4) electrocompetentes según procedimientos bien conocidos en la técnica. Después de un periodo de crecimiento de \sim2-3 horas a 37ºC en \sim1,0 ml de caldo LB, se sembraron células transformadas en placas de agar LB que contenían kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml). Se incluyeron ambos antibióticos en el medio de selección para asegurar que todas las células transformadas portaran tanto el plásmido pREP4 (KnR) que porta el gen lacIq necesario para la represión de la expresión inducible por IPTG de proteínas en pQE30, como el plásmido pQE30-BASB031 (ApR). Se incubaron las placas durante una noche a 37ºC durante \sim16 horas. Se recogieron colonias de KnR/ApR individuales con palillos estériles y se utilizaron para "sembrar" placas LB KnR/ApR recientes así como \sim1,0 ml de cultivo en caldo LB KnR/ApR. Tanto las placas sembradas como el caldo de cultivo se incubaron durante una noche a 37ºC en un incubador estándar (placas) o en un baño de agua con agitación.

Se empleó un análisis PCR basado en célula entera para verificar que los transformantes contenían el inserto de ADN de BASB031. En este caso, se transfirió \sim1,0 ml de cultivo de caldo LB Kn/Ap durante una noche a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se recogieron las células mediante centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (\sim3 min, temperatura ambiente, \sim12.000 x g). Se suspendió el sedimento celular en \sim200 \mul de agua estéril y se utilizó una alícuota de \sim10 \mul para programar un volumen final de reacción PCR de \sim50 \mul que contenía ambos cebadores de amplificación directa e inversa BASB031. Las concentraciones finales de los componentes de reacción PCR fueron esencialmente las mismas que las especificadas en el ejemplo 2, excepto porque se utilizaron \sim5,0 unidades de polimerasa Taq. Se aumentó la etapa inicial de desnaturalización a 95ºC a 3 minutos para asegurar la desestabilización térmica de las células bacterianas y la liberación de ADN de plásmido. Se utilizaron un ciclador térmico ABI modelo 9700, un perfil de amplificación térmica de 32 ciclos de tres etapas, concretamente 95ºC, 45 s; 55-58ºC, 45 s; 72ºC, 1 min, para amplificar el fragmento de PCR BASB031 de las muestras transformantes lisadas. Después de la amplificación térmica, se analizó una alícuota de \sim20 \mul de la reacción mediante electroforesis en gel de agarosa (0,8% de agarosa en un tampón Tris-acetato-EDTA (TAE)). Se visualizaron los fragmentos de ADN mediante iluminación UV después de electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se sometió a electroforesis un patrón de peso molecular de ADN (escala de 1 kb, Life Technologies) en paralelo con las muestras de ensayo, y se utilizó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Se identificaron transformantes que produjeron el producto de PCR esperado de \sim1400 pb como las cepas que contenían un constructo de expresión de BASB031. En las cepas que contenían plásmido de expresión, se analizó después la expresión inducible de BASB031 recombinante.

C: Análisis de expresión de transformantes PCR-positivos

Para cada transformante PCR-positivo identificado anteriormente, se inocularon \sim5,0 ml de caldo LB que contenía kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml) con células de la placa sembrada y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC con agitación (\sim250 rpm). Se inoculó una alícuota del cultivo simiente durante una noche (\sim1,0 ml) en un matraz Erlenmeyer de 125 ml que contenía \sim25 ml de caldo LB Kn/Ap, y se dejó crecer a 37ºC con agitación (\sim250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una DO600 de \sim0,5, concretamente en fase semilogarítmica (habitualmente aproximadamente a las \sim1,5-2,0 horas). En este momento, aproximadamente la mitad del cultivo (\sim12,5 ml) se transfirió a un segundo matraz de 125 ml y se indujo la expresión de proteína BASB031 recombinante mediante la adición de IPTG (solución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final 1,0 mM. La incubación de ambos cultivos inducido y no inducido con IPTG continuó durante \sim4 horas adicionales a 37ºC con agitación. Se retiraron muestras (\sim1,0 ml) de ambos cultivos inducido y no inducido después del periodo de inducción, y se recogieron las células mediante centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante \sim3 minutos. Se suspendieron los sedimentos celulares individuales en \sim50 \mul de agua estéril, después se mezclaron con un volumen igual de tampón de muestra SDS-PAGE 2x Laemelli que contenía 2-mercaptoetanol, y se dispusieron en un baño de agua a ebullición durante \sim3 min para desnaturalizar la proteína. Se cargaron volúmenes iguales (\sim15 \mul) de ambos lisados brutos inducido y no inducido por IPTG en gel de poliacrilamida con 12% de Tris/glicina por duplicado (minigeles de 1 mm de grosor, Novex). Se sometieron conjuntamente a electroforesis las muestras de lisado inducido y no inducido con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales utilizando un tampón de desarrollo estándar de SDS/Tris/glicina (BioRad). Después de la electroforesis, un gel se tiñó con azul brillante de Coomasie R250 (BioRad), y después se destiñó para visualizar la(s) nueva(s) proteina(s) BASB031 inducible(s) por IPTG. Se sometió a electrotransferencia el segundo gel en una membrana de PVDF (0,45 micrómetros de tamaño de poro, Novex) durante \sim2 horas a 4ºC utilizando un aparato de transferencia Mini-Protean II de BioRad y tampón de transferencia de metanol de Towbin (al 20%). Se realizaron los bloqueos de la incubación de la membrana y el anticuerpo según procedimientos bien conocidos en la técnica. Se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)3, seguido de un segundo anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado con HRP (QiaGen), para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante BASB031. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His se consiguió utilizando un sustrato insoluble ABT o utilizando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

D: Confirmación de secuencia

Para verificar adicionalmente que la proteína BASB031 recombinante inducible por IPTG que se está expresando está en el marco abierto de lectura correcto y no es una molécula espuria que surge de un artefacto de clonación (concretamente un desplazamiento de marco), se determinó la secuencia de ADN del inserto clonado. Se obtuvo la secuencia de ADN del gen BASB031 de M. catarrhalis a partir de una cadena utilizando metodologías de secuenciación cíclica con PCR asimétrico convencionales (ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Las reacciones de secuenciación se programaron con ADN de plásmido de expresión no digerido (\sim0,5 \mug/rxn) como molde y cebadores de secuenciación adecuados específicos del vector pQ30 y específicos del ORF (\sim3,5 pmol/rxn). Además del molde y el cebador de secuenciación, cada reacción de secuenciación (\sim20 \mul) contenía los cuatro dNTP diferentes (concretamente A, G, C y T) y los cuatro correspondientes nucleótidos terminadores ddNTP (concretamente ddA, ddG, ddC y ddT); estando cada terminador conjugado con uno de los cuatro tintes fluorescentes Joe, Tam, Rox o Fam. Lo productos de elongación de la secuenciación monocatenaria se terminaron en posiciones aleatorias a lo largo del molde mediante la incorporación de los terminadores ddNTP marcados con tinte. Los productos de terminación marcados con tinte fluorescente se purificaron utilizando columnas de cromatografía de exclusión de tamaño microcentrífuga (Princeton Genetics), se secaron a vacío, se suspendieron en un tampón de resuspensión de molde (Perkin-Elmer) para electroforesis capilar o en formamida desionizada para PAGE, se desnaturalizaron a 95ºC durante \sim5 min y se analizaron mediante electroforesis capilar de alta resolución (ABI 310 Automated DNA Sequenator, Perkin-Elmer) o PAGE de alta resolución (ABI 377 Automated DNA Sequenator) como recomienda el fabricante. Se recogieron los datos de secuencia del ADN producidos por las reacciones individuales, y se analizaron automáticamente las intensidades de pico fluorescente relativas en un ordenador PowerMAC utilizando software de análisis de secuencia ABI (Perkin-Elmer). Se corrigieron manualmente las secuencias de ADN autoanalizado individualmente para exactitud antes de condensarse con una "fila" de secuencia monocatenaria consenso utilizando el software AutoAssembler (Perkin-Elmer). La secuenciación determinó que el plásmido de expresión contenía la secuencia correcta en el marco abierto de lectura correcto.

Ejemplo 4 Producción de BASB031 recombinante Cepa bacteriana

Se utilizó una cepa de expresión recombinante de E. coli M15 (pREP4) que contiene un plásmido (pQE30) que codifica BASB031 de M. catarrhalis para producir masa celular para la purificación de proteína recombinante. Se cultivó la cepa de expresión en placas de agar LB que contenían kanamicina 50 \mug/ml ("Kn") y ampicilina 100 \mug/ml ("Ap") para asegurar que se mantuvieran tanto el plásmido control lacIQ pRPE4 como el constructo de expresión pQE30-BASB031. Para crioconservación a -80ºC, se propagó la cepa en caldo LB que contenía la misma concentración de antibióticos y después se mezcló con un volumen igual de caldo LB que contenía un 30% (p/v) de glicerol.

Medios

El medio de fermentación utilizado para la producción de proteína recombinante consistía en caldo 2X YT (Difco) que contenía Kn 50\mug/ml y Ap 100 \mug/ml. Se añadió antiespumante al medio del fermentador a 0,25 ml/l (antiespumante 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante BASB031, se añadió IPTG (\beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo) al fermentador (1 mM, final).

Fermentación

Se inoculó un matraz Erlenmeyer simiente de 500 ml que contenía 50 ml de volumen de trabajo con 0,3 ml de cultivo congelado rápidamente descongelado, o varias colonias de un cultivo en placa de agar selectivo, y se incubó durante aproximadamente 12 horas a 37 \pm 1ºC en una plataforma agitada a 150 rpm (Innova 210, New Brunswick Scientific). Este cultivo simiente se utilizó después para inocular un fermentador de 5 l de volumen de trabajo que contenía caldo 2X YT y ambos antibióticos Kn y Ap. Se hizo funcionar el fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) a 37\pm1ºC, 0,2-0,4 VVM de burbujeo de aire, a 250 rpm en impulsores Rushton. El pH no se controló en el cultivo simiente del matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH estuvo en el intervalo de 6,5 a 7,3 en el fermentador. Se añadió IPTG (solución madre 1,0 M, preparado en agua estéril) al fermentador cuando el cultivo alcanzó un crecimiento semilogarítmico (\sim0,7 unidades de DO600). Se indujeron las células durante 2-4 horas y después se recogieron mediante centrifugación utilizando una centrífuga 28RS Heraeus (Sepatech) o RC5C Superspeed (Sorvall Instruments). La pasta celular se almacenó a -20ºC hasta procesamiento.

Purificación Productos químicos y materiales

El imidazol, clorhidrato de guanidina, Tris(hidroximetilo) y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) de pureza biotecnológica o superior se obtuvieron todos de Ameresco Chemical, Solon, Ohio. El Triton X-100 (terc-
octilfenoxipolietoxietanol), fosfato de sodio monobásico y urea eran de pureza de reactivo o mejor, y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. El ácido acético glacial y ácido clorhídrico se obtuvieron de Mallincrodt Baker Inc., Phillpsburg, New Jersey. El metanol se obtuvo de Fisher Scienctific, Fairlawn, New Jersey. El Pefabloc®SC (fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo), comprimidos de cóctel de inhibidor de proteasa completo y PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) se obtuvieron de Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, Indiana. La bestatina, pepstatina A e inhibidor de proteasa E-64 se obtuvieron de Calbiochem, LaJolla, California. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1xPBS) se obtuvo de Quality Biological Inc., Gaithersburg, Maryland. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (10xPBS) se obtuvo de BioWhittaker, Walkersville, Maryland. El anticuerpo penta-His exento de BSA se obtuvo de Qiagen, Valencia, California. La IgG AffiniPure de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa se obtuvo de Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. La solución simple de AEC se obtuvo de Zymed, Sur de San Francisco, California. Todos los demás productos químicos fueron de pureza de reactivo o mejor.

La resina Ni-NTA Superflow se obtuvo de QiaGen Inc., Valencia, California. Los geles de poliacrilamida premoldeados con Tris-glicina al 4-20% y al 10-20%, todos los tampones y soluciones de desarrollo, patrones SeeBlue preteñidos, patrones MultiMarck multicoloreados y membranas de transferencia de PVDF se obtuvieron de Novex, San Diego, California. Los kits SDS-PAGE Silver Stain se obtuvieron de Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japón. La solución de tinción de Coomasie se obtuvo de Bio-Rad Laboratories, Hercules, California. Los filtros de jeringuila Acrodisc®PF 0,2 m se obtuvieron de Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Los filtros de jeringuilla desechables GD/X de 25 mm se obtuvieron de Whatman Inc., Clifton, New Jersey. Los tubos de diálisis de 8.000 MWCO se obtuvieron de BioDesign Inc., Od New York, Carmal New York. Los reactivos de ensayo de proteína BCA y los tubos de diálisis Snake Skin de 3.500 MWCO se obtuvieron de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

Protocolo de extracción

Se descongeló la pasta celular a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Se pesaron de 5 a 6 g de material en un tubo desechable de centrífuga de 50 ml. Se añadieron a esto 5 ml/g de tampón de clorhidrato de guanidina (Gu-HCl) (clorhidrato de guanidina 6 M, fosfato de sodio monobásico 100 mM, Tris 10 mM y 0,05% de Triton X-100, pH 8,0). Se resuspendió la pasta celular utilizando un homogeneizador PRO300D Proscientific a ¾ de potencia durante 1 minuto. Se dispuso después la mezcla de extracción a temperatura ambiente con agitación suave durante 60 a 90 minutos. Después de 60 a 90 minutos, la mezcla de extracción se centrifugó a 15.800 x g durante 15 minutos (centrífuga Sorvall RC5C, 11.500 rpm). Se decantó el sobrenadante (S1) y se guardó para purificación adicional. Se guardó el sedimento (P1) para análisis.

Unión de BASB031 a resina de níquel-NTA

Se añaden 3 a 4 ml de resina de Ni-NTA a S1. Se dispone ésta a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 hora. Después de 1 h, se empaqueta la S1/Ni-NTA en una columna XK16 Pharmacia. La columna se lava después con tampón Gu-HCl 1 M (clorhidrato de guanidina 1 M, fosfato de sodio monobásico 100 mM, Tris 10 mM y 0,05% de Triton X-100, pH 8,0). Esto es seguido por un lavado con tampón fosfato (fosfato de sodio monobásico 100 mM, Tris 10 mM y 0,05% de Triton X-100, pH 6,3). Se eluye después la proteína de la columna con tampón de imidazol 250 mM (imidazol 250 mM, fosfato de sodio monobásico 100 mM, Tris 10 mM y 0,05% de Triton X-100, pH 5,9).

Formulación final

Se formuló BASB031 mediante diálisis durante una noche frente a tres cambios de 0,1% de Triton X-100 y 1x PBS, pH 7,4 para eliminar el Gu-HCl e imidazol residuales. Se caracterizó la proteína purificada y se utilizó para producir anticuerpos como se describe a continuación.

Caracterizaciones bioquímicas Análisis SDS-PAGE y de transferencia Western

Se resolvió la proteína purificada recombinante en geles de poliacrilamida al 4-20% y se transfirió electroforéticamente a membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora como se ha descrito anteriormente (Thebaine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354). Se pretrataron después las membranas de PVDF con 25 ml de solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato que contenía un 5% de leche descremada desecada. Todas las incubaciones posteriores se llevaron a cabo utilizando este tampón de pretratamiento.

Se incubaron las membranas de PVDF con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmune o suero inmune de conejo anti-His durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron después las membranas de PVDF dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro de sodio 150 mM y 0,05% de Tween-20). Se incubaron las membranas de PVDF con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra anti-conejo marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron después membranas de PVDF 4 veces con tampón de lavado y se revelaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea como suministra Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada uno.

Los resultados de un SDS-PAGE (Figura 4) muestran una proteína de aproximadamente 52 kDa que es reactiva con un anticuerpo anti-RGS(His) mediante transferencias Western del SDS-PAGE.

Secuenciación de proteína

Se realizó la secuenciación de aminoácidos amino-terminal de la proteína purificada para confirmar la producción de la proteína recombinante correcta utilizando protocolos químicos bien definidos en un secuenciador Hewlett-Packard modelo G1000A con un CL modelo 1090 y un secuenciador Hewlett-Packard modelo 241 con un CL modelo 1100.

Ejemplo 5 Producción de antisueros contra BASB031 recombinante

Se generaron antisueros polivalentes dirigidos contra la proteína BASB031 vacunando dos conejos con la proteína BASB031 recombinante purificada. Se administró a cada animal un total de tres inmunizaciones por vía intramuscular (im) de aproximadamente 20 \mug de proteína BASB031 por inyección (empezando con coadyuvante completo de Freund y seguido por coadyuvante incompleto de Freund) a intervalos de aproximadamente 21 días. Se tomaron muestras de sangre a los animales antes de la primera inmunización ("antes de exposición") y los días 35 y 57.

Se controlaron las respuestas de proteína anti-BASB031 mediante un ELISA utilizando proteína BASB031 recombinante purificada (0,5 \mug/pocillo). La titulación se define como la dilución más alta igual o mayor a 0,1, calculada con la siguiente ecuación: DO media de dos muestras de ensayo de antisueros - DO media de dos muestras de ensayo de tampón. Se utilizaron los antisueros como primer anticuerpo para identificar la proteína en una transferencia Western como se describe en el ejemplo 4 anterior. Las transferencias Western muestran la presencia de anticuerpo anti-BASB031 en los sueros de animales inmunizados.

Ejemplo 6 Presencia de anticuerpo contra BASB031 en sueros de seres humanos convalecientes

Se realizaron análisis de transferencia Western de BASB031 recombinante purificada como se describe en el ejemplo 4 anterior, excepto porque se utiliza un conjunto de sueros humanos de niños infectados con M. catarrhalis como preparación del primer anticuerpo. Los resultados muestran que los antisueros de individuos afectados naturalmente reaccionan con la proteína recombinante purificada, como muestra la Figura 5.

Ejemplo 7 Producción de péptidos BASB031, antisueros y reactividad de los mismos

Se produjeron dos péptidos de aminoácidos cortos específicos de BASB031 que tienen las secuencias NPVPTLGHIAIQEDAC (SEC Nº ID 13) y YRTSQNEGANKVPRLC (SEC Nº ID 14) en el laboratorio utilizando procedimientos generalmente bien conocidos. Estos péptidos acoplados a KLH se utilizaron para producir anticuerpos en conejos hembra de Nueva Zelanda específicos exentos de patógenos de 12 semanas. Los conejos recibieron 4 inyecciones aproximadamente en intervalos de 3 semanas de 200 \mug de péptido-KLH en coadyuvante completo (1ª inyección) o incompleto (2ª, 3ª y 4ª inyección) de Freund. Se extrajo sangre a los animales antes de la primera inmunización y un mes después de la 4ª inyección.

Se midieron las titulaciones de punto medio anti-péptido mediante un ELISA utilizando péptidos libres. Las titulaciones de punto medio anti-péptido un mes después de la 4ª inmunización fueron superiores a 25.000. Se prepararon transferencias Western de BASB031 recombinante purificada utilizando anticuerpos anti-péptido como primer anticuerpo, como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se presentan en la Figura 6.

Materiales depositados

Se ha depositado un depósito que contiene una cepa de Moraxella catarrhalis Catlin en la American Type Culture Collection (en la presente memoria "ATCC") el 21 de junio de 1997, y se le ha asignado el número de depósito 43617. Se describió el depósito como de Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una biblioteca liofilizada de insertos de 1,5-2,9 kb construida a partir de un aislamiento de M. catarrhalis obtenido del aspirado transtraqueal de un minero de carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506-508 (1982).

El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se designa en la presente memoria como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen BASB031 completo.

Se ha depositado un depósito del vector pMC-PilQ constituido por ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 en la American Type Culture Collection (ATCC) el 12 de febrero de 1999, y se le ha asignado el número de depósito 207100.

La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido así codificado, son controles en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias en la presente memoria.

El depósito de la cepa depositada se ha realizado bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con fines de procedimiento de patente. La cepa depositada se liberará al público irrevocablemente y sin restricciones ni condiciones tras la expedición de una patente. La cepa patentada se proporciona únicamente como conveniencia para los expertos en la técnica, y no es una admisión de que se requiera un depósito para su habilitación, tal como es necesario según la norma 35 del USC ap. 112.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

Indicaciones relativas a microorganismos u otro material biológico depositado (Norma PCT 13bis)

5

<110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Nuevos compuestos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BM45325

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows versión 3.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1422

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacteria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 473

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacteria

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1422

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacteria

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 473

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacteria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1422

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacteria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 473

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacteria

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1422

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacteria

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 473

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacteria

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

19

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaattaccca tattgacagt c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaaccgtta aacaatggtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagggccaa ttacgcagag gggatccgat actcatatcg atcatgtgtc tgttaccca

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagggccaa ttacgcagag ggtcgactta ctatcttacc aatttgggtg taataaaaat

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaaa

\hfill

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligopéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Pro Val Pro Thr Leu Gly His Ile Ala Ile Gln Glu Asp Ala Cys}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligopéptido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Arg Thr Ser Gln Asn Glu Gly Ala Asn Lys Val Pro Arg Leu Cys}

\newpage

22

23

24

25

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 8 respecto a la totalidad de las SEC Nº ID 4, 6 y 8, respectivamente.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 8 respecto a la totalidad de las SEC Nº ID 4, 6 y 8, respectivamente.

3. El polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 y SEC Nº ID 8.

4. Un polipéptido aislado de SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 o SEC Nº ID 8.

5. Un fragmento inmunogénico del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, siendo el fragmento inmunogénico capaz de crear una respuesta de anticuerpo (si es necesario cuando está acoplado a un portador) que reconoce específicamente el polipéptido de SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 o SEC Nº ID 8, y siendo el fragmento opcionalmente parte de una proteína mayor tal como una proteína de fusión.

6. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC Nº ID 4, 6 ó 8 respecto a la totalidad de las SEC Nº ID 4, 6 ó 8, respectivamente; o una secuencia nucleotídica complementaria de dicho polinucleótido aislado.

7. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 95% de identidad con una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de SEC Nº ID 4, 6 ó 8 respecto a la región de codificación completa; o una secuencia nucleotídica complementaria de dicho polinucleótido aislado.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 85% de identidad con la SEC Nº ID 3, 5 ó 7 respecto a la totalidad de las SEC Nº ID 3, 5 ó 7, respectivamente; o una secuencia nucleotídica complementaria de dicho polinucleótido aislado.

9. El polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la identidad es de al menos un 95% con las SEC Nº ID 3, 5 ó 7.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 o SEC Nº ID 8, o el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5.

11. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEC Nº ID 1, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5 o SEC Nº ID 7.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de SEC Nº ID 2, SEC Nº ID 4, SEC Nº ID 6 o SEC Nº ID 8, obtenible mediante selección de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosa con una sonda marcada que tiene la secuencia SEC Nº ID 1, SEC Nº ID 3, SEC Nº ID 5 o SEC Nº ID 7, o un fragmento de las mismas.

13. Un vector de expresión o un microorganismo vivo recombinante que comprende un polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12.

14. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 13 o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula hospedadora.

15. Un procedimiento para producir un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 14 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

16. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, que comprende transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

17. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. La composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, en la que dicha composición comprende al menos un antígeno de Moraxella catarrhalis.

20. Un anticuerpo inmunoespecífico del polipéptido según la reivindicación 4, o un fragmento inmunogénico del polipéptido según la reivindicación 4, en el que el fragmento inmunogénico es capaz de crear una respuesta de anticuerpo (si es necesario cuando está acoplado a un portador) que reconoce específicamente el polipéptido de SEC Nº ID 2, 4 6 ó 8.

21. Un procedimiento de diagnóstico de una infección por Moraxella, que comprende identificar un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un anticuerpo que es inmunoespecífico de dicho polipéptido, presente en una muestra biológica de un animal sospechoso de tener dicha infección.

22. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una infección por Moraxella.

23. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una infección por Moraxella.

24. Una composición terapéutica útil para tratar seres humanos con una infección por Moraxella catarrhalis, que comprende al menos un anticuerpo según la reivindicación 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.