ES2252019T3 - Polipeptido y polinucleotido basb111 de moraxella catarrhalis. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 sobre la longitud

Description

Polipéptido y polinucleótido BASB111 de Moraxella catarrhalis.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos (denominados en este documento como "polinucleótido o polinucleótidos BASB111"), a polipéptidos codificados por ellos (denominados en este documento como "BASB111" o "polipéptido o polipéptidos BASB111"), a materiales y procedimientos de recombinación para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar estos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas rente a infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar la infección por ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (también denominada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram-negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, siendo la principal la otitis media en niños y jóvenes y la neumonía en ancianos. También es responsable de sinusitis, infecciones nosocomial y, menos frecuentemente, de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad importante en la infancia tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. En Estados Unidos se registran cada año más de 3,5 millones de casos y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19:823). Si se deja sin tratamiento o se convierte en crónica, esta enfermedad puede llevar a una pérdida de audición que podría ser temporal (en el caso de acumulación de fluido en el oído medio) o permanente (si se daña el nervio auditivo). En los bebés, esta pérdida de audición puede ser responsable de un retraso en el aprendizaje del habla.

Principalmente, se aislan tres especies de bacterias del oído medio de los niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) y M. catarrhalis. Están presentes en el 60 a 90% de los casos. La secuenciación del genoma completo de H. influenzae se describe en el documento WO 96/33276. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan ambas aproximadamente el 30% y M. catarrhalis aproximadamente el 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Pueden aislarse otras bacterias del oído medio (H. influenzae tipo B, S. pyogenes, etc.) pero a mucha menor frecuencia (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un requisito previo absoluto para el desarrollo de una otitis, sin embargo, también se necesitan otros requisitos para desarrollar la enfermedad (Dickinson, DP y col. (1988) J. Infect. Dis.158: 205, Faden, HL y col. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612). Estos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias al oído medio a través de los conductos de Eustaquio, seguido de la iniciación de un proceso inflamatorio. Estos factores son desconocidos hasta la fecha. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmune que siguen a una infección viral, por ejemplo, podría causar una incapacidad para controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, HL y col. (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más importante en algunos niños, que posteriormente se convierten en susceptible de desarrollar otitis media debido a la presencia mantenida de patógenos en el oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).

La respuesta inmune frente a M. catarrhalis está poco caracterizada. El análisis de las cepas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebés seguido de los 0 a 2 años de edad, indica que frecuentemente cogen y eliminan nuevas cepas. Esto indica que en los niños colonizados se preparar una respuesta inmune eficaz frente a esta bacteria (Faden, HL y col (1994) J. Infect. Dis. 169:1312).

En la mayoría de los adultos analizados, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y col. (1985) J. Infect. Dis. 151:878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida del suero: en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que de los que simplemente están colonizados (Hol, C y col. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL y col. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A):28S). Por tanto, la resistencia del suero podría considerarse como un factor de virulencia de la bacteria. Se ha observado una actividad opsonizante en los sueros de niños en recuperación de una otitis media.

No se han identificado en humanos los antígenos diana de estas respuestas inmunes diferentes, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por hierro, y que es reconocida por los sueros de pacientes con neumonía (Sethi, S, y col. (1995) Infect. Immun. 63:1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col. (1999), Infect. Immun. 67:1310).

Se han caracterizado algunas otras proteínas de membrana presentes en la superficie de M. catarrhalis usando procedimientos bioquímicos o por su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión, véase Murphy, TF (1996). Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía en ratón, la presencia de anticuerpos producidos frente a algunas de ellas (UspA, CopB) favorece un aclaramiento más rápido de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) está muy conservado entre las cepas de M. catarrhalis, y presente homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que ha demostrado ser eficaz frente a esta bacteria en modelos animales. El documento US-A-5.599.693 describe la clonación y expresión de una proteína de la membrana externa de 30, 80 y 100 kd de M. catarrhalis y la potencial utilidad de estas proteínas en la preparación de vacunas. El documento US-A-5.607.849 describe la secuencia de nucleótidos de la proteína E de la membrana externa de M. catarrhalis.

La frecuencia de infecciones por Moraxella catarrhalis se ha elevado espectacularmente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de cepas resistentes a antibióticos multiplicada y a una población en aumento de personas con sistemas inmunes debilitados. Ya no es raro aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a alguno o todos los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica inadecuada y una demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos y ensayos diagnósticos para este organismo.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a BASB111, en particular a polipéptidos BASB111 y a polinucleótidos BASB111, materiales de recombinación y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de estos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades por Moraxella. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar enfermedades asociadas con infecciones por Moraxella y condiciones asociadas con estas infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de los polinucleótidos o polipéptidos BASB111.

En más detalle, según un aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 2.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado de la ID SEC Nº 2.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento inmunogénico del polipéptido de la presente invención en el cual (si es necesario cuando se une a un vehículo) es capaz de generar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de la ID SEC Nº 2.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 2, o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de ID SEC Nº 2 sobre la región codificadora completa; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con la ID SEC Nº 1 sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polunucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de la ID SEC Nº 2.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de la ID SEC Nº 1.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la ID SEC Nº 2, que puede obtenerse analizando una biblioteca apropiada en condiciones rigurosas de hibridación con una sonda marcada que tiene la secuencia de la ID SEC Nº 1 o un fragmento de la misma.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un microorganismo vivo recombinante que comprende un vector de expresión de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una membrana de una célula hospedadora de la presente invención que expresa un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácido de la ID SEC Nº 2.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para producir un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácido de la ID SEC Nº 2, que comprende cultivar una célula hospedadora de la presente invención en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para expresar un polinucleótido de la presente invención que comprende transformar una célula hospedadora con el vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición para vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición para vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un anticuerpo generado frente al polipéptido o el fragmento inmunogénico de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para diagnosticar una infección por Moraxella, que comprende identificar un polipéptido de la presente invención, o un anticuerpo que es inmunoespecífico para dicho polipéptido, presente en una muestra biológica de un animal sospechoso de tener esta infección.

Aún en otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o polinucleótido de la presente invención en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición terapéutica útil para tratar humanos con una enfermedad por Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo dirigido frente al polipéptido de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente adecuado.

Diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita serán fácilmente aparentes para los expertos en la materia a partir de la lectura de las descripciones siguientes y a partir de la lectura de otras partes de la presente descripción.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB111 como se describe a continuación en mayor detalle. En particular, la invención se refiera a polipéptidos y polinucleótidos de BASB111 de Moraxella catarrhalis. La invención se refiere especialmente al BASB111 que tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos presentadas en la ID SEC Nº 1 y ID SEC Nº 2, respectivamente. Se entiende que las secuencias enumeradas a continuación en el Listado de Secuencias como "ADN" representan un ejemplo de una realización de la invención, ya que los expertos reconocerán que estas secuencias pueden emplearse de manera provechosa en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en este documento como "BASB111" y "polipéptidos BASB111" así como variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de estos y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención además proporciona:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos el 97-99% de identidad exacta con la de la ID SEC Nº 2;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta con la ID SEC Nº 1 sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 1, o

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta con la secuencia de aminoácido de la ID SEC Nº 2.

El polipéptido BASB111 proporcionado en la ID SEC Nº 2 es el polipéptido BASB111 de la cepa MC2931 de Moraxella catarrhalis (ATCC 43617).

La invención también proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB111, esto es, una porción contigua del polipéptido BASB111 que tiene la misma, o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2. Esto decir, el fragmento (si es necesario cuando se conjuga con un vehículo) es capaz de generar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido BASB111. Este fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB111 carente de una secuencia líder N-terminal y/o un dominio transmembranal y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de BASB111 según la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, lo más preferiblemente al menos el 95% de identidad, más preferiblemente al menos el 97-99% de identidad con la ID SEC Nº 2 sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma de una parte pero no del total de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB111, los fragmentos pueden estar "aislados" o comprendidos en un polipéptido mayor el cual forman una parte o región, más preferiblemente como una única región continua en un polipéptido único
mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, truncamiento de polipéptidos que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o una variante de la misma, tal como una serie continua de restos que incluyen una secuencia de aminoácidos amino y/o carboxilo terminales. También se prefieren formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula hospedadora. Además se prefieren fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones en hélice alfa y que forman una hélice alfa, regiones en lámina beta y que forman una lámina beta, regiones en vuelta y que forman una vuelta, regiones de giro y que forman giros, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta antipáticas, regiones flexibles, regiones que forman superficies, región que se une al sustrato y regiones con alto índice antigénico.

Fragmentos adicionalmente preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o delecionados a partir de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención pueden emplearse para la producción del correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis peptídico; por tanto, estos fragmentos pueden emplearse como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

En particular, se prefieren las variantes en las que se han sustituido, delecionado o añadido en cualquier combinación varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácidos.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en forma de la proteína "madura" o puede ser una parte de una proteína mayor tal como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contenga secuencias secretoras o líderes, prosecuencias, secuencias que ayudan a la purificación tales como restos múltiples de histidina o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de una cola polipeptídica o lipídica exógena o de secuencias polinucleotídicas para aumenta el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas por ingeniería genética, compuestas de un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, en particular la IgG1, donde la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización en particular, puede retirarse la parte Fc simplemente incorporando una secuencia de escisión que pueda escindirse con el factor de coagulación sanguínea Xa.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética y al uso de estas en la selección de fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las solicitudes de patente internacional Nº W094/29458 y W094/22914.

Las proteínas pueden conjugarse químicamente o expresarse como proteínas de fusión recombinantes para ser producidas en un sistema de expresión que permita el aumento de los niveles en comparación con la proteína no fusionada. La pareja de fusión puede ayudar a proporcionar epítopes de células T colaboradores (pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopes de colaboradores reconocidos por humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (aumento de la expresión) con rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente, la proteína de fusión serán tanto una pareja de fusión inmunológica como una pareja para aumentar la expresión.

Las parejas de fusión incluyen la proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus influenza, NS1 (hemaglutinina). Otra pareja de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente, se usa la porción C-terminal de la molécula. LytA deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa, LytA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) páginas 265-272}) una autolisina que degrada de forma específica ciertos enlaces en el esqueleto del péptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad por la colina o por algún análogo de colina, tal como DEAE. Esta propiedad ha sido explotada para el desarrollo de plásmidos que expresan C-lytA en E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su extremo amino terminal {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798}. Es posible usar la porción repetida de la molécula LytA, que se encuentra en el extremo C terminal que empieza en el resto 178, por ejemplo, restos 188-305.

La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos mencionados anteriormente, que son polipéptidos que varían con respecto a los de referencia en sustituciones de aminoácidos conservativos, por la cual, un resto se sustituye por otro con características similares. Estas sustituciones típicas están entre Ala, Val, Leu e Ile, entre Ser y Thr, entre los restos ácidos Asp y Glu, entre Asn y Gln y entre los restos básicos Lys y Arg o los restos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Estos polipéptidos incluyen polipéptidos naturales, polipéptidos producidos de forma recombinante, polipéptidos producidos de forma sintética o polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar estos polipéptidos son bien comprendidos en la técnica.

Se prefiere más que un polipéptido de la invención derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo, puede obtenerse preferiblemente de otros organismos del mismo género taxonómico. También puede obtenerse un polipéptido de la invención, por ejemplo, a partir de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Es un objetivo de la invención proporcionar polinucleótidos que codifiquen polipéptidos BASB111, especialmente polinucleótidos que codifiquen el polipéptido de este documento denominado BAS111.

En una realización particularmente preferida de la invención, el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB111 que comprenden una secuencia mostrada en ID SEC Nº 1, que incluye un gen de longitud completa o una variante del mismo.

El polinucleótido BASB111, proporcionado en la ID SEC Nº 1, es el polinucleótido BASB111 de la cepa MC2931 de Moraxella catarrhalis (ATCC 43617).

Un aspecto adicional de la invención es proporcionar moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB111, especialmente polipéptidos y polinucleótidos BASB111 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARN no procesados, ARN ribozimas, ARNm, ADNc, ADN genómicos y ADN B y Z. Realizaciones adicionales de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, variantes de los mismos y composiciones que los comprenden.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen completo, que codifica un polipéptido BABS111 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la ID SEC Nº 2 y polinucleótidos estrechamente relacionados con éste y variantes del mismo.

En otra realización particularmente preferida de la invención se contempla un polipéptido BASB111 de Moraxella catarrhalis que comprende o consta de una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 o una variante de la misma.

Usando la información proporcionada en este documento, tal como un polinucleótido de secuencia mostrada en ID SEC Nº 1, puede obtenerse un polinucleótido de la invención que codifica el polipéptido BASB111 de la invención usando procedimientos de clonación y selección convencionales, tales como los de clonación y secuenciación de fragmentos de ADN cromosómico de bacterias usando células de Moraxella catarrhalis Catlin como material de partida, seguido de la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, tal como una secuencia de polinucleótidos dada en la ID SEC Nº 1, típicamente, una biblioteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella catarrhalis Catlin en E. coli o en algunos otros hospedadores adecuados, se incubó con una sonda oligonucleotídica marcada radiactivamente, preferiblemente un 17-mer o mayor, derivado de una secuencia parcial. A continuación, se pueden distinguir clones que llevaban ADN idéntico a la sonda usando condiciones de hibridación rigurosas. Secuenciando los clones individuales identificados de este modo por hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia polipeptídica o polinucleotídica original, es posible extender a continuación la secuencia polinucleotídica en ambas direcciones para determinar una secuencia génica de longitud completa. De forma conveniente, esta secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN de doble cadena desnaturalizado preparado a partir de un clon plasmídico. Las técnicas adecuadas se describen en Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) (véase en particular, Selección por hibridación 1.90 y Moldes para secuenciación de ADN de doble hélice desnaturalizado 13.70). También puede realizarse la secuenciación directa del ADN genómico para obtener una secuencia génica de longitud completa. El polinucleótido mostrado en la ID SEC Nº 1, ilustrativo de la invención, se descubrió en una biblioteca de ADN derivado de Moraxella catarrhalis.

Además, la secuencia de ADN mostrada en la ID SEC Nº 1 contiene un marco de lectura abierta que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de restos de aminoácidos mostrados en la ID SEC Nº 2 con un peso molecular deducido que puede calcularse usando los valores de peso molecular de los restos de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la materia.

El polinucleótido de ID SEC Nº 1, entre el codon de inicio en el nucleótido número 1 y el codon de terminación que empieza en el nucleótido número 829 de la ID SEC Nº 1, codifica el polipéptido de la ID SEC Nº 2.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado compuesto o que consta de:

(a) una secuencia polinucleotídica que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta con la ID SEC Nº 1 sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 1, o

(b) una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta al 100% con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 2.

Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de otras especies distintas a Moraxella catarrhalis, por un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar una biblioteca apropiada en condiciones rigurosas de hibridación (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y una concentración de SDS de 0,1-1%) con una sonda marcada o detectable que consta o está compuesta de la secuencia de la ID SEC Nº 1 o un fragmento de la misma y aislar un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contiene dicha secuencia polinucleotídica.

La invención proporciona una secuencia polinucleotídica idéntica en su longitud completa en una secuencia codificadora (marco de lectura abierta) de la ID SEC Nº 1. La invención también proporciona una secuencia codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí misma, así como una secuencia que codifica un polipéptido maduro o un fragmento en marco de lectura con otra secuencia codificadora, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora, una secuencia pre, pro o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención también puede contener al menos una secuencia no codificadora, que incluye por ejemplo, pero sin limitaciones, al menos unas secuencias 5' y 3' no codificadoras, tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como señales de terminación dependiente e independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan el ARNm, intrones y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos también puede comprenden una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, pueden codificar una secuencia marcadora que facilite la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia marcadora es un péptido hexahistidina como el que se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:821-824 (1989), o una etiqueta peptídica HA (Wilson y col., Cell 37:767 (1984), los cuales pueden ser útiles para purificar secuencia polipeptídica fusionada a ellos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero sin limitaciones, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas de forma natural, que controlan la expresión
génica.

La secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido BASB111 de la ID SEC Nº 2 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polipéptido contenido en los nucleótidos 1 a 828 de la ID SEC Nº 1. De forma alternativa, puede ser una secuencia que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifique el polipéptido de la ID SEC Nº 2.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa en este documento, abarca a polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, en particular un polipéptido bacteriano y, más en particular, un polipéptido del BASB111 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 2. La expresión también abarca polinucleótidos que incluyen una región continua única o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de un vector integrado, una secuencia de transposón integrado, o debido a la edición del ARN o a la reorganización del ADN enómico) junto con regiones adicionales que también pueden contener secuencias codificadoras y/o no codificadoras.

La invención además se refiere a variantes de los polinucleótidos descritos en este documento que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida la ID SEC Nº 2. Pueden usarse fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar los polinucleótidos de longitud completa de la invención.

Realizaciones adicionales especialmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes de BASB111, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB111 de la ID SEC Nº 2, en la que se sustituyen, modifican, delecionan y/o añaden varios, algunos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún resto de aminoácido en cualquier combinación. Especialmente preferidas entre éstas son las sustituciones, adiciones y deleciones silentes que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB111.

Realizaciones preferidas adicionales de la invención son polinucleótidos que son al menos el 85% idénticos en su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB111 que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 2, y polinucleótidos que son complementarios a estos polinucleótidos. De forma alternativa, los más preferidos son polinucleótidos que comprenden una región que es al menos el 90% idéntica en su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB111 y los polinucleótidos complementarios a estos. A este respecto, se prefieren especialmente los polinucleótidos al menos el 95% idénticos en su longitud completa del mismo. Además, son muy preferidos aquellos con al menos el 97% entre aquellos con al menos el 95% y entre estos, son especialmente muy preferidos aquellos con al menos el 98% y al menos el 99%, siendo los más preferidos con al menos el 99%.

Las realizaciones preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de la ID SEC Nº 1.

De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas de esta invención, se proporcionan polinucleótidos que hibridan, especialmente en condiciones rigurosas, con secuencias polinucleotídicas BASB111, tales como los polinucleótidos en la ID SEC Nº 1.

La invención además se refiere a polinucleótidos que hibridan con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en este documento. A este respecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que hibridan en codiciones rigurosas con los polinucleótidos descritos es este documento. Como se usa en este documento, las expresiones "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas" significan hibridaciones que se producen sólo si hay al menos el 95% y preferiblemente al menos el 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación rigurosas es la incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, SSCx5 (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt x5, sulfato de dextrano al 10% y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnudo desnaturalizado, seguido por el lavado del soporte de hibridación en SSCx0,1 a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y aparecen ejemplos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), especialmente el Capítulo 11 de éste. También puede usarse solución de hibridación con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en la invención.

La invención también proporciona un polinucleótido que consta o comprende una secuencia polinucleotídica obtenida por análisis de una biblioteca apropiada que contiene el gen completo de una secuencia polinucleotídica mostrada en la ID SEC Nº 1 en condiciones rigurosas de hibridación con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia polinucleotídica mostrada en la ID SEC Nº 1 o un fragmento del mismo; y aislar dicha secuencia polinucleotídica. Los fragmentos útiles para obtener dicho polinucleótido incluye, por ejemplo, sondas y cebadores se describen por completo en otra parte de este documento.

Como se discute en otra parte de este documento con respecto a los ensayos del polinucleótido de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, pueden usarse como sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifiquen BASB111 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tiene una elevada identidad, especialmente elevada identidad de secuencia con el gen BASB111. Generalmente, estas sondas comprenderán al menos 15 restos de nucleótidos o pares de bases. Preferiblemente, estas sondas tendrán al menos 30 restos nucleotídicos o pares de bases y puede tener al menos 50 restos nucleotídicos o pares de bases. Las sondas especialmente preferidas tendrán al menos 20 restos nucleotídicos o pares de bases y podrán tener menos de 30 restos nucleotídicos o pares de bases.

Puede aislarse una región codificadora de un gen BASB111 por selección usando una secuencia de ADN proporcionada en la ID SEC Nº 1 para sintetizar una sonda oligonucleotídica. A continuación, se usa un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la un gen de la invención para analizar una biblioteca de ADNc, ADN o ARNm genómico para determinar qué miembros de la biblioteca hibridan con la sonda.

Se dispone de diversos procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para obtener ADN de longitud completa o para extender ADN cortos, por ejemplo, los basado en el procedimiento de Amplificación rápida de los extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85: 8998-9002,1988). Las modificaciones recientes de la técnica, ilustradas con ejemplos en la tecnología Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon^{TM}, los ADNc se han preparado a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada a cada extremo. A continuación se realiza la amplificación del ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "perdido" del ADN usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos del gen y del adaptador. Luego, se repite la reacción de PCR usando cebadores "anidados", esto es, cebadores diseñados para hibridar dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico del adaptador que híbrida además en el extremo 3' de la secuencia del adaptador y un cebador específico del gen que además híbrida en el extremo 5' de la secuencia génica seleccionada). Los productos de esta reacción pueden analizarse a continuación por secuenciación de ADN y construirse un ADN de longitud completa uniendo directamente el producto con el ADN existente para obtener una secuencia completa, o realizando una PCR independiente de longitud completa usando la información de la nueva secuencia para el diseño del cebador 5'.

Pueden emplearse los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, por ejemplo, como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos y diagnóstico de enfermedades, en especial enfermedades humanas, como se describe a continuación en este documento en relación con los ensayos del polinucleótido.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de la ID SEC Nº 1, pueden usarse en los procedimientos de este documento como se describe, pero preferiblemente para PCR, para determinar si los polipéptidos identificados en este documento se transcriben o no por completo o en parte en bacterias de tejido infectado. Se reconoce que estas secuencias también serán útiles en el diagnóstico de la fase y del tipo de infección que el patógeno ha logrado.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos amino o carboxilo terminales adicionales o aminoácidos en el interior del polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Estas secuencias pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína del precursor a una forma madura, pueden permitir el transporte de la proteína, pueden alargar o acortar la vida media de la proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como generalmente es el caso in vivo, los aminoácidos adicionales pueden eliminarse de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para cada polinucleótido de la invención, se proporciona un polinucleótido complementario de éste. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean íntegramente complementarios para cada polinucleótido con el cual son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionado con una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las prosecuencias, generalmente estos precursores inactivos se activan. Antes de la activación pueden eliminarse algunas o todas las prosecuencias. Generalmente, estos precursores se denominan proproteínas.

Además de las representaciones convencionales de nucleótidos A, G, C, T/U, el término "N" también puede usarse para describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que puede aparecer cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN en esta posición específica en la secuencia del ADN o ARN, exceptuando que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que, tomado en combinación con posiciones nucleotídicas adyacentes, cuando se lee en el marco de lectura correcto, tuviera el efecto de generar un codon de terminación prematuro en este marco de lectura.

En síntesis, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (la cual puede denominarse como una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son las secuencias líder de una preproteína o una preproteína, la cual es un precursor de una proproteína que tiene una secuencia líder y uno o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención con fines terapéuticas o profilácticos, en particular, inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento de suministro adecuado, tal como la inyección directa del ADN del plásmido en el músculo (Wolff y col., Hum Mol Genet (1992) 1:363, Manthorpe y col., Hum Gene Ther. (1983) 4: 419), el suministro de ADN formando complejo con vehículos proteicos específicos (Wu y col., J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), la coprecipitación del ADN con fosfato cálcico (Benvenisty y Reshef, PNAS USA, (1986) 83:9551), la encapsulación del ADN en diversas forma de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), el bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356:152, Einsenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12:791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col., PNAS USA (1984) 81:5849).

Vectores, células hospedadoras, sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, a células hospedadoras que se han manipulado genéticamente con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas de recombinación. Para producir estas proteínas también pueden emplearse sistemas de traducción libres de células usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la invención.

Pueden prepararse polipéptidos recombinantes de la presente invención por procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia a partir de células hospedadoras manipuladas genéticamente que comprenden sistemas de expresión. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiera a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células hospedadoras que se manipulan genéticamente con estos sistemas de expresión y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas de recombinación.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, pueden manipularse genéticamente células hospedadoras para incorporar sistemas de expresión de polinucleótidos de la invención o porciones de los mismos. La introducción de un polinucleótido en la célula hospedadora puede efectuarse mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), tales como transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, carga durante el raspado, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de hospedadores adecuados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtulis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como célula de levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basiodiomicete, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto, tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y melanoma de Bowes; y células vegetales, tales como células de gimnosperma o angiosperma.

Pueden usarse una gran diversidad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Estos vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosomas, episomales y virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papova virus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus virus de la viruela aviar, virus de pseudorabias, picornavirus, retrovirus y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos génicos plasmídicos y bacteriófagos, tales como cósmidos o fagémidos. Las construcciones de sistemas de expresión pueden contener regiones control que también regulan la expresión originada. En general, a este respecto puede usarse para la expresión cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un hospedador. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante cualquier diversidad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las mostradas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado para la secreción de una proteína traducida en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o puede ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía en lectina. Más preferiblemente, se emplea para purificación cromatografía de afinidad por iones metálicos (IMAC). Pueden emplearse técnicas bien conocidas para el replegamiento de proteínas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, aislamiento y/o purificación.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación e infección in vivo con este vector vivo llevará a la expresión in vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usados para este fin son, por ejemplo: virus de la viruela (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar, viruela del canario), alfavirus (virus Sindbis, virus del bosque Semliki, virus de la encefalomielitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus de la varicela zóster, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos o atenuados de diversas formas para obtener vacunas vivas. Estas vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, pronóstico, serotipaje y mutación

Esta invención también proporciona el uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB111 de la invención para su uso como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB111 en un eucariota, particularmente un mamífero, y especialmente un humano, proporcionará un procedimiento diagnóstico para el diagnóstico de la enfermedad, estadificación de la enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Pueden detectarse eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente humanos, particularmente los infectados o sospechosos de estar infectados con un organismo que comprende el gen o la proteína BASB111, a nivel de ácido nucleico o aminoácido mediante una diversidad de técnicas bien conocidas así como mediante procedimientos proporcionados en este documento.

Pueden obtenerse polipéptidos y polinucleótidos para pronóstico, diagnóstico u otros análisis a partir de materiales corporales de individuos supuestamente infectados y/o infectados. Pueden usarse directamente para la detección polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, o puede amplificarse enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación previa al análisis. También pueden usarse de la misma forma ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico. Usando amplificación, puede hacerse la caracterización de las especies y cepas del organismo infeccioso o residente presente en un individuo, mediante el análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Pueden detectarse deleciones e inserciones mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionado a partir de un organismo relacionado, preferiblemente de una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Pueden identificarse puntos de mutación hibridando el ADN amplificado con secuencias polinucleotídicas de BASB111 marcadas. Pueden distinguirse secuencias perfecta o significativamente coincidentes de dupletes imperfecta o más significativamente no coincidentes mediante digestión con ADNasa o RNasa, para ADN o ARN respectivamente, o mediante detección de diferencias en las temperaturas de fusión o en las cinéticas de renaturalización. También pueden detectarse diferencias en la secuencia polinucleotídica por alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos polinucleotídicos en geles en comparación con una secuencia de referencia. Esto puede realizarse con o sin agentes desnaturalizantes. También puede detectarse diferencias polinucleotídicas por secuenciación directa de ADN o ARN. Véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230: 1242 (1985). Los cambios de secuencia en localizaciones específicas también pueden descubrirse mediante ensayos de protección de nucleasas, tales como RNasas, y ensayo de protección de V1 y S1 o un procedimiento de escisión química. Véase, por ejemplo Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985).

En otra realización, puede construirse una matriz de sondas de oligonucleótidos que comprenda secuencias de nucleótidos de BASB111 o fragmentos de las mismas, para realizar una selección eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación o identificación taxonómica. Los procedimientos de tecnología de matrices son bien conocidos, tienen aplicación general y puede usarse para responder una diversidad de cuestiones en enética molecular que incluyen la expresión génica, el ligamiento genético y la variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science, 274: 610 (1996)).

De este modo, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia nucleotídica de la ID SEC Nº 1 o un fragmento de la misma;

(b) una secuencia nucleotídica complementaria a la de (a);

(c) un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la ID SEC Nº 2 o un fragmento del mismo; o

(d) un anticuerpo frente a un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la ID SEC Nº 2.

Se apreciará que cualquiera de estos kit, (a), (b), (c) o (d) puede contener un componente sustancial. Este kit se usará para diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad para una enfermedad, entre otros.

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente, de ID SEC Nº 1, que se asocia con una enfermedad o patogenicidad, proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede añadirse a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico del transcurso de una enfermedad, una determinación de una etapa de la enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, que son el resultado de la subexpresión, sobreexpresión, o expresión alterada del polinucleótido. Pueden detectarse organismos, particularmente organismos infecciosos, que tienen mutaciones en este polinucleótido a nivel de polinucleótido por una diversidad de técnicas, tales como las descritas en algún punto de este documento.

También pueden detectarse a nivel de polinucleótido o polipéptido células de un organismo portador de mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención por una diversidad de técnicas, permitiendo, por ejemplo, el serotipaje. Por ejemplo, puede usarse RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente usar RT-PCR junto con sistemas de detección automatizada, tal como, por ejemplo, GeneScan. También pueden usarse para el mismo fin PCR de ARN, ADNc o ADN genómico. Por ejemplo, pueden usarse cebadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB111 para identificar y analizar mutaciones.

La invención además proporciona cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados de los extremos 5' y/o 3'. Estos cebadores pueden usarse para, entre otras cosas, amplificar el ADN y/o ARN de BASB111 aislado a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores pueden usarse para amplificar un polinucleótido aislado a partir de un individuo infectado, de forma que el polinucleótido a continuación puede someterse a diversas técnicas para elucidar la secuencia polinucleotídica. De esta modo, las mutaciones en la secuencia polinucleotídica puede detectarse y usarse para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su etapa o transcurso, o para serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención además proporciona un procedimiento para diagnosticar infecciones causadas por Moraxella catarrhalis, que comprende determinar a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un niveles elevado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia de ID SEC Nº 1. El aumento o disminución de la expresión de un polinucleótido BASB111 puede medirse usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de RNAsa, transferencia de tipo Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, puede usarse un ensayo diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la sobreexpresión del polipéptido BASB111 comparada con las muestras de tejido control normal para detectar, por ejemplo, la presencia de una infección. Las técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de un polipéptido BASB111, en una muestra derivada de un hospedador, tales como material corporal, son bien conocidas por los expertos en la materia. Estos procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de tipo Western, ensayos de anticuerpos de tipo "sándwich", detección de anticuerpo y ensayos de tipo ELISA.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como componentes de matrices de polinucleótidos, preferiblemente matrices o cuadrículas de alta densidad. Estas matrices de alta densidad son particularmente útiles para fines diagnósticos y pronósticos. Por ejemplo, puede usarse un conjunto de manchas que comprenden un gen diferente y, además, un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, como sonda, tal como usando hibridación o amplificación de ácidos nucleicos, usando una sonda obtenida o derivada de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia polinucleotídica particular o secuencia relacionada en un individuo. Esta presencia puede indicar la presencia del patógeno Moraxella catarrhalis y puede ser útil para diagnosticar y/o pronosticar una enfermedad o el transcurso de una enfermedad. Se prefiere una cuadrícula que comprenda varias variantes de la secuencia polinucleotídicos de la ID SEC Nº 1. También se prefiere una cuadrícula que comprenda varias variantes de una secuencia polinucleotídica que codifique la secuencia polipeptídica de la ID SEC Nº 2.

Anticuerpos

Pueden usarse los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos, como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para estos polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos frente a polipéptidos o polinucleótidos BASB111.

Los anticuerpos generados frente a los polipéptidos o polinucleótidos de la invención pueden obtenerse administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos portadores de epítopes de cualquiera o de ambos, análogos de cualquiera o de ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal, preferiblemente no humano, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales puede usarse cualquier técnica conocida en la materia que proporciona anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como las de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., pág. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Las técnicas de producción de anticuerpos de cadena única (Patente de EE.UU. Nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena única frente a los polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. También pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos inmunoespecíficos humanizados frente a los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

De forma alternativa, puede utilizarse tecnología de despliegue de bacteriófagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión a un polipéptido de la invención a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos humanos seleccionados por poseer anti-BASB111 o a partir de bibliotecas vírgenes (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10, 779-783). También puede mejorarse la afinidad de estos anticuerpos, por ejemplo, mediante la redistribución de cadenas (Clackson y col.,

\hbox{(1991)  Nature   352 : 628).}

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislarse o para definir clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención, para purificar los polipéptidos o polinucleótidos, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.

De este modo, entre otros, pueden emplearse anticuerpos frente al polipéptido BASB111 o al polinucleótido BASB111 para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes polipeptídicas, que incluyen variantes antigénicas, epitópica o inmunológicamente equivalentes, forman un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacer éste menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano, el anticuerpo puede ser más preferiblemente "humanizado", cuando la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado del hibridoma se ha trasplantado a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, como se describe en Jones y col. (1986), Nature 321, 522-525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas y agonistas: Ensayos y moléculas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención también puede usarse para valorar la unión de moléculas de sustratos y ligandos pequeñas en, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1 (2): Capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección puede simplemente medir la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que portan el polipéptido o polinucleótido, o a una proteína de fusión del polipéptido mediante un marcador asociado directa o indirectamente con le compuesto candidato. De forma alternativa, el procedimiento de selección puede implicar competición con un competidor marcado. Además, estos métodos de selección pueden comprobar si el compuesto candidato da lugar a una señal generada por la activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiada a las células que contienen el polipéptido o polinucleótidos. En general se ensayan los inhibidores de la activación en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación por el agonista en presencia del compuesto candidato. Pueden emplearse polipéptidos activos de manera constitutiva y/o polipéptidos y polinucleótidos expresados de forma constitutiva en procedimientos de selección de agonistas inversos o inhibidores, en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto candidato da lugar a la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contenga un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, medir la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB111 de la mezcla y compara la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB111 de la mezcla con un patrón. Las proteínas de fusión, tales como las hechas a partir de porciones Fc y del polipéptido BASB111, como las descritas en este documento, pueden usarse también para ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos relacionados filogenéticamente y/o funcionalmente (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995) y K.Johanson y col., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen y/o interaccionan con un polipéptido de la presente invención pueden usarse también para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos en la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, se puede construir un ensayo de tipo ELISA para medir los niveles de polipéptido secretado o asociado a células usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Esto se puede utilizar para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también denonimando antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente.

La invención también proporciona compuestos de un procedimiento de selección para identificar aquellos que potencian (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de polipéptidos o polinucleótidos BASB111, particularmente, aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, la selección de agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción sintética, un compartimento celular, tal como una membrana, envoltura celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de ellos, que comprende el polipéptido BASB111 y un sustrato o ligando marcado que se incuba en presencia o ausencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASB111. La capacidad de la molécula candidata para ser agonista o antagonista del polipéptido BASB111 se refleja en la disminución de la unión del ligando marcado o disminución de la producción del producto a partir de este sustrato. Las moléculas que se unen de forma gratuita, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB111, son las que con mayor probabilidad son buenos agonistas. Son agonistas las moléculas que se unen bien y, como puede ser el caso, aumentan la tasa de producción del producto a partir del sustrato, aumentan la transducción de señales o aumentan la actividad de canales químicos. La detección de la tasa o nivel de, como puede ser el caso, producción de producto a partir del sustrato, transducción de señales o actividad del canal químico pueden potenciarse usando un sistema indicador. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen, pero sin limitaciones, colorimétricos, sustrato marcado que se convierte en producto, un gen indicador que es responsable de cambios en la actividad del polinucleótido o polipéptido BASB111 y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de ensayo para agonistas de BASB111 es un ensayo competitivo que combina BASB111 y un agonista potencial con las moléculas de unión a BASB111, moléculas de unión a BASB111 recombinantes, sustratos o ligandos naturales o sustratos o ligandos miméticos, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitivo. BASB111 puede marcarse, tal como con radiactividad o un compuesto colorimétricos, de modo que puede determinarse con exactitud el número de moléculas BASB111 unidas a una molécula de unión o convertidas en producto para valorar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y, de ese modo, inhiben o extinguen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido, tal como una proteína o anticuerpo estrechamente relacionado que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir las actividades inducidas por BASB111, previniendo, así, la acción o expresión de los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB111 descartando la unión de los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB111.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que ocupa el sitio de unión del polipéptido, previendo así la unión de moléculas de unión celulares, de modo que se previene la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitaciones, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas similares a péptidos. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con variantes de BASB111.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas por ingeniería genética compuestas de un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, en particular la IgG1, donde la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización en particular, puede retirarse la parte Fc simplemente incorporando una secuencia de escisión que pueda escindirse con el factor de coagulación sanguínea Xa. Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética y al uso de estas en la selección de fármacos, diagnóstico y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las solicitudes de patente internacional Nº WO94/29458 y WO94/22914.

Cada una de las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en este documento puede usarse en el descubrimiento o desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada tras la expresión puede usarse como diana para la selección de fármacos antibacterianos. De forma adicional, pueden usarse las secuencias polinucleotídicas que codifican las regiones amino terminales de la proteína codificada o Shine-Dalgarno, u otras secuencias que facilitan la traducción del ARNm respectivo, para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificadora de interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y una hospedador eucariota, preferiblemente mamífero, responsable de las secuelas de la infección. En particular, las moléculas de la invención pueden usarse: en la prevención de la adhesión de bacterias, en particular bacterias gram positivas y/o gram negativas, a proteínas de la matriz extracelular eucariota, preferiblemente de mamíferos, en dispositivos médicos o a proteínas de la matriz extracelular en heridas, para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de la matriz extracelular eucariota, preferiblemente mamíferos, y proteínas BASB111 bacterianas que median en el daño tisular y/o para bloquear la progresión normal de la patogénesis en infecciones iniciadas por motivos diferentes de la implantación de dispositivos médicos o por otras técnicas quirúrgicas.

Aún de acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan agonistas y antagonistas de BASB111, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención pueden emplearse, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimotopes del polipéptido de la invención. Un mimotope es una secuencia peptídica, suficientemente similar al péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que es capaz de ser reconocido por anticuerpos que reconocen el péptido nativo o es capaz de generar anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se une a un vehículo adecuado.

Pueden diseñarse mimotopes peptídicos para un fin en particular mediante la adición, deleción o sustitución de los aminoácidos elegidos. De este modo, pueden modificarse los péptidos con el fin de facilitar la conjugación a un vehículo proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación incluir una cisteína terminal. Además, puede ser deseable para los péptidos conjugados con un vehículo proteico incluir un extremo hidrófobo distal del extremo conjugado del péptido, de modo que el extremo no conjugado libre del péptido permanezca asociado con la superficie de la proteína vehículo. Presentándose así el péptido en una conformación que recuerda más estrechamente a la del péptido como se encuentra en el contexto de la molécula completa. Por ejemplo, pueden alterarse los péptidos para que tengan una cisteína N-terminal y una cola C-terminal hidrófoba amidada. De forma alternativa, puede realizarse la adición o sustitución de una forma D-estereoisómera de uno o más de los aminoácidos para crear un derivado propicio, por ejemplo, para potencial la estabilidad del
péptido.

De forma alternativa, los mimotopes peptídicos pueden identificarse usando anticuerpos que son capaces por sí solos de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como la tecnología de despliegue de fagos (Documento EP 0 552 267B1). Esta técnica genera una gran número de secuencias peptídicas que mimetizan la estructura de los péptidos nativos y son, por tanto, capaces de unirse a anticuerpos anti-péptido nativo, pero pueden no compartir necesariamente por sí mismos homología de secuencia significativa con el polipéptido
nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente humanos, que comprende inocular al individuo con un polinucleótido y/o polipéptido BASB111, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir una respuesta inmune de anticuerpo y/o de células T para proteger a dicho individuo de una infección, particularmente infección bacteriana y más particularmente una infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan procedimientos donde esta respuesta inmunológica retrasa la replicación viral. Aún otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir la respuesta inmunológica en un individuo, que comprende suministrar a este individuo un vector, secuencia o ribozima de ácido nucleico para dirigir la expresión del polinucleótido y/o polipéptido BASB111, o un fragmento o una variante del mismo para expresar el polinucleótido y/o polipéptido BASB111 o un fragmento o una variante del mismo in vivo para inducir una respuesta inmunológica, tal como, producir una respuesta inmune de anticuerpo y/o de células T, incluyendo, por ejemplo, células T que producen citoquinas o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferiblemente un humano, de una enfermedad, esté esa enfermedad establecida o no en el individuo. Un ejemplo de la administración del gen es impulsar éste dentro de la célula deseada en forma de recubrimiento de partículas o de otra cosa. Este vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo ADN-proteína o un complejo ARN-proteína.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un humano, capaz de haber inducido en él una respuesta inmune, induce una respuesta inmunológica en este individuo frente a un polinucleótido y/o polipéptido BASB111 codificado a partir de éste, en el que la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB111 codificado a partir de éste y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido o polipéptido BASB111 codificado a partir de éste u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede usarse de forma terapéutica o profiláctica y puede tomar la forma de inmunidad por anticuerpos y/o inmunidad celular, tal como la inmunidad celular surgida a partir de CTL o células T CD4+.

Un polipéptido BASB111 o un fragmento del mismo puede fusionarse con una coproteína o resto químico que puede o no producir anticuerpos por sí mismo, pero que es capaz de estabilizar a la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas y, preferiblemente, propiedades protectoras. De este modo, la proteína recombinante fusionada, preferiblemente comprende de forma adicional una coproteína antigénica, tal como la lipoproteína D de Haemophilus influenzae, Glutatión-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubilice la proteína y que facilite la producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La coproteína puede unirse al extremo amino o al carboxilo terminal de la primera proteína.

En una composición para vacuna según la invención, puede estar presente en un vector un polinucleótido y/o polipéptido BASB111 o un fragmento, un mimotope o una variante del mismo, tales como los vectores recombinantes vivos descritos anteriormente, por ejemplo, vectores bacterianos vivos.

También son adecuados para el polipéptido BASB111 vectores no vivos, por ejemplo "vesículas" o vesículas de membrana externa bacteriana. Las vesículas de ME derivan de la capa externa de la membrana de doble capa de bacterias Gram negativas y se ha documentado en muchas bacterias Gram negativas (Zhou, L y col. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228) incluyendo C. trachomatis y C. psittaci. También se incluye una lista no muy exhaustiva de patógenos bacterianos de los que se ha informado que producen vesículas: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Esherichia coli, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolítica.

Las vesículas tienen la ventaja de proporcionar proteínas de la membrana externa en su conformación nativa y de este modo son particularmente útiles para vacunas. Las vesículas también pueden mejorarse para su uso en vacunas mediante ingeniería genética de bacterias para modificar la expresión de una o más moléculas en el membrana externa. De este modo, por ejemplo, se puede introducir o regular por incremento (por ejemplo, alterando el promotor) la expresión de una proteína inmunogénica deseada en la membrana externa, tal como el polipéptido BASB111. En su lugar, o además, se puede regular por disminución la expresión de moléculas de la membrana externa que no son relevantes (por ejemplo, antígenos no protectores o proteínas inmunodominantes pero variables) o perjudiciales (por ejemplo, moléculas tóxicas como LPS, o inductores potenciales de una respuesta inmune). Estas aproximaciones se discuten con más detalle a continuación.

Las regiones flanqueantes no codificadoras del gen BASB111 contienen elementos reguladores importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel transcripcional como de la traducción. La secuencia de estas regiones, antes del extremo 5' y después del extremo 3’ de la fase de lectura abierto del gen puede obtenerse mediante secuenciación del ADN. Esta información de secuencia permite la determinación de motivos reguladores potenciales tal como los diferentes elementos promotores, secuencias terminadoras, elementos de secuencia inducibles, represores, elementos responsables de la variación de fase, la secuencia de Shine-Dalgarno, regiones con estructura secundaria potencial implicadas en la regulación, así como otros tipos de motivos o secuencias reguladores. Esta secuencia es un aspecto adicional de la invención.

Esta información de secuencia permite la modulación de la expresión natural del gen BASB111. La regulación por incremento de la expresión génica puede llevarse a cabo alterando el promotor, la secuencia de Shine-Dalgarno, elementos represores u operadores potenciales o cualquier otro elemento implicado. Asimismo, la regulación por disminución de la expresión puede llevarse a cabo mediante tipos de modificación similares. Alternativamente, cambiando las secuencias de variación de fase, la expresión del gen puede ponerse bajo el control le variación de fase o puede desacoplarse de esta regulación. En otra aproximación, la expresión del gen puede ponerse bajo el control de uno o más elementos inducibles que permitan una expresión regulada. Los ejemplos de esta regulación incluyen, pero sin limitaciones, la inducción por cambio de temperatura, la adición de sustratos inductores como carbohidratos seleccionados o sus derivados, oligoelementos, vitaminas, cofactores, iones metálicos, etc.

Estas modificaciones, como se describen anteriormente, pueden introducirse por varios medios diferentes. La modificación de secuencias implicadas en la expresión génica puede llevarse a cabo in vivo mediante mutagénesis al azar seguida por la selección del fenotipo deseado. Otra aproximación consiste en aislar la región de interés y modificarla mediante mutagénesis al azar o mutagénesis de sustitución, inserción o deleción dirigida a sitio. La región modificada puede volverse a introducir a continuación en el genoma bacteriano por recombinación homóloga y puede ensayarse el efecto sobre la expresión génica. En otra aproximación, el conocimiento de la secuencia de la región de interés puede usarse para sustituir o delecionar todas o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora dirigida se aisla y modifica para contener los elementos reguladores de otro gen, una combinación de elementos reguladores de diferentes genes, una región reguladora sintética o cualquier otra región reguladora, o delecionar partes seleccionadas de la secuencia reguladora de tipo silvestre. Entonces, estas secuencias modificadas pueden volverse a introducir en la bacteria a través de recombinación homóloga en el genoma. Una lista no muy exhaustiva de los promotores preferidos que podrían usarse para la regulación por incremento de la expresión génica incluye los promotores porA, porB, lbpB, tbpB, p111, lst, hpuAB de N. meningitidis o N gonorroheae, ompCD, copB, lbpB, ompE, UspA1; UspA2; TbpB de M. catarrhalis; p1, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmwl, Hmw2 de H. influenzae.

En un ejemplo, la expresión del gen puede modularse intercambiando sus promotores con un promotor más potente (por aislamiento de la secuencia antes del extremo 5’ del gen, modificación in vitro de esta secuencia y reintroducción en el genoma por recombinación homóloga). La expresión regulada por incremento puede obtenerse tanto en la bacteria como en las vesículas de la membrana externa liberadas (o hechas) desde la bacteria.

En otros ejemplos, las aproximaciones deseadas pueden usarse para generar cepas bacterianas recombinantes con características mejoradas para aplicaciones en vacunas. Estas pueden ser, pero sin limitaciones, cepas atenuadas, cepas con expresión incrementada de antígenos seleccionados, cepas que no expresan (o expresión disminuida) genes que interfieren con la respuesta inmune, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con liberación modulada de vesículas de membrana externa.

De este modo, también se proporciona en la invención una región secuencia arriba modificada del gen BASB111, cuya región antes del extremo 5' modificada contiene un elemento regulador heterólogo que altera el nivel de expresión de la proteína BASB111 localizada en la membrana externa. La región antes del extremo 5' según este aspecto de la invención incluye la secuencia antes del extremo 5' del gen BASB111. La región antes del extremo 5' empieza inmediatamente antes del extremo 5' del gen BASB111 y normalmente continúa hasta una posición no más allá de aproximadamente 1000 pb antes de extremo 5' del gen desde el codon de inicio ATG. En el caso de un gen localizado en una secuencia policistrónica (operón), la región antes de extremo 5’ puede empezar precediendo inmediatamente al gen de interés, o precediendo al primer gen en el operón. Preferiblemente, una región antes del extremo 5' modificada según este aspecto de la invención contiene un promotor heterólogo en una posición entre 500 y 700 pb antes del extremo 5' del ATG.

De este modo, la invención proporciona un polipéptido BASB111, en una vesícula bacteriana modificada. La invención, además proporciona células hospedadoras modificadas capaces de producir vectores de vesículas de membrana no viva. La invención además proporciona vectores de ácido nucleico que comprenden el gen BASB111 que tiene una región antes del extremo 5' modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

Adicionalmente, la invención proporciona procedimientos para preparar las células hospedadoras y las vesículas bacterianas según la invención.

Esta invención proporciona composiciones, particularmente composiciones para vacuna, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, como las descritas en Sato, Y. y col. Science 273: 352 (1996).

Esta invención también proporciona procedimientos que usan el polinucleótido descrito, o fragmentos particulares del mismo que se ha demostrado codifican regiones no variables de proteínas de la superficie celular bacteriana, en construcciones polinucleotídicas usadas en tales experimentos de inmunización genética en modelos de animales de infección con Moraxella catarrhalis. Estos experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopes proteicos capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que esta aproximación permitirá la posterior preparación de anticuerpos monoclonales derivados a partir del órgano requerido del animal que resiste o aclara una infección con éxito, de especial valor para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente la infección por Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente en humanos.

La invención también incluye una formulación para vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puesto que los polipéptidos y los polinucleótidos pueden degradarse en el estómago, cada uno se suministra preferiblemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas o no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente con la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en condiciones de liofilización que sólo requieren la adición del vehículo líquido estéril

\hbox{inmediatamente antes de su uso.}

La formulación para vacuna de la invención puede incluir también sistemas de adyuvante para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema de adyuvante provoca preferentemente una respuesta de tipo TH1.

Una respuesta inmune puede diferenciarse en líneas generales en dos categorías extremas, que son respuesta inmune humoral o repuesta mediada por células (caracterizadas tradicionalmente por mecanismos efectores de protección por anticuerpos y celular, respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células) y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes de tipo TH1 extremas se pueden caracterizar por la generación de antígenos específicos, linfocitos T citotóxicos restringidos a haplotipo y respuestas de células asesinas naturales. En ratones las respuestas de tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en humanos estas corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplia gama de isotipos de inmunoglobulina incluyendo en ratones IgG1, IgA e IgM.

Se puede considerar que la fuerza motriz que hay detrás del desarrollo de estos dos tipos derespuesta inmune son las citoquinas. Niveles elevados de citoquinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes mediadas por células frente a un determinado antígeno, mientras que niveles elevados de citoquinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales frente al antígeno.

La distinción entre respuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmune que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citoquinas en los términos descritos por Mosmann y Coffman para los clones de células T CD4 +ve murinos (Mosmann, T.R y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties Annual Review of lmmunology, 7, pag. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 se asocian con la producción por los linfocitos T de las citoquinas INF-\gamma e IL-2 . Otras citoquinas a menudo asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no son producidas por las células T, tal como la IL-2. Por el contrario, las respuestas de tipo TH2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citoquinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del balance TH1: TH2 de la respuesta inmune tras una vacunación o infección incluyen la medida directa de la producción de citoquinas TH1 o TH2 por los linfocitos T in vitro tras la reestimulación con el antígeno y/o la medida de la proporción IgG1: IgG2a de respuestas de anticuerpos específicos de antígeno.

De este modo, un adyuvante de tipo TH1 es aquel que estimula preferiblemente poblaciones de células T aisladas para producir niveles elevados de citoquinas de tipo TH1 cuando se reestimulan in vitro con antígeno y promueve el desarrollo tanto de respuestas de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de inmunoglobulina específica de antígeno, asociadas con el isotipo de tipo TH1.

En la Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209 se describen adyuvantes que son capaces de estimular preferentemente la respuesta de células TH1.

Uno de estos adyuvantes es el monofosforil-lípido A 3-O-desacetilado (3D-MPL). Se conoce a partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil-lípido A 3-O-desacetilado con las cadenas 4, 5 ó 6 acetiladas y es fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida de monofosforil-lípido A 3-O-desacetilado se describe en la Patente Europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals S.A.).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas como para ser esterilizadas mediante filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros (Patente Europea número 0 689 454). El 3D-MPL se presentará en el intervalo de 10 \mug-100 \mug, preferiblemente 25-50 \mug por dosis en el que el antígeno se presentará típicamente en un intervalo de 2-50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina. Opcionalmente esta puede mezclarse con monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.057.540.

Se han descrito previamente (documento WO96/33739) formulaciones de adyuvantes no reactogénicos que contienen QS21. Se ha comprobado que estas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol son adyuvantes estimuladores de TH1 que tienen éxito cuando se formulan junto con un antígeno.

Adyuvantes adicionales que estimulan preferentemente la respuesta de células TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias CpG no metiladas como se describe en el documento WO 96/02555.

También se contempla que combinaciones de diferentes adyuvantes estimuladores de TH1, como las mencionadas anteriormente en este documento, proporcionan un adyuvante que es un estimulador preferente de respuesta de células TH1. Por ejemplo, QS21 puede formularse junto con 3D-MPL. La proporción de QS21: 3D-MPL será típicamente del orden de 1: 10 a 10:1; preferiblemente de 1:5 a 5:1 y a menudo sustancialmente 1: 1. El intervalo preferido de sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:1 3D-MPL:QS21.

Preferiblemente también está presente un vehículo en la composición para vacuna según la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de
aluminio.

Una emulsión de aceite-en-agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos en la composición para vacuna según la invención se combina con QS21 y 3D-MPL en esta emulsión. De forma adicional, la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente para la administración a humanos, QS21 y 3D-MPL se presentarán en una vacuna en el intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal como 10-100 \mug, preferiblemente de 10 \mug-50 \mug por dosis. Típicamente, la emulsión de aceite en agua comprenderá del 2 al 10% de escualeno, del 2 a 10% de alfa tocoferol y del 0,3 al 3% de Tween 80. Preferiblemente la proporción de escualeno:alfa tocoferol es igual o menor que 1 ya que esta proporciona una emulsión más estable. El span 85 también puede estar presente a un nivel del 1%. En algunos casos, puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan un estabilizador adicional.

Las emulsiones no tóxicas de aceite en agua contienen preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo, escualano o escualeno y un emulsionante, por ejemplo, Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

En el documento WO 95/17210 se describe una formulación de adyuvante especialmente potente que implica a QS21, 3D-MPL y tocoferolin, en una emulsión de aceite en agua.

La presente invención también proporciona una composición para vacuna polivalente que comprende una formulación para vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para el tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunes y dolencias relacionadas. Esta composición para vacuna polivalente puede incluir un adyuvante inductor de TH1 como se ha descrito anteriormente en este documento.

Mientras que la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB111, se debe entender que esta cubre fragmentos de los polipéptidos o polinucleótidos naturales, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones que no afecten sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB111 y/o un polipéptido BASB111 para su administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido discutido en este documento o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse en combinación con un vehículo o vehículos estériles o no estériles para su uso con células, tejidos organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Estas composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo al medio o una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos vehículos pueden incluir, pero sin limitaciones, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración. La invención además se refiere a envases y kits diagnósticos y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente.

Se pueden emplear polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención por separado o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

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Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en cualquier forma conveniente y eficaz incluyendo, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

El agente activo puede administrarse a un individuo, en terapia o como un profiláctico, como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótico de la presente invención, péptido agonista o antagonista o compuesto de molécula pequeña, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos vehículos incluyen, pero sin limitaciones, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La invención además se refiere a envases y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente. Se pueden emplear polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención por separado o junto con otros compuestos, como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo, mediante una vía sistémica u oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente mediante inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías de inyección, como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Medios alternativos para la administración sistémica incluyen administración transmucosa y transdérmica usando agentes de penetración como sales biliares, ácido fusídico u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos puede ser también tópica y/o localizada, en forma de pomada, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos, y particularmente a humanos, se espera que el nivel de dosificación diario del agente activo será de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente alrededor de 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la dosis real que será la más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplos de un caso promedio. Puede haber, por supuesto, casos individuales que merezcan intervalos de dosificación superiores o inferiores, y éstos están dentro del alcance de la invención.

El intervalo de dosificación necesario depende de la elección del péptido, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la dolencia del sujeto y la valoración del médico que le atiende. Las dosificaciones adecuadas, sin embargo, están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg de peso corporal del sujeto.

Una composición para vacuna está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmune. Una unidad de dosis adecuada para vacunación es de 0,5-5 microgramos/kg de antígeno, y esta dosis es administrada preferiblemente en 1-3 veces y en un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observarán efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención lo que podría impedir su administración a individuos adecuados.

Se esperan, sin embargo, amplias variaciones en la dosificación necesaria, en vista de la diversidad de compuestos disponibles y las eficacias diferentes de diversas rutas de administración. Por ejemplo, podría esperarse que la administración oral necesitará de dosificaciones superiores a las de la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas convencionales para su optimización, como se entiende bien en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos constituyen una fuente de información valiosa con la cual determinar sus estructuras bi y tridimensionales, así como para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estas aproximaciones favorecen más fácilmente el almacenamiento de la secuencia en un medio legible por ordenador y, a continuación, usar los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para buscar en una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tal como

\hbox{el paquete de
programas GCG.}

La invención también proporciona los procedimientos para el análisis de secuencias o cadenas de caracteres, en especial secuencias genéticas o secuencias de proteína codificada. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencia incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencia, tal como el análisis de identidad y similitud, análisis de la estructura de ADN, ARN y proteína, ensamblaje de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencia, determinación de marcos de lectura abierta, análisis de señales de ácidos nucleicos, análisis del uso de codones, análisis de recortes de ácidos nucleico y análisis de picos de cromatograma de secuenciación.

Se proporciona un procedimiento basado en técnicas de ordenador para realizar la identificación de homologías. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia polinucleotídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar homologías.

También se proporciona un procedimiento basado en técnicas de ordenador para realizar identificaciones de homología, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: proporcionar una primera secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia polipeptídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar homologías.

Definiciones

"Identidad", como es conocido en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, según el caso, como se determina por comparación de secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según el caso, como se determina por la coincidencia entre las cadenas de estas secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, que incluyen, pero sin limitaciones, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Se diseñan procedimientos para determinar la identidad para conseguir la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad están recopilados en programas de ordenador disponibles públicamente. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitaciones, el programa GAP del paquete de programas GCG (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. y col., J. Molec. Biol. 215:403- 410 (1990)), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988)). La familia de programas BLAST está disponible públicamente en el NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y col., J. Mol. Biol.215: 403-410 (1990). También se puede usar el bien conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992)

Penalización por hueco: 8

Penalización por longitud de hueco: 2

Un programa útil con estos parámetros está públicamente disponible como el programa "hueco" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto con no penalizaciones para huecos en los extremos).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970) Matriz de comparación: coincidencias = +10, no coincidencia = 0

Penalización por hueco: 50

Penalización por longitud de hueco: 3

Disponible como: El programa "hueco" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para las comparaciones de ácidos nucleicos.

Un significado preferido para "identidad" de polinucleótidos y polipéptidos, según el caso, se proporcionan a continuación en (1) y (2).

(1) Las realizaciones de polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad con la secuencia de referencia de la ID SEC Nº 1, en la que dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la ID SEC Nº 1: o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparado con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo compuesto por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción nucleotídica, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones 5’ ó 3’ terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones nucleotídicas se determina multiplicando el número total de nucleótidos de la ID SEC Nº 1 por el entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y a continuación, restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la ID SEC Nº 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

donde n_{n} es el número de alteraciones nucleotídicas, x_{n} es el número total de nucleótidos de la ID SEC Nº 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100% y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y donde cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea a la baja hasta el entero anterior más próximo para restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de la ID SEC Nº 2 puede crear mutaciones antisentido, de sentido erróneo o desplazamiento del marco de lectura en esta secuencia codificadora y, por lo tanto, alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de estas alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia polinucleotídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la ID SEC Nº 1, que puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el porcentaje de identidad es menos del 100%. Estas alteraciones se seleccionan entre el grupo compuesto por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de ácido nucleico, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia polinucleotídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos de la ID SEC Nº 1 por el entero que define el porcentaje de identidad, dividido entre 100 y a continuación, restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos de la ID SEC Nº 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

donde n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos de la ID SEC Nº 1, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc.. \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y donde cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea a la baja hasta el entero anterior más próximo para restarlo de x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptidos incluyen además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad con una secuencia de referencia del polipéptido de la ID SEC Nº 2, en la que dicha secuencia de polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la ID SEC Nº 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo compuesto por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de ácido nucleico, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 por el entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y a continuación, restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la ID SEC Nº 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

donde n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100% y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y donde cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea a la baja hasta el entero anterior más próximo para restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia polipeptídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la ID SEC Nº 2, que puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el porcentaje de identidad es de menos del 100% de identidad. Estas alteraciones se seleccionan entre el grupo compuesto por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 por el entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y a continuación, restando ese producto de dicho número total de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

donde n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminácidos de la ID SEC Nº 2, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc. y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y donde cualquier producto no entero de x_{a} y se redondea a la baja hasta el entero anterior más próximo para restarlo de x_{a}.

"Individuo (o individuos)", cuando se usa en este documento en referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, que incluye, pero sin limitaciones, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate y un humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente en la naturaleza en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", según se emplea el término en este documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento de recombinación, está "aislado" incluso si está todavía presente en dicho organismo, pudiendo estar organismo estar vivo o no vivo.

"Polinucleótido (o polinucleótidos)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polideoxirriblonucleótido, los cuales puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado, incluyendo regiones de cadena sencilla o doble.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero que retiene las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia nucleotídica de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia nucleotídica de la variante puede o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar lugar a sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se discute a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere de otro polipéptido de referencia en la secuencia de aminoácidos. Generalmente, las diferencias son limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y de la variante son muy similares en conjunto e idénticas en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones o deleciones en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede estar codificado o no por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser natural, como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce en la naturaleza. Las variantes no naturales de polinucleótidos y polipéptidos pueden hacerse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad (o enfermedades)" significa cualquier enfermedad causada por, o relacionada con, una infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en bebés y en niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de líquido en el oído medio, daño del nervio auditivo, retraso en el aprendizaje del habla, infección en el tracto respiratorio superior e inflamación del oído medio.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se realizaron usando técnicas convencionales, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la materia, excepto donde se describa otra cosa en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, y no limitan la invención.

Ejemplo 1

Descubrimiento y secuenciación confirmatoria del ADN del gen BASB111 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis

La secuencia de ADN del gen BASB111 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis (también denominada como cepa MC2931) se muestra en la ID SEC Nº 1. La traducción de la secuencia polinucleotídica de BASB111 se muestra en la ID SEC Nº 2.

Ejemplo 2

Construcción del plásmido para expresar BASB111 recombinante A: Clonación de BASB111

Los sitios de restricción de EcoRI y SalI introducidos por ingeniería genética en los cebadores de amplificación sentido MC-Lip2-Fn/t-RI (5' - AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAT TTT GGT AAA ATT AAT GG-3') [ID SEC Nº 3] y complementario MC-Lip2RCh/t-SaI (5'- AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG CCA GCC TTT GAT AAC ACC ATC TT - 3')[ID SEC Nº 4], respectivamente, permitían la clonación direccional de un producto de PCR en el plásmido de expresión de E. coli pTLZ2 de modo que podría expresarse una proteína BASB111 madura como una proteína de fusión que contiene una etiqueta para cromatografía de afinidad (His)6 en el extremo C-terminal. El producto de PCR de BASB111 se purificó a partir de la reacción de amplificación usando columna de centrifugación a base de gel (QiaGen) según las instrucciones de los fabricantes. Para producir los extremos EcoRI y SalI requeridos, necesarios para la clonación, los productos de PCR purificados se digirieron secuencialmente hasta la terminación con las enzimas de restricción EcoRI y SalI como recomienda el fabricante (Life Technologies). Tras la primera digestión de restricción, se purificó el producto de PCR mediante una columna de centrifugación como anteriormente para retirar las sales y se eluyó en agua estéril antes de la segunda digestión enzimática. El fragmento de ADN digerido se purificó de nuevo usando columnas de centrifugación a base de sílica gel antes del ligamiento con el plásmido pTLZ2.

B: Producción del vector de expresión

Para preparar el plásmido de expresión pTLZ2 para ligamiento, se digirió hasta la terminación de forma similar con ambas EcoRI y SalI y a continuación, se trataron con una fosfatasa de intestino de ternero (FIT. \sim0,02 unidades/pmoles del extremo 5', Life Technologies) como orienta el fabricante para prevenir el autoligamiento. Se usó aproximadamente un exceso molar de 5 veces el fragmento digerido con respecto al vector preparado para programar la reacción de ligamiento. Se realizó una reacción de ligamiento en \sim20 \mul (\sim16ºC, \sim16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica usando la ADN ligasa de T4 (\sim2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Se usó una alícuota del ligamiento (\sim5 \mul) para transformar células JM109 electrocompetentes de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Después de de período de sobrecrecimento de \sim2-3 horas a 37ºC en \sim1,0 ml de cultivo LB, las células transformadas se pusieron en placas de agar LB que contenían ampicilina (100 \mug/ml). En la selección se incluyeron antibióticos. Las placas se incubaron durante una noche a 37ºC durante \sim16 horas. Las colonias ApR individuales se picaron con palillos estériles y se usaron para inocular en placas de LB Apr recién preparadas a modo de "parches" así como \sim1,9 ml de medio de cultivo LB.ApR. Tanto las placas en parches como el medio de cultivo se incubaron durante una noche a 37ºC en un incubador convencional (placas) o en un baño de agua con agitación. Se empleó un análisis por PCR basado en células completas para verificar que los transformantes contenían la inserción del ADN de BASB111. Aquí, el \sim1,0 ml de medio de cultivo LB Ap de una noche se transfirió a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se recogieron las células por centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (\sim3 min, temperatura ambiente, \sim12.000xg). El sedimento celular se resuspendió en \sim200 \mul de agua estéril y se usó una alícuota de \sim10 \mul para programar una reacción de PCR en un volumen final de \sim50 ml que contenía ambos cebadores de amplificación, sentido y complementario, de BASB111. Las concentraciones finales de los componentes de la reacción de PCR eran esencialmente las mismas que las especificadas en el ejemplo 2 excepto en que se usaron \sim5,0 unidades de polimerasa Taq. La etapa inicial de desnaturalización a 95ºC se aumentó a 3 minutos para asegurar la ruptura térmica de las células bacterianas y la liberación del ADN plasmídico. Se usó un termociclador ABI modelo 9700 y 32 ciclos de un perfil de amplificación térmica en tres etapas, es decir, 95ºC, 45 seg; 55-58ºC, 45 seg, 72ºC, 1 min, para amplificar el fragmento BASB111 de las muestras de lisados de los transformantes. Tras la amplificación térmica, se analizó una alícuota de la reacción de \sim20 \mul mediante electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 0,8% en un tampón Tris-acetato-EDTA (TAE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron tras la electroforesis en gel mediante iluminación con UV y tinción con bromuro de etidio. Se sometió a electroforesis un patrón de tamaño molecular de ADN (1 Kb ladder, Life Technlogies) en paralelo con las muestras de ensayo y se usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Los transformantes que producían el producto de PCR de tamaño esperado se identificaron como cepas que contenían una construcción de expresión de BASB111. A continuación, se analizó la expresión inducible del BASB111 recombinante en cepas que contenían plásmidos de expresión.

C: Análisis de la expresión de transformantes PCR-positivos

Para cada transformante positivo en PCR identificado anteriormente, se inocularon \sim5,0 ml de medio LB que contenía ampicilina (100 \mug/ml) con células de la placa en parche y se cultivaron durante una noche a 37ºC con agitación (\sim250 rpm). Se inoculó una alícuota del cultivo sembrado de una noche (\sim1,0 ml) en un matraz Erlenmeyer de 125 ml que contenía \sim25 de medio de cultivo LB Ap y se cultivó a 37ºC con agitación (\sim250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una D.O. 600 de \sim0,5, es decir, fase semilogarítmica (normalmente aproximadamente de 1,5-2,0 horas). En este momento, se transfirió aproximadamente la mitad del cultivo (\sim12,5 ml) a un segundo matraz de 125 ml y se indujo la expresión de la proteína BASB111 recombinante añadiendo IPTG (solución de reserva de 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) a una concentración final de 1,0 mM. La incubación tanto del cultivo inducido con IPTG como del no inducido se continuó durante \sim4 horas más a 37ºC con agitación. Tras el periodo de inducción, se retiraron muestras (\sim1,0 ml) tanto del cultivo inducido como del no inducido y las células se recogieron por centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante \sim3 minutos. Los sedimentos celulares individuales se resuspendieron en \sim50 \mul de agua estéril, después se mezclaron con un volumen igual de tampón de muestra de SDS-PAGE de Laemlli x2 que contenía 2-mercaptoetanol y se colocó en un baño de agua hirviendo durante \sim3 min para desnaturalizar las proteínas. Volúmenes iguales (\sim15 \mul) de crudos de ambos lisados celulares inducidos con IPTG y no inducidos se cargaron en un gel por duplicado de poliacrilamida al 12% en Tris/glicina (Minigeles de 1 mm de espesor, Novex). Las muestras de lisados inducidos y no inducidos se sometieron a electroforesis junto con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de desarrollo SDS/Tris/glicina convencional (BioRad). Tras la electroforesis, se tiñó un gel con azul brillante de Coomassie R250 (BioRad) y a continuación, se destiñó para visualizar la nueva o nuevas proteínas BASB111 inducibles con IPTG. El segundo gel se sometió a electrotransferencia a una membrana de PVDF (tamaño de poro de 0,45 micrómetros, Novex) durante \sim2 horas a 4ºC usando un aparato de transferencia Mini-Protean II de BioRad y tampón de transferencia de metanol (20%) de Towbin. El bloqueo de la membrana y las incubaciones con el anticuerpo se realizaron según procedimientos bien conocidos en la técnica. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)3, seguido de un segundo anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado con HRP (QiaGen), para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante BASB111. La visualización del patrón de reactividad del anticuerpo anti-His se alcanzó usando un sustrato insoluble ABT o usando Hiperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

Ejemplo 4

Producción de BASB111 recombinante Cepa bacteriana

Se usó una cepa de expresión recombinante de E. coli JM109 que contenía un plásmido (pTLZ2) que codificaba BASB111 de M. catarrhalis para producir masa celular para la purificación de la proteína recombinante. La cepa de expresión se cultivó en placas de agar LB que contenían ampicilina a 100 \mug/ml ("Ap") para asegurarse de que se mantenía el pTLZ2. Para la crioconservación a -80ºC, la cepa se propagó en medio LB que contenía la misma concentración de antibióticos y después se mezcló con una cantidad igual de medio LB que contenía glicerol al 30% (p/v).

Medios

Los medios de fermentación usados para la producción de proteína recombinante estaban compuestos de medio YT 2x (Difco) que contenía Ap a 100 \mug/ml. Se añadió al medio para el fermentador antiespumante a 0,25 ml/l (Antiespumante 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante, se añadió al fermentador IPTG (Isopropil \beta-D-Tiogalactopiranosido) (1 mM, final).

Fermentación

Se inoculó un matraz Erlenmeyer cultivo de 500 ml, que contenía un volumen de trabajo de 50 ml, con 0,3 ml de cultivo congelado y descongelado rápidamente o con varias colonias de un cultivo selectivo en placas de agar, y se incubó durante aproximadamente 12 horas a 37\pm1ºC en una plataforma con agitación a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswich Scientific). Este cultivo sembrado se usó a continuación para inocular un fermentador de 5 l de volumen de trabajo que contenía medio YT 2x y ambos antibióticos Ap. El fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) se manejó a 37\pm1ºC, 0,2-0,4 VVM de aire inducido, 250 rpm en ruedas de paletas Rushton. No se controló el pH ni en el cultivo de siembra en matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH osciló de 6,5 a 7,3 en el fermentador. Se añadió IPTG (solución de reserva de 1,0 M, preparado en agua estéril) al fermentador cuando el cultivo alcanzó crecimiento semilogarítmico (\sim0,7 unidades de D.O. 600). Las células se indujeron durante 2-4 horas y a continuación, se recogieron por centrifugación a alta velocidad usando una centrífuga 28RS Heraeus (Sepatech) o RC5C (Sorvall Instruments). La pasta de células de conservó a -20ºC hasta su procesamiento.

Purificación Productos químicos y materiales

El imidazol, hidrocloruro de guanidinio, Tris (hidroximetilo) y EDTA (ácido etilen diamino tetracético) de grado biotecnológico o superior, todos se obtuvieron de Ameresco Chemical, Solon, Ohio. Tritón X-100 (t-Octilfenoxipolietoxi-etanol), tritón X-114, fosfato sódico, monobásico y Urea eran de grado reactivo o superior y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. El ácido acético glacial y el ácido clorhídrico se obtuvieron de Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey. El metanol se obtuvo de Fisher Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey. Pefabloc©SC (4(2-aminoetil)-benzenosulfonilfluoruro), los comprimidos de mezcla de inhibidores completos de proteasas y PMSF (fenilmetil-sulfonilfluoruro) se obtuvieron de Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. Bestatina, Pepstatina A y el inhibidor de proteasas E-64 se obtuvieron de Calbiochem, La Jolla, California. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1xPBS) se obtuvo de Quality Biological, Inc, Gaithersburg, Maryland. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (10xPBS) se obtuvieron de BioWhittaker, Walkersville, Maryland. El anticuerpo Penta-His sin BSA se obtuvo de QiaGen, Valencia, California. La IgG de cabra anti-ratón AffiniPure conjugada con peroxidasa se obtuvo de Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. La solución única de AEC se obtuvo de Zymed, Sur de San Francisco, California. Todos estos productos químicos eran de grado reactivo o superior.

La resina de Sepharosa quelante de níquel de alto flujo se obtuvo de Pharmacia, Suecia, California. Los geles de poliacrilamida de Tris-Glicina del 4-10% y del 10-20% prefabricados, todos los tampones y soluciones de desarrollo, los patrones preteñidos SeeBlue, los patrones MultiMark multicoloreados y las membranas de transferencia PVDF se obtuvieron de Novex, San Diego, California. Los kits de tinción de plata de SDS-PAGE se obtuvieron a partir de Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japón. La solución de tinción de Coomassie se obtuvo de Bio-Rad Laboratorios, Hercules, California. Los filtros de jeringa Acrodisc© PF de 0,2 m se obtuvieron de Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Los filtros de jeringa desechables GD/X de 25 mm se obtuvieron de Whatman Inc. Clifton, Nueva Jersey. El tubo de diálisis de 8.000 PMPC se obtuvo de BioDesing Inc, Od Nueva York, Carmal Nueva York. Los reactivos del ensayo de proteínas BCA y el tubo de diálisis Snake Skin de 3.500 PMPC se obtuvieron de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

Purificación de BASB111 recombinante a partir de E. coli Extracción y purificación

La pasta de células se descongeló a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Tras disgregar la pasta celular, el sobrenandante se repartió con PBS enfriado en hielo que contenía TritónX-114 al 1%.

Se retiraron las células, se calentó el extracto a 37ºC y se repartieron las fases por centrifugación.

A continuación, esta fracción se pasó a través de una resina de Sepharosa quelante de níquel de alto flujo equilibrada en PBS (pH 7,5) que contenían glicerol al 10% y Tritón X100 al 0,05%. La proteína se eluyó con el mismo tampón que contenía Imidazol 200 mM. Se recogieron las fracciones que contenían la proteína eluída, se concentraron en una célula con agitación de 10 kDa de punto de corte y a continuación, se dializaron frente a PBS que contenía Tritón X100 al 0,1%.

Como se muestra en la Figura 1-A, la proteína BASB111 purificada aparecía en análisis por SDS-PAGE como una doble migración a aproximadamente 36 kDa (masa molecular relativa estimada). Se estimó que la pureza era mayor del 90%. Ambas bandas reaccionaban frente a un anticuerpo monoclonal de ratón obtenido frente al motivo 6-Histidina (Figura 1-B).

Caracterizaciones bioquímicas Análisis por SDS-PAGE e inmunotransferencia

La proteína BASB111 recombinante purificada se separó en geles de poliacrilamida del 4-20% y se transfirió electroforéticamente a membranas PVDF a 100 V durante 1 hora como se describe previamente (Thebaine y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). A continuación, las membranas se pretrataron con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía leche desnatada en polvo al 5%. Todas las incubaciones posteriores se realizaron usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmune o suero inmune de conejo anti-His durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las membranas PVDF se lavaron dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro sódico 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Las membranas PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra frente a conejo marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratorios, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las membranas PVDF se lavaron 4 veces con tampón de lavado y se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea suministrado por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada uno.

Ejemplo 5

Producción de antisueros frente a BASB111 recombinante

Los antisueros polivalentes dirigidos frente a la proteína BASB111 se generaron vacunando dos o cuatro conejos con la proteína BASB111 recombinante purificada. Cada animal recibe un total de tres inmunizaciones por vía subcutánea de aproximadamente 10 mg de proteína BASB111 por inyección a intervalos de aproximadamente 21 días. Los animales se sangraron antes de la primera inmunización ("presangrado") y los días 49 y 56.

Los antisueros polivalentes dirigidos frente a la proteína BASB111 se generaron vacunando seis ratones con la proteína BASB111 recombinante purificada. Cada animal recibe un total de dos o tres inmunizaciones por vía subcutánea de aproximadamente 10 mg de proteína BASB111 por inyección a intervalos de aproximadamente 14 días. Los animales se sangraron antes de la primera inmunización ("presangrado") y una semana después de la última inmunización.

Los valores anti-proteína BASB111 se midieron mediante un ELISA usando proteína BASB111 recombinante purificada (4 \mug/pocillo). El valor se define como los valores del punto medio calculados mediante el modelo logístico de 4 parámetros usando el software KL Fit. Los valores obtenidos tras la inmunización para los sueros de conejos y ratones fueron de 1:270000 y 1:46500, respectivamente. Los anticuerpos se usaron como el primer anticuerpo para identificar la proteína en una transferencia de tipo Western, como se describe en el ejemplo 7 a continuación. La transferencia de tipo Western muestra la presencia de un anticuerpo anti-BASB111 en los sueros de animales inmunizados (figura 2).

Ejemplo 6

Caracterización inmunológica: Superficie expuesta de BASB111

Los valores anti-proteína BASB111 se determinaron mediante un ELISA usando células completas muertas por formalina de las cepas 14, 358, 216, 2926 de Moraxella catarrhalis (20 \mug/pocillo). El valor se define como los valores del punto medio calculados mediante el modelo logístico de 4 parámetros usando el software SoftMax Pro.

Los valores observados con los sueros inmunes de conejos (1:2600, 1:2300, 1:.430, 1:3300 respectivamente) demuestran que la proteína BASB111 se detecta en la superficie de las células de M. catarrhalis.

Ejemplo 7

Caracterización inmunológica: análisis por inmunotransferencia

M. catarrhalis ATCC 43617 se cultivó en placas de agar de Muller Hinton durante 24 horas a 36ºC. Se usaron varias colonias para inocular 50 ml de medio de cultivo BHI en un matraz de 250 ml. Los cultivos se crecieron durante aproximadamente 5 horas a 200 rpm hasta que la A 620 fue de aproximadamente 0,6 y se recogieron por centrifugación. A continuación las células se concentraron diez veces y el equivalente a 4x10^{8} UFC se solubilizó en 150 ml de tampón de muestra de PAGE (tampón Tris 360 mM, pH 8,8 que contenía dodecil sulfato sódico al 4% y glicerol al 20%) y la suspensión se incubó a 100ºC durante 5 minutos. Las células solubilizadas se separaron en geles de poliacrilamida del 4-20% y las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa a 100 V durante 1 hora como se ha descrito previamente (Thebaine y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). A continuación, las membranas de nitrocelulosa se pretrataron con 50 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 3%. Todas las incubaciones posteriores se realizaron usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas de nitrocelulosa se incubaron con 250 \mul de una dilución 1:20 del suero preinmune o de suero inmune de ratón durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las membranas de nitrocelulosa se lavaron tres veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5 que contenía cloruro sódico 150 mM y Tween-20 al 0,05%), las membranas de nitrocelulosa se incubaron con 50 ml de una dilución 1:500 de Ig de cabra anti-ratón marcada con biotina (Amersham Life Sciences Products) durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la membranas de nitrocelulosa se lavaron 3 veces con tampón de lavado y se incubaron con 50 ml de una dilución 1:1000 de estreptavidina-peroxidasa (Amersham) durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las membranas de nitrocelulosa se lavaron 3 veces con tampón de lavado y se desarrollaron con 4-cloro-1-naftol suministrado por Sigma durante diez minutos cada uno.

En las cepa ATCC 43617 de Moraxella se detectó una proteína de aproximadamente 29 kDa (que se corresponde con el peso molecular esperado de BASB111) que es reactiva con los antisueros (figura 3).

Ejemplo 8

Caracterización inmunológica: actividad bactericida

La actividad citotóxica mediada por complemente de los anticuerpos anti-BASB111 se examinó para determinar el potencial como vacuna del antisuero frente a la proteína BASB111 preparado como se describe anteriormente. Las actividades del suero preinmune y del antisuero anti-BASB111 se examinaron en muerte de M. catarrhalis mediada por complemento.

Las cepas de M. catarrhalis se cultivaron en placas de Mueller Hinton durante 24 horas a 36ºC. Se añadieron varias colonias a 15 ml de BHI en los matraces de 125 ml. Los cultivos se crecieron durante 4 horas a 200 rpm hasta la A620 = 0,4. Tras una etapa de lavado, el sedimento se resuspendió en HBSS y la cepa se diluyó hasta obtener 28.500 UFC por mililitro.

Se depositaron 50 \mul de sueros preinmunes y del los sueros anti-BASB111 (inactivados a 56ºC durante 30 minutos) en el primer pocillo de una placa de 96 pocillos y en los otros pocillos de la misma línea se depositaron diluciones 1/2 en HBSS. Posteriormente, se añadieron 25 \mul de M. catarrhalis viva diluida y la mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. En cada pocillo se añadió complemento de cría de conejo (Pel Freez, Clinical Systems, Brown Deer, WI, EE.UU.) a una dilución de trabajo definida de antemano en un ensayo de toxicidad.

Las microplacas se cubrieron y se incubaron durante 1 hora a 37ºC a 200 rpm.

Cada ensayo incluía un control de complemento (pocillos sin suero que contenían fuentes de complemento activo o inactivado), un control positivo (pocillos que contenían suero con un valor conocido de anticuerpos bactericidas), un control de cultivo (pocillos sin complemento).

El valor bactericida del antisuero de los conejos o ratones (muerte del 50% de la cepa homóloga) era <1:60 (preinmunes) y >1:316 (inmune).

Materiales depositados

Un depósito que contenía una cepa de Moraxella catarrhalis Catlin se depositó en la American Type Culture Collection (en este documento "ATCC") el 21 de junio de 1997 y se le asignó el número de depósito 43617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosck y Kolle) y es una biblioteca liofilizada con una inserción de 1,5-2.,9 kb construida a partir de un aislado de M. catarrhalis obtenido de un aspirado transtraqueal de un minero del carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents. Chemother. 21: 506-508 (1982).

El depósito de la cepa de Moraxella catarrhalis se denomina en este documento como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen BASB111 de longitud completa.

Un depósito del vector pMC-ORF1/2 que consta del ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y se le asignó el número de depósito 207118.

Las secuencias de los polinucleótidos contenidas en la cepa o clon depositados, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado por estas, es determinante en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de las secuencias de este documento.

El depósito de las cepas depositadas se hizo en los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con fines de Procedimientos de Patentes. Las cepas depositadas estarán, de forma irrevocable y sin restricción o condiciones, a disposición pública para los expertos en la materia y no son un reconocimiento de que se requiere de un depósito para el permiso, tal como se establece en el título 35 del U.S.C.\NAK112.

1

\newpage

Información de las secuencias

Secuencias del polinucleótido y polipéptido BASB111

ID SEC Nº 1

Secuencia del polinucleótido BASB111 de la cepa ATCC43617 de Moraxella catarrhalis

2

ID SEC Nº 2

Secuencia del polipéptido BASB111 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de la

ID SEC Nº 1

3

ID SEC Nº 3

AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAT TTT GGT AAA ATT AAT GG

ID SEC Nº 4

AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG CCA GCC TTT GAT AAC ACC ATC TT

<110> SmithKline Beecham S. A.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Compuestos nuevos

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BM45395

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows, Versión 3.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 831

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\vskip1.000000\baselineskip

4

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggacagaggg aattcatgaa ttttggtaaa attaatgg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcagaggg tcgacttaat ggtgatggtg atggtgccag cctttgataa caccatctt

\hfill

59

Claims (28)

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 2.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1 en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

3. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

4. Un polipéptido aislado de la ID SEC Nº 2.

5. Un fragmento inmunogénico que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2, cuyo fragmento (si es necesario cuando se une a un vehículo) es capaz de originar una respuesta inmune que reconoce al polipéptido de la ID SEC Nº 2.

6. Un polipéptido o un fragmento inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico es parte de una proteína de fusión mayor.

7. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido o un fragmento inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2 sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 2, o una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado.

9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos el 85% de identidad con una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de la ID SEC Nº 2 sobre la región codificadora completa, o una secuencia nucleotídica complementaria con dicho polinucleótido aislado.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos el 85% de identidad con la de la ID SEC Nº 1 sobre la longitud completa de la ID SEC Nº 1, o una secuencia nucleotídica complementaria con dicho polinucleótido aislado.

11. El polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en la que la identidad es al menos del 95% con la ID SEC Nº 1.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de la ID SEC Nº 2, o el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5 ó 6.

13. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de la ID SEC Nº 1.

14. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de la ID SEC Nº 2, obtenible seleccionando una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de la ID SEC Nº 1 o un fragmento del mismo.

15. Un vector de expresión o un microorganismo vivo recombinantes que comprende un polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 7-14.

16. Un microorganismo vivo recombinante que comprende un vector de expresión según la reivindicación 15.

17. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 15.

18. Una membrana de la célula hospedadora según la reivindicación 17 que expresa un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 2.

19. Un procedimiento para producir un polipéptido o un fragmento inmunogénico de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 17 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico y recuperar el polipéptido a partir del medio de
cultivo.

20. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7-14 que comprende transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

21. Una composición para vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido o el fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Una composición para vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. La composición de vacuna según una de la reivindicación 21 ó 22 en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

24. Un anticuerpo generado frente al polipéptido o fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

25. Un procedimiento para diagnosticar una infección de Moraxella, que comprende identificar un polipéptido o un fragmento inmunológico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o un anticuerpo que es inmunoespecífico para dicho polipéptido, presente en una muestra biológica de un animal del que se sospecha que tiene esta infección.

26. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o un fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

27. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 7-14 en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

28. Una composición terapéutica útil para el tratamiento de humanos enfermos por Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo dirigido frente al polipéptido o fragmento inmunogénico de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéutico adecuado.