ES2253894T3 - Polinucleotidos y polipeptidos de moraxella catarrhalis. - Google Patents
Polinucleotidos y polipeptidos de moraxella catarrhalis.Info
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Abstract
Un polipéptido aislado capaz de inducir una respuesta inmune (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) que reconoce el polipéptido de la SEQ ID Nº 2, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2
Description
Polinucleótidos y polipéptidos de Moraxella
catarrhalis.
Esta invención se refiere a polinucleótidos,
(denominados en esta memoria descriptiva
"polinucleótido(s) BASB021)" polipéptidos
codificados por ellos (denominados en esta memoria descriptiva
"BASB021" o "polipéptido(s) BASB021"), materiales
recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto,
la invención se refiere a procedimientos para usar tales
polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra
infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se
refiere a ensayos de diagnóstico para detectar la infección de
ciertos patógenos.
Moraxella catarrhalis (también llamada
Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram - negativa
aislada frecuentemente a partir del tracto respiratorio superior
humano. Es responsable de varias patologías siendo las principales
otitis media en lactantes y niños, y neumonía en ancianos. También
es responsable de sinusitis, infecciones nosocomiales y menos
frecuentemente de enfermedades invasivas.
La otitis media es una enfermedad importante de
la infancia tanto por el número de casos como por sus secuelas
potenciales. Más de 3,5 millones de casos se registran cada caso en
los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han
experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la
edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19:823). Si se deja
sin tratar, o convirtiéndose en crónica, esta enfermedad puede
conducir a pérdidas de audición que podrían ser temporales (en el
caso de acumulación de fluidos en el oído medio) o permanente (si se
daña el nervio auditivo). En lactantes tales pérdidas de audición
pueden ser responsables de retraso en el aprendizaje del habla.
Tres especies bacterianas se aíslan
principalmente del oído medio de niños con otitis media:
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no
tipificable (NTHi), y M. catarrhalis. Están presentes en el
60 a 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra
que S. pneumoniae y NHTi representan ambos aproximadamente el
30%, y M. catarrhalis aproximadamente 15% de los casos de
otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Otras
bacterias se podrían aislar del oído medio (H. influenzae
tipo B, S. pyogenes etc.) pero en mucho menor frecuencia (2%
de los casos o menos).
Los datos epidemiológicos indican que, para los
patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto
respiratorio superior en un prerrequisito absoluto para el
desarrollo de una otitis; sin embargo también se requieren otros
para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col., (1988) J.
Infect. Dis. 158:205, Faden, HL y col., (1991) Ann. Otorhinol.
Laryngol. 100:612). Éstos son importantes para desencadenar la
migración de las bacterias en el oído medio a través de la trompa
de Eustaquio, seguido del inicio de un proceso inflamatorio. Estos
factores son actualmente desconocidos. Se ha postulado que una
anomalía transitoria del sistema inmune después de una infección
viral, por ejemplo, podría provocar una incapacidad de controlar la
colonización del tracto respiratorio (Faden, HL y col., (1994) J.
Infect. Dis. 169:1312). Una explicación alternativa es que la
exposición a los factores ambientales permite una colonización más
importante de algunos niños, que posteriormente serán susceptibles
de desarrollar otitis media debido a la presencia sustancial de
patógenos en el oído medio (Murphy, TF (1996) MIcobiol. Rev.
60:267).
La respuesta inmune a M. catarrhalis está
deficientemente caracterizada. El análisis de cepas aisladas
secuencialmente a partir de la nasofaringe de bebés de 0 a 2 años de
edad, indica que adquieren y eliminan frecuentemente nuevas cepas.
Esto indica que una respuesta inmune eficaz contra esta bacteria
está fijada por los niños colonizados (Faden, HL y col., (1994) J.
Infect. Dis. 169:1312).
En la mayoría de los adultos ensayados, se han
identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y col., (1985) J.
Infect. Dis. 151:878). Cepas de M. catarrhalis presentan
variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida
en suero: en general, los aislamientos de individuos enfermos son
más resistentes que los que están simplemente colonizados (Hol, C y
col., (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL y col., (1990) Am. J. Med
88 (supl. 5A):28S). Por lo tanto la resistencia en suero se puede
considerar como un factor de virulencia de las bacterias. Una
actividad opsonizante se ha observado en los sueros de niños que se
recuperan de otitis media.
No se han identificado los antígenos dirigidos
por estas diferentes respuestas inmunes en seres humanos, con la
excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está
regulada por hierro, y que se reconoce por el suero de pacientes con
neumonía (Sethi S, y col., (1995) Infect. Immun. 63:1516), y de
UspA1 y UspA2 (Chen D. y col., (1999), Infect. Inmun. 67:1310).
Unas otras pocas proteínas de membrana presentes
en la superficie de M. catarrhalis se han caracterizado
usando un procedimiento biológico, o por su implicación potencial
en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión, véase
Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía
de ratón, la presencia de anticuerpos originados contra alguno de
ellos UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la
infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) se conserva en gran
medida entre cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías
con un porin de Pseudomonas aeruginosa, que se ha demostrado
eficaz contra esta bacteria en modelos de animales.
La frecuencia de infección por Moraxella
catarrhalis ha aumentado dramáticamente en las pasadas pocas
décadas. Se ha atribuido a la emergencia de múltiples cepas
resistentes a antibióticos y un incremento en la población de
personas con sistemas inmunes debilitados. Ya no es inusual aislar
cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos
o todos los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una
necesidad médica insatisfecha y demanda nuevos agentes
antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de
antibióticos, y ensayos de diagnósticos para este organismo.
La presente invención se refiere a BASB021, en
particular a polipéptidos y polinucleótidos BASB021, materiales
recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto,
la invención se refiere a procedimientos para usar tales
polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo prevención y tratamiento
de enfermedades microbianas, entre otras. En un aspecto adicional,
la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar
enfermedades asociadas con infecciones microbianas y afecciones
asociadas con tales infecciones, tales como ensayos para detectar
la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos
BASB021.
Diversos cambios y modificaciones dentro del
espíritu y alcance de la invención descrita serán fácilmente
evidentes para los expertos en la técnica a partir de la lectura de
las descripciones siguientes y a partir de la lectura de otras
partes de la presente descripción.
La invención se refiere a polipéptidos y
polinucleótidos BASB021 como se describe en más detalle más
adelante. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y
polinucleótidos de BASB021 de Moraxella catarrhalis, que se
relaciona con la homología de la secuencia de aminoácidos a la
proteína de unión heme de la membrana externa HasR de Serratia
marcescens. La invención se refiere especialmente a BASB021 que
tiene las secuencias de aminoácidos y nucleótidos expuesta en la
SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2 respectivamente. Se entiende que las
secuencias citadas en la lista de secuencias más adelante como
"ADN" representan una ejemplificación de una realización de la
invención, ya que los expertos en la técnica reconocerán que tales
secuencias se pueden emplear de manera útil en polinucleótidos en
general, incluyendo ribopolinucleótidos.
En un aspecto de la invención se proporcionan
polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en esta
memoria descriptiva "BASB021" y "polipéptidos BASB021" así
como variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o
terapéuticamente útiles de los mismos, y composiciones que
comprenden los mismos.
La presente invención además proporciona:
- (a)
- un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos 97-99% de identidad o identidad exacta a la de la SEQ ID Nº 2;
- (b)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97-99% de identidad o identidad exacta a la de la SEQ ID Nº 1 en la longitud entera de la SEQ ID Nº 1; o
- (c)
- un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97-99% de identidad o identidad exacta a la de la SEQ ID Nº 2
Los polipéptidos BASB021 proporcionados en la SEQ
ID Nº 2 es el polipéptido BASB021 de las cepas de Moraxella
catarrhalis MC2931 (ATCC 43617).
La invención también proporciona un fragmento
inmunogénico de un polipéptido BASB021, es decir, una porción
contigua del polipéptido BASB021 que tiene la misma o
sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2; es
decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un vehículo)
es capaz de originar una respuesta inmune que reconoce el
polipéptido BASB021.
Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por
ejemplo, el polipéptido BASB021 que carece de una secuencia guía
N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un
dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto
preferido el fragmento inmunogénico de BASB021 de acuerdo con la
invención comprende sustancialmente todos los dominios
extracelulares de un polipéptido que tiene al menos 85% de
identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más
preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferiblemente al
menos 97-99% de identidad a la de la SEQ ID Nº 2 en
la longitud entera de la SEQ ID Nº 2.
Un fragmento es un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos que es completamente la misma que parte
pero no toda la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de
la invención. Como con los polipéptidos BASB021, los fragmentos
pueden estar "aislados" o comprendidos dentro de un polipéptido
mayor de los que forman una parte o región, lo más preferiblemente
como una única región continua en un único polipéptido mayor.
Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo,
polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia
de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2 o de una variante de la misma, tal
como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de
aminoácidos amino- y/o carboxilo terminal. También se prefieren las
formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas
por o en una célula hospedadora. Se prefieren además fragmentos
caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como
fragmentos que comprenden regiones hélice alfa y formadoras de
hélice alfa, regiones de hoja beta y formadoras de hoja beta,
regiones de giro y formadoras de giro, regiones de espiral o
formadoras de espiral, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas,
regiones antipáticas alfa, regiones antipáticas beta, regiones
flexibles, regiones formadoras de superficie, regiones de unión a
sustrato, y regiones de alto índice antigénico.
Además los fragmentos preferidos incluyen un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2, o un polipéptido
aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o
suprimidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2.
Los fragmentos de los polipéptidos de la
invención se pueden emplear para producir el polipéptido de longitud
completa correspondiente mediante síntesis de péptidos; por lo
tanto, estos fragmentos se pueden emplear como intermedios para
producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.
Se prefieren particularmente variantes en las que
varios, 5-10, 1-5,
1-3, 1-2 ó 1 aminoácidos están
sustituidos, suprimidos, o añadidos en cualquier combinación.
Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de
la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura"
o puede ser parte de una proteína mayor tal como un precursor o
proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de
aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o guía,
prosecuencias, secuencias que ayudan a la purificación tales como
residuos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para la
estabilidad durante la producción de recombinantes. Además, también
se considera la adición de secuencias de polipéptidos exógenos o de
colas de lípidos o de polinucleótidos para incrementar el potencial
inmunogénico de la molécula final.
En un aspecto, la invención se refiere a
proteínas de fusión soluble solubles modificadas genéticamente que
comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento
del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de
cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases
(IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como una inmunoglobulina la parte
constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1,
en la que tiene lugar fusión en la región bisagra. En una
realización particular, la parte Fc se puede retirar simplemente
mediante la incorporación de una secuencia de escisión que se puede
escindir con el factor Xa de coagulación de sangre.
Además, esta invención se refiere a
procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión
mediante ingeniaría genética, y al uso de los mismos para
seleccionar fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de
la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican
tales proteínas de fusión. Los ejemplos de tecnología de proteína
de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente
internacional Números WO 94/29458 y WO 94/22914.
Las proteínas pueden estar químicamente
conjugadas, o expresadas como proteínas de fusión recombinantes que
permiten que se produzca un incremento de niveles en un sistema de
expresión cuando se compara con la proteína no condensada. La
pareja de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos de células T
auxiliares (pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos
de células t auxiliares reconocidos por los seres humanos, o ayudar
en la expresión de la proteína (potenciador de expresión) a niveles
mayores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente la
pareja de fusión será tanto una pareja de fusión inmunológica como
una pareja potenciadora de expresión.
Las parejas de fusión incluyen la proteína D de
Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus
de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Otra pareja de fusión es la
proteína conocida como LytA. Preferiblemente se usa la porción
terminal C de la molécula. LytA se deriva de Streptococcus
pneumoniae que sintetiza una
N-acetil-L-alanina
amidasa LytA, (codificada por el gen LytA {Gene, 43 (1986) página
265-272}) una autolisina que específicamente
degrada ciertos enlaces en la estructura central del peptidoglicano.
El dominio C-terminal de la proteína LytA es
responsable de la afinidad a la colina o a algún análogo de colina
tal como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de
plásmidos que expresan C-LytA de E. coli
útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la
purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento
C-LytA en su extremo amino {Biotechnology: 10,
(1992) páginas 795-798}. Es posible usar la porción
repetida de la molécula de LytA encontrada en el extremo terminal C
que comienza en el residuo 178, por ejemplo los residuos
188-305.
La presente invención también incluye variantes
de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir polipéptidos
que varían entre los referentes en sustituciones conservadoras de
aminoácidos, en las que un residuo se sustituye por otro con
características similares. Tales sustituciones típicas son entre
otras Ala, Val, Leu e Ile; entre otros Ser y Thr; entre otros los
residuos ácidos Asp y Glu; entre otros Asn y Gln; y entre otros los
residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.
Los polipéptidos de la presente invención se
pueden preparar de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos
incluyen polipéptidos de origen natural aislados, polipéptidos
producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos de manera
sintética, o polipéptidos producidos mediante una combinación de
estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos se
comprenden bien en la técnica.
Lo más preferido es que un polipéptido de la
invención se derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo, se
puede obtener preferiblemente a partir de otros organismos del mismo
género taxonómico. Un polipéptido de la invención también se puede
obtener, por ejemplo, a partir de organismos de la misma familia u
orden taxonómico.
Es un objeto de la invención proporcionar
polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB021, particularmente
polinucleótidos que codifican el polipéptido denominado en esta
memoria descriptiva BASB021.
En una realización particularmente preferida de
la invención el polinucleótido comprende una región que codifica
BASBO20 que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID Nº 1 que
incluye un gen de longitud completa, o una variante del mismo.
Los polinucleótidos BASB021 proporcionados en la
SEQ ID Nº 1 son los polinucleótidos BASB021 de la cepa de
Moraxella catarrhalis MC2931 (ATCC 43617).
Como un aspecto adicional de la invención se
proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican y/o expresan
polipéptidos y polinucleótidos BASB021, incluyendo, particularmente
polipéptidos y polinucleótidos BASB021 de Moraxella
catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, los ARN no procesados, los
ARN de ribozima, los ARNm, los ADNc, los ADN genómicos, los ADN B-
y Z. Realizaciones adicionales de la invención incluyen,
polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica,
clínica o terapéuticamente útiles de los mismos, y las variantes de
los mismos, y las composiciones que los comprenden.
Otro aspecto de la invención se refiere a
polinucleótidos aislados, que incluyen al menos un gen de longitud
completa, que codifica un polipéptido BASB021 que tiene una
secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID Nº 2 y
polinucleótidos relacionados estrechamente con ellas y las variantes
de las mismas.
En otra realización particularmente preferida de
la invención existe un polipéptido BASB021 de Moraxella
catarrhalis que comprende o está constituida por una secuencia
de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2 o una variante de la misma.
Usando la información proporcionada en esta
memoria descriptiva, tal como una secuencia de polinucleótidos
expuesta la SEQ ID Nº 1, un polinucleótido de la invención que
codifica el polipéptido BASB021 se puede obtener usando
procedimientos de clonación y selección convencionales, tales como
para clonar y secuenciar fragmentos de ADN cromosómico a partir de
bacterias que usan células de Moraxella catarrhalis Catlin
como material de partida, seguido de la obtención de un clon de
longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de
polinucleótidos de la invención, tal como una secuencia de
polinucleótidos proporcionada en la SEQ ID Nº 1, típicamente una
genoteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella
catarrhalis Catlin en E. coli o algún otro hospedador
adecuado se sonda con un oligonucleótido marcado radiactivamente,
preferiblemente un 17 mer o más largo, derivado de una secuencia
parcial. Los clones que llevan ADN idéntico al de la sonda se puede
después distinguir usando condiciones restrictivas de hibridación.
Secuenciando los clones individuales así identificados mediante
hibridación con cebadores de secuenciación diseñado a partir de la
secuencia de polipéptidos o polinucleótidos polipéptido original es
posible después extender la secuencia de polinucleótidos en ambas
direcciones para determinar una secuencia de genes de longitud
completa. De manera conveniente, tal secuenciación se realiza, por
ejemplo, usando ADN de doble hebra desnaturalizado preparado a
partir de un clon de plásmido. Las técnicas adecuadas las describen
Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook y col., MOLECULAR
CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición; Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). (Véase en
particular, Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured
Double - Stranded DNA Templates 13.70). La secuenciación directa de
ADN genómico también se puede realizar para obtener una secuencia
génica de longitud completa. Como ilustración de la invención, cada
polinucleótido expuesto en la SEQ ID Nº 1 se descubrió en una
genoteca de ADN derivada de Moraxella catarrhalis.
Además, la secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID
Nº 1 contiene una fase abierta de lectura que codifica una proteína
que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácidos
expuesto en al SEQ ID Nº 2 con un peso molecular deducido que se
puede calcular usando valores de peso molecular de residuos de
aminoácidos bien conocidos por los expertos en la técnica.
El polinucleótido de referencia de la SEQ ID Nº
1, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de
parada que comienza en el nucleótido número 2842 de la SEQ ID Nº 1,
codifica el polipéptido de referencia de la SEQ ID Nº 2.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que comprende o está
constituido por:
- (a)
- una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97-99% de identidad o identidad exacta a la SEQ ID Nº 1 en la longitud entera de las SEQ ID Nº 1 respectivamente; o
- (b)
- una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97-99% de identidad o 100% exacta a la secuencia da aminoácidos de la SEQ ID Nº 2, en la longitud entera de las SEQ ID Nº 2 respectivamente.
Un polinucleótido que codifica un polipéptido de
la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos se especies
diferentes de Moraxella catarrhalis, se puede obtener
mediante un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar
una genoteca apropiada en condiciones restrictivas de hibridación
(por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo entre
45-65ºC y una concentración de SDS entre 0,1 y 1%)
con una sonda marcada o detectable que consiste o que comprende la
secuencia de la SEQ ID Nº 1 o un fragmento de la misma; y aislar un
gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha
secuencia de polinucleótidos.
La invención proporciona una secuencia de
polinucleótidos idéntica en su longitud completa a una secuencia
codificadora (fase abierta de lectura) en la SEQ ID Nº 1. También la
invención proporciona una secuencia codificadora de un polipéptido
maduro o un fragmento del mismo, por sí mismo así como una secuencia
codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento en fase de
lectura con otra secuencia codificadora, tal como una secuencia que
codifica una secuencia guía o secretora, una secuencia de pre- , o
pro- o prepro-proteína. El polinucleótido de la
invención también puede contener al menos una secuencia no
codificadora, que incluye por ejemplo, pero no se limita a al menos
una secuencia 5' y 3' no codificadora, tal como las secuencias
transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como
señales de terminación dependientes de rho o independientes de
rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias Kozak, secuencias que
estabilizan ARNm, intrones, y señales de poliadenilación. La
secuencia de polinucleótidos también puede comprender una secuencia
codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por
ejemplo, se puede codificar una secuencia de marca que facilita la
purificación del polipéptido condensado. En ciertas realizaciones de
la invención, la secuencia con marca es un péptido hexa histidina,
como se proporciona en el vector pQE (Qiagen , Inc) y descrita en
Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
821-824 (1989), o un péptido tag de HA (Wilson y
col., Cell 37: 767 (1984), los cuales pueden ser útiles en
la purificación de la secuencia de polipéptidos condensados a ellos.
Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no se
limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus
secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión
génica.
La secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido BASB021 de la SEQ ID Nº 2 puede ser idéntica a la
secuencia que codifica el polipéptido contenido en los nucleótidos 1
a 2841 de la SEQ ID Nº 1 respectivamente. Como alternativa puede ser
una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración)
del código genético, también codifica el polipéptido de la SEQ ID
Nº 2.
El término "polinucleótido que codifica un
polipéptido" como se usa en esta memoria descriptiva abarca
polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un
polinucleótido de la invención, particularmente un polipéptido
bacteriano y más particularmente un polipéptido de la Moraxella
catarrhalis BASB021 que tiene una secuencia de aminoácidos
expuesta en la SEQ ID Nº 2. El término también abarca
polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones
discontinuas quecodifican el polipéptido (por ejemplo,
polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia
de inserción integrada, una secuencia de vector integrado, una
secuencia de transposón integrado, o debido a la edición de ARN o
reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que
también pueden contener secuencias codificadoras y/o no
codificadoras.
La invención también se refiere a variantes de
los polinucleótidos descritas en esta memoria descriptiva que
codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos deducida de la SEQ ID Nº 2. Los fragmentos de
polinucleótidos de la invención se pueden usar, por ejemplo, para
sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención.
Las realizaciones adicionales particularmente
preferidas son polinucleótidos que codifican variantes de BASB021,
que tienen una secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB021 de
al SEQ ID Nº 2 en la que varios, unos pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3,
2, 1 o ningún residuo de aminoácido están sustituidos, modificados,
suprimidos y/o añadidos, en cualquier combinación. Especialmente
preferidas entre éstas están las sustituciones silenciosas,
adiciones y supresiones, que no alteran las propiedades y
actividades del polipéptido BASB021.
Realizaciones preferidas adicionales de la
invención son polinucleótidos que son al menos 85% idénticos en su
longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido
BASB021 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ
ID Nº 2, y polinucleótidos que con complementarios a tales
polinucleótidos. Como alternativa, los más preferidos son
polinucleótidos que comprenden una región que es al menos 90%
idéntica en su longitud entera a un polinucleótido que codifica el
polipéptido BASB021 y polinucleótidos complementarios a los mismos.
A este respecto, los polinucleótidos al menos 95% idénticos en su
longitud completa a los mismos se prefieren particularmente.
Además, aquellos con al menos 97% se prefieren en gran medida entre
aquellos con al menos 95%, y entre éstos aquellos con al menos 98% y
al menos 99% son en gran medida particularmente preferidos, siendo
los más preferidos con al menos 99%.
Realizaciones preferidas son polinucleótidos que
codifican polipéptidos que mantienen sustancialmente la misma
función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado
por un ADN de la SEQ ID Nº 1.
De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas
de esta invención se proporcionan polinucleótidos que se hibridan,
particularmente en condiciones restrictivas, a secuencias de
polinucleótidos de BASB021, tales como los polinucleótidos en la SEQ
ID Nº 1.
La invención además se refiere a polinucleótidos
que se hibridan a las secuencias de polinucleótidos proporcionados
en esta memoria descriptiva. A este respecto, la invención
especialmente se refiere a polinucleótidos que se hibridan en
condiciones restrictivas a los polinucleótidos descritos en esta
memoria descriptiva. Como se usa en esta memoria descriptiva, los
términos "condiciones restrictivas" y "condiciones
restrictivas de hibridación" significan hibridación que se
produce solamente si existe al menos 95% y preferiblemente al menos
97% de identidad entre secuencias. Un ejemplo específico de
condiciones restrictivas de hibridación es la incubación durante
toda una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al
50%, 5 x de SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato
sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt, sulfato de dextrano al
10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma fragmentado de salmón,
seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a
aproximadamente 65ºC. Las condiciones de lavado e hibridación se
conocen bien y se ilustran en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N. Y.,
(1989), particularmente el capítulo 11 en ese documento. La
hibridación en solución también se puede usar con las secuencias de
polinucleótidos proporcionadas por la invención.
La invención también proporciona un
polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia de
polinucleótidos obtenida mediante selección de una genoteca
apropiada que contiene el gen completo de una secuencia de
polinucleótidos expuesta en la SEQ ID Nº 1 en condiciones
restrictivas de hibridación con una sonda que tiene la secuencia de
dicha secuencias de polinucleótidos expuesta en la SEQ ID Nº 1 o un
fragmento de la misma; y aislamiento de dicha secuencia de
polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener tal
polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores totalmente
descritas en otra parte en esta memoria descriptiva.
Como se describe en otra parte en esta memoria
descriptiva con relación a los ensayos de polinucleótidos de la
invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, se
pueden usar como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN
genómico para aislar los ADNc de longitud completa y clones
genómicos que codifican BASB021 y para aislar ADNc y clones
genómicos de otros genes que tienen una identidad alta,
particularmente una alta identidad de secuencia, al gen BASB021.
Tales sondas generalmente comprenderán al menos 15 residuos de
nucleótidos o pares de bases. Preferiblemente, tales sondas tendrán
al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener
al menos 50 residuos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas
particularmente preferidas tendrán al menos 20 residuos de
nucleótidos o pares de bases y tendrán al menos 30 residuos de
nucleótidos o pares de bases.
Una región codificadora de un gen de BASB021 se
puede aislar mediante selección usando una secuencia de ADN
proporcionada en la SEQ ID Nº 1 para sintetizar una sonda de
oligonucleótidos. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia
complementaria a la de un gen de la invención se usa después para
seleccionar una genoteca de ADNc, ADN o ARNm genómico con el fin de
determinar qué miembros de la genoteca se hibridan a la sonda.
Existen varios procedimientos disponible y bien
conocidos por los expertos en la técnica para obtener los ADN de
longitud completa, o los ADN de extensión corta, por ejemplo los
basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de
ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA
85: 8998-9002, 1988). Recientes modificaciones de la
técnica, ilustradas por ejemplo por la tecnología de Marathon™
(Clontech Laboratories Inc.), han simplificado significativamente
la investigación de los ADN más largos. En la tecnología de
Marathon™, los ADN se han preparado a partir de ARNm extraído de un
tejido elegido y una secuencia "de adaptador" ligada a cada
extremo. Después la amplificación de ácido nucleico (PCR) se lleva
a cabo para amplificar el extremo 5' "ausente" del ADN usando
una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos de
genes y específicos de adaptadores. La reacción de PCR se repite
después usando cebadores "encajados", es decir, cebadores
diseñados para hibridarse dentro del producto amplificado
(típicamente un cebador específico de adaptador que hibrida además
el extremo 3' en la secuencia de adaptador y un cebador específico
del gen que hibrida además el extremo 5' en al secuencia génica
seleccionada). Después los productos de esta reacción se pueden
analizar mediante secuenciación de ADN y un ADN de longitud completa
construido o bien uniendo el producto directamente al ADN existente
proporcionando una secuencia completa, o llevando a cabo una PCR
separada de longitud completa usando la información de la secuencia
nueva para el diseño del cebador en 5'.
Se pueden emplear los polinucleótidos y
polipéptidos de la invención, por ejemplo, como reactivos y
materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos
de y diagnosis para enfermedades, particularmente enfermedades
humanas, como se describe posteriormente en esta memoria descriptiva
con relación a ensayos de polinucleótidos.
Los polinucleótidos de la invención que son
oligonucleótidos derivados de una secuencia de las SEQ ID Números 1
se pueden usar en los procedimientos en esta memoria descriptiva
como se ha descrito, pero preferiblemente para PCR, con el fin de
determinar si o no los polinucleótidos identificados en esta memoria
descriptiva en conjunto o en parte se transcriben en bacterias en
tejido infectado. Se reconoce que tales secuencias también tendrán
utilidad en diagnosis de la fase de infección y tipo de infección
que ha alcanzado el patógeno.
La invención también proporciona polinucleótidos
que codifican un polipéptido que es la proteína madura más
aminoácidos adicionales amino o carboxilo terminal, o aminoácidos
interiores al polipéptido maduro (por ejemplo, cuando la forma
madura tiene más de una cadena polipeptídica). Tales secuencias
pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína del
precursor a una forma madura, puede permitir transporte de
proteínas, puede alargar o acortar la semivida de las proteínas o
puede facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o
producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in
vivo, los aminoácidos adicionales se pueden procesar a partir
de la proteína madura mediante enzimas celulares.
Para cada y todo polinucleótido de la invención
se proporciona un polinucleótido complementario a él. Se prefiere
que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente
complementarios a cada polinucleótido con los que son
complementarios.
Una proteína precursora, que tiene una forma
madura del polipéptido condensado a uno o más prosecuencias puede
ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando las prosecuencias se
retiran tales precursores inactivos generalmente se activan.
Algunas o todas las prosecuencias se pueden retirar antes de
inactivación. En general, tales precursores se llaman
proproteínas.
Además de las representaciones A, G, C, T/U
convencionales para nucleótidos, el término "N" significa que
cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en
tal posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto que se
prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en
combinación con posiciones de nucleótidos adyacentes, cuando se lee
en la fase correcta de lectura, tendría el efecto de generar un
codón de terminación prematura en tal fase de lectura.
En resumen, un polinucleótido de la invención
puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una
secuencia guía (que se puede denominar una preproteína), un
precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias
que son las secuencias guía de una preproteína, o una proteína, que
es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia guía y
una o más prosecuencias, que generalmente se retiran durante las
etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del
polipéptido.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se
proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para
propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización
genética.
El uso de un polinucleótido de la invención en
inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento de
distribución adecuado tal como inyección directa de ADN de plásmido
en músculos (Wolff y col., Hum. Mol Genet (1992) 1:363,
Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4:419), distribución
de ADN complejado con vehículos proteicos específicos (Wu y col.,
J. Biol Chem. (1989) 264:16985), coprecipitación de ADN con
fosfato de calcio (Benvenistry y Reshef, PNAS USA, (1986)
83:9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas
(Kaneda y col., Science (1989) 243:375), bombardeo de
partículas (Tang y col., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun y
col., DNA Cell Biol (1993) 12:791) e infección in vivo
usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col, PNAS
USA, (1984) 81:5489).
La invención también se refiere a vectores que
comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención,
células hospedadoras que están modificadas por ingeniería genética
con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la
invención mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de
traducción libres de células también se pueden emplear para
producir tales proteínas usando ARN derivado de construcciones de
ADN de la invención.
Los polinucleótidos recombinantes de la presente
invención se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos
por los expertos en la técnica a partir de células hospedadoras
modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de
expresión. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional, la
presente invención se refiere a sistemas de expresión que
comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente
invención, para células hospedadoras que están modificadas por
ingeniería genética con tales sistemas de expresión, y para la
producción de polinucleótidos de la invención mediante técnicas
recombinantes.
Para la producción recombinante de los
polipéptidos de la invención, las células hospedadoras se pueden
modificar por ingeniería genética para incorporar sistemas de
expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la
invención. La introducción de un polinucleótido en la célula
hospedadora se puede efectuar mediante procedimientos descritos en
muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis, y
col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook,
y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
(1989), tal como, transfección por fosfato cálcico, transfección
mediada por DEAE - dextrano, transfección, microinyección,
transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación,
transducción, carga por legrado, introducción balística e
infección.
Los ejemplos representativos de hospedadores
apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de
estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli,
estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria
meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas,
tales como células de una levadura, Kluveromyces,
Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y
Aspergillus; células de insecto tales como células de
Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales
como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y
células de melanoma de Bowes; y células de plantas, tales como
células de una gimnosperma o angiosperma.
Se puede usar una gran variedad de sistemas de
expresión para producir los polipéptidos de al invención. Tales
vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de epitomas y de
virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de
bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de
elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de
virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus
vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de
pseudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores
derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados
elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como
cósmicos y fagémidos. Las construcciones de sistemas de expresión
pueden contener regiones de control que regulan así como generan
expresión. Genéticamente, cualquier sistema o vector adecuado para
mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un
polipéptido en un hospedador se puede usar para la expresión a este
respecto. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el
sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de
técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las
expuestas en y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY
MANUAL, (anteriormente).
En sistemas de expresión recombinantes en
eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en el lumen
del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el
entorno extracelular, se pueden incorporar señales de secreción
apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser
endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
Los polipéptidos de la presente invención se
pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células
recombinantes mediante procedimientos bien conocidos que incluyen
precipitación por sulfato amónico o etanol, extracción con ácido,
cromatografía de intercambio aniónica o catiónica, cromatografía
sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatita y v
lecitina. Los más preferiblemente, cromatografía de afinidad por
iones metálicos (IMAC) se emplea para purificación. Las técnicas
bien conocidas para replegar proteínas se pueden emplear para
regenerar conformación activa cuando se desnaturaliza el
polipéptido durante la síntesis intracelular, aislamiento y o
purificación.
El sistema de expresión también puede ser un
microorganismo vivo recombinante, tal como un virus a bacteria. El
gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria
recombinante vivo. La inoculación e infección in vivo con
este vector vivo conducirá a la expresión in vivo de un
antígeno e inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias
usados para este propósito son por ejemplo; poxvirus (por ejemplo,
vaccinia, viruela aviar, viruela de canarios), alfavirus (virus
Sindbis, virus del bosque Semiliki, virus de encefalitis equina
venezolana), adenovirus, virus asociado a adeno, picornavirus (virus
de la polio, rinovirus), herpesvirus (virus zoster de varicela,
etc), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Esos
virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuados de diversas
maneras con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacuna vivas
también forman parte de la invención.
Esta invención también se refiere al uso de
polinucleótidos y polipéptidos BASB021 de la invención para uso
como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o
polipéptidos BASB021 en un eucariota, particularmente un mamífero,
y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de
diagnóstico para diagnosis de enfermedad, determinación de la fase
de enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a fármacos.
Eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente seres
humanos, particularmente los infectados o sospechosos de estar
infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BABS021,
se pueden detectar en el nivel de ácidos nucleicos o aminoácidos
mediante una diversidad de técnicas bien conocidas así como
procedimientos proporcionados en esta memoria descriptiva.
Los polipéptidos y polinucleótidos para
prognosis, diagnosis u otro análisis se pueden obtener a partir de
materiales corporales de individuos supuestamente infectados y/o
infectados. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes,
particularmente ADN o ARN, se pueden usar directamente para
detección o se puede amplificar enzimáticamente usando PCR o
cualquier otra técnica de amplificación antes de análisis. El ARN,
particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico también se puede usar de
las mismas maneras. Usando amplificación, caracterización de la
especie y cepa de organismo infeccioso o residente presente en un
individuo, se puede preparar mediante un análisis del genotipo de
un polinucleótido seleccionado del organismo. Las supresiones e
inserciones se pueden detectar mediante un cambio en tamaño del
producto amplificado en comparación con un genotipo de una
secuencia de referencia seleccionada entre un organismo relacionado,
preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa
diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales se pueden
identificar mediante hidridación de ADN amplificado a secuencias de
polinucleótidos BASB021 marcados. Secuencias coincidentes perfecta
o significativamente se pueden distinguir de dúplex no coincidentes
imperfecta o más significativamente mediante digestión con ADNasa o
ARNasa, para ADN o ARN respectivamente, o mediante la detección de
diferencias en temperaturas de fusión o cinética de
renaturalización. Las diferencias de secuencias de polinucleótidos
también se puede detectar mediante alteraciones en al movilidad
electroforética de fragmentos de polinucleótidos en geles
comparados con una secuencia de referencia. Esto se puede llevar a
cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias de
polinucleótidos también se pueden detectar mediante secuenciación de
ADN o ARN directa. Véase, por ejemplo, Myers y col.,
Science, 230:1242 (1985). Cambios de secuencia en
localizaciones específicas también se pueden revelar mediante
ensayos de protección de nucleasa, tales como ARNasa, ensayo de
protección de V1 y S1 o un procedimiento de escisión química. Véase,
por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:
4397-4401 (1985).
En otra realización, una disposición de sondas de
oligonucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos BASB021
o fragmentos de la misma se pueden construir para llevar a cabo la
selección eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo,
clasificación taxonómica o identificación. Procedimientos de
tecnología de disposición se conocen bien y tienen aplicabilidad
general y se pueden usar para dirigir una diversidad de cuestionasen
genética molecular incluyendo expresión génica, unión genética, y
variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col.,
Science, 274:610 (1996)).
De este modo en otro aspecto, la presente
invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:
- (a)
- un polipéptido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 1, o un fragmento de la misma;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);
- (c)
- un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la SEQ ID Nº 2 o un fragmento del mismo; o
- (d)
- un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, preferiblemente para el polipéptido de la SEQ ID Nº 2.
Se apreciará que en cualquiera de dichos kits,
(a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Tal
kit se usará en diagnosis de una enfermedad o susceptibilidad a una
enfermedad, entre otros.
Esta invención también se refiere al uso de
polinucleótidos de la presente invención como reactivos de
diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido
de la invención, preferiblemente, la SEQ ID Nº 1, que está asociada
con una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta de
diagnóstico que se puede añadir a, o definir, una diagnosis de una
enfermedad, una prognosis de un curso de enfermedad, una
determinación de una fase de enfermedad, o una susceptibilidad a una
enfermedad, que se produce por infraexpresión, sobreexpresión o
expresión alterada del polinucleótido. Los organismos,
particularmente organismos infecciosos, que llevan mutaciones en
dicho polinucleótido se pueden detectar a nivel de polinucleótido
mediante una diversidad de técnicas, tales como las descritas en
otra parte en esta memoria descriptiva.
Las células de un organismo que llevan mutaciones
o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o
polipéptido de la invención también se puede detectar a nivel del
polinucleótido o polipéptido mediante una diversidad de técnicas,
que permite, por ejemplo, la formación de serotipos. Por ejemplo,
RT-PCR se puede usar para detectar mutaciones en el
ARN. Se prefiere particularmente, por ejemplo, GeneScan. ARN, ADNc
o ADN genómico también se puede usar para el mismo propósito, PCR.
Como ejemplo, los cebadores de PCR complementarios a un polipéptido
que codifica el polipéptido BASB021 se puede usar para identificar y
analizar mutaciones.
La invención además proporciona cebadores con 1,
2, 3 ó 4 nucleótidos retirados del extremo 5' y/o el 3'. Estos
cebadores se pueden usar para, entre otras cosas, amplificar ADN y/o
ARN de BASA020 aislados de una muestra derivada de un individuo, tal
como un material corporal. Los cebadores se pueden usar para
amplificar un polipéptido aislado de un individuo infectado, de
manera que el polinucleótido se puede después someter a diversas
técnicas para elucidación de al secuencia de polinucleótidos. De
esta forma, las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos se
puede detectar y usar para diagnosticar y/o pronosticar la infección
o su fase o curso, o determinar serotipo y/o clasificar el agente
infeccioso.
La invención además proporciona un procedimiento
para diagnosticar una enfermedad, preferiblemente infecciones
bacterianas, más preferiblemente infecciones provocadas por
Moraxella catarrhalis, que comprende la determinación de una
muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un
nivel aumentado de expresión de polinucleótido que tiene una
secuencia de SEQ ID Nº 1. El incremento o disminución de la
expresión de un polinucleótido BASB021 se puede medir usando
cualquiera de los procedimientos bien conocidos en al técnica para
la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo,
amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa,
transferencia de Northern, espectrometría y otros procedimientos de
hibridación.
Además, un ensayo diagnóstico de acuerdo con la
invención para detectar la sobreexpresión del polipéptido BASB021
comparado con muestras de tejidos de control normales se pueden
usar, por ejemplo, para detectar la presencia de una infección. Las
técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar niveles de un
polipéptido BASB021, en una muestra derivada de un hospedador, tal
como un material corporal, los conocen bien los expertos en al
técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen,
radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de
transferencia de Western, ensayos sándwich de anticuerpos, detección
de anticuerpos y ensayos ELISA.
Los polipéptidos de la invención se pueden usar
como componentes de disposiciones de polipéptidos, preferiblemente
disposiciones o retículas de alta densidad. Estas disposiciones de
alta densidad son particularmente útiles para propósitos de
diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, un conjunto de de manchas
cada una comprendiendo un gen diferente, y comprendiendo además un
polinucleótido o polinucleótidos de la invención, se puede usar para
sondar, tal como el uso de hibridación o amplificación de ácidos
nucleico, usando una sonda obtenida o derivada a partir de una
muestra corporal, para determinar la presencia de de una secuencia
de polinucleótidos particular o secuencia relacionada en un
individuo, Tal presencia puede indicar la presencia de un patógeno,
particularmente Moraxella catarrhalis, y puede se útil en el
diagnóstico y/o pronóstico de un curso de la enfermedad. Se prefiere
una retícula que comprende un número de variantes de la secuencia de
polinucleótidos de la SEQ ID Nº 1. También se prefiere una que
comprenda un número de variantes de una secuencia de polinucleótidos
que codifica la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID Nº 2.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la
invención o variantes de los mismos, o células que expresan los
mismos se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos
específicos para tales polipéptidos o polinucleótidos
respectivamente.
En ciertas realizaciones preferidas de la
invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o
polinucleótidos BASB021.
Los anticuerpos generados contra los polipéptidos
o polinucleótidos de la invención se pueden obtener administrando
los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos
que llevan epítopes de cualquiera o ambos, análogos de cualquiera o
ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un anima,
preferiblemente uno no humano, usando protocolos rutinarios. Para la
preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier
técnica conocida en la técnica que proporciona anticuerpos
producidos por cultivos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen
diversas técnicas, tales como las descritas en Kohler, G. y
Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975);
Kozbor y col., Immunology Today 4:72 (1983); Cole y col., pg.
77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER
THERAPY, Alan R. Liss, Inc (1985).
Las técnicas para la producción de anticuerpos de
cadena sencilla (patente de estados Unidos Nº 4.946.778) se pueden
adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla a polipéptidos
o polinucleótidos de esta invención. También, ratones transgénicos,
u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, se pueden
usar para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para
el polipéptido o polipéptidos de la invención.
Como alternativa, la tecnología de exposición de
proteínas y péptidos en la cápsida de fagos se puede utilizar para
seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un
polipéptido de la invención bien a partir de repertorios de genes v
amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos seleccionados
por poseer anti-BASB021 o de genotecas inactivas
(McCafferty, y col., (1990), Nature 348,
552-554; Marks, y col., (1992) Biotechnology
10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos
también se puede mejorar mediante, por ejemplo, arrastre de cadenas
(Clackson y col., (1991) Nature 352:628).
Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden
emplear para aislar o para identificar clones que expresan los
polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los
polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía
de afinidad.
De este modo, entre otros, los anticuerpos contra
polipéptido BABS021 o polinucleótido BABS021 se pueden emplear para
tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.
Las variantes de polipéptidos incluyen variantes,
antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalente forman un
aspecto particular de esta invención.
Preferiblemente, el anticuerpo de una variante
del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénica en el
individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano el anticuerpo
puede lo más preferiblemente estar "humanizado", la región o
regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado
de hibridoma se ha transplantado en un anticuerpo monoclonal
humano, por ejemplo como se describe en Jones y col., (1986),
Nature 321, 522-525 o Tempest y col., (1991)
Biotechnology 9, 266-273.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la
invención también se pueden usar para valorar la unión de de
sustratos de pequeñas moléculas y ligandos en, por ejemplo, células,
preparaciones libres de células, genotecas químicas, y mezclas de
productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos
y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o
funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current
Protocols in Immunology 1 (2): capítulo 5 (1991).
Los procedimientos de selección pueden medir
simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o
polinucleótido, o a células o membranas que llevan el polipéptido o
polinucleótido, o una proteína de fusión mediante medios de una
marca directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato.
Como alternativa, el procedimiento de selección puede implicar
competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos
de selección pueden probar si el compuesto candidato da como
resultado una señal generada por activación o inhibición del
polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección
apropiados para las células que comprenden el polipéptido o
polinucleótido. Los inhibidores de activación se ensayan
generalmente en presencia de un agonista conocido y se observa el
efecto sobre la activación mediante el agonista por la presencia del
compuesto candidato. El polipéptido constitutivamente activo y/o
polipéptidos constitutivamente expresados se pueden emplear en
procedimientos de selección para agonistas o inhibidores inversos,
en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto
candidato da como resultado la inhibición de activación del
polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los
procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas
de mezclado de un compuesto candidato con una solución que contiene
un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para
formar una mezcla, midiendo la actividad del polipéptido y/o
polinucleótido BABS021 en la mezcla, y comparando la actividad del
polipéptido y/o polinucleótido BABS021 de la mezcla con un patrón.
Las proteínas de fusión, tales como las realizadas a partir de la
porción Fc y polipéptido BASB021, como se ha descrito anteriormente
en esta memoria descriptiva, también se pueden usar para ensayos de
selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del
polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos
relacionados filogenético y/o funcionalmente relacionados (véase D.
Bennett y col., J Mol Recognition, 8: 52-58 (1995);
y K. Johanson y col., L Biol Chem, 270 (16):
9459-9471 (1995)).
Los polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos
que se unen y/o interactúan con un polipéptido de la presente
invención también se pueden usar para configurar procedimientos de
selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la
producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, se puede
construir un ensayo ELISA para medir los niveles secretados o
asociados a células de polipéptido que usa anticuerpos monoclonales
y policlonales mediante procedimientos convencionales conocidos en
la técnica. Éste se puede usar para descubrir agentes que pueden
inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamado
antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o
tejidos manipulados adecuadamente.
La invención también proporciona un procedimiento
de selección de compuestos para identificar aquellos que potencian
(agonista) o bloquean (antagonista) la acción de polipéptidos o
polinucleótidos ABSB020, particularmente los compuestos que son
bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección
puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para
seleccionar agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción de
síntesis, un compartimiento celular, tal como una membrana,
envuelta celular o pared celular, o una preparación de cualquiera
de los mismos, que comprende el polipéptido BABS021 y un sustrato o
ligando marcado de tal polipéptido se incuba en ausencia o
presencia de una molécula candidato que puede ser un agonista o
antagonista de BASB021. La capacidad de la molécula candidato de
agonizar o antagonizar el polipéptido BABS021 se refleja en una
disminución de la unión del ligando marcado o disminución de la
producción del producto de cada sustrato. Las moléculas que se unen
de forma gratuita, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido
BABS021 van a ser los más probablemente buenos antagonistas. Las
moléculas que se unen bien, y como puede ser el caso, incrementan la
velocidad de producción del producto a partir del sustrato,
incrementan la transducción de la señal, o incrementan la actividad
de los canales químicos son agonistas. La detección de la velocidad
o nivel de, como puede ser el caso, la producción del producto a
partir del sustrato, transducción de señal, o actividad de los
canales químicos se puede potenciar usando un sistema indicador.
Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto
incluyen pero no se limitan a colorimétricos, sustrato marcado
convertido en producto, un gen indicador que es responsable de
cambios en la actividad de polinucleótido o polipéptido BASB021, y
ensayos de unión conocidos en la técnica.
Otro ejemplo de un ensayo para agonistas de
BABS021 en un ensayo competitivo que combina BABS021 y un agonista
potencial con moléculas de unión a BASB021, moléculas de unión a
BABS021 recombinantes, sustratos o ligandos naturales, miméticos de
sustratos o ligandos, en condiciones apropiados para un ensayo de
inhibición competitiva. BABS021 se puede marcar, tal como mediante
radiactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que el número
de moléculas de BABS021 unidas a una molécula de unión o convertidas
en producto se puede determinar exactamente para evaluar la
eficacia del antagonista potencial.
Los antagonistas potenciales incluyen, entre
otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y
anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la
invención y por lo tanto inhiben o suprimen su actividad o
expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser pequeñas
moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido tal como una
proteína o anticuerpo estrechamente relacionada o que se une a los
mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de
unión, sin inducir actividades inducidas por BABS021, evitando por
lo tanto la acción o expresión de polinucleótidos y/o polipéptidos
BABS021 excluyendo los polinucleótidos y/o polipéptidos BABS021 de
la unión.
Los antagonistas potenciales incluyen una pequeña
molécula que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido
evitando por lo tanto la unión a moléculas de unión celular, de
manera que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de
pequeñas moléculas incluyen pero no se limitan a pequeñas moléculas
orgánicas, péptidos o moléculas de tipo péptido. Otros antagonistas
potenciales incluyen moléculas de polaridad opuesta (véase Okano,
J. Neurochem 56:560 (1991); OLIGONUCLEOTIDES AS ANTISENSE
INHIBITORS OF GEN EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988),
para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas
potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y
variantes de BABS021.
En un aspecto adicional, la presente invención se
refiere a proteínas de fusión modificadas por ingeniería genética
que comprende un polipéptido de la presente invención, o un
fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones
constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de
diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina se
prefiere la parte constante de la cadena pesada de IgG humana,
particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región
bisagra. En una realización particular, la parte Fc se puede
retirar simplemente mediante incorporación de una secuencia de
escisión que se puede escindir con el factor de coagulación Xa.
Además, esta invención se refiere a procedimientos para la
preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniaría
genética, y al uso de los mismos para seleccionar fármacos,
diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención también
se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de
fusión. Los ejemplos de tecnología de proteína de fusión se pueden
encontrar en las solicitudes de patente internacional Números WO
94/29458 y WO 94/22914.
Cada una de las secuencias de polinucleótidos
proporcionadas en esta memoria descriptiva se pueden usar en el
descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La
proteína codificada, tras expresión, se puede usar como una diana
para la selección de fármacos antibacterianos. De manera adicional,
las secuencias de polinucleótidos que codifican regiones terminales
de la proteína codificada o Shine - Delgarno u otra traducción que
facilita las secuencias del ARNm respectivo se pueden usar para
construir secuencias de polaridad opuesta para controlar la
expresión de la secuencia codificadora de interés.
La invención también proporciona el uso del
polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención
con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un
hospedador eucariótico, preferiblemente mamífero, responsable de una
secuela de infección. En particular, las moléculas de la invención
se pueden usar: en la prevención de adhesión de bacterias, en
particular bacterias Gram positivas y/o Gram negativas, a proteínas
de matriz extracelular de eucarióticos, preferiblemente de
mamíferos, o en dispositivos permanentes o a una matriz extracelular
en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de
matriz extracelular de eucarióticos, preferiblemente de mamíferos y
proteínas BABS021 bacterianas que median el gaño en tejido y/o;
bloquear la progresión normal de patogénesis en infecciones
iniciadas distintas de la implantación de dispositivos permanentes
o mediante otras técnicas quirúrgicas.
De acuerdo con incluso otro aspecto de la
invención, se proporcionan agonistas y antagonistas de BABS021,
preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o
bactericidas.
Los antagonistas y agonistas de la invención se
pueden emplear, por ejemplo, para evitar, inhibir y/o tratar
enfermedades.
En un aspecto adicional, la presente invención se
refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es
una secuencia peptídico, suficientemente similar al péptido nativo
(secuencialmente o estructuralmente), que es capaz de ser reconocida
por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es capaz de
originar anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se
acopla a un vehículo adecuado.
Los mimotopos de péptidos se pueden diseñar para
un propósito particular mediante adición, supresión o sustitución de
aminoácidos elegidos. De este modo, los péptidos se pueden modificar
para propósitos de fácil conjugación a un vehículo proteico. Por
ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de
conjugación química incluir una cisteína terminal. Además puede ser
deseable para péptidos conjugados a un vehículo proteico incluir un
terminal hidrófobo distal del terminal conjugado del péptido, de
manera que el extremo no conjugado libre del péptido permanece
asociado con la superficie de la proteína del vehículo. Por lo tanto
presentando el péptido en una conformación que se parece los más
estrechamente posible a la del péptido encontrado en el contexto de
la molécula entera nativa. Por ejemplo, los péptidos se pueden
alterar para que tengan una cisteína N-terminal y
una cola amidada hidrófoba C-termina. Como
alternativa, la adición o sustitución de una forma de diastereómero
D de uno o más de los aminoácidos se puede realizar para crear un
derivado beneficioso, por ejemplo para potenciar la estabilidad del
péptido.
Como alternativa los mimotopos de péptidos se
pueden identificar usando anticuerpos que son capaces ellos mismos
de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando
técnicas tales como tecnología de exposición de proteínas y
péptidos en la cápsida de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta
técnica, genera un gran número de secuencias peptídicas que imitan
la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces
de unirse a anticuerpos peptídicos anti-nativos,
pero pueden ellos mismos no compartir homología de secuencias
significativa con el polipéptido nativo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un
individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres
humanos, que comprende la inoculación del individuo con
polinucleótido y/o polipéptido BABS021, o un fragmento o variante
del mismo, adecuado para producir anticuerpo y/o respuesta inmune de
células T para proteger dicho individuo de la infección,
particularmente la infección bacteriana y lo más particularmente
infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan
procedimientos en los que tal respuesta inmunológica retrasa la
replicación bacteriana. Incluso otro aspecto de la invención se
refiere a un procedimiento de inducción de una respuesta
inmunológica en un individuo que comprende la distribución a tal
individuo de un vector, secuencia o ribozima de ácido nucleico para
dirigir la expresión de polinucleótido y/o polipéptido BABS021, o
un fragmento o una variante del mismo in vivo con el fin de
inducir una respuesta inmunológica, de manera que produzca
anticuerpo y/o respuesta inmune de células T, incluyendo, por
ejemplo, células T productoras de citoquina o células T citotóxicas,
para proteger dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de una
enfermedad, bien la enfermedad esté ya establecida dentro del
individuo o no. Un ejemplo de administrar el gen es acelerándolo en
las células deseadas como un revestimiento sobre partículas o de
otra manera. Tal vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN,
una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN,
un complejo ADN-proteína o un complejo
ARN-proteína.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a
una composición inmunológica que cuando se introduce en un
individuo, preferiblemente un ser humano, capaz de haber inducido
dentro de el una respuesta inmunológica, induce una respuesta
inmunológica en tal individuo a un polipéptido y/o polipéptido
BABS021 codificado a partir de ellos, en la que la composición
comprende un polipéptido y/o polipéptido BABS021 recombinante
codificado a partir de ellos y/o comprende ADN y/o ARN que codifica
y expresa un antígeno de dicho polipéptido, polipéptido BABS021
codificado a partir de ellos, u otro polipéptido de la invención.
La respuesta inmunológica se puede usar terapéuticamente o
profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpo
y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de
células CTL o T CD4+.
Un polipéptido BABS021 o un fragmento del mismo
se puede condensar con una coproteína o resto químico que puede o no
puede producir por él mismo anticuerpos, pero que es capaz de
estabilizar la primera proteína y producir una proteína condensada o
modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y
preferiblemente propiedades protectoras De este modo la proteína
recombínate condensada, comprende preferiblemente una coproteína
antigénica, tal como la lipoproteína D de Haemophilus
influenzae, Glutation -S- transferasa (GST) o
beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína
relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la
producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede
actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una
estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que
recibe la proteína. La coproteína se puede unir a o bien el terminal
amino o carboxi de la primera proteína.
Esta invención proporciona composiciones,
particularmente composiciones de vacuna, y procedimientos que
comprenden los polinucleótidos y/o polinucleótidos de la invención y
secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como las descritas en
Sato, Y. y col., Science 273:352 (1996).
También, esta invención proporciona
procedimientos que usan el polinucleótido o fragmentos particulares
de los mismos, que se ha mostrado que codifican regiones no
variables de las proteínas de la superficie celular bacteriana, en
construcciones de polinucleótidos usados en tales experimentos de
inmunización genética en modelos animales de infección con
Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán
particularmente útiles para identificar epítopos de proteínas
capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica.
Se cree que este planteamiento permitirá la preparación posterior de
anticuerpos monoclonales de valor particular, derivado del órgano
requerido del animal que resiste con éxito o eliminan la infección,
para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos
terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección por
Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente seres
humanos.
La invención también incluye una formulación de
vacunas que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante
inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal
como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ya que los
polipéptidos y/o polinucleótidos se pueden descomponer en el
estómago, cada uno se administra preferiblemente por vía
parenteral, incluyendo, por ejemplo, la administración que es
subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las
formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen
soluciones de inyecciones estériles acuosas y no acuosas que pueden
contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y
solutos que hacen la formulación isotónica con el fluido corporal,
preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles
acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o
agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en
recipientes de dosificación unitaria o de dosificación múltiple, por
ejemplo, ampollas y viales selladas y se pueden almacenar en una
condición de de secado por congelación solamente la adición del
vehículo líquido estéril inmediatamente antes de uso.
La formulación de vacuna de la invención también
puede incluir sistemas de adyuvantes para potenciar la
inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema de
adyuvante origina preferiblemente una respuesta de tipo TH1
inmune.
Una respuesta inmune se puede distinguir
ampliamente en dos categorías extremas, siendo una humoral o
respuestas mediada por células (tradicionalmente caracterizadas por
mecanismos efectores de anticuerpos y celulares de protección
respectivamente). Estas categorías de respuesta se ha denominado
respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células), y
respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).
Las respuestas extremas de tipo TH1 se pueden
caracterizar por la generación de linfocitos T citotóxicos
específicos de antígeno, restringido de haplotipo, y respuestas de
células asesinas naturales. En ratones las respuestas de tipo TH1 se
caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del subtipo
IgG2a, mientras que en el ser humano éstos corresponden a
anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se
caracterizan por la generación de un amplio intervalo de isotipos de
inmunoglobulina incluyendo en IgG1, IgA e IgM de ratones.
Se puede considerar que la fuerza de conducción
detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son
citoquinas. Altos niveles de citoquinas de tipo TH1 tienden a
favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células
para el antígeno dado, mientras que altos niveles de citoquinas de
tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes
humorales para el antígeno.
La distinción de respuestas inmunes de tipo TH1 y
TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta
inmune que se describe por ser predominantemente TH1 o
predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente
considerar las familias de citoquinas en términos de la descrita en
clones de células T CD4 +ve de tipo murino por Mosmann y Coffman
(Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells:
different patterns of lymphokine secretion lead to different
functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p.
145-173). Tradicionalmente, las respuestas de
tipo TH1 están asociadas a la producción de las citoquinas
INF-\gamma e IL-2 por linfocitos
T. Otras citoquinas asociadas a menudo directamente a ala inducción
de de respuestas inmunes de tipoTH1 no están producidas por células
T, tales como IL-12. Por el contrario, las
respuestas de tipo TH2 están asociadas a la secreción de
IL-4, IL-5, IL-6 e
IL-13.
Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son
particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de
citoquinas o bien de TH1 o TH2. Tradicionalmente los mejores
indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después
de una vacunación o infección incluye la medición directa de la
producción de citoquinas TH1 o TH2 mediante linfocitos T in
vitro después de la reestimulación con antígeno, y/o la medición
de la relación IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpo específica de
antígeno.
De este modo, un adyuvante de tipo TH1 es uno que
preferentemente estimula poblaciones de células T aisladas para
producir altos niveles de citoquinas de tipo TH1 cuando se
reestimulan con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo
de tanto linfocitos T citotóxicos CD8+ como respuestas de
inmunoglobulina específica de antígeno asociadas a isotipo de tipo
TH1.
Los adyuvantes que son capaces de estimulación
preferencial de la respuesta celular TH1 se describen en la
solicitud de patente internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209.
El monofosforil lípido A 3
des-O-acilado es uno de tales
adyuvantes. Éste se conoce a partir del documento GB 2220211
(Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3
des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas
aciladas y está fabricado por Ribi Immunocehm, Montana. Una forma
preferida de monofosforil lípido A 3
des-O-acilado se describe en la
patente europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biological SA).
Preferiblemente, las partículas de
3D-MPL son suficientemente pequeñas para que se
filtren de manera estéril a través de una membrana de 0,22 micrones
(patente europea número 0 689 454).
3D-MPL estará presente en el
intervalo de 10 \mug-100 \mug preferiblemente
25-50 \mug por dosis en el que el antígeno estará
típicamente presente en un intervalo 2-50 \mug por
dosis.
Otro adyuvante preferido comprende QS21, una
fracción no tóxica purificada por HPLC derivada de la corteza de
Quillaza Saponaria Molina. Opcionalmente éste se puede mezclar con
monofosforil lípido A 3
des-O-acilado
(3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.
El procedimiento de producción de QS21 se
describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.057.540.
Las formulaciones de adyuvantes no reactogénicos
que contienen QS21 se han descrito previamente (documento WO
96/33739). Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol se
ha mostrado que son adyuvantes estimulantes de TH1 exitosos cuando
se formulan junto con un antígeno.
Los adyuvantes adicionales que son estimuladores
preferenciales de respuesta de células TH1 incluyen oligonucleótidos
inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se
describe en el documento WO 96/02555.
Las combinaciones de diferentes adyuvantes
estimuladores de TH1, tales como las mencionadas en esta memoria
descriptiva anteriormente, también se contemplan por proporcionar un
adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta de
células TH1. Por ejemplo, QS21 se puede formular junto con
3D-MPL. La relación de QS21:3D-MPL
típicamente será del orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente 1:5 a 5:1
y a menudo sustancialmente 1:1. El intervalo preferido para sinergia
óptima es 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.
Preferiblemente un vehículo también está presente
en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El vehículo
puede ser una emulsión aceite en agua, o una sal de aluminio, tal
como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.
Una emulsión aceite en agua preferida comprende
un aceite metabolizable, tal como escualeno, tocoferol alfa y Tween
80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos en la
composición de vacuna de acuerdo con la invención se combinan con
QS21 y 3D-MPL en tal emulsión. Adicionalmente la
emulsión aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o
tricaprilina.
Típicamente para la administración a seres
humanos QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una
vacuna en el intervalo 1 \mug-200 \mug, tal como
10-100 \mug, preferiblemente 10
\mug-50 \mug por dosis. Típicamente la emulsión
aceite en agua comprenderá entre 2 y 10% de escualeno, entre 2 y 10
de tocoferol alfa y entre 0,3 y 3% de Tween 80. Preferiblemente la
relación de escualeno : tocoferol alfa es igual o menor que 1 ya
que esto proporciona una emulsión más estable. Span 85 también puede
estar presente a un nivel de 1%. En algunos casos puede ser
ventajoso que las vacunas de la presente invención contendrá además
un estabilizador.
Las emulsiones aceite en agua no tóxicas
preferiblemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo,
escualano o escualeno, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso.
El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada
con fosfato.
Una formulación de adyuvante particularmente
potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una
emulsión aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.
La presente invención también proporciona una
composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de
vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en
particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades
autoinmunes y afecciones relacionadas. Tal composición de vacuna
polivalente puede incluir un adyuvante que induce
TH-1 como se ha descrito en esta memoria descriptiva
anteriormente.
Aunque la invención se ha descrito con referencia
a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB02, se ha de entender
que ésta cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos de
origen natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con
adiciones, supresiones o sustituciones que no afectan
sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos
y polinucleótidos recombinantes.
En un aspecto adicional de la invención se
proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BABS021 y/o un polipéptido BABS021 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.
BABS021 y/o un polipéptido BABS021 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.
La invención también se refiere a composiciones
que comprenden polinucleótido y/o un polipéptido descrito en esta
memoria descriptiva o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos
y polinucleótidos de la invención se pueden emplear en combinación
con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para uso con
células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico
para la administración a un individuo. Tales composiciones
comprenden, por ejemplo, un aditivo del medio o una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la
invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución
salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol
y las combinaciones de los mismos. La formulación debe satisfacer el
modo de administración. La invención además se refiere a envases y
kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más
recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las
composiciones anteriormente mencionados de la invención.
Los polipéptidos, polinucleótidos y otros
compuestos de la invención se pueden emplear solos o junto con otros
compuestos, tales como compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
administrar de cualquier manera eficaz, conveniente incluyendo, por
ejemplo, la administración mediante las vías tópica, oral, vaginal,
intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal
o intradérmica entre otras.
En terapia o como profiláctico, el agente activo
se puede administrar a un individuo en forma de una composición
inyectable, por ejemplo en forma de una dispersión acuosa estéril,
preferiblemente isotónica.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal
como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la
presente invención, péptido agonista o antagonista o un compuesto de
moléculas pequeñas, en combinación con un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero no se
limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa,
agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. La
invención además se refiere a envases y kits que comprenden uno o
más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las
composiciones anteriormente mencionadas de la invención. Los
polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente
invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos,
tales como compuestos terapéuticos.
La composición se adaptará a la vía de
administración, por ejemplo mediante una vía sistémica o una oral.
Las formas preferidas de administración sistémica incluyen
inyección, típicamente mediante inyección intravenosa. Se pueden
usar otras vías de de inyección, tales como subcutánea,
intramuscular, o intraperitoneal. Medios alternativos para la
administración sistémica incluyen la administración transmucosal o
transdérmica que usa penetrantes tales como sales biliares o ácidos
fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros
compuestos de la presente invención se pueden formular en una
formulación entérica o una encapsulada, también puede ser posible
la administración oral. La administración de estos compuestos
también puede ser tópica y/o localizada, en forma de ungüentos,
pastas, geles, soluciones, polvos y similares.
Para la administración a mamíferos, y
particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de
dosificación diaria del agente activo estará entre 0,01 mg/kg y 10
mg/kg, típicamente aproximadamente 1 mg/kg. El médico en cualquier
caso determinará la dosificación real que será la más adecuada para
un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo
particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso
medio. Pueden, por supuesto, ser casos individuales donde intervalos
de dosificación más altos o más bajos son necesarios, y tales están
dentro del alcance de esta invención.
El intervalo de dosificación requerido depende de
la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de
la formulación, la naturaleza de la condición del sujeto, y el
juicio del facultativo asistente. Sin embargo, las dosificaciones
adecuadas están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg
del sujeto.
Una composición de vacuna está convenientemente
en una forma inyectable. Se pueden emplear adyuvantes convencionales
para mejorar la respuesta inmune. Una dosis unitaria adecuada para
vacunación es 0,5-5 microgramos/kg de antígeno, y
tal dosis se administra preferiblemente 1-3 veces y
con un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de
dosis indicado, no se observará ningún efecto toxicológico indicado
con los compuestos de la invención que impediría su administración a
individuos adecuados.
Sin embargo, se esperaran variaciones amplias en
la dosificación necesaria, en vista de la diversidad de compuestos
disponibles y las eficacias diferentes de diversas vías de
administración. Por ejemplo, la administración oral se esperaría que
requiera dosificaciones más altas que la administración por
inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de
dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas habituales
para optimización, como se entenderá bien en la técnica.
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos
forman una fuente de información valiosa con la que determinar sus
estructuras en 2 y 3 dimensiones así como para identificar recuentes
adicionales de homología similar. Estos planteamientos se facilitan
más fácilmente mediante almacenamiento de la secuencia en un medio
legible de ordenador y después usando los datos almacenados en un
programa de estructura molecular conocido o buscar una base de
datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas,
tal como el paquete de programas GCG.
La invención también proporciona procedimientos
para el análisis de secuencias de caracteres o cadenas,
particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas
codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias
incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de
secuencias, tales como análisis de identidad y similitud, análisis
de estructura de ADN, ARN y proteínas, conjunto de secuencias,
análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias,
determinación de la fase abierta de lectura, llamada de bases de
ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, recortes de ácidos
nucleicos, y análisis de picos de cromatogramas de
secuenciación.
Un procedimiento basado en ordenador se
proporciona para realizar identificación de homología. Este
procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera
secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un
polipéptido de la invención en un medio legible de ordenador; y
comparando dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos
una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para
identificar homología.
Un procedimiento basado en ordenador también se
proporciona para realizar la identificación de homología, dicho
procedimiento comprendiendo las etapas de: proporcionar una primera
secuencia de polipéptidos que comprende la secuencia de un
polipéptido de la invención en un medio legible de ordenador; y
comparando dicha primera secuencia de polipéptidos con al menos una
segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar
homología.
Todas las publicaciones y referencias, que
incluyen pero no se limitan a las patentes y las solicitudes de
patente, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en el
presente documento mediante referencia en su totalidad como si cada
publicación individual o referencia estuviera indicada específica e
individualmente para incorporarse mediante referencia en el
presente documento como si se expusiera completamente. Cualquier
solicitud de patente para la que esta solicitud reivindica prioridad
también se incorpora como referencia en esta memoria descriptiva en
su totalidad de la manera descrita anteriormente para las
publicaciones y referencias.
"Identidad" como se conoce en la técnica, es
una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos de dos o
más secuencias de polipéptidos, como puede ser el caso, como se
determina comparando las secuencias. En la técnica,
"identidad" también significa el grado de relación de
secuencias entre secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos,
como puede ser el caso, como se determina mediante la coincidencia
entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" se puede
fácilmente calcular mediante procedimientos conocidos, que incluyen
pero sin limitación, los descritos en (Computacional Molecular
Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, Nueva York,
1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith,
D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis
of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G.,
eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in
Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y
Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds.,
M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carrillo, H., y Lipman, D.,
SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Se diseñan
procedimientos para determinar la identidad para proporcionar la
mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Además, los
procedimientos para determinar la identidad se codifican en
programas de ordenador disponibles públicamente. Los procedimientos
de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos
secuencias incluyen, pero sin limitación, el programa GAP en el
paquete de programas GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids
Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP BLASTN (Altschul, S. F. y
col., J Molec. BIol. 215: 403-410 (1990), y
FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:
2444-2448 (1988). La familia de programas BLAST
está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST
Manual, Altschul, S. y col., NCBI NLM Bethesda. MD 20894:
Altschul, S., y col., J Mol. Biol. 215:
403-410 (1990). El algoritmo bien conocido de Smith
Waterman también se puede usar para determinar la identidad.
Los parámetros para la comparación de secuencias
de polipéptidos incluye lo siguiente:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48:
443-453 (1970).
Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y
Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos. 89:
10915-10919 (1992)
Penalización de huecos: 8
Penalización de longitud de huecos: 2
Un programa útil con estos parámetros está
públicamente disponible como el programa de "huecos" de
Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente
mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de
péptidos (junto con no penalización para los huecos extremos).
Los parámetros para la comparación de
polinucleótidos incluyen lo siguiente:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48:
443-453 (1970).
Matriz de comparación: coincidencias = + 10, no
coincidencia = 0
Penalización de huecos: 50
Penalización de longitud de huecos: 3
Disponible como: El programa de "huecos" de
Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por
defecto para las comparaciones de los ácidos nucleicos.
Un significado preferido de "identidad" para
polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se
proporcionan en (1) y (2) más adelante.
(1) Las realizaciones de polipéptidos además
incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de
polinucleótidos que tienen al menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó
100% de identidad con la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº:
1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a
la secuencia de referencia de SEC ID. Nº: 1 o puede incluir hasta un
cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la
secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se
seleccionan entre el grupo constituido por la menos una supresión,
sustitución de nucleótidos, incluyendo transición y transversión, o
inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las
posiciones terminales 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de
referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones
terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los
nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos
contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho
número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el
número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1 por el número entero
que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después
restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC
ID. Nº: 1, ó
n_{n} \leq x_{n} - (x_{n}
\cdot
y),
en la que n_{n} es el número de
alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de
nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%,
0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95
para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo
del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no
entero de x_{n} se redondea hacia abajo al número entero más
próximo antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una
secuencia de polinucleótidos que codifican el polipéptido de la SEC
ID. Nº: 2 puede crear mutaciones sin sentido, sentido erróneo, o de
desplazamiento de fase en esta secuencia codificadora y por lo
tanto alterar el polipéptido codificado por los polinucleótidos
después de tales
alteraciones.
A modo de ejemplo, una secuencia de
polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la
secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 1, es decir puede ser
100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de
alteraciones de ácidos nucleicos comparada con la secuencia de
referencia de manera que el porcentaje de identidad es menor que
100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo
constituido por al menos una supresión, sustitución de ácidos
nucleicos que incluye transición, transversión, o inserción, y en
la que dichas alteraciones se pueden producir en las porciones
terminales 5' ó 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia
o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales,
interespaciadas o bien individualmente entre los ácidos nucleicos
en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la
secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos
nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina
multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1
por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido
por 100 y después restando ese producto de dicho número total de
ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1, o
n_{n} \leq
x_{n} - (x_{n} \cdot
y),
en la que n_{n} es el número de
alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de
ácidos nucleicos en la SEC ID. Nº: 1, y es, por ejemplo, 0,70 para
70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., \cdot es el símbolo del
operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero
de x_{n} se redondea hacia abajo al número entero más próximo
antes de restarlo de
x_{n}.
(2) Las realizaciones de polipéptidos además
incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que
tiene al menos, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad a
la secuencia de polipéptidos de referencia de la SEC ID. Nº: 2, en
la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la
secuencia de referencia de SEC ID. Nº: 2 o puede incluir hasta un
cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la
secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se
seleccionan entre el grupo constituido por la menos una supresión,
sustitución de aminoácidos, incluyendo sustitución, conservadora o y
no conservadora, o inserción, y en la que dichas alteraciones se
pueden producir en las posiciones terminales amino- o carboxi de la
secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier parte entre
aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien
individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia
o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de
referencia, y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos
se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC
ID. Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad
dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número
total de nucleótidos en la SEC ID. Nº 2, ó
n_{a} \leq
x_{a} - (x_{a} \cdot
y).
en la que n_{a} es el número de
alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de
nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%,
0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95
para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo
del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no
entero de x_{a} se redondea hacia abajo al número entero más
próximo antes de restarlo de
x_{a}.
A modo de ejemplo, una secuencia de
polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la
secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 2, es decir puede ser
100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de
alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia
de manera que el porcentaje de identidad es menor que 100% de
identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo
constituido por al menos una supresión, sustitución de aminoácidos
que incluye sustitución conservadora y no conservadora, o
inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las
porciones terminales amino- o carboxi- de la secuencia de
polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas
posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre
los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos
contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones
de aminoácidos para un porcentaje de identidad dado se determina
multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2 por
el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por
100 y después restando ese producto de dicho número total de
aminoácidos en la SEC ID Nº: 2, o
n_{a} \leq
x_{a} - (x_{a} \cdot
y).
en la que n_{a} es el número de
alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de
aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2, y es 0,70 para 70%, 0,80 para 80%,
0,85 para 85 etc., y \cdot es el símbolo del operador de
multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a}
se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de
restarlo de
x_{a}.
"Individuo(s)" cuando se usa con
referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular,
incluyendo, pero sin limitación a metazoano, un mamífero, un óvido,
un bóvido, un simio, un primate, y un ser humano.
"Aislado" significa alterado "por la mano
del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si se
produce en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente
natural, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido
de origen natural en un organismo vivo no está "aislado", pero
el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales
coexistentes de su estado natural está "aislado", como se
emplea el término en esta memoria descriptiva. Además, un
polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo
mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier
otro procedimiento recombinante se "aísla" incluso si todavía
está presente en dicho organismo, dicho organismo puede ser vivo o
no vivo.
"Polinucleótido(s)" generalmente se
refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido,
que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado
incluyendo regiones de una sola o doble hebra.
"Variante" se refiere a un polinucleótido o
polipéptido que se diferencia de un polinucleótido o polipéptido de
referencia, pero conserva las propiedades esenciales. Una variante
típica de un polinucleótido difiere en una secuencia de nucleótidos
de otro, polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia
de nucleótidos de la variante puede o no puede alterar la secuencia
de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de
referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado
sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de
aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de
referencia, como se describe más adelante. Una variante típica de un
polipéptido se diferencia en la secuencia de aminoácidos del otro,
polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan
de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la
variante sean estrechamente similares en conjunto y, en muchas
regiones, idénticas. Una variante del polipéptido de referencia se
puede diferenciar en la secuencia de aminoácidos en una o más
sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un
residuo de aminoácidos sustituido o insertado puede o no puede estar
codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido
o polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante
alélica, o puede ser una variante que no se conoce que sea de origen
natural. Las variantes de origen no natural de polinucleótidos y
polipéptidos se pueden preparar mediante técnicas de mutagénesis o
mediante síntesis directa.
"Enfermedad(es)" significa cualquier
enfermedad producida por o relacionada con infección por una
bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y
niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y
enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de
audición, acumulación de fluido en el oído medio, daño en el nervio
auditivo, retraso en el aprendizaje del habla, infección del tracto
respiratorio superior e infección del oído medio.
Los ejemplos más adelante se llevan a cabo usando
técnicas habituales, que son bien conocidas y de rutina para los
expertos en la técnica, excepto donde se describe de otra manera en
detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la
invención.
El gen BABS021 de la SEC ID Nº: 1 de referencia
se descubrió primero en la base de datos Incyte PathoSeq que
contiene secuencias de ADN genómico no terminadas de la cepa ATCC
43617 de Moraxella catarrhalis también denominada cepa
Mc2931)La traducción de la secuencia de polinucleótidos
BABS021, mostrada en la SEC ID Nº: 2, mostró similitud
significativa (22% de identidad en una superposición de 875
aminoácidos) a la proteína de HasR de unión heme de la membrana
externa de Serratia marcescens.
La secuencia del gen BABS021 se confirmó además
experimentalmente. Con este fin, se extrajo ADN genómico de
10^{10} células de células de M. catarrhalis (cepa ATCC
43617) usando el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen
GMBH), y 1 \mug de este material se sometió a la amplificación de
ADN con la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores
E512171 (5' - ATG - ACA - CAA - ACC - AAG - CAT - AC - 3') [SEQ ID
Nº 3] y E512172 (5' - CTA - CCA - CTT - ATA - CAT - TG - 3') [SEQ
ID Nº 4]. Este producto de PCR se purificó en un aparato Biorobot
9600 (Qiagen Gmbh) y se sometió a secuenciación de ADN usando el kit
de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin - Elmer) y un secuenciador de
ADN ABI 377/PRISM. La secuenciación de ADN se realizó en ambas
hebras con una redundancia de 2 y la secuencia de longitud completa
se ensambló usando ell softwarte Sequencher™ (Applied Biosystems).
La secuenciación de ADN resultante volvió a ser 100% idéntica a la
SEC ID Nº: 1 de referencia.
Se extrajo ADN genómico de 16 cepas de
Moraxella catarrhalis (presentadas en la tabla 1) como se
describe más adelante. Moraxella catarrhalis se sembró por
estría para detectar colonias individuales sobre placas de agar BHI
y se desarrollaron durante toda una noche a 37ºC. Se recogieron 3 ó
4 colonias individuales y se usaron para inocular aproximadamente
1,5 ml de cultivo de siembra en caldo BHI (infusión de
cerebro-corazón) que se desarrolló durante toda una
noche en un incubador con oscilación, aproximadamente 300 rpm, a
37ºC. Un matraz erlenmeyer de 500 ml que contenía aproximadamente
150 ml de caldo BHI se inoculó con el cultivo de siembra y se
desarrolló durante aproximadamente 12-16 horas a
37ºC en un incubador con oscilación, aproximadamente 175 rpm, para
generar masa celular para aislamiento de ADN. Las células se
recogieron mediante centrifugación en un rotor GSA Sorvall a
aproximadamente 2000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Se retiró el sobrenadante y el sedimento celular se suspendió en
aproximadamente 5,0 ml de agua estéril. Se añadió un volumen igual
de tampón de lisis (NaCl 200 mM, EDTA 20 mM, Tris HCl 40 mM, pH 8,0,
SDS al 0,5% (p/v), 2-mercaptoetanol al 0,5% (v/v), y
250 \mug/ml de proteinasa K) y las células se suspendieron
mediante agitación suave y trituración. Después la suspensión
celular se incubó aproximadamente 12 horas a 50ºC para lisar las
bacterias y liberar ADN cromosómico. El material proteináceo se
precipitó mediante la adición de 5,0 ml de NaCl saturado
(aproximadamente 6,0 M, en agua estéril) y centrifugación
aproximadamente 5.500 x g en un rotor Sorvall SS34 a temperatura
ambiente. El ADN cromosómico se precipitó a partir del sobrenadante
transparente mediante la adición de dos volúmenes de etanol al 100%.
El ADN agregado se recogió y se lavó usando agitación suave en un
volumen pequeño de una solución de etanol al 70%. El ADN
cromosómico purificado se suspendió en agua estéril y se dejó que
se disolviera/desembolsara durante toda una noche a 4º>C mediante
balanceo suave. La concentración de ADN disuelto se determinó
espectrofotométricamente a 260 nm usando un coeficiente de extinción
de 1,0 unidades de O. O. aproximadamente 50 \mug/ml.
Este material se sometió a continuación a
amplificación por PCR usando los oligonucleótidos
MC-HasR-BamF (5' - CAG AGG GGA TCC
GCC ATG GCA GAG GAT ACC CTT AAG GAT GTG CC - 3') [SEQ ID Nº 5] y
oligonucleótidos MC-HasR-SalRC (5' -
CAG AGG GTC GAC CTA CCA CTT ATA AGT CAT TGA AAA TAA AGA ACG - 3'
[SEQ ID Nº 6]. Después los amplicones correspondientes del gen
BABS021 se sometieron independientemente a hidrólisis usando enzimas
de restricción (Alul, DdeI, MaeIII,
MnlI, NlaIII, RsaI) y se separaron los
productos de restricción se separaron por electroforesis sobre
agarosa o gel de poliacrilamida usando procedimientos de biología
molecular habituales como se describe en "Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, segunda edición, Eds: Sambrook, Fritsch y
Maniatis, Cold Spring Harbor Press 1989". Las fotografías de los
geles de electroforesis resultantes se muestran en la figura 1.
Para cada cepa, se puntuaron patrones de RFLP correspondiente a las
6 enzimas de restricción y se combinaron. Después se definieron
grupos de cepas que comparten combinación idéntica de patrones de
RFLP. Usando esta metodología, las cepas ensayadas en este estudio
caían en 3 grupos genómicos (Grupos 1: Mc2910, Mc2912, Mc2956,
Mc2969; Grupo 2: Mc2904, Mc2905; Mc2907, Mc2908, Mc2909, Mc2911,
Mc2913, Mc2926, Mc2931, Mc2960; Mc2975; Grupo 3 Mc2906). Estos
datos soportan que la población de Moraxella catarrhalis
usada en este estudio muestra alguna diversidad de secuencia de
nucleótidos para el gen BABS021.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepa | Aislada en: | A partir de: |
Mc2904 | Estados Unidos | Timpanocentesis |
Mc2905 | Estados Unidos | Timpanocentesis |
Mc2906 | Estados Unidos | Timpanocentesis |
Mc2907 | Estados Unidos | Timpanocentesis |
Mc2908 | Estados Unidos | Timpanocentesis de otitis aguda |
Mc2909 | Estados Unidos | Timpanocentesis |
Mc2910 | Estados Unidos | Timpanocentesis |
Mc2911 | Estados Unidos | Timpanocentesis de otitis aguda |
Mc2912 | Estados Unidos | Timpanocentesis de otitis aguda |
Mc2913 | Estados Unidos | Timpanocentesis de otitis aguda |
Mc2926 | Estados Unidos | Timpanocentesis |
Mc2931/ATCC 43617 | Estados Unidos | Aspirado transtraqueal |
Mc2956 | Finlandia | Fluido de oído medio |
Mc2960 | Finlandia | Fluido de oído medio |
Mc2969 | Noruega | Nasofaringe (faringitis-rinitis) |
Mc2975 | Noruega | Nasofaringe (rinitis) |
Los sitios de restricción BamHI y
SalI modificados por ingeniería genética en los cebadores de
amplificación ([SEQ ID Nº 5]) delantero y ([SEQ ID Nº 6])
complementario inverso, respectivamente, permitieron la clonación
direccional de un producto de PCR de aproximadamente 2800 pares de
bases en el plásmido pQE30 de expresión de E. coli
comercialmente disponible (QiaGen, resistente a ampicilina) tal como
una proteína BASB021 madura se podría expresar como una proteían de
fusión que contiene una marca de cromatografía por afinidad
(His)6 en el extremo N. El producto de PCR BASB021 se
purificó a partir de las columnas giratorias basadas en gel de
sílice (QiaGen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Para producir los extremos BamHI y SalI requeridos
necesarios para clonar, el producto de PCR purificado se digirió
secuencialmente hasta finalización con enzimas de restricción
BamHI y SalI como se recomienda por el fabricante
(Life Technologies). Después de la primera digestión de restricción,
el producto PCR se purificó mediante una columna giratoria como se
ha indicado anteriormente para retirar las sales y se eluyó en agua
estéril antes de la segunda digestión por enzima. El fragmento de
ADN digerido se purificó de nuevo usando columnas giratorias basadas
en gel de sílice antes de la ligadura con el plásmido pQE30.
Para preparar el plásmido pQE30 de expresión, se
digirió de manera similar hasta finalización con tanto BamHI
como SalI y después se trató con fosfatasa de intestino de
ternera ((CIP, aproximadamente 0,02 unidades/pmol del extremo 5',
Life Technologies) siguiendo las indicaciones del fabricante para
evitar la auto ligadura. Se usó un exceso de aproximadamente 5
veces molar del fragmento digerido para preparar el vector con el
fin de programar la reacción de ligadura. Se realizó un patrón de
aproximadamente 20 \mul de reacción de ligadura (aproximadamente
16ºC, aproximadamente 16 horas), usando procedimientos bien
conocidos en la técnica usando la T4 ADN ligasa (aproximadamente 2,0
unidades/reacción, Life Technologies). Una alícuota de la ligadura
(aproximadamente 5 \mul) se usó para transformar células
M15(pREP4) electrocompetentes de acuerdo con procedimientos
bien conocidos en al técnica. Después de un período de crecimiento
de aproximadamente 2-3 horas de a 37ºC en
aproximadamente 1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se
sembraron en placas de agar LB que contenían kanamicina (50
\mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml). Ambos antibióticos se
incluyeron en el medio de selección para asegurar que todas las
células transformadas llevaban el plásmido pREP4 (KnR), que lleva el
gen lacIq necesario para la represión de la expresión para la
expresión inducible por IPTG de proteínas sobre pQE30, y el plásmido
pQE30-BABS020 (ApR). Las placas se incubaron durante
toda una noche a 37ºC durante aproximadamente 16 horas. Se
recogieron colonias individuales KnR/ApR con mondadientes estériles
y se usaron para inocular "parches" placas de KnR/ApR en LB
reciente así como aproximadamente 1,0 ml de caldo de cultivo LB
KnR/ApR. Tanto las placas de parche como el cultivo en caldo se
incubaron durante toda una noche a 37ºC en o bien un incubador
habitual (placas) o baño de agua con oscilación.
Un análisis de PCR basado en células enteras se
empleó para verificar que los transformantes contenían la inserción
de ADN de BABS021. Aquí, aproximadamente 1,0 ml de caldo de cultivo
en LB de Kn/Ap durante toda una noche se transfirió a un tubo de
polipropileno de 1,5 ml y las células se recogieron mediante
centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (aproximadamente 3
minutos, temperatura ambiente, aproximadamente 12.000 x g). El
sedimento celular se suspendió en aproximadamente 200 \mul de agua
estéril y aproximadamente 10 \mul usados para programar una
reacción de PCR de aproximadamente 50 \mul de volumen final que
contenía cebadores de amplificación tanto directos como inversos de
BABS021. Las concentraciones finales Las concentraciones finales de
los componentes de reacción de PCR eran esencialmente los mismos que
los especificados en el ejemplo 2 excepto que se usaron
aproximadamente 5,0 unidades de Taq polimerasa. La etapa de
inicial de desnaturalización a 95ºC se incrementó hasta 3 minutos
para asegurar el rompimiento térmico de las células bacterianas y la
liberación del ADN del plásmido. Un ciclador térmico modelo 9700 de
ABI y un perfil de amplificación térmica de tres etapas y 32 ciclos,
es decir 95ºC, 45 segundos; 55-58ºC, 45 segundos,
72ºC 1 minutos, se usaron para amplificar el fragmento de PCR
MC-P6 a partir de las células transformantes
lisadas. Después de la amplificación térmica, una alícuota de
aproximadamente 20 \mul de la reacción se analizó mediante
electroforesis sobre gel de agarosa (agarosa al 0,8% en
Tris-acetato-EDTA (tampón TAE). Los
fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con UV
después de la electroforesis sobre gel y tinción con bromuro de
etidio. Un patrón de tamaño molecular de ADN (escala de 1 Kb, Life
Technologies) se sometió a electroforesis en paralelo con muestras
de ensayo y se usó para estimar el tamaño de los productos de PCR.
Los transformantes que producían el producto de PCR de 504 pares de
bases se identificaron como cepas que contenían una construcción de
expresión de BABS021. El plásmido de expresión que contenía cepas se
analizaron después para la expresión inducible de BABS021
recombinante.
Para cada transformante
PCR-positivo anterior, se inocularon aproximadamente
5,0 ml de caldo LB que contenía canamicina (50 \mug/ml) y
ampicilina (100 \mug/ml) con células de la placa de parches y se
desarrollaron durante toda una noche a 37ºC con agitación
(aproximadamente 250 rpm). Una alícuota del cultivo de siembra
durante toda una noche (aproximadamente 1,0 ml) se inoculó en un
matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía aproximadamente 125 ml de
caldo LB de Kn/Ap y se desarrolló a 37ºC con agitación
(aproximadamente 250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó
una D. O. a 600 de aproximadamente 0,5, es decir, fase
semilogarítmica (usualmente aproximadamente 1,5-2,0
horas). En este momento aproximadamente la mitad del cultivo
(aproximadamente 12,5 ml) se transfirió a un segundo matraz de 125
ml y expresión de proteína de BABS021 recombinante se indujo
mediante la adición de IPTG (solución 1,0 M preparada en agua
estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. La
incubación de los cultivos tanto inducidos por IPTG como no
inducidos se continuó durante aproximadamente 4 horas adicionales a
37ºC con agitación. Las muestras (aproximadamente 1,0 ml) de
cultivos tanto inducidos como no inducidos se retiraron después del
período de inducción y las células se recogieron mediante
centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante
aproximadamente 3 minutos. Los sedimentos celulares individuales se
suspendieron en aproximadamente 50 \mul de agua estéril, después
se mezclaron con un volumen igual de 2 x de tampón de muestra
SDS-PAGE de Lamelli que contenía
2-mercaptoetanol, y se colocaron en un baño de agua
en ebullición durante aproximadamente 3 minutos para desnaturalizar
la proteína. Se cargaron volúmenes iguales (aproximadamente 15 ml)
de lisados celulares tanto inducidos por IPTG como no inducidos por
duplicado en gel de poliacrilamida Tris al 12%/glicina (minigeles de
1 mm de espesor, Novex). Las muestras de lisados inducidos y no
inducidos se sometieron a electroforesis junto con marcadores de
peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones
convencionales usando un tampón de desarrollo SDS/Trs/glicina (Bio
Rad). Después de electroforesis, se tiño un gel con azul brillante
commassie R250 (BioRad) y después se destiñó para visualizar
la(s) proteína(s) BABS021 inducible(s) por
IPTG. El segundo gel se sometió a electrotransferencia sobre una
membrana PVDF (tamaño de poro 0,45 micrones, Novex) durante
aproximadamente 2 horas a 4ºC usando un aparato de transferencia
Mini-Protean II de BioRad y tampón de transferencia
de metanol (20%) de Towbin. El bloqueo de las incubaciones de
membrana y de anticuerpos se realizó de acuerdo con procedimientos
bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo anti-RGS
(His)3 monoclonal, seguido de un segundo anticuerpo
anti-ratón de conejo se conjugó a HPR (QiaGen), se
usó para confirmar la expresión e identidad de la proteína
recombinante BABS021. La visualización del patrón reactivo
anti-His se logró usando o bien un sustrato
insoluble en ABT o usando Hyperfilm con el sistema de
quimioluminiscencia ECL de Amersham.
Para verificar además que la proteína BABS021
recombinante inducible por IPTG que se expresa en la fase abierta de
lectura correcta y no una molécula falsa que surge de un artefacto
de clonación (es decir, un desplazamiento de fase), se determinó la
secuencia de ADN de la inserción clonada. La secuencia de ADN para
el gen BABS021 de Moraxella catarrhalis se obtuvo a partir de
una hebra usando metodologías convencionales de secuenciación de
ciclos de PCR asimétrica (ABI Prism Dye - Terminator Cycle
Sequencing, Perkin - Elmer). Las reacciones de secuenciación se
programaron con ADN de plásmido de expresión sin digerir
(aproximadamente 0,5 \mug/rxn) como molde y cebadores de
secuenciación específicos del vector pQE30 y específicos de ORF
(aproximadamente 3,5 pmol/rxn). Además del molde y cebador de
secuenciación, cada reacción de secuenciación (aproximadamente 20
\mul) contenía los cuatro ddNTP diferentes (es decir, A, G, C, y
T) y los cuatro nucleótidos terminadores ddNTP correspondientes (es
decir, ddA, ddG, ddC, y ddT); estando cada terminador conjugado a
uno de los cuatro tintes fluorescentes, Joe, Tam, Rox, o Fam. Los
productos de elongación de secuenciación de hebra individual se
terminaron en las posiciones aleatorias junto con el molde mediante
la incorporación de los terminadores de ddNTP marcados con tinte.
Los productos de terminación marcados con tintes fluorescentes se
purificaron usando columnas de cromatografía de exclusión por tamaño
en microcentrífuga (Princeton Genetics), se secaron a vacío, se
suspendieron en un tampón de resuspensión de molde (Perkin - Elmer)
para electroforesis capilar o formamida desionizada para PAGE, se
desnaturalizaron a 95ºC durante aproximadamente 5 minutos, y se
analizaron mediante electroforesis capilar de alta resolución
(secuenciador de ADN automático ABI 310, Perkin - Elmer) o PAGE de
alta resolución (secuenciador de ADN automático ABI 377, Perkin -
Elmer) según recomienda el fabricante. Se recogieron los datos de
secuencia de ADN producidos a partir de reacciones individuales y se
analizaron las intensidades de los picos fluorescentes relativos
automáticamente sobre un ordenador PowerMAC usando el software de
análisis de secuencias ABI (Perkin - Elmer). Las secuencias de ADN
autoanalizadas individualmente se editaron manualmente para evaluar
la exactitud antes de combinarse en una "cuerda" de secuencia
de cadena simple consenso usando software AutoAssembler (Perkin -
Elmer). La seceunciación determinó que el plásmido de expresión
contenía la secuencia correcta en la fase abierta de lectura
correcta.
La proteína recombinante BASB021 se expresó en
E. coli como una proteína de fusión 6xHis tag y se purificó
mediante Ni2+ - cromatografía de afinidad Hitrap cargada (Pharmacia
Biotech). La capacidad protectora de BASB021 recombinante humana se
ensayó en un modelo de ratón. Este modelo de ratón se basa en el
análisis de invasión de pulmón por M. catarrhalis siguiendo
una exposición intranasal convencional para ratones vacunados.
Grupos de 6 ratones BALB/c (hembras, de 6 semanas
de edad) se inmunizaron por vía subcutánea con 100 \mul de vacuna
correspondiente a 10 \mug de dosis y se reinmunizaron 2 semanas
después. Una semana después del refuerzo, los ratones reexpusieron
mediante instilación de 50 \mul de suspensión bacteriana (+/-
10^{6} UFC/50 \mul) en el orificio nasal izquierdo bajo
anestesia (los ratones se anestesiaron con una combinación de
anestésicos cetamina y xilazina, 0,24 mg de xilazina (Rompun) y 0,8
mg de cetamina (Imalgene)/100 \mul). Los ratones se sacrifican 4
horas después de la exposición y los pulmones se retiran
asépticamente y se homogeneizan individualmente. El log10 del número
medio ponderado de UFC/pulmón se determina contando las colonias
desarrolladas en placas de agar de Mueller - Hinton después de
sembrar 20 \mul de diluciones en serie del homogenato. Se
calcularon la media aritmética del log10 del número medio ponderado
de UFC/pulmón y las desviaciones estándar para cada grupo.
Los resultados se analizan estadísticamente
aplicando ANOVA de una vía después de asumir igualdad de varianza
(comprobada por la prueba de Brown y Fosythe) y normalidad
(comprobada usando la prueba de Shapiro - Wilk). Las diferencias
entre grupos se analizaron usando la prueba de Dunnet, prueba de
intervalo de student de Tukey (HSD) y prueba de Student - Newman -
Keuls.
Un depósito que contiene una cepa Catlin de
Moraxella catarrhalis se ha depositado en la Colección
Americana de Cultivos tipo (en esta memoria descriptiva
"ATCC") el 21 de junio de 1997 y número de depósito asignado
43617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis
(Frosch y Kolle) y es una genoteca insertada de
1,5-2,9 kb secada por congelación, construida a
partir de aislamiento de M. catarrhalis obtenido a partir de
un aspirado transtraqueal de un minero de carbón con bronquitis
crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother.
21: 506-508 (1982).
El depósito de la cepa de Moraxella
catarrhalis se denomina en esta memoria descriptiva como "la
cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".
La cepa depositada contiene un gen BABS021 de
longitud completa.
La secuencia de polinucleótidos contenida en la
cepa depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier
polipéptido codificado en ellos, se controlan en el caso de
cualquier conflicto con cualquier descripción de las secuencias en
esta memoria descriptiva.
El depósito de las cepas depositadas se ha hecho
bajo los términos del Tratado de Budapest en el reconocimiento
internacional del depósito de microorganismos para propósitos de
procedimiento de patente. La cepa depositada se liberarán
irrevocablemente y sin restricción o condición al público tras la
expedición de una patente. La cepa depositada se proporcionan
meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no son
una admisión que requiere un depósito para habilitación, tal como la
requerida bajo 35 U. S. C. \NAK 112.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Formulario pasa a página
siguiente)
<110> SmithKline Beecham Biologicals
S.A.
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<120> Compuestos novedosos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BM45326
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacterias
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 947
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacterias
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipatgacacaaa ccaagcatac
\hfill20
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<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipctaccactta taagtcattg
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<210> 5
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipcagaggggat ccgccatggc agaggatacc cttaaggatg tgcc
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<210> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipcagagggtcg acctaccact tataagtcat tgaaaataat aaagaacg
\hfill48
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Claims (26)
1. Un polipéptido aislado capaz de inducir una
respuesta inmune (si es necesario cuando se acopla a un vehículo)
que reconoce el polipéptido de la SEQ ID Nº 2, que comprende una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2 en la longitud completa
de SEQ ID Nº 2.
2. Un polipéptido aislado según la reivindicación
1 en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos 95% de
identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID
Nº 2 en la longitud completa de SEQ ID
Nº 2.
Nº 2.
3. El polipéptido aislado según la reivindicación
1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2.
4. Un polipéptido aislado constituido por la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 2.
5. Un fragmento inmunogénico del polipéptido
según una cualquiera de las la reivindicaciones 1 a 4, en el que el
fragmento inmunogénico es capaz de inducir una respuesta inmune, (si
es necesario cuando se acopla a un vehículo) que reconoce el
polipéptido de la SEQ ID Nº 2.
6. Un polinucleótido o un fragmento inmunogénico
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho
polipéptido o dicho fragmento inmunogénico es parte de una proteína
de fusión mayor.
7. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido o un fragmento inmunogénico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
8. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido capaz de
inducir una respuesta inmune (si es necesario cuando se acopla a un
vehículo) que reconoce el polipéptido de la SEQ ID Nº 2, en el que
el polipéptido tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID Nº 2 en la longitud completa de SEQ ID Nº
2; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho
polinucleótido aislado.
9. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido capaz de
inducir una respuesta inmune (si es necesario cuando se acopla a un
vehículo) que reconoce el polipéptido de la SEQ ID Nº 2, en el que
la secuencia de nucleótidos tiene al menos 85% de identidad con una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEQ ID Nº
2 en la región codificadora completa; o una secuencia de
nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.
10. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido capaz de
inducir una respuesta inmune (si es necesario cuando se acopla a un
vehículo) que reconoce el polipéptido de la SEQ ID Nº 2, en el que
la secuencia de nucleótidos tiene al menos 85% de identidad con la
SEQ ID Nº 1 en la región codificadora completa de la SEQ ID Nº 1; o
una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido
aislado.
11. El polinucleótido aislado según una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en el que la identidad es
al menos 95% con la SEQ ID Nº 1.
12. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEQ ID Nº
2; o el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5 ó 6.
13. Un polinucleótido aislado que comprende el
polinucleótido de la SEQ ID Nº 1.
14. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEQ ID
Nº 2; obtenible mediante la selección de una genoteca apropiada en
condiciones de hibridación restrictivas con una sonda marcada que
tiene la secuencia de SEQ ID Nº 1 o un fragmento de la misma.
15. Un vector de expresión o un microorganismo
vivo recombinante que comprende un polipéptido aislado según una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14.
16. Una célula hospedadora que comprende el
vector de expresión de la reivindicación 15, o una fracción
subcelular o membrana de dicha célula hospedadora.
17. Un procedimiento para producir un polipéptido
o un fragmento inmunogénico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 que comprende cultivar una célula hospedadora
de la reivindicación 16 en condiciones suficientes para la
producción de dicho polipéptido o dicho fragmento inmunogénico y
recuperar el polipéptido o el fragmento inmunogénico del medio de
cultivo.
18. Un procedimiento para expresar un
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones
7-14 que comprende transformar una célula
hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de
dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula huésped en
condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de
dichos polinucleótidos.
19. Una composición de vacunas que comprende una
cantidad eficaz del polipéptido o el fragmento inmunogénico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
20. Una composición de vacunas que comprende una
cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 14 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
21. La composición de vacunas según una
cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 en la que dicha
composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella
catarrhalis.
22. Un anticuerpo inmunoespecífico para el
polipéptido o fragmento inmunogénico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
23. Un procedimiento de diagnosis de una
infección por Moraxella catarrhalis, que comprende la
identificación de un polipéptido o un fragmento inmunogénico según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un anticuerpo que es
inmunoespecífico para dicho polipéptido o fragmento inmunogénico,
presentes dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de
tener tal infección.
24. Uso de una composición que comprende una
cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o un fragmento
inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en
la preparación de un medicamento para uso en la generación de una
respuesta inmune en un animal.
25. Uso de una composición que comprende una
cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 en la preparación de un
medicamento para uso en la generación de una respuesta inmune en un
animal.
26. Una composición terapéutica útil en el
tratamiento de seres humanos con enfermedad de Moraxella
catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con
la reivindicación 22 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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