ES2306662T3 - Nuevos compuestos de moraxella catarrhalis. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

Description

Nuevos compuestos de Moraxella catarrhalis.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos (denominados en la presente memoria como "BASB103"), polipéptidos codificados por los mismos (denominados en la presente memoria como "BASB103"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar una infección por ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (también denominada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram negativa que se aísla con frecuencia del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, siendo las principales otitis media en lactantes y niños y neumonía en personas mayores. También es responsable de sinusitis, infecciones intrahospitalarias y, menos frecuentemente, de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad importante de la infancia tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. Se registran más de 3,5 millones de casos cada año en los Estados Unidos y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis 19: 823). Si se dejan sin tratar o se hace crónica, esta enfermedad puede conducir a pérdidas de audición que pueden ser temporales (en el caso de acumulación de líquido en el oído medio) o permanentes (si se lesiona el nervio auditivo). En lactantes, dichas pérdidas de audición pueden ser responsables de un retraso en el aprendizaje del habla.

Se aíslan principalmente tres especies bacterianas del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza no tipable (NTHi) y M. catarrhalis. Están presentes en el 60 al 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan ambos aproximadamente el 30% y M. catarrhalis aproximadamente el 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Pueden aislarse otras bacterias del oído medio (H. influenza tipo B, S. pyogenes, etc.) pero en una frecuencia mucho menor (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos que se encuentra en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un requisito previo incuestionable para el desarrollo de una otitis; sin embargo, también se requieren otros para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col. (1988) J. Infect. Dis. 158: 205, Faden, HL y col. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Estos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias hacia el oído medio a través de la trompas de Eustaquio, seguido del inicio de un proceso inflamatorio. Se desconocen estos factores hasta la fecha. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmune después de una infección viral, por ejemplo, podría causar una incapacidad para controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, HL y col (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más importante en algunos niños, que posteriormente se vuelven susceptibles al desarrollo de otitis media debido a la presencia sostenida de patógenos en el oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267).

La respuesta inmune a M. catarrhalis está muy poco caracterizada. El análisis de cepas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebés en seguimiento de los 0 a los 2 años de edad, indica que cogen y eliminan con frecuencia nuevas cepas. Esto indica que existe una respuesta inmune eficaz contra estas bacterias en los niños colonizados (Faden, HL y col (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

En la mayoría de los adultos examinados se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y col. (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida del suero: en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que los de individuos que simplemente están colonizados (Hol, C y col. (1993) Lancet 341: 1381, Jordan, KL y col. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A): 28S). Por lo tanto, la resistencia al suero puede considerarse como un factor de virulencia de las bacterias. Se ha observado una actividad opsonizante en los sueros de niños que se recuperan de una otitis media.

No se han identificado los antígenos a los que se dirigen estas diferentes respuestas inmunes en seres humanos, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por hierro y que se reconoce por los sueros de pacientes con neumonía (Sethi, S y col. (1995) Infect. Immun. 63: 1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col. (1999), Infect. Immun. 67: 1310).

Se han caracterizado otras pocas proteínas de membrana presentes en la superficie de M. catarrhalis usando un procedimiento bioquímico, o por su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para una revisión, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos generados contra algunas de ellas (UspA, CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) está muy conservado entre cepas de M. catarrhalis y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que se ha demostrado eficaz contra esta bacteria en modelos animales.

La frecuencia de infecciones por Moraxella catarrhalis ha aumentado drásticamente en las pasadas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a antibióticos y a una población creciente de personas con sistemas inmunes debilitados. Ya no es infrecuente aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o a todos los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha generado una necesidad médica insatisfecha y una demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos y ensayos de diagnóstico para este organismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB103 en particular a polipéptidos BASB103 y polinucleótidos de BASB 103, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y afecciones asociadas con dichas infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB103.

Diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita serán fácilmente evidentes para los especialistas en la técnica a partir de la lectura de las siguientes descripciones y a partir de la lectura de otras partes de la presente descripción.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB 103, como se describen con más detalle a continuación. Todos los polipéptidos de acuerdo con la invención pertenecen a la familia de proteínas de membrana externa y, por lo tanto, son útiles como candidatas a vacunas.

En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB 103 de Moraxella catarrhalis, que no están relacionados por homología de la secuencia de aminoácidos con proteínas conocidas pero que tienen algunas características de proteína de membrana externa: secuencia señal, aminoácido N-terminal aromático, predicción de estructura 2D rica en láminas beta. La invención se refiere especialmente a BASB103 que tienen las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que se exponen en las SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2, respectivamente.

Se entiende que las secuencias mencionadas en la Lista de secuencias a continuación como "ADN" representan una ejemplificación de una realización de la invención, puesto que los especialistas reconocerán que dichas secuencias pueden emplearse de un modo útil en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en la presente memoria como "BASB103" y "polipéptidos BASB103", así como variantes biológicamente, diagnósticamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente útiles de los mismos y composiciones que los comprenden.

La presente invención proporciona además:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente, una identidad de al menos el 95%, más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% o exacta con la de la SEC ID Nº: 2;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, aún más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% o exacta con la SEC ID Nº: 1 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID Nº: 1; o

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, aún más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% o exacta con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

Los polipéptidos BASB103 que se proporcionan en la SEC ID Nº: 2 son los polipéptidos BASB103 de la cepa Mc2931 de Moraxella catarrhalis (ATCC 43617).

La invención también proporciona un fragmento inmunógeno de un polipéptido BASB103, es decir, una porción contigua del polipéptido BASB103 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, a condición de que dicho fragmento no tenga la secuencia nvvtntgatv vdgtrtifst lvkpaawaa v. Es decir, el fragmento (si es necesario acoplado a un transportador) es capaz de provocar una respuesta inmune que reconozca el polipéptido BASB103. Dicho fragmento inmunógeno puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB103 que carece de una secuencia líder N-terminal y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunógeno de BASB103 de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% con la SEC ID Nº: 2 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID Nº: 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma como parte pero no toda una secuencia cualquiera de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB 103, los fragmentos pueden ser "independientes" o estar comprendidos en el interior de un polipéptido de mayor tamaño del que forman una parte o región, más preferiblemente como una única región continua en un único polipéptido de mayor tamaño.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o de variantes de la misma, tal como una serie continua de restos que incluyen una secuencia de aminoácidos amino y/o carboxilo terminal. También se prefieren formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula huésped. Son más preferidos fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales, tales como fragmentos que comprenden hélices alfa y regiones formadoras de hélices alfa, láminas beta y regiones formadoras de láminas beta, giros y regiones formadoras de giros, enrollamientos y regiones formadoras de enrollamientos, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones anfipáticas alfa, regiones anfipáticas beta, regiones flexibles, regiones formadoras de superficies, región de unión a sustrato y regiones de elevado índice antigénico.

Los fragmentos más preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o delecionados de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

Pueden emplearse fragmentos de los polipéptidos de la invención para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis peptídica; por lo tanto, estos fragmentos pueden emplearse como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Se prefieren particularmente variantes en las que están sustituidos, delecionados o añadidos varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácido en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunógenos, de la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura" o pueden ser una parte de una proteína de mayor tamaño, tal como un precursor o una proteína de fusión. Con frecuencia es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contenga secuencias secretoras o líder, pro-secuencias, secuencias que faciliten la purificación, tales como múltiples restos de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de un polipéptido exógeno o cola lipídica o secuencias polinucleotídicas para aumentar el potencial inmunógeno de la molécula
final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles obtenidas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, a condición de que dicha proteína de fusión no tenga la secuencia nvvtntgatv vdgtrtifst lvkpaawaa v y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como una inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de una IgG humana, particularmente IgGI, en la que la fusión tiene lugar en la región de bisagra. En una realización en particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente por incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con el factor de coagulación sanguínea Xa.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética y al uso de las mismas para la selección de fármacos, el diagnóstico y la terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de la tecnología de proteínas de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO94/29458 y WO94/22914.

Las proteínas pueden conjugarse químicamente o expresarse como proteínas de fusión recombinantes permitiendo que se produzcan niveles aumentados en un sistema de expresión en comparación con una proteína no fusionada. El compañero de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos T auxiliares (compañero de fusión inmunológico), preferiblemente, epítopos T auxiliares reconocidos por humanos, o estimular la expresión de la proteína (potenciador de la expresión) a rendimientos mayores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente, el compañero de fusión será tanto un compañero de fusión inmunológico como un compañero potenciador de la expresión.

Los compañeros de fusión incluyen proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus influenza, NS 1 (hemaglutinina). Otro compañero de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente se usa la porción C-terminal de la molécula. LytA procede de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa, amidasa LytA (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) páginas 265-272}), una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la estructura del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad por la colina o por algunos análogos de colina tales como DEAE. Se ha explotado esta propiedad para el desarrollo de plásmidos que expresen C-LytA en E. coli, útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su extremo amino terminal (Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798). Es posible usar la porción repetida de la molécula LytA que se encuentra en el extremo C-terminal que comienza en el resto 178, por ejemplo, los restos 188-305.

La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos mencionados anteriormente, es decir, polipéptidos que varían de los referentes por sustituciones conservativas de aminoácidos, por las que se sustituye un resto por otro con características similares. Dichas sustituciones típicas son entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los restos básicos Lys y Arg; o restos aromáticos Phe y
Tyr.

Pueden prepararse polipéptidos de la presente invención de cualquier forma adecuada. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos de origen natural aislados, polipéptidos producidos de forma recombinante, polipéptidos producidos de forma sintética o polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos. Se comprenden bien en la técnica medios para preparar dichos polipéptidos.

Es más preferido que un polipéptido de la invención proceda de Moraxella catarrhalis,no obstante, puede obtenerse preferiblemente de otros organismos del mismo género taxonómico. También puede obtenerse un polipéptido de la invención, por ejemplo, a partir de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Un objeto de la invención es proporcionar polinucleótidos que codifiquen polipéptidos BASB103, particularmente, polipéptidos que codifiquen el polipéptido denominado BASB 103 en la presente memoria.

En una realización particularmente preferida de la invención el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB103 que comprende una secuencia que se expone en la SEC ID Nº: 1, que incluye un gen de longitud completa o una variante del mismo.

Los polinucleótidos de BASB103 proporcionados en la SEC ID Nº: 1 son polinucleótidos de BASB 103 de la cepa Mc2931 de Moraxella catarrhalis (ATCC 43617).

Como un aspecto adicional de la invención se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos de BASB 103, particularmente, polipéptidos y polinucleótidos de BASB 103 de Moraxella catarrhalis incluyendo, por ejemplo, ARN no procesados, ARN de ribozimas, ARNm, ADNc, ADN genómicos, ADN B y Z. Realizaciones adicionales de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos biológicamente, diagnósticamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente útiles, y variantes de los mismos y composiciones que los comprenden.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB 103 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº: 2 y polinucleótidos estrechamente relacionados con el mismo y variantes del mismo.

En otra realización particularmente preferida de la invención existe un polipéptido BASB 103 de Moraxella catarrhalis que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o una variante de la misma.

Usando la información que se proporciona en la presente memoria, tal como una secuencia polinucleotídica expuesta en la SEC ID Nº:, puede obtenerse un polinucleótido de la invención que codifique un polipéptido BASB 103 usando procedimientos de clonación y de selección convencionales, tales como los que se usan para la clonación y secuenciación de fragmentos de ADN cromosómico de bacterias usando células Catlin de Moraxella catarrhalis como material de partida, seguido de la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia polinucleotídica de la invención, tal como una secuencia polinucleotídica proporcionada en la SEC ID Nº: 1, típicamente se sonda una genoteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella catarrhalis Catlin en E. coli o algún otro huésped adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferiblemente, de 17 nucleótidos o más largo, obtenido de una secuencia parcial. Después, los clones que llevan un ADN idéntico al de la sonda puede distinguirse usando condiciones de hibridación rigurosas. Mediante la secuenciación de los clones individuales identificados de este modo por hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia polipeptídica o polinucleotídica original, entonces es posible prolongar la secuencia polinucleotídica en ambas direcciones para determinar una secuencia génica de longitud completa. Convenientemente, dicha secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN bicatenario desnaturalizado preparado a partir de un clon plasmídico. Se describen técnicas adecuadas en Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); (véase, en particular, Screening By Hybridization 1.90 y Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). También puede realizarse una secuenciación directa del ADN genómico para obtener una secuencia génica de longitud completa. A modo ilustrativo de la invención, cada polinucleótido expuesto en la SEC ID Nº: 1 se descubrió en una genoteca de ADN procedente de Moraxella catarrhalis.

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Además, cada secuencia de ADN expuesta en la SEC ID Nº: 1 contiene una fase de lectura abierta que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de restos aminoacídicos que se expone en la SEC ID Nº: 2 con un peso molecular deducido que puede calcularse usando los valores de peso molecular de restos aminoacídicos bien conocidos por los especialistas en la técnica.

El polinucleótido de la SEC ID Nº: 1, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de terminación que comienza en el nucleótido número 757 de la SEC ID Nº: 1, codifican el polipéptido de la SEC ID Nº: 2. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o consiste en:

(a) una secuencia polinucleotídica que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, aún más preferiblemente una identidad de al menos el 97-99% o exacta con la SEC ID Nº: 1 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID Nº: 1, respectivamente; o

(b) una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de al menos el 90%, más preferiblemente una identidad de al menos el 95%, aún más preferiblemente de al menos el 97-99% o exacta del 100% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID Nº: 2, respectivamente.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies distintas de Moraxella catarrhalis, puede obtenerse por un procedimiento que comprende las etapas de explorar una genoteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y una concentración de SDS del 0,1-1%) con una sonda marcada o detectable que consiste en o comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma; y el aislamiento de un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia polinucleotídica.

La invención proporciona una secuencia polinucleotídica idéntica a lo largo de su longitud completa a una secuencia codificante (fase de lectura abierta) de la SEC ID Nº: 1. También se proporciona por la invención una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, en solitario, así como una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento en la fase de lectura abierta con otra secuencia codificante, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre- o pro- o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención también puede contener al menos una secuencia no codificante, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitación, al menos una secuencia 5' y 3' no codificante, tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias de Kozak, secuencias que estabilizan ARNm, intrones y señales de poliadenilación. La secuencia polinucleotídica también puede comprender una secuencia codificante adicional que codifique aminoácidos adicionales. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilite la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989) o un marcador peptídico HA (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), pudiendo ambos ser útiles en la purificación de una secuencia polipeptídica fusionada a los mismos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero sin limitación, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias naturalmente asociadas que controlan la expresión de genes.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB 103 de la SEC ID Nº: 2 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polipéptido contenida en los nucleótidos 1 a 756 de la SEC ID Nº: 1. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos que codifica BASB 103 de la SEC ID Nº: 2, puede ser una secuencia que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifique el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, respectivamente.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido", como se usa en la presente memoria, abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y, más particularmente, un polipéptido BASB103 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº: 2. La expresión también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrada, una secuencia de transposón integrada o debido a la edición del ARN o a la reorganización del ADN genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.

La invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos en la presente memoria que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº: 2. Pueden usarse fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención.

Son realizaciones particularmente preferidas adicionales polinucleótidos que codifican BASB 103, variantes que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB103 de la SEC ID Nº: 2, respectivamente, en los que se sustituyen, modifican, delecionan y/o añaden varios, unos pocos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún resto aminoacídico, en cualquier combinación. Son especialmente preferidas entre estas sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB103.

Son realizaciones preferidas adicionales de la invención polinucleótidos que tienen una identidad de al menos el 85% a lo largo de su longitud completa con un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB103 que tiene una secuencia de aminoácidos que se expone en la SEC ID Nº: 2 y polinucleótidos que son complementarios a dichos polinucleótidos. Como alternativa, son más preferidos polinucleótidos que comprenden una región que tiene una identidad de al menos el 90% a lo largo de su longitud completa con un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB 103 y polinucleótidos complementarios a los mismos. A este respecto, se prefieren particularmente polinucleótidos que tienen una identidad de al menos el 95% a lo largo de su longitud completa con el mismo. Además, son muy preferidos los que tienen al menos el 97% entre los que tienen al menos el 95%, y entre estos son particularmente preferidos los que tienen al menos el 98% y al menos el 99%, siendo los más preferidos los que tienen al menos el 99%.

Son realizaciones preferidas polinucleótidos que codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de la SEC ID Nº: 1.

De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas de esta invención se proporcionan polinucleótidos que hibridan, particularmente en condiciones rigurosas, con secuencias polinucleotídicas de BASB 103, tales como los polinucleótidos de la SEC ID Nº: 1.

La invención se refiere además a polinucleótidos que hibridan con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en la presente memoria. A este respecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Como se usan en la presente memoria, las expresiones "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas" se refieren a la hibridación que se produce sólo si existe una identidad de al menos el 95% y, preferiblemente, de al menos el 97% entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación rigurosas es la incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, SSC 5x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10% y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, seguido de lavado del soporte de hibridación en SSC 0,1x a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ejemplifican en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), particularmente en el Capítulo 11 del mismo. También puede usarse una solución de hibridación con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas por la invención.

La invención también proporciona un polinucleótido que consiste en o comprende una secuencia polinucleotídica obtenida por exploración de una genoteca apropiada que contiene el gen completo para una secuencia polinucleotídica expuesta en la SEC ID Nº: 1 en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia polinucleotídica expuesta en la SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma; y el aislamiento de dicha secuencia polinucleotídica. Los fragmentos útiles para obtener dicho polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores descritos por completo en otra parte de la presente memoria.

Como se analiza en otra parte de la presente memoria con respecto a ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención pueden usarse como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifiquen BASB103 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tengan una elevada identidad, particularmente una elevada identidad de secuencia, con el gen de BASB103. Dichas sondas comprenderán generalmente al menos 15 restos nucleotídicos o pares de bases. Preferiblemente, dichas sondas tendrán al menos 30 restos nucleotídicos o pares de bases y pueden tener al menos 50 restos nucleotídicos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 restos nucleotídicos o pares de bases y tendrán menos de 30 restos nucleotídicos o pares de bases.

Puede aislarse una región codificante de un gen de BASB103 mediante exploración usando una secuencia de ADN proporcionada en la SEC ID Nº: 1 para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Después, se usa un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención para explorar una genoteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar con qué miembros de la genoteca hibrida la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos por los especialistas en la técnica para obtener ADN de longitud completa o prolongar ADN cortos, por ejemplo, los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, ejemplificadas por la tecnología de Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología de Marathon^{TM}, se han preparado ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido seleccionado y una secuencia "adaptadora" ligada en cada extremo. Después, se lleva a cabo una amplificación de ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "que falta" del ADN usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos de gen y específicos de adaptador. Después, se repite la reacción de PCR usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para hibridar en el interior del producto amplificado (típicamente, un cebador específico de adaptador que hibrida más allá del 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que hibrida más allá del 5' en la secuencia génica seleccionada). Después pueden analizarse los productos de esta reacción mediante secuenciación de ADN y construirse un ADN de longitud completa uniendo el producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa o llevando a cabo una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden emplearse, por ejemplo, como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos y la diagnosis de enfermedades, particularmente enfermedades humanas, como se analiza adicionalmente en la presente memoria con respecto a ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos procedentes de una secuencia de la SEC ID Nº: 1 pueden usarse en los procedimientos de la presente memoria como se describe, pero preferiblemente por PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en la presente memoria en su totalidad o en parte se transcriben o no en bacterias en tejidos infectados. Se reconoce que dichas secuencias también tendrán utilidad en el diagnóstico de la fase de infección y del tipo de infección que ha logrado el patógeno.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales amino o carboxilo terminales o aminoácidos en el interior del polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Dichas secuencias pueden desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína desde el precursor hasta una forma madura, pueden permitir el transporte de la proteína, puede alargar o acortar la semivida de la proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayos o producción, entre otras cosas. Como generalmente es el caso in vivo, los aminoácidos adicionales pueden eliminarse por procesamiento de la proteína madura por enzimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario al mismo. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido con el que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionada a una o más prosecuencias, puede ser una forma inactiva del polipéptido. Generalmente cuando las prosecuencias se eliminan dichos precursores inactivos se activan. Pueden eliminarse algunas o todas las prosecuencias antes de la activación. Generalmente, dichos precursores se denominan proproteínas.

Además de las representaciones convencionales A, G, C, T/U para nucleótidos, también puede usarse el término "N" en la descripción de ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en dicha posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto por que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se tome junto con posiciones nucleotídicas adyacentes, cuando se lea en la fase de lectura correcta, tenga el efecto de generar un codón de terminación prematuro en dicha fase de lectura.

En resumen, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (que puede denominarse como una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son secuencias líder de una preproteína, o una preproproteína, que es un precursor para una proproteína, que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para fines terapéuticos o profilácticos, en particular para inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en la inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento de administración adecuado tal como inyección directa de ADN plasmídico en músculos (Wolff y col., Hum Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), administración de ADN formando complejos con proteínas transportadoras específicas (Wu y col., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato cálcico (Benvenisty y Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y col. Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col., PNAS USA (1984) 81: 5849).

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Vectores, células huésped y sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células huésped que se modifican por ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. También pueden emplearse sistemas de traducción sin células para producir dichas proteínas usando ARN procedentes de las construcciones de ADN de la invención.

Pueden prepararse polipéptidos recombinantes de la presente invención por procedimientos bien conocidos por los especialistas en la técnica a partir de células huésped modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que están modificadas por ingeniería genética con dichos sistemas de expresión y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

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Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, pueden modificarse por ingeniería genética células huésped para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en el interior de la célula huésped puede efectuarse por procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), tales como, transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por raspado, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como células de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma Bowes; y células vegetales, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Puede usarse una gran diversidad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episomales y procedentes de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia, picornavirus, retrovirus y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Las construcciones de sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulen, así como provoquen la expresión. Generalmente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un huésped puede usarse para la expresión a este respecto. En la secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión por cualquiera de una diversidad de técnicas de rutina y bien conocidas, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (anteriormente).

En sistemas de expresión recombinante en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida hacia el interior del lumen del retículo endoplásmico, hacia el espacio periplásmico o hacia el entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Más preferiblemente, se emplea para la purificación una cromatografía de afinidad por iones metálicos (IMAC). Pueden emplearse técnicas bien conocidas para el replegamiento de proteínas para regenerar una conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, el aislamiento y/o la purificación.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o de una bacteria viva recombinante. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo conducirán a la expresión in vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunes. Son virus y bacterias usados con este fin, por ejemplo: poxvirus (por ejemplo, virus vaccinia, de la viruela aviar y de la viruela del canario), alfavirus (virus Sindbis, virus del bosque Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus de la varicela zóster, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos o atenuarse de diversas formas para obtener vacunas vivas. Dichas vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, pronóstico, serotipado y mutación

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB103 de la invención como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB103 en un eucariota, particularmente un mamífero y, especialmente, un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnosis para el diagnóstico de enfermedad, la determinación de la fase de enfermedad o la respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Pueden detectarse a nivel de ácidos nucleicos o de aminoácidos eucariotas, particularmente mamíferos y, especialmente, seres humanos, particularmente los infectados o sospechosos de estar infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB103, mediante una diversidad de técnicas bien conocidas, así como por procedimientos proporcionados en la presente memoria.

Pueden obtenerse polipéptidos y polinucleótidos para el pronóstico, el diagnóstico u otros análisis a partir de materiales corporales de un individuo supuestamente infectado y/o infectado. Pueden usarse directamente para la detección polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, o pueden amplificarse enzimáticamente mediante el uso de PCR o de cualquier otra técnica de amplificación anterior al análisis. También puede usarse ARN, en particular ARNm, ADNc y ADN genómico de la misma forma. Usando la amplificación, puede realizarse la caracterización de la especie y de la cepa de organismo infeccioso o residente presente en un individuo mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Pueden detectarse deleciones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada de un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Pueden identificarse mutaciones puntuales por hibridación de un ADN amplificado con secuencias polinucleotídicas de BASB103 marcadas. Las secuencias perfectamente o significativamente emparejadas pueden distinguirse de dúplex emparejados de forma imperfecta o más significativamente erróneamente emparejados mediante la digestión con ADNasa o ARNasa, para ADN o ARN, respectivamente, o mediante la detección de diferencias en las temperaturas de fusión o en la cinética de renaturalización. También pueden detectarse diferencias en la secuencia polinucleotídica por alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótidos en geles en comparación con una secuencia de referencia. Esto puede llevarse a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. También pueden detectarse diferencias polinucleotídicas por secuenciación directa de ADN o ARN. Véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230: 1242 (1985). También pueden ponerse de manifiesto cambios de secuencia en localizaciones específicas mediante ensayos de protección frente a nucleasas, tales como ARNasa, ensayo de protección frente a V I y S I o un procedimiento de escisión química. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985).

En otra realización, puede construirse una serie de sondas oligonucleotídicas que comprenden la secuencia de nucleótidos de BASB103 o fragmentos de la misma para realizar una exploración eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Se conocen bien y tienen aplicabilidad general procedimientos de la tecnología de series y pueden usarse para abordar una diversidad de cuestiones en genética molecular, incluyendo expresión génica, ligamiento genético y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science, 274: 610 (1996)).

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma;

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c) un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la SEC ID Nº: 2 o un fragmento del mismo; o

(d) un anticuerpo contra un polipéptido de la presente invención, preferiblemente contra el polipéptido de la SEC ID Nº: 2.

Se entenderá que en cualquier kit de este tipo, (a), (b), (c) o (d) pueden comprender un componente importante. Dicho kit será útil en el diagnóstico de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, entre otros.

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente, la SEC ID Nº: 1, que esté asociada con una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede sumarse a, o definir un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico de una evolución de una enfermedad, una determinación de una fase de enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, que es el resultado de una expresión inferior, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Pueden detectarse organismos, particularmente organismos infecciosos, que lleven mutaciones en dicho polinucleótido a nivel de polinucleótido mediante una diversidad de técnicas, tales como las que se describen en otra parte de la presente memoria.

También pueden detectarse células de un organismo que lleve mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención a nivel de polinucleótido o de polipéptido mediante una diversidad de técnicas para permitir el serotipado, por ejemplo. Por ejemplo, puede usarse una RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente el uso de RT-PCR junto con sistemas de detección automáticos, tales como, por ejemplo, GeneScan. También puede usarse ARN, ADNc o ADN genómico con el mismo propósito, una PCR. Como un ejemplo, pueden usarse cebadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB103 para identificar y analizar mutaciones.

La invención proporciona además cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o del extremo 3'. Estos cebadores pueden usarse, entre otras cosas, para amplificar ADN y/o ARN de BASB103 aislado a partir de una muestra procedente de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores pueden usarse para amplificar un polinucleótido aislado a partir de un individuo infectado, de tal modo que el polinucleótido puede someterse después a diversas técnicas para la elucidación de la secuencia polinucleotídica. De este modo, pueden detectarse mutaciones en la secuencia polinucleotídica y usarse para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su fase o evolución, o para serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención proporciona además un procedimiento para diagnosticar enfermedades, preferiblemente infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones causadas por Moraxella catarrhalis, que comprende determinar a partir de una muestra procedente de un individuo, tal como un material corporal, un nivel aumentado de expresión de un polinucleótido que tiene una secuencia de la SEC ID Nº: 1. La expresión aumentada o disminuida de un polinucleótido de BASB103 puede medirse usando uno cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección frente a ARNasa, transferencia de Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, puede usarse un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la sobreexpresión de polipéptido BASB 103 en comparación con muestras de tejido normal de control para detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Son bien conocidos por los especialistas en la técnica procedimientos de ensayo que pueden usarse para determinar niveles de un polipéptido BASB103 en una muestra procedente de un huésped, tal como un material corporal. Dichos procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western, ensayos sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos de ELISA.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como componentes de series de polinucleótidos, preferiblemente series o rejillas de alta densidad. Estas series de alta densidad son particularmente útiles para fines de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, pueden usarse un conjunto de puntos, comprendiendo cada uno un gen diferente y comprendiendo además un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, para sondar, tal como usando la hibridación o la amplificación de ácidos nucleicos usando sondas obtenidas o procedentes de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia polinucleotídica en particular o secuencia relacionada en un individuo. Dicha presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser útil en el diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad o de la evolución de una enfermedad. Se prefiere una rejilla que comprende un número de variantes de la secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº: 1. También se prefiere una rejilla que comprende un número de variantes de una secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención, o variantes de los mismos, o células que los expresan pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para dichos polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos de BASB103.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención mediante la administración de los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o de fragmentos que llevan epítopos de cualquiera de ellos o de ambos, análogos de cualquiera de ellos o de ambos, o células que expresan cualquiera de ellos o ambos, a un animal, preferiblemente no humano, usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales puede usarse cualquier procedimiento conocido en la técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como las de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., págs. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss; Inc. (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla contra polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Como alternativa, puede utilizarse la tecnología de presentación de fagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de humanos seleccionados por poseer anti-BASB103 o de genotecas sin tratamiento previo (McCafferty y col., (1990), Nature 348, 552-554; Marks y col., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos también puede mejorarse, por ejemplo, mediante cambio de cadena (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o identificar clones que expresen los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Por lo tanto, entre otros, pueden emplearse anticuerpos contra polipéptido BASB103 o polinucleótido de BASB103 para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes polipeptídicas incluyen variantes antigénicamente, epitópicamente o inmunológicamente equivalentes de un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo, o la variante del mismo, se modifica para hacerlo menos inmunógeno en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es un ser humano el anticuerpo puede, más preferiblemente, "humanizarse", donde la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de un hibridoma se ha transplantado en un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, como se describe en Jones y col. (1986), Nature 321, 522-525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas y Agonistas - Ensayos y Moléculas

También pueden usarse polipéptidos y polinucleótidos de la invención para evaluar la unión de sustratos y ligandos moleculares pequeños en, por ejemplo, células, preparaciones sin células, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1 (2): Capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que lleven el polipéptido o polinucleótido, o a una proteína de fusión del polipéptido por medio de un marcador directa o indirectamente asociado con el compuesto candidato. Como alternativa, el procedimiento de selección puede implicar la competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden evaluar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de la activación se ensayan generalmente en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación por el agonista de la presencia del compuesto candidato. Pueden emplearse polipéptidos constitutivamente activos y/o polipéptidos y polinucleótidos constitutivamente expresados en procedimientos de selección para agonistas inversos o inhibidores, en ausencia de un agonista o inhibidor, mediante la evaluación de si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, según sea el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contenga un polipéptido o polinucleótido de la presente invención para formar una mezcla, medir la actividad de polipéptido y/o polinucleótido de BASB103 en la mezcla y comparar la actividad de polipéptido y/o polinucleótido de BASB103 de la mezcla con un patrón. También pueden usarse proteínas de fusión, tales como las preparadas a partir de una porción Fc y BASB103, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, para ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos filogenéticamente y/o funcionalmente relacionados (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8: 52-58 (1995); y K. Johanson y col., J Biol Chem, 270 (16): 9459-9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen y/o interaccionan con un polipéptido de la presente invención también pueden usarse para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, puede construirse un ensayo de ELISA para medir niveles de polipéptido secretado o asociado a células usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Éste puede usarse para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también denominados antagonistas o agonistas, respectivamente) a partir de células o tejidos convenientemente manipulados.

La invención también proporciona un procedimiento de selección de compuestos para identificar los que potencian (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de polipéptidos o polinucleótidos de BASB 103, particularmente los compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar para agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción sintética, un compartimento celular, tal como una membrana, envoltura celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de los mismos que comprenda polipéptido BASB103 y un sustrato o ligando marcado de dicho polipéptido se incuban en ausencia o presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASB103. La capacidad de la molécula candidata agonista o antagonista del polipéptido BASB103 se refleja en una unión disminuida del ligando marcado o en una producción disminuida de producto a partir de dicho sustrato. Es más probable que las moléculas que se unen de forma gratuita, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB103, sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, según el caso, aumentan el índice de producción de producto a partir del sustrato, aumentan la transducción de señal o aumentan la actividad de los canales químicos son agonistas. La detección del índice o nivel de, según el caso, producción de producto a partir de sustrato, transducción de señal o actividad de los canales químicos puede mejorarse usando un sistema indicador. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen, pero sin limitación, colorimétricos, sustrato marcado convertido en producto, un gen indicador que es sensible a cambios en la actividad de polinucleótido o polipéptido BASB103 y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas de BASB103 es un ensayo competitivo que combina BASB103 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB103, moléculas de unión a BASB103 recombinante, sustratos o ligandos naturales, o sustratos o ligandos miméticos, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. BASB103 puede marcarse, tal como mediante radiactividad o mediante un compuesto colorimétrico, de tal modo que el número de moléculas de BASB103 unidas a una molécula de unión o convertidas en producto puede determinarse con precisión para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otras, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención e inhiben o suprimen de este modo su actividad o expresión. También pueden ser antagonistas potenciales moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo estrechamente relacionado que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir las actividades inducidas por BASB103, impidiendo de este modo la acción o la expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos de BASB103 evitando la unión de polipéptidos y/o polinucleótidos de BASB103.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido, impidiendo de este modo la unión a moléculas de unión celulares, de tal modo que se impide la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitación, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas de tipo peptídico. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase, Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB103.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles obtenidas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como una inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de una IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización en particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente por incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con el factor de coagulación sanguínea Xa. Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética y al uso de las mismas para la selección de fármacos, el diagnóstico y la terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de la tecnología de proteínas de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO94/29458 y WO94/22914.

Cada una de las secuencias polinucleotídicas que se proporcionan en la presente memoria puede usarse en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras la expresión, puede usarse como una diana para la selección de fármacos antibacterianos. Además, pueden usarse las secuencias polinucleotídicas que codifican las regiones amino terminales de la proteína codificada o de Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del ARNm respectivo para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificante de interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un huésped eucariota, preferiblemente un mamífero, responsable de las secuelas de la infección. En particular, las moléculas de la invención pueden usarse: en la prevención de la adhesión de bacterias, en particular bacterias gram positivas y/o gram negativas, a proteínas de la matriz extracelular de eucariotas, preferiblemente mamíferos, en dispositivos intravasculares o a proteínas de la matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de la matriz extracelular de eucariotas, preferiblemente mamíferos, y proteínas BASB103 bacterianas que median las lesiones tisulares y/o; para bloquear la evolución normal de la patogénesis en infecciones iniciadas de otra forma distinta a por la implantación de dispositivos intravasculares o por otras técnicas quirúrgicas.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención se proporcionan agonistas y antagonistas de BASB103, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención pueden emplearse, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimótopos del polipéptido de la invención. Un mimótopo es una secuencia peptídica suficientemente similar al péptido nativo (secuencialmente o estructuralmente) que es capaz de ser reconocida por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o que es capaz de generar anticuerpos que reconozcan el péptido nativo cuando esté acoplado a un transportador adecuado.

Pueden diseñarse mimótopos peptídicos para un objetivo en particular mediante la adición, deleción o sustitución de los aminoácidos elegidos. Por lo tanto, los péptidos pueden modificarse con el fin de facilitar la conjugación con una proteína transportadora. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además, puede ser deseable para péptidos conjugados con una proteína transportadora incluir un extremo terminal hidrófobo distal del extremo terminal conjugado del péptido, de tal modo que el extremo libre no conjugado del péptido permanezca asociado con la superficie de la proteína transportadora. Presentando de este modo el péptido en la conformación que más se parezca a la del péptido como se encuentra en el contexto de la molécula nativa completa. Por ejemplo, los péptidos pueden modificarse para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-terminal. Como alternativa, puede realizarse la adición o sustitución de una forma D-esteroisomérica de uno o más de los aminoácidos para generar un derivado beneficioso, por ejemplo, para mejorar la estabilidad del péptido.

Como alternativa, pueden identificarse mimótopos peptídicos usando anticuerpos que sean capaces por sí mismos de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como la tecnología de presentación de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias peptídicas que mimetizan la estructura de los péptidos nativos y, por lo tanto, son capaces de unirse a anticuerpos anti-péptidos nativos, pero pueden no compartir necesariamente por sí mismas una homología de secuencia significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente en seres humanos, que comprende inocular al individuo con polinucleótido y/o polipéptido BASB103, o un fragmento o variante del mismo adecuado para producir una respuesta inmune de anticuerpos y/o células T para proteger a dicho individuo de una infección, particularmente una infección bacteriana y, más particularmente, una infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan procedimientos mediante los que dicha respuesta inmunológica ralentiza la replicación bacteriana. Otro aspecto más de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo que comprende administrar a dicho individuo un vector de ácido nucleico, secuencia o ribozima para dirigir la expresión de un polinucleótido y/o polipéptido BASB103, o de un fragmento o una variante del mismo, para expresar un polinucleótido y/o polipéptido BASB 103, o un fragmento o una variante del mismo, in vivo para inducir un respuesta inmunológica, tal como, para producir una respuesta inmune de anticuerpos y/o células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de citocinas o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferiblemente a un ser humano, de una enfermedad, esté ya o no establecida esa enfermedad en el interior del individuo. Un ejemplo de administración del gen es introduciéndolo por aceleración en el interior de las células deseadas como un recubrimiento sobre partículas o de otra forma. Dicho vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo ADN-proteína o un complejo ARN-proteína.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, capaz de tener inducida en su interior una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en dicho individuo contra un polinucleótido de BASB103 y/o un polipéptido codificado a partir del mismo, en la que la composición comprende un polinucleótido de BASB103 recombinante y/o un polipéptido codificado a partir del mismo y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido de BASB103, polipéptido codificado a partir del mismo u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéuticamente o profilácticamente y puede adoptar la forma de una inmunidad por anticuerpos y/o una inmunidad celular, tal como la inmunidad celular que surge de CTL o células T CD4+.

Puede fusionarse un polipéptido BASB103 o un fragmento del mismo con una co-proteína o resto químico que puede o no producir por sí mismo anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas y, preferiblemente, propiedades protectoras. Una proteína recombinante fusionada de este modo comprende, preferiblemente, además una co-proteína antigénica, tal como lipoproteína D de Haemophilus influenzae, Glutation-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa o cualquier otra co-proteína relativamente grande que solubilice la proteína y facilite la producción y la purificación de la misma. Además, la co-proteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La co-proteína puede estar unida al extremo terminal amino o carboxilo de la primera proteína.

Mediante esta invención se proporcionan composiciones, particularmente composiciones vacunales, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como las descritas en Sato, Y. y col. Science 273: 352 (1996).

Además, mediante esta invención se proporcionan procedimientos que usan el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, que se ha demostrado que codifican regiones no variables de proteínas de la superficie celular bacteriana en construcciones polinucleotídicas usadas en dichos experimentos de inmunización genética en modelos animales de infección con Moraxella catarrhalis. Dichos experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopos proteicos capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se piensa que este enfoque permitirá la posterior preparación de anticuerpos monoclonales de un valor particular, procedentes del órgano necesario del animal resistente o que elimina la infección con éxito, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de una infección bacteriana, particularmente de una infección por Moraxella catarrhalis en mamíferos, particularmente en seres humanos.

La invención también incluye una formulación vacunal que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunógeno de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puesto que los polipéptidos y polinucleótidos pueden degradarse en el estómago, cada uno se administra preferiblemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, una administración que sea subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para una administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hagan a la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados que pueden conservarse en una condición seca por congelación que sólo requiere la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso.

La formulación vacunal de la invención también puede incluir sistemas adyuvantes para mejorar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente, el sistema adyuvante provoca de forma preferencial un tipo de respuesta TH1.

Una respuesta inmune puede caracterizarse, en líneas generales, en dos categorías extremas, siendo una respuesta inmune humoral o mediada por células (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos de protección efectores de anticuerpos y celulares, respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células) y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes extremas de tipo TH1 pueden caracterizarse por la generación de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y restringidos por haplotipo y respuestas de células asesinas naturales. En ratones, las respuestas de tipo TH1 se caracterizan con frecuencia por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en humanos éstas se corresponden con anticuerpos de tipo IgGI. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de un amplio intervalo de isotipos de inmunoglobulina, incluyendo en ratones IgGI, IgA e
IgM.

Puede considerarse que la fuerza motora detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citocinas. Altos niveles de citocinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células contra el antígeno dado, mientras que altos niveles de citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales contra el antígeno.

La distinción entre respuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo sustentará una respuesta inmune que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citocinas por lo que respecta a las descritas en los clones de células T CD4 positivas murinas por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, págs. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 se asocian con la producción de las citocinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas asociadas con frecuencia directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no se producen por células T, tales como IL-12. Por el contrario, las respuestas de tipo TH2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes vacunales son particularmente convenientes para la estimulación de respuestas de citocinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluye la medición directa de la producción de citocinas de TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de la reestimulación con antígeno y/o la medición de la proporción IgGI:IgG2a de respuestas de anticuerpos específicos de antígeno.

Por lo tanto, un adyuvante de tipo TH1 es uno que estimula de forma preferencial poblaciones de células T aisladas para producir altos niveles de citocinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con antígeno in vitro y promueve el desarrollo tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuestas de inmunoglobulinas específicas de antígeno asociadas con un isotipo de tipo TH1.

Se describen adyuvantes que son capaces de una estimulación preferencial de la respuesta de células TH1 en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209.

Uno de dichos adyuvantes es monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL). Se conoce del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y se fabrica por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida de monofosforil lípido A 3-des-O-acilado se describe en la Patente Europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son lo bastante pequeñas para esterilizarse por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros (Patente Europea número 0 689 454). El 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug-100 \mug, preferiblemente de 25 \mug-50 \mug por dosis, en la que el antígeno estará presente típicamente en un intervalo de 2-50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC obtenida de la corteza de Quillaja saponaria Molina. Opcionalmente, éste puede mezclarse con monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción del QS21 se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.057.540.

Se han descrito anteriormente (documento WO 96/33739) formulaciones de adyuvantes no reactógenos que contienen QS21. Dichas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han demostrado ser adyuvantes que estimulan TH1 con éxito cuando se formulan junto con un antígeno.

Los adyuvantes adicionales que son estimuladores preferenciales de la respuesta de células TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias CpG no metiladas, como se describen en el documento WO 96/02555.

También se contemplan combinaciones de diferentes adyuvantes que estimulan TH1, tales como los mencionados anteriormente en la presente memoria, como que proporcionan un adyuvante que es un estimulador preferencial de la respuesta de células TH1. Por ejemplo, QS21 puede formularse junto con 3D-MPL. La proporción de QS21:3D-MPL será típicamente del orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente de 1:5 a 5:1 y, con frecuencia, básicamente de 1:1. El intervalo preferido para una sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.

Preferiblemente también está presente un vehículo en la composición vacunal de acuerdo con la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos en la composición vacunal de acuerdo con la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en dicha emulsión. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente, para la administración en seres humanos, QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal como 10 \mug-100 \mug, preferiblemente 10 \mug-50 \mug por dosis. Típicamente, el aceite en agua comprenderá del 2 al 10% de escualeno, del 2 al 10% de alfa-tocoferol y del 0,3 al 3% de tween 80. Preferiblemente, la proporción de escualeno:alfa-tocoferol es igual a o inferior a 1, ya que esto proporciona una emulsión más estable. También puede estar presente span 85 a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizante.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas contienen preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo, escualeno o escualeno, un emulsionante, por ejemplo, Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La presente invención también proporciona una composición vacunal polivalente que comprende una formulación vacunal de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y afecciones relacionadas. Dicha composición vacunal polivalente puede incluir un adyuvante inductor de TH-1, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos de BASB103 debe entenderse que ésta abarca fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos de origen natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones que no afecten sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido de BASB103 y/o un polipéptido BASB103 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o polipéptidos analizados en la presente memoria, o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse junto con un vehículo o vehículos estériles o no estériles para el uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Dichas composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo de medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adaptarse al modo de administración. La invención se refiere además a envases y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente.

Pueden emplearse polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier forma eficaz conveniente incluyendo, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido o compuesto molecular pequeño agonista o antagonista junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos incluyen, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La invención se refiere además a envases y kit farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente. Pueden emplearse polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo, por una vía sistémica o una vía oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente por inyección intravenosa. Pueden usarse otras vías de inyección, tales como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Los medios alternativos para la administración sistémica incluyen la administración transmucosa y transdérmica usando penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o encapsulada, también es posible la administración por vía oral. La administración de estos compuestos también puede ser por vía tópica y/o localizada, en la forma de pomadas balsámicas, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos y, particularmente, a seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diario del agente activo sea de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente de aproximadamente 1 mg/kg. En cualquier caso el médico determinará la dosificación real que será más adecuada para un individuo y variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso medio. Por supuesto, puede haber casos individuales que merezcan intervalos de dosificación superiores o inferiores y dichos casos están dentro del alcance de esta invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la selección de péptido, de la vía de administración, de la naturaleza de la formulación, de la naturaleza de la afección del sujeto y del juicio del médico que lo atienda. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg de sujeto.

Una composición vacunal está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmune. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación es de 0,5-5 microgramos/kg de antígeno y dicha dosis se administra preferiblemente de 1 a 3 veces y con un intervalo de 1 a 3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observarán efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención que impedirían su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, deben esperarse amplias variaciones en la dosificación requerida en vista de la diversidad de compuestos disponibles y de las diferentes eficacias de diversas vías de administración. Por ejemplo, se espera que la administración por vía oral requiera dosificaciones mayores que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones de estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas convencionales para la optimización, como es bien sabido en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas constituyen un recurso de información valioso con el que determinar sus estructuras bidimensionales y tridimensionales, así como para identificar secuencias adicionales de una homología similar. Estos enfoques se favorecen más fácilmente por almacenamiento de la secuencia en un medio legible por ordenador y, después, uso de los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para realizar una búsqueda en una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tal como el paquete de programas GCG.

También se proporcionan por la invención procedimientos para el análisis de secuencias o cadenas características, particularmente secuencias genéticas o secuencias proteicas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencia, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de la estructura de ADN, ARN y proteínas, ensamblaje de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de la fase de lectura abierta, lectura automática de bases de ácido nucleico, análisis de uso de codones, recorte de bases de ácido nucleico y análisis picos de cromatogramas de secuenciación.

Se proporciona un procedimiento basado en un ordenador para realizar una identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia polinucleotídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar la homología.

También se proporciona un procedimiento basado en un ordenador para realizar una identificación de homología, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: proporcionar una primera secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia polipeptídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar la homología.

Definiciones

La "identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, según el caso, determinada por comparación de las secuencias. En la técnica, la "identidad" también se refiere al grado de relación de secuencia entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según el caso, determinado por el emparejamiento entre cadenas de dichas secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo, pero sin limitación, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos para determinar la identidad están diseñados para dar el emparejamiento más largo entre las secuencias evaluadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Los procedimientos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S. F. y col., J Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente del NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col.,NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. y col., J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). También puede usarse el bien conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992)

Penalización por huecos: 8

Penalización por longitud de huecos: 2

Un programa útil con estos parámetros está disponible públicamente como el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (sin penalización por huecos en los extremos).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: emparejamientos = +10, emparejamiento erróneo = 0

Penalización por huecos: 50

Penalización por longitud de huecos: 3

Disponible como: el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para comparaciones de ácidos nucleicos.

Un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, según sea el caso, se proporciona en (1) y (2) a continuación.

(1) Las realizaciones de polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con la secuencia de referencia de la SEC ID Nº: 1, en el que dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº: 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de modificaciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia, en la que dichas modificaciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de nucleótidos y en la que dichas modificaciones pueden producirse en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier posición entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de modificaciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEC ID Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y, después, restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID Nº: 1, o:

1

en la que n_{n} es el número de modificaciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEC ID Nº: 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto de x_{n} e y que no sea un número entero se redondea al número entero más próximo antes de restárselo a x_{n}. Las modificaciones de una secuencia polinucleotídica que codifica el polinucleótido de la SEC ID Nº: 2 pueden generar mutaciones sin sentido, con sentido erróneo o cambio de fase de lectura en su secuencia codificante y, por lo tanto, alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas modificaciones.

A modo de ejemplo, una secuencia polinucleotídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº: 1, es decir, puede tener una identidad del 100% o puede incluir hasta un cierto número entero de modificaciones de ácidos nucleicos en comparación con la secuencia de referencia, de tal modo que el porcentaje de identidad sea menor del 100% de identidad. Dichas modificaciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de ácido nucleicos, y en el que dichas modificaciones pueden producirse en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia polinucleotídica de referencia o en cualquier posición entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de modificaciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y, después, restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1, o:

100

en la que n_{n} es el número de modificaciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc. \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto de x_{n} e y que no sea un número entero se redondea al número entero más próximo antes de restárselo a x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptidos incluyen además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con una secuencia polipeptídica de referencia de la SEC ID Nº: 2, en el que dicha secuencia polipeptídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº: 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de modificaciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, en la que dichas modificaciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, y en la que dichas modificaciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier posición entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de modificaciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y, después, restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2, o:

2

en la que n_{a} es el número de modificaciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto de x_{a} e y que no sea un número entero se redondea al número entero más próximo antes de restárselo a x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia polipeptídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº: 2, es decir, puede tener una identidad del 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de modificaciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, de tal modo que el porcentaje de identidad sea menor del 100% de identidad. Dichas modificaciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, y en el que dichas modificaciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier posición entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de modificaciones de aminoácidos para un % de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y, después, restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2, o:

3

en la que n_{a} es el número de modificaciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc., y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto de x_{a} e y que no sea un número entero se redondea al número entero más próximo antes de restárselo a x_{a}.

El término "individuo(s)", cuando se usa en la presente memoria con respecto a un organismo, se refiere a un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitación, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate y un ser humano.

El término "aislado" significa alterado "por la mano del hombre" desde su estado natural, es decir, si aparece en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes en su estado natural está "aislado", según se emplea el término en la presente memoria. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o por cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" aún cuando todavía está presente en dicho organismo, pudiendo ser el organismo vivo o no vivo.

El término "polinucleótido(s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser un ARN o ADN no modificado o un ARN o ADN modificado, incluyendo regiones de cadena doble y sencilla.

El término "variante" se refiere a un polinucleótido polipéptido que se diferencia de un polinucleótido o polipéptido de referencia pero que conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido se diferencia en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se analiza a continuación. Una variante típica de un polipéptido se diferencia en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de tal modo que las secuencias del polipéptido de referencia y de la variante son muy similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferenciarse en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones o deleciones en cualquier combinación. Un resto aminoacídico sustituido o insertado puede ser o no uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conozca que aparezca naturalmente. Pueden generarse variantes de polinucleótidos y polipéptidos de origen no natural mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis
directa.

El término "enfermedad(es)" se refiere a cualquier enfermedad causada por o relacionada con una infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y niños, neumonía en personas mayores, sinusitis, infecciones intrahospitalarias y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de líquido en el oído medio, lesión del nervio auditivo, aprendizaje del habla retrasado, infección del tracto respiratorio superior e inflamación del oído medio.

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Ejemplos

Los ejemplos a continuación se llevan a cabo usando técnicas convencionales que son bien conocidas y de rutina para los especialistas en la técnica, excepto donde se describa en detalle otra cosa. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Secuenciación de ADN de los genes BASB103, BASB104, BASB105, BASB106, BASB107 y BASB108 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis

El gen BASB103 de la SEC ID Nº: 1 es de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis. La traducción de las secuencias polinucleotídicas de BASB103 se muestra en la SEC ID Nº: 2.

Materiales depositados

Un depósito que contiene una cepa Catlin de Moraxella catarrhalis se ha depositado con la Colección Americana de Cultivos Tipo (en la presente memoria "ATCC") el 21 de junio de 1997, y se le ha asignado el número de depósito 43617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una genoteca de un inserto de 1,5-2,9 kb seca por congelación construida a partir de un aislado de M. catarrhalis obtenido de un aspirado transtraqueal de un minero de carbón con bronquitis crónica. El depósito se describió en Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506-508 (1982).

La cepa de Moraxella catarrhalis depositada se denomina en la presente memoria como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen de BASB 103, BASB 104, BASB 105, BASB 106, BASB 107 y BASB 108 de longitud completa.

Un depósito del vector pMC-D15 que consiste en ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 se ha depositado con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) el 12 de febrero de 1999, y se le asignado el número depósito 207105.

La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa o clon depositado, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado por los mismos, son determinantes en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias en la presente memoria.

El depósito de las cepas depositadas se ha realizado en los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los fines del procedimiento en materia de patentes. Las cepas depositadas se liberarán al público de forma irrevocable y sin restricción o condición tras la expedición de una patente. Las cepas depositadas se proporcionan simplemente para comodidad de los especialistas en la técnica y no son una admisión de que se requiere un depósito para la reproducibilidad, como el que se requiere según
35 U.S.C. \NAK 112.

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Información de Secuencia Secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de BASB103, BASB104, BASB105, BASB106, BASB107 y BASB108

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SEC ID Nº: 1

Secuencia polinucleotídica de BASB103 de Moraxella calarrhalis de la cepa ATCC43617

4

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SEC ID Nº: 2

Secuencia polipeptídica de BASB103 de Moraxella catarrhalis deducida a partir del polinucleótido de la SEC ID Nº:1

5

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SEC ID Nº: 3

Secuencia polinucleotídica de BASB104 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

6

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SEC ID Nº: 4

Secuencia polipeptídica de BASB104 de Morarella catarrhalis deducida a partir del polinucleótido de la SEC ID Nº: 3

7

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SEC ID Nº: 5

Secuencia polinucleotídica de BASB105 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

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8

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SEC ID Nº: 6

Secuencia polipeptídica de BASB105 de Moraxella catarrhalis deducida a partir del polinucleótido de la SEC ID Nº:5

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9

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SEC ID Nº: 7

Secuencia polinucleotídica deBASB106 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

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10

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SEC ID Nº: 8

Secuencia polipeptídica de BASB106 de Moraxella catarrhalis deducida a partir del polinucleótido de la SEC ID Nº: 7

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11

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SEC ID Nº: 9

Secuencia polinucleotídica de BASB107 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

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12

13

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SEC ID Nº:10

Secuencia polipeptídica de BASB107 de Moraxella catarrhalis deducida a partir del polinucleótido de la SEC ID Nº: 9

14

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SEC ID Nº: 11

Secuencia polinucleotídica de BASB108 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC43617

15

150

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SEC ID Nº: 12

Secuencia polipeptídica de BASB108 de Moraxella catarrhalis deducida a partir del polinucleótido de la SEC ID Nº: 11

16

<110> SmithKline Beecham Biologicals S. A.

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<120> Nuevos Compuestos

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<130> BM45388

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<160> 12

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 759

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 1

17

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<210> 2

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<211> 252

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 2

18

180

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<210> 3

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<211> 1953

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<212> ADN

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<213> Moraxella cacarrhalis

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<400> 3

19

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<210> 4

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<211> 650

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<212> PRT

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<213> Moraxella cacarrhalis

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<400> 4

20

21

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<210> 5

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<211> 1218

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 5

22

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<210> 6

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<211> 405

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 6

23

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<210> 7

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<211> 1233

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

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<400> 7

24

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<210> 8

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<211> 410

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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25

250

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<210> 9

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<211> 2457

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 9

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26

260

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<210> 10

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<211> 818

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 10

27

28

29

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<210> 11

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<211> 2742

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<212> ADN

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<213> Moraxella cacarrhalis

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<400> 11

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30

300

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<210> 12

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<211> 913

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 12

31

32

33

Claims (25)

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

4. Un polipéptido aislado de la SEC ID Nº: 2.

5. Un fragmento inmunógeno del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho fragmento inmunógeno, si es necesario acoplado a un transportador, es capaz de provocar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, a condición de que dicho fragmento no tenga la secuencia nvvtntgatv vdgtrtifst lvkpaawaa v.

6. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido o un fragmento inmunógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, a condición de que dicha proteína de fusión no tenga la secuencia nvvtntgatv vdgtrtifst lvkpaawaa v.

7. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID Nº: 2; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 85% con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº: 2 a lo largo de la región codificante completa; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la de la SEC ID Nº: 1 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID Nº: 1; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

10. El polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la identidad es de al menos el 95% con la SEC ID Nº: 1.

11. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de la SEC ID Nº: 1.

13. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 2 que puede obtenerse por exploración de una genoteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1.

14. Un vector de expresión, sistema de expresión o un microorganismo vivo recombinante que comprende un polinucleótido recombinante aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13.

15. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 14 o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula huésped que expresa un polipéptido aislado, un fragmento inmunógeno o una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

16. Un procedimiento para producir un polipéptido, un fragmento inmunógeno o una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprender cultivar una célula huésped de la reivindicación 15 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido, dicho fragmento inmunógeno o dicha proteína de fusión y recuperar el polipéptido, el fragmento inmunógeno o la proteína de fusión a partir del medio de cultivo.

17. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, que comprende transformar una célula huésped con el vector de expresión de la reivindicación 14 y cultivar dicha célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

18. Una composición vacunal que comprende una cantidad eficaz del polipéptido o del fragmento inmunógeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Una composición vacunal que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. La composición vacunal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

21. Un anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido o fragmento inmunógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

22. Un procedimiento de diagnosticar una infección por Moraxella catarrhalis, que comprende identificar un polipéptido o un fragmento inmunógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un anticuerpo de la reivindicación 21, presente en el interior de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener dicha infección.

23. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o un fragmento inmunógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para el uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

24. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 en la preparación de un medicamento para el uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

25. Una composición terapéutica útil en el tratamiento de seres humanos con una enfermedad por Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 21 y un vehículo farmacéutico aceptable.