ES2325311T3

ES2325311T3 - Compuestos novedosos.

Info

Publication number: ES2325311T3
Application number: ES01988727T
Authority: ES
Inventors: Joelle Thonnard
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2001-10-24
Publication date: 2009-09-01
Anticipated expiration: 2021-10-24
Also published as: EP1337554B1; AU2002218260A1; ATE432286T1; DE60138828D1; WO2002034772A3; WO2002034772A2; CA2426742A1; GB0025998D0; EP1337554A2; US20040059090A1

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 97% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10 en la longitud completa de dicha secuencia; y (b) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1

Description

Compuestos novedosos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polinucleótidos, (denominados en esta memoria descriptiva "polinucleótido(s) BASB210)" polipéptidos codificados por ellos (denominados en esta memoria descriptiva "BASB210" o "polipépti- do(s) BASB210"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Haemophilus influenzae es una bacteria Gram negativa no móvil. El hombre es su único huésped natural.

Los aislamientos de H. influenzae se clasifican de manera usual de acuerdo con su cápsula de polisacáridos. Se han identificado seis tipos diferentes capsulares denominados a a f. Los aislamientos que no se aglutinan con los antisueros inducidos contra uno de estos seis serotipos se clasifican como no tipificables, y no expresan una cápsula.

El tipo b de H. influenzae es claramente diferente de los otros tipos ya que es su causa principal de la meningitis bacteriana y enfermedades sistémicas. H. influenzae no tipificable (NTHi) se aíslan de la sangre de pacientes con enfermedad sistémica.

NTHi es una causa común de neumonía, exacerbación de bronquitis crónica, sinusitis y otitis media.

La otitis media es una enfermedad importante de la infancia tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. Más de 3,5 millones de casos se registran cada caso en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (1). Si se deja sin tratar, o se convierte en crónica, esta enfermedad puede conducir a pérdidas de audición que podrían ser temporal (en el caso de acumulación de fluidos en el oído medio) o permanente (si se daña el nervio auditivo). En bebés tales pérdidas de audición pueden ser responsables de retraso en el aprendizaje del habla.

Tres especies bacterianas se aíslan principalmente del oído medio de niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, NTHi y M. catarrhalis. Están presentes en el 60 a 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NHTi representan ambos aproximadamente el 30%, y M. catarrhalis aproximadamente 15% de los casos de otitis media (2). Otras bacterias se podrían aislar del oído medio (H. influenzae tipo B, S. pyogenes etc.) pero en mucho menor frecuencia (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior en un requisito previo absoluto para el desarrollo de una otitis; sin embargo también se requieren otros para conducir a la enfermedad (3 - 9). Éstos son importantes para desencadenar la migración de las bacterias en el oído medio a través de la trompa de Eustaquio, seguido del inicio de un proceso inflamatorio. Estos factores son actualmente desconocidos. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmune después de una infección viral, por ejemplo, podría provocar una incapacidad de controlar la colonización del tracto respiratorio (5). Una explicación alternativa es que la exposición a los factores ambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente serán susceptibles de desarrollar otitis media debido a la presencia sustancial de patógenos en el oído medio (2).

Se ha mostrado que diversas proteínas de H. influenzae están implicadas en la patogénesis o se ha mostrado que confieren protección tras la vacunación en modelos animales.

Se ha reseñado la adherencia de NTHi a las células epiteliales nasofaríngeas (10). Además de la fimbria y pili (11-15), se han identificado muchas adhesinas en NTHi. Entre ellos, dos proteínas de alto peso molecular expuestas de superficie denominadas HMW1 y HMW2 se ha mostrado que median la adhesión de NTHi a células epiteliales (16). Se ha identificado otra familia de proteínas de alto peso molecular en cepas de NTHi que carecen de las proteínas que pertenecen a la familia de HMW1/HMW2. La proteína Hia de 115 kDa de NTHi (17) es en gran medida similar a la adhesina Hsf expresada por las cepas de H. influenzae de tipo b (18). Otra proteína, la proteína Hap muestra similitud con las IgA1 serina proteasas y se ha mostrado que están implicadas tanto en la adhesión como en la entrada celular (19).

Se han identificado cinco proteínas de la membrana externa principales (OMP) y se han numerado.

Los estudios originales que usan cepas de H. influenzae de tipo b mostraron que los anticuerpos específicos para P1 y P2 protegían a las ratas infantes de la exposición posterior (20-21). P2 se encontró que era capaz de inducir anticuerpos bacterianos y opsónicos, que se dirigen contra las regiones variables presentes dentro de las estructuras de bucle expuestas de superficie de esta OMP integral (22-23). La lipoproteína P4 también podría inducir anticuerpos bacterianos (24).

P6 es una lipoproteína asociada a péptidoglicano conservado que completa hasta 1-5 % de la membrana externa (25). Más tarde se reconoció una lipoproteína de aproximadamente el mismo peso mol., llamada PCP (proteína de reacción cruzada P6) (26). Una mezcla de las lipoproteínas conservadas P4, P6 y PCP no revelaron protección según se midió en un modelo de otitis-media de chinchilla (27). P6 sola parece inducir la protección en el modelo de chinchilla (28). P5 tiene homología de secuencia con la OmpA de Escherichia coli (29-30). P5 parece experimentar una tendencia antigénica durante las infecciones persistentes con NTHi (31). Sin embargo, las regiones conservadas de esta proteína indujeron la protección en el modelo de chinchilla de otitis media.

En línea con las observaciones realizadas con gonococos y meningococos, NTHi expresa un receptor de transferrina humana dual compuesta por TbpA y TbpB cuando se hacen crecer en limitación de hierro. Ratas infantes protegidas con Anti-TbpB. (32). Los receptores de Hemoglobina/haptoglobina se han descrito para NTHi (33). También se ha identificado un receptor para Haem: Hemopexin (34). También está presente un receptor de lactoferrina en NTHi, pero no se ha caracterizado todavía (35).

Una OMP de 80kDa, el antígeno de superficie D 15, proporciona protección contra NTHi en un modelo de exposición de ratón. (36). Una lipoproteína de la membrana externa de 42kDa, LPD se conserva entre Haemophilus influenzae e induce anticuerpos bacterianos (37). Una OMP de 98kDa secundaria (38), se encontró que era un antígeno protector, esta OMP puede ser muy bien una de las OMP inducible por la limitación de Fe o adhesinas de alto peso molecular que se han caracterizado. H. influenzae produce actividad de IgAl-proteasa (39). Las IgA1-proteasas ofNTHi revelan un alto grado de variabilidad antigénica (40). Otra proteína de OMP ofNTHi, OMP26, de 26 kDa se ha mostrado que potencia la eliminación pulmonar en un modelo de rata (41). La proteína NTHi HtrA también se ha mostrado que es un antígeno protector. De hecho, esta proteína protegía a la Chinchilla contra otitis media y protegía a las ratas infantes contra la bacteremia de H. influenzae de tipo b (42).

Referencias antecedentes

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42. Loosmore, S.M. et al. (1998) Infect. Immun. 66: 899

La frecuencia de infección por ofNTHi ha aumentado notablemente en las pasadas pocas décadas. Este fenómeno ha creado una necesidad médica insatisfecha y demanda nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de antibióticos, y ensayos de diagnósticos para este organismo. La presente invención desea resolver dicha necesidad.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB210, en particular a los polipéptidos BASB210 y polinucleótidos BASB210, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, que incluyen prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otros. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnósticos para detectar enfermedades asociadas a infecciones microbianas y afecciones asociadas a tales infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de los polinucleótidos o polipéptidos BASB210.

Diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y ámbito de la invención descrita serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica de la lectura de las descripciones siguientes y de la lectura de otras partes de la presente divulgación.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB210 como se describe en más detalle más adelante. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB210 de H. influenzae no tipificable. El polipéptido BASB210 tiene algunas características de una proteína de membrana externa integral, y se podría de esta manera exponer a la superficie de la bacteria. El polipéptido BASB210 tiene una secuencia de señal localizada entre el resto 1 y el resto 21. La invención se refiere especialmente a polinucleótidos BASB210 y los polipéptidos codificados enumerados en la tabla A. Los polinucleótidos y los polipéptidos codificados tienen la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos establecida en la Tabla A.

Los polinucleótidos y polipéptidos codificados tienen la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12 como se describe en la Tabla A.

TABLA A

1

Se entiende que las secuencias indicadas en el Listado de secuencias más adelante como "ADN" representan una ejemplificación de una realización de la invención, ya que los expertos en la técnica reconocerán que tales secuencias se pueden emplear de manera útil en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Las secuencias de los polinucleótidos BASB210 se establecen en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11. El grupo 1 de SEQ se refiere en el presente documento a uno cualquiera de los polinucleótidos establecidos en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11.

Las secuencias de los polipéptidos codificados por BASB210 se establecen en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12. El grupo 2 de SEQ se refiere en el presente documento a uno cualquiera de los polipéptidos establecidos en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:

(a): una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10 en la longitud completa de dicha secuencia; y

(b): una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un fragmento inmunogénico del polipéptido de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12 en el que el fragmento inmunogénico tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12, en el que el fragmento inmunogénico, si es necesario cuando se acopla a un vehículo, es capaz de inducir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado que codifica el fragmento inmunogénico de la invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 97% de identidad con una Secuencia de ADN seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 1 y 3 o al menos 98% de identidad con la Secuencia de ADN de la SEQ ID NO: 5 o al menos 99% de identidad con una Secuencia de ADN seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 7 y 9 en la longitud completa de dicha secuencia; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,10 y 12 que se puede obtener mediante selección de una genoteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la correspondiente Secuencia de ADN de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 u 11 o un fragmento de las mismas.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un vector de expresión o un microorganismo vivo recombinante que comprende un polipéptido aislado de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una célula huésped que comprende el vector de expresión de la invención o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula huésped que expresa un polipéptido aislado o fragmento inmunogénico de la invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un sistema de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para producir un polipéptido o fragmento inmunogénico de la invención que comprende el cultivo de una célula huésped de la invención en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para expresar un polinucleótido de la invención que comprende la transformación de una célula huésped con el vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivo de dicha célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una vesícula de membrana exterior bacteriana aislada que comprende un polipéptido o fragmento inmunogénico de la invención que se puede obtener a partir de una célula huésped que comprende un vector de vector de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o fragmento inmunogénico que tiene una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo, que modula la expresión natural del polipéptido o fragmento inmunogénico.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido o fragmento inmunogénico de la invención, o una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende el fragmento inmunogénico de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un anticuerpo generado contra el polipéptido o fragmento inmunogénico de la invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento de diagnosis de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media, que comprende la identificación de un polipéptido o fragmento inmunogénico de la invención, o un anticuerpo que es inmunoespecífico para dicho polipéptido o fragmento inmunogénico, presente dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener tal infección.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o prevención de infección por neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o fragmento inmunogénico de la invención o un polipéptido que comprende el fragmento inmunogénico de la invención, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido de la invención en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición terapéutica que comprende al menos un anticuerpo contra el polipéptido que tiene secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, y un vehículo farmacéutico adecuado, para uso en el tratamiento de seres humanos con infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición terapéutica que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra el polipéptido de la invención y un vehículo farmacéutico adecuado, para uso en el tratamiento de seres humanos con infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, o un polipéptido que comprende el fragmento inmunogénico de la invención, para el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento inmunogénico de la invención o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, para el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

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Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de H. influenzae denominados en esta memoria descriptiva "BASB210" y "polipéptidos BASB21" así como variantes biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención además proporciona:

(a): un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 97 - 99% o identidad exacta, a la de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10;

(b): un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica a polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o que tiene al menos 97-99% o identidad exacta, con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de 9- SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 10.

Los polipéptidos BASB210 proporcionados en el grupo de la SEQ ID Nº 2 son los polipéptidos BASB210 de las cepas de H. influenzae no tipificable como se describen en la Tabla A.

La invención también proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB210, es decir, una porción contigua del polipéptido BASB210 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del grupo de la SEQ Nº 2; es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) es capaz de originar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido BASB210. Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB210 que carece de una secuencia guía N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido el fragmento inmunogénico BASB210 de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todos los dominios extracelulares de un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos 97 - 99% de identidad a la del grupo de la SEQ Nº 2 en la longitud entera de dicha secuencia.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma como parte pero no toda de cualquiera de la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB210, los fragmentos pueden estar "aislados" o comprendidos dentro de un polipéptido mayor de los que forman una parte o región, lo más preferiblemente como una única región continua en un único polipéptido mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de la SEQ Nº 2 o de sus variantes, tal como una serie continua de restos que incluye una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxilo terminal. También se prefieren las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula huésped. Se prefieren además fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones hélice alfa y formadoras de hélice alfa, regiones de hoja beta y formadoras de hoja beta, regiones de giro y formadoras de giro, regiones de espiral o formadoras de espiral, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones anfipáticas alfa, regiones anfipáticas beta, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie, regiones de unión a sustrato, y regiones de alto índice antigénico.

Además los fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ Nº 2, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o suprimidos de la secuencia de aminoácidos del grupo de la SEQ Nº 2.

Los fragmentos adicionales preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el Grupo de la SEQ 2 o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o suprimidos a partir de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el Grupo de la SEQ 2 (por ejemplo el polipéptido maduro que carece de la secuencia de señal de los restos 1 - 21).

Todavía además los fragmentos preferidos son los que comprenden un epítope de células B o T auxiliares, por ejemplo los fragmentos/péptidos descritos en el Ejemplo 13.

Los fragmentos del polipéptido de la invención se pueden emplear para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante la síntesis de péptidos; por lo tanto, estos fragmentos se pueden emplear como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Se prefieren particularmente las variantes en las que varios, 5 - 10, 1 - 5, 1 - 3, 1 - 2 ó 1 aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o añadidos en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura" o puede ser parte de una proteína mayor tal como un precursor o proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o guía, prosecuencias, secuencias que ayudan a la purificación tales como restos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción de recombinantes. Además, también se considera la adición de secuencias de polipéptidos exógenos o de colas de lípidos o de polinucleótidos para incrementar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas genéticamente que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como una inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, en la que tiene lugar fusión en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc se puede retirar simplemente mediante la incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor Xa de coagulación de sangre.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniaría genética, y al uso de los mismos para seleccionar fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de tecnología de proteína de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente internacional Números WO 94/29458 y WO 94/22914.

Las proteínas pueden estar químicamente conjugadas, o expresadas como proteínas de fusión recombinantes que permiten que se produzca un incremento de niveles en un sistema de expresión cuando se compara con la proteína no condensada. La pareja de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos de células T auxiliares (pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopes de células T auxiliares reconocidos por los seres humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (potenciador de expresión) a niveles mayores que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente la pareja de fusión será tanto una pareja de fusión inmunológica como una pareja potenciadora de expresión.

Las parejas de fusión incluyen la proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Otra pareja de fusión es la proteína conocida como Omp26 (documento WO 97/01638). Otra pareja de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente se usa la porción terminal C de la molécula. LytA se deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa LytA, (codificada por el gen LytA {Gene, 43 (1986) página 265 - 272}) una autolisina que específicamente degrada ciertos enlaces en la estructura central del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algún análogo de colina tal como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LytA de E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su extremo amino {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795 - 798}. Es posible usar la porción repetida de la molécula de LytA encontrada en el extremo terminal C que comienza en el resto 178, por ejemplo los restos 188 - 305.

La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir polipéptidos que varían entre los referentes en sustituciones conservadoras de aminoácidos, en las que un residuo se sustituye por otro con características similares. Tales sustituciones típicas son entre otras Ala, Val, Leu e Ile; entre otros Ser y Thr; entre otros los restos ácidos Asp y Glu; entre otros Asn y Gln; y entre otros los restos básicos Lys y Arg; o restos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos de origen natural aislados, polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos de manera sintética, o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos se comprenden bien en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención se derive de H. influenzae no tipificable, sin embargo, se puede obtener preferiblemente a partir de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención también se puede obtener, por ejemplo, a partir de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Es un objeto de la invención proporcionar polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB210, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido denominado en esta memoria descriptiva BASB210.

En una realización particularmente preferida de la invención los polinucleótidos comprenden una región que codifica los polipéptidos BASB210 que comprende las secuencias establecidas en el grupo de la SEQ Nº 1 que incluye un gen de longitud completa, o una variante del mismo.

Los polinucleótidos BASB210 proporcionados en el grupo de la SEQ Nº 1 son los polinucleótidos BASB210 a partir de cepas de H. influenzae no tipificable como se describe en la Tabla A.

Como un aspecto adicional de la invención se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB210, incluyendo, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB210 de H. influenzae no tipificable, incluyendo, por ejemplo, los ARN no procesados, los ARN de ribozima, los ARNm, los ADNc, los ADN genómicos, los ADN B- y Z. Realizaciones adicionales de la invención incluyen, polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles de los mismos, y las variantes de los mismos, y las composiciones que los comprenden.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, que incluyen al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB210 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida del grupo de la SEQ Nº 2 y polinucleótidos relacionados estrechamente con ellas y las variantes de las mismas.

En otra realización particularmente preferida de la invención se refiere al polipéptido BASB210 de H. influenzae no tipificable que comprende o está constituida por una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo de la SEQ Nº 2 o una variante de la misma.

Usando la información proporcionada en esta memoria descriptiva, tal como una secuencia de polinucleótidos establecida en el grupo de la SEQ Nº 1, un polinucleótido de la invención que codifica los polipéptidos BASB210 se puede obtener usando procedimientos de clonación y selección convencionales, tales como aquellos para clonar y secuenciar fragmentos de ADN cromosómico a partir de bacterias que usan células de la cepa 3224A de H. influenzae no tipificable como material de partida, seguido de la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, tal como una secuencia de polinucleótidos proporcionada en el grupo de la SEQ Nº 1, típicamente una genoteca de clones de ADN cromosómico de la cepa 322A de H. influenzae no tipificable en E. coli o algún otro huésped adecuado se sonda con un oligonucleótido marcado radiactivamente, preferiblemente un 17 mer o más largo, derivado de una secuencia parcial. Los clones que llevan ADN idéntico al de la sonda se puede después distinguir usando condiciones rigurosas de hibridación. Secuenciando los clones individuales así identificados mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñado a partir de la secuencia de polipéptidos o polinucleótidos polipéptido original es posible después extender la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia de genes de longitud completa. De manera conveniente, tal secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN de doble hebra desnaturalizado preparado a partir de un clon de plásmido. Las técnicas adecuadas las describen Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). (Véase en particular, Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denutared Double - Stranded DNA Templates 13.70). La secuenciación directa de ADN genómico también se puede realizar para obtener una secuencia génica de longitud completa. Como ilustración de la invención, cada polinucleótido expuesto en el grupo de la SEQ Nº 1 se descubrió en una genoteca de ADN derivada de H. influenzae no tipificable.

Además, cada secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID Nº 1 contiene una fase abierta de lectura que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de restos de aminoácidos establecido en el grupo de la SEQ Nº 2 con un peso molecular deducido que se puede calcular usando valores de peso molecular de restos de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Los polinucleótidos del grupo de la SEQ Nº 1, entre el codón de inicio y el codón de parada, codifican respectivamente los polipéptidos del grupo de la SEQ Nº 2. El número de nucleótidos del codón de inicio y primer nucleótido del codón de parada se enumeran en la Tabla B para cada polinucleótido del grupo de la SEQ Nº 1.

TABLA B

3

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o esta constituido por:

(a): una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 97 - 99% o identidad exacta, a una secuencia de polinucleótidos SEC ID Nº: 1 ó 3 en la longitud completa de la SEC ID NO: 1 ó 3 respectivamente; o

(b): una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 98% de identidad con la secuencia de ADN de la SEQ ID NO:5, o al menos 99% de identidad a una secuencia de ADN seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO. 7 y 9 en la longitud completa de dicha secuencia; o una secuencia de nucleótidos complementaria con dicho polinucleótido aislado.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos se especies diferentes de H. influenzae no tipificable, se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar una genoteca apropiada en condiciones rigurosas de hibridación (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo entre 45 - 65ºC y una concentración de SDS entre 0,1 y 1%) con una sonda marcada o detectable que consiste o que comprende cualquier secuencia seleccionada entre el grupo de la SEQ Nº 1 o un fragmento de la misma; y aislar un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos.

La invención proporciona una secuencia de polinucleótidos idéntica en su longitud completa a una secuencia codificadora (fase abierta de lectura) en el grupo de la SEQ Nº 1. También la invención proporciona una secuencia codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí mismo así como una secuencia codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento en fase de lectura con otra secuencia codificadora, tal como una secuencia que codifica una secuencia guía o secretora, una secuencia de pre-, o pro- o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención también puede contener al menos una secuencia no codificadora, que incluye por ejemplo, pero no se limita a al menos una secuencia 5' y 3' no codificadora, tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan ARNm, intrones, y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos también puede comprender una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia de marca que facilita la purificación del polipéptido condensado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia con marca es un péptido hexa histidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc) y descrita en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821 - 824 (1989), o un péptido tag de HA (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), los cuales pueden ser útiles en la purificación de la secuencia de polipéptidos condensados a ellos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB210 del Grupo de la SEQ Nº 2 puede ser idéntica a la secuencia codificadora de polinucleótido correspondiente del Grupo de la SEQ 1. La posición del primer y último nucleótidos de las secuencias codificadoras del Grupo de la SEQ 1 se enumeran en la Tabla C. Como alternativa puede ser cualquier secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido del Grupo de la SEQ 2.

TABLA C

4

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa en esta memoria descriptiva abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de la H. influenzae no tipificable BASB210 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en el Grupo de la SEQ 2. El término también abarca polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrado, una secuencia de transposón integrado, o debido a la edición de ARN o reorganización de ADN genómico) conjuntamente con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificadoras y/o no codificadoras.

La invención además se refiere a variantes de los polinucleótidos descritas en esta memoria descriptiva que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de cualquiera de las secuencias del Grupo de la SEQ 2. Los fragmentos de polinucleótidos de la invención se pueden usar, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención.

Los fragmentos preferidos son los polinucleótidos que codifican un epítope de células B o auxiliares T, por ejemplo los fragmentos/péptidos descritos en el Ejemplo 13, y genes quiméricos recombinantes, que comprenden dichos fragmentos de polinucleótido.

Las realizaciones adicionales particularmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes BASB210, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB210 de cualquier secuencia del Grupo de la SEQ 2 en la que varios, unos pocos, 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún resto de aminoácido están sustituidos, modificados, suprimidos y/o añadidos, en cualquier combinación. Especialmente preferidas entre éstas están las sustituciones silenciosas, adiciones y supresiones, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB210.

Los polinucleótidos que se pueden usar en la invención son al menos 85% idénticos en su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB210 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las secuencias del Grupo de SEQ 2, y polinucleótidos que son complementarios a tales polinucleótidos. Como alternativa, los más preferidos son polinucleótidos que comprenden una región que es al menos 90% idéntica en su longitud entera a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB210 y polinucleótidos complementarios a los mismos. A este respecto, los polinucleótidos al menos 95% idénticos en su longitud completa a los mismos se prefieren particularmente. Además, aquellos con al menos 97% se prefieren en gran medida entre aquellos con al menos 95%, y entre éstos aquellos con al menos 98% y al menos 99% son en gran medida particularmente preferidos, siendo los más preferidos con al menos 99%.

Realizaciones preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que mantienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por una secuencia de ADN del Grupo de SEQ 1.

De acuerdo ciertas realizaciones preferidas de esta invención se proporcionan polinucleótidos que se hibridan, particularmente en condiciones rigurosas, a secuencias de polinucleótidos BASB210, tales como los polinucleótidos del Grupo de SEQ 1.

La invención además se refiere a polinucleótidos que se hibridan a las secuencias de polinucleótidos proporcionados en esta memoria descriptiva. A este respecto, la invención especialmente se refiere a polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a los polinucleótidos descritos en esta memoria descriptiva. Como se usa en esta memoria descriptiva, los términos "condiciones rigurosas" y "condiciones rigurosas de hibridación" significan hibridación que se produce solamente si existe al menos 95% y preferiblemente al menos 97% de identidad entre secuencias. Un ejemplo específico de condiciones rigurosas de hibridación es la incubación durante toda una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5 x de SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma fragmentado de salmón, seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de lavado e hibridación se conocen bien y se ilustran en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), particularmente el capítulo 11 en ese documento. La hibridación en solución también se puede usar con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

La invención también proporciona un polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia de polinucleótidos obtenida mediante selección de una genoteca apropiada que contiene el gen completo de una secuencia de polinucleótidos expuesta en cualquiera de las secuencias del Grupo de SEQ 1 en condiciones rigurosas de hibridación con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencias de polinucleótidos expuesta en la secuencia correspondiente del Grupo de SEQ 1 o un fragmento de la misma; y selección de dicha secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener tal polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores totalmente descritas en otra parte en esta memoria descriptiva.

Como se describe en otra parte en esta memoria descriptiva con relación a los ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, se pueden usar como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar los ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB210 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen una identidad alta, particularmente una alta identidad de secuencia, al gen BASB210. Tales sondas generalmente comprenderán al menos 15 restos de nucleótidos o pares de bases. Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 residuos de nucleótidos o pares de bases y tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de
bases.

Una región codificadora de un gen BASB210 se puede aislar mediante selección usando una secuencia de ADN proporcionada en el Grupo de SEQ 1 para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención se usa después para seleccionar una genoteca de ADNc, ADN o ARNm genómico con el fin de determinar qué miembros de la genoteca se hibridan a la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos por los expertos en la técnica para obtener los ADN de longitud completa, o los ADN de extensión corta, por ejemplo los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85: 8998 - 9002, 1988). Recientes modificaciones de la técnica, ilustradas por ejemplo por la tecnología de Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.), han simplificado significativamente la investigación de los ADN más largos. En la tecnología de Marathon^{TM}, los ADN se han preparado a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "de adaptador" ligada a cada extremo. Después la amplificación de ácido nucleico (PCR) se lleva a cabo para amplificar el extremo 5' "ausente" del ADN usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos de genes y específicos de adaptadores. La reacción de PCR se repite después usando cebadores "encajados", es decir, cebadores diseñados para hibridarse dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico de adaptador que hibrida además el extremo 3' en la secuencia de adaptador y un cebador específico del gen que hibrida además el extremo 5' en al secuencia génica seleccionada). Después los productos de esta reacción se pueden analizar mediante secuenciación de ADN y un ADN de longitud completa construido o bien uniendo el producto directamente al ADN existente proporcionando una secuencia completa, o llevando a cabo una PCR separada de longitud completa usando la información de la secuencia nueva para el diseño del cebador en 5'.

Se pueden emplear los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, por ejemplo, como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos de y diagnosis para enfermedades, particularmente enfermedades humanas, como se describe posteriormente en esta memoria descriptiva con relación a ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia del Grupo de SEQ 1 se pueden usar en los procedimientos en esta memoria descriptiva como se ha descrito, pero preferiblemente para PCR, con el fin de determinar si o no los polinucleótidos identificados en esta memoria descriptiva en conjunto o en parte se transcriben en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que tales secuencias también tendrán utilidad en diagnosis de la fase de infección y tipo de infección que ha alcanzado el patógeno.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales amino o carboxilo terminal, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (por ejemplo, cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica). Tales secuencias pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína del precursor a una forma madura, puede permitir transporte de proteínas, puede alargar o acortar la semivida de las proteínas o puede facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in vivo, los aminoácidos adicionales se pueden procesar a partir de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para cada y todo polinucleótido de la invención se proporciona un polinucleótido complementario a él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido con los que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido condensado a uno o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando las prosecuencias se retiran tales precursores inactivos generalmente se activan. Algunas o todas las prosecuencias se pueden retirar antes de inactivación. En general, tales precursores se llaman proproteínas.

Además de las representaciones A, G, C, T/U convencionales para nucleótidos, el término "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en tal posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótidos adyacentes, cuando se lee en la fase correcta de lectura, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematura en tal fase de lectura.

En resumen, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia guía (que se puede denominar una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que son las secuencias guía de una preproteína, o una proteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia guía y una o más prosecuencias, que generalmente se retiran durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento de distribución adecuado tal como inyección directa de ADN de plásmido en músculos (Wolf y col., Hum. Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), distribución de ADN complejado con vehículos proteicos específicos (Wu y col., J. Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenistry y Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col, PNAS USA, (1984) 81: 5489).

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Vectores, células huésped, sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células huésped que están modificadas por ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de traducción libres de células también se pueden emplear para producir tales proteínas usando ARN derivado de construcciones de ADN de la invención.

Los polinucleótidos recombinantes de la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de células huésped modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, para células huésped que están modificadas por ingeniería genética con tales sistemas de expresión, y para la producción de polinucleótidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células huésped se pueden modificar por ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula huésped se puede efectuar mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis, y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), tal como, transfección por fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE - dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por legrado, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis, H. influenzae y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como células de una levadura, Kluiveromyces, Saccharomyces, Pichia, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células de plantas, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Se puede usar una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de al invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de episomas y de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, virus papova, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmicos y fagémidos. Las construcciones de sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como generan expresión. Genéticamente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un hospedador se puede usar para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (anteriormente). En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, se pueden incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación por sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónica o catiónica, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatita y v lecitina. Los más preferiblemente, cromatografía de afinidad por iones metálicos (IMAC) se emplea para purificación. Las técnicas bien conocidas para replegar proteínas se pueden emplear para regenerar conformación activa cuando se desnaturaliza el polipéptido durante la síntesis intracelular, aislamiento y o purificación.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus a bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación e infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo de un antígeno e inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usados para este propósito son por ejemplo; poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar, viruela de canarios), alfavirus (virus Sindbis, virus del bosque Semiliki, virus de encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus asociado a adeno, picornavirus (virus de la polio, rinovirus), herpesvirus (virus zoster de varicela, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG estreptococos. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuados de diversas maneras con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacuna vivas también forman parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, pronóstico, determinación de serotipo y mutación

La presente invención también se refiere al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB210 de la invención para uso como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB210 en un eucariota, particularmente un mamífero, y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico para diagnosis de enfermedad, determinación de la fase de enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente seres humanos, particularmente los infectados o sospechosos de estar infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB210, se pueden detectar en el nivel de ácidos nucleicos o aminoácidos mediante una diversidad de técnicas bien conocidas así como procedimientos proporcionados en la presente memoria descriptiva.

Los polipéptidos y polinucleótidos para prognosis, diagnosis u otro análisis se pueden obtener a partir de materiales corporales de individuos supuestamente infectados y/o infectados. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, se pueden usar directamente para detección o se puede amplificar enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes de análisis. El ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico también se puede usar de las mismas maneras. Usando amplificación, caracterización de la especie y cepa de organismo infeccioso o residente presente en un individuo, se puede preparar mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las supresiones e inserciones se pueden detectar mediante un cambio en tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada entre un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales se pueden identificar mediante hidridación de ADN amplificado a secuencias de polinucleótidos BASB210 marcados. Secuencias coincidentes perfecta o significativamente se pueden distinguir de dúplex no coincidentes imperfecta o más significativamente mediante digestión con ADNasa o ARNasa, para ADN o ARN respectivamente, o mediante la detección de diferencias en temperaturas de fusión o cinética de renaturalización. Las diferencias de secuencias de polinucleótidos también se puede detectar mediante alteraciones en al movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótidos en geles comparados con una secuencia de referencia. Esto se puede llevar a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias de polinucleótidos también se pueden detectar mediante secuenciación de ADN o ARN directa. Véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230: 1242 (1985). Cambios de secuencia en localizaciones específicas también se pueden revelar mediante ensayos de protección de nucleasa, tales como ARNasa, ensayo de protección de V1 y S1 o un procedimiento de escisión química. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397 - 4401 (1985).

En otra realización, una disposición de sondas de oligonucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos BASB210 o fragmentos de la misma se pueden construir para llevar a cabo la selección eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación taxonómica o identificación. Procedimientos de tecnología de disposición se conocen bien y tienen aplicabilidad general y se pueden usar para dirigir una diversidad de cuestionasen genética molecular incluyendo expresión génica, unión genética, y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science, 274: 610 (1996)).

De este modo en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a): un polipéptido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 3 ó 5, o un fragmento de la misma;

(b): una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c): un polipéptido de la presente invención, preferiblemente cualquiera de los polipéptidos del Grupo de la SEQ 2 o un fragmento del mismo; o

(d): un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, preferiblemente para el polipéptido del Grupo de la SEQ 2.

Se apreciará que en cualquiera de dichos kits, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Tal kit se usará en diagnosis de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, entre otros.

La presente invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente, cualquier secuencia del Grupo de la SEQ 1, que está asociada con una enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta de diagnóstico que se puede añadir a, o definir, una diagnosis de una enfermedad, una prognosis de un curso de enfermedad, una determinación de una fase de enfermedad, o una susceptibilidad a una enfermedad, que se produce por infraexpresión, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente organismos infecciosos, que llevan mutaciones en dicho polinucleótido se pueden detectar a nivel de polinucleótido mediante una diversidad de técnicas, tales como las descritas en otra parte en esta memoria descriptiva.

Las células de un organismo que llevan mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención también se puede detectar a nivel del polinucleótido o polipéptido mediante una diversidad de técnicas, que permite, por ejemplo, la formación de serotipos. Por ejemplo, RT-PCR se puede usar para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente, por ejemplo, GeneScan. ARN, ADNc o ADN genómico también se puede usar para el mismo propósito, PCR. Como ejemplo, los cebadores de PCR complementarios a un polipéptido que codifica el polipéptido BASB210 se puede usar para identificar y analizar mutaciones.

La invención además proporciona cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos retirados del extremo 5' y/o el 3'. Estos cebadores se pueden usar para, entre otras cosas, amplificar ADN y/o ARN de BASA020 aislados de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores se pueden usar para amplificar un polipéptido aislado de un individuo infectado, de manera que el polinucleótido se puede después someter a diversas técnicas para elucidación de al secuencia de polinucleótidos. De esta forma, las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos se puede detectar y usar para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su fase o curso, o determinar el serotipo y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención además proporciona un procedimiento para diagnosticar una enfermedad, preferiblemente infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones provocadas por H. influenzae no tipificable, que comprende la determinación de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un nivel aumentado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia del Grupo de la SEQ 1. Incremento o disminución de la expresión de un polinucleótido BASB210 se puede medir usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, transferencia de Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, un ensayo diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la sobreexpresión del polipéptido BASB210 comparado con muestras de tejidos de control normales se pueden usar, por ejemplo, para detectar la presencia de una infección. Las técnicas de ensayo que se pueden usar para determinar niveles de un polipéptido BASB210, en una muestra derivada de un hospedador, tal como un material corporal, los conocen bien los expertos en la técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen, radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western, ensayos sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polipéptidos de la invención se pueden usar como componentes de disposiciones de polipéptidos, preferiblemente disposiciones o retículas de alta densidad. Estas disposiciones de alta densidad son particularmente útiles para propósitos de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, un conjunto de de manchas cada una comprendiendo un gen diferente, y comprendiendo además un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, se puede usar para sondar, tal como el uso de hibridación o amplificación de ácidos nucleico, usando una sonda obtenida o derivada a partir de una muestra corporal, para determinar la presencia de de una secuencia de polinucleótidos particular o secuencia relacionada en un individuo, Tal presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente H. influenzae no tipificable, y puede se útil en el diagnóstico y/o pronóstico de un curso de la enfermedad. Se prefiere una retícula que comprenda un número de variantes de cualquier secuencia de polinucleótidos del Grupo de la SEQ 1. También se prefiere una que comprenda un número de variantes de una secuencia de polinucleótidos que codifica cualquier secuencia de polinucleótidos del Grupo de la SEQ 2.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos respectivamente. Como alternativa, también se pueden usar mimotopos, de epítopes dentro de la secuencia de polipéptidos como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para el polipéptido de la invención. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen sustancialmente mayor afinidad para los polipéptidos de la invención que su afinidad para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB210.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención se pueden obtener administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que llevan epítopes de cualquiera o ambos, análogos de cualquiera o ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un anima, preferiblemente uno no humano, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica conocida en la técnica que proporciona anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como las descritas en Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495 - 497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., pg. 77 - 96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de estados Unidos Nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla a polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. También, ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para el polipéptido o polipéptidos de la invención.

Como alternativa, la tecnología de exposición de proteínas y péptidos en la cápsida de fagos se puede utilizar para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención bien a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos seleccionados por poseer anti-BASB210 o de genotecas inactivas (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552 - 554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10, 779 - 783). La afinidad de estos anticuerpos también se puede mejorar mediante, por ejemplo, arrastre de cadenas (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden emplear para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

De este modo, entre otros, los anticuerpos contra polipéptido BASB210 o polinucleótido BASB210 se pueden emplear para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes de polipéptidos incluyen variantes, antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalente forman un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo de una variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénica en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano el anticuerpo puede lo más preferiblemente estar "humanizado", la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma se ha transplantado en un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo como se describe en Jones y col., (1986), Nature 321, 522 - 525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266 - 273.

Ensayos y moléculas de antagonistas y agonistas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención también se pueden usar para valorar la unión de de sustratos de pequeñas moléculas y ligandos en, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, genotecas químicas, y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Colignan y col., Current Protocols in Immunology 1 (2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que llevan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión mediante medios de una marca directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Como alternativa, el procedimiento de selección puede implicar competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de activación se ensayan generalmente en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación mediante el agonista por la presencia del compuesto candidato. El péptido constitutivamente activo y/o polipéptidos constitutivamente expresados se pueden emplear en procedimientos de selección para agonistas o inhibidores inversos, en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezclado de un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, midiendo la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB210 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB210 de la mezcla con un patrón. Las proteínas de fusión, tales como las realizadas a partir de la porción Fc y polipéptido BASB210, como se ha descrito anteriormente en esta memoria descriptiva, también se pueden usar para ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos relacionados filogenético y/o funcionalmente relacionados (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8: 52 - 58 (1995); y K. Johanson y col., L Biol Chem, 270 (16): 9459 - 9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen y/o interactúan con un polipéptido de la presente invención también se pueden usar para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, se puede construir un ensayo ELISA para medir los niveles secretados o asociados a células de polipéptido que usa anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Éste se puede usar para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente.

Los inventores también describen un procedimiento de selección de compuestos para identificar aquellos que potencian (agonista) o bloquean (antagonista) la acción de polipéptidos o polinucleótidos BASB210, particularmente los compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción de síntesis, un compartimiento celular, tal como una membrana, envuelta celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de los mismos, que comprende el polipéptido BASB210 y un sustrato o ligando marcado de tal polipéptido se incuba en ausencia o presencia de una molécula candidato que puede ser un agonista o antagonista BASB210. La capacidad de la molécula candidato de agonizar o antagonizar el polipéptido BASB210 se refleja en una disminución de la unión del ligando marcado o disminución de la producción del producto de cada sustrato. Las moléculas que se unen de forma gratuita, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB210 van a ser los más probablemente buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien, y como puede ser el caso, incrementan la velocidad de producción del producto a partir del sustrato, incrementan la transducción de la señal, o incrementan la actividad de los canales químicos son agonistas. La detección de la velocidad o nivel de, como puede ser el caso, la producción del producto a partir del sustrato, transducción de señal, o actividad de los canales químicos se puede potenciar usando un sistema indicador. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen pero no se limitan a colorimétricos, sustrato marcado convertido en producto, un gen indicador que es responsable de cambios en la actividad de polinucleótido o polipéptido BASB210, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas BASB210 en un ensayo competitivo que combina BASB210 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB210, moléculas de unión a BASB210 recombinantes, sustratos o ligandos naturales, miméticos de sustratos o ligandos, en condiciones apropiados para un ensayo de inhibición competitiva. BASB210 se puede marcar, tal como mediante radiactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que el número de moléculas BASB210 unidas a una molécula de unión o convertidas en producto se puede determinar exactamente para evaluar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y por lo tanto inhiben o suprimen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo estrechamente relacionada o que se une a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB210, evitando por lo tanto la acción o expresión de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB210 excluyendo los polinucleótidos y/o polipéptidos BASB210 de la unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una pequeña molécula que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido evitando por lo tanto la unión a moléculas de unión celular, de manera que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de pequeñas moléculas incluyen pero no se limitan a pequeñas moléculas orgánicas, péptidos o moléculas de tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas de polaridad opuesta (véase Okano, J. Neurochem 56: 560 (1991); OLIGONUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GEN EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB210.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión modificadas por ingeniería genética que comprende un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina se prefiere la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc se puede retirar simplemente mediante incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor de coagulación Xa. Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniaría genética, y al uso de los mismos para seleccionar fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de tecnología de proteína de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patente internacional Números WO 94/29458 y WO 94/22914.

Cada una de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en esta memoria descriptiva se pueden usar en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras expresión, se puede usar como una diana para la selección de fármacos antibacterianos. De manera adicional, las secuencias de polinucleótidos que codifican regiones terminales de la proteína codificada o Shine - Delgarno u otra traducción que facilita las secuencias del ARNm respectivo se pueden usar para construir secuencias de polaridad opuesta para controlar la expresión de la secuencia codificadora de interés.

La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un hospedador eucariótico, preferiblemente mamífero, responsable de una secuela de infección. En particular, las moléculas de la invención se pueden usar: en la prevención de adhesión de bacterias, en particular bacterias Gram positivas y/o Gram negativas, a proteínas de matriz extracelular de eucarióticos, preferiblemente de mamíferos, o en dispositivos permanentes o a una matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de matriz extracelular de eucarióticos, preferiblemente de mamíferos y proteínas BASB210 bacterianas que median el gaño en tejido y/o; bloquear la progresión normal de patogénesis en infecciones iniciadas distintas de la implantación de dispositivos permanentes o mediante otras técnicas quirúrgicas.

Los inventores describen agonistas y antagonistas de BASB210, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención se pueden emplear, por ejemplo, para evitar, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es una secuencia de péptidos, suficientemente similar al péptido nativo (secuencialmente o estructuralmente), que es capaz de ser reconocida por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es capaz de originar anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se acopla a un vehículo adecuado.

Los mimotopos de péptidos se pueden diseñar para un propósito particular mediante adición, supresión o sustitución de aminoácidos elegidos. De este modo, los péptidos se pueden modificar para propósitos de fácil conjugación a un vehículo proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además puede ser deseable para péptidos conjugados a un vehículo proteico incluir un terminal hidrófobo distal del terminal conjugado del péptido, de manera que el extremo no conjugado libre del péptido permanece asociado con la superficie de la proteína del vehículo. Por lo tanto presentando el péptido en una conformación que se parece los más estrechamente posible a la del péptido encontrado en el contexto de la molécula entera nativa. Por ejemplo, los péptidos se pueden alterar para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-termina. Como alternativa, la adición o sustitución de una forma de diastereómero D de uno o más de los aminoácidos se puede realizar para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para potenciar la estabilidad del péptido. Los mimotopos también pueden ser secuencias retro de las secuencias de péptidos naturales, de manera que la orientación de secuencias está invertida. Los mimotopos también pueden ser retro - inverso en carácter. Los péptidos retro, inverso y retro - inverso se describen en el documento WO 95/24916 y documento WO 94/056311.

Como alternativa los mimotopos de péptidos se pueden identificar usando anticuerpos que son capaces ellos mismos de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como tecnología de exposición de proteínas y péptidos en la cápsida de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica, genera un gran número de secuencias de péptidos que imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces de unirse a anticuerpos peptídicos anti - nativos, pero pueden ellos mismos no compartir homología de secuencias significativa con el polipéptido nativo.

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Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres humanos, que comprende la inoculación del individuo con polinucleótido y/o polipéptido BASB210, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir anticuerpo y/o respuesta inmune de células T para proteger dicho individuo de la infección, particularmente la infección bacteriana y lo más particularmente infección por H. influenzae no tipificable. También se proporcionan procedimientos en los que tal respuesta inmunológica retrasa la replicación bacteriana. Incluso otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de inducción de una respuesta inmunológica en un individuo que comprende la distribución a tal individuo de un vector, secuencia o ribozima de ácido nucleico para dirigir la expresión de polinucleótido y/o polipéptido BASB210, o un fragmento o una variante del mismo in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, de manera que produzca anticuerpo y/o respuesta inmune de células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de citoquina o células T citotóxicas, para proteger dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de una enfermedad, bien la enfermedad esté ya establecida dentro del individuo o no. Un ejemplo de administrar el gen es acelerándolo en las células deseadas como un revestimiento sobre partículas o de otra manera. Tal vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo ADN - proteína o un complejo ARN - proteína.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, capaz de haber inducido dentro de el una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en tal individuo a un polipéptido y/o polipéptido BASB210 codificado a partir de ellos, en la que la composición comprende un polipéptido y/o polipéptido BASB210 recombinante codificado a partir de ellos y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polipéptido, polipéptido BASB210 codificado a partir de ellos, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica se puede usar terapéuticamente o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpo y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de células CTL o T CD4+.

El polipéptido BASB210 o un fragmento del mismo se puede condensar con una coproteína o resto químico que puede o no puede producir por él mismo anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína condensada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras De este modo la proteína recombínate condensada, comprende preferiblemente una coproteína antigénica, tal como la lipoproteína D de Haemophilus influenzae, Glutation-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La coproteína se puede unir a o bien el terminal amino o carboxi de la primera proteína.

En una composición de vacuna de acuerdo con la invención, un polipéptido y/o polinucleótido BASB210, o un fragmento, o un mimotopo, o una variante del mismo puede estar presente en un vector, tal como los vectores recombinantes vivos descritos anteriormente por ejemplo vectores bacterianos vivos.

También son adecuados vectores no vivos para el polipéptido BASB210, por ejemplo vesículas de membrana externa bacteriana o "burbujas". Las burbujas OM se derivan de la membrana externa de dos fases de bacterias Gram-negativa y se han documentado en muchas bacterias Gram-negativas (Zhou, L et al. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223 - 228) incluyendo C. trachomatis y C. psittaci. Una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos indicados para producer burbujas también incluye: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica.

Las burbujas tienen la ventaja de proporcionar proteínas de la membrana externa en su conformación nativa y de este modo son particularmente útiles para vacunas. Las burbujas también se pueden mejorar para uso en vacuna mediante modificación por ingeniería genética de la bacteria de manera que se modifique la expresión de una o más moléculas en la membrana exterior. De este modo por ejemplo la expresión de una proteína inmunogénica deseada en la membrana externa, tal como el polipéptido BASB210, se puede introducir o regular hacia abajo (por ejemplo, alterando el promotor). En lugar de o además de, la expresión de las moléculas de la membrana externa que son o bien no relevantes (por ejemplo, antígenos no protectores o inmunodominantes excepto proteínas variables) o perjudiciales (por ejemplo, moléculas tóxicas tales como LPS, o inductores potenciales de una respuesta autoinmune) se puede regular hacia abajo. Estos planteamientos son como se describen en más detalle en lo que sigue.

Las regiones flanqueantes no codificadoras del gen de BASB210 contienen elementos reguladores importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel de transcripción como de traducción. La secuencia de estas regiones, o bien cadena arriba o cadena abajo de la fase abierta de lectura del gen, se pueden obtener mediante secuenciación de ADN. Esta información de secuencia permite la determinación de motivos reguladores potenciales tales como los elementos promotores diferentes, secuencias de terminación, elementos de secuencia inducibles, represores, elementos responsables de la variación de fase, la secuencia shine-dalgarno, regiones con estructura secundaria potencial implicada en la regulación, así como otros tipos de motivos o secuencias. Esta secuencia es un aspecto adicional de la invención. Además, la SEQ ID NO: 13 es la secuencia de Haemophilus influenzae no tipificable cadena arriba (cadena arriba del codón de inicio predicho de los genes preferidos) que comprende aproximadamente 700 pares de bases.

Esta información de secuencia permite la modulación de la expresión natural del gen de BASB210. La regulación hacia arriba de la expresión génica se puede llevar a cabo alterando el promotor, la secuencia shine-dalgarno, represor potencial o elementos operadores, o cualesquiera otros elementos implicados. Del mismo modo, la regulación hacia debajo de la expresión se puede lograr mediante tipos similares de modificación. Como alternativa, cambiando las secuencias de variación de fase, la expresión del gen se puede poner en control de de variación de fase, o puede estar no acoplado a partir de esta regulación. En otro planteamiento, la expresión del gen se puede poner bajo el control de uno o más elementos inducibles que permiten la expresión regulada. Los ejemplos de tal regulación incluyen, pero no se limitan a, inducción por desplazamiento de temperatura, adición de substratos linductores como carbohidratos seleccionados o sus derivados, oligoelementos, vitaminas, co-factores, iones metálicos, etc.

Tales modificaciones como se han descrito anteriormente se pueden introducir mediante diferentes medios. La modificación de las secuencias implicadas en la expresión génica se puede hacer in vivo mediante mutagénesis al azar seguida de selección del fenotipo deseado. Otro planteamiento consiste en el aislamiento de la región de interés y modificarla por mutagénesis al azar, o mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de inserción o supresión. Después la región modificada se puede volver a introducir en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga, y se puede determinar el efecto sobre la expresión génica. En otro planteamiento, el conocimiento de la secuencia de la región de interés se puede usar para reemplazar o suprimir toda o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora dirigida se aísla y se modifica de manera que contenga los elementos reguladores de otro gen, una combinación de los elementos reguladores de genes diferentes, una región reguladora sintética, o cualquier otra región reguladora, o para suprimir partes seleccionadas de las secuencias reguladoras de tipo salvaje. Estas secuencias modificadas se pueden después volver a introducir en la bacteria mediante recombinación homóloga en el genoma. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos se podrían usar para la regulación hacia arriba de la expresión génica incluye el promotor porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae; ompCD, copB, lbpB, ompE, UspA1; UspA2; TbpB de M. Catarrhalis NT; p1, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 de H. influenzae.

En un ejemplo, la expresión del gen se puede modular cambiando su promotor con un promotor más fuerte (mediante el aislamiento de la secuencia hacia arriba del gen, modificación in vitro de esta secuencia, y la reintroducción en el genoma mediante recombinación homóloga). La expresión hacia arriba se puede obtener en ambas bacterias así como en la cubierta de las vesículas de las membranas externas (o fabricadas) de las bacterias.

En otros ejemplos, los planteamientos descritos se pueden usar para generar cepas de bacterias recombinantes con características mejoradas para aplicaciones de vacunas. Éstos pueden ser, pero sin limitación, cepas atenuadas, cepas con expresión incrementada de antígenos seleccionados, cepas con eliminación genética - (o expresión disminuida) de genes que interfieren con la respuesta inmune, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con recubrimiento modulado de vesículas de las membranas externas.

De este modo, la invención también proporciona una región cadena arriba modificada del gen BASB210, dicha región cadena arriba modificada contiene un elemento regulador heterólogo que altera el nivel de expresión de la proteína de BASB210 localizada en la membrana externa. La región cadena arriba de acuerdo con este aspecto de la invención incluye la secuencia cadena arriba del gen de BASB210. La región cadena arriba comienza inmediatamente cadena arriba del gen de BASB210 y continúa usualmente hasta una posición no más de aproximadamente 1000 pares de bases cadena arriba del gen del codón de inicio ATG. En el caso de un gen localizado en una secuencia policistrónica (operón) la región cadena arriba puede comenzar inmediatamente que precede al gen de interés, o que precede al primer gen en el operón. Preferiblemente, una región cadena arriba modificada de acuerdo con este aspecto de la invención contiene un promotor heterólogo en una posición entre 500 y 700 pares de bases cadena arriba de ATG.

El uso de las regiones cadena arriba descritas para regular hacia arriba la expresión del gen de BASB210, un procedimiento para lograr esto mediante recombinación homóloga (por ejemplo como se describe en el documento WO 01/09350 incorporado en el presente documento por referencia), un vector que comprende la secuencia cadena arriba adecuada para este propósito, y una célula huésped así alterada son todos los aspectos adicionales de esta invención.

De este modo la invención proporciona un polipéptido BASB210, en una burbuja bacteriana modificada. La invención además proporciona células huésped modificadas capaces de producir los vectores de burbuja basados en membrana no vivos. La invención además proporciona vectores de ácido nucleico que comprenden el gen de BASB210 que tiene una región modificada hacia arriba que contiene un elemento regulador heterólogo.

Además la invención proporciona procedimientos para preparar las células huésped y burbujas bacterianas de acuerdo con la invención.

Esta invención también proporciona composiciones, particularmente composiciones de vacunas, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como las descritas en Sato, Y. y col., Science 273: 352 (1996).

También, esta invención proporciona procedimientos que usan el polinucleótido o fragmentos particulares del mismo descritos, que se han mostrado que codifican regiones no variables de proteínas de la superficie celular bacteriana, en construcciones de polinucleótidos usados en tales experimentos de inmunización genéticos en modelos de animales de infección con H. influenzae no tipificable Tales experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopes de proteínas capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que este planteamiento permitirá la preparación posterior de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados del órgano requerido del animal que resiste con éxito o elimina la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección con H. influenzae no tipificable, en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención también incluye una formulación de vacunas que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ya que los polipéptidos y polinucleótidos se pueden descomponer en el estómago, cada uno se administra preferiblemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, la administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estéril acuosa y no acuosa que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas o no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o multidosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales se pueden almacenar en un estado liofilizado que solamente requiere la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de usar.

La formulación de las vacunas de la invención también pueden incluir sistemas de adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema de adyuvantes alcanza preferentemente un tipo TH1 de respuesta. Una respuesta inmune se puede distinguir ampliamente en dos categorías extremas, siendo una humoral o respuesta inmune humoral o mediada por células (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos efectores de anticuerpos y celulares de protección respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células), y repuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes extremas de tipo TH1 se pueden caracterizar por la generación de un antígeno específico, linfocitos T citotóxicos de halotipo restringido, y respuestas celulares naturales asesinas. En ratones las respuestas de tipo TH1 a menudo se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en el ser humano éstas corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de un amplio intervalo de isotipos de inmunoglobulinas que incluyen IdG1, IgA, e IgM en ratones.

Se puede considerar que la fuerza directora que está detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmune son citoquinas. Altos niveles de citoquinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células al antígeno dado, mientras que altos niveles citoquinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno.

La distinción de respuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune que se describe que es predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de los descritos en clones de células T CD4 +ve de murinos por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cels: different patterns of lymphokine secretion lead to diffrent funcional properties. Annual Review of Immunology, 7 p 145 - 173). Tradicionalmente las respuestas de tipo TH1 están asociadas con la producción de las citoquinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas a menudo directamente asociadas a la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no están producidas por las células T, tal como IL-2. Por el contrario, las respuestas de tipo TH2 están asociadas a la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son particularmente adecuados para la estimulación de repuestas de citoquinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluye la medición directa de la producción de citoquinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de la reestimulación con un antígeno y/o la medición de la relación IgG1:IgG2a de las respuestas de anticuerpos específicas de antígenos.

De este modo, un adyuvante de tipo TH1 es una que estimula preferiblemente las poblaciones de células T para producir altos niveles de citoquinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con un antígeno in vitro, y promueve el desarrollo de tanto linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuestas de inmunoglobulinas específicas de antígenos asociadas a, isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de la estimulación preferencial de la respuesta de las células TH1 se describen en las solicitudes de la patente internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209. El lípido A 3 Des-O-acilado monofosforilo (3D-MPL) es uno de tales adyuvantes. Éste se conoce a partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla del lípido A 3 Des-O-acilado monofosforilo con 4, 5 o 6 cadenas aciladas y lo fabrica Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida del lípido A 3 Des-O-acilado monofosforilo se describe en la patente europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals S.A).

Preferiblemente, las partículas del 3D-MPL son lo suficientemente pequeñas para esterilizarse cuando se filtran a través de una membrana de 0,22 micras (patente europea nº 0 689 454). El 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug - 100 \mug preferiblemente 25 - 50 \mug por dosis donde el antígeno típicamente estará presente en un intervalo de 2 - 50 \mug por dosis.

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Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica derivada de Hplc de la corteza de Quillaza Saponaria Molina. Opcionalmente éste se puede administrar con el lípido A 3 Des-O-acilado monofosforilo (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.057.540.

Las formulaciones de adyuvantes no reactogénicos que contienen QS21 se han descrito previamente (documento WO 96/33739). Tales formulaciones que comprenden el QS21 y colesterol se han mostrado adyuvantes estimulantes de TH1 cuando se formulan junto con un antígeno.

Además los adyuvantes que son estimuladores preferentes de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metilado como se describe en el documento WO 96/02555.

Las combinaciones de diferentes adyuvantes estimulantes de TH1, tales como los mencionados en esta memoria descriptiva anteriormente, también se contemplan que proporcionan un adyuvante que es un estimulador preferencial de la respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS 21 se puede formular junto con el 3D-MPL. La relación de QS21 : 3d-MPL típicamente será del orden de 1 : 10 a 10 : 1; preferiblemente 1 : 5 a 5 : 1 y a menudo sustancialmente 1 : 1. El intervalo preferido para sinergia óptima es 2,5 : 1 a 1 : 1 de 3D-MPL : QS.

Preferiblemente un vehículo también está presente en la composición de vacunas según la invención. El vehículo puede ser una emulsión aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión preferida aceite en agua comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfatocoferol y Twenn 80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos en la composición de vacunas según la invención se combinan con QS21 y 3d-MPL en tal emulsión. Adicionalmente la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente para la administración humana QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el intervalo de 1 \mug - 200 \mug, tal como 10 \mug - 100 \mug, preferiblemente 10 \mug - 50 \mug por dosis. Típicamente el aceite en agua comprenderá entre 2 y 10% de escualeno, entre 2 y 10% de alfatocoferol y entre 0,3 y 3% de tween 80. Preferiblemente la relación de escualeno : alfatocoferol es igual a o menor que 1 ya que esto proporciona una emulsión más estable. Span 85 también puede estar presente a un nivel de 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizador.

Las emulsiones aceite en agua no tóxicas preferiblemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo, escualeno o escualeno, un emulsionante, por ejemplo, Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación de adyuvantes particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en un a emulsión aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB210, se entiende que ésta cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos de origen natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, supresiones o sustituciones que no afectan sustancialmente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes. Los fragmentos/péptidos preferidos se describen en el ejemplo 13.

En una realización preferida, los polipéptidos, fragmentos e inmunógenos de la invención se formulan con uno o más de los siguientes grupos de antígenos: a) uno o más polisacáridos capsulares neumocócicos (o bien sencillo o conjugado a una proteína vehículo); b uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra infección por M. Catarrhalis NT; c) uno o más antígenos de proteínas que pueden proteger a un huésped contra infección por Streptococcus neumoníae; d) uno o más antígenos de proteína de Haemophilus influenzae no tipificable; e) uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra RSV; y f) uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra virus de influenza. Se prefieren las combinaciones con: los grupos a) y b); b) y c); b), d), y a) y/o c); b), d), e), f), y a) y/o c). Tales vacunas se pueden usar de manera ventajosa como vacunas de otitis media global.

Los antígenos de polisacáridos capsulares neumocócicos se seleccionan preferiblemente entre los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (lo más preferiblemente de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F).

Los antígenos de proteínas neumocócicas preferidas son las proteínas neumocócicas que se exponen en la superficie externa de los neumococos (capaces de reconocerse mediante un sistema inmune del huésped durante al menos parte del ciclo de vida del neumococo), o son proteínas que se secretan o liberan por los neumococos. Más preferiblemente, la proteína es una toxina, adhesina, transductor de señal de 2 componentes, o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o fragmentos del mismo. Las proteínas particularmente preferidas incluyen, pero no se limitan a: neumolisina (preferiblemente destoxificada mediante tratamiento químico o mutación) [Mitchel y col., Nucleic acids Res. 11 de julio de 1990; 18 (13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell y col., Biochim Biophys Acta 23 de enero de 1989; 1007 (1): 67 - 72 "Expression of the pneumolysisn gene in Escherichia coli: rapid purfication and biological poperties. Documento WO 96/05859 (A. Cyanamid), documento WO 90/06951 (Paton y col.,", documento WO 99/03884 (NAVA)]; PspA y variantes de supresión de membranas de la misma (documento US 5804193 - Briles y col.,); PspC y variantes de supresión de transmembranas de la misma (WO 97/09994 - Briles y col.,); PsaA y variantes de supresión de transmembranas de la misma (Berry y Paton, Infect Immun, diciembre 1996; 64 (12): 5255 - 62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37 - kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); proteínas de unión a colina neumocócica y variantes de supresión de transmembranas de la misma; CbpA y variantes de supresión de transmembranas de la misma (documentos WO 97/41151; WO 99/51266); gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (Infect. Immun. 1996 64: 3544); HSPO (documento WO 96/40928); PcpA (Sánchez - Beato y col., FEMS Microbial Lett 1998, 164: 207 - 14); proteína de tipo M, (Sol. Pat. SB. No, EP 0837130) y adhesina 18627, (Sol. Pat. SB. No, EP 0834568). Además los antígenos de proteínas de neumococos preferidos son los descritos en el documento WO 98/18931, particularmente los seleccionados en los documentos WO 98/18930 y PCT/US99/30390.

Los antígenos de proteína de M. Catarrhalis no tipificable que se pueden incluir en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) son: OMP106 [documento WO 97/41731 (Antex) y documento WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA y/o LbpB [documento WO 98/55606 (PMC)]; TbpA y/o TbpB [documento WO 97/13785 y documento WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010]; UspA1 y/o UspA2 [WO 93/03761 (Universidad de Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB 9917977.2); lipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); y OmpE.

Además los antígenos de proteína de H. influenzae no tipificable que se pueden incluir en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) incluyen: Proteína Fimbrina [(documento US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] y fusiones que comprenden péptidos de los mismos [por ejemplo fusiones de péptido LB1 (f); documento US 5843464 (OSU) o documento WO 99/64067]; OMP26 [documento WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [documento EP 281673 (Universidad del estado de Nueva York)]; proteína D (documento EP 594610); TbpA y/o TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); P2; y P5 (documento WO 94/26304).

Los antígenos preferidos del virus de influenza incluyen virus, enteros, vivos, o inactivados, virus de influenza divididos, crecidos en huevos o células MDCK, o células Vero o virosomas de gripe enteros (como se describe por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915 - 920) o proteínas purificadas o recombinantes de los mismos, tales como proteínas HA, NP, NA, o M, o sus combinaciones.

Los antígenos preferidos de RSV (Virus Sincitial respiratorio) incluyen la glicoproteína F, la glicoproteína G, la proteína HN, o derivados de las mismas.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB210 y/o un polipéptido BASB210 para la administración a una célula o a un organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden polinucleótido y/o un polipéptidos descritos en esta memoria descriptiva o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden emplear en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo del medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. La formulación debe satisfacer el modo de administración. La invención además se refiere a envases y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones anteriormente mencionados de la invención.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera eficaz, conveniente incluyendo, por ejemplo, la administración mediante las vías tópica, oral, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo en forma de una composición inyectable, por ejemplo en forma de una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o un compuesto de moléculas pequeñas, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. La invención además se refiere a envases y kits que comprenden uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones anteriormente mencionadas de la invención. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptarán a la vía de administración, por ejemplo mediante una vía sistémica o una oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente mediante inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías de de inyección, tales como subcutánea, intramuscular, o intraperitoneal. Medios alternativos para la administración sistémica incluyen la administración transmucosal o transdérmica que usa penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención se pueden formular en una formulación entérica o una encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en forma de ungüentos, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del agente activo estará entre 0,01 mg/kg y 10 mg/kg, típicamente aproximadamente 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la dosificación real que será la más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso medio. Pueden, por supuesto, ser casos individuales donde intervalos de dosificación más altos o más bajos son necesarios, y tales están dentro del alcance de esta invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la condición del sujeto, y el juicio del facultativo asistente. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1 - 100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en una forma inyectable. Se pueden emplear adyuvantes convencionales para mejorar la respuesta inmune. Una dosis unitaria adecuada para vacunación es 0,5 - 5 microgramos/kg de antígeno, y tal dosis se administra preferiblemente 1 - 3 veces y con un intervalo de 1 - 3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observará ningún efecto toxicológico indicado con los compuestos de la invención que impediría su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, se esperaran variaciones amplias en la dosificación necesaria, en vista de la diversidad de compuestos disponibles y las eficacias diferentes de diversas vías de administración. Por ejemplo, la administración oral se esperaría que requiera dosificaciones más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas habituales para optimización, como se entenderá bien en la técnica.

Bases de datos de las secuencias, secuencias en un medio tangible, y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos forman una fuente de información valiosa con la que determinar sus estructuras en 2 y 3 dimensiones así como para identificar recuentes adicionales de homología similar. Estos planteamientos se facilitan más fácilmente mediante almacenamiento de la secuencia en un medio legible de ordenador y después usando los datos almacenados en un programa de estructura molecular conocido o buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tal como el paquete de programas GCG.

Los inventores describen los procedimientos para el análisis de secuencias de caracteres o cadenas, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencias, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de estructura de ADN, ARN y proteínas, conjunto de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de la fase abierta de lectura, llamada de bases de ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, recortes de ácidos nucleicos, y análisis de picos de cromatogramas de secuenciación.

Un procedimiento basado en ordenador se proporciona para realizar identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible de ordenador; y comparando dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar homología.

Un procedimiento basado en ordenador también se proporciona para realizar la identificación de homología, dicho procedimiento comprendiendo las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polipéptidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible de ordenador; y comparando dicha primera secuencia de polipéptidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar homología.

Todas las publicaciones y referencias, que incluyen pero no se limitan a las patentes y las solicitudes de patente, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad como si cada publicación individual o referencia estuviera indicada específica e individualmente para incorporarse mediante referencia en el presente documento como si se expusiera completamente. Cualquier solicitud de patente para la que esta solicitud reivindica prioridad también se incorpora como referencia en esta memoria descriptiva en su totalidad de la manera descrita anteriormente para las publicaciones y referencias.

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Definiciones

"Identidad" como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos de dos o más secuencias de polipéptidos, como puede ser el caso, como se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, como puede ser el caso, como se determina mediante la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" se puede fácilmente calcular mediante procedimientos conocidos, que incluyen pero sin limitación, los descritos en (Computacional Molecular Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988). Se diseñan procedimientos para determinar la identidad para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad se codifican en programas de ordenador disponibles públicamente. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP BLASTN (Altschul, S. F. y col., J Molec. BIol. 215: 403 - 410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 2444 - 2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. y col., NCBI NLM Bethesda. MD 20894: Altschul, S., y col., J Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). El algoritmo bien conocido de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.

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Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluye lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970).

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos. 89: 10915 -
10919 (1992)

Penalización de huecos: 8

Penalización de longitud de huecos: 2

Un programa útil con estos parámetros está públicamente disponible como el programa de "huecos" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto con no penalización para los huecos extremos).

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Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970).

Matriz de comparación: coincidencias = + 10, no coincidencia = 0

Penalización de huecos: 50

Penalización de longitud de huecos: 3

Disponible como: El programa de "huecos" de Genetics Computer Group, Madison WI.

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Estos son los parámetros por defecto para las comparaciones de los ácidos nucleicos.

Un significado preferido de "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se proporcionan en (1) y (2) más adelante.

(1) Las realizaciones de polinucleótidos además incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tienen al menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad con la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID. Nº: 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por la menos una supresión, sustitución de nucleótidos, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, ó

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n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifican el polipéptido de la SEC ID. Nº: 2 puede crear mutaciones sin sentido, sentido erróneo, o de desplazamiento de fase en esta secuencia codificadora y por lo tanto alterar el polipéptido codificado por los polinucleótidos después de tales alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 1, es decir puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es menor que 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de ácidos nucleicos que incluye transición, transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las porciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1, o

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID. Nº: 1, y es, por ejemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptidos además incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad a la secuencia de polipéptidos de referencia de la SEC ID. Nº: 2, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID. Nº: 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por la menos una supresión, sustitución de aminoácidos, incluyendo sustitución, conservadora o y no conservadora, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales amino- o carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº 2, ó

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y).

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 2, es decir puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es menor que 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de aminoácidos que incluye sustitución conservadora y no conservadora, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las porciones terminales amino- o carboxi- de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas o bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2, o

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y).

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2, y es 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85 etc., y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de
x_{a}.

"Individuo(s)" cuando se usa en la presente memoria con referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitación a metazoano, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente natural, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido de origen natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en esta memoria descriptiva. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante se "aísla" incluso si todavía está presente en dicho organismo, dicho organismo puede ser vivo o no vivo.

"Polinucleótido(s)" genericamente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado incluyendo regiones de una sola o doble hebra.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que se diferencia de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en una secuencia de nucleótidos de otro, polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante puede o no puede alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se describe más adelante. Una variante típica de un polipéptido se diferencia en la secuencia de aminoácidos del otro, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean estrechamente similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Una variante del polipéptido de referencia se puede diferenciar en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácidos sustituido o insertado puede o no puede estar codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que sea de origen natural. Las variantes de origen no natural de polinucleótidos y polipéptidos se pueden preparar mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad producida por o relacionada con infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nosocomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de fluido en el oído medio, daño en el nervio auditivo, retraso en el aprendizaje del habla, infección del tracto respiratorio superior e infección del oído medio.

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Ejemplos

Los ejemplos dados más adelante se llevan a cabo usando técnicas habituales, que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la técnica, excepto donde se describe de otra manera en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

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Ejemplo 1

Secuenciación de ADN del gen de BASB210 de la cepa 3224A de Haeophiluus influenzae no tipificable A: BASB210 en la cepa 3224A de Haeophilus influenzae no tipificable

La secuencia del ADN del polinucleótido BASB210 de la cepa 3224A de Haemophilus influenzae no tipificable (también denominada la cepa ATCC PT-1816) se muestra en la SEQ ID No: 1. La traducción de la secuencia de polinucleótidos de BASB210 se muestra en la SEQ ID NO: 2.

B: BASB210 en la cepa 3224A de Haeophilus influenzae no tipificable

La secuencia del polinucleótido BASB210 se confirmó en la cepa 3224A de Haemophilus influenzae no tipificable. Para dicho fin, el ADN de plásmido (véase el ejemplo 3A) que contiene la región génica que codifica BASB210 a partir de la cepa 3224A de Haemophilus influenzae no tipificable se sometió a secuenciación de ADN usando el kit Big Dyes (Applied biosystems) y se analizó en un secuenciador de ADN ABI 373/A en las condiciones descritas por el proveedor usando los cebadoers oli 1 ORF1681 (5'-TC ATG AAA TTA CGC GCT GTT G-3') [SEQ ID NO: 14] y oli 2 ORF1681 (5'-AGA TCT TTT ATG GGA TTT TGC CCA C-3') [SEQ ID NO: 15] específicos para el poluinucleótido BASB210 y cebador de Secuencia universal M13 (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3') [SEQ ID NO: 16] y cebador de la secuencia inversa M13 (5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3') [SEQ ID NO: 17] específico para el vector. Como resultado, se obtuvieron el polinucleótido y secuencias deducidas de polipéptido, respectivamente. Usando el programa Clustalx 1.8, la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 3 se alineó con la SEQ ID NO: 1; una comparación por pares de identidades mostró que la secuencia de polinucleótidos era 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 (fig 1). Usando el mismo programa Clustalx 1.8, la secuencia de polipéptidos SEQ ID NO: 4 se alineó con la SEQ ID NO: 2; una comparación por pares de identidades mostró que la secuencia de polipéptidos era 100 % idéntica a la SEQ ID N0 2 (FIG 2).

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Ejemplo 2

Análisis de variabilidad del gen BASB210 entre varias cepas de Haemophilus influenzae no tipificable

Se extrajo ADN genómico de 4 cepas adicionales de Haemophilus influenzae NT (presentadas en la tabla 1) como se describe más adelante. Un matraz erlenmeyer de 500 ml que contenía aproximadamente 100 ml de caldo BHI se inoculó con el cultivo de siembra y se desarrolló durante aproximadamente 12 - 16 horas a 37ºC en un incubador con oscilación, aproximadamente 175 rpm, para generar masa celular para aislamiento de ADN. Las células se recogieron mediante centrifugación en un rotor GSA Sorvall a aproximadamente 2000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Se retiró el sobrenadante. Se extrajo el ADN genómico del sedimento de las células de Haemophilus influenzae NT usando el kit de extracción de ADN genómico de QIAGEN (Qiagen Gmbh). 1 \mug de este material se sometió a amplificación de ADN por Reacción en Cadena de la polimerasa usando los cebadores MCM013 (5'-GCG AGT ATT TCA TTT ATA CCA A-3') [SEQ ID NO: 18] y MCM014 (5'-AAC AAG GCT CAC TTT TTA TTG-3') [SEQ ID NO: 19]. Este producto de PCR se purificó usando el kit High Pure PCR Product Purification (Roche), se sometió a secuenciación de ADN usando el kit Dyes kit (Applied biosystems) y se analizó sobre un analizador genético ABI PRISM 310 por medio de los cebadores MCM013 [SEQ ID NO: 18] y MCM014 [SEQ ID NO: 19] en las condiciones descritas por el proveedor. Usando el programa Clustalx 1.8, se realizó una alineación de las secuencias del polinucleótido, y se mostró en la Figura 3. Una comparación por parejas de identidades mostró que las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 5, 7,9 y 11 se estableció que tenía entre 95 y 98 % de identidad con la SEQ ID NO: 3 (Tabla 2). Usando el programa Clustalx 1.8, se realizó una alineación de las secuencias del polinucleótido, y se mostró en la Figura 4. Una comparación por parejas de identidades mostró que las secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 6, 8, 10 y 12 se estableció que tenía entre 94 y 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 4 (Tabla 3).

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TABLA 1 Características de las cepas de Haemophilus influenzae NT usadas en este estudio

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TABLA 2 Comparación por parejas de secuencias de polinucleótidos

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TABLA 3 Comparación por parejas de secuencias de polipéptidos

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Ejemplo 3

Construcción de plásmido para expresar el BASB210 recombinante A: Clonación de BASB210

Los sitios de restricción BspHI y BglII modificados por ingeniería genética en los cecebadores oli 1 ORF 1681 (5'-TC ATG AAA TTA CGC GCT GTT G-3') [SEQ ID NO:] delantero y oli 2 ORF1681 (5'-AGA TCT TTT ATG GGA TTT TGC CCA C-3') [SEQ ID NO:] inverso, respectivamente, permitieron la clonación direccional del producto de PCR en el plásmido de expresión de E. coli pQE60 de manera que la proteína BASB210 se pueda expresar como una proteína de fusión que contiene un etiqueta de cromatografía de afinidad de (His)6 en el extremo C. El producto de PCR de BASB210 se introdujo primero en el vector de clonación pCRIITOPO vector (In vitrogen) usando células bacterianas Top 10 bacterial cells, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta construcción intermedia ase realizó para facilitarla clonación adicional en un vector de expersión. Los transformantes que contenían la inserción de ADN de BASB210 se seleccionaron mediante análisis de enzima de restricción. Después de digestión, una alícuota de aproximadamente 20 \mul de la reacción se analizó mediante electroforesis sobre gel de agarosa (agarosa al 0,8% en Tris-acetato-EDTA (tampón TAE). Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con UV después de la electroforesis sobre gel y tinción con bromuro de etidio. Un patrón de tamaño molecular de ADN (escala de 1 Kb, Life Technologies) se sometió a electroforesis en paralelo con muestras de ensayo y se usó para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN. El plásmido purificado a partir de los transformantes seleccionados se digirió posteriormente hasta la finalización con enzimas de restricción BspHI y Bg/II como se recomienda por el fabricante (Life Technologies). Después el fragmento de ADN digerido se purificó usando columnas giratorias basadas en gel de sílice antes de la ligadura con el plásmido pQE60.

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B. Producción de vector de expresión

Para preparar el plásmido pQE60 de expresión, se digirió de manera similar hasta finalización con tanto NcoI como BglII. Se usó un exceso de aproximadamente 5 veces molar de los fragmentos digeridos para preparar el vector con el fin de programar la reacción de ligadura. Se realizó un patrón de aproximadamente 20 \mul de reacción de ligadura (aproximadamente 16ºC, aproximadamente 16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica usando la T4 ADN ligasa (aproximadamente 2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Una alícuota de la ligadura (aproximadamente 5 \mul) se usó para transformar células M15(pREP4) electrocompetentes de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Después de un período de crecimiento de aproximadamente 2 - 3 horas a 37ºC en aproximadamente 1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se sembraron en placas de agar LB que contenían ampicilina (100 \mug/ml) y canamicina (30 \mug/ml). Los antibióticos se incluyeron en la selección Las placas se incubaron durante toda una noche a 37ºC durante aproximadamente 16 horas. Se recogieron colonias individuales ApR/KnR con palillos estériles y se usaron para inocular "parches" placas de ApR/KnR en LB reciente así como aproximadamente 1,0 ml de caldo de cultivo LB Ap/Kan. Tanto las placas de parche como el cultivo en caldo se incubaron durante toda una noche a 37ºC en o bien un incubador habitual (placas) o baño de agua con oscilación. Se empleó un análisis de PCR basado en células enteras para verificar que los transformantes contenían la inserción de ADN de BASB210. Aquí, aproximadamente 1,0 ml de caldo de cultivo en LB de Ap/Kn durante toda una noche se transfirió a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y las células se recogieron mediante centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (aproximadamente 3 minutos, temperatura ambiente, aproximadamente 12.000 x g). El sedimento celular se suspendió en aproximadamente 200 \mul de agua estéril y aproximadamente 10 \mul usados para programar una reacción de PCR de aproximadamente 50 \mul de volumen final que contenía cebadores de amplificación tanto directos como inversos de BASB210. La etapa de inicial de desnaturalización a 95ºC se incrementó hasta 3 minutos para asegurar el rompimiento térmico de las células bacterianas y la liberación del ADN del plásmido. Un ciclador térmico modelo 9700 de ABI y un perfil de amplificación térmica de tres etapas y 32 ciclos, es decir 95ºC, 45 segundos; 55 - 58ºC, 45 segundos, 72ºC 1 minutos, se usaron para amplificar el fragmento de BASB210 a partir de las muestras de transformantes lisadas. Después de la amplificación térmica, una alícuota de aproximadamente 20 \mul de la reacción se analizó mediante electroforesis sobre gel de agarosa (agarosa al 0,8% en Tris-acetato-EDTA (tampón TAE). Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con UV después de la electroforesis sobre gel y tinción con bromuro de etidio. Un patrón de tamaño molecular de ADN (escala de 1 Kb, Life Technologies) se sometió a electroforesis en paralelo con muestras de ensayo y se usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Los transformantes que producían el producto de PCR de tamaño esperado se identificaron como cepas que contenían una construcción de expresión de BASB210. El plásmido de expresión que contenía cepas se analizaron después para la expresión inducible de
BASB210 recombinante.

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C. Análisis de expresión de transformantes PCR - positivos

Una alícuota del cultivo de siembra durante toda una noche (aproximadamente 1,0 ml) se inoculó en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía aproximadamente 125 ml de caldo LB de Ap/Kn y se desarrolló a 37ºC con agitación (aproximadamente 250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una D. O. a 600 de aproximadamente 0,5, es decir, fase semilogarítmica (usualmente aproximadamente 1,5 - 2,0 horas). En este momento aproximadamente la mitad del cultivo (aproximadamente 12,5 ml) se transfirió a un segundo matraz de 125 ml y expresión de proteína de BASB210 recombinante se indujo mediante la adición de IPTG (solución 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. La incubación de los cultivos tanto inducidos por IPTG como no inducidos se continuó durante aproximadamente 4 horas adicionales a 37ºC con agitación. Las muestras (aproximadamente 1,0 ml) de cultivos tanto inducidos como no inducidos se retiraron después del período de inducción y las células se recogieron mediante centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 minutos. Los sedimentos celulares individuales se suspendieron en aproximadamente 50 \mul de agua estéril, después se mezclaron con un volumen igual de 2 x de tampón de muestra SDS - PAGE de Lamelli que contenía 2-mercaptoetanol, y se colocaron en un baño de agua en ebullición durante aproximadamente 3 minutos para desnaturalizar la proteína. Se cargaron volúmenes iguales (aproximadamente 15 ml) de lisados celulares tanto inducidos por IPTG como no inducidos por duplicado en gel de poliacrilamida Tris al 12%/glicina (minigeles de 1 mm de espesor, Novex). Las muestras de lisados tanto inducidos como no inducidos se sometieron a electroforesis junto con marcadores de peso molecular teñidos previamente (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de desarrollo SDS/Trs/glicina (Bio Rad). Después de electroforesis, se tiño un gel con azul brillante commassie R250 (BioRad) y después se destiñó para visualizar la(s) proteína(s) BASB210 inducible(s) por IPTG. El segundo gel se sometió a electrotransferencia sobre una membrana PVDF (tamaño de poro 0,45 micrones, Novex) durante aproximadamente 2 horas a 4ºC usando un aparato de transferencia Mini-Protean II de BioRad y tampón de transferencia de metanol (20%) de Towbin. El bloqueo de las incubaciones de membrana y de anticuerpos se realizó de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo anti - RGS (His)3 monoclonal, seguido de un segundo anticuerpo anti - ratón de conejo se conjugó a HPR (QiaGen), se usó para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante BASB210. La visualización del patrón reactivo anti - His se logró usando o bien un sustrato insoluble en ABT o usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

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Ejemplo 4

Producción de BASB210 recombinante Cepa bacteriana

Una cepa de expresión recombinante de E. coli M15 (pREP4) que contiene un plásmido (pQE60) que codifica BASB210 de Haemophilus influenzae NT, se usó para producir masa celular para la purificación de proteína recombinante. La cepa de expresión se cultivó sobre placas de agar LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina ("Ap") y 30 \mug/ml de canamicina ("Km") para asegurar que pQE60 y pREP4 se mantuvieron. Para la criopreservación a -80ºC, la cepa se propagó en caldo LB que contenía la misma concentración de anticuerpos después se mezcló con un volumen igual de caldo LB que contenía glicerol al 30% (p/v).

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Medio

El medio de crecimiento usado para la producción de proteína recombinante estaba constituido por caldo LB (Difco) que contenía 100 \mug/ml de Ap y 30 \mug/ml de Km. Para inducir la expresión de la proteína recombinante BASB210, se añadió al cultivo IPTG (Isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido) (final, 1 mM).

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Fermentación

Un matraz de siembra erlenmeyer de 100 ml, que contenía 50 ml de volumen de trabajo, se inoculó con 0,3 ml de cultivo congelado descongelado rápidamente, o varias colonias de un cultivo en placa de agar selectivo, y se incubó durante aproximadamente 12 horas a 37ºC \pm 1ºC en una plataforma oscilante a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Este cultivo de siembra se usó después para inocular un fermentador de volumen de trabajo de 500 ml que contenía caldo LB y tanto el antibiótico Ap como Km. IPTG (solución madre 1,0 M, preparada en agua estéril) se añadió al erlenmeyer cuando el cultivó alcanzó crecimiento semilogarítmico (aproximadamente 0,5 unidades a 600 de D. O.) Las células se indujeron durante 4 horas después se recogieron mediante centrifugación usando o bien un Heraeus 28RS (Sepatech) o centrífuga de supervelocidad RC5C (Sorvall Instruments). La pasta celular se almacenó a -20ºC hasta procesamiento.

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Compuestos químicos y materiales

Imidazol, y Tritón X-100 se compraron de Merck. Tritón X-100 obtuvo de Sigma. Aprotinina se obtuvo de Sigma Chemical Company, AEBSF esra de ICN-Biochemicals. Todos los demás compuestos químicos eran de calidad reactiva o mejor.

Resina Ni-NTA Superflow y Anticuerpo Penta - His se obtuvieron de QiaGen. El ensayo MicroBCA se obtuvo de Pierce; los filtros Amicon 3 de Millipore. La membrana de diálisis (MWCO12-14000) era de MFPI, Estados Unidos. Marcador de masa molecular (escala BenchMark ladder) era de Life-technologies.

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Ejemplo 5

Expresión y purificación de la proteína recombinante BASB210 en Escherichia coli Extracción - Purificación

Pasta de células de 500 ml de cultivo inducido de IPTG (aproximadamente 4 horas, DO 620 = 0,5) se volvió a suspender en 40 ml de tampón fosfato pH 7,5 que contiene 1 mM AEBSF y 1mM Aprotinina como inhibidores de proteasa. Se lisaron las células en un rompedor de células. El lisado se repatió en detergente con 1,5% de Triton X-114 durante 2 horas a 4ºC y se centrifugó a 3.000 g durante 30 minutos a 4ºC. Se calentó el extracto hasta 37ºC durante 15 minutos y se centrifugó a 1.000 g durante 10 minutos a 20ºC. La fase de Triton (fase inferior) se diluyó hasta 15 ml con tampón fosfato pH 7,5 que contiene 0,3 M NaCl, 0,005% Triton X-100, 10% de glicerol (tampón A) y se aplicó a resina Ni-NTA Superflow en lotes (incubación durante toda una noche). Se lavó la resina con tampón A.

Se eluyeron las proteínas con tampón A que contenía de manera sucesiva 50 mM, 100 mM, y 200 mM Imidazol. Las fracciones que contienen proteína BASB210 se reunieron y se dializaron contra tampón PBS pH 7,4 que contiene 0,1% de Triton X-100. Como se muestra en la Figura 5-A, la proteína BASB210 purificada aparecía en el análisis SDS-PAGE en forma de una banda principal que migra alrededor de 25 kDa (masa molecular relativa estimada). Se estimó que la pureza no era mayor de 90 %. La proteína BASB210 era reactiva contra un anticuerpo monoclonal de ratón inducido contra el motivo 6-Histidina (figura 5-B).

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Ejemplo 6

Producción de Antisueros para BASB210 Recombinante

Antisuero polivalente dirigido contra la proteína BASB210 se generó vacunando conejos con la proteína BASB0230 recombinante purificada. El antisuero polivalente dirigido contra la proteína BASB210 también se generaron mediante vacunación de ratones con la proteína BASB210 recombinante purificada. Se tomaron muestras de sangre de los animales antes de la primera inmunización ("pre-sangrado") y después de la última inmunización.

Los títulos de la proteína anti-BASB210 se midieron mediante un ELISA usando proteína BASB210 recombinante purificada como el antígeno de revestimiento. El título se define como los títulos de punto medio calculados mediante el modelo logístico de 4 parámetros usando el software XLFit. Los antisueros también se usan como el primer anticuerpo para identificar la proteína en una transferencia de Western como se describe en el ejemplo 8 más adelante.

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Ejemplo 7

Caracterización inmunológica: Exposición de superficie de BASB210

Los títulos de la proteína anti-BASB210 se determinan mediante un ELISA usando células completas destruidas con formalina de Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi). El título se define como los títulos de punto medio calculados mediante el modelo logístico de 4 parámetros usando el software XLFit.

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Ejemplo 8

Caracterización inmunológica: Análisis de transferencia de Western

Se desarrollaron varias cepas de NTHi, así como aislamientos clínicos en placas de agar chocolate durante 24 horas a 36ºC y CO_{2} al 5%. Se usaron varias colonias para inocular Brain Herat Infusion (BHI) complementado con NAD y hemina, cada uno a \mug/ml. Los cultivos se desarrollan hasta que la absorbancia a 620 nm era aproximadamente 0,4 y se recogieron las células mediante centrifugación. Después las células se concentraron y se solubilizaron en tampón de muestra PAGE. Las células soubilizadas se resolvieron después en geles de poliacrilamida al 4 - 20% y las proteínas separadas se transfirieron electroforéticamente a membranas PVDF. Todas las incubaciones posteriores se llevaron a cabo usando este tampón de tratamiento previo.

Las membranas PVDF se incuban con suero preinmune o suero inmune de ratón. Las membranas PVDF se lavaron después. Las membranas PVDF se incuban con IgG anti - conejo de oveja o ratón marcada con biotina. Las membranas PVDF se lavaron después 3 veces con tampón de lavado, y se incubaron con estreptavidina - peroxidasa. Las membranas PVDF se lavaron después 3 veces con tampón de lavado, y se desarrollaron con 4-cloro-1-naftol.

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Ejemplo 9

Caracterización inmunológica: Actividad bacteriana

Se examina la actividad citotóxica mediada por complemento de anticuerpos anti-BASB210 para determinar el potencial de vacuna de antisuero de proteína BASB210 que se prepara como se ha descrito anteriormente. Se examinan las actividades del suero pre-inmune y el antisuero anti-BASB210 en la mediación de la destrucción de complemento de NTHi.

Se desarrollan sobre placas cepas de NTHi. Se añaden varias colonias al medio líquido. Se desarrollan cultivos y se recogen hasta que la A620 es aproximadamente 0,4. Después de una etapa de lavado, se suspende y se diluye el sedimento.

Se depositan el suero preinmune yb el suero anti-BASB210 en el primer pocillo de una placa de a 96 pocillos y se depositan diluciones en serie en los otros pocillos de la misma línea. Se añade posteriormente NTHi diluida viva y se incuba la mezcla. Se añade complemento en cada pocillo a una dilución de trabajo definida de antemano en un ensayo de toxicidad.

Cada ensayo incluye un control de complemento (pocillos sin suero que contienen fuente de complemento activo o inactivado), un control positivo (pocillos que contienen suero con un título conocido de anticuerpos bactericidas), un control de cultivo (pocillos sin suero y complemento) y un control de suero (pocillos sin complemento).

Se mide la actividad bactericida de antisuero de conejo o ratón (50% de destrucción de la cepa homóloga).

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Ejemplo 10

Presencia de Anticuerpo para BASB210 en sueros de convalecientes humanos

Se realiza un análisis de transferencia de Western de BASB210 recombinante purificado como se describe en el Ejemplo 5 anterior, excepto que se usa una combinación de suero humano de niños infectados por NTHi como la primera preparación de anticuerpo.

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Ejemplo 11

Eficacia de vacuna de BASB210: potenciación de eliminación del pulmón de NTHi en ratones

Este modelo de ratón se basa en el análisis de invasión de pulmón por NTHi siguiendo una exposición intranasal convencional.

Grupos de 6 ratones BALB/c (hembras, de 6 semanas de edad) se inmunizaron por vía subcutánea con 100 \mul de vacuna correspondiente a una dosis de10 \mug y se reinmunizaron 2 semanas después. Una semana después de la reinmunizaron, los ratones se expusieron mediante instilación de 50 \mul de suspensión bacteriana (5 10^{5} UFC/50 \mul) en el orificio nasal izquierdo bajo anestesia (los ratones se anestesiaron con una combinación de anestésicos cetamina y xilazina, 0,24 mg de xilazina (Rompun) y 0,8 mg de cetamina (Imalgene)/100 \mul). Los ratones se sacrifican 0,5, 6 y 24 horas después de la exposición y los pulmones se retiran asépticamente y se homogeneizan individualmente. El log10 del número medio ponderado de UFC/pulmón se determina contando las colonias desarrolladas en placas de agar GC después de sembrar 20 \mul de 5 diluciones en serie del homogenato. Se calculó la media aritmética del log10 del número de UFC/pulmón y las desviaciones estándar para cada grupo.

Los resultados se analizan estadísticamente aplicando ANOVA de una vía después de asumir igualdad de varianza (comprobada por el ensayo de Brown y Fosythe) y normalidad (comprobada usando el ensayo Shapiro-Wilk). Las diferencias entre grupos se analizan usando el ensayo de intervalo de student de Tukey (HSD).

En este experimento se inmunizaron grupos de ratones se inmunizaron o bien con BASB210 absorbido sobre AlPO4 (10 ug de BASB210 sobre 100 \mug de AlPO_{4}) o con una preparación de células enteras muertas (kwc) de la cepa 3224A de NTHi absorbidas sobre AlPO_{4} (5 10^{8} cells sobre 100 \mug de AlPO_{4}) o con 100 \mug de AlPO_{4} sin antígeno. Se expusieron los ratones con 5 10_{5} CFU de bacterias de la cepa 3224A de NTHi vivas.

El log10 del número medio ponderado de UFC/pulmón y la desviación estándar se calcularon para cada grupo 0,5, 6 y 24 horas después de la exposición. Los ratones inmunizados de manera simulada tenían 5,74 (+/- 0,43) y 4,34 (+/- 0,12) log10 UFC/pulmón 6 y 24 horas después de la exposición, respectivamente.

La preparación de kwc indujo una eliminación en pulmón significativa cuando se compara con el grupo control, 24 horas (diferencia 0,83 log, p = 0,0068) después del desafío. La vacuna de BASB210 indujo una diferencia significativa 0,67 log (+/- 0,17, p = 0,0090) en la eliminación en pulmón cuando se compara con el grupo control 24 horas después de la exposición.

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Ejemplo 12

Inhibición de la adhesión de NTHi sobre células por antisuero anti-BASB210

Este ensayo mide la capacidad de suero anti BASB210 para inhibir la adhesión de bacterias NTHi a células epiteliales. Esta actividad puede evitar la colonización de la nasofaríngea por NTHi. Se incuba un volumen de bacterias en hielo con un volumen de dilución en suero preinmune o anti-BASB210. Esta mezcla se añade posteriormente en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contiene un cultivo de células confluentes que se lava una vez con medio de cultivo para eliminar las trazas de antibiótico. La placa se centrifuga y se incuba.

Después cada pocillo se lava cuidadosamente. Después del último lavado, se añade a los pocillos glicocolato de sodio. Después de la incubación, la capa celular se desecha y se homogeneiza. Las diluciones del homogenato se siembran sobre plaacs de agar y se incuban. Se cuenta el número de colonias de cada placa y se calcula el número de bacterias presentes en cada pocillo.

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Ejemplo 13

Epítopes útiles

Los epítopes de células B de una proteína se localizan principalmente en su superficie. Para predecir los epítopes de células B del polipéptido BASB210.

Se combinaron dos procedimientos. Predicción de la estructura 2D y predicción del índice antigénico. La predicción de la estructura 2D se realizó usando el programa PSIPRED (de David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, Reino Unido) (Fig. 6). Se calculó el índice antigénico a base del procedimiento descrito por Jameson y Wolf (CABIOS 4: 181-186 [1988]). Los parámetros usados en este programa son el índice antigénico y la longitud mínima para un péptido antigénico. Un índice antigénico de 0,9 para un mínimo de 5 aminoácidos consecutivos se usó como umbrales para el programa. Los péptidos que comprenden buenos epítopes de células B potenciales se enumeran en la Tabla 4. Pueden ser útiles (preferiblemente conjugados o unidos de manera recombinante a una proteína mayor) en una composición de vacuna para la prevención de infecciones por ntHi, como podrían ser péptidos similares que comprenden mutaciones conservadoras (preferiblemente 70, 80, 95, 99 ó 100% de identidad a las secuencias de la tabla 4) o truncamientos que comprende 5 o más (por ejemplo, 6, 7, u 8) aminoácidos de los mismos o extensiones que comprende por ejemplo, 1, 2, 3, 5, 10 más aminoácidos en cualquiera de ambos extremos del contexto nativo del polipéptido BASB210 que conserva un epítope eficaz que puede inducir una respuesta inmune en un huésped contra el polipéptido BASB210.

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TABLA 4 Epítopes de células B potenciales de la SEQ ID NO: 2

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Los epítopes de células T auxiliares son péptidos unidos a las moléculas de clase II de HLA y reconocidos por células T auxiliares. La predicción de epítopes de células T auxiliares útiles del polipéptido BASB210 se basó en el procedimiento TEPITOPE descrito por Sturniolo at al. (Nature Biotech. 17: 555 - 561 [1999]). Los péptidos que comprenden buenos, epítopes de células T potenciales se enumeran en la Tabla 5. Éstos pueden ser útiles (preferiblemente conjugados a péptidos, polipéptidos o polisacáridos) para propósitos de vacuna, como pueden ser péptidos similares que comprenden mutaciones conservadoras (preferiblemente 70, 80, 95, 99 ó 100% de identidad a las secuencias más adelante) o truncamientos que comprenden 5 o más (por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 26 ó 30) aminoácidos de los mismos o extensiones que comprende por ejemplo, 1, 2, 3, 5, 10 aminoácidos adicionales en cualquiera o ambos extremos del contexto nativo del polipéptido BASB210 que conserva un epítope auxiliar T eficaz del polipéptido BASB210.

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TABLA 5 Epítopes de células T potenciales de la SEQ ID NO: 2

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Todas las regiones identificadas que contienen epítopes como se han definido anteriormente están con respecto a la SEQ ID NO: 4. Las regiones correspondientes en las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 como se definen por la posición en la tabla 4 y 5 con respecto a SEQ ID NO: 4 y por su péptido correspondiente en la alineación de de la figura 4 para la SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 son también péptidos preferidos de la invención como se describe en este ejemplo.

Materiales depositados

Un depósito de la cepa 3 (cepa 3224A) se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) el 5 de mayo de 2000 y número de depósito de asignado PTA-1816.

El depósito de la cepa de Haemophilus influenzae no tipificable se denomina en esta memoria descriptiva como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen de BASB210 de longitud completa.

La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado en consecuencia, se controlan en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de la secuencia en la presente memoria descriptiva.

El depósito de la cepa depositada se ha hecho en los términos del tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos del procedimiento de patentes. La cepa depositada será irrevocablemente y sin restricción o condición liberadas al público tras la expedición de una patente. La cepa depositada se proporciona meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no es una admisión que un deposito requiere para habilitación tal como la requerida a tenor de 35 U.S.C \NAK 112. Se puede requerir una licencia para preparar, usar o vender la cepa depositada, y los compuestos derivados de ellos, y por lo tanto no se puede conceder tal licencia.

Información de secuencias Secuencias de Polinucleótidos y Polipéptidos de BASB210

SEQ ID NO: 1 secuencia de polinucleótidos de BASB210

12

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SEQ ID NO: 2 secuencia de polipéptidos de BASB210

13

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SEQ ID NO: 3 secuencia de polinucleótidos de BASB210

14

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SEQ ID NO: 4 secuencia de polipéptidos de BASB210

15

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SEQ ID NO: 5 secuencia de polinucleótidos de BASB210

16

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SEQ ID NO: 6 secuencia de polipéptidos de BASB210

17

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SEQ ID NO: 7 secuencia de polinucleótidos BASB210

18

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SEQ ID NO: 8 secuencia de polipéptidos de BASB210

19

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SEQ ID NO: 9 secuencia de polinucleótidos de BASB210

20

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SEQ ID NO: 10 secuencia de polipéptidos de BASB210

21

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SEQ ID NO: 11 secuencia de polinucleótidos de BASB210

22

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SEQ ID NO: 12 secuencia de polipéptidos de BASB210

23

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SEQ ID NO: 13 secuencia de polinucleótidos cadena arriba del inicio predicho

Codón del polinucleótido BASB210

24

SEQ ID NO: 14

100

SEQ ID NO: 15

101

SEQ ID NO: 16

102

SEQ ID NO: 17

103

SEQ ID NO: 18

104

SEQ ID NO: 19

105

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:

(a): una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 97% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10 en la longitud completa de dicha secuencia; y

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1 en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8 y 10, en la longitud completa de dicha secuencia.

3. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12.

4. Un polipéptido aislado de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12.

5. Un fragmento inmunogénico del polipéptido of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12 en el que el fragmento inmunogénico tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12, en el que el fragmento inmunogénico, si es necesario cuando se acopla a un vehículo, es capaz de inducir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12.

6. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dicho polipéptido es parte de una proteína de fusión mayor.

7. Un polinucleótido aislado que codifica un fragmento inmunogénico según la reivindicación 5.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 97% de identidad con una secuencia de ADN seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 3 o al menos 98% de identidad con la Secuencia de ADN de la SEQ ID NO: 5 o al menos 99% de identidad con una Secuencia de ADN seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 7 y 9 en la longitud completa de dicha secuencia; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

9. El polinucleótido aislado según la reivindicación 8 en el que la identidad es al menos 99% con una secuencia de ADN seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 1, 3 y 5.

10. Un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 y 11.

11. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12 que se puede obtener mediante la selección de una genoteca apropiada en condiciones rigurosas de hibridación con una sonda marcada que tiene la secuencia correspondiente de ADN de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 u 11 o un fragmento de las mismas.

12. Un vector de expresión o un microorganismo vivo recombinante que comprende un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 - 11.

13. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 12 o una fracción subcelular o membrana de dicha célula que expresa un polipéptido aislado o fragmento inmunogénico como se define en las reivindicaciones 1 a 6.

14. Un sistema de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.

15. Un procedimiento para producir un polipéptido o fragmento inmunogénico como se define en las reivindicaciones 1 a 6 que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 13 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

16. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 que comprende transformar una célula huésped con el vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

17. Una vesícula de membrana externa bacteriana aislada que comprende un polipéptido o fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que se puede obtener a partir de una célula huésped que comprende un vector de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o fragmento inmunogénico que tiene una región modificada cadena arriba que contiene un elemento regulador heterólogo, que modula la expresión natural del polipéptido o fragmento inmunogénico.

18. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido o fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. La composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19 en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de H. influenzae no tipificalble.

21. Un anticuerpo generado contra el polipéptido o fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

22. Un procedimiento de diagnosis de la infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media, que comprende identificar un polipéptido o fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un anticuerpo que es inmunoespecífico para dicho polipéptido o fragmento inmunogénico, presente dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener tal infección.

23. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

24. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento y prevención de infección otitis media.

25. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un polipéptido que comprende el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

26. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un polipéptido que comprende el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento y prevención de infección de otitis media.

27. Uso de composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

28. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

29. Uso de composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento y prevención de infección de otitis media.

30. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 en la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento y prevención de infección de otitis media.

31. Una composición terapéutica que comprende al menos un anticuerpo contra el polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, y un vehículo farmacéutico adecuado, para uso en el tratamiento de seres humanos de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

32. Una composición terapéutica que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra el polipéptido de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéutico adecuado, para uso en el tratamiento de seres humanos con infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

33. Una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, o un polipéptido que comprende el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5, para el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

34. Una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, o un polipéptido que comprende el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5, para el tratamiento y prevención de infección de otitis media.

35. Una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz of un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento inmunogénico of reivindicación 5 o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, para el tratamiento o prevención de infección de neumonía, bronquitis, sinusitis u otitis media.

36. Una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz of un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento inmunogénico de la reivindicación 5 o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en la longitud completa de dicha secuencia, para el tratamiento y prevención de infección de otitis media.