DE69921649T2

DE69921649T2 - Moraxella catarrhalis pilq proteine

Info

Publication number: DE69921649T2
Application number: DE69921649T
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Ruelle; Carlota Vinals-Bassols
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2019-06-01
Also published as: AU4504999A; EP1082436B1; EP1082436A2; CA2330240A1; US6706269B1; DE69921649D1; WO1999064448A3; WO1999064448A2; ATE281524T1; GB9812163D0; ES2232144T3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Polynukleotide (nachfolgend bezeichnet als "BASB031-Polynukleotid(e)"), durch sie codierte Polypeptide (bezeichnet nachfolgend als "BASB031" oder "BASB031-Polypeptid(e)"), rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide und Polynukleotide, einschließlich Impfstoffen gegen bakterielle Infektionen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Diagnosetests zum Nachweis einer Infektion mit bestimmten Pathogenen.
Hintergrund der Erfindung
Moraxella catarrhalis (ebenfalls als Branhamella catarrhalis bezeichnet) ist ein Gram-negatives Bakterium, das häufig aus den humanen oberen Atemwegen isoliert wird. Es ist verantwortlich für verschiedene Pathologien, von denen die hauptsächlichen Mittelohrentzündung bei Kleinkindern und Kindern und Lungenentzündung bei älteren Menschen sind. Es ist ebenfalls verantwortlich für Sinusitis, Krankenhausinfektionen und weniger häufig für invasive Erkrankungen.
Mittelohrentzündung ist eine bedeutende Krankheit in der Kindheit, sowohl nach der Anzahl der Fälle als auch nach ihren potentiellen Folgen. Mehr als 3,5 Millionen Fälle werden jedes Jahr in den Vereinigten Staaten aufgezeichnet, und es wird geschätzt, daß 80 % der Kinder wenigstens einen Fall von Mittelohrentzündung erfahren haben, bevor sie das Alter von 3 erreichen (J.O. Klein, (1994) Clin. Inf. Dis. 19:823). Wenn sie unbehandelt bleibt oder chronisch wird, kann diese Krankheit zu Hörverlusten führen, die temporär (im falle von Flüssigkeitsansammlung im Mittelohr) oder andauernd (falls der Hörnerv beschädigt wird) sein können. Bei Kindern können solche Hörverluste für eine verzögerte Spracherlernung verantwortlich sein.
Drei Bakterienarten werden primär aus dem Mittelohr von Kindern mit Mittelohrentzündung isoliert: Streptococcus pneumoniae, nicht-typisierbarer Haemophilus influenza (NTHi) und M. catarrhalis. Sie sind in 60 bis 90 % der Fälle vorhanden. Eine Übersicht über kürzliche Untersuchungen zeigt, daß S. pneumoniae und NTHi beide ca. 30 % darstellen und M. catarrhalis ca. 15 % der Mittelohrfälle darstellt (T.F. Murphy (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Andere Bakterien konnten aus dem Mittelohr isoliert werden (H. influenza Typ B, S. pyogenes etc.), aber mit einer viel geringeren Häufigkeit (2 % der Fälle oder weniger).
Epidemiologische Daten weisen darauf hin, daß für die im Mittelohr gefundenen Pathogene die Besiedlung der oberen Atemwege eine absolute Voraussetzung für die Entwicklung einer Ohrentzündung ist; andere sind jedoch auch erforderlich, um zur Krankheit zu führen (D.P. Dickinson et al., (1988) J. Infect. Dis. 158:205, H.L. Faden et al., (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612). Diese sind wichtig, um die Wanderung der Bakterien in das Mittelohr über die eustachischen Röhren auszulösen, gefolgt vom Beginn eines entzündlichen Prozesses. Diese Faktoren sind bis heute unbekannt. Es wurde postuliert, daß eine vorübergehende Anomalie des Immunsystems, z.B. im Anschluß an eine Virusinfektion, eine Unfähigkeit zur Bekämpfung der Besiedlung der Atemwege verursachen könnte (H.L. Faden et al., (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Eine alternative Erklärung besteht darin, daß der Kontakt mit Umweltfaktoren eine wichtigere Besiedlung einiger Kinder erlaubt, die anschließend anfällig für die Entwicklung von Mittelohrentzündung wegen der anhaltenden Gegenwart von Mittelohr-Pathogenen werden (T.F. Murphy (1996) Microbiol. Rev. 60: 267).
Die Immunreaktion auf M. catarrhalis ist schlecht charakterisiert. Die Analyse der Stämme, die sequentiell aus dem Nasenrachenraum von Säuglingen im Alter von 0 bis 2 Jahren isoliert wurden, deutet darauf hin, daß sie häufig neue Stämme erhalten und eliminieren. Dies deutet darauf hin, daß eine wirksame Immunreaktion gegen diese Bakterien durch die befallenen Kinder aufgestellt wird (H.L. Faden et al., (1994) J. Infect. Dis. 169:1312).
Bei den meisten untersuchten Erwachsenen wurden bakterizide Antikörper identifiziert (A.J. Chapman et al., (1985) J. Infect. Dis. 151:878). Stämme von M. catarrhalis stellen Variationen in ihrer Fähigkeit zum Widerstand gegen bakterizide Serumaktivität dar: allgemein sind Isolate aus erkrankten Personen resistenter als diejenigen, die nur besiedelt sind (C. Hol et al., (1993) Lancet 341:1281, K.L. Jordan et al., (1990) Am. J. Med. 88 (Suppl. 5A):28S). Serumresistenz könnte deshalb als ein Virulenzfaktor der Bakterien betrachtet werden. Eine Opsonisierungsaktivität wurde in den Seren von Kindern beobachtet, die sich von einer Mittelohrentzündung erholen.
Die durch diese unterschiedlichen Immunreaktionen beim Menschen getroffenen Antigene wurden nicht identifiziert, mit der Ausnahme von OMP B1, ein 84 kDa Protein, dessen Expression durch Eisen reguliert wird und das durch die Seren von Patienten mit Pneumonie erkannt wird (S. Sethi et al., (1995) Infect. Immun. 63:1516), und von UspA1 und UspA2 (D. Chen et al., (1999) Infect. Immun. 67:1310).
Einige andere Membranproteine, die sich auf der Oberfläche von M. catarrhalis befinden, wurden unter Verwendung eines biochemischen Verfahrens oder wegen ihrer Beteiligung an der Induktion einer Schutzimmunität charakterisiert (zur Übersicht vgl. T.F. Murphy, (1996) Microbiol. Rev. 60:267). In einem Pneumoniemodell der Maus begünstigt die Gegenwart von Antikörpern, die gegen einige von Ihnen (UspA, CopB) erzeugt werden, eine schnellere Beseitigung der pulmonalen Infektion. Ein anderes Polypeptid (OMP CD) ist hoch konserviert unter den M. catarrhalis-Stämmen und stellt Homologien mit einem Porin von Pseudomonas aeruginosa dar, von dem gezeigt wurde, daß es wirksam gegen dieses Bakterien in Tiermodellen ist.
P.R. Martin et al., "Characterization of pilQ, a new gene required for the biogenesis of type 4 fimbrial in Pseudomonas aeruginosa". Molecular Microbiology, Bd. 9, Nr. 4, August 1993, S. 857-868, offenbart das pilQ-Nukleotid und die Aminosäuresequenz aus Pseudomonas aeruginosa.
Die Häufigkeit von Moraxella catarrhalis-Infektionen ist in den letzten Jahrzehnten dramatisch angestiegen. Dies wurde dem Auftreten von mehrfach Antibiotika-resistenten Stämmen und einer zunehmenden Bevölkerung mit geschwächtem Immunsystem zugeschrieben. Es ist nicht mehr unüblich, Moraxella catarrhalis-Stämme zu isolieren, die resistent gegen einige oder alle der Standardantibiotika sind. Dieses Phänomen hat eine unerfüllte Notwendigkeit und Nachfrage nach neuen antimikrobiellen Mitteln, Impfstoffen, Wirkstoff-Durchmusterungsverfahren und diagnostischen Tests für diesen Organismus geschaffen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft BASB031, insbesondere BASB031-Polypeptide und BASB031-Polynukleotide, rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Polypeptide und Polynukleotide, einschließlich der Prävention und Behandlung von Moraxella-Infektion. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung diagnostische Tests zum Nachweis von Krankheiten, die mit Moraxella-Infektionen verbunden sind, und von Zuständen, die mit solchen Infektionen verbunden sind, wie Tests zum Nachweis der Expression oder Aktivität von BASB031-Polynukleotiden oder -Polypeptiden.
Im einzelnen wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4, 6 bzw. 8 hat.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polypeptid von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:8 bereitgestellt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein immunogenes Fragment des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, worin das immunogene Fragment eine Antikörperreaktion erzeugen kann (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger), die spezifisch das Polypeptid von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 erkennt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4, 6 oder 8 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4, 6 bzw. 8 hat; oder eine zum isolierten Polynukleotid komplementäre Nukleotidsequenz.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isolierters Polynukleotid bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 95 % Identität mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit SEQ ID NO:4, 6 oder 8 codiert, über die gesamte codierende Region hat; oder eine zum isolierten Polynukleotid komplementäre Nukleotidsequenz.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:3, 5 oder 7 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:3, 5 bzw. 7 hat; oder eine zum isolierten Polynukleotid komplementäre Nukleotidsequenz.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:8 codiert.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das das Polynukleotid von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 umfaßt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 codiert, erhältlich durch Durchmustern einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde mit der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 oder einem Fragment davon.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor oder ein rekombinanter lebender Mikroorganismus bereitgestellt, der ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid umfaßt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die den Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung umfaßt, oder eine subzelluläre Fraktion oder eine Membran der Wirtszelle, die ein isoliertes Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 besteht, oder SEQ ID NO:2 ist.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptids bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 besteht, oder SEQ ID NO:2 ist, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die zur Erzeugung des Polypeptids ausreichend sind, und Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Expression eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor, der wenigstens eines der Polynukleotide umfaßt, und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression eines der Polynukleotide ausreichend sind.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge des Polypeptids der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein für das Polypeptid von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 oder ein immunogenes Fragment davon immunspezifischer Antikörper bereitgestellt, worin das immunogene Fragment eine Antikörperreaktion erzeugen kann (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger), die spezifisch das Polypeptid von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 erkennt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Moraxella-Infektion bereitgestellt, umfassend das Identifizieren eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder eines Antikörpers, der für das Polypeptid immunspezifisch ist, vorhanden innerhalb einer biologischen Probe aus einem für eine solche Infektion verdächtigen Tier.
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines Polypeptids oder Polynukleotids der vorliegenden Erfindung umfaßt, in der Herstellung eines Mediums zur Behandlung oder Prävention einer Moraxella-Infektion bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine therapeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die in der Behandlung von Menschen mit einer Moraxella catarrhalis-Infektion nützlich ist, umfassend wenigstens einen gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörper und einen geeigneten Träger.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft BASB031-Polypeptide und -Polynukleotide, wie sie nachfolgend im größeren Detail beschrieben werden. Insbesondere betrifft die Erfindung Polypeptid und Polynukleotide von BASB031 von Moraxella catarrhalis, das durch Aminosäuresequenzhomologie mit dem P. aeruginosa PilQ Fimbrien-Assembly-Proteinpolypeptid verwandt ist. Die Erfindung betrifft speziell BASB031 mit den in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 und SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 dargestellten Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen. Es ist selbstverständlich, daß die im nachfolgenden Sequenzprotokoll als "DNA" aufgeführten Sequenzen eine exemplarische Darstellung einer Ausführungsform der Erfindung darstellen, da die Durchschnittsfachleute er kennen werden, daß solche Sequenzen nützlich in Polynukleotiden allgemein, einschließlich Ribopolynukleotiden, eingesetzt werden können.
Polypeptide
In einem Aspekt der Erfindung werden Polypeptide von Moraxella catarrhalis bereitgestellt, hier als "BASB031" und "BASB031-Polypeptide" bezeichnet werden, sowie biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Varianten davon und diese umfassende Zusammensetzungen.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner vor:

(a) ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97-99 % Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:4, 6 oder 8 oder eine exakte Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 hat;
(b) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97-99 % Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:3, 5 oder 7 oder eine exakte Identität mit SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:1, 3, 5 bzw. 7 hat; oder
(c) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97-99 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4, 6 oder 8 oder eine exakte Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 hat.

Die in SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 bereitgestellten BASB031-Polypeptide sind die BASB031-Polypeptid aus den Moraxella catarrhalis-Stämmen Mc2931 (ATCC 43617), Mc2911 und Mc2969.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein immunogenes Fragment eines BASB031-Polypeptids bereit, d.h. einen zusammenhängenden Teil des BASB031-Polypeptids, der die gleiche oder im wesentlichen die gleiche immunogene Aktivität wie das Polypeptid hat, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 umfaßt; d.h. das Fragment (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger) kann ein Immunreaktion erzeugen, die das BASB031-Polypeptid erkennt. Ein solche immunogenes Fragment kann z.B. das BASB031-Polypeptid einschließen, dem eine N-terminale Leitsequenz und/oder eine Transmembrandomäne und/oder C-terminale Ankerdomäne fehlt. In einem bevorzugten Aspekt umfaßt das immunogene Fragment von BASB031 gemäß der Erfindung im wesentlich die gesamte extrazelluläre Domäne eines Polypeptids, das wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97-99 % Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:4, 6 oder 8 über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, 6 bzw. 8 hat.
Ein Fragment ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die völlig gleich wie ein Teil, aber nicht die Gesamtheit einer Aminosäuresequenz eines Polypeptids in der Erfindung ist. Wie bei BASB031-Polypeptiden können Fragmente "freistehend" sein oder innerhalb eines größeren Polypeptids enthalten sein, in welchem sie einen Teil oder eine Region bilden, am meisten bevorzugt als einzelne zusammenhängende Region in einem einzelnen größeren Polypeptid.
Bevorzugte Fragmente schließen z.B. Verkürzungspolypeptide mit einem Teil einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 oder von Varianten davon ein, wie eine kontinuierliche Reihe von Resten, die eine Amino- und/oder Carboxyl-terminale Aminosäuresequenz einschließt. Abbauformen der Polypeptide der Erfindung, die durch oder in einer Wirtszelle erzeugt werden, sind ebenfalls bevorzugt. Ferner bevorzugt sind Fragmente, die durch strukturelle oder funktionelle Attribute gekennzeichnet sind, wie Fragmente, die alpha-Helix- und alpha-Helix-bildende Regionen, beta-Faltblatt- und beta-Faltblatt-bildende Regionen, Turn- und Turn-bildende Regionen, Coil- und Coil-bildende Regionen, hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, flexible Regionen, Oberflächen-bildende Regionen, Substrat-bindende Regionen und Regionen mit hohem Antigenindex umfassen.
Weiter bevorzugte Fragmente schließen ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuresequenz aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 umfaßt, oder ein isoliertes Polypeptid ein, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren umfaßt, die aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 trunkiert oder deletiert sind.
Fragmente der Polypeptide der Erfindung können zur Erzeugung des entsprechenden Polypeptids voller Länge durch Peptidsynthese eingesetzt werden; daher können diese Fragmente als Zwischenstufen zur Erzeugung der Polypeptide voller Länge der Erfindung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt sind Varianten, in denen mehrere, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 oder 1 Aminosäuren in jeder Kombination substituiert, deletiert oder addiert sind.
Die Polypeptide oder immunogenen Fragmente der Erfindung können in Form des "reifen" Proteins sein oder können ein Teil eines größeren Proteins sein, wie eines Vorläufers oder eines Fusionsproteins. Es ist häufig vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzuschließen, die sekretorische oder Leitsequenzen, Prosequenzen, Sequenzen, die die Reinigung unterstützen, wie multiple Histidinreste, oder eine zusätzliche Sequenz für Stabilität während der rekombinanten Herstellung enthält. Außerdem wird ebenfalls die Addition von exogenen Polypeptid- oder Lipidschwanz- oder Polynukleotidsequenzen zur Erhöhung des immunogenen Potentials des fertigen Moleküls erwogen.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung gentechnisch veränderte lösliche Fusionsproteine, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon und verschiedene Teile der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen der verschiedenen Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) umfassen. Bevorzugt als Immunoglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von humanem IgG, insbesondere IgG1, wobei die Fusion in der Gelenkregion erfolgt. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil einfach durch Einfügen einer Spaltsequenz entfernt werden, die mit Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann.
Außerdem betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine durch Gentechnik und deren Verwendung zur Wirkstoffdurchmusterung, Diagnose und Therapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren. Beispiele für die Fusionsproteintechnik können in WO 94/29458 und WO 94/22914 gefunden werden.
Die Proteine können chemisch konjugiert oder als rekombinante Fusionsproteine exprimiert werden, was die Erzeugung erhöhter Mengen in einem Expressionssystem im Vergleich mit dem nicht-fusionierten Protein erlaubt. Der Fusionspartner kann bei der Bereitstellung von T-Helferepitopen helfen (immunologischer Fusionspartner), bevorzugt von T-Helferepitopen, die durch Menschen erkannt werden, oder kann bei der Expression des Proteins mit höheren Ausbeuten als das native rekombinante Protein helfen (Expressionsverstärker). Bevorzugt wird der Fusionspartner sowohl ein immunologischer Fusionspartner als auch ein Expressionsverstärkungspartner sein.
Fusionspartner schließen Protein D aus Haemophilus influenzae und das Nichtstrukturprotein aus dem Grippevirus, NS1 (Hämagglutinin), ein. Ein anderer Fusionspartner ist das als LytA bekannte Protein. Bevorzugt wird der C-terminale Teil des Moleküls verwendet. LytA stammt aus Streptococcus pneumoniae, die eine N-Acetyl-L-Alanin-Amidase synthetisieren, Amidase-LytA (codiert durch das LytA-Gen {Gene, 43 (1986) S. 265-272}), ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen im Peptidoglycan-Gerüst abbaut. Die C-terminale Domäne des LytA-Proteins ist verantwortlich für die Affinität an das Cholin oder an einige Cholin-Analoge, wie DEAE. Diese Eigenschaft wurde zur Entwicklung von E. coli C-LytA-exprimierenden Plasmiden ausgenützt, die nützlich zur Expression von Fusionsproteinen sind. Die Reinigung von Hybridproteinen, die das C-LytA-Fragment an ihrem Amino-Terminus enthalten, wurde beschrieben {Biotechnology: 10 (1992) S. 795-798}. Es ist möglich, den Repeat-Teil des LytA-Moleküls zu verwenden, der im C-terminalen Ende beginnend bei Rest 178 gefunden wird, z.B. Reste 188-305.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Varianten der zuvor genannten Polypeptide ein, d.h. Polypeptide, die sich von der Referenz durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wobei ein Rest durch einen anderen mit ähnlichen Eigenschaften substituiert ist. Solche typischen Substitutionen sind zwischen Ala, Val, Leu und Ile; zwischen Ser und Thr; zwischen den sauren Resten Asp und Glu; zwischen Asn und Gln; und zwischen den basischen Resten Lys und Arg; oder zwischen den aromatischen Resten Phe und Tyr.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auf jede geeignete Weise hergestellt werden. Solche Polypeptide schließen isolierte natürlich vorkommende Polypeptide, rekombinant erzeugte Polypeptide, synthetisch erzeugte Polypeptide oder Polypeptide ein, die durch eine Kombination dieser Verfahren erzeugt wurden. Mittel zur Herstellung solcher Polypeptide sind allgemein fachbekannt.
Es ist am meisten bevorzugt, daß ein Polypeptid der Erfindung aus Moraxella catarrhalis stammt, jedoch kann es bevorzugt aus anderen Organismenen der gleichen taxonomischen Gattung erhalten werden. Ein Polypeptid der Erfindung kann auch z.B. aus Organismen der gleichen taxonomischen Familie oder Ordnung erhalten werden.
Polynukleotide
Es ist ein Ziel der Erfindung, Polynukleotide bereitzustellen, die BASB031-Polypeptide codieren, insbesondere Polynukleotide, die das hier als BASB031 bezeichnete Polypeptid codieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Polynukleotid eine Region, die BASB031-Polypeptide codiert, die eine in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 dargestellte Sequenz umfassen, was ein Gen voller Länge oder eine Variante davon einschließt.
Die in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 bereitgestellten BASB031-Polynukleotide sind die BASB031-Polynukleotide aus den Moraxella catarrhalis-Stämmen Mc2931 (ATCC 43617), Mc2911 und Mc2969.
Als ein weiterer Aspekt der Erfindung werden isolierte Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die BASB031-Polypeptide und -Polynukleotide codieren und/oder exprimieren, insbesondere Moraxella catarrhalis-BASB031-Polypeptide und -Polynukleotide, einschließlich von z.B. ungereiften RNAs, Ribozym-RNAs, mRNAs, cDNAs, genomischen DNAs, B- und Z-DNAs. Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Polynukleotide und Polypeptide und Varianten davon sowie diese umfassende Zusammensetzungen ein.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Polynukleotide, die wenigstens ein Gen voller Länge einschließen, das ein BASB031-Polypeptid mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 codiert, und damit eng verwandte Polynukleotide und Varianten davon.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein BASB031-Polypeptid aus Moraxella catarrhalis bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 umfaßt oder daraus besteht, oder eine Variante davon.
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Informationen, wie z.B. der in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 dargestellten Polynukleotidsequenz, kann ein Polynukleotid der Erfindung, das BASB031-Polypeptid codiert, unter Verwendung von Standard-Klonierungs- und -Durchmusterungsverfahren erhalten werden, wie z.B. durch diejenigen zur Klonierung und Sequenzierung chromosomaler DNA-Fragmente aus Bakterien unter Verwendung von Moraxella catarrhalis-Catlin-Zellen als Ausgangsmaterial, gefolgt vom Erhalt eines Klons voller Länge. Zum Beispiel wird zum Erhalt einer Polynukleotidsequenz der Erfindung, wie einer in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 angegebenen Polynukleotidsequenz, typischerweise eine Bibliothek von Klonen chromosomaler DNA von Moraxella catarrhalis Catlin in E. coli oder einem anderen geeigneten Wirt mit einem radiomarkiertem Oligonukleotid, bevorzugt einem 17-mer oder länger, das aus einer Partialsequenz stammt, sondiert. Klone, die DNA tragen, die identisch mit derjenigen der Sonde ist, können dann unter Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen unterschieden werden. Durch Sequenzieren der so identifizierten individuellen Klone durch Hybridisierung mit Sequenzierungsprimern, die aus der ursprünglichen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz konstruiert wurden, ist es dann möglich, die Polynukleotidsequenz in beide Richtungen zu verlängern, um eine Gensequenz voller Länge zu bestimmen. Zweckmäßig wird eine solche Sequenzierung z.B. unter Verwendung denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt, die aus einem Plasmidklon hergestellt wurde. Geeignete Techniken werden beschrieben von T. Maniatisch, E.F. Fritsch und Sambrook et al., "MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). (Siehe insbesondere "Screening By Hybridization 1.90" und "Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70"). Direkte genomische DNA-Sequenzierung kann ebenfalls durchgeführt werden, um eine Gensequenz voller Länge zu erhalten. Illustrativ für die Erfindung wurde jedes in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 dargestellte Polynukleotid in einer aus Moraxella catarrhalis stammenden DNA-Bibliothek gefunden.
Außerdem enthält jede in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 dargestellte DNA-Sequenz ein offenes Leseraster, das ein Protein mit etwa der Anzahl von Aminosäureresten codiert, die in SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 dargestellt sind, mit einem abgeleiteten Molekulargewicht, das unter Verwendung von Molekulargewichtswerten der Aminosäurereste berechnet werden kann, die den Fachleuten allgemein bekannt sind.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:1 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nr. 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nr. 1420 von SEQ ID NO:1 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:2.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:3 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nr. 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nr. 1420 von SEQ ID NO:3 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:4.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:5 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nr. 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nr. 1420 von SEQ ID NO:5 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:6.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:7 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nr. 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nr. 1420 von SEQ ID NO:7 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:8.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid vor, das folgendes umfaßt oder daraus besteht:

(a) eine Polynukleotidsequenz, die wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97-99 % Identität mit SEQ ID NO:3, 5 oder 7 oder eine exakte Identität mit SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:1, 3, 5 bzw. 7 hat; oder
(b) eine Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97-99 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4, 6 oder 8 oder 100 % genaue Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2, 4, 6 bzw. 8 hat.

Ein Polynukleotid, das ein Polypeptid in der vorliegenden Erfindung codiert, einschließlich von Homologen und Orthologen aus anderen Arten als Moraxella catarrhalis, kann durch ein Verfahren erhalten werden, das die Schritte der Durchmusterung einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (z.B. unter Verwendung einer Temperatur im Bereich von 45-65°C und einer SDS-Konzentration von 0,1-1 %) mit einer markierten oder detektierbaren Sonde, die aus der Sequenz von SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 oder einem Fragment daraus besteht oder diese umfaßt, und des Isolierens eines Gens voller Länge und/oder genomischer Klone, die die Polynukleotidsequenz enthalten, umfaßt.
Die Erfindung stellt eine Polynukleotidsequenz bereit, die über ihre gesamte Länge mit einer codierenden Sequenz (offenes Leseraster) in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 identisch ist. Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung wird eine codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder ein Fragment davon, als solches oder als codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder ein Fragment in einem Leseraster mit einer anderen codierenden Sequenz, wie z.B. einer Sequenz, die eine Leit- oder sekretorische Sequenz, eine Prä- oder Pro- oder Präpro-Protein-Sequenz codiert. Das Polynukleotid der Erfindung kann ebenfalls wenigstens eine nicht-codierende Sequenz enthalten, z.B. einschließlich, aber nicht beschränkt auf wenigstens eine nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenz, wie die transkribierten, aber nicht-translatierten Sequenzen, Terminationssignale (wie rho-abhängige und rho-unabhängige Terminationssignale), Ribosom-Bindunsstellen, Kozak-Sequenzen, Sequenzen die mRNA stabilisieren, Introns und Polyadenylierungssignale. Die Polynukleotidsequenz kann ebenfalls eine zusätzliche codierende Sequenz umfassen, die zusätzliche Aminosäuren codiert. Z.B. kann eine Markersequenz codiert werden, die die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexa-Histidinpeptid, wie im pQE-Vektor bereitgestellt (QiaGen, Inc.) und beschrieben in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989), oder ein HA-Peptid-Tag (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)), von denen beide nützlich in der Reinigung der an sie fusionierten Polypeptidsequenz sein können. Polynukleotide der Erfindung können ebenfalls einschließen, aber sind nicht beschränkt auf Polynukleotide, die ein Strukturgen und seine natürlich verbundenen Sequenzen umfassen, die die Genexpression kontrollieren.
Die Nukleotidsequenz, die BASB031-Polypeptid von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 codiert, kann identisch mit der Polypeptid-codierenden Sequenz sein, die in den Nukleotiden 1 bis 1419 von SEQ ID NO: 1, 3, 5 bzw. 7 enthalten ist. Alternativ kann sie eine Sequenz sein, die als Ergebnis der Redundanz (Degeneration) des genetischen Codes ebenfalls das Polypeptid mit SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 codiert.
Der Begriff "Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert", wie er hier verwendet wird, umfaßt Polynukleotide, die eine Sequenz einschließen, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, insbesondere ein bakterielles Polypeptid und ganz besonders ein Polypeptid von Moraxella catarrhalis BASB031 mit einer in SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 dargestellten Aminosäuresequenz. Der Begriff umfaßt ebenfalls Polynukleotide, die eine einzelne zusammenhängende Region oder diskontinuierliche Regionen einschließen, die das Polypeptid codieren (z.B. Polynukleotide, die durch einen integrierten Phagen, eine integrierte Insertionssequenz, eine integrierte Vektorsequenz, eine integriertes Transposonsequenz oder aufgrund von RNA-Editing oder genomischer DNA-Reorganisation unterbrochen sind), zusammen mit zusätzlichen Regionen, die ebenfalls codierende und/oder nicht-codierende Sequenzen enthalten können.
Die Erfindung betrifft ferner Varianten der hier beschriebenen Polynukleotide, die Varianten eines Polypeptids mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 codieren. Fragmente von Polynukleotiden der Erfindung können z.B. zur Synthese von Polynukleotiden voller Länge der Erfindung verwendet werden.
Weitere besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die BASB031-Varianten codieren, die die Aminosäuresequenz von BASB031-Polypeptid mit SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 haben, worin mehrere, einige, 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste substituiert, modifiziert, deletiert und/oder addiert sind, in jeder Kombination. Speziell bevorzugt unter diesen sind stumme Substitutionen, Additionen und Deletionen, die nicht die Eigenschaften und Aktivitäten von BASB031-Polypeptid verändern.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Polynukleotide, die wenigstens 85 % identisch über ihre gesamte Länge mit einem Polynukleotid sind, das ein BASB031-Polypeptid mit einer in SEQ ID NO:4, 6 oder 8 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, und Polynukleotide, die zu solchen Polynukleotiden komplementär sind. Alternativ sind höchst bevorzugt Polynukleotide, die eine Region umfassen, die wenigstens 90 % identisch über ihre gesamte Länge mit einem Polynukleotid ist, das BASB031-Polypeptid codiert, und dazu komplementäre Polynukleotide. In dieser Hinsicht sind Polynukleotide mit wenigstens 95 % Identität über ihre gesamte Länge dazu besonders bevorzugt. Außerdem sind diejenigen mit wenigstens 97 % hoch bevorzugt unter denjenigen mit wenigstens 95 %, und unter diesen sind diejenigen mit wenigstens 98 % und wenigstens 99 % besonders hoch bevorzugt, wobei wenigstens 99 % stärker bevorzugt ist.
Bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die Polypeptide codieren, die im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid beibehalten, das durch eine DNA mit SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 codiert wird.
Gemäß bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung werden Polynukleotide bereitgestellt, die mit BASB031-Polynukleotidsequenzen, wie mit denjenigen Polynukleotiden in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7, hybridisieren, insbesondere unter stringenten Bedingungen.
Die Erfindung betrifft ferner Polynukleotide, die mit den hier bereitgestellten Polynukleotidsequenzen hybridisieren. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung speziell Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hier beschriebenen Polynukleotiden hybridisieren. Wie hier verwendet, bezeichnen die Begriffe "stringente Bedingungen" und "stringente Hybridisierungsbedingungen" eine Hybridisierung, die nur auftritt, falls wenigstens 95 % und bevorzugt wenigstens 97 % Identität zwischen den Sequenzen vorliegt. Ein spezifisches Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die folgendes umfaßt: 50 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml von denaturierter, gescherter Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen des Hybridisierungsträgers in 0,1 × SSC bei ca. 65°C. Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind allgemein bekannt und exemplarisch angegeben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, NY (1989), insbesondere Kapitel 11. Lösungshybridisierung kann ebenfalls mit den durch die Erfindung bereitgestellten Polynukleotidsequenzen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Polynukleotid bereit, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt oder daraus besteht, die durch Durchmusterung einer geeigneten Bibliothek erhalten wird, die das vollständige Gen für eine in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 dargestellte Polynukleotidsequenz enthält, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde mit der Sequenz der in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 dargestellten Polynukleotidsequenz oder einem Fragment davon; und Isolieren der Polynukleotidsequenz. Zum Erhalt eines solchen Polynukleotids nützliche Fragmente schließen z.B. Sonden und Primer ein, die vollständig hier an anderer Stelle beschrieben werden.
Wie hier an anderer Stelle in bezug auf Polynukleotidtests der Erfindung erörtert, können z.B. die Polynukleotide der Erfindung als Hybridisierungssonde für RNA, cDNA und genomische DNA verwendet werden, um cDNAs voller Länge und genomische Klone zu isolieren, die BASB031 codieren, und um cDNA und genomische Klone anderer Gene zu isolieren, die eine hohe Identität, insbesondere eine hohe Sequenzidentität, mit dem BASB031-Gen haben. Solche Sonden werden allgemein wenigstens 15 Nukleotidreste oder Basenpaare umfassen. Bevorzugt werden solche Sonden wenigstens 30 Nukleotidreste oder Basenpaare haben und können wenigstens 50 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen. Besonders bevorzugte Sonden werden wenigstens 20 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen und werden weniger als 30 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen.
Eine codierende Region eines BASB031-Gens kann durch Durchmusterung unter Verwendung einer in SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 bereitgestellten DNA-Sequenz isoliert werden, um eine Oligonukleotidsonde zu synthetisieren. Ein markiertes Oligonukleotid mit einer Sequenz, die komplementär zu derjenigen eines Gens der Erfindung ist, wird dann zur Durchmusterung einer Bibliothek von cDNA, genomischer DNA oder mRNA verwendet, um zu bestimmen, an welche Mitglieder der Bibliothek die Sonde hybridisiert.
Es gibt verschiedene Verfahren, die verfügbar und allgemein den Fachleuten bekannt sind, um DNAs voller Länge zu erhalten oder kurze DNAs zu verlängern, z.B. diejenigen auf Basis der Methode der "Rapid Amplification of cDNA Ends" (RACE) (siehe z.B. Frohman et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Kürzliche Modifikationen der Technik, exemplarisch dargestellt durch die Marathon^TM-Technologie (Clontech Laboratories Inc.) haben die Suche nach längeren cDNAs signifikant vereinfacht. In der Marathon^TM-Technologie werden cDNAs aus mRNA hergestellt, die aus einem gewählten Gewebe extrahiert wurde, und eine "Adapter"-Sequenz an jedes Ende ligiert. Nukleinsäureamplifikation (PCR) wird dann durchgeführt, um das "fehlende" 5'-Ende der DNA unter Verwendung einer Kombination aus Gen-spezifischen und Adapter-spezifischen Oligonukleotidprimern zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion wird dann unter Verwendung "ineinandergeschachtelter" Primer wiederholt, d.h. mit Primern, die geschaffen sind, um innerhalb des amplifizierten Produkts wieder zu verbinden (typischerweise ein Adapter-spezifischer Primer, der weiter 3' in der Adaptersequenz verbindet, und ein Gen-spezifischer Primer, der weiter 5' in der ausgewählten Gensequenz verbindet). Die Produkte dieser Erfindung können dann durch DNA-Sequenzierung analysiert und eine DNA voller Länge konstruiert werden, entweder durch direktes Verbinden des Produkts mit der bestehenden DNA, um eine vollständige Sequenz zu ergeben, oder durch Durchführen einer separaten PCR voller Länge unter Verwendung der neuen Sequenzinformation für die Konstruktion des 5'-Primers.
Die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung können z.B. als Forschungsreagenzien und Materialien zur Entdeckung von Behandlungen und Diagnostika für Krankheiten eingesetzt werden, insbesondere von Humankrankheiten, wie hier ferner in bezug auf Polynukleotidtests erörtert wird.
Die Polynukleotide der Erfindung, die Oligonukleotide sind, die aus einer Sequenz von SEQ ID NOs:1-8 stammen, können in den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, aber bevorzugt zur PCR, um zu bestimmen, ob die hier identifizierten Polynukleotide ganz oder teilweise in Bakterien in infiziertem Gewebe transkribiert werden oder nicht. Es wird erkannt, daß solche Sequenzen ebenfalls einen Nutzen in der Diagnose des Stadiums einer Infektion und des Typs der Infektion, die/den das Pathogen erreicht hat, haben wird.
Die Erfindung stellt ebenfalls Polynukleotide bereit, die ein Polypeptid codieren, das das reife Protein plus zusätzliche Amino- oder Carboxyl-terminale Aminosäuren oder Aminosäuren innerhalb des reifen Polypeptids ist (wenn z.B. die reife Form mehr als eine Polypeptidkette hat). Solche Sequenzen können u.a. eine Rolle in der Reifung eines Proteins von einem Vorläufer zu einer reifen Farm spielen, können den Proteintransport erlauben, können die Protein-Halbwertszeit verlängern oder verkürzen oder können die Manipulation eines Proteins für einen Test oder die Herstellung vereinfachen. Wie es allgemein in vivo der Fall ist, können die zusätzlichen Aminosäuren vom reifen Protein durch zelluläre Enzyme wegverarbeitet werden.
Für jedes und alle Polynukleotide der Erfindung wird ein dazu komplementäres Polynukleotid bereitgestellt. Es ist bevorzugt, daß diese komplementären Polynukleotide vollständig komplementär zu jedem Polynukleotid sind, zu dem sie komplementär sind.
Ein Vorläuferprotein, das eine reife Form des Polypeptids fusioniert an eine oder mehrere Prosequenzen aufweist, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Wenn Prosequenzen entfernt werden, werden solche inaktiven Vorläufer allgemein aktiviert. Einige oder alle der Prosequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Allgemein werden solche Vorläufer Proproteine genannt.
Zusätzlich zu den standardmäßigen Darstellungen A, G, C, T/U für Nukleotide kann auch der Begriff "N" bei der Beschreibung bestimmter Polynukleotide der Erfindung verwendet werden. "N" bedeutet, daß jedes der vier DNA- oder RNA-Nukleotide an einer so bezeichneten Position in der DNA- oder RNA-Sequenz erscheinen kann, ausgenommen es ist bevorzugt, daß N nicht eine Nukleinsäure ist, die bei Kombination mit benachbarten Nukleotidpositionen, beim Lesen im korrekten Leseraster, die Wirkung der Erzeugung eines verfrühten Terminationscodons in einem solchen Leseraster haben würde.
Zusammengefaßt kann ein Polynukleotid der Erfindung ein reifes Protein, eine reifes Protein plus eine Leitsequenz (was als ein Präprotein bezeichnet werden kann), einen Vorläufer eines reifen Proteins mit einer oder mehreren Prosequenzen, die nicht Leitsequenzen eines Präproteins sind, oder ein Präproprotein codieren, das ein Vorläufer eines Proproteins ist mit einer Leitsequenz und einer oder mehreren Prosequenzen, die allgemein während der Reifungsschritte entfernt werden, die aktive und reife Formen des Polypeptids erzeugen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung für therapeutische oder prophylaktische Zwecke bereitgestellt, insbesondere zur genetischen Immunisierung.
Die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung in der genetischen Immunisierung wird bevorzugt eine geeignete Übertragungsmethode einsetzen, wie die direkte Injektion von Plasmid-DNA in Muskeln (Wolff et al., Hum. Mol. Genet. (1992) 1:363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4.419), die Übertragung von DNA, die mit spezifischen Proteinträgern komplexiert ist (Wu et al., J. Biol. Chem. (1989) 264:16985), die Kopräzipitation von DNA mit Calciumphosphat (Benvenisty & Reshef, PNAS USA (1986) 83:9551), die Verkapselung von DNA in verschiedenen Formen von Liposomen (Kaneda et al., Science (1989) 243:375), Teilchenbombardierung (Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell biol. (1993) 12:791) und Infektion in vivo unter Verwendung klonierter retroviraler Vektoren (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81:5849).
Vektoren, Wirtszellen, Expressionssysteme
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vektoren, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, Wirtszellen, die mit Vektoren der Erfindung gentechnisch verändert sind, und die Erzeugung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls eingesetzt werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs zu erzeugen, die aus den DNA-Konstrukten der Erfindung stammen.
Rekombinante Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch Verfahren, die den Fachleuten allgemein bekannt sind, aus gentechnisch veränderten Wirtszellen hergestellt werden, die Expressionssysteme umfassen. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt Expressionssysteme, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die mit solchen Expressionssystemen gentechnisch verändert sind, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken.
Für die rekombinante Herstellung der Polypeptide der Erfindung können Wirtszellen gentechnisch verändert werden, so daß sie Expressionssysteme oder Teile davon oder Polynukleotide der Erfindung aufnehmen. Die Einführung eines Polynukleotids in die Wirtszelle kann durch Verfahren bewirkt werden, die in vielen Standard-Laborhandbüchern beschrieben werden, wie Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), wie z.B. Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion, mit kationischem Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, "Scrape Loading", ballistische Einführung und Infektion.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte schließe bakterielle Zellen ein, wie Zellen von Streptococci, Staphylococci, Enterococci, E. coli, Streptomyces, Cyanobakterien, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis und Moraxella catarrhalis; pilzliche Zellen, wie Zellen einer Hefe, Kluveromyces, Saccharomyces, einer Basidiomycete, Candida albicans und Aspergillus; Insektenzellen, wie Zellen von Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; tierische Zellen, wie CHO-, COS-, HeLa-, C127-, 3T3-, BHK-, 293-, CV-1- und Bowes-Melanom-Zellen; und pflanzliche Zellen, wie Zellen eines Nacktsamers oder Bedecktsamers.
Eine große Vielzahl von Expressionssystemen kann verwendet werden, um die Polypeptide der Erfindung zu erzeugen. Solche Vektoren schließen u.a. aus Chromosomen, Episomen und Viren stammende Vektoren ein, z.B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, aus Bakteriophagen, aus Transposonen, aus Hefeepisomen, aus Insertionselementen, aus chromosomalen Hefeelementen, aus Viren, wie Baculoviren, Papovaviren, wie SV40, Vakziniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabies-Viren, Picornaviren, Retroviren und Alphaviren, stammen, und Vektoren, die aus Kombinationen daraus stammen, wie diejenigen, die aus genetischen Plasmid- und Bakteriophagen-Elementen stammen, wie Cosmide und Phagemide. Die Expressionssystemkonstrukte können Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren sowie hervorrufen. Allgemein kann jedes System oder jeder Vektor, das/der geeignet ist, um Polynukleotide aufrecht zu erhalten, zu vermehren oder zu exprimieren und/oder ein Polypeptid in einem Wirt zu exprimieren, zur Expression in dieser Hinsicht verwendet werden. Die geeignete DNA-Sequenz kann in das Expressionssystem durch jede einer Vielzahl von allgemein bekannten und routinemäßigen Techniken insertiert werden, wie z.B. durch diejenigen, die aufgeführt werden in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra).
In rekombinanten Expressionssystemen in Eukaryonten können zur Sekretion eines translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung geeignete Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingefügt werden. Diese Signale können endogen für das Polypeptid sein, oder sie können heterologe Signale sein.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können aus rekombinanten Zellkulturen durch allgemein bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie. Am meisten bevorzugt wird Ionenmetall-Affinitätschromatographie (IMAC) zur Reinigung eingesetzt. Allgemein bekannte Techniken zum Neufalten von Proteinen können eingesetzt werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der intrazellulären Synthese, Isolierung und/oder Reinigung denaturiert wird.
Das Expressionssystem kann auch ein rekombinanter lebender Mikroorganismus sein, wie ein Virus oder Bakterium. Das interessierende Gen kann in das Genom eines lebenden rekombinanten Virus oder Bakteriums eingefügt werden. Inokulation und Infektion in vivo mit diesem Lebendvektor wird zur in vivo Expression des Antigens und zur Induktion von Immunreaktionen führen. Viren und Bakterien, die für diesen Zweck verwendet werden, sind z.B. Pockenviren (z.B. Vakzinia, Geflügelpocken, Kanarienpocken), Alphaviren (Sindbis-Virus, Semliki-Forest-Virus, venezolanisches equines Enzephalitisvirus), Adenoviren, Adeno-assoziiertes Virus, Picornaviren (Poliovirus, Rhinovirus), Herpesviren (Varicella zoster-Virus etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Diese Viren und Bakterien können virulent sein oder auf verschiedenen Wegen abgeschwächt werden, um Lebendimpfstoffe zu erhalten. Solche Lebendimpfstoffe bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Diagnostische, prognostische, serotypisierende und Mutationstests
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von BASB031-Polynukleotiden und -Polypeptiden der Erfindung zur Verwendung als diagnostische Reagenzien. Die Detektion von BASB031-Polynukleotiden und/oder -Polypeptiden in einem Eukaryonten, insbesondere einem Säugetier und speziell einem Menschen, wird ein diagnostisches Verfahren zur Diagnose der Krankheit, Einstufung der Krankheit oder Reaktion eines infektiösen Organismus auf Wirkstoffe bereitstellen. Eukaryonten, insbesondere Säugetiere und speziell Menschen, insbesondere diejenigen, die mit einem Organismus infiziert sind, der das BASB031-Gen oder -Protein umfaßt, oder einer solchen Infektion verdächtig sind, können auf der Nukleinsäure- oder Aminosäureebene durch eine Vielzahl allgemein bekannter Techniken sowie durch hier bereitgestellte Methoden detektiert werden.
Polypeptide und Polynukleotide zur Prognose, Diagnose oder anderen Analyse können aus dem Körpermaterial eines mutmaßlich infizierten und/oder eines infizierten Individuums erhalten werden. Polynukleotide aus jeder dieser Quellen, insbesondere DNA oder RNA, können direkt zur Detektion verwendet werden oder können enzymatisch unter Verwendung von PCR oder jeder anderen Amplifikationstechnik vor der Analyse amplifiziert werden. RNA, insbesondere mRNA, cDNA und genomische DNA können ebenfalls auf den gleichen Weisen verwendet werden. Unter Verwendung der Amplifikation kann die Charakterisierung der Art und des Stammes des infektiösen oder residenten Organismus, der in einem Individuum vorhanden ist, durch Analyse des Genotyps eines ausgewählten Polynukleotids des Organismus vorgenommen werden. Deletionen und Insertionen können durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich mit einem Genotyp einer Referenzsequenz detektiert werden, die aus einem verwandten Organismus ausgewählt wird, bevorzugt aus einer unterschiedlichen Art der gleichen Gattung oder eines unterschiedlichen Stammes der gleichen Art. Punktmutationen können durch Hybridisieren von amplifizierter DNA mit markierten BASB031-Polynukleotidsequenzen identifiziert werden. Perfekt oder signifikant übereinstimmende Sequenzen können von unperfekt oder signifikanter fehlübereinstimmenden Duplizes durch DNase- oder RNase-Verdauung, für DNA bzw. RNA, oder durch Nachweisen von Unterschieden in den Schmelztemperaturen oder in der Renaturierungskinetik unterschieden werden. Polynukleotidsequenzunterschiede können ebenfalls durch Veränderungen in der elektrophoretischen Beweglichkeit von Polynukleotidfragmenten in Gelen im Vergleich mit einer Referenzsequenz detektiert werden. Die kann mit oder ohne Denaturierungsmittel durchgeführt werden. Polynukleotidunterschiede können ebenfalls durch direkte DNA- oder RNA-Sequenzierung nachgewiesen werden. Siehe z.B. Myers et al., Science, 230: 1242 (1985). Sequenzveränderungen an spezifischen Orten können ebenfalls durch Nuklease-Schutztests aufgezeigt werden, wie Rnase-, V1- und S1-Schutztest, oder durch ein chemisches Spaltungsverfahren. Siehe z.B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985).
In einer anderen Ausführungsform kann ein Array von Oligonukleotidsonden, die eine BASB031-Nukleotidsequenz oder Fragmente davon umfassen, zur Durchführung einer effizienten Durchmusterung von z.B. genetischen Mutationen, des Serotyps, der taxonomischen Klassifikation oder Identifizierung konstruiert werden. Verfahren der Array-Technologie sind allgemein bekannt und besitzen allgemeine Anwendbarkeit und können verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen der molekularen Genetik anzugehen, einschließlich Genexpression, genetischer Verbindung und genetischer Variabilität (siehe z.B. Chee et al., Science, 274: 610 (1996)).
So betrifft die vorliegende Erfindung in einem anderen Aspekt ein diagnostisches Kit, das folgendes umfaßt:

(a) ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 oder ein Fragment davon;
(b) eine zu derjenigen von (a) komplementäre Nukleotidsequenz;
(c) ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt das Polypeptid mit SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 oder ein Fragment davon; oder
(d) einen Antikörper gegen ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt gegen das Polypeptid mit SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8.

Man wird einsehen, daß in jedem solchen Kit (a), (b), (c) oder (d) eine substantielle Komponente umfassen kann. Ein solches Kit wird unter anderem von Nutzen in der Diagnose einer Krankheit oder Anfälligkeit für eine Krankheit sein.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung als diagnostische Reagenzien. Die Detektion einer mutierten Form eines Polynukleotids der Erfindung, bevorzugt SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7, das mit einer Krankheit oder Pathogenität verbunden ist, wird ein diagnostisches Werkzeug bereitstellen, das zu einer Diagnose einer Krankheit, einer Prognose eines Krankheitsverlaufs, einer Bestimmung eines Krankheitsstadiums oder einer Anfälligkeit für eine Krankheit beitragen wird oder diese definieren wird, die aus Unterexpression, Überexpression oder veränderter Expression des Polynukleotids resultiert. Organismen, insbesondere infektiöse Organismen, die Mutationen in einem solchen Polynukleotid tragen, können auf der Polynukleotidebene durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden, wie durch die hier an anderer Stelle beschriebenen.
Zellen aus einem Organismus, der Mutationen oder Polymorphismen (allelische Variationen) in einem Polynukleotid und/oder Polypeptid der Erfindung trägt, können ebenfalls auf der Polynukleotid- oder Polypeptidebene durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden, z.B. um die Serotypisierung zu erlauben. Z.B. kann RT-PCR zum Nachweis von Mutationen in der RNA verwendet werden. Es ist besonders bevorzugt, RT-PCR in Verbindung mit automatisierten Detektionssystemen zu verwenden, wie z.B. GeneScan. RNA, cDNA oder genomische DNA können ebenfalls für den gleichen Zweck, PCR, verwendet werden. Zum Beispiel können PCR-Primer, die komplementär zu einem Polynukleotid sind, das BASB031-Polypeptid codiert, zur Identifizierung und Analyse von Mutationen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ferner Primer mit 1, 2, 3 oder 4 Nukleotiden, die aus dem 5'- und/oder 3'-Ende entfernt sind, bereit. Diese Primer können unter anderem zur Amplifizierung von BASB031-DNA und/oder -RNA verwendet werden, die aus einer aus einem Individuum stammenden Probe, wie z.B. einem Körpermaterial, isoliert ist. Die Primer können zur Amplifikation eines aus einem infizierten Individuum isolierten Polynukleotids verwendet werden, so daß das Polynukleotid dann verschiedenen Techniken zur Aufklärung der Polynukleotidsequenz unterworfen werden kann. Auf diese Weise können Mutationen in der Polynukleotidsequenz detektiert und verwendet werden, um die Infektion oder ihr Stadium oder ihren Verlauf zu diagnostizieren und/oder zu prognostizieren, oder um das infektiöse Mittel zu serotypisieren und/oder zu klassifizieren.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Diagnostizieren von Infektionen bereit, die durch Moraxella catarrhalis verursacht werden, umfassend das Bestimmen, aus einer aus einem Individuum stammenden Probe, wie z.B. aus einem Körpermaterial, eines erhöhten Expressionsgrads von Polynukleotid mit einer Sequenz mit SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7. Eine erhöhte oder verringerte Expression eines BASB031-Polynukleotids kann unter Verwendung jedes derjenigen Verfahren gemessen werden, die auf diesem Gebiet für die Quantifizierung von Polynukleotiden allgemein bekannt sind, wie z.B. Amplifikation, PCR, RT-PCR, RNase-Schutz, Northern-Blotting, Spektrometrie und andere Hybridisierungsverfahren.
Zusätzlich kann ein diagnostischer Test gemäß der Erfindung zum Nachweis der Überexpression von BASB031-Polypeptid im Vergleich mit normalen Kontrollgewebeproben verwendet werden, um z.B. die Gegenwart einer Infektion nachzuweisen. Testtechniken, die zur Bestimmung der Mengen eines BASB031-Polypeptids in einer Probe verwendet werden können, die aus einem Wirt stamm, wie z.B. ein Körpermaterial, sind den Fachleuten allgemein bekannt. Solche Testverfahren schließen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western-Blot-Analyse, Antikörper-Sandwich-Test, Antikörperdetektion und ELISA-Tests ein.
Die Polynukleotide der Erfindung können als Komponenten von Polynukleotid-Arrays verwendet werden, bevorzugt hochdichten Arrays oder Gittern. Diese hochdichten Arrays sind besonders nützlich für diagnostische und prognostische Zwecke. Z.B. kann ein Satz von Tüpfeln, die jeweils ein unterschiedliches Gen umfassen und ferner ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, zur Sondierung verwendet werden, wie z.B. unter Verwendung von Hybridisierung oder Nukleinsäureamplifikation, wobei Sonden verwendet werden, die aus einer Körperprobe erhalten werden oder abstammen, um die Gegenwart einer besonderen Polynukleotidsequenz oder einer verwandten Sequenz in einem Individuum zu bestimmen. Eine solche Gegenwart kann die Gegenwart eines Moraxella catarrhalis-Pathogens anzeigen und kann nützlich in der Diagnose und/oder Prognose einer Krankheit oder eines Krankheitsverlaufs sein. Ein Gitter, das eine Anzahl von Varianten der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 umfaßt, ist bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt ist ein Gitter, das eine Anzahl von Varianten einer Polynukleotidsequenz umfaßt, die die Polypeptidsequenz mit SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 codiert.
Antikörper
Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung oder Varianten davon oder Zellen, die diese exprimieren, können als Immunogene zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die immunspezifische für solche Polypeptide bzw. Polynukleotide sind.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Antikörper gegen BASB031-Polypeptide oder -Polynukleotide bereitgestellt.
Antikörper, die gegen die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung erzeugt werden, können durch Verabreichen der Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung oder von Epitop-tragenden Fragmenten von jedem davon, Analoga von jedem davon oder von Zellen, die eines davon exprimieren, an ein Tier, bevorzugt nicht-human, unter Verwendung von Routineprotokollen erhalten werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper kann jede fachbekannte Technik verwendet werden, die Antikörper liefert, die durch kontinuierliche Zellinienkulturen erzeugt werden. Beispiele schließen verschiedene Techniken ein, wie diejenigen in G. Kohler und C. Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al. S. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, R. Alan Liss, Inc. (1985).
Techniken zur Erzeugung von einkettigen Antikörpern ( US-PS 4 946 778 ) können angepaßt werden, um einkettige Antikörper gegen Polypeptide oder Polynukleotide dieser Erfindung zu erzeugen. Ebenfalls können transgene Mäuse oder andere Organismen oder Tiere, wie andere Säugetiere, zur Expression humanisierter Antikörper verwendet werden, die immunspezifisch für die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung sind.
Alternativ kann die Phagen-Display-Technologie verwendet werden, um Antikörpergene mit Bindungsaktivitäten für ein Polypeptid der Erfindung entweder aus Sammlungen von PCR-amplifizierten v-Genen aus Lymphozyten von Menschen, die auf Anti-BASB031 durchmustert wurden, oder aus naiven Bibliotheken auszuwählen (McCafferty et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). Die Affinität dieser Antikörper kann ebenfalls durch z.B. "chain shuffling" verbessert werden (Clackson et al., (1991) Nature 352: 628).
Die oben beschriebenen Antikörper können zur Isolierung oder Identifizierung von Klonen eingesetzt werden, die die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung exprimieren, um die Polypeptide oder Polynukleotide durch z.B. Affinitätschromatographie zu reinigen.
So können u.a. Antikörper gegen BASB031-Polypeptid oder BASB031-Polynukleotid zur Behandlung von Infektionen, insbesondere bakterielle Infektionen, eingesetzt werden.
Polypeptidvarianten schließen antigenisch, epitopisch oder immunologisch äquivalente Varianten ein und bilden einen besonderen Aspekt dieser Erfindung.
Bevorzugt ist der Antikörper oder eine Variante davon modifiziert, um ihn/sie weniger immunogen im Individuum zu machen. Falls z.B. das Individuum ein Mensch ist, kann der Antikörper am meisten bevorzugt "huamisiert" sein, wobei die komplementär bestimmende Region oder Regionen des Hybridom-abgeleiteten Antikörpers in einen humanen monoklonalen Antikörper transplantiert wurden, z.B. wie beschrieben in Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 oder Tempest et al. (1991) Biotechnology 9, 266-273.
Antagonisten und Agonisten – Tests und Moleküle
Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können ebenfalls zur Beurteilung der Bindung von kleinen Molekülsubstraten und Liganden in z.B. Zellen, zellfreien Zubereitungen, chemischen Bibliotheken und natürlichen Produktmischungen verwendet werden. Diese Substrate und Liganden können natürliche Substrate und Liganden sein oder können strukturelle oder funktionelle Mimetika sein. Siehe z.B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2), Kapitel 5 (1991).
Die Durchmusterungsverfahren können einfach die Bindung einer Testverbindung an das Polypeptid oder Polynukleotid oder an Zellen oder Membranen, die das Polypeptid oder Polynukleotid tragen, oder an ein Fusionsprotein des Polypeptids mittels eines Markers messen, der direkt oder indirekt mit der Testverbindung assoziiert ist. Alternativ kann das Durchmusterungsverfahren eine Konkurrenz mit einem markierten Konkurrenten beinhalten. Ferner können diese Durchmusterungsverfahren testen, ob die Testverbindung zu einem Signal führt, das durch Aktivierung oder Inhibierung des Polypeptids oder Polynukleotids erzeugt wird, wobei Detektionssysteme verwendet werden, die geeignet für die Zellen sind, die das Polypeptid oder Polynukleotid umfassen. Inhibitoren der Aktivierung werden allgemein in Gegenwart eines bekannten Agonisten getestet, und der Effekt bei Aktivierung durch den Agonisten durch die Gegenwart der Testverbindung wird beobachtet. Konstitutiv aktives Polypeptid und/oder konstitutiv exprimierte Polypeptide und Polynukleotide können in Durchmusterungsverfahren auf inverse Agonisten oder Inhibitoren in Abwesenheit eines Agonisten oder Inhibitors eingesetzt werden, indem getestet wird, ob die Testverbindung zu einer Inhibierung der Aktivierung des Polypeptids oder Polynukleotids führt, je nach Fall. Ferner können die Durchmusterungsverfahren einfach die Schritte des Vermischens einer Testverbindung mit einer Lösung, die ein Polypeptid oder Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthält, um eine Mischung zu bilden, des Messens der BASB031-Polypeptid- und/oder -Polynukleotid-Aktivität in der Mischung und des Vergleichens der BASB031-Polypeptid- und/oder -Polynukleotid-Aktivität der Mischung mit einem Standard umfassen. Fusionsproteine wie diejenigen, die aus dem Fc-Teil und BASB031-Polypeptid hergestellt werden, wie zuvor beschrieben, können ebenfalls für Hochdurchsatz-Durchmusterungstests verwendet werden, um Antagonisten des Polypeptids der vorliegenden Erfindung sowie von phylogenetisch und/oder funktionell verwandten Polypeptiden zu identifizieren (siehe D. Bennett et al., J. Mol. Recognition, 8:52-58 (1995); und K. Johanson et al., J. Biol. Chem., 270(16):9459-9471 (1995)).
Die Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper, die mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden und/oder Wechselwirken, können ebenfalls zur Konfigurierung von Durchmusterungsverfahren zum Detektieren der Wirkung hinzugegebener Verbindungen auf die Erzeugung von mRNA und/oder Polypeptid in Zellen verwendet werden. Z.B. kann ein ELISA-Test zur Messung von sezernierten oder Zell-gebundenen Mengen von Polypeptid unter Verwendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper durch fachbekannte Standardverfahren konstruiert werden. Dieser kann verwendet werden, um Mittel zu finden, die die Produktion von Polypeptid aus geeignet manipulierten Zellen oder Geweben inhibieren oder steigern können (auch als Antagonist bzw. Agonist bezeichnet).
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen zur Identifizierung derjenigen bereit, die die Wirkung von BASB031-Polypeptiden oder -Polynukleotiden steigern (Agonist) oder blockieren (Antagonist), insbesondere derjenigen Verbindungen, die bakteriostatisch und/oder bakterizid sind. Das Durchmusterungsverfahren kann Hochdurchsatztechniken beinhalten. Z.B. wird zur Durchmusterung auf Agonisten oder Antagonisten eine synthetische Reaktionsmischung, ein zellu läres Kompartiment, wie eine Membran, eine Zellhülle oder Zellwand, oder eine Zubereitung von jedem daraus, umfassend BASB031-Polypeptid und ein markiertes Substrat oder einen markierten Liganden für ein solches Polypeptid, in Abwesenheit oder Gegenwart eines Testmoleküls inkubiert, das ein BASB031-Agonist oder -Antagonist sein kann. Die Fähigkeit des Testmoleküls, agonistisch oder antagonistisch für das BASB031-Polypeptid zu wirken, wird in einer abnehmenden Bindung des markierten Liganden oder einer abnehmenden Erzeugung von Produkt aus einem solchen Substrat widergespiegelt. Moleküle, die unnötig binden, d.h. ohne Induzierung der Wirkungen von BASB031-Polypeptid, sind höchstwahrscheinlich gute Antagonisten. Moleküle, die gut binden und je nach Fall die Geschwindigkeit der Produkterzeugung aus Substrat erhöhen, die Signalleitung erhöhen oder die chemische Kanalaktivität erhöhen, sind Agonisten. Die Detektion der Geschwindigkeit oder Menge, je nach Fall, der Erzeugung von Produkt aus Substrat, der Signalleitung oder der chemischen Kanalaktivität kann durch Verwendung eines Reportersystems gesteigert werden. Reportersysteme, die nützlich in dieser Hinsicht sein können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf kolorimetrische, ein markiertes Substrat, das zu Produkt umgewandelt wird, ein Reportergen, das auf Veränderungen der BASB031-Polynukleotid- oder -Polypeptid-Aktivität reagiert, und fachbekannte Bindungstests.
Ein anderes Beispiel für einen Test auf BASB031-Agonisten ist ein kompetitiver Test, der BASB031 und einen potentiellen Agonisten mit BASB031-bindenden Molekülen, rekombinanten BASB031-bindenden Molekülen, natürlichen Substraten oder Liganden oder Substrat- oder Ligand-Mimetika unter geeigneten Bindungen für einen kompetitiven Inhibierungstest kombiniert. BASB031 kann markiert werden, wie durch Radioaktivität oder eine kolorimetrische Verbindung, so daß die Anzahl von BASB031-Molekülen, die an ein Bindungsmolekül gebunden sind oder zum Produkt umgewandelt werden, genau bestimmt werden kann, um die Wirksamkeit des potentiellen Antagonisten zu beurteilen.
Potentielle Antagonisten schließen u.a. kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und Antikörper ein, die an ein Polynukleotid und/oder Polypeptid der Erfindung binden und dadurch seine Aktivität oder Expression inhibieren oder auslöschen. Potentielle Antagonisten können ebenfalls kleine organische Moleküle, ein Peptid, ein Polypeptid, wie ein engverwandtes Protein oder Antikörper, sein, die/der an die gleiche Stelle eines Bindungsmoleküls bindet, wie ein bindendes Molekül, ohne BASB031-induzierte Aktivitäten zu induzieren, wodurch die Wirkung oder Expression von BASB031-Polypeptiden und/oder -Polynukleotiden verhindert wird, indem die Bindung von BASB031-Polypeptiden und/oder -Polynukleotiden ausgeschlossen wird.
Potentielle Antagonisten schließen ein kleines Molekül ein, das an die Bindungsstelle des Polypeptid bindet und diese besetzt, wodurch die Bindung an zelluläre Bindungsmoleküle verhindert wird, so daß die normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele für kleine Moleküle schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf kleine organische Moleküle, Peptide oder peptidartige Moleküle. Andere potentielle Antagonisten schließen antisense-Moleküle ein (siehe Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), für eine Beschreibung dieser Moleküle). Bevorzugte potentielle Antagonisten schließen Verbindungen ein, die mit BASB031 verwandt sind, und Varianten davon.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung gentechnisch veränderte lösliche Fusionsproteine, die Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon und verschiedene Teile der konstanten Regionen von schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen der verschiedenen Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) umfassen. Bevorzugt als Immunglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von humanem IgG, insbesondere IgG1, worin die Fusion an der Gelenkregion stattfindet. In einer besonderen Ausführungsform kann der FC-Teil einfach durch Einfügen einer Spaltsequenz entfernt werden, die mit Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann. Außerdem betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine durch Gentechnik und die Verwendung zur Wirkstoffdurchmusterung, Diagnose und Therapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren. Beispiele für die Fusionsproteintechnologie können in WO 94/29458 und WO 94/22914 gefunden werden.
Jede der hier bereitgestellten Polynukleotidsequenzen kann zum Auffinden und zur Entwicklung von antibakteriellen Verbindungen verwendet werden. Das codierte Protein kann bei Expression als Ziel für die Durchmusterung von antibakteriellen Wirkstoffen verwendet werden. Zusätzlich können die Polynukleotidsequenzen, die die Amino-terminalen Regionen des codierten Proteins codieren, oder Shine-Delgarno-Sequenzen oder andere, die Translation erleichternde Sequenzen der jeweiligen mRNA verwendet werden, um antisense-Sequenzen zu konstruieren, um die Expression der interessierenden codierenden Sequenz zu kontrollieren.
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung des Polypeptids, Polynukleotids, Agonisten oder Antagonisten der Erfindung bereit, um in die anfängliche physikalische Wechselwirkung zwischen einem Pathogen oder Pathogenen und einem eukaryontischen Wirt, bevorzugt einem Säugetierwirt, einzugreifen, die für die Folgen der Infektion verantwortlich ist. Insbesondere können die Moleküle der Erfindung verwendet werden: in der Prävention der Adhäsion von Bakterien, insbesondere von Gram-positiven und/oder Gram-negativen Bakterien, an eukaryontischen, vorzugsweise vom Säugetier, extrazellulären Matrixproteinen auf invasiven Vorrichtungen oder an extrazelluläre Matrixproteine in Wunden; zur Blockierung der bakteriellen Adhäsion zwischen eukaryontischen, bevorzugt vom Säugetier, extrazellulären Matrixproteinen und bakteriellen BASB031-Proteinen, die eine Gewebeschädigung vermitteln; und/oder zur Blockierung des normalen Fortschritts der Pathogenese bei Infektionen, die anders als durch die Implantation von invasiven Vorrichtungen oder durch andere chirurgische Techniken hervorgerufen wurden.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung werden BASB031-Agonisten und -Antagonisten bereitgestellt, bevorzugt bakteriostatische oder bakterizide Agonisten und Antagonisten.
Die Antagonisten und Agonisten der Erfindung können z.B. zur Prävention, Inhibierung und/oder Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Mimotope des Polypeptids der Erfindung. Ein Mimotop ist eine Peptidsequenz, ausreichend ähnlich dem nativen Peptid (sequentiell oder strukturell), die durch Antikörper erkannt werden kann, die das native Peptid erkennen; oder die Antikörper erzeugen kann, die das native Peptid bei Kopplung an einen geeigneten Träger erkennen.
Peptidmimotope können für einen besonderen Zweck durch Addition, Deletion oder Substitution von ausgewählten Aminosäuren konstruiert werden. So können die Peptide für die Zwecke der. Erleichterung der Konjugation an einen Proteinträger modifiziert werden. Z.B. kann es für einige chemische Konjugationsverfahren wünschenswert sein, ein terminales Cystein einzuschließen. Zusätzlich kann es für Peptide wünschenswert sein, die an einen, Proteinträger konjugiert sind, einen hydrophoben Terminus einzuschließen, der sich distal vom konjugierten Terminus des Peptids befindet, so daß das freie unkonjugierte Ende des Peptids mit der Oberfläche des Trägerproteins verbunden bleibt, wodurch das Peptid in einer Konformation angeboten wird, die derjenigen des Peptids am nächsten ähnelt, wie es im Zusammenhang des ganzen nativen Moleküls gefunden wird. Z.B. können die Peptide verändert werden, um ein N-terminales Cystein und einen C-terminalen hydrophoben amidierten Schwanz aufzuweisen. Alternativ kann die Addition oder Substitution einer D-Stereoisomerform einer oder mehrerer der Aminosäuren durchgeführt werden, um ein vorteilhaftes Derivat zu erzeugen, z.B. zur Erhöhung der Stabilität des Peptids.
Alternativ können Peptidmimotope unter Verwendung von Antikörpern identifiziert werden, die selbst an die Polypeptide der vorliegenden Erfindung binden können, unter Verwendung von Techniken wie der Phagen-Display-Technologie ( EP 0 552 267 B1 ). Diese Technik erzeugt eine große Anzahl von Peptidsequenzen, die die Struktur der nativen Peptide nachahmen und deshalb an Anti-natives Peptid-Antikörper binden können, aber nicht notwendigerweise selbst eine signifikante Sequenzhomologie mit dem nativen Polypeptid teilen.
Impfstoffe
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, insbesondere einem Säugetier, bevorzugt Menschen, welches das Impfen des Individuums mit BASB031-Polynukleotid und/oder Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon umfaßt, angemessen zur Erzeugung von Antikörper- und/oder T-Zell-Immunreaktion, um das Individuum vor Infektion zu schützen, insbesondere vor bakterieller Infektion und am meisten bevorzugt vor Moraxella catarrhalis-Infektion. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren, durch die eine solche immunologische Reaktion die bakterielle Vervielfältigung verlangsamt. Noch ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, welches das Übertragen, an ein solches Individuum, eines Nukleinsäurevektors, einer Sequenz oder eines Ribozyms umfaßt, um die Expression von BASB031-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon auszurichten, zur Expression von BASB031-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon in vivo, um eine immunologische Reaktion zu induzieren, wie z.B. zur Erzeugung von Antikörper- und/oder T-Zell-Immunreaktion, einschließlich z.B. Cytokinerzeugender T-Zellen oder cytotoxischer T-Zellen, um das Individuum, bevorzugt einen Menschen, vor Krankheit zu schützen, unabhängig davon, ob diese Krankheit bereits im Individuum etabliert ist oder nicht. Ein Beispiel für die Verabreichung des Gens ist durch seine Beschleunigung in die gewünschten Zellen als Überzug auf Partikeln oder in anderer Weise. Ein solcher Nukleinsäurevektor kann DNA, RNA, ein Ribozym, eine modifizierte Nukleinsäure, ein DNA/RNA-Hybrid, einen DNA-Protein-Komplex oder einen RNA-Protein-Komplex umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine immunologische Zusammensetzung, die bei Einführung in ein Individuum, bevorzugt einen Menschen, in dem eine immunologische Reaktion induziert werden kann, eine immunologische Reaktion in einem solchen Individuum gegen ein BASB031-Polynukleotid und/oder daraus codiertes Polypeptid induziert, worin die Zusammensetzung ein rekombinantes BASB031-Polynukleotid und/oder daraus codiertes Polypeptid umfaßt und/oder DNA und/oder RNA umfaßt, die ein Antigen des BASB031-Polynukleotids, daraus codierten Polypeptids oder anderen Polypeptids der Erfindung codiert und exprimiert. Die immunologische Reaktion kann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden und kann die Form von Antikörperimmunität und/oder zellulärer Immunität annehmen, wie zelluläre Immunität, die aus CTL oder CD4+ T-Zellen entsteht.
Ein BASB031-Polypeptid oder ein Fragment davon kann mit Coprotein oder einer chemischen Einheit fusioniert werden, die selbst Antikörper erzeugen kann oder nicht, die aber das erste Protein stabilisieren und ein fusioniertes oder modifiziertes Protein erzeugen kann, das antigene und/oder immunogene Eigenschaften und bevorzugt Schutzeigenschaften aufweisen wird. Ein solches fusioniertes rekombinantes Protein umfaßt bevorzugt ferner ein antigenes Coprotein, wie Lipoprotein D aus Haemophilus influenzae, Glutathion-S-Transferase (GST) oder beta-Galactosidase, oder jedes andere relativ große Coprotein, das das Protein solubilisiert und dessen Herstellung und Reinigung erleichtert. Außerdem kann das Coprotein als Hilfsstoff im Sinne der Bereitstellung einer allgemeinen Stimulierung des Immunsystems des Organismus wirken, der das Protein erhält. Das Coprotein kann entweder an den Amino- oder den Carboxy-Terminus des ersten Proteins gebunden sein.
Bereitgestellt durch diese Erfindung werden Zusammensetzungen, insbesondere Impfstoffzusammensetzungen, und Verfahren, die die Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung und immunstimulierende DNA-Sequenzen umfassen, wie diejenigen, die beschrieben werden in Y. Sato et al., Science 273:352 (1996).
Ebenfalls bereitgestellt durch diese Erfindung werden Verfahren, die das beschriebene Polynukleotid oder besondere Fragmente davon verwenden, von denen gezeigt wurde, daß sie nicht-variable Regionen der bakteriellen Zelloberflächenproteine codieren, in Polynukleotidkonstrukten, die in solchen genetischen Immunisierungsexgerimenten in Tiermodellen der Infektion mit Moraxella catarrhalis verwendet werden. Solche Experimente werden besonders nützlich zur Identifizierung von Proteinepitopen sein, die eine prophylaktische oder therapeutische Immunreaktion hervorrufen können. Es wird angenommen, daß dieser Ansatz die anschließende Herstellung monoklonaler Antikörper mit besonderem Wert erlauben wird, die aus dem geforderten Organ des Tieres stammen, das erfolgreich einer Infektion widersteht oder diese klärt, zur Entwicklung von prophylaktischen Mitteln oder therapeutischen Behandlungen von bakteriellen Infektionen, insbesondere Moraxella catarrhalis-Infektion, in Säugetieren, insbesondere Menschen.
Die Erfindung schließt ebenfalls eine Impfstofformulierung ein, die ein immunogenes rekombinantes Polypeptid und/oder Polynukleotid der Erfindung zusammen mit einem geeigneten Träger umfaßt, wie mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Da die Polypeptide und Polynukleotide im Magen aufgebrochen werden können, wird jedes bevorzugt parenteral verabreicht, einschließlich z.B. durch Verabreichung, die subkutan, intramuskulär, intravenös oder intradermal ist. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wäßrige oder nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidantien, Puffer, bakteriostatische Verbindungen und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch zur Körperflüssigkeit, bevorzugt dem Blut des Individuums, machen; und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel oder Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern angeboten werden, z.B. versiegelten Ampullen und Fläschchen, und können in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers unmittelbar vor der Verwendung erfordert.
Die Impfstofformulierung der Erfindung kann ebenfalls Hilfsstoffsysteme zur Steigerung der Immunogenität der Formulierung einschließen. Bevorzugt erzeugt das Hilfsstoffsystem bevorzugt eine Reaktion vom TH1-Typ.
Eine Immunreaktion kann allgemein durch zwei extreme Kategorien unterschieden werden, welches humorale oder zellvermittelte Immunreaktionen sind (traditionell charakterisiert durch Antikörper- bzw. zelluläre Effektor-Mechanismen des Schutzes). Diese Kategorien der Reaktion werden als Reaktionen vom TH1-Typ (zellvermittelte Reaktion) und Immunreaktionen von TH2-Typ (humorale Reaktion) bezeichnet.
Extreme Immunreaktionen vom TH1-Typ können durch die Erzeugung von Antigen-spezifischen, Haplotyp-beschränkten cytotoxischen T-Lymphozyten und natürliche Killerzell-Reaktionen gekennzeichnet sein. In Mäusen sind Reaktionen vom TH1-Typ häufig durch die Erzeugung von Antikörpern vom IgG2a-Untertyp gekennzeichnet, während im Menschen diese den Antikörpern vom IgG1-Typ entsprechen. Immunreaktionen vom TH2-Typ sind durch die Erzeugung eines weiten Bereichs von Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet, die Mäuse-IgG1, IgA und IgM einschließen.
Es kann erwogen werden, daß die hinter der Entwicklung dieser zwei Typen von Immunreaktionen antreibende Kraft Cytokine sind. Hohe Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ neigen dazu, die Induzierung von zellvermittelten Immunreaktionen gegen das gegebene Antigen zu begünstigen, während hohe Mengen von Cytokinen vom TH2-Typ dazu neigen, die Induzierung von humoralen Immunreaktionen gegen das Antigen zu begünstigen.
Die Unterscheidung von Immunreaktionen vom TH1- und TH2-Typ ist nicht absolut. In der Wirklichkeit wird ein Individuum eine Immunreaktion stützen, die als vorherrschend TH1 oder vorherrschend TH2 beschrieben wird. Es ist jedoch häufig zweckmäßig, die Familien von Cytokinen als diejenigen zu betrachten, die in murinen CD4+ve T-Zell-Klonen von Mosmann und Coffman beschrieben wurden (T.R. Mosmann und R.L. Coffman (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine seceretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, S. 145-173). Traditionell werden Reaktionen vom TH1-Typ mit der Erzeugung von INF-γ- und IL-2-Cytokinen durch T-Lymphozyten verbunden. Andere Cytokine, die häufig direkt mit der Induzierung von Immunreaktionen vom TH1-Typ verbunden sind, werden nicht durch T-Zellen, wie IL-12, erzeugt. Im Gegensatz sind Reaktionen vom TH2-Typ mit der Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13 verbunden.
Es ist bekannt, daß bestimmte Impfstoffhilfsstoffe besonders geeignet zur Stimulierung von Cytokinreaktionen entweder vom TH1- oder TH2-Typ geeignet sind. Traditionell schließt der beste Indikator des TH1:TH2-Gleichgewichts der Immunreaktion nach einer Impfung oder Infektion die direkte Messung der Erzeugung von TH1- oder TH2-Cytokinen durch T-Lymphozyten in vitro nach Restimulation mit Antigen und/oder die Messung des IgG1:IgG2a-Verhältnisses der Antigen-spezifischen Antikörperreaktionen ein.
So ist ein Hilfsstoff vom TH1-Typ ein solcher, der bevorzugt isolierte T-Zell-Populationen zur Erzeugung hoher Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ stimuliert, wenn mit Antigen in vitro restimuliert, und die Entwicklung von sowohl CD8+-cytotoxischen T-Lymphozyten als auch Antigen- spezifischen Immunglobulinreaktionen fördert, die mit Isotyp vom TH1-Typ verbunden sind.
Hilfsstoffe, die für eine bevorzugte Stimulierung der TH1-Zell-Reaktion in der Lage sind, werden in WO 94/00153 und WO 95/17209 beschrieben.
3-Des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL) ist ein solcher Hilfsstoff. Dieser ist aus GB 2220211 (Ribi) bekannt. Chemisch ist es eine Mischung aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten und wird von Ribi Immunochem, Montana hergestellt. Eine bevorzugt Form von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A wird in EP 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA) offenbart.
Bevorzugt sind die Partikel von 3D-MPL klein genug, um durch eine 0,22 μm-Membran sterilfiltriert zu werden ( EP 0 689 454 ). 3D-MPL wird im Bereich von 10-100 μg, bevorzugt 25-50 μg pro Dosis vorhanden sein, worin das Antigen typischerweise in einem Bereich von 2-50 μg pro Dosis vorhanden sein wird.
Ein anderer bevorzugter Hilfsstoff umfaßt QS21, eine HPLC-gereinigte, nicht-toxische Fraktion, die aus der Rinde von Quillaja Saponaria Molina stammt. Gegebenenfalls kann dies mit 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL), gegebenenfalls zusammen mit einem Träger, vermischt werden.
Das Verfahren zur Herstellung von QS21 wird in US-PS 5 057 540 offenbart.
Nicht-reaktogene Hilfsstofformulierungen, die QS21 enthalten, wurden zuvor beschrieben (WO 96/33739). Es wurde gezeigt, daß solche Formulierungen, die QS21 und Cholesterin umfassen, erfolgreiche TH1-stimulierende Hilfsstoffe bei Formulierung zusammen mit einem Antigen sind.
Weitere Hilfsstoffe, die bevorzugte Stimulatoren der TH1-Zell-Reaktion sind, schließen immunmodulatorische Oligonukleotide ein, z.B. unmethylierte CpG-Sequenzen, wie in WO 96/02555 offenbart.
Kombinationen von unterschiedlichen TH1-stimulierenden Hilfsstoffen, wie den hier oben genannten, werden ebenfalls als Bereitstellung eines Hilfsstoffs erwogen, der ein bevorzugter Stimulator der TH1-Zell-Reaktion ist. Z.B. kann QS21 zusammen mit 3D-MPL formuliert werden. Das Verhältnis von QS21:3D-MPL wird typischerweise in der Größenordnung von 1.10 bis 10:1 sein, bevorzugt 1:5 bis 5:1 und häufig im wesentlichen 1:1. Der bevorzugte Bereich für eine optimale Synergie ist 2,5:1 bis 1:1 3D-MPL:QS21.
Bevorzugt ist ein Träger ebenfalls in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung vorhanden. Der Träger kann eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder ein Aluminiumsalz, wie Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid, sein.
Eine bevorzugte Öl-in-Wasser-Emulsion umfaßt ein metabolisierbares Öl, wie Squalen, alpha-Tocopherol und Tween 80. In einem besonders bevorzugten Aspekt werden die Antigene in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung mit QS21 und 3D-MPL in einer solchen Emulsion kombiniert. Zusätzlich kann die Öl-in-Wasser-Emulsion Span 85 und/oder Lecithin und/oder Tricaprylin enthalten.
Zur humanen Verabreichung werden QS21 und 3D-MPL typischerweise in einem Impfstoff im Bereich von 1-200 μg, wie 10-100 μg, bevorzugt 10-50 μg pro Dosis vorhanden sein. Typischerweise wird die Öl-in-Wasser-Emulsion 2 bis 10 % Squalen, 2 bis 10 % alpha-Tocopherol und 0,3 bis 3 % Tween 80 umfassen. Bevorzugt ist das Verhältnis von Squalen:alpha-Tocopherol gleich oder weniger als 1, da dies eine stabilere Emulsion liefert. Span85 kann ebenfalls in einer Menge von 1 % vorhanden sein. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, daß die erfindungsgemäßen Impfstoffe ferner einen Stabilisator enthalten werden.
Nicht-toxische Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten bevorzugt ein nicht-toxisches Öl, z.B. Squalan oder Squalen, einen Emulgator, z.B. Tween 80, in einem wäßrigen Träger. Der wäßrige Träger kann z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung sein.
Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine polyvalente Impfstoffzusammensetzung bereit, die eine Impfstofformulierung der Erfindung in Kombination mit anderen Antigenen umfaßt, insbesondere anderen Antigenen, die zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten und verwandten Zuständen nützlich sind. Eine solche polyvalente Impfstoffzusammensetzung kann einen TH-1-induzierenden Hilfsstoff wie hier beschrieben einschließen.
Obwohl die Erfindung in bezug auf bestimmte BASB031-Polypeptide und -Polynukleotide beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, daß dies Fragmente der natürlich vorkommenden Polypeptide und Polynukleotide und ähnliche Polypeptide und Polynukleotide mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen, die die immunogenen Eigenschaften der rekombinanten Polypeptide oder Polynukleotide nicht substantiell beeinträchtigen, umfaßt.
Zusammensetzungen, Kits und Verabreichung
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein BASB031-Polynukleotid und/oder ein BASB031-Polypeptid zur Verabreichung an eine Zelle oder einen multizellulären Organismus umfassen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Zusammensetzungen, die ein hier diskutiertes Polynukleotid und/oder Polypeptid oder deren Agonisten oder Antagonisten umfassen. Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können in Kombination mit einem nicht-sterilen oder sterilen Träger oder Trägern zur Verwendung mit Zellen, Geweben oder Organismen eingesetzt werden, wie mit einem pharmazeutischen Träger, der zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist. Solche Zusammensetzungen umfassen z.B. ein Additiv für das Medium oder eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten. Solche Träger können einschließen, aber sind nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen daraus. Die Formulierung sollte für den Verabreichungsmodus passen. Die Erfindung betrifft ferner diagnostische und pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind.
Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie mit therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in jeder effektiven, zweckmäßigen Weise verabreicht werden, z.B. u.a. zur Verabreichung auf dem topischen, oralen, analen, vaginalen, intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, intranasalen oder intradermalen Weg.
In der Therapie oder als Prophylaktikum kann das aktive Mittel an ein Individuum als injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, z.B. als sterile wäßrige Dispersion, bevorzugt isotonisch.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids, wie die lösliche Form eines Polypeptids und/oder Polynukleotids der vorliegenden Erfindung, eines agonistischen oder antagonistischen Peptids oder kleinen Moleküls in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten umfassen. Solche Träger schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen daraus. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind. Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie mit therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die Zusammensetzung wird an den Verabreichungsweg angepaßt werden, z.B. auf einem systemischen oder einem oralen Weg. Bevorzugte Formen der systemischen Verabreichung schließen Injektion, typischerweise durch intravenöse Injektion, ein. Andere Injektionswege, wie subkutan, intramuskuläre oder intraperitoneal, können verwendet werden. Alternative Mittel zur systemischen Verabreichung schließen die transmukosale und transdermale Verabreichung unter Verwendung von Penetrationsmitteln, wie Gallensalzen oder Fusidinsäuren oder anderen Detergenzien, ein. Falls ein Polypeptid oder andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu einer enterischen oder verkapselten Formulierung formuliert werden kann, mag zusätzlich die orale Verabreichung auch möglich sein. Die Verabreichung dieser Verbindungen kann ebenfalls topisch und/oder lokalisiert in Form von Salben, Pasten, Gelen, Lösungen, Pulvern und dgl. sein.
Zur Verabreichung an Säugetiere und insbesondere Menschen wird erwartet, daß das tägliche Dosierungsniveau des aktiven Mittels von 0,01 mg/kg bis 10 mg/kg sein wird, typischerweise ca. 1 mg/kg. Der Arzt wird in jedem Fall die tatsächliche Dosierung bestimmen, die am meisten geeignet für ein Individuum sein wird, und sie wird mit dem Alter, Gewicht und der Reaktion des besonderen Individuums variieren. Die obigen Dosierungen sind exemplarisch für den Durchschnittsfall. Es kann natürlich individuelle Fälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche indiziert sind.
Der Dosierungsbereich hängt von der Wahl des Peptids, dem Verabreichungsweg, der Natur der Formulierung, der Natur des Zustands des Patienten und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Geeignete Dosierungen sind jedoch im Bereich von 0,1-100 μg/kg Patient.
Eine Impfstoffzusammensetzung ist zweckmäßig in injizierbarer Form. Zweckmäßige Hilfsstoffe können eingesetzt werden, um die Immunreaktion zu steigern. Eine geeignete Einheitsdosis zur Impfung ist 0,5-5 μg/kg von Antigen, und eine solche Dosis wird bevorzugt 1- bis 3-mal und mit einem Intervall von 1 bis 3 Wochen verabreicht. Mit dem angegebenen Dosisbereich werden keine nachteiligen toxikologischen Wirkungen mit den Verbindungen der Erfindung beobachtet werden, die ihre Verabreichung an geeignete Individuen ausschließen würden.
Große Variationen der erforderlichen Dosierung sind jedoch hinsichtlich der Vielzahl von verfügbaren Verbindungen und der unterschiedlichen Wirksamkeiten der verschiedenen Verabreichungswege zu erwarten. Z.B. würde erwartet werden, daß die orale Verabreichung höhere Dosierungen als die Verabreichung durch intravenöse Injektion erfordert. Variationen in diesen Dosierungsniveaus können unter Verwendung von empirischen Standardroutinen zur Optimierung eingestellt werden, wie es allgemein auf diesem Gebiet verständlich ist.
Sequenzdatenbanken, Sequenzen in einem greifbaren Medium und Algorithmen
Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen bilden eine wertvolle Informationsquelle, mit der ihre 2- und 3-dimensionalen Strukturen bestimmt sowie weitere Sequenzen ähnlicher Homologie identifiziert werden können. Diese Ansätze werden am leichtesten durch Speicherung der Sequenz in einem computerlesbaren Medium und anschließende Verwendung der gespeicherten Daten in einem bekannten makromolekularen Strukturprogramm oder zur Recherche einer Sequenzdatenbank unter Verwendung allgemein bekannter Recherchenwerkzeuge, wie das GCG-Programmpaket, erleichtert.
Ebenfalls durch die Erfindung bereitgestellt werden Verfahren zur Analyse von Symbolsequenzen oder Ketten, insbesondere genetischen Sequenzen oder codierten Proteinsequenzen. Bevorzugte Verfahren der Sequenzanalyse schließen z.B. ein Verfahren der Sequenzhomologieanalyse, wie Identitäts- und Ähnlichkeitsanalyse, DNA-, RNA- und Protein-Strukturanalyse, Sequenzaufbau, kladistische Analyse, Sequenzmotivanalyse, Bestimmung des offenen Leserasters, Nukleinsäure-Basenzählung ("base calling"), Analyse der Codonenverwendung, Nukleinsäure-Basenbeschneidung ("base trimming") und sequenzierenden Chromatogramm-Peakanalyse.
Ein Verfahren auf Computerbasis wird zur Durchführung der Homologieindentifizierung bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Schritte: Bereitstellen einer ersten Polynukleotidsequenz, die die Sequenz eines Polynukleotids der Erfindung in einem computerlesbaren Medium umfaßt; und Vergleichen der ersten Polynukleotidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung der Homologie.
Ein Verfahren auf Computerbasis wird ebenfalls zur Durchführung der Homologieidentifizierung bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Bereitstellen einer ersten Polypeptidsequenz, die die Sequenz eines Polypeptids der Erfindung in einem computerlesbaren Medium umfaßt; und Vergleichen der ersten Polypeptidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung von Homologie.
Alle Veröffentlichungen und Literaturstellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung zitiert werden, werden hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Literaturstelle spezifisch und individuell als durch Verweis in vollständiger Länge eingeführt angegeben wäre. Jede Patentanmeldung, deren Priorität diese Anmeldung beansprucht, wird ebenfalls durch Verweis hier in ihrer Gesamtheit in der oben für Veröffentlichungen und Literaturstellen beschriebenen Weise eingeführt.
Definitionen
"Identität", wie es fachbekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, wie sie durch Vergleich der Sequenzen bestimmt wird. Auf diesem Gebiet bezeichnet "Identität" ebenfalls den Grad der Sequenzverwandtheit zwischen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, wie es durch die Übereinstimmung zwischen Ketten solcher Sequenzen bestimmt wird. "Identität" kann leicht durch bekannte Verfahren berechnet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf diejenigen, die beschrieben werden in "Computation Molecular Biology", A.M. Lesk, Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, D.W. Smith, Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, A.M. Griffin und H.G. Griffin, Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heine, Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, M. Gribskov und J. Devereux, Hrsg. M. Stockton Press, New York, 1991; und H. Carillo und D. Lipman, SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988). Verfahren zur Identitätsbestimmung werden konstruiert, um die größte Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen zu ergeben. Außerdem sind Verfahren zur Identitätsbestimmung in öffentlich verfügbaren Computerprogrammen codifiziert. Computerprogrammverfahren zu Identitätsbestimmung zwischen zwei Sequenzen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf das GAP-Programm im GCG-Programmpaket (J. Devereux et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTN (S.F. Altschul et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)) und FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)). Die BLAST-Familie von Programmen ist öffentlich erhältlich von NCBI und aus anderen Quellen (BLAST Manual, S. Altschul et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; S. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Der allgemein bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenfalls zur Identitätsbestimmung verwendet werden.
Parameter für den Polypeptid-Sequenzvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)
Vergleichsmatrix: BLOSSUM62 von Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992)
Lücken-Strafpunkte: 8
Lückenlänge-Strafpunkte: 2
Ein für diese Parameter nützliches Programm ist öffentlich verfügbar als "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison WI. Die zuvorgenannten Parameter sind die Standardparameter für Peptidvergleiche (neben keinem Strafpunkt für Endlücken).
Parameter für den Polynukleotidvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)
Vergleichsmatrix: Übereinstimmungen = +10, Fehlübereinstimmung = 0
Lücken-Strafpunkte: 50
Lückenlänge-Strafpunkte: 3
Verfügbar als "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison WI. Dies sind die Standardparameter für Nukleinsäurevergleiche.
Eine bevorzugte Bedeutung für "Identität" für Polynukleotide und Polypeptide, je nach Fall, wird nachfolgend unter den Ziffern (1) und (2) bereitgestellt:

(1) Polynukleotid-Ausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polynukleotid ein, das eine Polynukleotidsequenz mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100 % Identität mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 umfaßt, worin die Polynukleotidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 sein kann oder bis zu einer bestimmten ganzzahligen Anzahl von Nukleotidveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Nukleotiddeletion, -substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder -insertion besteht, und worin die Verän derungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenznukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleotiden in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl von Nukleotidveränderungen durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 bestimmt wird, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl von Nukleotidveränderungen ist, x_n die Gesamtzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 ist, y 0,50 für 50 %, 0,60 für 60 %, 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 %, 0,90 für 90 %, 0,95 für 95 %, 0,97 für 97 % oder 1,00 für 100 % ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_n abgerundet wird. Veränderungen einer Polynukleotidsequenz, die das Polypeptid mit SEQ ID NO:2 codiert, können Unsinn-, Fehlsinn- oder Rasterverschiebungsmutationen in dieser codierenden Sequenz erzeugen und dadurch das Polypeptid verändern, das durch das Polynukleotid im Anschluß an solche Veränderungen codiert wird.

Als Beispiel kann eine Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 sein, d.h. sie kann zu 100 % identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzzahligen Anzahl von Nukleinsäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100 % Identität ist. Solcher Veränderungen sind aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Nukleinsäuredeletion, -substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenz-Polynukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleinsäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1 bestimmt, oder: nn ≤ xn – (xn·y)worin n_n die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen ist, x_n die Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1 ist, y z.B. 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 % etc. ist, · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_n abgerundet wird.

(2) Polypeptidausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polypeptid ein, das ein Polypeptid mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100 % Identität mit einer Polypeptid-Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 umfaßt, worin die Polypeptidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 sein kann oder bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativen und nicht-konservativen Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenz-Polypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl von Aminosäureveränderungen durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 bestimmt wird, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 ist, y 0,50 für 50 %, 0,60 für 60 %, 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 %, 0,90 für 90 %, 0,95 für 95 %, 0,97 für 97 % oder 1,00 für 100 % ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_a abgerundet wird.

Als Beispiel kann eine Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 sein, d.h. sie kann zu 100 % identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz ein schließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100 % Identität ist. Solche Veränderungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativen und nicht-konservativen Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenz-Polypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Aminosäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 bestimmt, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 ist, y z.B. 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 % etc. ist, und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_a abgerundet wird.
"Individuum"/"Individuen", wenn hier mit Bezug auf einen Organismus verwendet, bezeichnet einen multizellulären Eukaryonten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Metazoon, ein Säugetier, ein Rind, Ziege/Schaf, einen Affen, einen Primaten und einen Menschen.
"Isoliert" bedeutet "mit menschlicher Hand" aus seinem natürlichen Zustand verändert, d.h. falls es in der Natur vorkommt, wurde es aus seiner natürlichen Umgebung verändert oder entfernt oder beides. Z.B. ist ein in einem lebenden Organismus natürlich vorhandenes Polynukleotid oder Polypeptid nicht "isoliert", aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, das von den koexistierenden Materialien seines natürlichen Zustands getrennt wird, ist "isoliert", wie der Begriff hier eingesetzt wird. Außerdem ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, das in einen Organismus durch Transformation, genetische Manipulation oder durch jedes andere rekombinante Verfahren eingeführt wird "isoliert", selbst wenn es noch in dem Organismus vorhanden ist, wobei der Organismus lebend oder nicht-lebend sein kann.
"Polynukleotid(e)" bezeichnet allgemein jedes Polyribonukleotid oder Polydesoxyribonukleotid, das unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann, einschließlich einzel- und doppelsträngiger Regionen.
"Variante" bezeichnet ein Polynukleotid oder Polypeptid, das sich von einem Referenz-Polynukleotid oder -polypeptid unterscheidet, aber wesentliche Eigenschaften beibehält. Eine typische Variante eines Polynukleotids unterscheidet sich von einem anderen Referenz-Polynukleotid in der Nukleotidsequenz. Veränderungen in der Nukleotidsequenz der Vatiante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch das Referenz-Polynukleotid codiert wird, verändern oder nicht. Nukleotidveränderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und trunkierungen im Polypeptid führen, das durch die Referenzsequenz codiert wird, wie nachfolgend erörtert. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich von einem anderen Referenz-Polypeptid in der Aminosäuresequenz. Allgemein sind Unterschiede beschränkt, so daß die Sequenzen des Referenz-Polypeptids und der Variante sehr ähnlich insgesamt und in vielen Regionen identisch sind. Eine Variante und ein Referenz-Polypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen in jeder Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder insertierter Aminosäurerest kann ein solcher sein, der durch den genetischen Code codiert wird oder nicht. Eine Variante eines Polynukleotids oder Polypeptids kann eine natürlich vorkommende sein, wie eine Allelvariante oder sie kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, daß sie natürlich auftritt. Nicht-natürlich auftretende Varianten von Polynukleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenesetechniken oder durch direkte Synthese hergestellt werden.
"Krankheit(en)" bezeichnet jede Krankheit, die durch Infektion mit einem Bakterium verursacht wird oder damit verbunden ist, einschließlich z.B. Mittelohrentzündung bei Kleinkindern und Kindern, Lungenentzündung bei älteren Menschen, Sinusitis, Krankenhausinfektionen und invasive Krankheiten, chronische Mittelohrentzündung mit Gehörverlust, Flüssigkeitsanreicherung im Mittelohr, Hörnervschädigung, Verzögerung des Spracherlernens, Infektion der oberen Atemwege und Entzündung des Mittelohrs.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für die Fachleute allgemein bekannt und Routine sind, außer wenn im Detail anders beschrieben. Die Beispiele sind illustrativ, aber beschränken nicht die Erfindung.
Beispiel 1:
Auffinden und bestätigende DNA-Sequenzierung des BASB031-Gens aus Moraxella catarrhalis Stamm ATCC 43617
Das BASB031-Gen von SEQ ID NO:1 wurde zuerst in der Incyte PathoSeq-Datenbank gefunden, die unvollständige genomische DNA-Sequenzen des Moraxella catarrhalis-Stammes ATCC 43617 (ebenfalls als Stamm Mc2931 bezeichnet) enthält. Die Translation der BASB031-Polynukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NO:2, zeigte eine signifikante Ähnlichkeit (35 % Identität in einer Überlappung mit 446 Aminosäuren) mit dem PilQ-Protein von Pseudomonas aeruginosa.
Die Sequenz des BASB031-Gens wurde weiter experimentell bestätigt. Für diesen Zweck wurde genomische DNA aus 1010 Zellen der M. catarrhalis-Zellen (Stamm ATCC 43617) unter Verwendung des QIAGEN genomischen DNA-Extraktions-Kits (Qiagen GmbH) extrahiert, und 1 μg dieses Materials wurde der Polymerasekettenreaktion-DNA-Amplifikation unter Verwendung der Primer E475783 (5'-AAA TTA CCC ATA TTG ACA GTC-3') [SEQ ID NO:9] und E475484 (5'-CAA ACC GTT AAA CAA TGG TC-3') [SEQ ID NO:10] unterworfen. Dieses PCR-Produkt wurde an einer Vorrichtung Biorobot 9600 (Qiagen GmbH) gereinigt und der DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Big Dye Cycle Sequencing Kits (Perkin-Elmer) und eines DNA-Sequenzierers ABI 377/PRISM unterworfen. Die DNA-Sequenzierung wurde an beiden Strängen mit einer Redundanz von 2 durchgeführt, und die Sequenz voller Länge wurde unter Verwendung der Sequencher^TM-Software (Applied Biosystems) zusammengesetzt. Die resultierende DNA-Sequenz und abgeleitete Polypeptidsequenz sind in SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 gezeigt. Es wurde festgestellt, daß ein Nukleotid in SEQ ID NO:3 (in Position 1254) von seinem Gegenstück in SEQ ID NO:1 abwich, wie in 2 gezeigt.
Beispiel 2:
Variabilitätsanalyse des BASB031-Gens zwischen mehreren Moraxella catarrhalis-Stämmen
2A: Restriktionsfragmentlängenanalyse (RFLP)
Genomische DNA wurde aus 16 M. catarrhalis-Stämmen (dargestellt in Tabelle 1) wie nachfolgend beschrieben extrahiert. M. catarrhalis wurde auf einzelne Kolonien auf BHI-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Drei oder vier einzelne Kolonien wurden gepickt und zur Impfung einer ca. 1,5 ml-BHI-(Hirn-Herz-Infusion)-Bouillon-Impfkultur verwendet, die über Nacht in einem Schüttelinkubator mit ca. 300 U/min bei 37°C gezüchtet wurde. Ein 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, der ca. 150 ml BHI-Bouillon enthielt, wurde mit der Impfkultur geimpft und für ca. 12 bis 16 Stunden bei 37°C in einem Schüttelinkubator mit ca. 175 U/min gezüchtet, um Zellmasse zur DNA-Isolierung zu erzeugen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren in einem Sorvall GSA-Rotor mit ca. 2000 × g für 15 Minuten bei Raumtemperatur aufgefangen. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet in ca. 5,0 ml sterilem Wasser suspendiert. Ein gleiches Volumen von Lysepuffer (200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 % (G/V) SDS, 0,5 % (V/V) 2-Mercaptoethanol und 250 μg/ml Proteinase K) wurde hinzugegeben und die Zellen durch vorsichtiges Bewegen und Verreiben suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann ca. 12 Stunden bei 50°C inkubiert, um die Bakterien zu lysieren und chromosomale DNA freizusetzen. Proteinhaltiges Material wurde durch Zugabe von 5,0 ml gesättigtem NaCl (ca. 6,0 M in sterilem Wasser) und Zentrifugieren mit ca. 5500 × g in einem Sorvall SS34-Rotor bei Raumtemperatur ausgefällt. Chromosomale DNA wurde aus dem geklärten Überstand durch Zugabe von zwei Volumina 100 % Ethanol ausgefällt. Aggregierte DNA wurde aufgefangen und unter vorsichtigem Bewegen in einem kleinen Volumen einer 70%igen Ethanol-Lösung gewaschen. Gereinigte chromosomale DNA wurde in sterilem Wasser suspendiert und über Nacht bei 4°C durch vorsichtiges Schaukeln gelöst/dispergiert. Die Konzentration von gelöster DNA wurden spektrophotometrisch bei 260 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,0 O.D. Einheit zu ca. 50 μg/ml bestimmt.
Dieses Material wurde als nächstes der PCR-Amplifikation unterworfen, wobei die MC-PilQ-BamF-Oligonukleotide (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC GAT ACT CAT ATC GAT CAT GTG TCT GTT ACC CA-3') [SEQ ID NO:11] und MC-PilQ-SalRC (AAC GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA CTA TCT TAC CAA TTT GGG TGT AAT AAA AAT CAA AA -3') [SEQ ID NO:12] verwendet wurden. Die entsprechenden BASB031-Gen-Amplicons wurden dann unabhängig unter Verwendung von Restriktionsenzymen (Sau3A2, MseI, MaeII, NlaIII, AciI, RsaI) hydrolysiert, und die Restriktionsprodukte wurden durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie getrennt, wie beschrieben in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", zweite Auflage, Hrsg.: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Press 1989. Die Photographien der resultierenden Elektrophoresegele sind in 1 dargestellt. Für jeden Stamm wurden RFLP-Muster, die den 6 Restriktionsenzymen entsprechen, bewertet und kombiniert. Gruppen von Stämmen, die eine identische Kombination von RFLP-Mustern teilen, wurden dann definiert. Unter Verwendung dieser Methodik fielen die in dieser Untersuchung getesteten Stämme in 4 genomische Gruppen (Gruppe 1: Mc2904, Mc2905, Mc2907, Mc2908, Mc2910, Mc2911, Mc2912, Mc2926, Mc2931, Mc2956, Mc2960, Mc2969, Mc2969, Mc2975; Gruppe 2: Mc2906; Gruppe 3: Mc2909; Gruppe 4: Mc2913). Diese Daten stützen, daß die in dieser Untersuchung verwendete Population von Moraxella catarrhalis eine beschränkte Nukleotidsequenz-Diversität für das BASB031-Gen zeigt.
2B: DNA-Sequenzierung in anderen Stämmen:
Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen experimentellen Verfahrens wurde ebenfalls die Sequenz des BASB031-Gens für zwei andere Moraxella catarrhalis-Stämme (Mc2911 und Mc2969) bestimmt. Die Polynukleotidsequenzen des BASB031-Gens der Stämme Mc2911 und Mc2969 sind in SEQ ID NO:5 bzw. 7 gezeigt. Diese Polynukleotidsequenzen wurden zu Aminosäuresequenzen translatiert, die in SEQ ID NO:6 bzw. 8 gezeigt sind. Unter Verwendung des MegAlign-Programms aus dem DNASTAR-Lasergene-Paket wurde eine multiple Angleichung der Polynukleotidsequenzen von SEQ ID NO:1, 3, 5 und 7 durchgeführt und ist in 2 dargestellt. Ein paarweiser Vergleich der Identitäten ist in Tabelle 2 zusammengefaßt, die zeigt, daß die vier BASB031-Nukleotid-Gensequenzen alle ähnlich mit einem Identitätsgrad von mehr als 98,0 % sind. Unter Verwendung des gleichen Programms wurde eine multiple Angleichung der Polypeptidsequenzen von SEQ ID NO:2, 4, 6 und 8 durchgeführt und ist in 3 dargestellt. Ein paarweiser Vergleich der Identitäten in Tabelle 3 zusammengefaßt, die zeigt, daß die vier BASB031-Proteinsequenzen alle ähnlich mit einem Identitätsgrad von mehr als 99,0 % sind.
Tabelle 1: Merkmale der in dieser Untersuchung verwendeten Stämme von Moraxella catarrhalis
Tabelle 2: Paarweise Identitäten der BASB031-Polynukleotidsequenzen (in %)
Tabelle 3: Paarweise Identitäten der BASB031-Polypeptidsequenzen (in %)
Beispiel 3: Konstruktion von Plasmid zur Expression von rekombinantem BASB031
A: Klonierung von BASB031
Die BamHI- und SalI-Restriktionsstellen, eingefügt in die vorwärts ([SEQ ID NO:11]) bzw. reversen komplementären ([SEQ ID NO:12]) Amplifikationsprimer, erlaubte die direktionale Klonierung eines PCR-Produkts mit ca. 1400 bp in das kommerziell erhältliche E. coli-Expressionsplasmid pQE30 (QiaGen, ampicillinresistent), so daß ein reifes BASB031-Protein als Fusionsprotein exprimiert werden konnte, das einen (His)6-Affinitätschromatographie-Tag am N-Terminus enthielt. Das BASB031-PCR-Produkt wurde aus der Amplifikationsreaktion unter Verwendung von Spin-Säulen auf Kieselgelbasis (QiaGen) gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt. Zur Herstellung der erforderlichen BamHI- und SalI-Termini, die zum Klonieren notwendig sind, wurde gereinigtes PCR-Produkt sequentiell vollständig mit BamHI- und SalI-Restriktionsenzymen wie vom Hersteller (Life Technologies) empfohlen verdaut. Im Anschluß an die erste Restriktionsverdauung wurde das PCR-Produkt über Spin-Säulen wie oben gereinigt, um Salze zu entfernen, und in sterilem Wasser vor der zweiten Enzymverdauung eluiert. Das verdaute DNA-Fragment wurde erneut unter Verwendung von Spin-Säulen auf Kieselgelbasis vor der Ligation mit dem pQE30-Plasmid gereinigt.
B: Herstellung von Expressionsvektor
Zur Herstellung des Expressionsplasmids pQE30 zur Ligation wurde es ähnlich vollständig mit sowohl BamHI als auch SalI verdaut und dann mit Kälberdarmphosphatase (CIP, ca. 0,02 Einheiten/pmol von 5'-Ende, Life Technologies) gemäß Hersteller zur Verhinderung von Selbstligation behandelt. Ein ca. 5-facher molarer Überschuß des verdauten Fragments zum hergestellten Vektor wurde zur Programmierung der Ligationsreaktion verwendet. Eine Standard-Ligationsreaktion mit ca. 20 μl (ca. 16°C, ca. 16 Stunden) unter Verwendung von fachbekannten Verfahren wurde unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (ca. 2,0 Einheiten/Reaktion, Life Technologies) durchgeführt. Eine Teilmenge der Ligation (ca. 5 μl) wurde zur Transformation von elektrokompetenten M15 (pREP4)-Zellen gemäß fachbekannten Verfahren verwendet. Im Anschluß an einen ca. 2- bis 3-stündigen Auswuchszeitraum bei 37°C in ca. 1,0 ml LB-Bouillon wurden transformierte Zellen auf LB-Agarplatten ausplattiert, die Kanamycin (50 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) enthielten. Beide Antibiotika wurden in den Selektionsmedien eingeschlossen um sicherzustellen, daß alle transformierten Zellen sowohl das pREP4-Plasmid (KnR), das das für die Repression der Expression für die IPTG-induzierbare Expression von Proteinen an pQE30 erforderliche lacIq-Gen trägt, als auch das pQE30-BASB031-Plamid (ApR) trugen. Platten wurden über Nacht bei 37°C für ca. 16 Stunden inkubiert. Individuelle KnR/ApR-Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern gepickt und verwendet, um frische LB-KnR/ApR-Platten sowie ca. 1,0 ml LB-KnR/ApR-Bouillonkultur zu "Patch"-impfen. Sowohl die "Patch"-Platten als auch die Bouillonkultur wurden über Nacht bei 37°C entweder in einem Standardinkubator (Platten) oder einem Schüttelwasserbad inkubiert.
Eine PCR-Analyse auf Vollzellbasis wurde eingesetzt um zu verifizieren, daß die Transformanten das BASB031-DNA-Insert enthielten. Hier wurden die ca. 1,0 ml Übernacht-Lb-Kn/Ap-Kulturbouillon in 1,5 ml Polypropylenröhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugieren in einer Beckmann-Mikrozentrifuge (ca. 3 min. Raumtemperatur, ca. 12 000 × g) gesammelt. Das Zellpellet wurde in ca. 200 μl sterilem Wasser suspendiert, und eine ca. 10 μl-Teilmenge wurde zur Programmierung einer PCR-Reaktion mit ca. 50 μl Endvolumen verwendet, die sowohl vorwärts- als auch reverse BASB031-Amplifikationsprimer enthielt. Endkonzentrationen der PCR-Reaktionskomponenten waren im wesentlichen die gleichen wie die in Beispiel 2 angegebenen, außer daß ca. 5,0 Einheiten Taq-Polymerase verwendet wurden. Der erste Denaturierungsschritt mit 95°C wurde auf 3 Minuten erhöht, um eine thermische Aufbrechung der bakteriellen Zellen und Freisetzung von Plasmid-DNA sicherzustellen. Ein Thermocycler ABI Modell 9700 und ein dreistufiges thermisches Amplifikationsprofil mit 32 Durchläufen, d.h. 95°C, 45 s; 55-58°C, 45 s; 72°C, 1 min wurden verwendet, um das BASB031-PCR-Fragment aus den lysierten Transformantenproben zu amplifizieren. Im Anschluß an die thermische Amplifikation wurde eine Teilmenge von ca. 20 μl der Reaktion durch Agarose-Gelelektrophorese (0,8 % Agarose in einem Tris-Acetat-EDTA-(TAE)-Puffer) analysiert. DNA-Fragmente wurden durch UV-Beleuchtung nach Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärbung visualisiert. Ein DNA-Molekülgrößenstandard (1 Kb-Treppe, Life Technologies) wurde parallel zu den Testproben der Elektrophorese unterworfen und wurde verwendet, um die Größe der PCR-Produkte abzuschätzen. Transformanten, die das erwartete PCR-Produkt mit ca. 1400 bp erzeugten, wurden als Stämme identifiziert, die ein BASB031-Expressionskonstrukt enthielten. Expressionsplasmid enthaltende Stämme wurden dann auf die induzierbare Expression von rekombinantem BASB031 analysiert.
C: Expressionsanalyse von PCR-positiven Transformanten
Für jede oben identifizierte PCR-positive Transformante wurden ca. 5,0 ml LB-Bouillon, die Kanamycin (50 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) enthielt, mit Zellen aus der "Patch-Platte" geimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln (ca. 250 U/min) gezüchtet. Eine Teilmenge der Übernacht-Impfkultur (ca. 1,0 ml) wurde in einen 125 ml-Erlenmeyerkolben übergeimpft, der ca. 25 ml LB Kn/Ap-Bouillon enthielt, und bei 37°C unter Schütteln (ca. 250 U/min) gezüchtet, bis die Kulturtrübung ein O.D. 600 ca. 0,5 erreichte, d.h. eine mittlere log-Phase (gewöhnlich ca. 1,5-2,0 Stunden). Zu diesem Zeitpunkt wurde ca. die Hälfte der Kultur (ca. 12,5 ml) in einen zweiten 125 ml-Kolben überführt und die Expression von rekombinantem BASB031-Protein durch Addition von IPTG (1,0 M Vorrat, hergestellt in sterilem Wasser, Sigma) auf eine Endkonzentration von 1,0 mM induziert. Die Inkubation sowohl der IPTG-induzierten als auch nicht-induzierten Kulturen wurde für weitere ca. 4 Stunden bei 37°C unter Schütteln fortgesetzt. Proben (ca. 1,0 ml) von sowohl induzierten als auch nicht-induzierten Kulturen wurden nach dem Induktionszeitraum entfernt und die Zellen durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für ca. 3 Minuten aufgefangen. Individuelle Zellpellets wurden in ca. 50 μl sterilem Wasser suspendiert, und dann mit einem gleichen Volumen von 2 × Laemelli SDS-PAGE-Probenpuffer vermischt, der 2-Mercaptoethanol enthielt, und in ein siedendes Wasserbad für ca. 3 min zur Denaturierung des Proteins gestellt. Gleiche Volumina (ca. 15 μl) von sowohl rohem IPTG-induzierten als auch nicht-induzierten Zelllysaten wurden auf doppelte 12 % Tris/Glycin-Polyacrylamidgele (1 mm dicke Mini-gels, Novex) geladen. Die induzierten und nicht-induzierten Lysatproben wurden zusammen mit vorangefärbten Molekulargewichtsmarkern (SeeBlue, Novex) unter herkömmlichen Bedingungen unter Verwendung eines Standard-SDS/Tris/Glycin-Laufpuffers (BioRad) elektrophoretisch behandelt. Im Anschluß an die Elektrophorese wurde ein Gel mit Comassie-Brilliant-Blue R250 (BioRad) angefärbt und dann zur Visualisierung neuer BASB031-IPTG-induzierbarer Proteine entfärbt. Das zweite Gel wurde auf eine PVDF-Membran (0,45 μm Porengröße, Novex) für ca. 2 h bei 4°C unter Verwendung einer BioRad Mini-Protean II-Blotting-Vorrichtung und Towbin-Methanol (20 %) Transferpuffer elektrogeblottet. Das Blockieren der Membran und Antikörper-Inkubationen wurden gemäß allgemein bekannten Verfahren durchgeführt. Ein monoklonaler Anti-RGS(His)3-Antikörper gefolgt von einem zweiten Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper, konjugiert an HRP (QiaGen), wurden verwendet, um die Expression und Identität des rekombinanten BASB031-Proteins zu bestätigen. Visualisierung des Anti-His-Antikörper-reaktiven Musters wurde erreicht unter Verwendung entweder eines ABT-unlöslichen Substrats oder unter Verwendung von Hyperfilm mit dem Amersham ECL-Chemilumineszenzsystem.
D: Sequenzbestätigung
Zur weiteren Verifizierung, daß das exprimierte IPTG-induzierbare rekombinante BASB031-Protein im richtigen offenen Leseraster ist und nicht ein scheinbares Molekül ist, das aus einem Klonierungsartefakt stammt (d.h. eine Rasterverschiebung), wurde die DNA-Sequenz des klonierten Inserts bestimmt. Die DNA-Sequenz für das M. catarrhalis BASB031-Gen wurde aus einem Strang unter Verwendung herkömmlicher asymmetrischer PCR-Cyclus-Sequenzierungsmethodik erhalten (ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Sequenzierungsreaktionen wurden mit unverdauter Expressionsplasmid-DNA (ca. 0,5 μg/rxn) als Matrize und geeigneten pQUE30 Vektor-spezifischen und ORF-spezifischen Sequenzierungsprimern (ca. 3,5 pmol/rxn) programmiert. Zusätzlich zur Matrize und zum Sequenzierungsprimer enthielt jede Sequenzierungsreaktion (ca. 20 μl) die vier unterschiedlichen dNTPs (d.h. A, G, C und T) und die vier entsprechenden ddNTPs (d.h ddA, ddG, ddC und ddT) Terminatornukleotide; wobei jeder Terminator an einen der vier Fluoreszenzfarbstoffe Joe, Tam Rox oder Fam konjugiert war. Einsträngige Sequenzierungsverlängerungsprodukte wurden an statistischen Positionen entlang der Matrize durch Einbau der Farbstoff-markierten ddNTP-Terminatoren beendet. Fluoreszenzfarbstoff-markierte Terminationsprodukte wurden unter Verwendung von Mikrozentrifugen-Größenausschlußchromatographie-Säulen (Princeton Genetics) gereinigt, im Vakuum getrocknet, in einem Template Resuspension-Puffer (Perkin-Elmer) zur Kapillarelektrophorese oder entionisiertem Formamid für PAGE suspendiert, für ca. 5 min bei 95°C denaturiert und durch hochauflösende Kapillarelektrophorese (ABI 310 Automated DNA Sequenator, Perkin-Elmer) oder hochauflösendes PAGE (ABI 377 Automated DNA Sequenator) gemäß Herstellerempfehlung analysiert. Aus individuellen Reaktionen erzeugte DNA-Sequenzdaten wurden gesammelt und die relativen Fluoreszenz-Peak-Intensitäten automatisch auf einem PowerMAC-Computer unter Verwendung von ABI-Sequence Analysis Software (Perkin-Elmer) analysiert. Individuell autoanalysierte DNA-Sequenzen wurden manuell auf Genauigkeit editiert, bevor sie zu einer konsensus-Einzelstrangsequenz-"Kette" unter Verwendung von AutoAssembler-Software (Perkin-Elmer) verbunden wurden. Die Sequenzierung bestimmte, daß das Expressionsplasmid die richtige Sequenz im richtigen offenen Leseraster enthielt.
Beispiel 4: Produktion von rekombinantem BASB031
Bakterienstamm
Ein rekombinanter Expressionsstamm von E. coli M15 (pREP4), der ein Plasmid enthielt (pQE30), das BASB031 aus M. catarrhalis codiert, wurde zur Erzeugung von Zellmasse zur Reinigung von rekombinantem Protein verwendet. Der Expressionsstamm wurde auf LB-Agarplatten kultiviert, die 50 μg/ml Kanamycin ("Kn") und 100 μg/ml Ampicillin ("Ap") enthielten, um sicherzustellen, daß sowohl das pREP4 lacIq-Kontrollplasmid als auch das pQE30-BASB031-Expressionskonstrukt beide aufrecht erhalten wurden. Zur Gefriertrocknung bei –80°C wurde der Stamm in LB-Bouillon fortgepflanzt, die die gleiche Konzentration von Antibiotika enthielt, und dann mit einem gleichen Volumen von LB-Bouillon vermischt, die 30 % (G/V) Glycerin enthielt.
Medien
Das zur Erzeugung von rekombinantem Protein verwendete Fermentationsmedium bestand aus 2 × YT-Bouillon (Difco), die 50 μg/ml Kn und 100 μg/ml Ap enthielt. Antischaummittel wurde zum Medium für den Fermenter mit 0,25 ml/l hinzugegeben (Antifoam 204, Sigma). Zur Induzierung der Expression von rekombinantem BASB031-Protein wurde IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zum Fermenter gegeben (1 mM, Endkonzentration).
Fermentation
Ein 500 ml-Erlenmeyer-Impfkolben, der 50 ml Arbeitsvolumen enthielt, wurde mit 0,3 ml von schnell aufgetauter tiefgefrorener Kultur oder mehreren Kolonien aus einer selektiven Agarplattenkultur geimpft und für ca. 12 Stunden bei 37 ± 1°C auf einem Schütteltisch mit 150 U/min (Innova 2100, New Brunswick Scientific) inkubiert. Diese Impfkultur wurde dann verwendet, um einen Fermenter mit 5 l Arbeitsvolumen zu impfen, der 2 × YT-Bouillon und sowohl Kn- als auch Ap-Antibiotika enthielt. Der Fermenter (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) wurde bei 37 ± 1°C, 0,2-0,4 VVM Luftvolumen und 250 U/min mit Rushton-Flügelrädern betrieben. Der pH wurde weder in der Kolbenkulutur noch im Fermenter kontrolliert. Während der Fermentation war der pH im Bereich von 6,5 bis 7,3 im Fermenter. IPTG (1,0 M Vorratslösung, hergestellt in sterilem Wasser) wurde zum Fermenter gegeben, als die Kultur das Wachstum der mittleren logarithmischen Phase erreichte (ca. 0,7 OD 600 Einheiten). Zellen wurden für 2-4 Stunden induziert und dann durch Zentrifugieren geerntet, wobei entweder ein 28RS Heraeus (Sepatech) oder eine RC5C Superspeed-Zentrifuge (Sorvall Instruments) verwendet wurde. Zellpaste wurde bei –20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
Reinigung
Chemikalien und Materialien
Imidazol, Guanidinhydrochlorid, Tris(hydroxymethyl) und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) von Biotechnologie-Qualität oder besser wurden alle von Ameresco Chemical, Solon, Ohio erhalten. Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxy-ethanol), einbasiges Natriumphosphat und Harnstoff waren von Analysenqualität oder besser und wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri erhalten. Eisessig und Salzsäure wurden von Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, New Jersey, erhalten. Methanol wurde von Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey erhalten. Pefabloc^®SC (4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid), komplette Proteaseinhibitor-Cocktailtabletten und PMSF (Phenylmethyl-sulfonylfluorid) wurden von Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana erhalten. Bestatin, Pepstatin A und E-64 Protease-Inhibitor wurden von Calbiochem, LaJolla, Californien erhalten. Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1 × PBS) wurde von Quality Biological Inc., Gaithersburg, Maryland erhalten. Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (10 × PBS) wurde von BioWhittaker, Walkersville, Mayrland erhalten. Penta-His-Antikörper, BSA-frei, wurde von QiaGen, Valencia, Californien erhalten. Peroxidase-konjugiertes AffiniPure Ziege-Anti-Maus-IgG wurde von Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. erhalten. AEC-Einfachlösung wurde von Zymed, South San Francisco, Californien erhalten. Alle anderen Chemikalien waren von Analysenqualität oder besser.
Ni-NTA-Superflow-Harz wurde von QiaGen Inc., Valencia, Californien erhalten. Vorgegossene Tris-Glycin 4-20 % und 10-20 % Polyacrylamidgele, alle Laufpuffer und Lösungen, SeeBlue Pre-Stained Standards, MultiMark Multi-Colored Standards und PVDF-Transfermembranen wurden von Novex, San Diego, Californien erhalten. SDS-PAGE Silver Stain-Kits wurden von Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokyo, Japan erhalten. Coomassie-Anfärbelösung wurde von Bio-Rad Laboratories, Hercules, Californien erhalten. Acrodisc^®PF 0.2 μ-Spritzenfilter wurden von Pall Gelman Sciences, Ann. Arbor, Michigan, erhalten. GD/X 25 mm Einwegspritzenfilter wurden von Whatman Inc., Clifton, New Jersey erhalten. Dialyseschläuche mit Molekulargewichtskante 8 000 wurden von BioDesign Inc., New York, Carmal New York, erhalten. BCA Protein-Assay-Reagenzien und Snake Skin-Dialyseschläuche mit Molekulargewichtskante 3 500 wurden von Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois erhalten.
Extraktionsprotokoll
Zellpaste wurde bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Minuten aufgetaut. 5 bis 6 g Material wurden in ein 50 ml-Einwegzentrifugenröhrchen abgewogen. Dazu wurden 5 ml/g Guanidinhydrochlorid (Gu-HCl)-Puffer gegeben (6 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05 % Triton X-100, pH 8,0). Zellpaste wurde unter Verwendung eines PR0300D Proscientific Homogenisators mit 3/4 der Leistung für 1 Minute resuspendiert. Die Extraktionsmischung wurde dann auf Raumtemperatur unter vorsichtigem Rühren für 60 bis 90 Minuten gestellt. Nach 60 bis 90 Minuten wurde die Extraktionsmischung mit 15 800 × g für 15 Minuten zentrifugiert, (Sorvall RC5C-Zentrifuge, 11 500 U/min). Der Überstand (S1) wurde abdekantiert und zur weiteren Reinigung aufbewahrt. Das Pellet (P1) wurde zur Analyse aufbewahrt.
Bindung von BASB031 an Nickel-NTA-Harz
Zu S1 werden 3 bis 4 ml Ni-NTA-Harz gegeben. Dies wird dann bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Rühren für 1 Stunde gehalten. Nach einer Stunde wird das S1/Ni-NTA in eine XK16 Pharmacia-Säule gepackt. Die Säule wird dann mit 1 M Gu-HCl-Puffer gewaschen (1 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05 % Triton X-100, pH 8,0). Diesem folgt dann eine Spülung mit Phosphatpuffer (100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05 % Triton X-100, pH 6,3). Das Protein wird dann aus der Säule mit 250 mM Imidazolpuffer eluiert (250 mM Imidazol, 100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05 % Triton X-100, pH 5,9).
Endformulierung
BASB031 wurde durch Dialyse über Nacht gegen drei Wechsel von 0,1 % Triton X-100 und 1 × PBS, pH 7,4, formuliert, um verbleibendes Gu-HCl und Imidazol zu entfernen. Das gereinigte Protein wurde charakterisiert und zur Erzeugung von Antikörpern wie nachfolgend beschrieben verwendet.
Biochemische Charakterisierung
SDS-PAGE und Western Blot-Analyse
Das rekombinante gereinigte Protein wurde an 4-20 % Polyacrylamidgelen getrennt und elektrophoretisch auf PVDF-Membranen mit 100 V für 1 Stunde wie zuvor beschrieben übertragen (Thebaine et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). Die PVDF-Membranen wurden dann mit 25 ml Dulbecco Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 5 % fettarme Trockenmilch enthielt, vorbehandelt. Alle anschließenden Inkbuationen wurden unter Verwendung dieses Vorbehandlungspuffers durchgeführt.
PVDF-Membranen wurden mit 25 ml einer 1:500-Verdünnung von Vorimmunserum oder Kaninchen-Anti-His-Immunserum für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. PVDF-Membranen wurden dann zweimal mit Waschpuffer gewaschen (20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 150 mM Natriumchlorid und 0,05 % Tween-20 enthielt). PVDF-Membranen wurden mit 25 ml einer 1:5000-Verdünnung von Peroxidase-markiertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. PVDF-Membranen wurden dann 4-mal mit Waschpuffer gewaschen und wurden mit 3-Amino-9-ethylcarbazol und Harnstoffperoxid wie von Zymed geliefert (San Fracisco, CA) für jeweils 10 Minuten entwickelt.
Die Ergebnisse eines SDS-PAGE (4) zeigen ein Protein mit ca. 52 kDa, das reaktiv gegenüber einem Anti-RGS(HIs)-Antikörper durch Western Blots des SDS-PAGE ist.
Proteinsequenzierung
Amino-terminale Aminosäuresequenzierung des gereinigten Proteins wurde durchgeführt, um die Erzeugung des richtigen rekombinanten Proteins zu bestätigen, wobei wohldefinierte chemische Protokolle an einem Hewlett-Packard Modell G1000A-Sequenzer mit einem Modell 1090 LC und einem Hewlett-Packard Modell 241 Sequenzer mit einem Modell 1100 LC verwendet wurden.
Beispiel 5: Herstellung von Antiseren gegen rekombinantes BASB031
Gegen das BASB031-Protein gerichtete polyvalente Antiseren wurden durch Impfung von zwei Kaninchen mit dem gereinigten rekombinanten BASB031-Protein erzeugt. Jedem Tier werden insgesamt drei Immunisierungen intramuskulär (i.m.) von ca. 20 μg BASB031-Protein pro Injektion (beginnend mit kompletten Freund-Adjuvans und gefolgt von unvollständigem Freund-Adjuvans) in Intervallen von ca. 21 Tagen gegeben. Den Tieren wurde vor der ersten Immunisierung ("Vorblutung") und an den Tagen 35 und 57 Blut entnommen.
Anti-BASB031-Protein-Reaktionen wurden durch ein ELISA unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem BASB031-Protein (0,5 μg/Vertiefung) überwacht. Der Titer wird als die höchste Verdünnung definiert, die gleich oder größer als 0,1 ist, berechnet mit der folgenden Gleichung:
Durchschnitts-OD von zwei Testproben von Antiseren – Durchschnitts-OD von zwei Testproben von Puffer. Die Antiseren wurden als erster Antikörper zur Identifizierung des Proteins in einem Western Blot wie in Beispiel 4 oben beschrieben verwendet. Der Western-Blot zeigt die Gegenwart von Anti-BASB031-Antikörper in den Seren von immunisierten Tieren.
Beispiel 6: Gegenwart von Antikörper gegen BASB031 in humanen konvaleszenten Seren
Western Blot-Analysen von gereinigtem rekombinantem BASB031 wurden wie oben in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, außer daß ein Reservoir von humanen Seren aus mit M. catarrhalis infizierten Kindern als erste Antikörperzubereitung verwendet wird. Die Ergebnisse zeigen, daß Antiseren aus natürlich infizierten Individuen auf das gereinigte rekombinante Protein reagieren, wie in 5 gezeigt.
Beispiel 7: Herstellung von BASB031-Peptiden, -Antiseren und deren Reaktivität
Zwei BASB031-spezifische Peptide mit kurzen Aminosäuren und mit den Sequenzen NPVPTLGHIAIQEDAC (SEQ ID NO:13) und YRTSQNEGANKVPRLC(SEQ ID NO:14) wurden im Labor unter Verwendung von allgemein bekannten Verfahren erzeugt. Diese Polypeptide, gekoppelt an KLH, wurden zur Erzeugung von Antikörpern in 12 Wochen alten weiblichen Kaninchen "Specific Pathogen Free New-Zealand" verwendet. Die Kaninchen enthielten 4 Injektionen in Intervallen von ca. 3 Wochen von 200 μg Peptid-KLH in vollständigem (1. Injektion) oder unvollständigem (2., 3. und 4. Injektionen) Freund-Adjuvans. Den Tieren wurde Blut vor der ersten Immunisierung und einen Monat nach der 4. Injektion entnommen.
Anti-Peptid-Mittelpunkttiter wurden durch ein ELISA unter Verwendung freier Peptide gemessen. Anti-Peptid-Mittelpunkttiter einen Monat nach der 4. Immunisierung betrugen über 25 000. Western Blots von gereinigtem rekombinantem BASB031 unter Verwendung von Anti-Peptid-Antikörpern als erster Antikörper wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
Hinterlegte Materialien
Eine Hinterlegung, die einen Moraxella catarrhalis Catlin-Stamm enthält, wurde bei der American Type Culture Collection (nachfolgend "ATCC") am 21. Juni 1997 hinterlegt und der Hinterlegungsnummer 43617 zugewiesen. Die Hinterlegung wurde als Branhamella catarrhalis (Frosch und Kolle) beschrieben und ist eine gefriergetrocknete 1,5-2,9 kb Insert-Bibliothek, konstruiert aus M. catarrhalis-Isolat, erhalten aus einem transtrachealen Aspirat eines Kohlengrubenarbeiters mit chronischer Bronchitis. Die Hinterlegung wird in Antimicrob. Agents Chemother. 21:506-508 (1982) beschrieben.
Die Hinterlegung des Moraxella catarrhalis-Stammes wird hier als "der hinterlegte Stamm" oder als "die DNA des hinterlegten Stammes" bezeichnet.
Der hinterlegte Stamm enthält ein BASB031-Gen voller Länge.
Eine Hinterlegung des Vektors pMC-PilQ, der aus Moraxella catarrhalis-DNA besteht, inseriert in pQE30, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 12. Februar 1999 hinterlegt und der Hinterlegungsnummer 207100 zugewiesen.
Die Sequenz der in diesem hinterlegten Stamm enthaltenen Polynukleotide sowie die Aminosäuresequenz von jedem dadurch codierten Polypeptid bestimmen in jedem Fall jeden Konflikt mit jeder vorliegenden Beschreibung von Sequenzen.
Die Hinterlegung des hinterlegten Stammes wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung über die Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vorgenommen. Der hinterlegte Stamm wird unwiderruflich und ohne Beschränkung oder Bedingung für die Öffentlichkeit bei Patenterteilung freigegeben. Der hinterlegte Stamm wird bloß als Erleichterung für die Fachleute bereitgestellt und ist kein Zugeständnis, daß eine Hinterlegung für die Ausführbarkeit erforderlich ist, wie dies gemäß 35 U.S.C. §112 erforderlich ist.
INDICATIONS RELATING TO DEPOSITED MICROORGANISM OR OTHER BIOLOGICAL MATERIAL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4, 6 bzw. 8 hat.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz wenigstens 95 % Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4, 6 bzw. 8 hat.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 und SEQ ID NO:8 besteht.
Isoliertes Polypeptid mit SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO: 8.
Immunogenes Fragment des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das immunogene Fragment eine Antikörperreaktion (falls erforderlich bei Kopplung an einen Träger) hervorrufen kann, die spezifisch das Polypeptid mit SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 erkennt, und worin das Fragment gegebenenfalls Teil eines größeren Proteins, wie eines Fusionsproteins, ist.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4, 6 oder 8 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4, 6 bzw. 8 hat; oder eine Nukleotidsequenz, die komplementär zum isolierten Polynukleotid ist.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 95 % Identität mit einer Nukleotidsequenz hat, die ein Polypeptid mit SEQ ID NO:4, 6 oder 8 über die gesamte codierende Region codiert; oder eine Nukleotidsequenz, die komplementär zum isolierten Polynukleotid ist.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:3, 5 oder 7 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:3, 5 bzw. 7 hat; oder eine Nukleotidsequenz, die komplementär zum isolierten Polynukleotid ist.
Isoliertes Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, worin die Identität wenigstens 95 % mit SEQ ID NO:3, 5 oder 7 ist.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid mit SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 oder das immunogene Fragment gemäß Anspruch 5 codiert.
Isoliertes Polynukleotid, das das Polynukleotid mit SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 umfaßt.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid mit SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 codiert, erhältlich durch Durchmustern einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde mit der Sequenz von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 oder einem Fragment davon.
Expressionsvektor oder rekombinanter lebender Mikroorganismus, der ein isoliertes Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12 umfaßt.
Wirtszelle, die den Expressionsvektor gemäß Anspruch 13 oder eine subzelluläre Fraktion oder eine Membran der Wirtszelle umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 14 unter Bedingungen, die für die Herstellung des Polypeptids ausreichend sind, und Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
Verfahren zur Expression eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der wenigstens eines der Polynukleotide umfaßt, und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die ausreichend zur Expression eines der Polynukleotide sind.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge des Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, worin die Zusammensetzung wenigstens ein anderes Moraxella catarrhalis-Antigen umfaßt.
Antikörper, der für das Polypeptid gemäß Anspruch 4 oder ein immunogenes Fragment des Polypeptids gemäß Anspruch 4 immunspezifisch ist, worin das immunogene Fragment eine Antikörperreaktion hervorrufen kann (falls erforderlich bei Kopplung an einen Träger), die spezifisch das Polypeptid mit SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 erkennt.
Verfahren zur Diagnose einer Moraxella-Infektion, umfassend das Identifizieren eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Antikörpers, der immunspezifisch für das Polypeptid ist, vorhanden in einer biologischen Probe aus einem Tier mit Verdacht für eine solche Infektion.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Moraxella-Infektion.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12 umfaßt, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Moraxella-Infektion.
Therapeutische Zusammensetzung, die nützlich in der Behandlung von Menschen mit einer Moraxella catarrhalis-Infektion ist, umfassend wenigstens einen Antikörper gemäß Anspruch 20 und einen geeigneten pharmazeutischen Träger.