DE69928925T2

DE69928925T2 - Antigene polypeptide aus neisseria meningitidis, dafür kodierende polynukleotide und entsprechende schützende antikörper

Info

Publication number: DE69928925T2
Application number: DE69928925T
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Ruelle; Johannes Petrus Maria Tommassen
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Rijksuniversiteit Utrecht
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Rijksuniversiteit Utrecht
Priority date: 1998-05-26
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2019-05-27
Also published as: US20060189792A1; WO1999061620A2; NZ508324A; KR20010052409A; GB9811260D0; CA2329269A1; EP1080198A2; ZA200006872B; AU4500699A; CN1322249A; ATE312921T1; ES2253893T3; US6994860B1; IL139696A0; DE69928925D1; NO20005952L; JP2002516105A; MXPA00011764A; WO1999061620A3; HUP0102730A2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Polynukleotide (hier als "BASB030-Polynukleotid(e)" bezeichnet), durch sie codierte Polypeptide (hier als "BASB030" oder "BASB030-Polypeptid(e)" bezeichnet), rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide und Polynukleotide, einschließlich von Impfstoffen gegen bakterielle Infektionen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Diagnosetests zum Nachweis von Infektionen mit bestimmten Pathogenen.
Hintergrund der Erfindung
Neisseria meningitidis (Meningococcus) ist ein gramnegatives Bakterium, das häufig aus den oberen Atemwegen des Menschen isoliert wird. Es verursacht gelegentlich bakterielle Invasionskrankheiten, wie Bakteriämie und Meningitis. Das Auftreten von Meningococcen-Erkrankungen zeigt geographische, saisonale und jährliche Unterschiede (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V., Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). Die häufigsten Erkrankungen in gemäßigten Ländern beruhen auf Stämmen der Serogruppe B und variieren im Auftreten von 1-10/100 000/Jahr Gesamtbevölkerung, wobei manchmal höhere Werte erreicht werden (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. et al., Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., et al., Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990).
Epidemien, die von Meningococcen der Serogruppe A dominiert werden, hauptsächlich in Zentralafrika, werden angetroffen, wobei sie manchmal Werte von bis zu 1000/100 000/Jahr erreichen (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V., Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). Insgesamt werden beinahe alle Fälle von Meningococcenerkrankung durch die Meningococcen der Serogruppen A, B, C, W-135 und Y verursacht, und ein tetravalenter A-, C-, W-135-, Y-Polysaccharid-Impfstoff ist erhältlich (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10:335-339, 1982).
Die Polysaccharid-Impfstoffe werden derzeit durch chemische Konjugation an Trägerproteine verbessert (Lieberman, J.M., Chiu, S.S., Wong, V.K. et al., JAMA 275: 1499-1503, 1996).
Ein Serogruppen-B-Impfstoff ist nicht verfügbar, da festgestellt wurde, daß das B-Kapselpolysaccharid nicht-immunogen ist, wahrscheinlich weil es eine Strukturähnlichkeit mit den Wirtkomponenten teilt (Wyle, F.A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L. et al., J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J.M., Leinonen, M., Mäkelä, P.M., Lancet ii.: 355-357, 1983).
Für viele Jahre wurden Anstrengungen eingeleitet und durchgeführt, um Impfstoffe auf Basis der äußeren Meningococcen-Membran zu entwickeln (de Moraes, J.C., Perkins, B., Camargo, M.C. et al., Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E.A., Gronnesby, J.K. et al., 338: 1093-1096, 1991). Solche Impfstoffe haben Wirksamkeiten von 57-85 % bei älteren Kindern (> 4 Jahre) und Heranwachsenden gezeigt.
Viele Komponenten der äußeren Bakterienmembran sind in diesen Impfstoffen vorhanden, wie PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa und FrpB, und der Beitrag dieser Komponenten zum beobachteten Schutz erfordert noch eine weitere Definition. Andere Komponenten der äußeren Bakterienmembran wurden unter Verwendung tierischer oder humaner Antikörper als potentiell relevant für die Induzierung von schützender Immunität definiert, wie TbpB und NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B.R., J. Exp. Med. 185: 1173-1183, 1997; Lissolo, L., Maître-Wilmotte, C., Dumas, P. et al., Inf. Immun. 63: 884-890, 1995). Die Mechanismen des Immunschutzes werden eine Antikörpervermittelte bakterizide Aktivität und Opsonophagozytose beinhalten.
Ein Bakteriämie-Tiermodell wurde verwendet, um alle Antikörpervermittelten Mechanismen zu vereinigen (Saukkonen, K., Leinonen, M., Abdillahi, H., Poolman, J.T., Vaccine 7: 325-328, 1989). Es ist allgemein akzeptiert, daß der späte Komplementkomponente-vermittelte bakterizide Mechanismus wesentlich für Immunität gegen Menigococcenerkrankung ist (Ross, S.C., Rosenthal, P.J., Berberic, H.M., Densen, P.J., Infect. Dis. 155: 1266-1275, 1987).
Die Häufigkeit von Infektionen mit Neisseria meningitidis hat in den vergangenen Jahrzehnten dramatisch zugenommen. Dies wurde dem Auftreten von mehrfach gegen Antibiotika resistenten Stämmen und einer zunehmenden Population von Menschen mit geschwächtem Immunsystem zugeschrieben. Es ist nicht mehr unüblich, Neisseria meningitidis-Stämme zu isolieren, die resistent gegen einige oder alle der Standardantibiotika sind. Dieses Phänomen hat einen unerfüllten medizinischen Bedarf an und eine Nachfrage nach neuen antimikrobiellen Mitteln, Impfstoffen, Wirkstoffdurchmusterungsverfahren und Diagnosetests für diesen Organismus geschaffen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft BASB030, insbesondere BASB030-Polypeptide und BASB030-Polynukleotide, rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide und Polynukleotide, einschließlich u.a. der Prävention und Behandlung der mikrobiellen Krankheiten. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Diagnosetests zum Nachweis von Krankheiten, die mit mikrobiellen Infektionen verbunden sind, und von Zuständen, die mit solchen Infektionen verbunden sind, wie Tests zum Nachweis der Expression oder Aktivität von BASB030-Polynukleotiden oder -Polypeptiden.
Verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und Umfangs der offenbarten Erfindung werden den Fachleuten leicht durch das Lesen der folgenden Beschreibung und durch das Lesen der anderen Teile der vorliegenden Offenbarung ersichtlich werden.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft BASB030-Polypeptide und -Polynukleotide wie nachfolgend in weiteren Einzelheiten beschrieben. Insbesondere betrifft die Erfindung Polypeptide und Polynukleotide von BASB030 von Neisseria meningitidis, das durch Aminosäure-Sequenzhomologie mit dem äußeren Membranprotein PilQ von Neisseria gonorrhoeae verwandt ist. Die Erfindung betrifft speziell BASB030 mit den in SEQ ID NO:1, 3, 5 bzw. SEQ ID NO:2, 4, 6 dargestellten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen. Es ist selbstverständlich, daß die im nachfolgenden Sequenzprotokoll als "DNA" aufgeführten Sequenzen ein erläuterndes Beispiel einer Ausführungsform der Erfindung sind, da die Fachleute erkennen werden, daß solche Sequenzen brauchbar in Polynukleotiden allgemein, einschließlich Ribopolynukleotiden, eingesetzt werden können.
Polypeptide
In einem Aspekt der Erfindung werden Polypeptide von Neisseria meningitidis, die hier als "BASB030" und "BASB030-Polypeptide" bezeichnet werden, sowie biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Varianten davon und sie umfassende Zusammensetzungen bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner vor:

(a) ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 90 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 95 % Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97-99 % oder eine exakte Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:2, 4, 6 hat;
(b) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 90 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97-99 % oder eine exakte Identität mit SEQ ID NO:1, 3, 5 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:1, 3, 5 respektive hat; oder
(c) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 90 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97-99 % oder eine exakte Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 hat.

Die in SEQ ID NO:2, 4, 6 bereitgestellten BASB030-Polypeptide sind die BASB030-Polypeptide aus den Neisseria meningitidis-Stämmen ATCC 13090 und H44/76.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein immunogenes Fragment eines BASB030-Polypeptids bereit, das heißt einen zusammenhängenden Teil des BASB030-Polypeptids, der die gleiche oder im wesentlichen gleiche immunogene Aktivität wie das Polypeptid hat, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 umfaßt. D.h. das Fragment (nach Bedarf an einen Träger gekoppelt) kann eine Immunreaktion hervorrufen, die das BASB030-Polypeptid erkennt. Ein solches immunogenes Fragment kann z. B. das BASB030-Polypeptid einschließen, dem eine N-terminale Leitsequenz und/oder eine Transmembrandomäne und/oder eine C-terminale Ankerdomäne fehlt. In einem bevorzugten Aspekt umfaßt das immunogene Fragment von BASB030 gemäß der Erfindung im wesentlichen die gesamte extrazelluläre Domäne eines Polypeptids, das wenigstens 90 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 95 % Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97-99 % Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:2, 4, 6 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 hat.
Ein Fragment ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die völlig die gleiche wie ein Teil, aber nicht die Gesamtheit einer beliebigen Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung ist. Wie bei BASB030-Polypeptiden können Fragmente "freistehend" oder innerhalb eines größeren Polypeptids, von dem sie einen Teil oder eine Region bilden, enthalten sein, am meisten bevorzugt als einzelne zusammenhängende Region in einem einzelnen größeren Polypeptid.
Bevorzugte Fragmente schließen z. B. Trunkierungspolypeptide mit einem Teil einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder von Varianten davon ein, wie z. B. eine kontinuierliche Reihe von Resten, die eine Amino- und/oder Carboxyl-terminale Aminosäuresequenz einschließt. Abbauformen der Polypeptide der Erfindung, erzeugt durch oder in einer Wirtszelle, sind ebenfalls bevorzugt. Weiter bevorzugt sind Fragmente, die durch strukturelle oder funktionelle Eigenschaften gekennzeichnet sind, wie Fragmente, die alpha-Helix-Regionen und alpha-Helix-bildende Regionen, beta-Faltblatt-Regionen und beta-Faltblatt-bildende Regionen, Turn-Regionen und Turn-bildende Regionen, Knäuelregionen und knäuelbildende Regionen, hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, flexible Regionen, oberflächenbildende Regionen, substratbindende Regionen und Regionen mit einem hohen antigenen Index umfassen.
Weitere bevorzugte Fragmente schließen ein isoliertes Polypeptid ein, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 umfaßt, oder ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren umfaßt, die aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 trunkiert oder deletiert sind.
Fragmente der Polypeptide der Erfindung können zur Erzeugung des entsprechenden Polypeptids voller Länge durch Peptidsynthese eingesetzt werden; daher können diese Fragmente als Zwischenstufen zur Erzeugung der Polypeptide voller Länge der Erfindung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt sind Varianten, in denen mehrere, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 oder 1 Aminosäuren, substituiert, deletiert oder addiert in jeder Kombination sind.
Die Polypeptide oder immunogenen Fragmente der Erfindung können in Form des "reifen" Proteins sein oder können ein Teil eines größeren Proteins sein, wie ein Vorläufer- oder Fusionsprotein. Es ist häufig vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzuschließen, die sekretorische oder Leitsequenzen, Prosequenzen, Sequenzen, die die Reinigung unterstützen, wie multiple Histidin-Reste, oder eine zusätzliche Sequenz zur Stabilität während der rekombinanten Produktion enthält. Außerdem wird ebenfalls die Addition von exogenen Polypeptid- oder Lipidschwanz- oder Polynukleotidsequenzen zur Erhöhung des immunogenen Potentials des fertigen Moleküls erwogen.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung gentechnisch hergestellte lösliche Fusionsproteine, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon und verschiedene Teile der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen verschiedener Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) umfassen. Bevorzugt als ein Immunglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von humanem IgG, insbesondere IgG1, worin die Fusion in der Gelenkregion stattfindet. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil einfach durch Einfügen einer Spaltsequenz entfernt werden, die mit Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann.
Außerdem betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine durch Gentechnik und deren Verwendung zur Wirkstoffdurchmusterung, Diagnose und Therapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren. Beispiele für die Fusionsproteintechnologie können in den internationalen Patentanmeldungen WO 94/29458 und WO 94/22914 gefunden werden.
Die Proteine können chemisch konjugiert oder als rekombinante Fusionsproteine exprimiert werden, was die Erzeugung erhöhter Mengen in einem Expressionssystem im Vergleich zu nicht-fusioniertem Protein erlaubt. Der Fusionspartner kann bei der Bereitstellung von T-Helferepitopen (immunologischer Fusionspartner) helfen, bevorzugt von T-Helferepitopen, die von Menschen erkannt werden, oder bei der Expression des Proteins mit höheren Ausbeuten als das native rekombinante Protein helfen (Expressionsverstärker). Bevorzugt wird der Fusionspartner sowohl ein immunologischer Fusionspartner als auch ein die Expression verstärkender Partner sein.
Fusionspartner schließen Protein D aus Haemophilus influenzae und das Nichtstrukturprotein aus dem Influenzae-Virus NS1 (Hämagglutinin) ein. Ein weiterer Fusionspartner ist das als LytA bekannte Protein. Bevorzugt wird der C-terminale Teil des Moleküls verwendet. LytA stammt aus Streptococcus pneumoniae, das eine N-Acetyl-L-alaninamidase synthetisiert, Amidase-LytA (codiert vom LytA-Gen {Gene, 43 (1986), Seite 265-272}), ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen im Peptidoglycangerüst abbaut. Die C-terminale Domäne des LytA-Proteins ist verantwortlich für die Affinität zum Cholin oder zu einigen Cholinanaloga wie DEAE. Diese Eigenschaft wurde für die Entwicklung von E. coli C-LytA-exprimierenden Plasmiden ausgenutzt, die zur Expression von Fusionsproteinen nützlich sind. Die Reinigung von Hybridproteinen, die das C-LytA-Fragment an ihrem Aminoterminus enthalten, wurde beschrieben {Biotechnology: 10 (1992), Seite 795-798}. Es ist möglich, den Repeat-Teil des LytA-Moleküls zu verwenden, der im C-terminalen Ende beginnend bei Rest 178 gefunden wird, z. B. die Reste 188-305.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Varianten der zuvor genannten Polypeptide ein, d.h. Polypeptide, die sich von den Referenzen durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wobei ein Rest gegen einen anderen mit ähnlichen Eigenschaften substituiert wird. Typische Substitutionen gibt es zwischen Ala, Val, Leu und Ile; zwischen Ser und Thr; zwischen den sauren Resten Asp und Glu; zwischen Asn und Gln; und zwischen den basischen Resten Lys und Arg; oder zwischen den aromatischen Resten Phe und Typr.
Erfindungsgemäße Polypeptide können in jeder geeigneten Weise hergestellt werden. Solche Polypeptide schließen isolierte, natürlich vorkommende Polypeptide, rekombinant erzeugte Polypeptide, synthetisch erzeugte Polypeptide oder Polypeptide, die durch eine Kombination dieser Verfahren erzeugt werden, ein. Mittel zur Herstellung solcher Polypeptide sind auf diesem Gebiet allgemein bekannt.
Es ist am meisten bevorzugt, daß ein Polypeptid der Erfindung aus Neisseria meningitidis stammt, jedoch kann es bevorzugt aus anderen Organismen derselben taxonomischen Gattung erhalten werden. Ein Polypeptid der Erfindung kann auch z. B. aus Organismen derselben taxonomischen Familie oder Ordnung erhalten werden.
Polynukleotide
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Polynukleotide bereitzustellen, die BASB030-Polypeptide codieren, insbesondere Polynukleotide, die das hier mit BASB030 bezeichnete Polypeptid codieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Polynukleotid eine Region, die BASB030-Polypeptide codiert, umfassend eine in SEQ ID NO:1, 3, 5 aufgeführte Sequenz, die ein Gen voller Länge einschließt, oder eine Variante davon.
Die in SEQ ID NO:1, 3, 5 bereitgestellten BASB030-Polynukleotide sind die BASB030-Polynukleotide aus den Neisseria meningitidis-Stämmen ATCC 13090 und H44/76.
Als ein weiterer Aspekt der Erfindung werden isolierte Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die BASB030-Polypeptide und -Polynukleotide codieren und/oder exprimieren, insbesondere Neisseria meningitidis BASB030-Polypeptide und -Polynukleotide, z. B. einschließlich ungereifter RNAs, Ribozym-RNAs, mRNAs, cDNAs, genomischer DNAs, B- und Z-DNAs. Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Polynukleotide und Polypeptide und Varianten davon und diese umfassende Zusammensetzungen ein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Polynukleotide, die wenigstens ein Gen voller Länge einschließen, das ein BASB030-Polypeptid mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO:2, 4, 6 codiert, und damit eng verwandte Polynukleotide und Varianten davon.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gibt es ein BASB030-Polypeptid aus Neisseria meningitidis, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder eine Variante davon umfaßt oder daraus besteht.
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Informationen, wie einer in SEQ ID NO:1, 3, 5 dargestellten Polynukleotidsequenz, kann ein Polynukleotid der Erfindung, das BASB030-Polypeptid codiert, unter Verwendung von Klonierungs- und Durchmusterungsstandardverfahren erhalten werden, wie durch diejenigen zur Klonierung und Sequenzierung chromosomaler DNA-Fragmente aus Bakterien unter Verwendung von Neisseria meningitidis-Zellen als Ausgangsmaterial, gefolgt vom Erhalt eines Klons voller Länge. Z. B. wird zum Erhalt einer Polynukleotidsequenz der Erfindung, wie einer Polynukleotidsequenz, die in SEQ ID NO:1, 3, 5 angegeben ist, typischerweise eine Bibliothek von Klonen von chromosomaler DNA von Neisseria meningitidis in E. coli oder einem anderen geeigneten Wirt mit einem radiomarkierten Oligonukleotid sondiert, bevorzugt einem 17-mer oder länger, abgeleitet aus einer Teilsequenz. Klone, die DNA tragen, die identisch mit der der Sonde ist, können dann unter Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen unterschieden werden. Durch Sequenzierung der so identifizierten individuellen Klone durch Hybridisierung mit Sequenzierungsprimern, die aus der ursprünglichen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz konstruiert werden, ist es dann möglich, die Polynukleotidsequenz in beiden Richtungen zur Bestimmung einer Gensequenz voller Länge zu erweitern. Zweckmäßig wird eine solche Sequenzierung z. B. unter Verwendung denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt, die aus einem Plasmidklon hergestellt wird. Geeignete Techniken werden beschrieben von T. Maniatis, E.F. Fritsch und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) (siehe insbesondere "Screening By Hybridization 1.90" und "Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70"). Die direkte genomische DNA-Sequenzierung kann ebenfalls durchgeführt werden, um eine Gensequenz voller Länge zu erhalten. Veranschaulichend für die Erfindung wurde jedes in SEQ ID NO:1, 3, 5 dargestellte Polynukleotid in einer aus Neisseria meningitidis stammenden DNA-Bank gefunden.
Außerdem enthält jede in SEQ ID NO:1, 3, 5 dargestellte DNA-Sequenz ein offenes Leseraster, das ein Protein mit etwa der Anzahl von Aminosäureresten codiert, die in SEQ ID NO:2, 4, 6 dargestellt sind, mit einem abgeleiteten Molekulargewicht, das unter Verwendung von Molekulargewichtswerten von Aminosäureresten berechnet werden kann, die den Fachleuten allgemein bekannt sind.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:1, zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nr. 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nr. 2308 von SEQ ID NO:1 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:2.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:3, zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nr. 1 und dem letzten Codon, das bei Nukleotid Nr. 2308 von SEQ ID NO:3 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:4.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:5, zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nr. 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nr. 2308 von SEQ ID NO:5 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:6.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid bereit, das folgendes umfaßt oder daraus besteht:

(a) eine Polynukleotidsequenz, die wenigstens 85 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 90 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97-99 % oder eine exakte Identität mit SEQ ID NO:1, 3, 5 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:1, 3, 5 respektive hat; oder
(b) eine Polynukleotidsequenz, die eine Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 90 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97-99 % Identität hat oder 100 % exakte Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2, 4, 6 respektive hat.

Ein Polynukleotid, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einschließlich Homologen und Orthologen aus anderen Arten als Neisseria meningitidis, kann durch ein Verfahren erhalten werden, das die Schritte der Durchmusterung einer entsprechenden Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (z. B. unter Verwendung einer Temperatur im Bereich von 45-65°C und einer SDS-Konzentration von 0,1-1 %) mit einer markierten oder detektierbaren Sonde, die aus der Sequenz von SEQ ID NO:1, 3, 5 oder einem Fragment davon besteht oder diese umfaßt; und Isolieren eines Gens voller Länge und/oder genomischer Klone, die die Polynukleotidsequenz enthalten, umfaßt.
Die Erfindung stellt eine Polynukleotidsequenz bereit, die über ihre gesamte Länge mit einer codierenden Sequenz (offenes Leseraster) in SEQ ID NO:1, 3, 5 identisch ist. Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung wird eine codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder Fragment davon, als solches sowie als codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder ein Fragment in einem Leseraster mit einer anderen codierenden Sequenz, wie einer Sequenz, die eine Leit- oder sekretorische Sequenz, eine Prä- oder Pro- oder Präproproteinsequenz codiert. Das Polynukleotid der Erfindung kann ebenfalls wenigstens eine nichtcodierende Sequenz enthalten, die z. B. ohne Beschränkung eine nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenz einschließt, wie die transkribierten, aber nicht-translatierten Sequenzen, Terminationssignale (wie rho-abhängige und rho-unabhängige Terminationssignale), Ribosom-Bindungsstellen, Kozak-Sequenzen, Sequenzen, die mRNA stabilisieren, Introns und Polyadenylierungssignale. Die Polynukleotidsequenz kann ebenfalls zusätzliche codierende Sequenzen umfassen, die zusätzliche Aminosäuren codieren. Z. B. kann eine Markersequenz, die die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert, codiert werden. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexahistidinpeptid, wie es im pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt und in Gentz et al. beschrieben wird, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989), oder ein HA-Peptid-Tag (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)), die beide nützlich in der Reinigung von daran fusionierter Polypeptidsequenz sein können. Polynukleotide der Erfindung schließen ebenfalls ohne Beschränkung Polynukleotide ein, die ein Strukturgen und seine natürlich verbundenen Sequenzen umfassen, die die Genexpression steuern.
Die Nukleotidsequenz, die BASB030-Polypeptid von SEQ ID NO:2, 4, 6 codiert, kann identisch mit der Polypeptid-codierenden Sequenz sein, die in den Nukleotiden 1 bis 2307 von SEQ ID NO:1 enthalten ist, oder mit der Polypeptid-codierenden Sequenz, die in den Nukleotiden 1 bis 2307 von SEQ ID NO:3 enthalten ist, bzw. mit der Polypeptid-codierenden Sequenz, die in den Nukleotiden 1 bis 2307 von SEQ ID NO:5 enthalten ist. Alternativ kann sie eine Sequenz sein, die als Ergebnis der Redundanz (Degeneriertheit) des genetischen Codes ebenfalls das Polypeptid von SEQ ID NO:2, 4, 6 codiert.
Der Begriff "Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert", wie er hier verwendet wird, umfaßt Polynukleotide, die eine Sequenz einschließen, die ein Polypeptid der Erfindung codieren, insbesondere ein bakterielles Polypeptid und ganz besonders ein Polypeptid von Neisseria meningitidis-BASB030 mit einer in SEQ ID NO:2, 4, 6 dargestellten Aminosäuresequenz. Der Begriff umfaßt ebenfalls Polynukleotide, die eine einzelne kontinuierliche Region oder diskontinuierliche Regionen einschließen, die das Polypeptid codieren (z. B. Polynukleotide, die durch einen integrierten Phagen, eine integrierte Insertionssequenz, eine integrierte Vektorsequenz, eine integrierte Transposonsequenz oder aufgrund von RNA-Editing oder genomischer DNA-Reorganisation unterbrochen sind), zusammen mit zusätzlichen Regionen, die ebenfalls codierende und/oder nicht-codierende Sequenzen enthalten können.
Die Erfindung betrifft ferner Varianten der hier beschriebenen Polynukleotide, die Varianten eines Polypeptids mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 codieren. Fragmente von Polynukleotiden der Erfindung können z. B. zur Synthese von Polynukleotiden voller Länge der Erfindung verwendet werden.
Weitere besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die BASB030-Varianten codieren, die die Aminosäuresequenz von BASB030-Polypeptid von SEQ ID NO:2, 4, 6 aufweisen, worin mehrere, einige, 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste substituiert, modifiziert, deletiert und/oder addiert sind, in jeder Kombination. Speziell bevorzugt darunter sind stumme Substitutionen, Additionen und Deletionen, die nicht die Eigenschaften und Aktivitäten von BASB030-Polypeptid verändern.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Polynukleotide, die zu wenigstens 85 % identisch über ihre gesamte Länge mit einem Polynukleotid sind, das BASB030-Polypeptid mit einer in SEQ ID NO:2, 4, 6 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, und Polynukleotide, die komplementär zu solchen Polynukleotiden sind. In dieser Hinsicht sind Polynukleotide, die zu wenigstens 90 % identisch über ihre gesamte Länge mit diesem sind, besonders bevorzugt, und unter diesen besonders bevorzugten Polynukleotiden sind diejenigen mit wenigstens 95 % speziell bevorzugt. Außerdem sind diejenigen mit wenigstens 97 % hoch bevorzugt unter denjenigen mit wenigstens 95 %, und unter diesen sind diejenigen mit wenigstens 98 % und wenigstens 99 % besonders hoch bevorzugt, wobei wenigstens 99 % die bevorzugteren sind.
Bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die Polypeptide codieren, die im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid beibehalten, das durch eine DNA von SEQ ID NO:1, 3, 5 codiert wird.
Gemäß bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung werden Polynukleotide bereitgestellt, die insbesondere unter stringenten Bedingungen an BASB030-Polynukleotidsequenzen hybridisieren, wie die Polynukleotide in SEQ ID NO:1, 3, 5.
Die Erfindung betrifft ferner Polynukleotide, die mit den hier bereitgestellten Polynukleotidsequenzen hybridisieren. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung speziell Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hier beschriebenen Polynukleotiden hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "stringente Bedingungen" und "stringente Hybridisierungsbedingungen" eine Hybridisierung, die nur auftritt, fall es wenigstens 95 % und bevorzugt wenigstens 97 % Identität zwischen den Sequenzen gibt. Ein spezifisches Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die folgendes umfaßt: 50 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml von denaturierter, gescherter Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen des Hybridisierungsträgers in 0,1 × SSC bei ca. 65°C. Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind allgemein bekannt und werden exemplarisch angegeben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), insbesondere Kapitel 11. Lösungshybridisierung kann ebenfalls mit den durch die Erfindung bereitgestellten Polynukleotidsequenzen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Polynukleotid bereit, das aus einer Polynukleotidsequenz besteht oder diese umfaßt, die durch Durchmustern einer geeigneten Bibliothek erhalten wird, die das vollständige Gen für eine in SEQ ID NO:1, 3, 5 dargestellte Polynukleotidsequenz enthält, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde mit der Sequenz der in SEQ ID NO:1, 3, 5 dargestellten Polynukleotidsequenz oder einem Fragment davon; und durch Isolieren der Polynukleotidsequenz. Zum Erhalt eines solchen Polynukleotids nützliche Fragmente schließen z. B. Sonden und Primer ein, die vollständig hier an anderer Stelle beschrieben werden.
Wie hier z. B. an anderer Stelle in bezug auf Polynukleotidtests der Erfindung beschrieben wird, können die Polynukleotide der Erfindung als Hybridisierungssonde für RNA, cDNA und genomische DNA verwendet werden, um cDNAS voller Länge und genomische Klone zu isolieren, die BASB030 codieren, und um cDNA und genomische Klone anderer Gene zu isolieren, die eine hohe Identität, insbesondere eine hohe Sequenzidentität, mit dem BASB030-Gen haben. Solche Sonden werden allgemein wenigstens 15 Nukleotidreste oder Basenpaare umfassen. Bevorzugt werden solche Sonden wenigstens 30 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen und können wenigstens 50 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen. Besonders bevorzugte Sonden werden wenigstens 20 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen und werden weniger als 30 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen.
Eine codierende Region eines BASB030-Gens kann durch Durchmusterung unter Verwendung einer in SEQ ID NO:1, 3, 5 bereitgestellten DNA-Sequenz isoliert werden, um eine Oligonukleotidsonde zu synthetisieren. Ein markiertes Oligonukleotid mit einer Sequenz, die komplementär zu derjenigen eines Gens der Erfindung ist, wird dann verwendet, um eine Bibliothek von cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu durchmustern, um zu bestimmen, mit welchen Elementen der Bibliothek die Sonde hybridisiert.
Es sind verschiedene Verfahren erhältlich und den Fachleuten allgemein bekannt, um DNAs voller Länge zu erhalten oder kurze DNAs zu erweitern, z. B. diejenigen auf Basis des Verfahrens der schnellen Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) (siehe z. B. Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Kürzliche Modifikationen der Technik, z. B. exemplarisch dargestellt durch die Marathon^TM-Technologie (Clontech Laboratories Inc.), haben die Suche nach längeren cDNAs signifikant vereinfacht. In der Marathon^TM-Technologie werden cDNAs aus mRNA, die aus einem gewählten Gewebe extrahiert wird, und einer an jedes Ende ligierten "Adapter"-Sequenz hergestellt. Nukleinsäureamplifikation (PCR) wird dann durchgeführt, um das "fehlende" 5'-Ende der DNA unter Verwendung einer Kombination aus genspezifischen und adapterspezifischen Oligonukleotidprimern zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion wird dann unter Verwendung "verschachtelter" Primer wiederholt, d.h. mit Primern, die zum Verbinden innerhalb des amplifizierten Produkts geschaffen sind (typischerweise ein adapterspezifischer Primer, der weiter 3' in der Adaptersequenz verbindet, und ein genspezifischer Primer, der weiter 5' in der ausgewählten Gensequenz verbindet). Die Produkte dieser Reaktion können dann durch DNA-Sequenzierung analysiert und eine DNA voller Länge entweder durch direktes Verbinden des Produkts mit der bestehenden DNA unter Erhalt einer vollständigen Sequenz oder durch Durchführen einer getrennten PCR voller Länge unter Verwendung der neuen Sequenzinformation für die Entwicklung des 5'-Primers konstruiert werden.
Die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung können z. B. als Forschungsreagenzien und Materialien zum Auffinden von Behandlungen von und Diagnostika für Krankheiten eingesetzt werden, insbesondere menschlichen Krankheiten, wie hier weiter in bezug auf Polynukleotidtests erörtert wird.
Die Polynukleotide der Erfindung, die aus. einer Sequenz von SEQ ID NOS:1-6 stammende Oligonukleotide sind, können hier wie beschrieben in den Verfahren verwendet werden, aber bevorzugt zur PCR, um zu bestimmen, ob die hier identifizierten Polynukleotide vollständig oder teilweise in Bakterien in infiziertem Gewebe transkribiert werden oder nicht. Es wird erkannt, daß solche Sequenzen ebenfalls Anwendung in der Diagnose des Stadiums der Infektion und des Typs der Infektion, den das Pathogen erreicht hat, haben werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls Polynukleotide bereit, die ein Polypeptid codieren, das das reife Protein plus zusätzliche Amino- oder Carboxyl-terminale Aminosäuren oder Aminosäuren innerhalb des reifen Polypeptids ist (z. B. wenn die reife Form mehr als eine Polypeptidkette hat). Solche Sequenzen können u.a. eine Rolle in der Reifung eines Proteins von einem Vorläufer zu einer reifen Form spielen, können den Proteintransport erlauben, können die Protein-Halbwertszeit verlängern oder verkürzen oder können die Manipulation eines Proteins für den Test oder die Herstellung erleichtern. wie allgemein in vivo der Fall, können die zusätzlichen Aminosäuren aus dem reifen Protein durch zelluläre Enzyme herausgereift werden.
Für jedes einzelne Polynukleotid der Erfindung wird ein dazu komplementäres Polynukleotid bereitgestellt. Es ist bevorzugt, daß diese komplementären Polynukleotide vollständig komplementär zu jedem Polynukleotid sind, zu dem sie komplementär sind.
Ein Vorläuferprotein, das eine reife Form des Polypeptids hat, das an eine oder mehrere Prosequenzen fusioniert ist, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Wenn Prosequenzen entfernt werden, werden solche inaktiven Vorläufer allgemein aktiviert. Einige oder alle der Prosequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Allgemein werden solche Vorläufer Proproteine genannt.
Zusätzlich zu den standardmäßigen Darstellungen A, G, C, T/U für Nukleotide kann bei der Beschreibung bestimmter Polynukleotide der Erfindung ebenfalls der Begriff "N" verwendet werden. "N" bedeutet, daß jedes der vier DNA- oder RNA-Nukleotide an einer so bezeichneten Position in der DNA- oder RNA-Sequenz erscheinen kann, außer es ist bevorzugt, daß N keine Nukleinsäure ist, die bei Kombination mit benachbarten Nukleotidpositionen, beim Lesen im korrekten Leseraster, die Wirkung der Erzeugung eines verfrühten Terminationscodons in einem solchen Leseraster haben würde.
Zusammengefaßt kann ein Polynukleotid der Erfindung ein reifes Protein, ein reifes Protein plus eine Leitsequenz (was als Präprotein bezeichnet werden kann), einen Vorläufer eines reifen Proteins mit einer oder mehreren Prosequenzen, die nicht die Leitsequenzen eines Präproteins sind, oder ein Präproprotein, das ein Vorläufer für ein Proprotein ist, mit einer Leitsequenz und einer oder mehreren Prosequenzen codieren, die allgemein während der Reifungsschritte entfernt werden, die aktive und reife Formen des Polypeptids erzeugen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung für therapeutische oder prophylaktische Zwecke bereitgestellt, insbesondere zur genetischen Immunisierung.
Die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung in der genetischen Immunisierung wird bevorzugt eine geeignete Übertragungsmethode einsetzen, wie die direkte Injektion von Plasmid-DNA in Muskeln (Wolff et al., Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), Übertragung einer mit spezifischen Proteinträgern komplexierten DNA (Wu et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), Kopräzipitation von DNA mit Calciumphosphat (Benvenisty & Reshef, PNAS USA (1986) 83: 9551), Verkapselung von DNA in verschiedenen Formen von Liposomen (Kaneda et al., Science (1989) 243: 375), Teilchenbeschuß (Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) und Infektion in vivo unter Verwendung klonierter retroviraler Vektoren (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).
Vektoren, Wirtszellen, Expressionssysteme
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vektoren, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, Wirtszellen, die genetisch mit Vektoren der Erfindung verändert sind, und die Erzeugung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls zur Erzeugung solcher Proteine unter Verwendung von RNAs eingesetzt werden, die aus den DNA-Konstrukten der Erfindung stammen.
Rekombinante Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch Verfahren, die den Fachleuten gut bekannt sind, aus gentechnisch veränderten Wirtszellen, die Expressionssysteme umfassen, hergestellt werden. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt Expressionssysteme, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die gentechnisch mit solchen Expressionssystemen verändert sind, und die Erzeugung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken.
Zur rekombinanten Erzeugung der Polypeptide der Erfindung können Wirtszellen gentechnisch verändert werden, um Expressionssysteme oder Teile davon oder Polynukleotide der Erfindung einzuführen. Die Einführung eines Polynukleotids in die Wirtszelle kann durch Verfahren bewirkt werden, die in vielen Standardlaborhandbüchern beschrieben werden, wie Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), wie z. B. Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion, durch kationisches Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, "Scrape Loading", ballistische Einführung und Infektion.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte schließen bakterielle Zellen ein, wie z. B. Zellen von Streptococci, Staphylococci, Enterococci, E. coli, Streptomyces, Cyanobakterien, Bacillus subtilis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae und Neisseria meningitidis; Pilzzellen, wie z. B. Zellen einer Hefe, Kluveromyces, Saccharomyces, eine Basidiomycete, Candida albicans und Aspergillus; Insektenzellen, wie z. B. Zellen von Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; tierische Zellen, wie z. B. CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 und Bowes-Melanomzellen; und Pflanzenzellen, wie z. B. Zellen eines Nacktsamers oder Bedecktsamers.
Eine große Vielzahl von Expressionssystemen kann zur Erzeugung der Polypeptide der Erfindung verwendet werden. Solche Vektoren schließen u.a. aus Chromosomen, Episomen und Viren stammende Vektoren ein, z. B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, aus Bakteriophagen, aus Transposonen, aus Hefeepisomen, aus Insertionselementen, aus chromosomalen Hefeelementen und aus Viren stammen, wie den Baculoviren, Papovaviren, wie z. B. SV40, Vakziniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabies-Viren, Picornaviren, Retroviren und alpha-Viren, und Vektoren, die aus Kombinationen daraus stammen, wie diejenigen, die aus genetischen Plasmid- und Bakteriophagenelementen stammen, wie Cosmide und Phagemide. Die Expressionssystemkonstrukte können Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren sowie erzeugen. Allgemein kann jedes System oder jeder Vektor, das/der zur Aufrechterhaltung, Vermehrung oder Expression von Polynukleotiden und/oder zur Expression eines Polypeptids in einem Wirt geeignet ist, zur Expression in dieser Hinsicht verwendet werden. Die geeignete DNA-Sequenz kann in das Expressionssystem durch jede einer Vielzahl gutbekannter und routinemäßiger Techniken eingefügt werden, wie z. B. durch diejenigen, die in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (siehe oben) dargestellt werden.
In rekombinanten Expressionssystemen in Eukaryonten können zur Sekretion eines translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung geeignete Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingeführt werden. Diese Signale können endogen für das Polypeptid sein, oder sie können heterologe Signale sein.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können aus rekombinanten Zellkulturen durch allgemein bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauscherchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lectinchromatographie. Am meisten bevorzugt wird die Ionenmetallaffinitätschromatographie (IMAC) zur Reinigung eingesetzt. Allgemein bekannte Techniken zur Neufaltung von Proteinen können eingesetzt werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der intrazellulären Synthese, Isolierung und/oder Reinigung denaturiert wird.
Das Expressionssystem kann ebenfalls ein rekombinanter lebender Mikroorganismus sein, wie ein Virus oder Bakterium. Das interessierende Gen kann in das Genom eines lebenden rekombinanten Virus oder Bakteriums eingefügt werden. Impfung und Infektion in vivo mit diesem lebenden Vektor wird zur In-vivo-Expression des Antigens und Induktion von Immunreaktionen führen. Für diesen Zweck verwendete Viren und Bakterien sind z. B.: Pockenviren (z. B. Vakzinia, Geflügelpocken, Kanarienpocken), alpha-Viren (Sindbis-Virus, Semliki-Forest-Virus, venezolanisches Pferdeenzephalitis-Virus), Adenoviren, Adeno-assoziiertes Virus, Picornaviren (Poliovirus, Rhinovirus), Herpesviren (Varicella zoster-Virus, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Diese Viren und Bakterien können virulent oder in verschiedenen Weisen abgeschwächt sein, um Lebendimpfstoffe zu erhalten. Solche Lebendimpfstoffe bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Diagnostische, prognostische, serotypisierende und Mutationstests
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von BASB030-Polynukleotiden und -Polypeptiden der Erfindung zur Verwendung als Diagnostika. Der Nachweis von BASB030-Polynukleotiden und/oder -Polypeptiden in einem Eukaryonten, insbesondere einem Säugetier und speziell einem Menschen, wird ein Diagnoseverfahren zur Diagnose von Krankheit, Stadium der Krankheit oder Reaktion eines infektiösen Organismus auf Wirkstoffe bereitstellen. Eukaryonten, insbesondere Säugetiere und speziell Menschen, besonders diejenigen, die mit einem Organismus infiziert sind, der das BASB030-Gen oder -Protein umfaßt, oder dafür infektionsverdächtig sind, können auf der Nukleinsäure- oder Aminosäureebene durch eine Vielzahl allgemein bekannter Techniken sowie durch hier bereitgestellte Verfahren nachgewiesen werden.
Polypeptide und Polynukleotide zur Prognose, Diagnose oder einer anderen Analyse können aus Körpermaterialien aus einem infizierten oder mutmaßlich infizierten Individuum erhalten werden. Polynukleotide aus jeder dieser Quellen, insbesondere DNA oder RNA, können direkt zum Nachweis verwendet werden oder können enzymatisch unter Verwendung von PCR oder jeder anderen Amplifikationstechnik vor der Analyse amplifiziert werden. RNA, insbesondere mRNA, cDNA und genomische DNA, kann ebenfalls in der gleichen Weise verwendet werden. Unter Verwendung der Amplifikation kann die Charakterisierung der Art und des Stammes des in einem Individuum vorhandenen infektiösen oder resistenten Organismus durch eine Analyse des Genotyps eines ausgewählten Polynukleotids des Organismus vorgenommen werden. Deletionen und Insertionen können durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich mit einem Genotyp einer Referenzsequenz detektiert werden, die aus einem verwandten Organismus ausgewählt wird, bevorzugt einer unterschiedlichen Art der gleichen Gattung oder eines unterschiedlichen Stammes der gleichen Art. Punktmutationen können durch Hybridisieren von amplifizierter DNA mit markierten BASB030-Polynukleotidsequenzen identifiziert werden. Perfekt oder signifikant übereinstimmende Sequenzen können von unperfekt oder signifikanter nicht übereinstimmenden Duplizes durch DNase- oder RNase-Verdauung für DNA bzw. RNA unterschieden werden, oder durch Nachweisen von Unterschieden in den Schmelztemperaturen oder der Renaturierungskinetik. Polynukleotidsequenzunterschiede können ebenfalls durch Veränderungen in der elektrophoretischen Beweglichkeit von Polynukleotidfragmenten in Gelen im Vergleich zu einer Referenzsequenz nachgewiesen werden. Dies kann mit oder ohne Denaturierungsmittel durchgeführt werden. Polynukleotidunterschiede können ebenfalls durch direkte DNA- oder RNA-Sequenzierung nachgewiesen werden. Siehe z. B. Myers et al., Science, 230: 1242 (1985). Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können ebenfalls durch Nuklease-Schutztests aufgezeigt werden, wie z. B. RNase-, V1- und S1-Schutztest, oder durch ein chemisches Spaltungsverfahren. Siehe z. B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985).
In einer anderen Ausführungsform kann ein Array von Oligonukleotidsonden konstruiert werden, das eine BASB030-Nukleotidsequenz oder Fragmente davon umfaßt, um eine effiziente Durchmusterung von z. B. genetischen Mutationen, Serotyp, taxonomischer Klassifikation oder Identifizierung durchzuführen. Array-Technologieverfahren sind allgemein bekannt und besitzen allgemeine Anwendbarkeit und können zur Beantwortung einer Vielzahl von Fragen der molekularen Genetik verwendet werden, einschließlich Genexpression, genetischer Verbindung und genetischer Variabilität (siehe z. B. Chee et al., Science, 274: 610 (1996)).
Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Diagnose-Kit, welches folgendes umfaßt:

(a) ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, 3, 5 oder ein Fragment davon;
(b) eine zu derjenigen von (a) komplementäre Nukleotidsequenz;
(c) ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt das Polypeptid von SEQ ID NO:2, 4, 6 oder ein Fragment davon; oder
(d) einen Antikörper für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt für das Polypeptid von SEQ ID NO:2, 4, 6. Es wird anerkannt werden, daß in jedem solchen Kit (a), (b), (c) oder
(d) eine substantielle Komponente umfassen kann. Ein solches Kit wird u.a. von Nutzen in der Diagnose einer Krankheit oder Anfälligkeit für eine Krankheit sein.

Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung von Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung als Diagnostika. Die Detektion einer mutierten Form eines Polynukleotids der Erfindung, bevorzugt SEQ ID NO:1, 3, 5, das mit einer Krankheit oder Pathogenität verbunden ist, wird ein diagnostisches Werkzeug bereitstellen, das zu folgendem beitragen oder folgendes definieren kann: eine Diagnose einer Krankheit, eine Prognose für einen Krankheitsverlauf, eine Bestimmung eines Krankheitsstadiums oder eine Anfälligkeit für eine Krankheit, die aus Unterexpression, Überexpression oder veränderter Expression des Polynukleotids resultiert. Organismen, insbesondere infektiöse Organismen, die Mutationen in einem solchen Polynukleotid tragen, können auf der Polynukleotidebene durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden, wie z. B. diejenigen, die hier an anderer Stelle beschrieben werden.
Zellen aus einem Organismus, die Mutationen oder Polymorphien (allelische Variationen) in einem Polynukleotid und/oder Polypeptid der Erfindung tragen, können ebenfalls auf der Polynukleotid- oder Polypeptidebene durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden, um z. B. das Serotypisieren zu erlauben. Z. B. kann RT-PCR zum Nachweis von Mutationen in der RNA verwendet werden. Es ist besonders bevorzugt, RT-PCR in Verbindung mit automatisierten Detektionssystemen zu verwenden, wie z. B. GeneScan. RNA, cDNA oder genomische DNA kann ebenfalls für den gleichen Zweck, PCR, verwendet werden. Z. B. können PCR-Primer, die komplementär zu einem Polynukleotid sind, das BASB030-Polypeptid codiert, zur Identifizierung und Analyse von Mutationen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ferner Primer bereit, aus denen 1, 2, 3 oder 4 Nukleotide vom 5'- und/oder 3'-Ende entfernt sind. Diese Primer können unter anderem zum Aplifizieren von BASB030-DNA und/oder -RNA verwendet werden, die aus einer Probe isoliert wurde, die aus einem Individuum stammt, wie z. B. Körpermaterial. Die Primer können zum Amplifizieren eines Polynukleotids verwendet werden, das aus einem infizierten Individuum isoliert wurde, so daß das Polynukleotid dann verschiedenen Techniken zur Aufklärung der Polynukleotidsequenz unterworfen werden kann. Auf diese Weise können Mutationen in der Polynukleotidsequenz nachgewiesen und zur Diagnose und/oder Prognose der Infektion oder ihres Stadiums oder Verlaufs oder zur Serotypisierung und/oder Klassifizierung des infektiösen Mittels verwendet werden.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Krankheit bereit, bevorzugt von bakteriellen Infektionen, besonders bevorzugt von Infektionen, die durch Neisseria meningitidis verursacht werden, umfassend das Bestimmen eines erhöhten Expressionsgrades von Polynukleotid mit einer Sequenz von SEQ ID NO:1, 3, 5 in einer aus einem Individuum stammenden Probe, wie z. B. in einem Körpermaterial. Eine erhöhte oder verringerte Expression eines BASB030-Polynukleotids kann unter Verwendung jedes derjenigen Verfahren gemessen werden, die auf diesem Gebiet zur Quantifizierung von Polynukleotiden allgemein bekannt sind, wie z. B. Amplifikation, PCR, RT-PCR, RNase-Schutz, Northern Blotting, Spektrometrie und andere Hybridisierungsverfahren.
Zusätzlich kann ein erfindungsgemäßer Diagnosetest z. B. zum Nachweis der Überexpression von BASB030-Polypeptid im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben zum Nachweis der Gegenwart einer Infektion verwendet werden. Testtechniken, die zur Bestimmung des Gehalts eines BASB030-Polypeptids in einer aus einem Wirt stammenden Probe, wie z. B. in einem Körpermaterial, verwendet werden können, sind den Fachleuten allgemein bekannt. Solche Testverfahren schließen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, die Western-Blot-Analyse, Antikörper-Sandwich-Tests, Antikörpernachweis und ELISA-Tests ein.
Die Polynukleotide der Erfindung können als Komponenten von Polynukleotidarrays verwendet werden, bevorzugt hochdichten Arrays oder Gittern. Diese hochdichten Arrays sind besonders nützlich für diagnostische und prognostische Zwecke. Z. B. kann ein Satz von Tüpfeln, die jeweils ein unterschiedliches Gen und ferner ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, zum Sondieren verwendet werden, wie z. B. unter Verwendung von Hybridisierung oder Nukleinsäureamplifikation, unter Verwendung einer Sonde, die aus einer Körperprobe erhalten wird oder daraus stammt, zur Bestimmung der Gegenwart einer besonderen Polynukleotidsequenz oder einer verwandten Sequenz in einem Individuum. Eine solche Gegenwart kann die Gegenwart eines Pathogens anzeigen, insbesondere Neisseria meningitidis, und kann nützlich im Diagnostizieren und/oder Prognostizieren einer Krankheit oder eines Krankheitsverlaufs sein. Ein Gitter, das eine Anzahl von Varianten der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, 3, 5 umfaßt, ist bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt ist ein Gitter, das eine Anzahl von Varianten einer Polynukleotidsequenz umfaßt, die die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO:2, 4, 6 codiert.
Antikörper
Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung oder Varianten davon oder Zellen, die dieselben exprimieren, können als Immunogene zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die immunspezifisch für solche Polypeptide bzw. Polynukleotide sind.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Antikörper gegen BASB030-Polypeptide oder -Polynukleotide bereitgestellt.
Antikörper, die gegen die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung erzeugt werden, können durch Verabreichen der Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung oder von Epitop-tragenden Fragmenten von einem oder beiden, von Analoga von einem oder beiden oder von Zellen, die eines oder beide exprimieren, an ein Tier, bevorzugt einen nicht menschlichen Organismus, unter Verwendung von Routineprotokollen erhalten werden. Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann jede fachbekannte Technik verwendet werden, die Antikörper liefert, die durch kontinuierliche Zellinienkulturen erzeugt werden. Beispiele schließen verschiedene Techniken ein, wie z. B. diejenigen in G. Kohler und C. Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., S. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).
Techniken zur Erzeugung von einkettigen Antikörpern (US-PS 4 946 778) können zur Erzeugung von einkettigen Antikörpern gegen Polypeptide oder Polynukleotide dieser Erfindung angepaßt werden. Ebenfalls können transgene Mäuse oder andere Organismen oder Tiere, wie andere Säugetiere, zur Expression humanisierter Antikörper verwendet werden, die immunspezifisch für die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung sind.
Alternativ kann die Phagen-Display-Technologie verwendet werden, um Antikörpergene mit Bindungsaktivitäten für ein Polypeptid der Erfindung entweder aus Sammlungen von PCR-amplifizierten v-Genen, von Lymphozyten aus Menschen, die auf Besitz von Anti-BASB030 durchmustert wurden, oder aus naiven Bibliotheken auszuwählen (McCafferty et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks et al. (1992), Biotechnology 10, 779-783). Die Affinität dieser Antikörper kann ebenfalls durch z. B. Kettenvermischung ("chain shuffling") verbessert werden (Clackson et al., (1991) Nature 352, 628).
Die oben beschriebenen Antikörper können zur Isolierung oder Identifizierung von Klonen eingesetzt werden, die die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung exprimieren, um die Polypeptide oder Polynukleotide durch z. B. Affinitätschromatographie zu reinigen.
So können u.a. Antikörper gegen BASB030-Polypeptid oder BASB030-Polynukleotid zur Behandlung von Infektionen eingesetzt werden, insbesondere von bakteriellen Infektionen.
Polypeptidvarianten schließen antigenisch, epitopisch oder immunologisch äquivalente Varianten ein und bilden einen besonderen Aspekt dieser Erfindung.
Bevorzugt wird der Antikörper oder eine Variante davon modifiziert, um ihn weniger immunogen im Individuum zu machen. Falls z. B. das Individuum menschlich ist, kann der Antikörper am meisten bevorzugt "humanisiert" sein, wobei die komplementaritätsbestimmende Region oder solche Regionen des Hybridom-abstammenden Antikörpers in einen humanen monoklonalen Antikörper transplantiert wurden, z. B. wie beschrieben in Jones et al.
(1986), Nature 321, 522-525 oder Tempest et al. (1991), Biotechnology 9, 266-273.
Antagonisten und Agonisten – Tests und Moleküle
Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um die Bindung kleiner Molekülsubstrate und Liganden in z. B. Zellen, zellfreien Zubereitungen, chemischen Bibliotheken und natürlichen Produktmischungen zu untersuchen. Diese Substrate und Liganden können natürliche Substrate und Liganden sein oder können strukturelle oder funktionelle Mimetika sein. Siehe z. B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2): Kapitel 5 (1991).
Die Durchmusterungsverfahren können einfach die Bindung einer Testverbindung an das Polypeptid oder Polynukleotid oder an Zellen oder Membranen, die das Polypeptid oder Polynukleotid tragen, oder an ein Fusionsprotein des Polypeptids mittels einer Markierung, die direkt oder indirekt mit der Testverbindung verbunden ist, messen. Alternativ kann das Durchmusterungsverfahren die Konkurrenz mit einem markierten Konkurrenten beinhalten. Ferner können diese Durchmusterungsverfahren untersuchen, ob die Testverbindung zu einem Signal führt, das durch Aktivierung oder Inhibierung des Polypeptids oder Polynukleotids erzeugt wird, unter Verwendung von Detektionssystemen, die geeignet für die Zellen sind, die das Polypeptid oder Polynukleotid umfassen. Inhibitoren der Aktivierung werden allgemein in Gegenwart eines bekannten Agonisten untersucht, und die Wirkung auf die Aktivierung durch den Agonisten durch die Gegenwart der Testverbindung wird beobachtet. Konstitutiv aktives Polypeptid und/oder konstitutiv exprimierte Polypeptide und Polynukleotide können in Durchmusterungsverfahren für inverse Agonisten oder Inhibitoren in Abwesenheit eines Agonisten oder Inhibitors eingesetzt werden, durch Untersuchen, ob die Testverbindung zur Inhibierung der Aktivierung des Polypeptids oder Polynukleotids führt, je nach Fall. Ferner können die Durchmusterungsverfahren einfach die Schritte aus Vermischen einer Testverbindung mit einer Lösung, die ein Polypeptid oder Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthält, zur Bildung einer Mischung, Messen der BASB030-Polypeptid- und/oder -Polynukleotidaktivität in der Mischung und Vergleichen der BASB030-Polypeptid- und/oder -Polynukleotidaktivität der Mischung mit einem Standard umfassen. Fusionsproteine wie diejenigen, die aus dem Fc-Teil und BASB030-Polypeptid hergestellt werden, wie hier zuvor beschrieben, können ebenfalls für Durchmusterungstests mit hohem Durchsatz zur Identifizierung von Antagonisten des Polypeptids der vorliegenden Erfindung sowie von phylogenetisch und/oder funktionell verwandten Polypeptiden verwendet werden (siehe D. Bennett et al., J. Mol. Recognition, 8:52-58 (1995); und K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270(16):9459-9471 (1995)).
Die Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper, die an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden und/oder damit wechselwirken, können ebenfalls zur Konfigurierung von Durchmusterungsverfahren zum Nachweis der Wirkung hinzugegebener Verbindungen auf die Erzeugung von mRNA und/oder Polypeptid in Zellen verwendet werden. Z. B. kann ein ELISA-Test zur Messung sezernierter oder Zell-assoziierter Mengen von Polypeptid unter Verwendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper durch fachbekannte Standardverfahren konstruiert werden. Dieser kann verwendet werden, um Mittel zu finden, die die Erzeugung von Polypeptid aus geeignet manipulierten Zellen oder Geweben hemmen oder steigern können (ebenfalls Antagonist bzw. Agonist genannt).
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen zur Identifizierung derjenigen bereit, die die Wirkung von BASB030-Polypeptiden oder -Polynukleotiden steigern (Agonist) oder blockieren (Antagonist), insbesondere von denjenigen Verbindungen, die bakteriostatisch und/oder bakterizid sind. Das Durchmusterungsverfahren kann Hochdurchsatztechniken beinhalten. Z. B. wird zur Durchmusterung auf Agonisten oder Antagonisten eine synthetische Reaktionsmischung, ein Zellkompartiment, wie z. B. eine Membran, eine Zellhülle oder Zellwand, oder eine Zubereitung aus jedem davon, welche BASB030-Polypeptid und ein markiertes Substrat oder einen markierten Liganden eines solchen Polypeptids umfassen, in Abwesenheit oder Gegenwart eines Testmoleküls inkubiert, das ein BASB030-Agonist oder -Antagonist sein kann. Die Fähigkeit des Testmoleküls, das BASB030-Polypeptid zu fördern oder diesem entgegenzuwirken, wird in der verringerten Bindung des markierten Liganden oder der verringerten Erzeugung von Produkt aus einem solchen Substrat widergespiegelt. Moleküle, die überflüssig binden, d.h. ohne Induzieren der Wirkungen von BASB030-Polypeptid, sind sehr wahrscheinlich gute Antagonisten. Moleküle, die gut binden und gegebenenfalls die Geschwindigkeit der Produkterzeugung aus dem Substrat erhöhen, die Signalleitung erhöhen oder die chemische Kanalaktivität erhöhen, sind Agonisten. Die Detektion der Geschwindigkeit oder gegebenenfalls des Grades der Produkterzeugung aus Substrat, Signalleitung oder chemischer Kanalaktivität kann durch Verwendung eines Reportersystems gesteigert werden. Reportersysteme, die in dieser Hinsicht nützlich sein können, schließen ohne Beschränkung kolorimetrische Systeme, markiertes Substrat, das zu Produkt umgewandelt wird, ein Reportergen, das auf Veränderungen der BASB030-Polynukleotid- oder Polypeptidaktivität anspricht, und fachbekannte Bindungstests ein.
Ein weiteres Beispiel für einen Test auf BASB030-Agonisten ist ein kompetitiver Test, der BASB030 und einen potentiellen Agonisten mit BASB030-bindenden Molekülen, rekombinanten BASB030-bindenden Molekülen, natürlichen Substraten oder Liganden oder Substrat- oder Ligandmimetika unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Inhibierungstest kombiniert. BASB030 kann markiert werden, wie z. B. durch Radioaktivität oder eine kolorimetrische Verbindung, so daß die Anzahl von BASB030-Molekülen, die an ein Bindungsmolekül gebunden werden oder zu Produkt umgewandelt werden, genau bestimmt werden kann, um die Wirksamkeit des potentiellen Antagonisten zu testen.
Potentielle Antagonisten schließen u.a. kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und Antikörper ein, die an ein Polynukleotid und/oder Polypeptid der Erfindung binden und dadurch seine Aktivität oder Expression hemmen oder auslöschen. Potentielle Antagonisten können ebenfalls kleine organische Moleküle, ein Peptid, ein Polypeptid, wie z. B. ein eng verwandtes Protein, oder ein Antikörper sein, der an die gleichen Stellen an einem Bindungsmolekül bindet, wie z. B. ein Bindungsmolekül, ohne BASB030-induzierte Aktivitäten zu induzieren, wodurch die Wirkung oder Expression von BASB030-Polypeptiden und/oder -Polynukleotiden verhindert wird, indem die Bindung von BASB030-Polypeptiden und/oder -Polynukleotiden ausgeschlossen wird.
Potentielle Antagonisten schließen ein kleines Molekül ein, das an die Bindungsstelle des Polypeptids bindet und diese besetzt, wodurch die Bindung an zelluläre Bindungsmoleküle verhindert wird, so daß die normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele für kleine Moleküle schließen ohne Beschränkung kleine organische Moleküle, Peptide oder peptidartige Moleküle ein. Andere potentielle Antagonisten schließen antisense-Moleküle ein (siehe Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) für eine Beschreibung dieser Moleküle). Bevorzugte potentielle Antagonisten schließen Verbindungen, die mit BASB030 verwandt sind, und Varianten davon ein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung gentechnisch konstruierte lösliche Fusionsproteine, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon und verschiedene Teile der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen von verschiedenen Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) umfassen. Bevorzugt als ein Immunglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von humanem IgG, insbesondere IgGl, wobei die Fusion an der Gelenkregion erfolgt. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil einfach durch Einfügen einer Spaltsequenz entfernt werden, die mit Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann. Außerdem betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine durch Gentechnik und ihre Verwendung zur Wirkstoffdurchmusterung, Diagnose und Therapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren. Beispiele für Fusionsproteintechnologie können in den internationalen Patentanmeldungen WO 94/29458 und WO 94/22914 gefunden werden.
Jede der hier bereitgestellten Polynukleotidsequenzen kann im Auffinden und in der Entwicklung antibakterieller Verbindungen verwendet werden. Das codierte Protein kann bei Expression als Target für die Durchmusterung antibakterieller Wirkstoffe verwendet werden. Zusätzlich können die Polynukleotidsequenzen, die die Amino-terminalen Regionen des codierten Proteins oder Shine-Delgarno- oder andere, die Translation erleichternde Sequenzen der jeweiligen mRNA codieren, zur Konstruktion von antisense-Sequenzen verwendet werden, um die Expression der interessierenden codierenden Sequenz zu steuern.
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung des Polypeptids, Polynukleotids, Agonisten oder Antagonisten der Erfindung bereit, um die ursprüngliche physikalische Wechselwirkung zwischen einem Pathogen oder Pathogenen und einem eukaryontischen Wirt, bevorzugt einem Säugetierwirt, zu beeinträchtigen, die für die Infektionsfolgen verantwortlich ist. Insbesondere können die Moleküle der Erfindung verwendet werden: In der Prävention der Adhäsion von Bakterien, insbesondere von grampositiven und/oder gramnegativen Bakterien, an eukaryontische extrazelluläre Matrixproteine, bevorzugt vom Säugetier, an Dauervorrichtungen oder an extrazelluläre Matrixproteine in Wunden; zur Blockierung der bakteriellen Adhäsion zwischen eukaryontischen extrazellulären Matrixproteinen, bevorzugt vom Säugetier, und bakteriellen BASB030-Proteinen, die Gewebeschädigung vermitteln; und/oder zur Blockierung der normalen Entwicklung der Pathogenese bei Infektionen, die anders als durch die Implantation von Dauervorrichtungen oder durch andere chirurgische Techniken eingeleitet werden.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden BASB030-Agonisten und -Antagonisten bereitgestellt, bevorzugt bakteriostatische oder bakterizide Agonisten und Antagonisten.
Die Antagonisten und Agonisten der Erfindung können z. B. zur Prävention, Inhibierung und/oder Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Mimotope des Polypeptids der Erfindung. Ein Mimotop ist eine Peptidsequenz, die ausreichend ähnlich dem nativen Peptid ist (sequenziell oder strukturell) und durch Antikörper erkannt werden kann, die das native Peptid erkennen; oder Antikörper hervorrufen kann, die das native Peptid bei Kopplung an einen geeigneten Träger erkennen.
Peptidmimotope können für einen besonderen Zweck durch Addition, Deletion oder Substitution ausgewählter Aminosäuren geschaffen werden. So können die Peptide für die Zwecke der Erleichterung der Konjugation an einen Proteinträger modifiziert werden. Z. B. kann es für gewisse chemische Konjugationsverfahren wünschenswert sein, ein terminales Cystein einzuschließen. Zusätzlich kann es für Peptide, die an einen Proteinträger konjugiert werden, wünschenswert sein, einen hydrophoben Terminus distal vom konjugierten Terminus des Peptids einzuschließen, so daß das freie unkonjugierte Ende des Peptids mit der Oberfläche des Trägerproteins verbunden bleibt. Dadurch wird das Peptid in einer Konformation präsentiert, die derjenigen des Peptids am nächsten ähnelt, wie sie im Zusammenhang des ganzen nativen Moleküls gefunden wird. Z. B. können die Peptide verändert werden, damit sie ein N-terminales Cystein und einen C-terminalen hydrophoben amidierten Schwanz aufweisen. Alternativ kann die Addition oder Substitution einer D-stereoisomeren Form einer oder mehrerer der Aminosäuren durchgeführt werden, um ein vorteilhaftes Derivat zu erzeugen, z. B. zur Erhöhung der Stabilität des Peptids.
Alternativ können Peptidmimotope unter Verwendung von Antikörpern identifiziert werden, die selbst an die Polypeptide der vorliegenden Erfindung binden können, unter Verwendung von Techniken wie z. B. der Phagen-Display-Technologie ( EP 0 552 267 B1 ). Diese Technik erzeugt eine große Anzahl von Peptidsequenzen, die die Struktur der nativen Peptide nachahmen und deshalb an Anti-natives Peptid-Antikörper binden können, aber nicht notwendigerweise selbst eine signifikante Sequenzhomologie mit dem nativen Polypeptid teilen.
Impfstoffe
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, insbesondere einem Säugetier, bevorzugt Menschen, welches das Impfen des Individuums mit BASB030-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon umfaßt, angemessen zur Erzeugung einer Antikörper- und/oder T-Zell-Immunreaktion, um das Individuum vor Infektion zu schützen, insbesondere bakterielle Infektion und ganz besonders Neisseria meningitidis-Infektion. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren, durch die eine solche immunologische Reaktion die bakterielle Vermehrung verlangsamt. Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, welches das Übertragen, an ein solches Individuum, eines Nukleinsäurevektors, einer Sequenz oder eines Ribozyms zur Ausrichtung der Expression von BASB030-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder eines Fragments oder einer Variante davon zur Expression von BASB030-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder eines Fragments oder einer Variante davon in vivo umfaßt, um eine immunologische Reaktion zu erzeugen, wie z. B. zur Erzeugung einer Antikörper- und/oder T-Zell-Immunreaktion, einschließlich z. B. Cytokinerzeugender T-Zellen oder cytotoxischer T-Zellen, um das Individuum, bevorzugt einen Menschen, vor Krankheit zu schützen, unabhängig davon, ob die Krankheit schon innerhalb des Individuums etabliert ist oder nicht. Ein Beispiel der Verabreichung des Gens ist seine Beschleunigung in die gewünschten Zellen als Beschichtung auf Partikeln oder in anderer Weise. Ein solcher Nukleinsäurevektor kann DNA, RNA, ein Ribozym, eine modifizierte Nukleinsäure, ein DNA/RNA-Hybrid, einen DNA-Protein-Komplex oder einen RNA-Protein-Komplex umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine immunologische Zusammensetzung, die bei Einführung in ein Individuum, bevorzugt einen Menschen, das zur Induzierung einer immunologischen Reaktion fähig ist, eine immunologische Reaktion in einem solchen Individuum gegen ein BASB030-Polynukleotid und/oder daraus codiertes Polypeptid induziert, worin die Zusammensetzung ein rekombinantes BASB030-Polynukleotid und/oder daraus codiertes Polypeptid und/oder DNA und/oder RNA umfaßt, die ein Antigen des BASB030-Polynukleotids, daraus codierten Polypeptids oder eines anderen Polypeptids der Erfindung codiert und exprimiert. Die immunologische Reaktion kann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden und kann die Form von Antikörperimmunität und/oder zellulärer Immunität annehmen, wie z. B. zelluläre Immunität, die aus CTL- oder CD4+-T-Zellen herrührt.
Ein BASB030-Polypeptid oder ein Fragment davon kann mit Co-Protein oder einer chemischen Einheit fusioniert werden, die selbst Antikörper erzeugen kann oder nicht, aber die das erste Protein stabilisieren und ein fusioniertes oder modifiziertes Protein erzeugen kann, das antigene und/oder immunogene Eigenschaften haben wird, und bevorzugt schützende Eigenschaften. So fusioniertes rekombinantes Protein umfaßt bevorzugt ferner ein antigenes Co-Protein, wie z. B. Lipoprotein D aus Haemophilus influenzae, Glutathion-S-Transferase (GST) oder beta-Galactosidase, oder jedes andere relativ große Co-Protein, das das Protein solubilisiert und dessen Erzeugung und Reinigung erleichtert. Außerdem kann das Co-Protein als ein Hilfsmittel im Sinne der Bereitstellung einer allgemeinen Stimulation des Immunsystems des Organismus wirken, der das Protein empfängt. Das Co-Protein kann entweder an den Amino- oder den Carboxy-Terminus des ersten Proteins angebracht werden.
Bereitgestellt durch diese Erfindung werden Zusammensetzungen, insbesondere Impfstoffzusammensetzungen, und Verfahren, die die Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung und immunstimulierende DNA-Sequenzen umfassen, wie diejenigen, die in Y. Sato et al., Science, 273: 352 (1996) beschrieben werden.
Ebenfalls bereitgestellt durch diese Erfindung werden Verfahren, die das beschriebene Polynukleotid oder besondere Fragmente davon, von denen gezeigt wurde, daß sie nicht-variable Regionen der bakteriellen Zelloberflächenproteine codieren, in Polynukleotidkonstrukten verwenden, die in solchen genetischen Immunisierungsexperimenten in Tiermodellen der Infektion mit Neisseria meningitidis verwendet werden. Solche Experimente werden besonders nützlich zur Identifizierung von Proteinepitopen sein, die eine prophylaktische oder therapeutische Immunreaktion hervorrufen können. Es wird angenommen, daß dieser Ansatz die anschließende Herstellung monoklonaler Antikörper mit besonderem Wert erlauben wird, die aus dem erforderlichen Organ des Tieres stammen, das erfolgreich der Infektion widersteht oder sie klärt, zur Entwicklung prophylaktischer Mittel oder therapeutischer Behandlungen von bakterieller Infektion, insbesondere einer Infektion mit Neisseria meningitidis, in Säugetieren, insbesondere Menschen.
Die Erfindung schließt ebenfalls eine Impfstofformulierung ein, die ein immunogenes rekombinantes Polypeptid und/oder Polynukleotid der Erfindung zusammen mit einem geeigneten Träger umfaßt, wie z. B. einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Da die Polypeptide und Polynukleotide im Magen gespalten werden können, wird jedes bevorzugt parenteral verabreicht, einschließlich z. B. durch eine Verabreichung, die subkutan, intramuskulär, intravenös oder interdermal ist. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen ein, die Antixoidantien, Puffer, bakteriostatische Verbindungen und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch zur Körperflüssigkeit, bevorzugt zum Blut, des Individuums machen; und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel oder Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Einzeldosis- oder Mehrfachdosisbehältern angeboten werden, z. B. versiegelten Ampullen und Fläschchen, und können in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers unmittelbar vor der Verwendung erfordert.
Die Impfstofformulierung der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls Hilfsstoffsysteme zur Steigerung der Immunogenität der Formulierung einschließen. Bevorzugt erhöht das Hilfsstoffsystem vorzugsweise eine Reaktion vom TH1-Typ.
Eine Immunreaktion kann allgemein in zwei extreme Kategorien unterteilt werden, die humorale oder zellvermittelte Immunreaktionen sind (traditionell gekennzeichnet durch Antikörper- bzw. zelluläre Effektormechanismen des Schutzes). Diese Kategorien der Reaktion werden als Reaktionen vom TH1-Typ (zellvermittelte Reaktion) und Immunreaktionen vom TH2-Typ (humorale Reaktion) bezeichnet.
Extreme Immunreaktionen vom TH1-Typ können durch die Erzeugung von Antigen-spezifischen, Haplotyp-beschränkten cytotoxischen T-Lymphozyten und natürliche Killerzellreaktionen gekennzeichnet sein. In Mäusen sind Reaktionen vom TH1-Typ häufig durch die Erzeugung von Antikörpern des IgG2a-Untertyps gekennzeichnet, während im Menschen diese den Antikörpern vom IgG1-Typ entsprechen. Immunreaktionen vom TH2-Typ sind durch die Erzeugung eines weiten Bereichs von Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet, einschließlich bei Mäusen IgG1, IgA und IgM.
Man kann annehmen, daß die treibende Kraft hinter der Entwicklung dieser zwei Typen von Immunreaktionen Cytokine sind. Hohe Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ neigen zur Begünstigung der Induktion von zellvermittelten Immunreaktionen gegen das gegebene Antigen, während hohe Mengen von Cytokinen vom TH2-Typ zur Begünstigung der Induzierung humoraler Immunreaktionen gegen das Antigen neigen.
Die Unterscheidung von Immunreaktionen vom TH1- und TH2-Typ ist nicht absolut. In der Realität wird ein Individuum eine Immunreaktion unterstützen, die als vorherrschend TH1 oder vorherrschend TH2 beschrieben wird. Jedoch ist es häufig zweckmäßig, die Familien von Cytokinen im Sinne der Begriffe zu betrachten, die in murinen CD4 +ve T-Zell-Klonen von Mosmann und Coffman beschrieben werden (Mosmann, T.R. und Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, S. 145-173). Traditionell sind Reaktionen vom TH1-Typ mit der Erzeugung der INF-γ- und IL-2-Cytokine durch T-Lymphozyten verbunden. Andere Cytokine, die häufig direkt mit der Induzierung von Immunreaktionen vom TH1-Typ verbunden sind, werden nicht durch T-Zellen erzeugt, wie z. B. IL-12. Im Gegensatz sind Reaktionen vom TH2-Typ mit der Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13 verbunden.
Es ist bekannt, daß bestimmte Impfstoffhilfsmittel besonders geeignet zur Stimulierung der Cytokin-Reaktionen entweder vom TH1- oder TH2-Typ sind. Traditionell schließen die besten Indikatoren des TH1:TH2-Gleichgewichts der Immunreaktion nach einer Impfung oder Infektion die direkte Messung der Erzeugung von TH1- oder TH2-Cytokinen durch T-Lymphocyten in vitro nach Restimulierung mit Antigen und/oder die Messung des IgG1:IgG2a-Verhältnisses von Antigen-spezifischen Antikörperreaktionen ein.
So ist ein Hilfsmittel vom TH1-Typ ein solches, das vorzugsweise isolierte T-Zell-Populationen zur Erzeugung hoher Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ stimuliert, wenn sie mit Antigen in vitro restimuliert werden, und die Entwicklung von sowohl CD8+ cytotoxischen T-Lymphozyten als auch Antigen-spezifischen Immunglobulinreaktionen fördert, die mit dem Isotyp vom TH1-Typ verbunden sind.
Hilfsstoffe, die zur vorzugsweisen Stimulierung der TH1-Zell-Reaktion fähig sind, werden in den internationalen Patentanmeldungen WO 94/00153 und WO 95/17209 beschrieben.
3-Des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL) ist ein solcher Hilfsstoff. Dieser ist aus GB 2220211 (Ribi) bekannt. Chemisch ist er eine Mischung aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten und wird von Ribi Immunochem, Montana, hergestellt. Eine bevorzugte Form von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A wird in EP 0 689 454 B1 offenbart (SmithKline Beecham Biologicals SA).
Bevorzugt sind die Partikel von 3D-MPL klein genug, um durch eine 0,22 μm-Membran sterilfiltriert zu werden ( EP 0 689 454 ). 3D-MPL wird im Bereich von 10-100 μg vorhanden sein, bevorzugt 25-50 μg pro Dosis, worin das Antigen typischerweise in einem Bereich von 2-50 μg pro Dosis vorhanden sein wird.
Ein anderer bevorzugter Hilfsstoff umfaßt QS21, eine aus der Rinde von Quillaja Saponaria Molina stammende; HPLC-gereinigte, nicht-toxische Fraktion. Gegebenenfalls kann dieser mit 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL), gegebenenfalls zusammen mit einem Träger, vermischt werden.
Das Verfahren zur Erzeugung von QS21 wird in US-PS 5 057 540 offenbart.
Nicht-reaktogene Hilfsstofformulierungen, die QS21 enthalten, wurden zuvor beschrieben (WO 96/33739). Solche Formulierungen, die QS21 und Cholesterin umfassen, wurden als erfolgreiche TH1-stimulierende Hilfsstoffe bei Formulierung zusammen mit einem Antigen nachgewiesen.
Weitere Hilfsstoffe, die bevorzugte Stimulatoren der TH1-Zell-Reaktion sind, schließen immunmodulatorische Oligonukleotide ein, z. B. unmethylierte CpG-Sequenzen, wie in WO 96/02555 offenbart.
Kombinationen aus unterschiedlichen TH1-stimulierenden Hilfsstoffen, wie z. B. diejenigen, die hier oben erwähnt wurden, werden ebenfalls als Bereitstellung eines Hilfsstoffs erwogen, der ein bevorzugter Stimulator der TH1-Zell-Reaktion ist. Z. B. kann QS21 zusammen mit 3D-MPL formuliert werden. Das Verhältnis von QS21:3D-MPL wird typischerweise in der Größenordnung von 1:10 bis 10:1 sein; vorzugsweise 1:5 bis 5:1 und häufig im wesentlichen 1:1. Der bevorzugte Bereich für einen optimalen Synergismus beträgt 2,5:1 bis 1:1 3D-MPL:QS21.
Bevorzugt ist ebenfalls ein Träger in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung vorhanden. Der Träger kann eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder ein Aluminiumsalz, wie z. B. Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid, sein.
Eine bevorzugte Öl-in-Wasser-Emulsion umfaßt ein metabolisierbares Öl wie Squalen, alpha-Tocopherol und Tween 80. In einem besonders bevorzugten Aspekt werden die Antigene in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung mit QS21 und 3D-MPL in einer solchen Emulsion kombiniert. Zusätzlich kann die Öl-in-Wasser-Emulsion Span 85 und/oder Lecithin und/oder Tricaprylin enthalten.
Typischerweise für die menschliche Verabreichung werden QS21 und 3D-MPL in einem Impfstoff im Bereich von 1-200 μg, wie z. B. 10-100 μg, bevorzugt 10-50 μg, pro Dosis vorhanden sein. Typischerweise wird die Öl-in-Wasser-Emulsion 2 bis 10 % Squalen, 2 bis 10 % alpha-Tocopherol und 0,3 bis 3 % Tween 80 umfassen. Bevorzugt ist das Verhältnis Squalen:alpha-Tocopherol gleich oder weniger als 1, da dies eine stabilere Emulsion liefert. Span 85 kann ebenfalls in einer Menge von 1 % vorhanden sein. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, daß die erfindungsgemäßen Impfstoffe ferner einen Stabilisator enthalten.
Nicht-toxische Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten bevorzugt ein nichttoxisches Öl, z. B. Squalan oder Squalen, einen Emulgator, z. B. Tween 80, in einem wäßrigen Träger. Der wäßrige Träger kann z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung sein.
Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine polyvalente Impfstoffzusammensetzung bereit, die eine Impfstofformulierung der Erfindung in Kombination mit anderen Antigenen umfaßt, insbesondere Antigenen, die zur Behandlung von Krebstypen, Autoimmunkrankheiten und verwandten Zuständen nützlich sind. Eine solche polyvalente Impfstoffzusammensetzung kann einen TH-1-induzierenden Hilfsstoff wie hier zuvor beschrieben einschließen.
Obwohl die Erfindung in bezug auf bestimmte BASB030-Polypeptide und -Polynukleotide beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, daß dies Fragmente der natürlich vorkommenden Polypeptide und Polynukleotide und ähnliche Polypeptide und Polynukleotide mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen, die nicht wesentlich die immunogenen Eigenschaften der rekombinanten Polypeptide oder Polynukleotide beeinflussen, abdeckt.
Das Antigen kann ebenfalls in Form ganzer Bakterien (tot oder lebend) oder als subzelluläre Fraktionen übertragen werden. Diese Möglichkeiten schließen N. meningitidis selbst ein.
Zusammensetzungen, Kits und Verabreichung
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen, die ein BASB030-Polynukleotid und/oder ein BASB030-Polypeptid umfassen, zur Verabreichung an eine Zelle oder an einen multizellulären Organismus bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Zusammensetzungen, die ein hier erörtertes Polynukleotid und/oder Polypeptid oder deren Agonisten oder Antagonisten umfassen. Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können in Kombination mit (einem) nicht-sterilen oder sterilen Träger(n) zur Verwendung mit Zellen, Geweben oder Organismen eingesetzt werden, wie z.B. einem pharmazeutischen Träger, der zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist. Solche Zusammensetzungen umfassen z. B. ein Mediumadditiv oder eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten. Solche Träger können ohne Beschränkung Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen daraus einschließen. Die Formulierung sollte für den Verabreichungsmodus passen. Die Erfindung betrifft ferner diagnostische und pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind.
Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie z. B. therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in jeder wirksamen, zweckmäßigen Weise verabreicht werden, die z. B. die Verabreichung durch u.a. topische, orale, anale, vaginale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intranasale oder intradermale Wege einschließt.
In der Therapie oder als Prophylaktikum kann das aktive Mittel an ein Individuum als injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, z. B. als sterile wäßrige Dispersion, bevorzugt isotonisch.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids, wie z. B. die lösliche Form eines Polypeptids und/oder Polynukleotids der vorliegenden Erfindung, eines agonistischen oder antagonistischen Peptids oder einer Verbindung mit einem kleinen Molekül, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten umfassen. Solche Träger schließen ohne Beschränkung Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen daraus ein. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind. Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie z. B. therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die Zusammensetzung wird für den Verabreichungsweg, z. B. auf einem systemischen oder einem oralen Weg, angepaßt werden. Bevorzugte Formen der systemischen Verabreichung schließen die Injektion ein, typischerweise durch intravenöse Injektion. Andere Injektionswege, wie z. B. subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal, können verwendet werden. Alternative Mittel zur systemischen Verabreichung schließen die transmucosale und transdermale Verabreichung unter Verwendung von Penetrationsmitteln, wie z. B. Gallensalze oder Fusidinsäure, oder anderen Detergenzien ein. Falls ein Polypeptid oder andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer enterischen oder verkapselten Formulierung formuliert werden können, kann zusätzlich auch die orale Verabreichung möglich sein. Die Verabreichung dieser Verbindungen kann ebenfalls topisch und/oder lokalisiert in Form von Salben, Pasten, Gelen, Lösungen, Pulvern und dgl. sein.
Zur Verabreichung an Säugetiere und insbesondere Menschen wird erwartet, daß das tägliche Dosisniveau des aktiven Mittels von 0,01 bis 10 mg/kg betragen wird, typischerweise um 1 mg/kg. Der Arzt wird in jedem Fall die tatsächliche Dosierung bestimmen, die am besten für ein Individuum geeignet ist und mit dem Alter, Gewicht und der Reaktion des besonderen Individuums variieren wird. Die obigen Dosierungen sind Beispiele für den Durchschnittsfall. Es kann natürlich individuelle Fälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche angemessen sind, und solche sind im Umfang dieser Erfindung.
Der erfindungsgemäße Dosierungsbereich hängt von der Wahl des Peptids, dem Verabreichungsweg, der Natur der Formulierung, der Natur des Patientenzustands und der Beurteilung durch den behandelnden Arzt ab. Geeignete Dosierungen sind jedoch im Bereich von 0,1-100 μg/kg Patient.
Eine Impfstoffzusammensetzung ist zweckmäßig in injizierbarer Form. Herkömmliche Hilfsstoffe können eingesetzt werden, um die Immunreaktion zu steigern. Eine geeignete Einheitsdosis für die Impfung beträgt 0,5-5 μg/kg von Antigen, und eine solche Dosis wird vorzugsweise 1- bis 3-mal und in einem Intervall von 1 bis 3 Wochen verabreicht. Bei dem angegebenen Dosisbereich werden keine nachteiligen toxikologischen Wirkungen mit den Verbindungen der Erfindung beobachtet werden, die ihre Verabreichung an geeignete Individuen ausschließen würden.
Weite Variationen der benötigten Dosierung sind jedoch hinsichtlich der Vielzahl von erhältlichen Verbindungen und der unterschiedlichen Wirksamkeiten der verschiedenen Verabreichungswege zu erwarten. Z. B. würde man erwarten, daß die orale Verabreichung höhere Dosierungen als die Verabreichung durch intravenöse Injektion erfordert. Variationen in diesen Dosierungsniveaus können unter Verwendung von empirischen Standardroutinen zur Optimierung eingestellt werden, wie es auf diesem Gebiet selbstverständlich ist.
Sequenzdatenbanken, Sequenzen in einem greifbaren Medium und Algorithmen
Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen bilden eine wertvolle Informationsquelle, um ihre 2- und 3-dimensionalen Strukturen zu bestimmen sowie weitere Sequenzen ähnlicher Homologie zu identifizieren. Diese Ansätze werden am einfachsten erleichtert durch Speicherung der Sequenz auf einem computerlesbaren Medium und anschließende Verwendung der gespeicherten Daten in einem bekannten makromolekularen Strukturprogramm oder zum Durchsuchen einer Sequenzdatenbank unter Verwendung allgemein bekannter Suchwerkzeuge, wie z. B. mit dem GCG-Programmpaket.
Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung werden Verfahren zur Analyse von Merkmalssequenzen oder -ketten (Strings), insbesondere von genetischen Sequenzen oder codierten Proteinsequenzen. Bevorzugte Verfahren der Sequenzanalyse schließen z. B. Verfahren der Sequenzhomologieanalyse, wie z. B. Identitäts- und Ähnlichkeitsanalyse, DNA-, RNA- und Proteinstrukturanalyse, Sequenzzusammenlagerung, kladistische Analyse, Sequenzmotivanalyse, Bestimmung des offenen Leserasters, Nukleinsäure-Basenbenennung, Codonpräferenzanalyse, Nukleinsäure-Basentrimmung und sequenzierende Chromatogramm-Peakanalyse ein.
Ein Verfahren auf Computerbasis wird zur Durchführung der Homologieidentifizierung bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Schritte: Bereitstellen einer ersten Polynukleotidsequenz, die die Sequenz eines Polynukleotids der Erfindung umfaßt, auf einem computerlesbaren Medium; und Vergleichen der ersten Polynukleotidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Homologieidentifizierung.
Ein Verfahren auf Computerbasis wird ebenfalls zur Durchführung der Homologieidentifizierung bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Bereitstellen einer ersten Polypeptidsequenz, die die Sequenz eines Polypeptids der Erfindung umfaßt, auf einem computerlesbaren Medium; und Vergleichen der ersten Polypeptidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Homologieidentifizierung.
Alle in dieser Beschreibung zitierten Veröffentlichungen und Literaturstellen, die ohne Beschränkung Patente und Patentanmeldungen ein schließen, werden hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Literaturstelle spezifisch und individuell als hier durch Verweis vollständig eingeführt angegeben wäre. Jede Patentanmeldung, deren Priorität diese Anmeldung beansprucht, wird hier ebenfalls in ihrer Gesamtheit durch Verweis in der oben beschriebenen Weise für Veröffentlichungen und Literaturstellen eingeführt.
Definitionen
"Identität", wie es fachbekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, gemäß Bestimmung durch Vergleich der Sequenzen. Auf diesem Gebiet bezeichnet "Identität" ebenfalls den Grad der Sequenzverwandtheit zwischen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, gemäß Bestimmung durch die Übereinstimmung zwischen Ketten solcher Sequenzen. "Identität" kann leicht durch bekannte Verfahren berechnet werden, die ohne Beschränkung diejenigen einschließen, die beschrieben werden in: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. und Griffin, H.G., Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991; und Carillo, H. und Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988). Verfahren zur Identitätsbestimmung werden entwickelt, um die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen zu ergeben. Außerdem werden Verfahren zur Identitätsbestimmung in öffentlich zugänglichen Computerprogrammen codifiziert. Computerprogrammverfahren zur Identitätsbestimmung zwischen zwei Sequenzen schließen ohne Beschränkung das GAP-Programm im GCG-Programmpaket (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)) und FASTA (Pearon und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988)) ein. Die BLAST-Programmfamilie ist öffentlich erhältlich von NCBI und aus anderen Quellen (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul. S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Der allgemein bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenfalls zur Identitätsbestimmung verwendet werden.
Parameter für den Polypeptidsequenzvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).
Vergleichsmatrix: BLOSSUM62 von Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992).
"Gap Penalty" (Lückenstrafe): 8
"Gap Length Penalty" (Lückenlängenstrafe): 2
Ein für diese Parameter nützliches Programm ist öffentlich erhältlich als "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison, WI. Die zuvor genannten Parameter sind die Standardparameter für Peptidvergleiche (neben keiner "Penalty" (Strafe) für Endlücken).
Parameter für den Polynukleotidvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).
Vergleichsmatrix: Übereinstimmungen = +10, Fehlübereinstimmung = 0.
"Gap Penalty": 50
"Gap Length Penalty": 3
Erhältlich als: Das "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison, WI. Dieses sind die Standardparameter für Nukleinsäurevergleiche.
Eine bevorzugte Bedeutung für "Identität" für Polynukleotide und Polypeptide je nach Fall wird nachfolgend in (1) und (2) geliefert.
(1) Polynukleotidausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polynukleotid ein, das eine Polynukleotidsequenz mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100 % Identität mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 umfaßt, worin die Polynukleotidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 sein kann oder bis zu einer gewissen ganzen Zahl von Nukleotidveränderungen im Vergleich zur Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Nukleotiddeletion, -substitution, einschließlich -transition und -transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenznukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleotiden in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl der Nukleotidveränderungen bestimmt wird durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl von Nukleotidveränderungen ist, x_n die Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 ist, y 0,50 für 50 %, 0,60 für 60 %, 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 %, 0,90 für 90 %, 0,95 für 95 %, 0,97 für 97 % oder 1,00 für 100 % ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_n abgerundet wird. Veränderungen einer Polynukleotidsequenz, die das Polypeptid von SEQ ID NO:2 codieren, können Nichtsinn-, Fehlsinn- oder Rasterverschiebungsmutationen in dieser codierenden Sequenz erzeugen und dadurch das Polypeptid verändern, das durch das Polynukleotid im Anschluß an solche Veränderungen codiert wird.
Als Beispiel kann eine Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 sein, d.h. zu 100 % identisch, oder sie kann bis zu einer gewissen ganzen Zahl von Nukleinsäureveränderungen im Vergleich zur Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100 % Identität ist. Solche Veränderungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Nukleinsäuredeletion, -substitution, einschließlich -transition und -transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenzpolynukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen können, eingestreut entweder individuell zwischen den Nukleinsäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird bestimmt durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen ist, x_n die Gesamtanzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1 ist, y z. B. 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 % etc. ist, · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_n abgerundet wird.
(2) Polypeptidausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polypeptid ein, das ein Polypeptid mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100 % Identität mit einer Polypeptidreferenzsequenz von SEQ ID NO:2 umfaßt, worin die Polypeptidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 sein kann oder bis zu einer gewissen ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativer und nicht-konservativer Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenzpolypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell zwischen den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl von Aminosäureveränderungen bestimmt wird durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 ist, y 0,50 für 50 %, 0,60 für 60 %, 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 %, 0,90 für 90 %, 0,95 für 95 %, 0,97 für 97 % oder 1,00 für 100 % ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_a abgerundet wird.
Als Beispiel kann eine Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 sein, d.h. zu 100 % identisch, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich zur Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100 % Identität ist. Solche Veränderungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativer und nichtkonservativer Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenzpolypeptidsquenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen können, eingestreut entweder individuell zwischen den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Aminosäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird bestimmt durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 ist, y z. B. 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 % etc. ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_aabgerundet wird.
"Individuum" ("Individuen"), wenn dieser Begriff hier in bezug auf einen Organismus verwendet wird, bezeichnet einen multizellulären Eukaryonten, der ohne Beschränkung ein Metazoon, ein Säugetier, einen Oviden, einen Boviden, einen Affen, einen Primaten und einen Menschen einschließt.
"Isoliert" bedeutet "mittels Menschenhand" von seinem natürlichen Zustand verändert, d.h. es wurde, falls es in der Natur auftritt, verändert oder aus seiner natürlichen Umgebung entfernt oder beides. Z. B. ist ein natürlich in einem lebenden Organismus vorhandenes Polynukleotid oder Polypeptid nicht "isoliert", aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, das aus den co-existierenden Materialien seines natürlichen Zustands abgetrennt ist, ist "isoliert" wie der Begriff hier eingesetzt wird. Außerdem ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, das in einen Organismus durch Transformation, genetische Manipulation oder durch jedes andere rekombinante Verfahren eingeführt wird, "isoliert", selbst wenn es noch in dem Organismus vorhanden ist, wobei der Organismus lebend oder nicht-lebend sein kann.
"Polynukleotid(e)" bezeichnet allgemein jedes Polyribonukleotid oder Polydesoxyribonukleotid, das unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann, einschließlich ein- und doppelsträngiger Regionen.
"Variante" bezeichnet ein Polynukleotid oder Polypeptid, das sich von einem Referenzpolynukleotid oder -polypeptid unterscheidet, aber die wesentlichen Eigenschaften beibehält. Eine typische Variante eines Polynukleotids unterscheidet sich in der Nukleotidsequenz von einem anderen Referenzpolynukleotid. Veränderungen in der Nukleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch das Referenzpolynukleotid codiert wird, verändern oder nicht. Nukleotidveränderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, -additonen, -deletionen, -fusionen und -trunkierungen im Polypeptid führen, das durch die Referenzsequenz codiert wird, wie nachfolgend erörtert. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen Referenzpolypeptid. Allgemein sind Unterschiede so beschränkt, daß die Sequenzen des Referenzpolypeptids und der Variante sehr ähnlich insgesamt und in vielen Regionen identisch sind. Eine Variante und ein Referenzpolypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen oder Deletionen in jeder Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder inserierter Aminosäurerest kann ein solcher sein, der durch den genetischen Code codiert wird, oder nicht. Eine Variante eines Polynukleotids oder Polypeptids kann eine natürlich auftretende sein, wie z. B. eine allelische Variante, oder sie kann eine Variante sein, die nicht als natürlich auftretend bekannt ist. Nicht-natürlich auftretende Varianten von Polynukleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenesetechniken oder durch direkte Synthese hergestellt werden.
"Krankheit(en)" bezeichnet jede Krankheit, die durch Infektion mit einem Bakterium verursacht wird oder darauf bezogen ist, einschließlich z. B. einer Infektion der oberen Atemwege und invasiver bakterieller Krankheiten, wie z. B. Bakteriämie und Meningitis.
Beispiele:
Die nachfolgenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die den Fachleuten allgemein bekannt und für sie Routine sind, außer wenn dies im Detail anders beschrieben wird. Die Beispiele sind zur Veranschaulichung, aber beschränken nicht die Erfindung.
Beispiel 1: Auffinden und bestätigende DNA-Sequenzierung des BASB030-Gens aus zwei N. meningitidis-Stämmen
A: BASB030 in N. meningitidis Serogruppe B Stamm ATCC13090
Das in SEQ ID NO:1 offenbarte BASB030-Gen wurde zuerst in der Incyte PathoSeq-Datenbank gefunden, die unfertige genomische DNA-Sequenzen des N. meningitidis-Stammes ATCC13090 enthält. Die Translation der BASB030-Polynukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID NO:2, zeigte eine signifikante Ähnlichkeit (81 % Identität in einer Überlappung von 758 Aminosäuren) mit dem äußeren Membranprotein PilQ von Neisseria gonorrhoeae. Die Sequenz des BASB030-Gens wurde ferner experimentell bestätigt. Zu diesem Zweck wurde genomische DNA aus 1010 Zellen der N. meningitidis-Zellen (Stamm ATCC13090) unter Verwendung des QIAGEN-Extraktionskits für genomische DNA (Qiagen GmbH) extrahiert, und 1 μg dieses Materials wurde der Polymerase-Kettenreaktion-DNA-Amplifikation unter Verwendung der Primer PilQ1 (5'-GGG G GCTAGC AA TAC CAA ACT GAC AAA AAT CAT TTC C-3'] [SEQ ID NO:7], der eine interne NheI-Stelle enthält (unterstrichen), und PilQ2 (5'-GGG G AAGCTT AT AGC GCA GGC TGT TGC CGG C-3') [SEQ ID NO:8], der eine interne HindIII-Stelle enthält (unterstrichen), unterworfen. Dieses PCR-Produkt wurde gelgereinigt und der DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Big Dye Cycle Sequencing-Kits (Perkin-Elmer) und eines ABI 373A/PRISM DNA-Sequenzers unterworfen. Die DNA-Sequenzierung wurde an beiden Strängen mit einer Redundanz von 2 durchgeführt, und die Sequenz voller Länge wurde unter Verwendung des SegMan-Programms aus dem DNASTAR-Lasergene-Software-Paket zusammengesetzt. Die resultierende DNA-Sequenz und abgeleitete Polypeptidsequenz sind in SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 gezeigt.
B: BASB030 in N. meningitidis Serogruppe B Stamm H44/76
Die Sequenz des BASB030-Gens wurde ebenfalls in einem anderen N. meningitidis Serogruppe B Stamm bestimmt, dem Stamm H44/76. Zu diesem Zweck wurde genomische DNA aus dem N. meningitidis-Stamm H44/76 unter Verwendung der in Beispiel 1 dargestellten experimentellen Bedingungen extrahiert. Dieses Material (1 μg) wurde dann der Polymerase-Kettenreaktion-DNA-Amplifikation unter Verwendung der Primer PilQ1 und PilQ2, die spezifisch für das BASB030-Gen sind, unterworfen. Ein –2300 bp DNA-Fragment wurde erhalten, durch die NhI/HindIII-Restriktionsendonukleasen verdaut und in die entsprechenden Stellen des pET-24b-Klonierungs/Expressionsvektors (Novagen) unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie inseriert (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage, Hrsg.: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Press 1989). Rekombinantes pET-24b/BASB030 wurde dann der DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Big Dyes-Kit (Applied Biosystems) unterworfen und an einem ABI 373/A DNA-Sequenzer unter den vom Hersteller beschriebenen Bedingungen analysiert. Als Ergebnis wurden die Polynukleotid- und abgeleiteten Polypeptidsequenzen erhalten, bezeichnet als SEQ ID NO:5 bzw. SEQ ID NO:6. Unter Verwendung des MegAlign-Programms aus dem DNASTAR-Paket wurde eine Angleichung der Polynukleotidsequenzen von SEQ ID NO:1, 3 und 5 durchgeführt und ist in 1 dargestellt; ein paarweiser Vergleich der Identitäten ist in Tabelle 1 zusammengefaßt und zeigt, daß die drei BASB030-Polynukleotid-Gensequenzen alle ähnlich mit einem Identitätsgrad von mehr als 98,0 % sind. Unter Verwendung des gleichen MegAlign-Programms wurde eine Angleichung der Polypeptidsequenzen von SEQ ID NO:2, 4 und 6 durchgeführt und wird in 2 dargestellt; ein paarweiser Vergleich der Identitäten ist in Tabelle 2 zusammengefaßt und zeigt, daß die drei BASB030-Proteinsequenzen alle ähnlich mit einem Identitätsgrad von mehr als 95,0 % sind. Zusammen zeigen diese Daten einen starken Sequenzerhalt des BASB030-Gens zwischen zwei N. meningitidis-Serogruppe B-Stämmen. Tabelle 1: Paarweise Identitäten der BASB030 Polynukleotidsequenzen (in %)
Tabelle 2: Paarweise Identitäten der BASB030-Polypeptidsequenzen (in %)
Beispiel 2: Expression und Reinigung von rekombinantem BASB030-Protein in Escherichia coli
Die Konstruktion des pET-24b/BASB030-Klonierungs/Expressionsvektors wurde in Beispiel 1B beschrieben. Dieser Vektor beherbergt das BASB030-Gen, isoliert aus dem Stamm H44/76, in Fusion mit einem Abschnitt von 6 Histidinresten, gestellt unter die Kontrolle des starken Bakteriophagen T7-Gen-10-Promotors. Zur Expressionsuntersuchung wurde dieser Vektor in den Escherichia coli-Stamm Novablue (DE3) (Novagen) eingeführt, in dem das Gen für die T7-Polymerase unter die Kontrolle des Isopropyl-beta-D-thiogalactosid-(IPTG)-regulierbaren lac-Promotors gestellt ist. Flüssigkulturen (100 ml) des rekombinanten E. coli-Stammes Novablue (DE3) [pET-24b/BASB030] wurden bei 37°C unter Bewegung gezüchtet, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) 0,6 erreichte. Zu diesem Zeitpunkt wurde IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben, und die Kultur wurde für vier weitere Stunden gezüchtet. Die Kultur wurde dann mit 10 000 U/min zentrifugiert, und das Pellet wurde bei –20°C für wenigstens 10 Stunden eingefroren. Nach dem Auftauen wurde das Pellet während 30 min bei 25°C in Puffer A (6 M Guanidinhydrochlorid, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 8,0) resuspendiert, dreimal durch eine Nadel geleitet und durch Zentrifugieren geklärt (20 000 U/min, 15 min). Die Probe wurde dann mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min auf eine mit Ni²⁺-beladene Hitrap-Säule (Pharmacia Biotech) aufgetragen. Nach Hindurchleiten des Durchflusses wurde die Säule nacheinander mit 40 ml Puffer B (8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 8,0), und 40 ml Puffer C (8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 6,3) gewaschen. Das rekombinante Protein BASB030/His6 wurde dann aus der Säule mit 30 ml Pufffer D (8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, pH 6,3), der 500 mM Imidazol enthielt, eluiert, und 3 ml-Fraktionen wurden aufgefangen. Wie in 3 gezeigt wird, wurde ein hochangereichertes (Reinheit zu mehr als 90 % rein in Coomassie-Anfärbung abgeschätzt) BASB030/His6-Protein aus der Säule eluiert, das mit 85 kDa (abgeschätztes relatives Molekulargewicht) wanderte. Dieses Polypeptid war reaktiv gegenüber einem monoklonalen Antikörper der Maus, gezüchtet gegen das 5-Histidin-Motiv (siehe 3; Spur 2). Außerdem konnte das denaturierte, rekombinante PilQ-His6-Protein in einer Lösung ohne Harnstoff solubilisiert werden. Zu diesem Zweck wurde denaturiertes PilQ-His6, das in 8 M Harnstoff enthalten war, umfassend gegen Puffer R (150 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄, 0,5 M Arginin, pH 6,8), der nacheinander 6 M, 4 M, 2 M und keinen Harnstoff enthielt, dialysiert (2 Stunden). Die entsprechende Zubereitung von PilQ bleibt selbst nach Einfrieren und Auftauen löslich. Zusammen zeigen diese Daten, daß das BASB030-Gen unter einer entweder löslichen oder unlöslichen, rekombinanten Form (BASB030/His6) in E. coli exprimiert und gereinigt werden kann.
Beispiel 3: Immunisierung von Mäusen mit BASB030-Polypeptiden und Erkennung der Antikörperreaktion an rekombinantem BASB030-Polypeptid durch ELISA
Teilweise gereinigten natives BASB030 wurde dreimal in BALB/C-Mäuse an den Tagen 0, 14 und 28 injiziert (5 Tiere/Gruppe). Dieses native BASB030-Polypeptid stammte direkt aus einem Neisseria meningitidis B-Stamm (erhalten von J. Tommassen). Den Tieren wurden auf dem subkutanen Weg 5 μg (ersten Injektion) und 2 μg (zweite und dritte Injektionen) von BASB030-Polypeptid injiziert, formuliert in SBAS2 (SB62-Emulsion mit 5 μg MPL und 5 μg QS21 pro Dosis) oder nach Adsorption an AlPO₄ (mit 5 μg MPL). Eine negative Kontrollgruppe, die aus nur mit der SBAS2-Formulierung immunisierten Mäusen bestand (ohne BASB030-Polypeptid), wurde auch dem Experiment zugefügt. Den Mäusen wurde an den Tagen 28 (14 Tage Post II) und 35 (7 Tage Post III) Blut abgenommen, um spezifische Anti-BASB030-Antikörper nachzuweisen. Spezifische Anti-BASB030-Antikörper wurden durch ELISA unter Verwendung von teilweise gereinigtem rekombinantem BASB030-Polypeptid als aufgetragenes Protein auf Mikroplatten gemessen. Die Analysen wurden an vereinigten Seren (aus 5 Mäusen) nur Post II (Tag 28) vorgenommen.
Erkennung von BASB030-Epitopen am rekombinanten Protein durch ELISA
Kurz gesagt werden Mikrotiterplatten (Maxisorp, Nunc) mit 100 μl der rekombinanten BASB030-Lösung mit ca. 0,5 μg/ml in PBS für 2 Stunden bei 37°C beschichtet. Danach werden die Platten dreimal mit 300 μl von 150 mM NaCl - 0,05 % Tween 20 gewaschen. Danach werden sie mit 100 μl von PBS - 0,3 % Casein überzogen und für 30 min bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Die Platten werden erneut unter Verwendung des gleichen Verfahrens vor der Inkubation mit Antikörpern gewaschen. Tierseren werden seriell 2-fach in PBS - 0,3 % Casein - 0,05 % Tween 20 verdünnt und in die Mikroplatten (12 Verdünnungen, ausgehend bei der Verdünnung 1/100) vor Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min unter Schütteln und vor dem nächsten identischen Waschschritt gegeben. Anti-Maus-Ig (aus Kaninchen, Dakopatts E0413), konjugiert an Biotin, wird mit 1/2000 in PBS - 0,3 % Casein - 0,05 % Tween 20 verwendet, um Maus-anti-BASB030-Antikörper nachzusweisen. Nach dem letzten Waschschritt (wie zuvor) werden die Platten mit einer Streptavidin-Peroxidase-Komplexlösung, verdünnt auf 1/4000 in der gleichen Lösungsmittellösung, für 30 min bei Raumtemperatur unter Schüttelbedingungen inkubiert.
Die nachfolgend veranschaulichten Ergebnisse zeigen, daß das BASB030-Polypeptid hoch immunogen in BALB/C-Mäusen ist, sowohl in der SBAS2-Emulsion als auch nach Adsorption an AlPO₄/MPL (4). Diese Antikörper, die nach nur zwei Injektionen des nativen Proteins induziert wurden, können das rekombinante BASB030-Polypeptid erkennen. Die Figur zeigt auch, daß die SBAS2-Emulsion etwas immunogener als die AlPO₄/MPL-Formulierung ist. Das gereinigte rekombinante BASB030-Polypeptid wurde auch BALB/C-Mäusen zur Auswertung seiner Immunogenität injiziert.
Erkennung von nativen BASB030-Epitopen auf den Zellen durch Vollzell-ELISA
Der homologe H44/76 MenB-Stamm (B:15:P1.7, 16) wurde als beschichtete Bakterien verwendet, um spezifische Anti-BASB030-Antikörper in Tierseren nachzuweisen. Kurz gesagt werden Mikrotiterplatten (Maxisorp, Nunc) mit 100 μl einer 1/10 Verdünnung (in PBS) mit einer H44/76-Bakterienlösung auf einer 6 Stunden-Kultur beschichtet, worin die Bakterien durch 400 μg/ml Tetracyclin abgetötet wurden. Die Platten werden für wenigstens 16 Stunden bei 37°C inkubiert, bis die Platten vollständig getrocknet sind. Dann werden sie dreimal mit 300 μl von 150 mM NaCl - 0,05 % Tween 20 gewaschen. Danach werden die Platten mit 100 μl von PBS - 0,3 % Casein überzogen und für 30 min bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Die Platten werden erneut unter Verwendung des gleichen Verfahrens vor der Inkubation mit Antikörpern gewaschen. Tierseren werden seriell 2-fach in PBS - 0,3 % Casein - 0,05 % Tween 20 verdünnt und in die Mikroplatten (12 Verdünnungen, ausgehend von der 1/100-Verdünnung) vor Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min unter Schütteln gegeben, vor dem nächsten identischen Waschschritt. Anti-Maus-Ig (aus Kaninchen, Dakopatts E0413), konjugiert an Biotin, wird mit 1/2000 in PBS - 0,3 % Casein - 0,05 % Tween 20 verwendet, um Maus-anti-BASB030-Antikörper nachzuweisen. Nach dem letzten Waschschritt (wie zuvor) werden die Platten mit einer Streptavidin-Peroxidase-Komplexlösung, verdünnt auf 1/4000 in der gleichen Lösungsmittellösung, für 30 min bei Raumtemperatur unter Schüttelbedingungen inkubiert.
Wie nachfolgend in 5 gezeigt wird, können wir schlußfolgern, daß es eine spezifische BASB030-Antigenerkennung am homologen H44/76-Stamm in Mäusen gibt, die mit dem gereinigten Molekül immunisiert wurden, formuliert in der SBAS2-Emulsion sowie an AlPO₄/MPL-Hilfsstoff (eine Sammlung von 5 Mäusen/Gruppe erfolgte). Die Antikörperreaktion ist höher bei der SBAS2-Formulierung, wie es am rekombinanten BASB030-Protein beobachtet wird. Mäuse, denen nur der Hilfsstoff SBAS2 injiziert wurde, zeigen keine eindeutige positive Reaktion.
Beispiel 4: Gegenwart von Anti-BASB030-Antikörpern in Seren aus humanen konvaleszenten Patienten
In diesem Test wurden humane konvaleszente Seren durch Western-Blotting auf Gegenwart von spezifischen Antikörpern unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem BASB030-Protein sowie nativem BASB030-Protein (von J. Tommassen, Niederlande) untersucht. Kurz gesagt werden 5 μg von gereinigtem BASB030-Protein (rekombinant oder nativ) in ein SDS-PAGE-Gradientengel (4-20 %, Novex, Code Nr. EC60252) zur elektrophoretischen Wanderung gegeben. Die Proteine werden auf ein Nitrocelluloseblatt (0,45 μm, Bio-rad Code Nr. 162-0114) mit 100 V für 1 Stunde unter Verwendung eines Bio-rad Trans-Blot-Systems (Code Nr. 170-3930) übertragen. Danach wird der Filter mit PBS - 0,05 % Tween 20 über Nacht bei Raumtemperatur vor Inkubation mit den humanen Seren blockiert. Diese Seren werden 100-fach in PBS - 0,05 % Tween 20 verdünnt und auf dem Nitrocelluloseblatt für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Schütteln und unter Verwendung eines Miniblotter-Sysems (Miniprotean, Bio-rad Code Nr. 170-4017) inkubiert. Nach drei wiederholten Waschschritten in PBS - 0,05 % Tween 20 für 5 min wird das Nitrocelluloseblatt bei Raumtemperatur für 1 Stunde unter vorsichtigem Schütteln mit den entsprechendem Konjugat (biotinylierte Anti-humanes IG-Antikörper aus Schaf, Amersham Code Nr. RPN10003, oder biotinylierte Anti-Maus-Ig-Antikörper aus Kaninchen, Amersham Code RPN1001), verdünnt mit 1/500 im gleichen Waschpuffer, inkubiert. Die Membran wird dreimal wie zuvor gewaschen und für 30 min unter Rühren und unter Verwendung des Streptavidin-Peroxidase-Komplexes (Amersham Code Nr. 1051), verdünnt mit 1/1000 im Waschpuffer, inkubiert. Nach den letzten drei wiederholten Waschschritten erfolgt die Aufdeckung während der 10- bis 15-minütigen Inkubationszeit in einer 50 ml-Lösung, die 30 mg 4-Chlor-1-naphthol (Sigma), 10 ml Methanol, 40 ml PBS und 30 μl H₂O₂ enthält. Die Anfärbung wird angehalten, während die Membran mehrmals in destilliertem Wasser gewaschen wird.
Die in den 6 und 7 (Teil A) veranschaulichten Ergebnisse zeigen, daß 5 bis 7 der 7 konvaleszenten Seren entweder das native BASB030-Protein bei unterschiedlichen Molekulargewichten (6) oder das rekombinante BASB030-Protein bei ca. 90 kDa (7) erkennen. Die zwei konvaleszenten Seren, die schwach gegen das rekombinante BASB030-Polypeptid reagieren, sind Nr. 261469 und Nr. 261979 (7), während Nr. 262117 und 261979 am nativen BASB030-Polypeptid keine klare Reaktion zeigen (6). Diejenigen, die mit der höchsten Intensität reagieren, sind die gleichen an beiden Proteinen (rekombinant und nativ). Diese Reaktionen könnten die Bedeutung dieses Polypeptids als Impfstoffkandidat widerspiegeln. Das native BASB030-Protein scheint wenigstens drei unterschiedliche Banden zu zeigen, die wahrscheinlich dem BASB030-Polypeptid zugewiesen werden, wobei die höchste identisch auf beiden Gelen ist (ca. 90 kDa). Natives BASB030-Polypeptid, das direkt aus Bakterien isoliert wird, zeigt Abbauprodukte, da Banden mit ca. 45 und 35 kDa deutlich sichtbar sind. In Teil B beider Western-Blots wird die Reaktion von Mäuse-Antikörpern veranschaulicht, die gegen das homologe Protein von Neisseria gonorrhoeae gerichtet sind (J. Tommassen, Niederlande). Die Ergebnisse veranschaulichen deutlich, daß es eine klare Kreuzreaktion zwischen beiden homologen BASB030-Proteinen gibt: am rekombinanten BASB030-Protein werden zwei deutliche Banden detektiert, von denen eine die Hauptbande bei 90 kDa gemäß Erkennung durch humane konvaleszente Seren ist und die andere bei ca. 70 kDa ist (7). Am nativen BASB030-Protein erkennen Mäuse-Antikörper nicht nur die zwei Hauptbanden bei 90 und 45 kDa, wie mit konvaleszenten Seren beobachtet, sondern auch Banden, die Abbauprodukte sein könnten (ca. 75, 70, 55, 40, 35 und 25 kDa, siehe 6).
Beispiel 5: Wirksamkeit eines BASB030-Impfstoffs: Aktivität von Anti-BASB030-Antikörpern
Bakterizide Aktivität von Anti-BASB030-Antikörpern am homologen Neisseria meningitidis-Stamm
Die bakterizide Aktivität von tierischen Seren (bei Ansammlungen) wurde wie zuvor beschrieben (1, 2) mit nur geringfügigen Unterschieden untersucht. Kurz gesagt wird die Neisseria meningitidis-Serogruppe B (H44/76-Stamm) zur Bestimmung der bakteriziden Aktivität von tierischen Seren verwendet. In Mikroplatten mit 96 Vertiefungen mit U-Boden (NUNC) mit 50 μl/Vertiefung wurden serielle zweifache Serumverdünnungen mit 37,5 μl/Vertiefung der Meningococcensuspension der logarithmischen Phase, eingestellt auf 2,5·10⁴ KBE/ml, für 15 min bei 37°C unter Schütteln mit 210 U/min (Orbitalschüttler, Forma Scientific) inkubiert. Dann wurden 12,5 μl von Babykaninchen-Komplement (Pel-freeze Biologicals, USA) vor Inkubation für eine weitere Stunde unter den gleichen Bedingungen hinzugegeben. Danach wurden 10 μl-Teilmengen der Mischung aus jeder Vertiefung auf Müller-Hinton-Agarplatten getüpfelt, die 1 % Isovitalex und 1 % hitzeinaktiviertes Perdeserum enthielten, vor Inkubation über Nacht bei 37°C mit 5 % CO₂. Am Tag danach werden Kolonien für jede untersuchte Verdünnung gezählt und bakterizide Titer als die Verdünnung des Serums für 50 % Abtötung im Vergleich mit der Komplementkontrolle ohne Serum bestimmt. Durch dieses Verfahren können individuelle Kolonien bis zu 100 KBE/Fleck gezählt werden. Titer werden als die Verdünnung ausgedrückt, die 50 % Abtötung induziert, berechnet durch Regressionsanalyse.
Die in Tabelle 3 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, daß Anti-BASB030-Antikörper eine starke bakterizide Wirkung auf den homologen H44/76-Stamm haben, wie es auch bei dem als positive Kontrolle verwendeten monoklonalen Anti-PorA-Antikörper beobachtet wird. Bei der 1/2560-Verdünnung ist die prozentuale Abtötung noch sehr hoch (91 %).
Literaturstellen:

1. P. Hoogerhout, E.M.L.M. Donders, J.A.M. van Gaans-van den Brink, B. Kuipers, H.F. Brugghe, L.M.S. van Unen, H.A.M. Timmermans, G.J. ten Hove, A.D.P.J.M de Jong, C.C.A.M. Peeters, E.J.H.J. Wiertz und J.T. Poolman, Infection and immunity, Sept. 1995, Bd. 63, Nr. 9, S. 3473-3478.
2. S.E. Maslanka, L.L. Gheesling, D.E. Libutti, K.B.J. Donaldson, H.S. Harakeh, J.K. Dykes, F.F. Arhin, S.J.N. Devi, E.C. Frasch, J.C. Huang, P. Kriz-Kuzemenska, R.D. Lemmon, M. Lorange, C.C.A.M. Peeters, S. Quataert, J.Y. Tai, G.M. Carlone und "The Multilaboratory Study Group", Clin. Diagn. Lab. Immunol., 1997, 4: 156-167.

Tabelle 3: Bakterizide Wirkung von Anti-BASB030-Antikörpern
Beispiel 6: Wirksamkeit der Anti-BASB030-Antikörper im passiven Schutzmodell (Babyratten).
Aus immunisierten Mäusen (5/Gruppe, zwei Gruppen) erhaltene Anti-BASB030-Antikörper wurden auf ihre schützende Wirkung im Schutzmodell mit der Babyratte ausgewertet. Der Test mißt die Clearance-Aktivität des Neisseria meningitidis B-Stammes durch die Antikörper, injiziert 24 Stunden vor der Exposition.
Kurz gesagt werden 100 μl einer 1/10-Verdünnung aus einer Ansammlung von Mäuseseren (mit spezifischen Anti-BASB030-Antikörpern) auf dem intraperitonealen Weg (IP) in 7 Tage alte Babyratten (Sprague Dawley) 24 Stunden vor Kontakt mit lebenden Bakterien injiziert (Tag -1). Am Tag 0 wurden den Babyratten, randomisiert und passiv mit Mäuseseren am Tag -1 immunisiert, 10 mg Eisendextran in 100 μl auf dem IP-Weg injiziert, 30 min vor Kontakt auf dem gleichen IP-Weg mit 107 lebenden Bakterien (100 μl) aus einem oder mehreren Neisseria meningitidis-Stämmen H44/76 (B:15:P1.7,16), zuvor durch die Ratte passagiert (zweimal). Der Neisseria meningitis-Stamm wird in flüssigem TSB-Medium für ca. 2 Stunden gezüchtet. Die Bakterien werden dann in PBS verdünnt, um eine Suspension mit 1·10⁸ KBE/ml zu erhalten. Sieben Tage alte Babyratten werden für diesen Assay verwendet. Die Gruppen sind aus 8 Raten zusammengesetzt, die statistisch aus Würfen vermischt sind, vor Immunisierung durch die IP-Injektion von 100 μl eines zu untersuchenden vereinigten Serums. Drei Stunden nach dem Kontakt werden 20 μl Blut, erhalten durch Herzpunktion nach Anästhesie, in PBS verdünnt (1/10, 1/100, 1/1000 und 1/10000), und die mehreren Verdünnungen werden auf Mueller-Hinton-Medium zur Zählung der koloniebildenden Einheiten (KBE) aus plattiert. Danach (24 Stunden später) wird die Anzahl von KBE abgeschätzt und mit der Anzahl von KBE/ml Blut in Babyratten verglichen, die passiv mit PBS immunisiert. wurden. Die Kontrollgruppe bestand aus Ratten, denen PBS injiziert wurde. Gewichtete Mittelwerte werden für jedes Tier berechnet, und der Mittelwert jeder Gruppe wird mit jedem anderen Mittelwert verglichen. Die mit Anti-BASB030-Antikörpern erhaltenen Ergebnisse (siehe 8) veranschaulichen, daß diese spezifischen Antikörper eine Clearance-Wirkung auf den Neisseria meningitidis-Stamm H44/76 bei Vergleich mit der negativen Kontrollgruppe haben. Es wird bis zu 1 log₁₀ an Differenz als Vorteil für die Anti-BASB030-Antikörper im Vergleich mit nichtspezifischen Antikörpern beobachtet, die in Mäusen vorhanden sind, denen nur PBS injiziert wurde. Die mit unseren Anti-BASB030-Antikörpern beobachtete Schutzwirkung ist äquivalent derjenigen, die mit einem gut charakterisierten monoklonalen Anti-PorA-Antikörper erhalten wird (H44/29, Anti-P1.16).
Legende für 3
Substantiell reine (mehr als 80 %) BASB030-Proteinfraktionen wurden an einem 4-20 % Gradienten-Polyacryiamidgel (NOVEX) unter SDS-PAGE-Bedingungen parallel zu einem Protein-Molekulargewichtsmarker erhalten. Die Gele wurden entweder mit Coomassie Blue R250 angefärbt oder durch Western-Blot unter Verwendung eines monoklonalen Anti-(His5)-Antikörpers analysiert.
Hinterlegte Materialien
Eine Hinterlegung, die einen Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stamm enthält, wurde bei der American Type Culture Collection (nachfolgend "ATCC") am 22. Juni 1997 hinterlegt, und ihr wurde die Eingangsnummer 13090 zugewiesen. Die Hinterlegung wurde als Neisseria meningitidis (Albrecht und Ghon) beschrieben und ist eine gefriergetrocknete 1,5-2,9 kb Insert-Bibliothek, konstruiert aus N. meningitidis-Isolat. Die Hinterlegung wird beschrieben in Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 8: 1-15 (1958).
Die Hinterlegung des Neisseria meningitidis-Stammes wird hier als "der hinterlegte Stamm" oder als "die DNA des hinterlegten Stammes" bezeichnet.
Der hinterlegte Stamm enthält das BASB030-Gen voller Länge. Die Sequenz der im hinterlegten Stamm enthaltenen Polynukleotide sowie die Aminosäuresequenz jedes dadurch codierten Polypeptids sind im Fall eines Konflikts mit einer hier vorliegenden Beschreibung der Sequenzen bestimmend.
Die Hinterlegung des hinterlegten Stammes wurde nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vorgenommen. Der Stamm wird unwiderruflich und ohne Beschränkung oder Bedingung für die Öffentlichkeit bei Patenterteilung freigegeben. Der hinterlegte Stamm wird allein als Annehmlichkeit für die Fachleute bereitgestellt und ist kein Zugeständnis, das eine Hinterlegung für die Ausführbarkeit erforderlich ist, wie gemäß 35 U.S.C. §112 erforderlich. ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS ODER ANDEREM BIOLOGISCHEN MATERIAL (Regel 13^bis PCT)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid, das eine Immunreaktion hervorrufen kann (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger), die das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 erkennt, umfassend eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 90 % Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4 bzw. SEQ ID NO:6 hat.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz wenigstens 95 % Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4 bzw. SEQ ID NO:6 hat.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht.
Isoliertes Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht.
Isoliertes Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2.
Immunogenes Fragment des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das immunogene Fragment eine Immunreaktion hervorrufen kann (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger), die das Polypeptid von SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 erkennt, und worin das Fragment gegebenenfalls Teil eines größeren Proteins wie eines Fusionsproteins ist.
Polypeptid oder immunogenes Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Polypeptid Teil eines größeren Fusionsproteins ist.
Isoliertes Polynukleotid, das ein Polypeptid oder ein immunogenes Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 90 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4 bzw. SEQ ID NO:6 hat; oder Nukleotidsequenz, die komplementär zu dem isolierten Polynukleotid ist.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die wenigstens 90 % Identität mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 codiert, über die gesamte codierende Region hat; oder Nukleotidsequenz, die komplementär zu dem isolierten Polynukleotid ist.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die wenigstens 97 % Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:5 hat; oder Nukleotidsequenz, die komplementär zu dem isolierten Polynukleotid ist.
Isoliertes Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, worin die Identität wenigstens 99 % mit SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 ist.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 oder das immunogene Fragment gemäß Anspruch 6 oder 7 codiert.
Isoliertes Polynukleotid, das das Polynukleotid von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 umfasst.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 codiert, erhältlich durch Durchmustern einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde mit der Sequenz von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 oder einem Fragment davon.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die das Polypeptid von SEQ ID NO:2 codiert.
Isoliertes Polynukleotid, das das Polynukleotid von SEQ ID NO:1 umfasst.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die das Polypeptid von SEQ ID NO:2 codiert, erhältlich durch Durchmustern einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde mit der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder einem Fragment davon.
Expressionsvektor oder rekombinanter lebender Mikroorganismus, der ein isoliertes Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 8 bis 18 umfasst.
Wirtszelle, die den Expressionsvektor gemäß Anspruch 19 umfasst, der ein isoliertes Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 90 % Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht, oder mit dem immunogene Fragment gemäß Anspruch 6 oder 7 hat, oder Membran der Wirtszelle, die das exprimierte Polypeptid oder immunogene Fragment enthält.
Membran oder subzelluläre Fraktion einer Wirtszelle, die ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein immunogenes Fragment eines Polypeptids gemäß Anspruch 6 oder 7 exprimiert.
Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 90 % Identität mit der Aminosäuresequenz hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht, oder eines immunogenen Fragments gemäß Anspruch 6 oder 7, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 20 unter Bedingungen, die ausreichend zur Erzeugung des Polypeptids sind, und Gewinnen des Polypeptids oder immunogenen Fragments aus dem Kulturmedium.
Verfahren zum Exprimieren eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 8 bis 18, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der wenigstens eines der Polynukleotide umfasst, und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die ausreichend zur Expression eines Polynukleotides sind.
Verfahren zur Erzeugung der Membran gemäß Anspruch 21, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein Polynukleotid umfasst, das ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein immunogenes Fragment gemäß Anspruch 6 oder 7 codiert, und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die ausreichend zur Erzeugung des Polypeptids sind, und Gewinnen der Membran aus dem Kulturmedium.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge des Polypeptids oder des immunogenen Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge des Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 8 bis 18 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 25 oder 26, worin die Zusammensetzung wenigstens ein anderes Neisseria meningitidis-Antigen umfasst.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Neisseria meningitidis-Infektion, umfassend das Identifizieren eines Polypeptids oder eines immunogenen Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Antikörpers, der immunspezifisch für das Polypeptid ist, vorhanden innerhalb einer biologischen Probe aus einem Tier, das einer solchen Infektion verdächtigt wird.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines Polypeptids oder eines immunogenen Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Erzeugung einer Immunreaktion in einem Tier.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eins Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 8 bis 18 umfasst, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Erzeugung einer Immunreaktion in einem Tier.