DE60019614T2

DE60019614T2 - Moraxella catarrhalis antigen basb117

Info

Publication number: DE60019614T2
Application number: DE60019614T
Authority: DE
Inventors: Joelle Thonnard
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 2000-07-31
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2020-08-01
Also published as: EP1206547B1; WO2001009339A3; WO2001009339A2; DE60019614D1; AU6568800A; ATE293693T1; EP1206547A2; ES2239609T3; CA2380831A1; GB9918206D0

Description

Neue Verbindungen
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Polynukleotide (hier als "BASB117-Polynukleotid(e)" bezeichnet), durch sie codierte Polypeptide (hier als "BASB117" oder "BASB117-Polypeptid(e)" bezeichnet), rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide und Polynukleotide, einschließlich Impfstoffe gegen bakterielle Infektionen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung diagnostische Tests zum Nachweis einer Infektion mit bestimmten Pathogenen.
Hintergrund der Erfindung
Moraxella catarrhalis (ebenfalls Branhamella catarrhalis genannt) ist ein Gram-negatives Bakterium, das häufig aus den oberen Atemwegen des Menschen isoliert wird. Es ist verantwortlich für verschiedene Pathologien, deren hauptsächliche Mittelohrentzündung in Säuglingen und Kindern und Lungenentzündung bei älteren Menschen ist. Es ist ebenfalls verantwortlich für Sinusitis, Nosokomialinfektionen und weniger häufig für Invasionskrankheiten.
Mittelohrentzündung ist eine bedeutende Kinderkrankheit, sowohl nach der Anzahl der Fälle als auch nach ihren potentiellen Folgen. Mehr als 3,5 Millionen Fälle werden jedes Jahr in den Vereinigten Staaten aufgezeichnet, und es wird geschätzt, daß 80 % der Kinder wenigstens eine Episode von Otitis vor dem Erreichen eines Alters von 3 erfahren haben (Klein, J.O. (1994) Clin. Inf. Dis. 19:823). Wenn sie unbehandelt belassen oder chronisch wird, kann diese Krankheit zu Gehörverlusten führen, die temporär (im Falle von Flüssigkeitsansammlung im Mittelohr) oder permanent (falls der Hörnerv geschädigt wird) sein können. Bei Säuglingen können solche Gehörverluste verantwortlich für eine verzögerte Spracherlernung sein.
Drei bakterielle Arten werden primär aus dem Mittelohr von Kindern mit Mittelohrentzündung isoliert: Streptococcus pneumoniae, nicht-typifizierbare Haemophilus influenza (NTHi) und M. catarrhalis. Sie sind in 60 bis 90 % der Fälle vorhanden. Eine Übersicht über kürzliche Untersuchungen zeigt, daß S. pneumoniae und NTHi beide ca. 30 % und M. catarrhalis ca. 15 % der Mittelohrfälle darstellen (Murphy, T.F. (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Andere Bakterien können aus dem Mittelohr isoliert werden (H. influenza Typ B, S. pyogenes etc.), aber mit einer viel geringeren Häufigkeit (2 % der Fälle oder weniger).
Epidemiologische Daten weisen darauf hin, daß für die im Mittelohr gefundenen Pathogene die Besiedlung der oberen Atemwege eine absolute Voraussetzung für die Entwicklung einer Otitis ist; andere sind jedoch ebenfalls erforderlich, um zur Krankheit zu führen (Dickinson, D.P. et al. (1988) J. Infect. Dis. 158:205; Fasen, H.L. et al. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612). Diese sind wichtig, um die Migration der Bakterien in das Mittelohr über die Eustachio-Röhren auszulösen, gefolgt vom Start eines Entzündungsprozesses. Diese Faktoren sind bis heute unbekannt. Es wurde postuliert, daß eine vorübergehende Anomalie des Immunsystems, z.B. im Anschluß an eine Virusinfektion, eine Unfähigkeit zur Bekämpfung der Besiedlung der Atemwege verursachen könnten (Faden, H.L. et al. (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Eine alternative Erklärung besteht darin, daß der Kontakt mit Umweltfaktoren eine bedeutendere Besiedlung einiger Kinder erlaubt, die anschließend anfällig für die Entwicklung von Mittelohrentzündung wegen der anhaltenden Gegenwart von Mittelohrpathogenen werden (Murphy, T.F. (1996) Microbiol. Rev. 60:267).
Die Immunreaktion gegen M. catarrhalis ist nur schlecht charakterisiert. Die Analyse von Stämmen, die sequenziell aus dem Nasenrachen von Säugligen isoliert wurden, verfolgt im Alter von 0 bis 2 Jahren, deutet darauf hin, daß sie häufig neue Stämme erhalten und eliminieren. Dies deutet darauf hin, daß eine wirksame Immunreaktion gegen dieses Bakterium durch die befallenen Kinder aufgebaut wird (Faden, H.L. et al. (1994) J. Infect. Dis. 169:1312).
Bei den meisten untersuchten Erwachsenen wurden bakterizide Antikörper identifiziert (Chapman, A.J. et al. (1985) J. Infect. Dis. 151:878). Stämme von M. catarrhalis bilden Variationen in ihrer Fähigkeit, der bakteriziden Serumaktivität zu widerstehen: allgemein sind Isolate aus erkrankten Individuen resistenter als diejenigen, die nur befallen sind (Hol, C. et al. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, K.L, et al. (1990) Am. J. Med. 88 (Suppl. 5A):285). Die Serumresistenz könnte deshalb als ein Virulenzfaktor für das Bakterium betrachtet werden. Eine Opsonisierungs aktivität wurde in den Seren von Kindern beobachtet, die sich von Mittelohrentzündung erholen.
Die durch diese unterschiedlichen Immunreaktionen in Menschen getroffenen Antigene wurden nicht identifiziert, mit der Ausnahme von OMP B1, ein 84 kDa-Protein, dessen Expression durch Eisen reguliert wird und das durch die Seren von Patienten mit Lungenentzündung erkannt wird (Sethi, S. et al. (1995), Infect. Immun. 63:1516), und von UspA1 und UspA2 (Chen, D. et al. (1999), Infect. Immun. 67:1310).
Einige andere Membranproteine, die auf der Oberfläche von M. catarrhalis vorhanden sind, wurden unter Verwendung eines biochemischen Verfahrens oder wegen ihrer potentiellen Beteiligung an der Induktion einer Schutzimmunität charakterisiert (für eine Übersicht siehe Murphy, T.F. (1996) Microbiol. Rev. 60:267). In einem Lungenentzündungsmodell der Maus begünstigt die Gegenwart von Antikörpern, die gegen einige von ihnen erzeugt wurden (UspA, CopB), einen schnellere Klärung der pulmonalen Infektion. Ein anderes Polypeptid (OMP CD) ist hochkonserviert unter den M. catarrhalis-Stämmen und bildet Homologien mit einem Porin von Pseudomonas aeruginosa, von dem gezeigt wurde, daß es wirksam gegen dieses Bakterium in Tiermodellen ist. WO 97/32980 offenbart Transferrinrezeptorproteine von Moraxella.
Die Häufigkeit von Infektionen mit Moraxella catarrhalis hat in den vergangenen Jahrzehnten dramatisch zugenommen. Dies wurde dem Auftreten multipler Antibiotika-resistenter Stämme und einer zunehmenden Bevölkerung von Menschen mit geschwächten Immunsystemen zugeschrieben. Es ist nicht mehr unüblich, Moraxella catarrhalis-Stämme zu isolieren, die resistent gegen einige oder alle der Standardantibiotika sind. Dieses Phänomen hat eine unerfüllte medizinische Notwendigkeit und Nachfrage nach neuen antimikrobiellen Mitteln, Impfstoffen, Wirkstoffdurchmusterungsverfahren und diagnostischen Tests für diesen Organismus geschaffen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft BASB117, insbesondere BASB117-Polypeptide und BASB117-Polynukleotide, rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptid und Polynukleotide, unter anderem einschließlich Prävention und Behandlung von mikrobiellen Krankheiten. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung diagnostische Tests zum Nachweis von Krankheiten, die mit mikrobiellen Infektionen verbunden sind, und von Zuständen, die mit solchen Infektionen verbunden sind, wie Tests zum Nachweis der Expression oder Aktivität von BASB117-Polynukleotiden oder -Polypeptiden.
Verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und Umfangs der offenbarten Erfindung werden den Fachleuten aus dem Lesen der folgenden Beschreibung und aus dem Lesen der anderen Teile der vorliegenden Offenbarung leicht ersichtlich werden.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft BASB117-Polypeptide und -Polynukleotide, wie sie im größeren Detail nachfolgend beschrieben werden. Insbesondere betrifft die Erfindung Polypeptide und Polynukleotide von BASB117 von Moraxella catarrhalis, das durch Aminosäuresequenzhomologie mit dem Neisseria gonorrhoeae-Pilus-Expressionsprotein PilP verwandt ist. Das BASB117-Polypeptid hat die Eigenschaften eines Lipoproteins, und es wird deshalb vorhergesagt, daß es oberflächenexprimiert wird. Die Erfindung betrifft speziell BASB117 mit den in SEQ ID NO:1 oder 3 bzw. SEQ ID NO:2 oder 4 dargestellten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen. Es versteht sich, daß die im nachfolgenden Sequenzprotokoll als "DNA" aufgeführten Sequenzen eine Erläuterung einer Ausführungsform der Erfindung darstellen, da die Fachleute erkennen werden, daß solche Sequenzen nützlich in Polynukleotiden allgemein eingesetzt werden können, einschließlich Ribopolynukleotiden.
Polypeptide
In einem Aspekt der Erfindung werden Polypeptide von Moraxella catarrhalis bereitgestellt, die hier als "BASB117" und "BASB117-Polypeptide" bezeichnet werden, sowie biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Varianten davon, und diese umfassende Zusammensetzungen.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner vor:

(a) ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85 Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97–99 % oder exakte Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:2 aufweist;
(b) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97–99 % oder exakte Identität mit SEQ ID NO:1 oder 3 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:1 bzw. 3 aufweist; oder
(c) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität; noch mehr bevorzugt wenigstens 97–99 % oder exakte Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 aufweist.

Die in SEQ ID NO:2 bereitgestellten BASB117-Polypeptide sind die BASB117-Polypeptide aus Moraxella catarrhalis-Stamm Mc2931 (ATCC 43617).
Die Erfindung stellt ebenfalls ein immunogenes Fragment eines BASB117-Polypeptids bereit, d.h. einen zusammenhängenden Teil des BASB117-Polypeptids, der die gleiche oder im wesentlichen gleiche immunogene Aktivität wie das Polypeptid hat, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 umfaßt; das heißt, das Fragment (falls erforderlich bei Kopplung an einen Träger) kann eine Immunreaktion hervorrufen, die das BASB117 Polypeptid erkennt. Ein solches immunogenes Fragment kann z.B. das BASB117-Polypeptid einschließen, dem eine N-terminale Leitsequenz und/oder eine Transmembrandomäne und/oder eine C-terminale Ankerdomäne fehlt. In einem bevorzugten Aspekt umfaßt das erfindungsgemäße immunogene Fragment von BASB117 im wesentlichen die gesamte extrazelluläre Domäne eines Polypeptids, das wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97–99 % Identität mit dem von SEQ ID NO:2 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 aufweist.
Ein Fragment ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die vollständig die gleiche wie ein Teil, aber nicht die gesamte, einer Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung ist. Wie bei BASB117-Polypeptiden können Fragmente "freistehend" sein oder innerhalb eines größeren Polypeptids enthalten sein, von dem sie einen Teil oder eine Region bilden, am meisten bevorzugt als eine einzelne kontinuierliche Region in einem einzelnen größeren Polypeptid.
Bevorzugte Fragmente schließen z.B. Trunkierungspolypeptide mit einem Teil einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 oder Varianten davon ein, wie ein kontinuierliche Reihe von Resten, die eine Amino- und/oder Carboxylterminale Aminosäuresequenz einschließt. Abbauformen der Polypeptide der Erfindung, die durch oder in einer Wirtszelle erzeugt werden, sind ebenfalls bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Fragmente, die durch strukturelle oder funktionelle Attribute gekennzeichnet sind, wie Fragmente, die alpha-Helix- und alpha-Helix-bildende Regionen, beta-Faltblatt- und beta-Falt blatt-bildende Regionen, Turn- und Turn-bildende Regionen, Coil- und Colibildende Regionen, hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alphaamphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, flexible Regionen, oberflächenbildende Regionen, substratbindende Regionen und Regionen mit hohem antigenem Index umfassen.
Weiterhin bevorzugte Fragmente schließen ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 umfaßt, oder ein isoliertes Polypeptid ein, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden, aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 trunkierten oder deletierten Aminosäuren umfaßt.
Fragmente der Polypeptide der Erfindung können zur Erzeugung des entsprechenden Polypeptids voller Länge durch Peptidsynthese eingesetzt werden. Deshalb können diese Fragmente als Zwischenstufen zur Herstellung der Polypeptide voller Länge der Erfindung eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt sind Varianten, in denen mehrere, 5–10, 1–5, 1–3, 1–2 oder 1 Aminosäuren substituiert, deletiert oder addiert in jeder Kombination sind.
Die Polypeptide oder immunogenen Fragmente der Erfindung können in Form des "reifen" Proteins sein oder können ein Teil eines größeren Proteins sein, wie ein Vorläufer- oder ein Fusionsprotein. Es ist häufig vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzuschließen, die sekretorische oder Leitsequenzen, Prosequenzen, Sequenzen, die bei der Reinigung helfen, wie multiple Histidinreste, oder eine zusätzliche Sequenz zur Stabilität während der rekombinanten Herstellung enthält. Weiterhin wird ebenfalls die Addition von exogenem Polypeptid oder Lipidschwanz oder Polynukleotidsequenzen zur Erhöhung des immunogenen Potentials des fertigen Moleküls erwogen.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung gentechnisch veränderte lösliche Fusionsproteine, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon und verschiedene Teile der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen verschiedener Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) umfassen. Bevorzugt als Immunglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von humanem IgG, insbesondere IgG1, wobei die Fusion an der Gelenkregion erfolgt. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil einfach durch Einfügen einer Spaltsequenz entfernt werden, die mit Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann.
Weiterhin betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine durch Genmanipulation und ihre Verwendung zur Wirkstoffdurchmusterung, Diagnose und Therapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren. Beispiele für die Fusionsproteintechnologie können in WO 94/29458 und WO 94/22914 gefunden werden.
Die Proteine können chemisch konjugiert oder als rekombinante Fusionsproteine exprimiert werden, was die Erzeugung erhöhter Mengen in einem Expressionssystem im Vergleich mit dem nicht-fusionierten Protein erlaubt. Der Fusionspartner kann bei der Bereitstellung von T-Helferepitopen (immunologischer Fusionspartner), bevorzugt von durch Menschen erkannten T-Helferepitopen, oder bei der Expression des Proteins (Expressionsverstärker) mit höheren Mengen als das native rekombinante Protein helfen. Bevorzugt wird der Fusionspartner sowohl ein immunologischer Fusionspartner als auch ein Expressionsverstärkungspartner sein.
Fusionspartner schließen Protein D aus Haemophilus influenzae und das Nichtstrukturprotein aus dem Grippevirus, NS1 (Hämagglutinin), ein. Ein anderer Fusionspartner ist das als LytA bekannte Protein. Bevorzugt wird der C-terminale Teil des Moleküls verwendet. LytA stammt aus Streptococcus pneumoniae, das eine N-Acetyl-L-Alanin-Amidase synthetisiert, Amidase-LytA (codiert durch das LytA-Gen {Gene, 43 (1986), S. 265–273}), ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen im Peptidoglycangerüst abbaut. Die C-terminale Domäne des LytA-Proteins ist verantwortlich für die Affinität zum Cholin oder zu bestimmten Cholin-Analoga, wie DEAE. Diese Eigenschaft wurde zur Entwicklung von C. coli C-LytA-exprimierenden Plasmiden ausgenutzt, die zur Expression von Fusionsproteinen nützlich sind. Die Reinigung von Hybridproteinen, die das C-LytA-Fragment an ihrem Amino-Terminus enthalten, wurden beschrieben {Biotechnology: 10 (1992), S. 795–798}. Es ist möglich den Repeat-Teil des LytA-Moleküls zu verwenden, der im C-terminalen Ende beginnend bei Rest 178 gefunden wird, z.B. Reste 188–305.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Varianten der zuvor genannten Polypeptide ein, d.h. Polypeptide, die sich von den Bezugnahmen durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wobei ein Rest durch einen anderen mit ähnlichen Eigenschaften substituiert wird. Solche typischen Substitutionen sind zwischen Ala, Val, Leu und Ile; zwischen Ser und Thr; zwischen den sauren Resten Asp und Glu; zwischen Asn und Gln; und zwischen den basischen Resten Lys und Arg; oder zwischen den aromatischen Resten Phe und Tyr.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in jeder geeigneten Weise hergestellt werden. Solche Polypeptide schließen isolierte natürlich vorkommende Polypeptide, rekombinant erzeugte Polypeptide, synthetisch erzeugte Polypeptide oder Polypeptide ein, die durch eine Kombination dieser Verfahren hergestellt werden. Mittel zur Herstellung solcher Polypeptide sind allgemein fachbekannt.
Es ist am meisten bevorzugt, daß ein Polypeptid der Erfindung aus Moraxella catarrhalis stammt, jedoch kann es bevorzugt aus anderen Organismen der gleichen taxonomischen Gattung erhalten werden. Ein Polypeptid der Erfindung kann ebenfalls z.B. aus Organismen der gleichen taxonomischen Familie oder Ordnung erhalten werden.
Polynukleotide
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Polynukleotide bereitzustellen, die BASB117-Polypeptide codieren, insbesondere Polynukleotide, die das hier als BASB117 bezeichnete Polypeptid codieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Polynukleotid eine Region, die BASB117-Polypeptide codiert und eine in SEQ ID NO:1 oder 3 aufgeführte Sequenz umfaßt, die ein Gen voller Länge einschließt, oder eine Variante davon.
Die in SEQ ID NO:1 oder 3 bereitgestellten BASB117-Polynukleotide sind die BASB117-Polynukleotide aus Moraxella catarrhalis-Stamm Mc2931 (ATCC 43617).
Als ein weiterer Aspekt der Erfindung werden isolierte Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die BASB117-Polypeptide und -Polynukleotide codieren und/oder exprimieren, insbesondere Moraxella catarrhalis BASB117-Polypeptide und -Polynukleotide, z.B. einschließlich ungereifte RNAs, Ribozym-RNAs, mRNAs, cDNAs, genomische DNAs, B- und Z-DNRs. Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Polynukleotide und Polypeptide und Varianten davon und diese umfassende Zusammensetzungen ein.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Polynukleotide, die wenigstens ein Gen voller Länge einschließen, das ein BASB117-Polypeptid mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 oder 4 aufweist, und eng. damit verwandte Polynukleotide und Varianten davon.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gibt es ein BASB117-Polypeptid von Moraxella catarrhalis, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 oder eine Variante davon umfaßt oder daraus besteht.
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Informationen, wie mit einer in SEQ ID NO:1 oder 3 dargestellten Polynukleotidsequenz, kann ein Polynukleotid der Erfindung, das BASB117-Polypeptid codiert, unter Verwendung von standardmäßigen Klonierungs- und Durchmusterungsverfahren erhalten werden, wie durch diejenigen zur Klonierung und Sequenzierung von chromosomalen DNA-Fragmenten aus Bakterien unter Verwendung von Moraxella catarrhalis-Catlin-Zellen als Ausgangsmaterial, gefolgt vom Erhalt eines Klons voller Länge. Zum Beispiel wird zum Erhalt einer Polynukleotidsequenz der Erfindung, wie einer in SEQ ID NO:1 oder 3 angegebenen Polynukleotidsequenz, typischerweise eine Bibliothek von Klonen von chromosomaler DNA von Moraxella catarrhalis Catlin in E. coli oder einem anderen geeigneten Wirt mit einem radiomarkierten Oligonukleotid, bevorzugt einem 17-mer oder länger, das aus einer Teilsequenz stammt, sondiert. Klone, die DNA tragen, die identisch mit derjenigen der Sonde ist, können dann unter Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen unterschieden werden. Durch Sequenzieren der so identifizierten individuellen Klone durch Hybridisierung mit Sequenzierungsprimern, die aus der ursprünglichen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz geschaffen wurden, ist es dann möglich, die Polynukleotidsequenz in beide Richtungen auszudehnen, um eine Gensequenz voller Länge zu bestimmen. Zweckmäßig wird eine solche Sequenzierung z.B. unter Verwendung von denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt, die aus einem Plasmidklon hergestellt wird. Geeignete Techniken werden beschrieben von T. Maniatis, E.F. Fritsch und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) (siehe insbesondere "Screening By Hybridization 1.90" und "Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70"). Eine direkte genomische DNA-Sequenzierung kann ebenfalls durchgeführt werden, um eine Gensequenz voller Länge zu erhalten. Illustrativ für die Erfindung wurde jedes in SEQ ID NO:1 oder 3 dargestellte Polynukleotid in einer aus Moraxella catarrhalis stammenden DNA-Bibliothek gefunden.
Außerdem enthält jede in SEQ ID NO:1 oder 3 dargestellt DNA-Sequenz ein offenes Leseraster, das ein Protein mit ca. der Anzahl von Aminosäureresten codiert, die in SEQ ID NO:2 oder 4 dargestellt sind, mit einem abgeleiteten Molekulargewicht, das unter Verwendung von den Fachleuten allgemein bekannten Molekulargewichtswerten für Aminosäurereste berechnet werden kann.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:1 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nr. 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nr. 649 von SEQ ID NO:1 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:2.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:3 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nr. 1 und dem letzten Codon, das bei Nukleotid Nr. 646 von SEQ ID NO:3 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:4, das das gleiche wie SEQ ID NO:2 ist.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid vor, das folgendes umfaßt oder daraus besteht:

(a) eine Polynukleotidsequenz, die wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97–99 % oder exakte Identität mit SEQ ID NO:1 oder 3 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:1 bzw. 3 aufweist; oder
(b) eine Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97–99 % oder 100 % exakte Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 aufweist.

Ein Polynukleotid, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einschließlich Homologen und Orthologen aus anderen Arten als Moraxella catarrhalis, kann durch ein Verfahren erhalten werden, das die Schritte aus der Durchmusterung einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (zum Beispiel unter Verwendung einer Temperatur im Bereich von 45–65°C und einer SDS-Konzentration von 0,1–1 %) mit einer markierten oder detektierbaren Sonde, die aus der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder 3 oder einem Fragment davon besteht oder diese umfaßt; und aus der Isolierung eines Gens voller Länge und/oder genomischer Klone, das/die die Polynukleotidsequenz enthält, umfaßt.
Die Erfindung stellt eine Polynukleotidsequenz bereit, die über ihre gesamte Länge mit einer codierenden Sequenz (offenes Leseraster) in SEQ ID NO:1 oder 3 identisch ist. Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung wird eine codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder ein Fragment davon, als solche, sowie eine codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder Fragment im Leseraster mit einer anderen codierenden Sequenz, wie eine Sequenz, die eine Leit- oder sekretorische Sequenz, eine Prä- oder Pro- oder Präpro-Proteinsequenz codiert. Das Polynukleotid der Erfindung kann ebenfalls wenigstens eine nicht-codierende Sequenz enthalten, z.B. ein schließend, aber nicht beschränkt auf wenigstens eine nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenz, wie die transkribierten, aber nicht-translatierten Sequenzen, Terminationssignale (wie rho-abhängige und rho-unabhängige Terminationssignale), Ribosom-Bindunsstellen, Kozak-Sequenzen, Sequenzen, die mRNA stabilisieren, Introns und Polyadenylierungssignale. Die Polynukleotidsequenz kann ebenfalls zusätzlich codierende Sequenz umfassen, die zusätzliche Aminosäuren codiert. Zum Beispiel kann eine Markersequenz codiert werden, die die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexa-Histidinpeptid, wie bereitgestellt im pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) und beschrieben in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821–824 (1989), oder ein HA-Peptid-Tag (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)); die beide nützlich in der Reinigung von daran fusionierter Polypeptidsequenz sein können. Polynukleotide der Erfindung schließen ebenfalls ein, aber sind nicht beschränkt auf Polynukleotide, die ein Strukturgen und seine natürlich assoziierten Sequenzen, die die Genexpression kontrollieren, umfassen.
Die Nukleotidsequenz, die BASB117-Polypeptid von SEQ ID NO:2 codiert, kann identisch mit der Polypeptid-codierenden Sequenz, die in den Nukleotiden 1 bis 648 von SEQ ID NO:1 enthalten ist, bzw. mit der Polypeptid-codierenden Sequenz sein, die in den Nukleotiden 1 bis 648 von SEQ ID NO:3 enthalten ist. Alternativ kann sie eine Sequenz sein, die als Ergebnis der Redundanz (Entartung) des genetischen Codes ebenfalls das Polypeptid von SEQ ID NO:2 codiert. Der Begriff "Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert", wie er hier verwendet wird, umfaßt Polynukleotide, die eine Sequenz einschließen, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, insbesondere ein bakterielles Polypeptid und insbesondere ein Polypeptid des Moraxella catarrhalis-BASB117 mit einer in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz. Der Begriff umfaßt ebenfalls Polynukleotide, die eine einzelne kontinuierliche Region oder diskontinuierliche Regionen, die das Polypeptid codieren (z.B. Polynukleotide, die durch einen integrierten Phagen, eine integrierte Insertionssequenz, eine integrierte Vektorsequenz, eine integrierte Transposonsequenz oder aufgrund von RNA-Editing oder genomischer DNA-Reorganisation), zusammen mit zusätzlichen Regionen einschließen, die ebenfalls codierende und/oder nicht-codierende Sequenzen enthalten können.
Die Erfindung betrifft ferner Varianten der hier beschriebenen Polynukleotide, die Varianten eines Polypeptids mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 codieren. Fragmente von Polynukleotiden der Erfindung können z.B. zur Synthese von Polynukleotiden voller Länger der Erfindung verwendet werden.
Weitere besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die BASB117-Varianten codieren, die die Aminosäuresequenz von BASB117-Polypeptid von SEQ ID NO:2 aufweisen, in der mehrere, einige, 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste substituiert, modifiziert, deletiert und/oder addiert sind, in jeder Kombination. Speziell bevorzugt darunter sind stumme Substitutionen, Additionen und Deletionen, die nicht die Eigenschaften und Aktivitäten von BASB117-Polypeptid verändern.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Polynukleotide, die wenigstens 85 % identisch über ihre gesamte Länge mit einem Polynukleotid sind, das BASB117-Polypeptid mit einer in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, und Polynukleotide, die komplementär zu solchen Polynukleotiden sind. Alternativ sind höchst bevorzugt Polynukleotide, die eine Region umfassen, die wenigstens 90 % identisch über ihre gesamte Länge mit einem Polynukleotid ist, das BASB117-Polypeptid codiert, und dazu komplementäre Polynukleotide. In dieser Hinsicht sind Polynukleotide, die wenigstens 95 % identisch über ihre gesamte Länge damit sind, besonders bevorzugt. Außerdem sind diejenigen mit wenigstens 97 % unter denjenigen mit wenigstens 95 % hoch bevorzugt, und unter diesen sind diejenigen mit wenigstens 98 % und wenigstens 99 % besonders hoch bevorzugt, wobei wenigstens 99 % die stärker bevorzugten sind.
Bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die Polypeptide codieren, die im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid beibehalten, das durch eine DNA von SEQ ID NO:1 oder 3 codiert wird.
Gemäß bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung werden Polynukleotide bereitgestellt, die, insbesondere unter stringenten Bedingungen, mit BASB177-Polynukleotidsequenzen hybridisieren, wie diejenigen Polynukleotide in SEQ ID NO:1 oder 3.
Die Erfindung betrifft ferner Polynukleotide, die mit den hier bereitgestellten Polynukleotidsequenzen hybridisieren. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung speziell Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hier beschriebenen Polynukleotiden hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "stringente Bedingungen" und "stringente Hybridisierungsbedingungen" eine Hybridisierung, die nur auftritt, falls es wenigstens 95 % und bevorzugt wenigstens 97 % Identität zwischen den Sequenzen gibt. Ein spezifisches Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die folgendes umfaßt: 50 % Formamid, 5×SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml von denaturierter, gescherter Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen des Hybridisierungsträgers in 0,1 × SSC bei ca. 65°C. Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind allgemein bekannt und exemplarisch angegeben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), insbesondere Kapitel 11 darin. Eine Lösungshybridiseirung kann ebenfalls mit den durch die Erfindung bereitgestellten Polynukleotidsequenzen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Polynukleotid bereit, das aus einer Polynukleotidsequenz besteht oder diese umfaßt, die durch Durchmustern einer geeigneten Bibliothek, die das vollständige Gen für eine in SEQ ID NO:1 oder 3 dargestellt Polynukleotidsequenz enthält, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde mit der Sequenz der in SEQ ID NO:1 oder 3 dargestellten Polynukleotidsequenz oder einem Fragment davon; und Isolieren der Polynukleotidsequenz erhalten wird. Fragmente, die zum Erhalt eines solchen Polynukleotids nützlich sind, schließen z.B. Sonden und Primer ein, die an anderer Stelle hier vollständig beschrieben werden.
Wie hier an anderer Stelle in bezug auf Polynukleotidtests der Erfindung erörtert wird, können z.B. die Polynukleotide der Erfindung als eine Hybridisierungssonde für RNA, cDNA und genomische DNA verwendet werden, um cDNAs voller Länge und genomische Klone zu isolieren, die BASB117 codieren, und um cDNA und genomische Klone anderer Gene zu isolieren, die eine hohe Identität, insbesondere eine hohe Sequenzidentität, mit dem BASB117-Gen haben. Solche Sonden werden allgemein wenigstens 15 Nukleotidreste oder Basenpaare umfassen. Bevorzugt werden solche Sonden wenigstens 30 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen und können wenigstens 50 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen. Besonders bevorzugte Sonden werden wenigstens 20 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen und werden weniger als 30 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen.
Eine codierende Region eines BASB117-Gens kann durch Durchmusterung unter Verwendung einer in SEQ ID NO:1 oder 3 bereitgestellten DNA-Sequenz zur Synthese einer Oligonukleotidsonde isoliert werden. Ein markiertes Oligonukleotid mit einer Sequenz, die komplementär zu derjenigen eines Gens der Erfindung ist, wird dann zur Durchmusterung einer Bibliothek von cDNA, genomischer DNA oder mRNA verwendet um festzustellen, mit welchen Elementen der Bibliothek die Sonde hybridisiert.
Es gibt verschiedene verfügbare und den Fachleuten allgemein bekannte Verfahren, um DNAs voller Länge zu erhalten oder kurze DNAs zu verlängern, z.B. diejenigen auf Basis des Verfahrens der "Rapid Amplification of cDNA Ends" (RACE) (siehe z.B. Frohman et al., PNAS USA 85: 8998–9002, 1988). Kürzliche Modifikationen der Technik, exemplarisch dargestellt durch die Marathon^TM-Technologie (Clontech Laboratories Inc.), haben die Suche nach längeren cDNAs bedeutend vereinfacht. In der Matathon^TM-Technologie werden cDNAs aus mRNA hergestellt, die aus einem ausgewählten Gewebe extrahiert wird, und eine "Adapter"-Sequenz an jedes Ende ligiert. Dann wird eine Nukleinsäureamplifikation (PCR) durchgeführt, um das "fehlende" 5'-Ende der DNA zu amplifizieren, wobei eine Kombination aus genspezifischen und adapterspezifischen Oligonukleotidprimern verwendet wird. Die PCR-Reaktion wird dann unter Verwendung "verschachtelter" Primer wiederholt, d.h. mit Primern, die innerhalb des amplifizierten Produktes wiederverbinden (typischerweise ein adapterspezifischer Primer, der weiter 3' in der Adaptersequenz wiederverbindet, und ein genspezifischer Primer, der weiter 5' in der ausgewählten Gensequenz wiederverbindet). Die Produkte dieser Reaktion können dann durch DNA-Sequenzierung analysiert und eine DNA voller Länge entweder durch Verbinden des Produkts direkt mit der bestehenden DNA zum Erhalt einer vollständigen Sequenz oder durch Durchführung einer getrennten PCR voller Länge konstruiert werden, wobei die neue Sequenzinformation für die Konstruktion des 5'-Primers verwendet wird.
Die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung können z.B. als Forschungsreagenzien und Materialien zum Auffinden von Behandlungen und Diagnostika für Krankheiten, insbesondere Humankrankheiten, eingesetzt werden, wie es hier weiter in bezug auf Polynukleotidtests erörtert wird.
Die Polynukleotide der Erfindung, die Oligonukleotide sind, die aus einer Sequenz von SEQ ID NO:1 oder 3 stammen, können in den Verfahren wie hier beschrieben verwendet werden, aber bevorzugt für PCR, um zu bestimmen, ob die hier identifizierten Polynukleotide im ganzen oder teilweise in Bakterien in infiziertem Gewebe transkribiert werden oder nicht. Es wird erkannt, daß solche Sequenzen ebenfalls Anwendung in der Diagnose des Infektionsstadiums und Infektionstyps haben werden, das/den das Pathogen erreicht hat.
Die Erfindung stellt ebenfalls Polynukleotide bereit, die ein Polypeptid codieren, das das reife Protein plus zusätzliche amino- oder carboxylterminale Aminosäuren oder Aminosäuren innerhalb des reifen Polypeptids (z.B. wenn die reife Form mehr als eine Polypeptidkette hat) ist. Solche Sequenzen können u.a. eine Rolle in der Reifung eines Proteins von einem Vorläufer zu einer reifen Form spielen, können den Proteintransport erlauben, können die Proteinhalbwertszeit verlängern oder verkürzen oder können die Manipulation eines Proteins zum Test oder zur Produktion erleichtern. Wie es allgemein der Fall in vivo ist, können die zusätzlichen Aminosäuren durch zelluläre Enzyme vom reifen Protein entfernt werden.
Für jedes einzelne Polynukleotid der Erfindung wird ein dazu komplementäres Polynukleotid bereitgestellt. Es ist bevorzugt, daß diese komplementären Polynukleotide vollständig komplementär zu jedem Polynukleotid sind, zu dem sie komplementär sind.
Ein Vorläuferprotein, das eine reife Form des Polypeptids an eine oder mehrer Prosequenzen fusioniert aufweist, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Wenn Prosequenzen entfernt werden, werden solche inaktiven Vorläufer allgemein aktiviert. Einige oder alle der Prosequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Allgemein werden solche Vorläufer Proproteine genannt.
Zusätzlich zu den standardmäßigen Darstellungen A, G, C und T/U für Nukleotide kann der Ausdruck "N" ebenfalls in der Beschreibung bestimmter Polynukleotide der Erfindung verwendet werden. "N" bedeutet, daß jedes der vier DNA- oder RNA-Nukleotide an einer so bezeichneten Position in der DNA- oder RNA-Sequenz erscheinen kann, ausgenommen es ist bevorzugt, daß N keine Nukleinsäure ist, die bei Kombination mit benachbarten Nukleotidpositionen, beim Lesen im richtigen Leseraster, die Wirkung der Erzeugung eines vorzeitigen Terminationscodons in einem solchen Leseraster haben würde.
Zusammenfassend kann ein Polynukleotid der Erfindung ein reifes Protein, eine reifes Protein plus eine Leitsequenz (was als ein Präproptein bezeichnet werden kann), einen Vorläufer eines reifen Proteins mit einer oder mehreren Prosequenzen, die nicht Leitsequenzen eines Präproteins sind, oder ein Präpro-Protein, das ein Vorläufer eines Proproteins ist, mit einer Leitsequenz und einer oder mehreren Prosequenzen, die allgemein während der Reifungsschritte entfernt werden, die aktive und reife Formen des Polypeptids erzeugen, codieren.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung für therapeutische oder prophylaktische Zwecke bereitgestellt, insbesondere zur genetischen Immunisierung.
Die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung in der genetischen Immunisierung wird bevorzugt ein geeignetes Übertragungsverfahren einsetzen, wie die direkte Injektion von Plasmid-DNA in Muskeln (Wolff et al., Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), die Übertragung von mit spezifischen Proteinträgern komplexierter DNA (Wu et al, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), die Kopräzipitation von DNA mit Calciumphosphat (Benvenisty & Reshef, PNAS USA (1986) 83:9551), die Verkapselung von DNA in verschiedenen Formen von Liposomen (Kaneda et al., Science (1989) 243:375), Partikelbombardierung (Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) und die Infektion in vivo unter Verwendung klonierter retroviraler Vektoren (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).
Vektoren, Wirtszellen, Expressionssysteme
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vektoren, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, Wirtszellen, die gentechnisch mit Vektoren der Erfindung verändert sind, und die Produktion von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls eingesetzt werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs herzustellen, die aus den DNA-Konstrukten der Erfindung stammen.
Rekombinante Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch den Fachleuten wohlbekannte Verfahren aus gentechnisch veränderten Wirtszellen, die Expressionssysteme umfassen, hergestellt werden. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem weitere Aspekt Expressionssysteme, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die gentechnisch mit solchen Expressionssystemen verändert sind, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken.
Zur rekombinanten Herstellung der Polypeptide der Erfindung können Wirtszellen gentechnisch verändert werden, um Expressionssysteme oder Teile davon oder Polynukleotide der Erfindung aufzunehmen. Die Einführung eines Polynukleotids in die Wirtszelle kann durch Verfahren bewirkt werden, die in vielen Standardlaborbüchern beschrieben werden, wie z.B. Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986), und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), wie zum Beispiel Calciumphosphat transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Transfektion, Mikroinjektion, durch kationisches Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, "Scrape Loading", ballistische Einführung und Infektion.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte schließen bakterielle Zellen ein, wie Zellen von Streptococci, Staphylococci, Enterococci, E. coli, Streptomyces, Cyanobakterien, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis und Moraxella catarrhalis; pilzliche Zellen, wie Zellen einer Hefe, Kluveromyces, Saccharomyces, eine Basidiomycete, Candida albicans und Aspergillus; Insektenzellen, wie Zellen von Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; tierische Zellen, wie CHO-, COS-, HeLa-, C127-, 3T3-, BHK-, 293-, CV-1- und Bowes-Melanom-Zellen; und Pflanzenzellen, wie Zellen eines Nacktsamers oder Bedecktsamers.
Eine große Vielzahl von Expressionssystemen kann zur Herstellung der Polypeptide der Erfindung verwendet werden. Solche Vektoren schließen u.a. chromosomal, episomal und aus Virus abgeleitete Vektoren ein, z.B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, aus einem Bakteriophagen, aus Transposonen, aus Hefeepisomen, aus Insertionselementen, aus chromosomalen Hefeelementen, aus Viren, wie Baculoviren, Papovaviren, wie SV40, Vakzinia-Viren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabies-Viren, Picornaviren, Retroviren und Alphaviren, stammen, und Vektoren, die aus Kombinationen daraus stammen, wie diejenigen, die aus genetischen Plasmid- und Bakteriophagenelementen stammen, wie Cosmide und Phagemide. Die Expressionssystemkonstrukte können Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren sowie hervorrufen. Allgemein kann jedes System oder jeder Vektor, das/der zur Aufrechterhaltung, Vermehrung oder Expression von Polynukleotiden und/oder zur Expression eines Polypeptids in einem Wirt geeignet ist, zur Expression in dieser Hinsicht verwendet werden. Die entsprechende DNA-Sequenz kann in das Expressionssystem durch jede einer Vielzahl wohlbekannter und routinemäßiger Techniken eingefügt werden, wie z.B. durch diejenigen, die dargestellt werden in Sambrook et al, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (siehe oben).
In rekombinanten Expressionssystemen in Eukaryonten können zur Sekretion eines translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung entsprechende Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingeführt werden. Diese Signale können endogen für das Polypeptid sein, oder sie können heterologe Signale sein.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können aus rekombinanten Zellkulturen durch allgemein bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauscherchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lectinchromatographie. Am meisten bevorzugt wird die Ionenmetallaffinitätschromatographie (IMAC) zur Reinigung eingesetzt. Allgemein bekannte Techniken zum Neufalten von Proteinen können eingesetzt werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der intrazellulären Synthese, Isolierung und/oder Reinigung denaturiert wird.
Das Expressionssystem kann ebenfalls ein rekombinanter lebender Mikroorganismus sein, wie ein Virus oder Bakterium. Das interessierende Gen kann in das Genom eines lebenden rekombinanten Virus oder Bakteriums inseriert werden. Die Impfung und In-vivo-Infektion mit diesem Lebendvektor wird zu einer Expression des Antigens in vivo und Induktion von Immunreaktionen führen. Viren und Bakterien, die für diesen Zweck verwendet werden, sind z.B.: Pockenviren (z.B.: Vakzinia, Geflügelpocken, Kanarienpocken), Alphaviren (Sindbis-Virus, Semliki-Forest-Virus, Venezolanisches Pferdeenzephalitisvirus), Adenoviren, Adeno-assoziiertes Virus, Picornaviren (Poliovirus, Rhinovirus), Herpesviren (Varizella-zoster-Virus, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella und BCG. Diese Viren und Bakterien können virulent sein oder auf verschiedenen Wegen abgeschwächt sein, um Lebendimpfstoffe zu erhalten. Solche Lebendimpfstoffe bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Diagnostische, prognostische, serotypisierende und Mutationstests
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von BASB117-Polynukleotiden und -Polypeptiden der Erfindung zur Verwendung als diagnostische Reagenzien. Die Detektion von BASB117-Polynukleotiden und/oder -Polypeptiden in einem Eukaryonten, insbesondere einem Säugetier und speziell einem Menschen, wird ein diagnostisches Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, des Stadiums einer Krankheit oder der Reaktion eines infektiösen Organismus auf Wirkstoffe bereitstellen. Eukaryonten, insbesondere Säugetiere und speziell Menschen, insbesondere diejenigen, die mit einem Organismus, der das BASB117-Gen oder -Protein umfaßt, infiziert sind oder einer solchen Infektion verdächtig sind, können auf der Nukleinsäure- oder Aminosäureebene durch eine Vielzahl von wohlbekannten Techniken sowie durch die bereitgestellten Verfahren detektiert werden.
Polypeptide und Polynukleotide zur Prognose, Diagnose oder anderen Analyse können aus Körpermaterialien eines mutmaßlich infizierten und/oder infizierten Individuums erhalten werden. Polynukleotide aus jeder dieser Quellen, insbesondere DNA oder RNA, können direkt zur Detektion verwendet werden oder können enzymatisch durch Verwendung von PCR oder jeder anderen Amplifikationstechnik vor der Analyse amplifiziert werden. RNA, insbesondere mRNA, cDNA und genomische DNA können ebenfalls auf den gleichen Weisen verwendet werden. Unter Verwendung der Amplifikation kann die Charakterisierung der Art und des Stammes eines infektiösen oder residenten Organismus, der in einem Individuum vorhanden ist, durch eine Analyse des Genotype eines ausgewählten Polynukleotids des Organismus durchgeführt werden. Deletionen und Insertionen können durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich mit einem Genotyp einer Referenzsequenz detektiert werden, die aus einem verwandten Organismus ausgewählt ist, bevorzugt aus einer unterschiedlichen Art der gleichen Gattung oder eines unterschiedlichen Stammes der gleichen Art. Punktmutationen können durch Hybridisieren von amplifizierter DNA mit markierten BASB117-Polynukleotidsequenzen identifiziert werden. Perfekt oder signifikant übereinstimmende Sequenzen können von unperfekt oder signifikanter fehlübereinstimmenden Duplizes der DNase- oder RNase-Verdauung für DNA bzw. RNA unterschieden werden, oder durch Detektieren von Unterschieden in Schmelztemperaturen oder der Renaturierungskinetik. Polynukleotidsequenzunterschiede können ebenfalls durch Veränderungen der elektrophoretischen Mobilität von Polynukleotidfragmenten in Gelen im Vergleich mit einer Referenzsequenz detektiert werden. Dies kann mit oder ohne Denaturierungsmittel durchgeführt werden. Polynukleotidunterschiede können ebenfalls durch direkte DNA- oder RNA-Sequenzierung detektiert werden. Siehe z.B. Myers et al., Science 230: 1242 (1985). Sequenzveränderungen an spezifischen Positionen können ebenfalls durch Nukleaseschutztests aufgezeigt werden, wie durch RNase-, V1- und S1-Schutztests, oder durch ein chemisches Spaltverfahren. Siehe z.B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397–4401 (1985).
In einer anderen Ausführungsform kann ein Array von Oligonukleotidsonden, die BASB117-Nukleotidsequenz oder Fragmente davon umfassen, konstruiert werden, um eine effiziente Durchmusterung von z.B. genetischen Mutationen, Serumtyp, taxonomischer Klassifikation oder Identifizierung durchzuführen. Array-Technologie-Verfahren sind wohlbekannt und besitzen allgemeine Anwendbarkeit und können für eine Vielzahl von Fragen der molekularen Genetik verwendet werden, einschließlich Genexpression, genetische Verbindung und genetische Variabilität (siehe z.B. Chee et al., Science 274:610 (1996)).
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einem anderen Aspekt ein diagnostisches Kit, das folgendes umfaßt:

(a) ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 oder 3, oder ein Fragment davon;
(b) eine zu der von (a) komplementäre Nukleotidsequenz;
(c) ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt das Polypeptid von SEQ ID NO:2 oder 4, oder ein Fragment davon; oder
(d) einen Antikörper für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt für das Polypeptid von SEQ ID NO:2 oder 4.

Man wird einsehen, daß in jedem solchen Kit (a), (b), (c) oder (d) eine substantielle Komponente umfassen kann. Ein solches Kit wird unter anderem von Nutzen in der Diagnose einer Krankheit oder Anfälligkeit für eine Krankheit sein.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung als diagnostische Reagenzien. Die Detektion einer mutierten Form eines Polynukleotids der Erfindung, bevorzugt SEQ ID NO:1 oder 3, die mit einer Krankheit oder Pathogenität verbunden ist, wird ein diagnostisches Werkzeug bereitstellen, das zur Diagnose einer Krankheit, zur Prognose eines Krankheitsverlaufs, zur Bestimmung eines Krankheitsstadiums oder zur Anfälligkeit einer Krankheit beitragen oder diese definieren kann, die aus einer Unterexpression, Überexpression oder veränderten Expression des Polynukleotids resultiert. Organismenen, insbesondere infektiöse Organismenen, die Mutationen in einem solchen Polynukleotid tragen, können auf der Polynukleotidebene durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden, wie durch die hier an anderer Stelle beschriebenen.
Zellen aus einem Organismus, der Mutationen oder Polymoprhismen (allelische Variationen) in einem Polynukleotid und/oder Polypeptid der Erfindung tragen, können ebenfalls auf der Polynukleotid- oder Polypeptidebene durch eine Vielzahl von Techniken detektiert werden, um z.B. eine Serotypisierung zu erlauben. Zum Beispiel kann RT-PCR verwendet werden, um Mutationen in der RNA nachzuweisen. Es ist insbesondere bevorzugt, RT-PCR in Verbindung mit automatisierten Detektionssystemen, wie z.B. GeneScan, zu verwenden. RNA, cDNA oder genomische DNA kann ebenfalls für den gleichen Zwecke, PCR, verwendet werden. Zum Beispiel können PCR-Primer, die komple mentär zu einem Polynukleotid sind, das BASB117-Polypeptid codiert, zur Identifizierung und Analyse von Mutationen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ferner Primer bereit mit 1, 2, 3 oder 4 Nukleotiden, die vom 5'- und/oder 3'-Ende entfernt sind. Diese Primer können z.B. unter anderem zur Amplifikation von BASB117-DNA und/oder -RNA verwendet werden, die aus einer Probe isoliert ist, die aus einem Individuum stammt, wie ein Körpermaterial. Die Primer können zur Amplifikation eines Polynukleotids verwendet werden, das aus einem infizierten Individuum isoliert ist, so daß das Polynukleotid dann verschiedenen Techniken zur Aufklärung der Polynukleotidsequenz unterworfen werden kann. Auf diese Weise können Mutationen in der Polynukleotidsequenz nachgewiesen und zur Diagnose und/oder Prognose der Infektion oder ihres Stadiums oder Verlaufes oder zur Serotypisierung und/oder Klassifizierung des infektiösen Mittels verwendet werden.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, bevorzugt von bakteriellen Infektionen, besonders bevorzugt von durch Moraxella catarrhalis verursachten Infektionen, bereit, umfassend das Bestimmen eines erhöhten Expressionsgrads von Polypeptid mit einer Sequenz von SEQ ID NO:1 oder 3 aus einer aus einem Individuum stammen Probe, wie aus einem Körpermaterial. Eine erhöhte oder verringerte Expression eines BASB117-Polynukleotids kann unter Verwendung jedes der Verfahren gemessen werden, die auf diesem Gebiet zur Quantifizierung von Polynukleotiden wohlbekannt sind, wie z.B. Amplifikation, PCR, RT-PCR, RNase-Schutz, Northern Blotting, Spektrometrie und andere Hybridisierungsverfahren.
Zusätzlich kann ein diagnostischer Test gemäß der Erfindung zum Nachweis einer Überexpression von BASB117-Polypeptid im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben verwendet werden, um zum Beispiel die Gegenwart einer Infektion nachzuweisen. Testtechniken, die zur Bestimmung des Niveaus eines BASB117-Polypeptids in einer aus einem Wirt stammenden Probe, wie einem Körpermaterial, verwendet werden können, sind den Fachleuten wohlbekannt. Solche Testverfahren schließen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western Blot-Analyse, Antikörper-Sandwich-Tests, Antikörperdetektion und ELISA-Tests ein.
Die Polynukleotide der Erfindung können als Komponenten von Polynukleotidanordnungen (Arrays) verwendet werden, bevorzugt hochdichten Anordnungen oder Gittern. Diese hochdichten Anordnungen sind besonders nützlich für diagnostische und prognostische Zwecke. Zum Beispiel kann ein Satz von Punkten, die jeweils ein unterschiedliches Gen umfassen und ferner ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, zur Sondierung, wie z.B. unter Verwendung von Hybridisierung oder Nukleinsäureamplifikation, unter Verwendung einer Sonde verwendet werden, die aus einer Körperprobe erhalten wurde oder daraus stammt, um die Gegenwart einer besonderen Polynukleotidsequenz oder verwandten Sequenz in einem Individuum nachzuweisen. Eine solche Gegenwart kann die Gegenwart eines Pathogens, insbesondere Moraxella catarrhalis, anzeigen und kann nützlich in der Diagnose und/oder Prognose einer Krankheit oder eines Krankheitsverlaufs sein. Ein Gitter, das eine Anzahl von Varianten der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 oder 3 umfaßt, ist bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt ist ein Gitter, das eine Anzahl von Varianten einer Polynukleotidsequenz umfaßt, die die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO:2 codiert.
Antikörper
Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung oder Varianten davon oder Zellen, die diese exprimieren, können als Immunogene zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die immunspezifisch für solche Polypeptide bzw. Polynukleotide sind. Der Begriff "immunspezifisch" bedeutet, daß die Antikörper eine wesentlich größere Affinität für die Polypeptide der Erfindung als für andere verwandte Polypeptide im Stand der Technik haben.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Antikörper gegen BASB117-Polypeptide oder -Polynukleotide bereitgestellt.
Antikörper, die gegen die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung erzeugt werden, können durch Verabreichen der Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung oder von Epitop-tragenden Fragmenten von einem oder beiden, von Analoga von einem oder beiden oder von Zellen, die eines oder beide exprimieren, an ein nicht-menschliches Tier unter Verwendung von Routineprotokollen erhalten werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper kann jede fachbekannte Technik verwendet werden, die Antikörper liefert, die durch kontinuierliche Zellinienkulturen erzeugt werden. Beispiele schließen verschiedene Techniken ein, wie diejenigen in G. Kohler und C. Milstein, Nature 256: 495–497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., S. 77–96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss. Inc. (1985).
Techniken zur Herstellung einkettiger Antikörper (US-PS 4 946 778) können zur Herstellung einkettiger Antikörper gegen Polypeptide oder Polynukleotide dieser Erfindung angepaßt werden. Ebenfalls können transgene Mäuse oder andere nicht-menschliche Organismen oder nicht-menschliche Tiere, wie andere nicht-menschliche Säugetiere, zur Expression humanisierter Antikörper verwendet werden, die immunspezifisch für die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung sind.
Alternativ kann die Phagen-Display-Technologie verwendet werden, um Antikörpergene mit Bindungsaktivitäten für ein Polypeptid der Erfindung auszuwählen, entweder aus Sammlungen von PCR-amplifizierten v-Genen von Lymphozyten aus Menschen, die auf das Besitzen von Anti-BASB117 durchmustert wurden, oder aus naiven Bibliotheken (McCafferty et al. (1990), Nature 348, 552–554; Marks et al. (1992), Biotechnology 10, 779–783). Die Affinität dieser Antikörper kann ebenfalls durch z.B. "Chain Shuffling" verbessert werden (Clackson et al. (1991) Nature 352; 628).
Die oben beschriebenen Antikörper können eingesetzt werden, um Klone zu isolieren oder zu identifizieren, die die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung exprimieren, um die Polypeptide oder Polynukleotide durch zum Beispiel Affnitätschromatographie zu reinigen.
So können u.a. Antikörper gegen BASB117-Polypeptide oder BASB117-Polynukleotide eingesetzt werden, um Infektionen, insbesondere bakterielle Infektionen, zu behandeln.
Polypeptidvarianten schließen antigenisch, epitopisch oder immunologisch äquivalente Varianten ein und bilden einen besonderen Aspekt dieser Erfindung.
Bevorzugt wird der Antikörper oder eine Variante davon modifiziert, um ihn/sie weniger immunogen im Individuum zu machen. Falls z.B. das Individuum ein Mensch ist, kann der Antikörper am meisten bevorzugt "humanisiert" sein, wobei die Komplementaritäts-bestimmende Region oder Regionen des aus Hybridom stammenden Antikörpers in einen humanen monoklonalen Antikörper transplantiert wurden, z.B. wie beschrieben in Jones et al. (1986), Nature 321, 522–525, oder Tempest et al. (1991) Biotechnology 9, 266–273.
Antagonisten und Agonisten – Tests und Moleküle
Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können ebenfalls zur Bewertung der Bindung von kleinen Molekülsubstraten und Liganden in z.B. Zellen, zellfreien Zubereitungen, chemischen Bibliotheken und natürlichen Produktmischungen verwendet werden. Diese Substrate und Liganden können natürliche Substrat und Liganden sein oder können strukturelle oder funktionelle Mimetika sein. Siehe z.B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Kapitel 5 (1991).
Die Durchmusterungsverfahren können einfach die Bindung einer zu testenden Verbindung an das Polypeptid oder Polynukleotid oder an Zellen oder Membranen, die das Polypeptid oder Polynukleotid tragen, oder an ein Fusionsprotein des Polypeptids mittels eines Markers, der direkt oder indirekt mit der zu testenden Verbindung assoziiert ist, messen. Alternativ kann das Durchmusterungsverfahren die Konkurrenz mit einem markierten Konkurrenten beinhalten. Ferner können diese Durchmusterungsverfahren testen, ob die zu testende Verbindung zu einem Signal führt, das durch Aktivierung oder Inhibierung des Polypeptids oder Polynukleotids erzeugt wird, wobei Detektionssysteme verwendet werden, die geeignet für die Zellen sind, die das Polypeptid oder Polynukleotid umfassen. Inhibitoren der Aktivierung werden allgemein in Gegenwart eines bekannten Agonisten getestet, und die Wirkung auf die Aktivierung durch den Agonisten durch die Gegenwart der zu testenden Verbindung wird beobachtet. Konstitutiv aktives Polypeptid und/oder konstitutiv exprimierte Polypeptide und Polynukleotide können in Durchmusterungsverfahren auf inverse Agonisten oder Inhibitoren in Abwesenheit eines Agonisten oder Inhibitors eingesetzt werden, indem getestet wird, ob die zu testende Verbindung zu einer Inhibierung der Aktivierung des Polypeptids oder Polynukleotids, je nach Fall, führt. Ferner können die Durchmusterungsverfahren einfach die Schritte aus Vermischen einer zu testenden Verbindung mit einer Lösung, die ein Polypeptid oder Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthält, zur Bildung einer Mischung, Messen von BASB117-Polypeptid- und/oder -Polynukleotid-Aktivität in der Mischung und Vergleichen der BASB117-Polypeptid- und/oder -Polynukleotid-Aktivität der Mischung mit einem Standard umfassen. Fusionsproteine, wie diejenigen, die aus dem Fc-Teil und BASB117-Polypeptid hergestellt werden, wie hier zuvor beschrieben, können ebenfalls für Hochdurchsatz-Durchmusterungstests verwendet werden, um Antagonisten des Polypeptids der vorliegenden Erfindung sowie von phylogenetisch und/oder funktionell verwandten Polypeptiden zu identifizieren (siehe D. Bennett et al., J. Mol. Recognition, 8:52–58 (1995); und K. Johanson et al., J. Biol. Chem., 270(16):9459–9471 (1995)).
Die Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper, die mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden und/oder damit wechselwirken, können ebenfalls zur Konfiguration von Durchmusterungsverfahren zum Nachweisen der Wirkung von zugesetzten Verbindungen auf die Erzeugung von mRNA und/oder Polypeptid in Zellen verwendet werden. Zum Beispiel kann ein ELISA-Test zur Messung sezernierter oder Zell-assoziierter Mengen von Polypeptid unter Verwendung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern durch fachbekannte Standardverfahren konstruiert werden. Dieser kann zum Auffinden von Mitteln verwendet werden, die die Erzeugung von Polypeptid aus geeignet manipulierten Zellen oder Geweben inhibieren oder steigern können (ebenfalls als Antagonisten bzw. Agonisten bezeichnet).
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen zur Identifizierung derjenigen bereit, die die Wirkung von BASB117-Polypeptiden oder -Polynukleotiden steigern (Agonist) oder blockieren (Antagonist), insbesondere von denjenigen Verbindungen, die bakteriostatisch und/oder bakterizid sind. Das Verfahren der Durchmusterung kann Hochdurchsatztechniken beinhalten. Zum Beispiel wird zur Durchmusterung auf Agonisten oder Antagonisten eine synthetische Reaktionsmischung, ein zelluläres Kompartiment, wie eine Membran, eine Zellhülle oder Zellwand, oder eine Zubereitung aus beliebigen daraus, umfassend BASB117-Polypeptid und ein markiertes Substrat oder Ligand eines solchen Polypeptids, in Abwesenheit oder Gegenwart eines zu testenden Moleküls, das ein BASB117-Agonist oder -Antagonist sein kann, inkubiert. Die Fähigkeit des zu testenden Moleküls, mit dem BASB117-Polypeptid zusammenzuwirken oder entgegenzuwirken, wird durch eine abnehmende Bindung des markierten Liganden oder eine verringerte Erzeugung von Produkt aus einem solchen Substrat widergespiegelt. Moleküle, die grundlos binden, d.h. ohne Induzierung der Wirkungen von BASB117-Polypeptid, sind höchstwahrscheinlich gute Antagonisten. Moleküle, die gut binden und je nach Fall die Geschwindigkeit der Produkterzeugung aus Substrat erhöhen, die Signalweiterleitung erhöhen oder die chemische Kanalaktivität erhöhen, sind Agonisten. Die Detektion der Geschwindigkeit oder Menge, je nach Fall, der Produktion von Produkt aus Substrat, der Signalweiterleitung oder der chemischen Kanalaktivität kann durch Verwendung eines Reportersystems gesteigert werden. Reportersysteme, die in dieser Hinsicht nützlich sein können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf kolorimetrisches, markiertes Substrat, das zu Produkt umgewandelt wird, ein Reportergen, das empfindlich auf Veränderungen in BASB117-Polynukleotid- oder -Polypeptid-Aktivität ist, und fachbekannte Bindungstest.
Ein anderes Beispiel für einen Test auf BASB117-Agonisten ist ein kompetitiver Test, der BASB117 und einen potentiellen Agonisten mit BASB117-bindenden Molekülen, rekombinanten BASB117-bindenden Molekülen, natürlichen Substraten oder Liganden oder Substrat- oder Ligandmimetika unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Inhibierungstest vereinigt. BASB117 kann markiert werden, wie durch Radioaktivität oder eine kolorimetrische Verbindung, so daß die Anzahl von BASB117-Molekülen, die an ein Bindungsmolekül gebunden sind oder zu Produkt umgewandelt werden, genau bestimmt werden kann, um die Wirksamkeit des potentiellen Antagonisten zu bewerten.
Potentielle Antagonisten schließen u.a. kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und Antikörper ein, die an ein Polynukleotid und/oder Polypeptid der Erfindung binden und dadurch dessen Aktivität oder Expression inhibieren oder auslöschen. Potentielle Antagonisten können ebenfalls kleine organische Moleküle, ein Peptid, ein Polypeptid, wie ein eng verwandtes Protein, oder ein Antikörper sein, der/die/das die gleichen Stellen an einem bindenden Molekül bindet, wie ein bindendes Molekül, ohne BASB117-induzierte Aktivitäten zu induzieren, wodurch die Wirkung oder Expression von BASB117-Polypeptiden und/oder -Polynukleotiden verhindert wird, indem BASB117-Polypeptide und/oder -Polynukleotide von der Bindung ausgeschlossen werden.
Potentielle Antagonisten schließen ein kleines Molekül ein, das an die Bindungsstelle des Polypeptids bindet und diese besetzt, um dadurch die Bindung an zelluläre bindende Moleküle zu verhindern, so daß die normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele für kleine Moleküle schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf kleine organische Moleküle, Peptide oder peptidartige Moleküle. Andere potentielle Antagonisten schließen antisense-Moleküle ein (siehe Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991): OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION. CRC Press, Boca Raton, FL (1988), für eine Beschreibung dieser Moleküle). Bevorzugte potentionelle Antagonisten schließen Verbindungen ein, die mit BASB117 verwandt sind, und Varianten davon.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung gentechnisch veränderte lösliche Fusionsproteine, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon und verschiedene Teile der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen verschiedener Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) umfassen. Bevorzugt als Immunglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von humanem IgG, insbesondere IgG1, wobei die Fusion an der Gelenkregion erfolgt. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil einfach durch Aufnahme einer Spaltsequenz, die mit Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann, entfernt werden. Außerdem betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine durch Gentechnik und ihre Verwendung zur Wirkstoffdurchmusterung, Diagnose und Therapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren. Beispiele für die Fusionsproteintechnologie können in WO 94/29458 und WO 94/22914 gefunden werden.
Jede der hier bereitgestellten Polynukleotidsequenzen kann im Auffinden und in der Entwicklung antibakterieller Verbindungen verwendet werden. Das codierte Protein kann bei Expression als Ziel für die Durchmusterung von antibakteriellen Wirkstoffen verwendet werden. Zusätzlich können die Polynukleotidsequenzen, die die Amino-terminalen Regionen des codierten Proteins oder Shine-Delgarno- oder andere, die Translation erleichternde Sequenzen der jeweiligen mRNA codieren, zur Konstruktion von antisense-Sequenzen verwendet werden, um die Expression der interessierenden codierenden Sequenz zu kontrollieren.
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung des Polypeptids, Polynukleotids, Agonisten oder Antagonisten der Erfindung bereit, um mit der anfänglichen physikalischen Wechselwirkung zwischen einem Pathogen oder Pathogenen und einem eukaryontischen, bevorzugt Säugetier, Wirt wechselzuwirken, der für die Folgen der Infektion verantwortlich ist. Insbesondere können die Moleküle der Erfindung verwendet werden: in der Prävention der Adhäsion von Bakterien, insbesondere von Gram-positiven und/oder Gram-negativen Bakterien, an eukaryontische, bevorzugt Säugetier, extrazellulären Matrixproteine auf Verweilvorrichtungen oder an extrazellulären Matrixproteinen in Wunden; zur Blockierung der bakteriellen Adhäsion zwischen eukaryontischen, bevorzugt Säugetier, extrazellulären Matrixproteinen und bakteriellen BASB117-Proteinen, die Gewebeschädigung vermitteln; und/oder zur Blockierung des normalen Fortschreitens der Pathogenese in Infektionen, die anders als durch die Implantation von Verweilvorrichtungen oder durch andere chirurgische Techniken ausgelöst wurden.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung werden BASB117-Agonisten und -Antagonisten bereitgestellt, bevorzugt bakteriostatische oder bakterizide Agonisten und Antagonisten. Die Antagonisten und Agonisten der Erfindung können zum Beispiel zur Prävention, Inhibierung und/oder Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Mimotope des Polypeptids der Erfindung. Ein Mimotop ist eine Peptidsequenz, ausreichend ähnlich dem nativen Peptid (sequenziell oder strukturell), die durch Antikörper erkannt werden kann, die das native Peptid erkennen, oder die Antikörper hervorrufen kann, die das native Peptid erkennen, wenn es an einen geeigneten Träger gekoppelt ist.
Peptidmimotope können für einen besonderen Zweck durch Addition, Deletion oder Substitution ausgewählter Aminosäuren geschaffen werden. So können die Peptide für die Zwecke der Erleichterung der Konjugation mit einem Proteinträger modifiziert werden. Zum Beispiel kann es für einige chemische Konjugationsverfahren wünschenswert sein, ein terminales Cystein einzuschließen. Zusätzlich kann es für Peptide wünschenswert sein, die mit einem Proteinträger konjugiert sind, ein hydrophobes Ende distal vom konjugierten Ende des Peptids einzuschließen, so daß das freie unkonjugierte Ende des Peptids mit der Oberfläche des Trägerproteins assoziiert bleibt, wodurch das Peptid in einer Konformation angeboten wird, die derjenigen des Peptids am meistert ähnelt, in der es im Zusammenhang des ganzen nativen Moleküls gefunden wird. Zum Beispiel können die Peptide verändert werden, um ein N-terminales Cystein und einen C-terminalen hydrophoben amidierten Schwanz aufzuweisen. Alternativ kann die Addition oder Substitution einer D-Stereoisomerform einer oder mehrerer der Aminosäuren durchgeführt werden, um ein vorteilhaftes Derivat zu schaffen, zum Beispiel zur Steigerung der Stabilität des Peptids.
Alternativ können Peptidmimotope unter Verwendung von Antikörpern, die selbst mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung binden können, unter Verwendung von Techniken wie der Phagen-Display-Technik ( EP 0 552 267 B1 ) identifiziert werden. Diese Technik erzeugt eine große Anzahl von Peptidsequenzen, die die Struktur der nativen Peptide nachahmen und deshalb an anti-natives Peptid-Antikörper binden können, aber nicht notwendigerweise selbst eine signifikante Sequenzhomologie mit dem nativen Polypeptid teilen.
Impfstoffe
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, insbesondere einem Säugetier, bevorzugt Menschen, welches das Impfen des Individuums mit BASB117-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon umfaßt, angemessen zur Erzeugung von Antikörper und/oder T-Zell-Immunrreaktion, um das Individuum vor Infektion zu schützen, insbesondere vor bakterieller Infektion und am meisten bevorzugt vor Infektion mit Moraxella catarrhalis. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren, durch die eine solche immunologische Reaktion die bakterielle Vermehrung verlangsamt. Noch ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, das das Übertragen, an ein solches Individuum, eines Nukleinsäurevektors, einer Sequenz oder von Ribozym, um die Expression von BASB117-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon zu Expression von BASB117-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon in vivo umfaßt; um eine immunologische Reaktion zu induzieren, wie z.B. zur Erzeugung von Antikörper und/oder T-Zell-Immunreaktion, einschließlich von z.B. Cytokin erzeugenden T-Zellen oder cytotoxischen T-Zellen, um das Individuum, bevorzugt einen Menschen, vor Krankheit zu schützen, unabhängig davon, ob die Krankheit bereits im Individuum etabliert ist oder nicht. Ein Beispiel für die Verabreichung des Gens ist durch dessen Beschleunigung in die gewünschten Zellen als ein Überzug auf Partikeln oder in anderer Weise. Ein solcher Nukleinsäurevektor kann DNA, RNA, ein Ribozym, eine modifizierte Nukleinsäure, ein DNA/RNA-Hybrid, einen DNA-Protein-Komplex oder einen RNA-Protein-Komplex umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine immunologische Zusammensetzung, die bei Einführung in ein Individuum, bevorzugt einen Menschen, in dem eine immunologische Reaktion induziert werden kann, eine immunologische Reaktion in einem solchen Individuum gegen ein BASB117-Polynukleotid und/oder daraus codiertes Polypeptid induziert, worin die Zusammensetzung ein rekombinantes BASB117-Polynukleotid und/oder daraus codiertes Polypeptid umfaßt und/oder DNA und/oder RNA umfaßt, die ein Antigen des BASB117-Polynukleotids, daraus codierten Polypeptids oder eines anderen Polypeptids der Erfindung codiert und exprimiert. Die immunologische Reaktion kann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden und kann die Form von Antikörperimmunität und/oder zellulärer Immunität annehmen, wie z.B. zelluläre Immunität, die aus CTL- oder CD4+ T-Zellen entsteht.
Ein BASB117-Polypeptid oder ein Fragment davon kann mit Co-Protein oder einer chemischen Einheit fusioniert werden, das/die selbst Antikörper erzeugen kann oder nicht, aber das erste Protein stabilisieren kann und ein fusioniertes oder modifiziertes Protein erzeugen kann, das antigene und/oder immunogene Eigenschaften haben wird und bevorzugt Schutzeigenschaften. So fusioniertes rekombinantes Protein umfaßt bevorzugt ferner ein antigenes Co-Protein, wie z.B. Lipoprotein D aus Haemophilus influenzae, Glutathin-S-Transferase (GST) oder beta-Galactosidase oder jedes andere relativ große Co-Protein, das das Protein solubilisiert und seine Herstellung und Reinigung erleichtert. Außerdem kann das Co-Protein als ein Hilfsstoff in dem Sinne der Bereitstellung einer generalisierten Stimu lation des Immunsystems des Organismus wirken, der das Protein empfängt. Das Co-Protein kann entweder an das Amino- oder Carboxy-Ende des ersten Proteins gebunden werden.
In einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung kann ein BASB117-Polypeptid und/oder -Polynukleotid oder ein Fragment oder ein Mimotop oder eine Variante davon in einem Vektor vorhanden sein, wie in lebenden, rekombinanten Vektoren, die oben beschrieben wurden, z.B. lebenden bakteriellen Vektoren.
Ebenfalls geeignet sind nicht-lebende Vektoren für das BASB117-Polypeptid, z.B. bakterielle äußere Membranvesikel oder "Bläschen". Äußere Membranbläschen stammen aus der äußeren Membran der zweischichtigen Membran von Gram-negativen Bakterien und wurden in vielen Gram-negativen Bakterien dokumentiert (Zhou, L. et al. 1998, FEMS Microbiol. Lett. 163:223–228), einschließlich C. trachomatis und C. psittaci. Eine nicht-erschöpfende Liste bakterieller Pathogene, von denen berichtet wird, daß sie Bläschen erzeugen, schließt ebenfalls ein: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Escherichia coli, Haemophilus Influenza, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa und Yersinia enterocolitica.
Bläschen haben den Vorteil der Bereitstellung von äußeren Membranproteinen in ihrer nativen Konformation und sind deshalb besonders nützlich für Impfstoffe. Bläschen können ebenfalls für die Impfstoffverwendung durch Veränderung des Bakteriums verbessert werden, um die Expression eines oder mehrerer Moleküle auf der äußeren Membran zu modifizieren. So kann z.B. die Expression eine gewünschten immunogenen Proteins auf der äußeren Membran, wie das BASB117-Polypeptid, eingeführt oder aufreguliert werden (z.B. durch Veränderung des Promotors). Anstelle oder zusätzlich zur Expression von äußeren Membranmolekülen, die entweder nicht relevant (z.B. nicht-schützende Antigene oder immundominante, aber varbiable Proteine) oder nachteilig sind (z.B. toxische Moleküle wie LPS oder potentielle Induktoren einer Autoimmunreaktion), können abreguliert werden. Diese Ansätze werden nachfolgend im Detail erörtert.
Die nicht-codierenden flankierenden Regionen des BASB117-Gens enthalten regulatorische Elemente, die wichtig in der Expression des Gens sind. Diese Regulation erfolgt sowohl auf der transkriptionalen als auch translationalen Ebene. Die Sequenz dieser Regionen, entweder stromaufwärts oder stromabwärts des offenen Leserasters des Gens, kann durch DNA- Sequenzierung erhalten werden. Diese Sequenzinformation erlaubt die Bestimmung der potentiellen regulatorischen Motive, wie z.B. der unterschiedlichen Promotorelemente, Terminatorsequenzen, induzierbaren Sequenzelemente, Repressoren, Elemente, die für Phasenvariation verantwortlich sind, der Shine-Dalgarno-Sequenz, der Regionen mit potentieller Sekundärstruktur, die an der Regulation beteiligt ist, sowie anderer Typen von regulatorischen Motiven oder Sequenzen. Diese Sequenz ist ein weiterer Aspekt der Erfindung.
Diese Sequenzinformation erlaubt die Modulation der natürlichen Expression des BASB117-Gens. Die Aufregulation der Genexpression kann durch Veränderung des Promotors, der Shine-Dalgarno-Sequenz, potentieller Repressor- oder Operator-Elemente oder beliebiger anderer beteiligter Elemente erreicht werden. Gleichsam kann die Abregulation der Expression durch ähnliche Typen der Modifikation erreicht werden. Alternativ kann die Expression des Gens durch Veränderung von Phasenvariationssequenzen unter eine Phasenvariationskontrolle gestellt werden, oder sie kann von dieser Regulation entkoppelt werden. In einem anderen Ansatz kann die Expression des Gens unter die Kontrolle eines oder mehrerer induzierbarer Elemente gestellt werden, die eine regulierte Expression erlauben. Beispiele für eine solche Regulation schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die Induktion durch Temperaturverschiebung, Addition von Induktorsubstraten, wie ausgewählten Kohlehydraten oder ihren Derivaten, Spurenelementen, Vitaminen, Co-Faktoren, Metallionen, etc.
Solche Modifikationen wie oben beschrieben können durch verschiedene Mittel eingeführt werden. Die Modifikation von Sequenzen, die an der Genexpression beteiligt sind, kann in vivo durch Zufallsmutagenese gefolgt von Selektion auf dem gewünschten Phänotyp durchgeführt werden. Ein anderer Ansatz besteht aus der Isolation der interessierenden Region und Modifikation durch Zufallsmutagenese oder ortsgerichtete Austausch-, Insertions- oder Deletionsmutagenese. Die modifizierte Region kann dann in das bakterielle Genom durch homologe Rekombination wiedereingeführt werden, und die Wirkung auf die Genexpression kann bewertet werden. In einem anderen Ansatz kann das Sequenzwissen über die interessierende Region verwendet werden, um die gesamten oder einen Teil der natürlichen regulatorischen Sequenzen auszutauschen oder zu deletieren. In diesem Fall wird die betreffende regulatorische Region isoliert und modifiziert, so daß sie die regulatorischen Elemente aus einem anderen Gen, eine Kombination regulatorischer Elemente aus unterschiedlichen Genen, eine synthetische regu latorische Region oder eine beliebige andere regulatorische Region enthält, oder so daß ausgewählte Teile der regulatorischen Sequenzen vom Wildtyp deletiert sind. Diese modifizierten Sequenzen können dann in das Bakterium über homologe Rekombination in das Genom wieder eingeführt werden. Eine nicht-erschöpfende Liste von bevorzugten Promotoren, die für die Aufregulation der Genexpression verwendet werden können, schließt ein: die Promotoren porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB aus N. meningitidis oder N. gonorroheae; ompCD, copB, lbpB, ompE, UspA1; UspA2; TbpB aus M. catarrhalis; p1, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2 aus H. influenzae.
In einem Beispiel kann die Expression des Gens durch Austauschen seines Promotors gegen einen stärkeren Promotor moduliert werden (durch Isolierung der Sequenz des Gens stromaufwärts, In-vitro-Modifikation dieser Sequenz und Wiedereinführung in das Genom durch homologe Rekombination). Eine auf regulierte Expression kann sowohl im Bakterium als auch in den äußeren Membranvesikeln, die aus dem Bakterium abgestoßen (oder hergestellt) werden, erhalten werden.
In anderen Beispielen können die beschriebenen Ansätze zur Erzeugung rekombinanter bakterieller Stämme mit verbesserten Eigenschaften für Impfstoffanwendungen verwendet werden. Diese können sein, aber sind nicht beschränkt auf abgeschwächte Stämme, Stämme mit erhöhter Expression ausgewählter Antigene, Stämme mit Knock-Outs (oder verringerter Expression) von Genen, die mit der Immunreaktion wechselwirken, Stämme mit modulierter Expression von immundominanten Proteinen, Stämme mit moduliertem Ausstoßen von äußeren Membranvesikeln.
So wird durch die Erfindung ebenfalls eine modifizierte Stromaufwärts-Region des BASB117-Gens bereitgestellt, wobei die modifizierte Stromaufwärts-Region ein heterologes regulatorisches Element enthält, das die Expressionsstärke des BASB117-Proteins verändert, lokalisiert auf der äußeren Membran. Die Stromaufwärts-Region gemäß diesem Aspekt der Erfindung schließt die Sequenz stromaufwärts des BASB117-Gens ein. Die Stromaufwärts-Region beginnt unmittelbar stromaufwärts des BASB117-Gens und setzt sich gewöhnlich bis zu einer Position von nicht mehr als ca. 1000 bp stromaufwärts des Gens vom ATG-Startcodon fort. Im Falle eines Gens, das sich in einer polycistronischen Sequenz (Operon) befindet, kann die Stromaufwärts-Region unmittelbar dem interessierenden Gen vorangehend oder dem ersten Gen im Operon vorangehend beginnen. Bevorzugt enthält eine modifizierte Strom aufwärts-Region gemäß diesem Aspekt der Erfindung einen heterologen Promotor an einer Position zwischen 500 und 700 bp stromaufwärts des ATG.
So stellt die Erfindung ein BASB117-Polypeptid in einem modifizierten bakteriellen Bläschen bereit. Die Erfindung stellt ferner modifizierte Wirtszellen bereit, die die Bläschenvektoren auf nicht-lebender Membranbasis erzeugen können. Die Erfindung stellt ferner Nukleinsäurevektoren bereit, die das BASB117-Gen mit einer modifizierten Stromaufwärts-Region umfassen, die ein heterologes regulatorische Element enthält.
Ferner werden durch die Erfindung Verfahren zur Herstellung der Wirtszellen und bakteriellen Bläschen gemäß der Erfindung bereitgestellt.
Ebenfalls durch diese Erfindung bereitgestellt werden Zusammensetzungen, insbesondere Impfstoffzusammensetzungen, und Verfahren, die die Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung und immunstimulatorische DNA-Sequenzen umfassen, wie diejenigen, die beschrieben werden in Y. Sato et al., Science 273:352 (1996).
Ebenfalls bereitgestellt durch diese Erfindung werden Verfahren unter Verwendung des beschriebenen Polynukleotids oder der besonderen Fragmente davon, von denen gezeigt wurde, daß sie nicht-variable Regionen von bakteriellen Zelloberflächenproteinen codieren, in Polynukleotidkonstrukten, die in solchen genetischen Immunisierungsexperimenten in Tiermodellen der Infektion mit Moraxella catarrhalis verwendet werden. Solche Experimente werden besonders nützlich zur Identifizierung von Proteinepitopen sein, die eine prophylaktische oder therapeutische Immunreaktion hervorrufen können. Es wird angenommen, daß dieser Ansatz die anschließende Herstellung monoklonaler Antikörper von besonderem Wert erlauben wird, die aus dem erforderlichen Organ des Tieres stammen, das der Infektion erfolgreich widersteht oder diese klärt, zur Entwicklung von prophylaktischen Mitteln oder therapeutischen Behandlungen einer bakteriellen Infektion, insbesondere einer Infektion mit Moraxella catarrhalis, in Säugetieren, insbesondere Menschen.
Die Erfindung schließt ebenfalls eine Impfstofformulierung ein, die ein immunogenes rekombinantes Polypeptid und/oder Polynukleotid der Erfindung zusammen mit einem geeigneten Träger, wie einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, umfaßt. Da die Polypeptide und Polynukleotide im Magen abgebaut werden können, wird jedes bevorzugt parenteral verabreicht, zum Beispiel einschließlich Verabreichung, die subkutan, intramuskulär, intravenös oder intradermal ist. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektions lösungen ein, die Antioxidantien, Puffer, bakteriostatische Verbindungen und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch zur Körperflüssigkeit, bevorzugt zum Blut, des Individuums machen; und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel oder Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern angeboten werden, zum Beispiel versiegelten Ampullen und Fläschchen, und können in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers unmittelbar vor der Verwendung erfordert.
Die Impfstofformulierung der Erfindung kann ebenfalls Hilfsstoffsysteme zur Steigerung der Immunogenität der Formulierung einschließen. Bevorzugt erhöht das Hilfsstoffsystem vorzugsweise eine Reaktion vom TH1-Typ.
Eine Immunreaktion kann allgemein durch zwei extreme Kategorien unterschieden werden, die humorale oder zellvermittelte Immunreaktionen sind (traditionell charakterisiert durch Antikörper- bzw. zelluläre Effektormechanismen des Schutzes). Diese Kategorien der Reaktion werden als Reaktionen vom TH1-Typ (zellvermittelte Reaktion) und Immunreaktionen vom TH2-Typ (humorale Reaktion) bezeichnet.
Extreme Immunreaktionen vom TH1-Typ können durch die Erzeugung von antigenspezifischen, Haplotyp-beschränkten cytotoxischen T-Lymphozyten und natürliche Killerzell-Reaktionen gekennzeichnet sein. In Mäusen sind Reaktionen vom TH1-Typ häufig durch die Erzeugung von Antikörpern vom IgG2a-Untertyp gekennzeichnet, während diese in Menschen Antikörpern vom IgG1-Typ entsprechen. Immunreaktionen vom TH2-Typ sind durch die Erzeugung eines breiten Spektrums von Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet, die in Mäusen IgG1, IgA und IgM einschließen.
Man kann erwägen, daß die treibende Kraft hinter der Entwicklung dieser zwei Typen von Immunreaktionen Cytokine sind. Hohe Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ neigen dazu, die Induktion von zellvermittelten Immunreaktionen gegen gegebenes Antigen zu begünstigen, während hohe Mengen von Cytokinen vom TH2-Typ die Induktion humoraler Immunreaktionen gegen das Antigen begünstigen.
Die Unterscheidung von Immunreaktionen vom TH1- und TH2-Typ ist nicht absolut. In der Realität wird ein Individuum eine Immunreaktion unterstützen, die als vorherrschend TH1 oder vorherrschend TH2 beschrieben wird. Jedoch ist es häufig zweckmäßig, die Familien von Cytokinen in bezug auf diejenigen zu betrachten, die von Mosmann und Coffman in murinen CD4+ve T- Zell-Klonen beschrieben wurden (T.R. Mosmann und R.L. Coffman (1989), "TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties", Annual Review of Immunology, 7, S. 145–173).
Traditionell sind Reaktionen vom TH1-Typ mit der Produktion von INF-γ und IL-2-Cytokinen durch T-Lymphocyten assoziiert. Andere Cytokine, die häufig direkt mit der Induktion von Immunreaktionen vom TH1-Typ assoziiert sind, werden nicht durch T-Zellen erzeugt, wie z.B. IL-12. Im Gegensatz sind Reaktionen vom TH2-Typ mit der Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13 assoziiert.
Es ist bekannt, daß bestimmte Impfstoffhilfsstoffe besonders geeignet zur Stimulation von Cytokinreaktionen vom entweder TH1- oder TH2-Typ sind. Traditionell schließen die besten Indikatoren des TH1:TH2-Gleichgewichts der Immunreaktion nach einer Impfung oder Infektion die direkte Messung der Erzeugung von TH1- oder TH2-Cytokinen durch T-Lymphozyten in vitro nach Restimulation mit Antigen und/oder die Messung des IgG1:IgG2a-Verhältnisses der antigenspezifischen Antikörperreaktionen ein.
So ist ein Hilfsstoff vom TH1-Typ einer, der vorzugsweise isolierte T-Zell-Populationen stimuliert, um hohe Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ zu erzeugen, wenn mit Antigen in vitro restimuliert wird, und fördert die Entwicklung von sowohl CD8+ cytotoxischen T-Lymphozyten als auch antigenspezifischen Immunglobulinreaktionen, die mit dem Isotyp vom TH1-Typ assoziiert sind.
Hilfsstoffe, die bevorzugt die TH1-Zellreaktion stimulieren können, werden in WO 94/00153 und WO 95/17209 beschrieben.
3-Des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL) ist ein solcher Hilfsstoff. Dieses ist aus GB 2220211 (Ribi) bekannt. Chemisch ist es eine Mischung aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten und wird hergestellt von Ribi Immunochem, Montana. Eine bevorzugte Form von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A wird in EP 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA) offenbart.
Bevorzugt sind die Partikel von 3D-MPL klein genug, um durch eine 0,22 μm-Membran sterilfiltriert zu werden ( EP 0 689 454 ). 3D-MPL wird im Bereich von 10 bis 100 μg, bevorzugt 25 bis 50 μg pro Dosis vorhanden sein, wobei das Antigen typischerweise im Bereich von 2 bis 50 μg pro Dosis vorhanden sein wird.
Ein anderer bevorzugter Hilfsstoff umfaßt QS21, eine HPLC-gereinigte, nicht-toxische Fraktion, die aus der Rinde von Quillaja Saponaria Molina stammt. Optional kann dies mit 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL) vermischt werden, gegebenenfalls zusammen mit einem Träger.
Das Herstellungsverfahren für QS21 wird in US-PS 5 057 540 offenbart.
Nicht-reaktogene Hilfsstofformulierungen, die QS21 enthalten, wurden zuvor beschrieben (WO 96/33739). Es wurde gezeigt, daß solche Formulierungen, die QS21 und Cholesterin umfassen, erfolgreiche TH1-stimulierende Hilfsstoffe sind, wenn sie zusammen mit einem Antigen formuliert werden.
Weitere Hilfsstoffe, die bevorzugte Stimulatoren der TH1-Zellreaktion sind, schließen immunmodulatorische Oligonukleotide ein, z.B. unmethylierte CpG-Sequenzen, wie sie in WO 96/02555 offenbart werden.
Kombinationen aus unterschiedlichen TH1-stimulierenden Hilfsstoffen, wie aus denjenigen, die hier oben erwähnt wurden, werden ebenfalls als Bereitstellung eines Hilfsstoffs erwogen, der ein bevorzugter Stimulator der TH1-Zellreaktion ist. Zum Beispiel kann QS21 zusammen mit 3D-MPL-formuliert werden. Das Verhältnis QS21:3D-MPL wird typischerweise in der Größenordnung von 1:10 bis 10:1 sein, bevorzugt 1:5 bis 5:1 und häufig im wesentlichen 1:1. Der bevorzugte Bereich zur optimalen Synergie beträgt 2,5:1 bis 1:1 3D-MPL:QS21.
Bevorzugt ist ebenfalls ein Träger in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung vorhanden. Der Träger kann eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder ein Aluminiumsalz, wie Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid, sein.
Eine bevorzugte Öl-in-Wasser-Emulsion umfaßt ein metabolisierbares Öl, wie Squalen, alpha-Tocopherol und Tween 80. In einem besonders bevorzugten Aspekt sind die Antigene in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung mit QS21 und 3D-MPL in einer solchen Emulsion kombiniert. Zusätzlich kann die Öl-in-Wasser-Emulsion Span 85 und/oder Lecithin und/oder Tricaprylin enthalten.
Typischerweise werden QS21 und 3D-MPL zur humanen Verabreichung in einem Impfstoff im Bereich von 1–200 g, wie 10–100 μg, bevorzugt 10–50 μg pro Dosis vorhanden sein. Typischerweise wird die Öl-in-Wasser-Emulsion 2 bis 10 % Squalen, 2 bis 10 % alpha-Tocopherol und 0,3 bis 3 % Tween 80 umfassen. Bevorzugt ist das Verhältnis Squalen:alpha-Tocopherol gleich oder weniger als 1, da dies eine stabilere Emulsion liefert. Span 85 kann ebenfalls in einer Menge von 1 % vorhanden sein. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, daß die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung zusätzlich einen Stabilisator enthalten.
Nicht-toxische Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten bevorzugt ein nicht-toxisches Öl, z.B. Squalan oder Squalen, einen Emulgator, z.B. Tween 80, in einem wäßrigen Träger. Der wäßrige Träger kann z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung sein.
Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine polyvalente Impfstoffzusammensetzung bereit, die eine Impfstofformulierung der Erfindung in Kombination mit anderen Antigenen umfaßt, insbesondere mit Antigenen, die nützlich zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten und verwandten Zuständen sind. Eine solche polyvalente Impfstoffzusammensetzung kann einen TH-1-induzierenden Hilfsstoff wie hier zuvor beschrieben einschließen.
Obwohl die Erfindung in bezug auf bestimmte BASB117-Polypeptide und Polynukleotide beschrieben wurde, versteht es sich, daß dies Fragmente der natürlich vorkommenden Polypeptide und Polynukleotide und ähnliche Polypeptide und Polynukleotide mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen, die nicht substantiell die immunogenen Eigenschaften der rekombinanten Polypeptide oder Polynukleotide beeinflussen, umfaßt.
Zusammensetzungen, Kits und Verabreichung
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen, die ein BASB117-Polynukleotid und/oder einer BASB117-Polypeptid umfassen, zur Verabreichung an eine Zelle oder an einen multizellulären Organismus bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Zusammensetzungen, die ein Polynukleotid und/oder ein Polypeptid wie hier erörtert oder deren Agonisten oder Antagonisten umfassen. Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können in Kombination mit einem nicht-sterilen oder sterilen Träger oder Trägern zur Verwendung mit Zellen, Geweben oder Organismen eingesetzt werden, wie mit einem pharmazeutischen Träger, der zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist. Solche Zusammensetzungen umfassen z.B. ein Mediumadditiv oder eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten. Solche Träger können einschließen, aber sind nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen daraus. Die Formulierung sollte für den Verabreichungsmodus passen. Die Erfindung betrifft ferner diagnostische und pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind.
Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie mit therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in jeder wirksamen, zweckmäßigen Weise verabreicht werden, einschließlich z.B. Verabreichungen durch u.a. topische, orale, anale, vaginale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intranasale oder intradermale Wege.
In der Therapie als Phrophylaktikum kann das aktive Mittel an ein Individuum als eine injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, z.B. als eine sterile wäßrige Dispersion, bevorzugt isotonisch.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids, wie die lösliche Form eines Polypeptids und/oder Polynukleotids, der vorliegenden Erfindung, ein agonistisches oder antagonistisches Peptid oder eine Verbindung als kleines Molekül in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten umfassen. Solche Träger schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen daraus. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind. Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie mit therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die Zusammensetzung wird für den Weg der Verabreichung angepaßt werden, z.B. auf einem systemischen oder einem oralen Weg. Bevorzugte Formen der systemischen Verabreichung schließen die Injektion ein, typischerweise durch intravenöse Injektion. Andere Injektionswege, wie subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal, können verwendet werden. Alternative Mittel zur systemischen Verabreichung schließen die transmukosale und transdermale Verabreichung unter Verwendung von Penetrationsmitteln ein, wie Gallensalzen oder Fusidinsäuren oder anderen Detergenzien. Falls ein Polypeptid oder andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer enterischen oder verkapselten Formulierung formuliert werden können, kann zusätzlich eine orale Verabreichung ebenfalls möglich sein. Die Verabreichung dieser Verbindungen kann ebenfalls topisch und/oder lokalisiert in Form von Salben, Pasten, Gelen, Lösungen, Pulvern und dgl. erfolgen.
Zur Verabreichung an Säugetiere und insbesondere Menschen wird erwartet, daß das tägliche Dosierungsniveau des aktiven Mittels von 0,01 bis 10 mg/kg sein wird, typischerweise um 1 mg/kg. Der Arzt wird in jedem Fall die tatsächliche Dosierung bestimmen, die am geeignetsten für ein Individuum ist und mit dem Alter, Gewicht und der Reaktion des besonderen Individuums variieren wird. Die obigen Dosierungen sind exemplarisch für den Durchschnittsfachmann. Es kann selbstverständlich individuelle Fälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche angezeigt sind, und solche sind im Umfang dieser Erfindung.
Der erforderliche Dosierungsbereich hängt von der Wahl des Peptids, dem Verabreichungsweg, der Natur der Formulierung, der Natur des Zustands des Patienten und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Geeignete Dosierungen sind jedoch im Bereich von 0,1 bis 100 μg/kg Patient.
Eine Impfstoffzusammensetzung ist zweckmäßig in injizierbarer Form. Herkömmliche Hilfsstoffe können zur Steigerung der Immunreaktion eingesetzt werden. Eine geeignete Einheitsdosis zur Impfung ist 0,5–5 μg/kg von Antigen, und eine solche Dosis wird bevorzugt 1- bis 3-mal und bei einem Intervall von 1 bis 3 Wochen verabreicht. Mit dem angegebenen Dosisbereich werden keine nachteiligen toxikologischen Wirkungen mit den Verbindungen der Erfindung beobachtet werden, die ihre Verabreichung an geeignete Individuen ausschließen würden.
Weite Variationen der benötigten Dosierung werden jedoch angesichts der Vielfalt von verfügbaren Verbindungen und der unterschiedlichen Wirksamkeiten der verschiedenen Verabreichungswege erwartet. Zum Beispiel wird erwartet, daß die orale Verabreichung höhere Dosierungen als die Verabreichung durch intravenöse Injektion erfordert. Variationen in diesen Dosierungsmengen können unter Verwendung empirischer Standardroutinen zur Optimierung angepaßt werden, wie sie auf diesem Gebiet verstanden werden.
Sequenzdatenbanken, Sequenzen in einem konkreten Medium und Algorithmen
Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen bilden eine wertvolle Informationsquelle, mit der ihre 2- und 3-dimensionalen Strukturen bestimmt sowie weitere Sequenzen ähnlicher Homologie identifiziert werden können.
Diese Ansätze werden am leichtesten durch Speicherung der Sequenz in einem computerlesbaren Medium und anschließende Verwendung der gespeicherten Daten in einem bekannten makromolekularen Strukturprogramm oder zur Recherche einer Sequenzdatenbank unter Verwendung allgemein bekannter Recherchenwerkzeuge, wie z.B. das GCG-Programmpaket, erleichtert.
Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung werden Verfahren zur Analyse von Merkmalssequenzen oder Ketten, insbesondere genetischen Sequenzen oder codierten Proteinsequenzen. Bevorzugte Verfahren der Sequenzanalyse schließen z.B. Verfahren der Sequenzhomologieanalyse ein, wie die Identitäts- und Ähnlichkeitsanalyse, DNA-, RNA- und Proteinstrukturanalyse, Sequenzanordnung, kladistische Analyse, Sequenzmotivanalyse, Bestimmung des offenen Leserasters, Nukleinsäure-Basenzählung, Analyse der Codon-Verwendung, Nukleinsäure-Basenbeschneidung und sequenzierende Chromatogramm-Peakanalyse.
Ein Verfahren auf Computerbasis wird zur Durchführung der Homologieidentifikation bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte aus: Bereitstellen einer ersten Polynukleotidsequenz, die die Sequenz eines Polynukleotids der Erfindung umfaßt, in einem computerlesbaren Medium; und Vergleichen der ersten Polynukleotidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung von Homologie.
Ein Verfahren auf Computerbasis wird ebenfalls bereitgestellt zur Durchführung der Homologieidentifikation, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, aus: Bereitstellen einer ersten Polypeptidsequenz, die die Sequenz eines Polypeptids der Erfindung umfaßt, in einem computerlesbaren Medium; und Vergleichen der ersten Polypeptidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung von Homologie.
Alle Veröffentlichungen und Literaturstellen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung zitiert werden, werden hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Literaturstelle spezifisch und individuell als durch Verweis eingefügt angegeben wäre, als ob vollständig wiedergegeben. Jede Patentanmeldung, deren Priorität diese Anmeldung beansprucht, wird ebenfalls hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit in der oben für Veröffentlichungen und Literaturstellen beschriebenen Weise eingeführt.
Definitionen
"Identität", wie es fachbekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, gemäß Bestimmung durch Vergleich der Sequenzen. Auf diesem Gebiet bezeichnet "Identität" ebenfalls den Grad der Sequenzverwandtheit zwischen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, gemäß Bestimmung durch die Übereinstimmung zwischen Ketten solcher Sequenzen. "Identität" kann leicht durch bekannte Verfahren berechnet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf diejenigen, die beschrieben werden in: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. und Griffin, H.G., Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991; und Carillo, H. und Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Verfahren zur Identitätsbestimmung werden entwickelt, um die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen zu ergeben. Außerdem werden Verfahren zur Identitätsbestimmung in öffentlich zugänglichen Computerprogrammen codifiziert. Computerprogrammverfahren zur Identitätsbestimmung zwischen zwei Sequenzen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf das GAP-Programm im GCG-Programmpaket (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403–410 (1990)) und FASTA (Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444–2448 (1988)). Die BLAST-Programmfamilie ist öffentlich erhältlich von NCBI und aus anderen Quellen (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990)). Der allgemein bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenfalls zur Identitätsbestimmung verwendet werden.
Parameter für den Polypeptidsequenzvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443–453 (1970)
Vergleichsmatrix: BLOSSUM62 von Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915–10919 (1992)
"Gap Penalty" (Lückenstrafe): 8
"Gap Length Penalty" (Lückenlängenstrafe): 2
Ein für diese Parameter nützliches Programm ist öffentlich erhältlich als "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison, WI. Die zuvor genannten Parameter sind die Standardparameter für Peptidvergleiche (neben keiner "Penalty" (Strafe) für Endlücken).
Parameter für den Polynukleotidvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443–453 (1970)
Vergleichsmatrix: Übereinstimmungen = +10, Fehlübereinstimmung = 0
"Gap Penalty": 50
"Gap Length Penalty": 3
Erhältlich als: Das "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison, WI. Dieses sind die Standardparameter für Nukleinsäurevergleiche.
Eine bevorzugte Bedeutung für "Identität" für Polynukleotide und Polypeptide je nach Fall wird nachfolgend in (1) und (2) geliefert.
(1) Polynukleotidausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polynukleotid ein, das eine Polynukleotidsequenz mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100 % Identität mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 umfaßt, worin die Polynukleotidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 sein kann oder bis zu einer gewissen ganzen Zahl von Nukleotidveränderungen im Vergleich zur Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Nukleotiddeletion, -substitution, einschließlich -transition und -transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenznukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleotiden in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl der Nukleotidveränderungen bestimmt wird durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl von Nukleotidveränderungen ist, x_n die Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 ist, y 0,50 für 50 %, 0,60 für 60 %, 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 %, 0,90 für 90 %, 0,95 für 95 %, 0,97 für 97 % oder 1,00 für 100 % ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_n abgerundet wird. Veränderungen einer Polynukleotidsequenz, die das Polypeptid von SEQ ID NO:2 codiert, können Nichtsinn-, Fehlsinn- oder Rasterverschiebungsmutationen in dieser codierenden Sequenz erzeugen und dadurch das Poly peptid verändern, das durch das Polynukleotid im Anschluß an solche Veränderungen codiert wird.
Als Beispiel kann eine Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 sein, d.h. zu 100 % identisch, oder sie kann bis zu einer gewissen ganzen Zahl von Nukleinsäureveränderungen im Vergleich zur Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100 % Identität ist. Solche Veränderungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Nukleinsäuredeletion, -substitution, einschließlich -transition und -transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenzpolynukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen kann, eingestreut entweder individuell zwischen den Nukleinsäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird bestimmt durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen ist, x_n die Gesamtanzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1 ist, y z.B. 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 % etc. ist, · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_n abgerundet wird.
(2) Polypeptidausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polypeptid ein, das ein Polypeptid mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100 % Identität mit einer Polypeptidreferenzsequenz von SEQ ID NO:2 hat, worin die Polypeptidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 sein kann oder bis zu einer gewissen ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativer und nicht-konservativer Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenzpolypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten kann, eingestreut entweder individuell zwischen den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl von Aminosäureveränderungen bestimmt wird durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 ist, y 0,50 für 50 %, 0,60 für 60 %, 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 %, 0,90 für 90 %, 0,95 für 95 %, 0,97 für 97 % oder 1,00 für 100 % ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_a abgerundet wird.
Als Beispiel kann eine Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 sein, d.h. zu 100 % identisch, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich zur Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100 % Identität ist. Solche Veränderungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativer und nicht-konservativer Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenzpolypeptidsquenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen kann, eingestreut entweder individuell zwischen den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Aminosäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird bestimmt durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtanzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 ist, y z.B. 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 % etc. ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_a abgerundet wird.
"Individuum" ("Individuen"), wenn dieser Begriff hier in bezug auf einen Organismus verwendet wird, bezeichnet einen multizellulären Eukaryonten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Metazoon, ein Säugetier, einen Oviden, einen Boviden, einen Affen, einen Primaten und einen Menschen.
"Isoliert" bedeutet "mittels Menschenhand" von seinem natürlichen Zustand verändert, d.h. es wurde, falls es in der Natur auftritt, verändert oder aus seiner natürlichen Umgebung entfernt oder beides. Z.B. ist ein natürlich in einem lebenden Organismus vorhandenes Polynukleotid oder Polypeptid nicht "isoliert", aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, das aus den koexistierenden Materialien seines natürlichen Zustands abgetrennt ist, ist "isoliert", wie der Begriff hier eingesetzt wird. Außerdem ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, das in einen Organismus durch Transformation, genetische Manipulation oder durch jedes andere rekombinante Verfahren eingeführt wird, "isoliert", selbst wenn es noch in dem Organismus vorhanden ist, wobei der Organismus lebend oder nicht-lebend sein kann.
"Polynukleotid(e)" bezeichnet allgemein jedes Polyribonukleotid oder Polydesoxyribonukleotid, das unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann, einschließlich ein- und doppelsträngiger Regionen.
"Variante" bezeichnet ein Polynukleotid oder Polypeptid, das sich von einem Referenzpolynukleotid oder -polypeptid unterscheidet, aber die wesentlichen Eigenschaften beibehält. Eine typische Variante eines Polynukleotids unterscheidet sich in der Nukleotidsequenz von einem anderen Referenzpolynukleotid. Veränderungen in der Nukleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch das Referenzpolynukleotid codiert wird, verändern oder nicht. Nukleotidveränderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, -additonen, -deletionen, -fusionen und -trunkierungen im Polypeptid führen, das durch die Referenzsequenz codiert wird, wie nachfolgend erörtert. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen Referenzpolypeptid. Allgemein sind Unterschiede so beschränkt, daß die Sequenzen des Referenzpolypeptids und der Variante sehr nahe insgesamt und in vielen Regionen identisch sind. Eine Variante und ein Referenzpolypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen oder Deletionen in jeder Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder inserierter Aminosäurerest kann ein solcher sein, der durch den genetischen Code codiert wird, oder nicht. Eine Variante eines Polynukleotids oder Polypeptids kann eine natürlich auftretende sein, wie z.B. eine allelische Variante, oder sie kann eine Variante sein, die nicht als natürlich auftretend bekannt ist. Nicht-natürlich auftretende Varianten von Polynukleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenesetechniken oder durch direkte Synthese hergestellt werden.
"Krankheit(en)" bezeichnet jede Krankheit, die durch Infektion mit einem Bakterium verursacht wird oder darauf bezogen ist, einschließlich z.B. Mittelohrentzündung bei Säuglingen und Kindern, Lungenentzündung bei älteren Menschen, Sinusitis, Nosokomialinfektionen und Invasionskrankheiten, chronische Mittelohrentzündung mit Gehörverlust, Flüssigkeitsansammlung im Mittelohr, Hörnervschädigung, verzögerte Spracherlernung, Infektion der oberen Atemwege und Entzündung des Mittelohrs.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die den Fachleuten allgemein bekannt und für sie Routine sind, außer wenn dies im Detail anders beschrieben wird. Die Beispiele sind zur Veranschaulichung, aber beschränken nicht die Erfindung.
Beispiel 1: DNA-Sequenzierung des BASB117-Gens aus Moraxella catarrhalis Stamm ATCC 43617.
A: BASB117 in Moraxella catarrhalis-Stamm
Das BASB117-Gen von SEQ ID NO:1 ist aus Moraxella catarrhalis Stamm ATCC 43617. Die Translation der BASB117-Polynukleotidsequenz ist in SEQ ID NO:2 gezeigt.
B: BASB117 in Moraxella catarrhalis Stamm 43617
Die Sequenz des BASB117-Gens wurde in Moraxella catarrhalis Stamm ATCC 43617 bestätigt. Zu diesem Zweck wurde Plasmid-DNA (siehe Beispiel 2A), die die Genregion enthält, die das reife BASB117 aus Moraxella catarrhalis Stamm ATCC 43617 codiert, als PCR-Matrize verwendet. Dieses Material wurde dann der Polymerase Kettenreaktion-DNA-Amplifikation unter Verwendung der Primer pTLZ F 5' TGA CAA TTA ATC ATC GGC TCG-3' [SEQ ID NO:5] und revers pTLZ RV.2 5' GGC TGA AAA TCT TCT CTC ATC C-3' [SEQ ID NO:6] unterworfen. Das PCR-Amplikon wurde der DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Big Dyes-Kit (Applied Biosystems) unterworfen und an einem ABI 373/A DNA-Sequenzer unter den vom Hersteller beschriebenen Bedingungen analysiert. Als Ergebnis wurden die als SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 bezeichneten Polynukleotid- und abgeleiteten Polypeptidsequenzen erhalten. Diese Sequenzen umfassen nicht die Signalsequenz, da die Signalsequenz aus dem Plasmid stammte.
Unter Verwendung des MegAlign-Programms aus dem DNASTAR-Software-Paket wurde eine Angleichung der Polynukleotidsequenzen von SEQ ID NO:1 und 3 durchgeführt und wird in 1 dargestellt; ein paarweiser Vergleich der Identitäten zeigt, daß die zwei BASB117-Polynukleotid-Gensequenzen 100 % identisch in der Region sind, die für das reife Protein codiert. Unter Verwendung des MagAlign-Programms wurde eine Angleichung der Polypeptidsequenzen von SEQ ID NO:2 und 9 durchgeführt und wird in 2 dargestellt; ein paarweiser Vergleich der Identitäten zeigt, daß die BASB117-Proteinsequenzen 100 % identisch in der Region des reifen Proteins sind.
Beispiel 2: Konstruktion von Plasmid zur Expression von rekombinnantem BASB117
A: Klonierung von BASB117
Die EcoRI- und SalI-Restriktionsstellen, eingefügt in die Amplifikationsprimer vorwärts MC-Lip9-Fn/t-RI (5'-AGG CAG AGG GAA TTC ATG TTC AAT GAA TAT TAT CGG TG-3') [SEQ ID NO:7] bzw. rückwärts MC-Lip9RCh/t-Sal (5'-AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG TTG CTT ATG AAT AAA ATG AAT GTT TAC-3') [SEQ ID NO:8], erlaubte das direktionale Klonieren eines PCR-Produkts in das E. coli-Expressionsplasmid pTLZ2, so daß ein reifes BASB117-Protein als ein Fusionsprotein exprimiert werden konnte, das ein (His)6-Affinitätschromatographie-Tag am C-Terminus enthielt. Das BASB117-PCR-Produkt wurde aus der Amplifikationsreaktion unter Verwendung von Spin-Säulen auf Kieselgelbasis (QiaGen) gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt. Zur Herstellung der erforderlichen EcoRI- und SalI-Termini, die notwendig für die Klonierung sind, wurde gereinigtes PCR-Produkt sequenziell vollständig mit EcoRI- und SalI-Restriktionsenzymen gemäß Empfehlung vom Hersteller (Life Technologies) verdaut. Im Anschluß an die erste Restriktionsverdauung wurde das PCR-Produkt über eine Spin-Säule wie oben gereinigt, um Salze zu entfernen, und in sterilem Wasser vor der zweiten Enzymverdauung eluiert. Das verdaute DNA-Fragment wurde erneut unter Verwendung von Spin-Säulen auf Kieselgelbasis vor der Ligation mit dem pTLZ2-Plasmid gereinigt.
B: Herstellung von Expressionsvektor
Zur Herstellung des Expressionsplasmids pTLZ2 zu Ligation wurde es ähnlich vollständig mit sowohl EcoRI als auch SalI verdaut und dann mit Kälberdarmphosphatase (CIP, ca. 0,02 Einheiten/pmol von 5'-Ende, Life Technologies) gemäß Herstelleranweisung behandelt, um eine Selbstligation zu verhindern. Ein etwa 5-fach molarer Überschuß des verdauten Fragments zum hergestellten Vektor wurde verwendet, um die Ligationsreaktion zu programmieren. Eine standardmäßige ca. 20 μl Ligationsreaktion (ca. 10°C, ca. 16 Stunden) unter Verwendung von fachbekannten Verfahren wurde unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (ca. 2,0 Einheiten/Reaktion, Life Technologies) durchgeführt. Eine Teilmenge der Ligation (ca. 5 μl) wurde zur Transformation von elektrokompetenten JM109-Zellen gemäß allgemein fachbekannten Verfahren verwendet. Im Anschluß an einen ca. 2- bis 3-stündiges Auswuchszeitraum bei 37°C in ca. 1,0 ml LB-Bouillon wurden transformierte Zellen auf LB-Agarplatten ausplattiert, die Ampicillin (100 μg/ml) enthielten. Antibiotikum wurde in der Selektion eingeschlossen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C für ca. 16 Stunden inkubiert. Individuelle ApR-Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern gepickt und verwendet, um frische LB-Apr-Platten sowie eine ca. 1,0 ml LB ApR-Bouillonkultur zu "patchen". Sowohl die Patch-Platten als auch die Bouillonkultur wurden über Nacht bei 37°C entweder in einem Standardinkubator (Platten) oder einem Schüttelwasserbad inkubiert. Eine PCR-Analyse auf Vollzellbasis wurde zur Verifizierung eingesetzt, daß die Transformanten das BASB117-DNA-Insert enthielten. Hier wurden die ca. 1,0 ml der Übernacht-LB Ap-Bouillonkultur in ein 1,5 ml-Polypropylenröhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugieren in einer Beckmann-Mikrozentrifuge (ca. 3 min, Raumtemperatur, ca. 12 000 g) aufgefangen. Das Zellpellet wurde in ca. 200 μl sterilem Wasser suspendiert und eine ca. 10 μl Teilmenge zur Programmierung einer PCR-Reaktion mit ca. 50 μl Endvolumen verwendet, die sowohl die vorwärts als auch rückwärts BASB117-Amplifikationsprimer enthielt. Endkonzentrationen der PCR-Reaktionskomponenten waren im wesentlichen die gleichen wie die in Beispiel 2 angegebenen, außer daß ca. 5,0 Einheiten Taq-Polymerase verwendet wurden. Der anfängliche Denaturierungsschritt bei 95°C wurde auf 3 Minuten verlängert, um das thermische Auseinanderbrechen der bakteriellen Zellen und die Freisetzung von Plasmid-DNA sicherzustellen. Eine ABI-Thermokreislaufvorrichtung Modell 9700 und ein dreistufiges thermisches Amplifikationsprofil mit 32 Umläufen, d.h. 95°C, 45 s; 55–58°C, 45 s; 72°C, 1 min, wurden zur Amplifikation des BASB117-Fragments aus den lysierten Transformantenproben verwendet. Im Anschluß an die thermische Amplifikation wurde eine Teilmenge von ca. 20 μl der Reaktion durch Agarose-Gelelektrophorese (0,8 % Agarose in einem Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Puffer) analysiert. DNA-Fragmente wurden durch UV-Beleuchtung nach Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärbung visualisiert. Ein DNA-Molekülgrößenstandard (1 Kb-Stufe, Life Technologies) wurde parallel mit den Testproben elektrophoretisch behandelt und wurde verwendet, um die Größe der PCR-Produkte abzuschätzen. Transformanten, die das PCR-Produkt der erwarteten Größe erzeugten, wurden als Stämme identifiziert, die ein BASB117-Expressionsprodukt enthielten. Expressionsplasmid enthaltende Stämme wurde dann auf die induzierbare Expression von rekombinantem BASB117 analysiert.
C: Expressionsanalyse von PCR-positiven Transformanten
Für jede oben identifizierte PCR-positive Transformante wurden ca. 5,0 ml LB-Bouillon, die Ampicillin (100 μg/ml) enthielt, mit Zellen aus der "Patch"-Platte geimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln (ca. 250 U/min) gezüchtet. Eine Teilmenge der Übernacht-Impfkultur (ca. 1,0 ml) wurde in einen 125 ml-Erlenmeyer-Kolben übergeimpft, der ca. 25 ml LB Ap-Bouillon enthielt, und bei 37°C unter Schütteln (ca. 250 U/min) gezüchtet, bis die Kulturtrübung ein O.D. 600 von ca. 0,5 erreichte, d.h. eine mittlere Log-Phase (gewöhnlich ca. 1,5–2,0 Stunden). Zu diesem Zeitpunkt wurde ca. die Hälfte der Kultur (ca. 12,5 ml) in einen zweiten 125 ml-Kolben überführt und die Expression von rekombinantem BASB117-Protein durch Zugabe von IPTG (1,0 M Vorrat, hergestellt in sterilem Wasser, Sigma) auf eine Endkonzentration von 1,0 mM induziert. Die Inkubation sowohl der IPTG-induzierten als auch der nicht-induzierten Kulturen wurde für weitere ca. 4 Stunden bei 37°C unter Schütteln fortgesetzt. Proben (ca. 1,0 ml) von sowohl induzierten als auch nicht-induzierten Kulturen wurden nach dem Induktionszeitraum entfernt und die Zellen durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für ca. 3 Minuten aufgefangen. Individuelle Zellpellets wurden in ca. 50 μl sterilem Wasser suspendiert, dann mit einem gleichen Volumen von 2X Laemelli-SDS-PAGE-Probenpuffer vermischt, der 2-Mercaptoethanol enthielt, und in ein siedendes Wasserbad für ca. 3 min zur Denaturierung des Proteins gestellt. Gleiche Volumina (ca. 15 μl) sowohl der rohen IPTG-induzierten als auch der nicht-induzierten Zelllysate wurden auf 2-faches 12 % Tris/Glycin-Polyacrylamidgel (1 mm dicke Minigels, Novex) geladen. Die induzierten und nicht-induzierten Lysatproben wurden zusammen mit vorangefärbten Molekulargewichtsmarkern (SeeBlue, Novex) unter herkömmlichen Bedingungen unter Verwendung eines Standard-SDS-Tris/Glycin-Laufpuffers (BioRad) elektrophoretisch behandelt. Im Anschluß an die Elektrophorese wurde ein Gel mit Comassie-Brilliant-Blue R250 (BioRad) angefärbt und dann zur Visualisierung neuer BASB117-IPTG-induzierbarer Proteine entfärbt. Das zweite Gel wurde auf eine PVDF-Membran (0,45 μm Porengröße, Novex) für ca. 2 h bei 4°C unter Verwendung einer BioRad Mini-Protean II-Blotting-Vorrichtung und Towbin-Methanol (2 %) Transferpuffer elektrogeblottet. Das Blockieren der Membran und die Antikörperinkubationen wurden gemäß allgemein fachbekannten Verfahren durchgeführt. Ein monoklonaler Anti-RGS(His)3-Antikörper, gefolgt von einem zweiten Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper, konjugiert mit HRP (QiaGen), wurde verwendet, um die Expression und Identität des rekombinanten BASB117-Proteins zu bestätigen. Visualisierung des Anti-His-Antikörper-reaktiven Musters wurde erreicht unter Verwendung entweder eines ABT-unlöslichen Substrats oder unter Verwendung von Hyperfilm mit dem Amersham ECL-Chemilumineszenzsystem.
Beispiel 3: Herstellung von rekombinantem BASB117
Bakterienstamm
Ein rekombinanter Expressionsstamm von E. coli JM109, der ein Plasmid (pTLZ2) enthielt, das BASB117 aus M. catarrhalis codiert, wurde zur Herstellung von Zellmasse zur Reinigung von rekombinantem Protein verwendet. Der Expressionsstamm wurde auf LB-Agarplatten kultiviert, die 100 μg/ml Ampicillin ("Ap") enthielten, um sicherzustellen, daß das pTLZ2 aufrechterhalten wurde. Zur Gefrierkonservierung bei –80°C wurde der Stamm in LB-Bouillon vermehrt, die die gleiche Konzentration von Antibiotika enthielt, und dann mit einem gleichen Volumen von LB-Bouillon vermischt, die 30 % (G/V) Glycerin enthielt.
Medien
Das zur Herstellung von rekombinantem Protein verwendete Fermentationsmedium bestand aus 2X YT-Bouillon (Difco), die 100 μg/ml Ap enthielt. Antischaummittel wurde zum Medium für den Fermenter mit 0,25 ml/l hinzugegeben (Antifoam 204, Sigma). Zur Induzierung der Expression des rekombinanten BASB117-Proteins wurde IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zum Fermenter gegeben (1 mM Endkonzentration).
Fermentation
Ein 500 ml-Erlenmeyer-Impfkolben, der 50 ml Arbeitsvolumen enthielt, wurde mit 0,3 ml von schnell aufgetauter, tiefgefrorener Kultur oder mehreren Kolonien aus einer selektiven Agarplattenkultur geimpft und für ca. 12 Stunden bei 37 ± 1°C auf einem Schütteltisch mit 150 U/min (Innova 2100, New Brunswick Scientific) inkubiert. Diese Impfkultur wurde dann verwendet, um einen Fermenter mit 5 1 Arbeitsvolumen zu impfen, der 2X YT-Bouillon und beide Ap-Antibiotika enthielt. Der Fermenter (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) wurde bei 37 ± 1°C, 0,2–0,4 WM Luftvolumen und 250 U/min mit Rushton-Flügelrädern betrieben. Der pH wurde weder in der Kolbenkultur noch im Fermenter kontrolliert. Während der Fermentation war der pH im Bereich von 6,5 bis 7,3 im Fermenter. IPTG (1,0 M Vorrat, hergestellt in sterilem Wasser) wurde zum Fermenter hinzugegeben, als die Kultur das Wachstum der mittleren logarithmischen Phase erreichte (ca. 0,7 Einheiten bei O.D. 600). Die Zellen wurden für 2–4 Stunden induziert und dann durch Zentrifugieren geerntet, wobei entweder ein 28RS-Heaeus (Sepatech) oder eine RCSC-Superspeed-Zentrifuge (Sorvall Instruments) verwendet wurde. Zellpaste wurde bei –20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
Beispiel 4: Reinigung von rekombinantem BASB117 aus E. coli
Extraktion – Reinigung
Zellpaste aus IPTG-induzierter Kultur wird in 60 ml Phosphatpuffer pH 7,5 resuspendiert, der 1 mM AEBSF und 1 mM Aprotinin als Proteaseinhibitoren enthält. Zellen werden in einem Zellaufbrecher lysiert, zentrifugiert, gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Pellet wird in 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, der 6M Guanidiniumchlorid enthält (Puffer A), suspendiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Der gesamte Extrakt wird mit 27 000 g für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Ni-NTA-Superflow-Harz, äquilibriert in Puffer A, inkubiert. Das Harz wird zweimal mit 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 6,3, der 8 M Harnstoff enthält (Puffer B), gewaschen. Die Elution wurde sukzessive mit Puffer B, eingestellt auf pH 5,9 und dann pH 4,5, durchgeführt. Fraktionen, die BASB121-Antigen enthalten, werden mit 25 Vol.-% 0,2M Phosphatpuffer, pH 7,5 neutralisiert. Vereinigte Fraktionen werden sukzessive gegen 100 mM NaH₂PO₄, das 8M Harnstoff enthält, dann 4M Harnstoff, dann 2M Harnstoff und schließlich gegen PBS, pH 7,4, das 0,1 % Triton X-100 enthält, dialysiert.
Gereinigtes BASB117-Antigen wird unter Verwendung von Micro BCA-Testreagens quantifiziert.
Beispiel 5: Herstellung von Antiseren gegen rekombinantes BASB117
Gegen das BASB117-Protein gerichtete polyvalente Antiseren werden durch Impfung von Kaninchen mit dem gereinigten rekombinanten BASB117-Protein erzeugt. Den Tieren wird Blut entnommen vor der ersten Immunisierung ("Vorblutung") und nach der letzten Immunisierung.
Anti-BASB117-Protein-Titer werden durch ein ELISA unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem BASB117-Protein gemessen. Der Titer wird als Mittelpunkttiter definiert, berechnet durch ein logistisches Modell mit 4 Parametern unter Verwendung der XL-Fit-Software.
Die Antiseren werden ebenfalls als erste Antikörper verwendet, um das Protein in einem Western Blot wie im nachfolgenden Beispiel 7 beschrieben zu identifizieren. Der Western Blot wird verwendet, um die Gegenwart von Anti-BASB117-Antikörper in den Seren von immunisierten Tieren zu zeigen.
Beispiel 6: Immunologische Charakterisierung: Oberflächenkontakt von BASB117
Anti-BASB117-Proteintiter werden durch ein ELISA unter Verwendung von Formalin-getöteten Vollzellen von Moraxella catarrhalis bestimmt. Der Titer wird als Mittelpunkttiter definiert, berechnet durch ein logistisches Modell mit 4 Parametern unter Verwendung der XL-Fit-Software.
Der bei Kaninchen- oder Maus-Immunseren beobachtete Titer zeigt, daß das BASB117-Protein auf der Oberfläche von M. catarrhalis-Zellen vorhanden ist.
Beispiel 7: Immunologische Charakterisierung: Western Blot-Analyse
Mehrere Stämme von M. catarrhalis, einschließlich ATCC 43617, sowie klinische Isolate aus verschiedenen geographischen Regionen werden auf Muller-Hinton-Agarplatten für 24 Stunden bei 36°C gezüchtet. Mehrere Kolonien werden zum Impfen von Bouillon verwendet. Die Kulturen werden gezüchtet, bis der A620-Wert ca. 0,6 beträgt, und die Zellen werden durch Zentrifugieren aufgefangen. Die Zellen werden dann aufkonzentriert und in PAGE-Probenpuffer solubilisiert. Die solubilisierten Zellen werden dann auf 4–20 % Polyacrylamidgelen aufgetrennt und die getrennten Proteine elektrophoretisch auf PVDF-Membranen überführt. Die PVDF-Membranen werden dann mit Sättigungspuffer vorbehandelt. Alle anschließenden Inkubationen werden unter Verwendung dieses Vorbehandlungspuffers durchgeführt.
PVDF-Membranen werden mit Vorimmunserum oder Kaninchen- oder Maus-Immunseren inkubiert. PVDF-Membranen werden dann gewaschen. PVDF-Membranen werden mit Biotin-markiertem Schaf-Anti-Kaninchen- oder -Maus-Ig inkubiert. PVDF-Membranen werden 3-mal mit Waschpuffer gewaschen und mit Streptavidinperoxydase inkubiert. PVDF-Membranen werden dann 3-mal mit dem Waschpuffer gewaschen und mit 4-Chlor-1-naphthol entwickelt.
Die Detektion eines Proteins, das dem für BASB117 erwarteten Molekulargewicht entspricht und reaktiv gegenüber den Antiseren ist, wird verwendet um zu zeigen, daß dieses Produkt durch alle untersuchten Moraxella-Stämme erzeugt wird und darin konserviert ist.
Beispiel 8: Immunologische Charakterisierung: Bakterizide Aktivität
Die Komplement-vermittelte cytotoxische Aktivität von Anti-BASB117-Antikörpern wird untersucht, um das Impfstoffpotential von BASB117-Protein- Antiserum zu bestimmen, das wie oben beschrieben hergestellt wird. Die Aktivitäten des Präimmunserums und des Anti-BASB117-Antiserums in der Vermittlung der Komplement-Abtötung von M. catarrhalis werden untersucht.
Stämme von M. catarrhalis werden auf Platten gezüchtet. Mehrere Kolonien werden zu flüssigem Medium gegeben. Die Kulturen werden gezüchtet und aufgefangen, bis der A620-Wert ca. 0,4 beträgt. Nach einem Waschschritt wird das Pellet suspendiert und verdünnt.
Präimmunseren und die Anti-BASB117-Seren werden in der ersten Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen abgeschieden, und Reihenverdünnungen werden in den anderen Vertiefungen der gleichen Zeile abgeschieden. Lebendes verdünntes M. catarrhalis wird anschließend hinzugegeben, und die Mischung wird inkubiert. Komplement wird zu jeder Vertiefung mit einer Arbeitsverdünnung hinzugegeben, die zuvor in einem Toxizitätstest definiert wurde. Jeder Test schließt eine Komplement-Kontrolle (Vertiefungen ohne Serum, die aktive oder inaktivierte Komplementquelle enthalten), eine Positivkontrolle (Vertiefungen, die Serum mit einem bekannten Titer von bakteriziden Antikörpern enthalten), eine Kulturkontrolle (Vertiefungen ohne Serum und Komplememt) und eine Serumkontrolle (Vertiefungen ohne Komplement) ein.
Bakterizide Aktivität von Kaninchen- oder Maus-Antiserum (50 % Abtötung von homologem Stamm) wird gemessen.
Beispiel 9: Gegenwart von Antikörper gegen BASB117 in humanen konvaleszenten Seren
Eine Western Blot-Analyse von gereinigtem rekombinantem BASB117 wird wie oben in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, außer daß ein Reservoir von humanen Seren aus Kindern, die mit M. catarrhalis infiziert sind, als erste Antikörperzubereitung verwendet wird. Diese wird verwendet um zu zeigen, daß Antiseren aus natürlich infizierten Individuen auf das gereinigte rekombinante Protein reagieren.
Beispiel 10: Wirksamkeit von BASB117-Impfstoff: Steigerung der Lungen-Clearance von M. catarrhalis in Mäusen.
Dieses Mäusemodell beruht auf der Analyse der Lungeninvasion durch M. catarrhalis mit Anschluß an eine intranasale Standardexposition von geimpften Mäusen.
Gruppen von Mäusen werden mit BASB117-Impfstoff immunisiert. Nach der Auffrischung werden die Mäuse durch Einträufeln von bakterieller Suspension in die Nasenlöcher unter Anästhesie herausgefordert. Die Mäuse werden zwischen 30 Minuten und 24 Stunden nach der Exposition getötet, und die Lungen werden aseptisch entfernt und individuell homogenisiert. Der Log 10-gewichtete Mittelwert von KBE/Lunge wird durch Zählen der Kolonien bestimmt, die auf Agarplatten nach dem Ausplattieren von Verdünnungen des Homogenats gezüchtet wurden. Der arithmetische Mittelwert des Log 10-gewichteten Mittelwerts von KBE/Lunge und die Standardabweichungen werden für jede Gruppe berechnet. Die Ergebnisse werden statistisch analysiert.
In diesem Experiment werden Gruppen von Mäusen entweder mit BASB117 oder mit einer abgetöteten Vollzell-(kwc)-Zugabe von M. catarrhalis immunisiert oder zum Schein immunisiert.
Dies wird verwendet um zu zeigen, daß die kwc-Zubereitung und der BASB117-Impfstoff eine signifikante Lungen-Clearance im Vergleich mit der Kontrollgruppe induzieren.
Beispiel 11: Inhibierung der M. catarrhalis-Adhäsion an Zellen durch Anti-BASB117-Antiserum
Dieser Test mißt die Fähigkeit von Anti-BASB117-Seren zur Inhibierung der Adhäsion von Moraxella-Bakterien ein Epithelzellen. Diese Aktivität könnte die Kolonisierung z.B. des Nasenrachens durch Moraxella verhindern.
Ein Volumen von Bakterien wird auf Eis mit 1 Volumen von Präimmun- oder Anti-BASB117-Immunserum-Verdünnung inkubiert. Diese Mischung wird anschließend zu Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben, die eine konfluente Zellkultur enthält, die einmal mit Kulturmedium gewaschen wird, um Spuren von Antibiotika zu entfernen. Die Platte wird zentrifugiert und inkubiert. Jede Vertiefung wird dann vorsichtig gewaschen. Nach der letzten Waschung wird Natriumglycocholat zu den Vertiefungen hinzugegeben. Nach der Inkubation wird die Zellschicht abgeschabt und homogenisiert. Verdünnungen des Homogenats werden auf Agarplatten ausplattiert und inkubiert. Die Anzahl von Kolonien auf jeder Platte wird gezählt und die Anzahl von jeder Vertiefung von Bakterien berechnet. Dies wird verwendet um zu zeigen, daß mit Anti-BASB117-Antiserum inkubierte Bakterien in ihrer Anhaftfähigkeit zu Hep-2-Zellen gehemmt sind.
Hinterlegte Materialien
Eine Hinterlegung, die einen Moraxella catarrhalis Catlin-Stamm enthält, wurde bei der American Type Culture Collection (nachfolgend "ATCC") am 21. Juni 1997 hinterlegt und der Hinterlegungs-Nr. 43617 zugewiesen. Die Hinterlegung wurde als Branhamella catarrhalis (Frosch und Kolle) beschrieben und ist eine gefriergetrocknete 1,5–2,9 kb Insert-Bibliothek, konstruiert aus M. catarrhalis-Isolat, erhalten aus einem transtrachealen Aspirat eines Kohlengrubenarbeiters mit chronischer Bronchitis. Die Hinterlegung wird in Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506–508 (1982) beschrieben.
Die Hinterlegung des Moraxella catarrhalis-Stammes wird hier als "der hinterlegte Stamm" oder als "die DNA des hinterlegten Stammes" bezeichnet. Der hinterlegte Stamm enthält ein BASB117-Gen voller Länge.
Eine Hinterlegung des Vektors pMC-D15, der aus Moraxella catarrhalis-DNA besteht, inseriert in pQE30, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 12. Februar 1999 hinterlegt und der Hinterlegungs-Nr. 207105 zugewiesen.
Die Sequenz der im hinterlegten Stamm/Klon enthaltenen Polynukleotide sowie die Aminosäuresequenz jedes dadurch codierten Polypeptids sind bestimmend im Fall eines Konflikts mit jeder hier vorliegenden Beschreibung von Sequenzen.
Die Hinterlegung der hinterlegten Stämme wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vorgenommen. Die hinterlegten Stämme werden unwiderruflich und ohne Beschränkung oder Bedingung für die Öffentlichkeit bei Patenterteilung freigegeben. Die hinterlegten Stämme werden bloß als Erleichterung für die Fachleute bereitgestellt und sind kein Zugeständnis, daß eine Hinterlegung für die Ausführbarkeit erforderlich ist, wie dies gemäß 35 U.S.C. §112 erforderlich ist.
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 aufweist.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz wenigstens 95 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 aufweist.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 umfaßt.
Isoliertes Polypeptid, das aus SEQ ID NO:2 besteht.
Immunogenes Fragment des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fragment (falls erforderlich bei Kupplung an einen Träger) eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO:2 erkennt.
Polypeptid oder immunogenes Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Polypeptid oder das immunogene Fragment Teil eines größeren Fusionsproteins ist.
Isoliertes Polynukleotid, das ein Polypeptid oder ein immunogenes Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 aufweist; oder eine zu dem isolierten Polynukleotid komplementäre Nukleotidsequenz.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid von SEQ ID NO:2 codiert, über die gesamte codierende Region aufweist; oder eine zu dem isolierten Polynukleotid komplementäre Nukleotidsequenz.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:1 oder 3 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:1 bzw. 3 aufweist; oder eine zu dem isolierten Polynukleotid komplementäre Nukleotidsequenz.
Isoliertes Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, worin die Identität wenigstens 95 % mit SEQ ID NO:1 oder 3 ist.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid von SEQ ID NO:2 oder das immunogene Fragment von Anspruch 5 oder 6 codiert.
Isoliertes Polynukleotid, das das Polynukleotid von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 umfaßt.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 12, erhältlich durch Durchmustern einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde mit der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:3 oder einem Fragment davon.
Expressionsvektor oder rekombinanter lebender Mikroorganismus, der ein isoliertes Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14 umfaßt.
Wirtszelle, die den Expressionsvektor gemäß Anspruch 15 umfaßt.
Membran oder subzelluläre Fraktion der Wirtszelle gemäß Anspruch 16, worin die Membran oder subzelluläre Fraktion ein isoliertes Polypeptid umfaßt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines immunogenen Fragments gemäß Ansprüchen 1 bis 6, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 16 unter Bedingungen, die ausreichend zur Herstellung des Polypeptids oder des immunogenen Fragments sind, und Gewinnen des Polypeptids oder des immunogenen Fragments aus dem Kulturmedium.
Verfahren zur Expression eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der wenigstens eines der Polynukleotide umfaßt, und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die ausreichend zur Expression eines beliebigen der Polynukleotide sind.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge des Polypeptids oder des immunogenen Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge des Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21, worin die Zusammensetzung wenigstens ein anderes Moraxella catarrhalis-Antigen umfaßt.
Antikörper, der gegen ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz erzeugt ist, die wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 aufweist, oder ein immunogenes Fragment davon, wobei das Fragment (falls erforderlich bei Kupplung an einen Träger) eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO:2 erkennt.
Antikörper gemäß Anspruch 23, worin die Aminosäuresequenz wenigstens 95 % Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 aufweist.
Antikörper gemäß Anspruch 23, worin die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 ist.
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, worin das Polypeptid oder das immunogene Fragment Teil eines größeren Fusionsproteins ist.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Moraxella catarrhalis-Infektion, umfassend das Identifizieren eines Polypeptids oder eines immunogenen Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, vorhanden innerhalb einer biologischen Probe, die aus einem Tier zu isolieren ist, das für eine solche Infektion verdächtigt wird.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines Polypeptids oder eines immunogenen Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Erzeugung einer Immunreaktion in einem Tier.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14 umfaßt, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Erzeugung einer Immunreaktion in einem Tier.
Therapeutische Zusammensetzung, die nützlich in der Behandlung von Menschen mit Moraxella catarrhalis-Krankheit ist, umfassend wenigstens einen gegen das Polypeptid oder das immunogene Fragment der Ansprüche 1 bis 6 gerichteten Antikörper und einen geeigneten pharmazeutischen Träger.