DE69928947T2

DE69928947T2 - Moraxella catarrhalis basb034 polypeptide und verwendungen davon

Info

Publication number: DE69928947T2
Application number: DE69928947T
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Ruelle
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2019-09-15
Also published as: KR20010085794A; GB9820002D0; NZ510512A; US20030180317A1; CN1326509A; JP2002525057A; EP1114160B1; AU5863299A; ES2253911T3; CA2342398A1; PL347943A1; NO20011263L; NO20011263D0; EP1114160A1; ATE312923T1; US6600013B1; US7432366B2; AU752667B2; ZA200102108B; CN1198931C

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Polynukleotide (hier als "BASB034-Polynukleotid(e)" bezeichnet), durch sie codierte Polypeptide (hier als "BASB034" oder "BASB034-Polypeptid(e)" bezeichnet), rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Polypeptide und Polynukleotide, einschließlich Impfstoffe gegen bakterielle Infektionen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung diagnostische Tests (Assays) zum Nachweis einer Infektion mit bestimmten Pathogenen.
Hintergrund der Erfindung
Moraxella catarrhalis (ebenfalls Branhamella catarrhalis genannt) ist ein Gram-negatives Bakterium, das häufig aus den humanen oberen Atemwegen isoliert wird. Es ist verantwortlich für verschiedene Pathologien, deren hauptsächliche Mittelohrentzündung bei Kleinkindern und Kindern und Lungenentzündung bei älteren Menschen sind. Es ist ebenfalls verantwortlich für Sinusitis, Krankenhausinfektionen und, weniger häufig, invasive Krankheiten.
Mittelohrentzündung ist eine wichtige Kinderkrankheit, sowohl nach Anzahl der Fälle als auch nach ihren potentiellen Folgeerscheinungen. Mehr als 3,5 Millionen Fälle werden jedes Jahr in den Vereinigten Staaten aufgezeichnet, und es wird geschätzt, daß 80% der Kinder wenigstens einen Mittelohrentzündungsfall erfahren haben, bevor sie das Alter von 3 erreichen (J. O. Klein, (1994) Clin. Inf. Dis. 19: 823). Unbehandelt oder chronisch kann diese Krankheit zu Gehörverlusten führen, die temporär (im Fall von Flüssigkeitsansammlung im Mittelohr) oder permanent (falls der Hörnerv beschädigt wird) sein können. Bei Kleinkindern können solche Gehörverluste für eine verzögerte Spracherlernung verantwortlich sein.
Drei Bakterienarten werden primär aus dem Mittelohr von Kindern mit Mittelohrentzündung isoliert: Streptococcus pneumoniae, nicht-typifizierbares Haemophilus influenza (NTHi) und M. catarrhalis. Sie sind in 60 bis 90% der Fälle vorhanden. Eine Übersicht über kürzliche Untersuchungen zeigt, daß S. pneumoniae und NTHi beide ca. 30% und M. catarrhalis ca. 15% der Mittelohrentzündungsfälle darstellen (T. F. Murphy (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Andere Bakterien konnten aus dem Mittelohr isoliert werden (H. influenzae Typ B, S. pyogenes etc.), aber mit einer viel geringeren Häufigkeit (2% der Fälle oder weniger).
Epidemiologische Daten weisen darauf hin, daß für die Pathogene, die im Mittelohr gefunden werden, die Besiedelung der oberen Atemwege eine absolute Vorbedingung für die Entwicklung einer Ohrentzündung ist; jedoch sind auch andere ebenso erforderlich, um zur Krankheit zu führen (D. P. Dickinson et al. (1988) J. Infect. Dis. 158: 205; H. L. Faden et al. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100: 612). Diese sind wichtig zur Auslösung der Wanderung der Bakterien in das Mittelohr über die eustachischen Röhren, gefolgt von der Einleitung eines Entzündungsprozesses. Diese Faktoren sind bis heute unbekannt. Es wurde postuliert, daß eine vorübergehende Anomalie des Immunsystems, z.B. im Anschluß an eine Virusinfektion, eine Unfähigkeit zur Bekämpfung der Besiedelung der Atemwege verursachen könnte (H. L. Faden et al. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312). Eine alternative Erklärung besteht darin, daß der Kontakt mit Umweltfaktoren eine bedeutendere Besiedelung einiger Kinder erlaubt, die anschließend anfällig für die Entwicklung von Mittelohrentzündung wegen der anhaltenden Gegenwart von Mittelohr-Pathogenen werden (T. F. Murphy (1996) Microbiol. Rev. 60: 267).
Die Immunreaktion gegen M. catarrhalis ist schlecht charakterisiert. Die Analyse von Stämmen, die sequentiell aus dem Nasenrachenraum von Babys isoliert wurden, die über das Alter von 0 bis 2 Jahren verfolgt wurden, weist darauf hin, daß sie häufig neue Stämme erlangen und eliminieren. Dies weist darauf hin, daß eine wirksame Immunreaktion gegen diese Bakterien durch die besiedelten Kinder aufgebaut wird (H. L. Faden et al. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).
In den meisten untersuchten Erwachsenen wurden bakterizide Antikörper identifiziert (A. J. Chapman et al. (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Stämme von M. catarrhalis stellen Variationen in ihrer Fähigkeit dar, serumbakterizider Aktivität zu widerstehen: allgemein sind Isolate aus erkrankten Individuen resistenter als diejenigen, die nur besiedelt sind (C. Hol et al. (1993) Lancet 341: 1281, K. L. Jordan et al. (1990) Am. J. Med. 88 (Suppl. 5A):28S). Serumresistenz könnte deshalb als ein Virulenzfaktor der Bakterien betrachtet werden. Eine opsonisierende Aktivität wurde in den Seren von Kindern beobachtet, die sich von einer Mittelohrentzündung erholen.
Die Antigene, auf die durch diese unterschiedlichen Immunreaktionen in Menschen abgezielt wird, wurden nicht identifiziert, mit der Ausnahme von OMP Bl, einem 84 kDa Protein, dessen Expression durch Eisen reguliert wird und das durch die Seren von Patienten mit Lungenentzündung erkannt wird (S. Sethi et al. (1995) Infect. Immun. 63: 1516), und von UspA1 und UspA2 (D. Chen et al. (1999) Infect. Immun. 67: 1310).
Einige andere Membranproteine, die auf der Oberfläche von M. catarrhalis vorhanden sind, wurden unter Verwendung eines biochemischen Verfahrens oder wegen ihrer potentiellen Beteiligung an der Induzierung einer Schutzimmunität charakterisiert (für eine Übersicht siehe T. F. Murphy (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). In einem Lungenentzündungsmodell der Maus begünstigt die Gegenwart von Antikörpern, die gegen einige von ihnen entwickelt wurden (UspA, CopB), eine schnellere Klärung der Lungeninfektion. Ein anderes Polypeptid (OMP CD) ist unter den M. catarrhalis-Stämmen hoch konserviert und stellt Homologien mit einem Porin von Pseudomonas aeruginosa dar, das sich als wirksam gegen dieses Bakterium in Tiermodellen erwiesen hat.
Die Häufigkeit von Infektionen mit Moraxella catarrhalis hat in den vergangenen Jahrzehnten dramatisch zugenommen. Dies wurde dem Auftreten von mehrfach Antibiotika-resistenten Stämmen und einer zunehmenden Bevölkerung von Menschen mit geschwächten Immunsystemen zugeschrieben. Es ist nicht mehr ungewöhnlich, Moraxella catarrhalis-Stämme zu isolieren, die gegen einige oder alle der Standardantibiotika resistent sind. Dieses Phänomen hat einen nicht erfüllten medizinischen Bedarf und eine Nachfrage nach neuen antimikrobiellen Mitteln, Impfstoffen, Wirkstoffdurchmusterungsverfahren und diagnostischen Tests für diesen Organismus geschaffen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft BASB034, insbesondere BASB034-Polypeptide und BASB034-Polynukleotide, rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide und Polynukleotide, die unter anderem die Prävention und Behandlung von mikrobiellen Krankheiten einschließen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung diagnostische Tests zum Nachweis von Krankheiten, die mit mikrobiellen Infektionen verbunden sind, und von Zuständen, die mit solchen Infektionen verbunden sind, wie z.B. Tests zum Nachweis der Expression oder Aktivität von BASB034-Polynukleotiden oder -Polypeptiden.
Verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und Umfangs der offenbarten Erfindung werden den Fachleuten durch das Lesen der folgenden Beschreibung und durch das Lesen der anderen Teile der vorliegenden Offenbarung leicht ersichtlich werden.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft BASB034-Polypeptide und -Polynukleotide, wie sie in größerem Detail nachfolgend beschrieben werden. Insbesondere betrifft die Erfindung Polypeptide und Polynukleotide von BASB034 von Moraxella catarrhalis, das durch Aminosäure-Sequenzhomologie mit dem Phospholipase A-Protein der äußeren Membran von Klebsiella pneumoniae verwandt ist. Die Erfindung betrifft speziell BASB034 mit den in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 und SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 dargestellten Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen. Es versteht sich, daß die im nachfolgenden Sequenzprotokoll als "DNA" aufgeführten Sequenzen eine exemplarische Darstellung einer Ausführungsform der Erfindung sind, da die Durchschnittsfachleute erkennen werden, daß solche Sequenzen nützlich in Polynukleotiden allgemein, einschließlich Ribopolynukleotiden, eingesetzt werden können.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 besteht.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die die Polypeptide der Erfindung codiert.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das das Polynukleotid von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 umfaßt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor oder ein rekombinanter lebender Mikroorganismus bereitgestellt, der ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid umfaßt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter lebender Mikroorganismus bereitgestellt, der einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Moraxella catarrhalis-Wirtszelle bereitgestellt, die einen Expressionsvektor umfaßt, der ein isoliertes Polynukleotid umfaßt, das ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 hat, oder ein Fragment davon codiert, das (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger) eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine äußere Membran eines rekombinanten Mikroorganismus der Erfindung bereitgestellt, der ein isoliertes Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 besteht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine äußere Membran eines rekombinanten Mikroorganismus bereitgestellt, der eine auf regulierte Expression eines isolierten Polypeptids aufweist, das eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 hat, oder ein Fragment davon umfaßt, das (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger) eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptids wie in der Erfindung definiert bereitgestellt, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen, die ausreichend zur Erzeugung des Polypeptids sind, und Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines immunogenen Fragments des Polypeptids bereitgestellt, wie es in der Erfindung beansprucht wird, worin das immunogene Fragment eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 umfaßt und eine Immunreaktion hervorrufen kann (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger), die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen, die ausreichend zur Erzeugung des immunogenen Fragments sind, und Gewinnen des immunogenen Fragments aus dem Kulturmedium.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Exprimieren eines Polynukleotids der Erfindung bereitgestellt, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der wenigstens eines der Polynukleotide umfaßt, und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die ausreichend zur Expression eines beliebigen der Polynukleotide sind.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Exprimieren eines Polynukleotids bereitgestellt, das ein immunogenes Fragment des Polypeptids codiert, wie es in der Erfindung beansprucht wird, worin das immunogene Fragment eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 umfaßt und eine Immunreaktion hervorrufen kann (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger), die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt, umfassend das Transformieren einer Moraxella catarrhalis-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der wenigstens eines der Polynukleotide umfaßt, und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die ausreichend für ein beliebiges der Polynukleotide sind.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge eines isolierten Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 hat, oder ein Fragment davon umfaßt, das (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger) eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge eines isolierten Polynukleotids, das eine Nukleotidsequenz, die wenigstens 85% Identität mit derjenigen von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7 hat, oder eine Nukleotidsequenz umfaßt, die komplementär zu dem isolierten Polynukleotid ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, worin die Zusammensetzung wenigstens ein anderes Moraxella catarrhalis-Antigen umfaßt.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine immunologisch wirksame Menge eines isolierten Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 umfaßt, oder ein Fragment eines isolierten Polypeptids umfaßt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 hat, worin das Fragment an einen Träger gekoppelt ist und eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines isolierten Polynukleotids, das eine Nukleotidsequenz, die wenigstens 85% Identität mit derjenigen von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7 hat, oder eine Nukleotidsequenz umfaßt, die komplementär zu dem isolierten Polynukleotid ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Erzeugung einer Immunreaktion in einem Tier bereitgestellt.
Polypeptide
In einem Aspekt der Erfindung werden Polypeptide von Moraxella catarrhalis, die hier als "BASB034" und "BASB034-Polypeptide" bezeichnet werden, sowie biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Varianten davon und dieselben umfassende Zusammensetzungen bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner vor:

(a) ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 ausgewählt ist;
(b) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus; oder
(c) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, das aus SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 ausgewählt ist.

Das in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 bereitgestellten BASB034-Polypeptide sind die BASB034-Polypeptide aus den Moraxella catarrhalis-Stämmen MC2931 (ATCC 43617), Mc2908, Mc2913 und Mc2969.
In Ausführungsformen stellt die Erfindung ebenfalls ein immunogenes Fragment eines BASB034-Polypeptids bereit, das heißt einen zusammenhängenden Teil des BASB034-Polypeptids, der die gleiche oder im wesentlichen die gleiche immunogene Aktivität wie das Polypeptid hat, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 umfaßt. Das heißt, das Fragment (falls erforderlich bei Kopplung an einen Träger) kann eine Immunreaktion hervorrufen, die das BASB034-Polypeptid erkennt. Ein solches immunogenes Fragment kann zum Beispiel das BASB034-Polypeptid einschließen, dem eine N-terminale Leitsequenz und/oder eine Transmembrandomäne und/oder eine C-terminale Ankerdomäne fehlt. In einem bevorzugten Aspekt umfaßt das von der Erfindung eingesetzte immunogene Fragment von BASB034 im wesentlichen die gesamte extrazelluläre Domäne eines Polypeptids, das wenigstens 85% Identität, bevorzugt wenigstens 90% Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95% Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97–99% Identität mit demjenigen von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 2 hat.
Ein Fragment ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die völlig die gleiche wie ein Teil, aber nicht die gesamte Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung ist. Wie bei BASB034-Polypeptiden können Fragmente "freistehend" sein oder innerhalb eines größeren Polypeptids umfaßt sein, von dem sie einen Teil oder eine Region bilden, am meisten bevorzugt als eine einzelne zusammenhänge Region in einem einzelnen größeren Polypeptid.
Bevorzugte Fragmente schließen z.B. Trunkierungspolypeptide mit einem Teil einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 oder von Varianten davon ein, wie eine kontinuierliche Reihe von Resten, die eine Amino- und/oder Carboxy-terminale Aminosäuresequenz einschließt. Abbauformen der Polypeptide der Erfindung, die durch oder in einer Wirtszelle erzeugt werden, sind ebenfalls bevorzugt. Weiter bevorzugt sind Fragmente, die durch strukturelle oder funktionelle Eigenschaften gekennzeichnet sind, wie Fragmente, die alpha-Helix- und alpha-Helix-bildende Regionen, beta-Faltblatt- und beta-Faltblatt-bildende Regionen, Turn- und Turn-bildende Regionen, Knäuel- und Knäuel-bildende Regionen, hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, flexible Regionen, Oberflächen-bildende Regionen, Substrat-bindende Regionen und Regionen mit hohem antigenen Index umfassen.
Weiter bevorzugte Fragmente schließen ein isoliertes Polypeptid ein, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 umfaßt, oder ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren trunkiert oder deletiert aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 umfaßt.
Fragmente der Polypeptide der Erfindung können zur Erzeugung des entsprechenden Polypeptids voller Länge durch Peptidsynthese eingesetzt werden; deshalb können diese Fragmente als Zwischenstufen zur Erzeugung der Polypeptide der Erfindung voller Länge eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt sind Varianten, in denen mehrere, 5–10, 1–5, 1–3, 1–2 oder 1 Aminosäuren substituiert, deletiert oder addiert sind, in jeder Kombination.
Die Polypeptide oder immunogenen Fragmente der Erfindung, oder die darin verwendet werden, können in Form des "reifen" Proteins sein oder können ein Teil eines größeren Proteins sein, wie ein Vorläufer- oder Fusionsprotein. Es ist häufig vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzuschließen, die sekretorische oder Leitsequenzen, Prosequenzen, Sequenzen, die bei der Reinigung helfen, wie multiple Histidinreste, oder eine zusätzliche Sequenz zur Stabilität während der rekombinanten Erzeugung enthalten. Außerdem wird ebenfalls die Addition von exogenem Polypeptid oder Lipidschwanz oder Polynukleotidsequenzen zur Erhöhung des immunogenen Potentials des fertigen Moleküls erwogen.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung gentechnisch hergestellte lösliche Fusionsproteine, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung und verschiedene Teile der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen verschiedener Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) umfassen. Bevorzugt als Immunglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von humanem IgG, insbesondere IgG1, wobei die Fusion an der Gelenkregion stattfindet. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil einfach durch Einfügen einer Spaltsequenz entfernt werden, die mit Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann.
Außerdem betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine durch Gentechnik und deren Verwendung zur Wirkstoffdurchmusterung, Diagnose und Therapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren. Beispiele für die Fusionsproteintechnik können in WO 94/29458 und WO 94/22914 gefunden werden.
Die Proteine können chemisch konjugiert oder als rekombinante Fusionsproteine exprimiert werden, was die Erzeugung erhöhter Mengen in einem Expressionssystem im Vergleich mit dem nicht-fusionierten Protein erlaubt. Der Fusionspartner kann bei der Bereitstellung von T-Helferepitopen (immunologischer Fusionspartner), bevorzugt T-Helferepitopen, die durch Menschen erkannt werden, oder bei der Expression des Proteins (Expressionsverstärker) mit höheren Erträgen als das native rekombinante Protein helfen. Bevorzugt wird der Fusionspartner sowohl ein immunologischer Fusionspartner als auch ein Expressionsverstärkerpartner sein.
Fusionspartner schließen Protein D aus Haemophilus influenzae und das Nichtstrukturprotein aus dem Grippevirus, NS1 (Hämagglutinin), ein. Ein anderer Fusionspartner ist das als LytA bekannte Protein. Bevorzugt wird der C-terminale Teil des Moleküls verwendet. LytA stammt aus Streptococcus pneumoniae, die eine N-Acetyl-L-Alanin-Amidase synthetisieren, Amidase-LytA, (codiert durch das LytA-Gen {Gene, 43 (1986) Seite 265–272}), ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen im Peptidoglycangerüst abbaut. Die C-terminale Domäne des LytA-Proteins ist verantwortlich für die Affinität zum Cholin oder gewissen Cholin-Analoga wie DEAE. Diese Eigenschaft wurde für die Entwicklung von E. coli C-LytA-exprimierenden Plasmiden ausgenutzt, die nützlich zur Expression von Fusionsproteinen sind. Die Reinigung von Hybridproteinen, die das C-LytA-Fragment an ihrem Aminoterminus enthalten, wurde beschrieben {Biotechnology: 10 (1992), Seite 795–798}. Es ist möglich, den Repeat-Teil des LytA-Moleküls zu verwenden, der im C-terminalen Ende beginnend bei Rest 178 gefunden wird, z.B. die Reste 188–305.
Wir beschreiben auch Varianten der zuvor genannten Polypeptide, d.h. Polypeptide, die sich von den bezeichneten durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wobei ein Rest durch einen anderen mit ähnlichen Eigenschaften substituiert ist. Solche typischen Substitutionen sind zwischen Ala, Val, Leu und Ile; zwischen Ser und Thr; zwischen den sauren Resten Asp und Glu; zwischen Asn und Gln; und zwischen den basischen Resten Lys und Arg; oder zwischen den aromatischen Resten Phe und Tyr.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in jeder geeigneten Weise hergestellt werden. Solche Polypeptide schließen isolierte natürlich vorkommende Polypeptide, rekombinant erzeugte Polypeptide, synthetisch erzeugte Polypeptide oder Polypeptide ein, die durch eine Kombination dieser Verfahren hergestellt werden. Mittel zur Herstellung solcher Polypeptide sind allgemein fachbekannt.
Es ist am meisten bevorzugt, daß ein Polypeptid der Erfindung aus Moraxella catarrhalis stammt, jedoch kann es bevorzugt aus anderen Organismen der gleichen taxonomischen Gattung erhalten werden. Ein Polypeptid der Erfindung kann ebenfalls z.B. aus Organismen der gleichen taxonomischen Familie oder Ordnung erhalten werden.
Polynukleotide
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Polynukleotide bereitzustellen, die BASB034-Polypeptide codieren, insbesondere Polynukleotide, die das hier mit BASB034 bezeichnete Polypeptid codieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Polynukleotid eine Region, die BASB034-Polypeptide codiert, umfassend eine in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 dargestellte Sequenz, die ein Gen voller Länge einschließt.
Die in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 bereitgestellten BASB034-Polynukleotide sind die BASB034-Polynukleotide aus den Moraxella catarrhalis-Stämmen MC2931 (ATCC 43617), Mc2908, Mc2913 und Mc2969.
Als ein weiterer Aspekt der Erfindung werden isolierte Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die BASB034-Polypeptide und -Polynukleotide codieren und/oder exprimieren, insbesondere Moraxella catarrhalis-BASB034-Polypeptide und -Polynukleotide, einschließlich z.B. ungereifter RNAs, Ribozym-RNAs, mRNAs, cDNAs, genomischer DNAs, B- und Z-DNAs. Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Polynukleotide und Polypeptide und Varianten davon sowie dieselben umfassende Zusammensetzungen ein.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Polynukleotide, die wenigstens ein Gen voller Länge einschließen, das ein BASB034-Polypeptid mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 codiert.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein BASB034-Polypeptid von Moraxella catarrhalis bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 oder eine Variante davon umfaßt oder daraus besteht.
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Informationen, wie z.B. einer in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 aufgeführten Polynukleotidsequenz, kann ein Polynukleotid der Erfindung, das BASB034-Polypeptid codiert, unter Verwendung von standardmäßigen Klonierungs- und Durchmusterungsverfahren erhalten werden, wie durch diejenigen zur Klonierung und Sequenzierung chromosomaler DNA-Fragmente aus Bakterien unter Verwendung von Moraxella catarrhalis Catlin-Zellen als Ausgangsmaterial, gefolgt vom Erhalt eines Klons voller Länge. Zum Beispiel wird zum Erhalt einer Polynukleotidsequenz der Erfindung, wie eine in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 angegebene Nukleotidsequenz, typischerweise eine Bibliothek von Klonen von chromosomaler DNA von Moraxella catarrhalis Catlin in E. coli oder einem anderen geeigneten Wirt mit einem radiomarkierten Oligonukleotid sondiert, bevorzugt mit einem 17-mer oder länger, das aus einer Teilsequenz abgeleitet ist. Klone, die DNA tragen, die identisch mit derjenigen der Sonde ist, können dann unter Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen unterschieden werden. Durch Sequenzierung der so identifizierten individuellen Klone durch Hybridisierung mit Sequenzierungsprimern, die aus der ursprünglichen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz geschaffen wurden, ist es dann möglich, die Polynukleotidsequenz in beide Richtungen zur Bestimmung einer Gensequenz voller Länge zu verlängern. Zweckmäßig wird eine solche Sequenzierung z.B. unter Verwendung denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt, die aus einem Plasmidklon hergestellt wird. Geeignete Techniken werden beschrieben von T. Maniatis, E. F. Frisch und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). (Siehe insbesondere "Screening By Hybridization 1.90" und "Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70".) Eine direkte genomische DNA-Sequenzierung kann ebenfalls zum Erhalt einer Gensequenz voller Länge durchgeführt werden. Illustrativ für die Erfindung wurde das in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 dargestellte Polynukleotid in einer aus Moraxella catarrhalis stammenden DNA-Bibliothek gefunden.
Außerdem enthält jede in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 dargestellte DNA-Sequenz ein offenes Leseraster, das ein Protein mit etwa der Anzahl von Aminosäureresten, die in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 dargestellt sind, mit einem abgeleiteten Molekulargewicht codiert, das unter Verwendung von Molekulargewichtswerten von Aminosäureresten berechnet werden kann, die den Fachleuten allgemein bekannt sind.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO: 1 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nummer 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nummer 1327 von SEQ ID NO: 1 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO: 2.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO: 3 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nummer 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nummer 1327 von SEQ ID NO: 3 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO: 4.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO: 5 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nummer 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nummer 1327 von SEQ ID NO: 5 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO: 6.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO: 7 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nummer 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nummer 1327 von SEQ ID NO: 7 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO: 8.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid vor, umfassend oder bestehend aus:

(a) eine(r) Polynukleotidsequenz, die die Sequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 umfaßt; oder
(b) eine(r) Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 umfaßt.

Ein Polynukleotid, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einschließlich Homologen und Orthologen aus anderen Arten als Moraxella catarrhalis, kann durch ein Verfahren erhalten werden, das die Schritte der Durchmusterung einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (z.B. unter Verwendung einer Temperatur im Bereich von 45–65°C und einer SDS-Konzentration von 0,1–1%) mit einer markierten oder detektierbaren Sonde, bestehend aus der oder umfassend die Sequenz von SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 oder ein Fragment davon; und der Isolierung eines Gens voller Länge und/oder genomischer Klone, die die Polynukleotidsequenz enthalten, umfaßt.
Die Erfindung stellt eine Polynukleotidsequenz bereit, die über ihre gesamte Länge mit einer codierenden Sequenz (offenes Leseraster) in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 identisch ist. Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung wird eine codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder ein Fragment davon, als solche sowie als codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder ein Fragment im Leseraster mit einer anderen codierenden Sequenz, wie einer Sequenz, die eine Leit- oder sekretorische Sequenz, eine Prä- oder Pro- oder Präpro-Proteinsequenz codiert. Das Polynukleotid in der Erfindung kann ebenfalls wenigstens eine nicht-codierende Sequenz enthalten, die z.B. ohne Beschränkung wenigstens eine nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenz, wie die transkribierten, aber nicht-translatierten Sequenzen, Terminationssignale (wie Rho-abhängige und Rho-unabhängige Terminationssignale), Ribosom-Bindungsorte, Kozak-Sequenzen, Sequenzen, die mRNA stabilisieren, Introns und Polyadenylierungssignale, einschließt. Die Polynukleotidsequenz kann ebenfalls eine zusätzliche codierende Sequenz umfassen, die zusätzliche Aminosäuren codiert. Zum Beispiel kann eine Marker sequenz codiert werden, die die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexahistidinpeptid, wie im pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt und in Gentz et al. beschrieben, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821–824 (1989), oder ein HA-Peptid-Tag (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)), die beide nützlich in der Reinigung von an sie fusionierter Polypeptidsequenz sein können. Polynukleotide der Erfindung schließen ebenfalls ohne Beschränkung Polynukleotide ein, die ein Strukturgen und seine natürlich assoziierten Sequenzen umfassen, die die Genexpression kontrollieren.
Die Nukleotidsequenz, die BASB034-Polypeptid von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 codiert, kann identisch mit der Polypeptid-codierenden Sequenz sein, die in den Nukleotiden 1 bis 1326 von SEQ ID NO: 1, 3, 5 bzw. 7 enthalten ist. Alternativ kann sie eine Sequenz sein, die als Ergebnis der Redundanz (Degeneriertheit) des genetischen Codes auch das Polypeptid von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 codiert.
Der Begriff "Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert", wie er hier verwendet wird, umfaßt Polynukleotide, die eine Sequenz einschließen, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, insbesondere ein bakterielles Polypeptid und ganz besonders ein Polypeptid des Moraxella catarrhalis-BASB034 mit einer in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 dargestellten Aminosäuresequenz. Der Begriff umfaßt ebenfalls Polynukleotide, die eine einzelne zusammenhängende Region oder diskontinuierliche Regionen einschließen, die das Polypeptid codieren (z.B. Polynukleotide, die durch einen integrierten Phagen, eine integrierte Insertionssequenz, eine integrierte Vektorsequenz, eine integrierte Transposonsequenz oder aufgrund von RNA-Editing oder genomischer DNA-Reorganisation unterbrochen sind), zusammen mit zusätzlichen Regionen, die ebenfalls codierende und/oder nicht-codierende Sequenzen enthalten können.
Die Erfindung betrifft ferner Varianten der hier beschriebenen Polynukleotide, die Varianten eines Polypeptids mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 codieren. Fragmente von Polynukleotiden der Erfindung können z.B. zur Synthese von Polynukleotiden voller Länge der Erfindung verwendet werden.
Weitere besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die BASB034-Varianten codieren, die die Aminosäuresequenz von BASB034-Polypeptid von SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 aufweisen, worin mehrere, einige, 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste substituiert, modifiziert, deletiert und/oder addiert sind, in jeder Kombination. Speziell bevorzugt unter diesen sind stumme Substitutionen, Additionen und Deletionen, die nicht die Eigenschaften und Aktivitäten von BASB034-Polypeptid verändern.
Aspekte der Erfindung sind Polynukleotide, die wenigstens 85% identisch über ihre gesamte Länge mit einem Polynukleotid sind, das BASB034-Polypeptid mit einer in SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, und Polynukleotide, die komplementär zu solchen Polynukleotiden sind. Alternativ sind höchst bevorzugt Polynukleotide, die eine Region umfassen, die wenigstens 90% identisch über ihre gesamte Länge mit einem Polynukleotid ist, das BASB034-Polypeptid codiert, und dazu komplementäre Polynukleotide. In dieser Hinsicht sind Polynukleotide, die wenigstens 95% identisch über ihre gesamte Länge mit demselben sind, besonders bevorzugt. Ferner sind diejenigen mit wenigstens 97% hoch bevorzugt unter denjenigen mit wenigstens 95%, und unter diesen sind diejenigen mit wenigstens 98% und wenigstens 99% besonders hoch bevorzugt, wobei wenigstens 99% die besonders bevorzugten sind.
Bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die Polypeptide codieren, die im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid beibehalten, das durch eine DNA von SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 codiert wird.
Gemäß bestimmten Aspekten dieser Erfindung wird von Polynukleotiden Gebrauch gemacht, die, insbesondere unter stringenten Bedingungen, mit BASB034-Polynukleotidsequenzen hybridisieren, wie die Polynukleotide in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7.
Die Erfindung betrifft ferner Polynukleotide, die mit den hier bereitgestellten Polynukleotidsequenzen hybridisieren. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung speziell Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hier beschriebenen Polynukleotiden hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "stringente Bedingungen" und "stringente Hybridisierungsbedingungen" eine Hybridisierung, die nur auftritt, falls es wenigstens 95% und bevorzugt wenigstens 97% Identität zwischen den Sequenzen gibt. Ein spezifisches Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml von denaturierter, gescherter Lachssperma-DNA umfaßt, gefolgt von Waschen des Hybridisierungsträgers in 0,1 × SSC bei ca. 65°C. Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind allgemein bekannt und werden exemplarisch angegeben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), insbesondere Kapitel 11. Lösungshybridisierung kann ebenfalls mit den durch die Erfindung bereitgestellten Polynukleotidsequenzen verwendet werden.
Aspekte der Erfindung setzen auch ein Polynukleotid ein, bestehend aus oder umfassend eine Polynukleotidsequenz, die erhalten wird durch Durchmustern einer geeigneten Bibliothek, die das komplette Gen für eine in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 dargestellte Polynukleotidsequenz enthält, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde mit der Sequenz der in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 dargestellten Polynukleotidsequenz oder einem Fragment davon; und Isolieren der Polynukleotidsequenz. Zum Erhalt eines solchen Polynukleotids nützliche Fragmente schließen z.B. Sonden und Primer ein, die hier an anderer Stelle vollständig beschrieben werden.
Wie hier an anderer Stelle in Bezug auf Polynukleotidtests der Erfindung erörtert wird, können z.B. die Polynukleotide der Erfindung als Hybridisierungssonde für RNA, cDNA und genomische DNA verwendet werden, um cDNAs voller Länge und genomische Klone zu isolieren, die BASB034 codieren, und um cDNA und genomische Klone anderer Gene zu isolieren, die eine hohe Identität, insbesondere eine hohe Sequenzidentität, mit dem BASB034-Gen haben. Solche Sonden werden allgemein wenigstens 15 Nukleotidreste oder Basenpaare umfassen. Bevorzugt werden solche Sonden wenigstens 30 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen und können wenigstens 50 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen. Besonders bevorzugte Sonden werden wenigstens 20 Nukleotidreste oder Basenpaare haben und werden weniger als 30 Nukleotidreste oder Basenpaare haben.
Eine codierende Region eines BASB034-Gens kann durch Durchmustern unter Verwendung einer in SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 bereitgestellten DNA-Sequenz zur Synthese einer Oligonukleotidsonde isoliert werden. Ein markiertes Oligonukleotid mit einer Sequenz, die komplementär zu derjenigen eines Gens der Erfindung ist, wird dann zur Durchmusterung einer Bibliothek von cDNA, genomischer DNA oder mRNA zur Bestimmung verwendet, mit welchen Elementen der Bibliothek die Sonde hybridisiert.
Es sind verschiedene Verfahren vorhanden und den Fachleuten allgemein bekannt, um DNAs voller Länge zu erhalten oder kurze DNAs zu verlängern, z.B. diejenigen auf Basis des Verfahrens der Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) (siehe z.B. Frohman et al., PNAS USA 85: 8998–9002, 1988). Kürzliche Modifikationen der Technik, exemplarisch dargestellt durch die Marathon^TM-Technik (Clontech Laboratories Inc.), haben die Suche nach län geren cDNAs signifikant vereinfacht. Bei der Marathon^TM-Technik werden cDNAs aus mRNA, die aus einem gewählten Gewebe extrahiert wurde, hergestellt und eine "Adapter"-Sequenz an jedes Ende ligiert. Nukleinsäure-Amplifikation (PCR) wird dann durchgeführt, um das "fehlende" 5'-Ende der DNA unter Verwendung einer Kombination aus genspezifischen und adapterspezifischen Oligonukleotidprimern zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion wird dann unter Verwendung "verschachtelter" Primer wiederholt, d.h. mit Primern, die geschaffen sind, um innerhalb des amplifizierten Produkts zu reassoziieren (typischerweise ein adaptertypischer Primer, der weiter 3' in der Adaptersequenz reassoziiert, und ein genspezifischer Primer, der weiter 5' in der ausgewählten Gensequenz reassoziiert). Die Produkte dieser Reaktion können dann durch DNA-Sequenzierung analysiert und eine DNA voller Länge entweder durch Verbinden des Produkts direkt mit der bestehenden DNA zum Erhalt einer vollständigen Sequenz oder durch Durchführen einer getrennten PCR voller Länge unter Verwendung der neuen Sequenzinformation zur Schaffung des 5'-Primers konstruiert werden.
Die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung können z.B. als Forschungsreagenzien und Materialien für die Entdeckung von Behandlungen von und Diagnostika für Krankheiten, insbesondere menschliche Krankheiten, eingesetzt werden, wie hier weiter in bezug auf Polynukleotidtests erörtert wird.
Die hier beschriebenen Polynukleotide der Erfindung, die Oligonukleotide sind, die aus einer Sequenz der SEQ ID NOS: 1–8 stammen, können in den Verfahren wie hier beschrieben verwendet werden, aber bevorzugt zur PCR, zur Bestimmung, ob die hier identifizierten Polynukleotide ganz oder teilweise in Bakterien in infiziertem Gewebe transkribiert werden oder nicht. Es wird anerkannt, daß solche Sequenzen ebenfalls einen Nutzen in der Diagnose des Stadiums der Infektion und des Typs der Infektion, die das Pathogen erreicht hat, besitzen werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls Polynukleotide bereit, die ein Polypeptid codieren, das das reife Protein plus zusätzliche Amino- oder Carboxyl-terminale Aminosäuren oder Aminosäuren innerhalb des reifen Polypeptids ist (z.B. wenn die reife Form mehr als eine Polypeptidkette hat). Solche Sequenzen können u.a. eine Rolle in der Reifung eines Proteins aus einem Vorläufer zu einer reifen Form spielen, können den Proteintransport erlauben, können die Proteinhalbwertszeit verlängern oder verkürzen oder können die Manipulation eines Proteins zum Test oder zur Herstellung erleichtern. Wie es allgemein der Fall in vivo ist, können die zusätzlichen Aminosäuren vom reifen Protein durch zelluläre Enzyme entfernt werden.
Für jedes einzelne Polynukleotid der Erfindung wird dazu komplementäres Polynukleotid bereitgestellt. Es ist bevorzugt, daß diese komplementären Polynukleotide vollständig komplementär zu jedem Polynukleotid sind, zu dem sie komplementär sind.
Ein Vorläuferprotein, das eine reife Form des Polypeptids an eine oder mehrere Prosequenzen fusioniert aufweist, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Wenn Prosequenzen entfernt werden, werden solche inaktiven Vorläufer allgemein aktiviert. Einige oder alle der Prosequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Allgemein werden solche Vorläufer Proproteine genannt.
Zusätzlich zu den standardmäßigen Darstellungen A, G, C, T/U für Nukleotide kann ebenfalls der Begriff "N" bei der Beschreibung bestimmter Polynukleotide der Erfindung verwendet werden. "N" bedeutet, daß jedes der vier DNA- oder RNA-Nukleotide an einer so bezeichneten Position in der DNA- oder RNA-Sequenz erscheinen kann, ausgenommen es ist bevorzugt, daß N keine Nukleinsäure ist, die bei Kombination mit benachbarten Nukleotidpositionen, beim Lesen im korrekten Leseraster, die Wirkung der Erzeugung eines verfrühten Terminationscodons in einem solchen Leseraster haben würde.
In der Summe kann ein Polynukleotid der Erfindung ein reifes Protein, ein reifes Protein plus eine Leitsequenz (was als ein Präprotein bezeichnet werden kann), einen Vorläufer eines reifen Proteins mit einer oder mehreren Prosequenzen, die nicht die Leitsequenzen eine Präproteins sind, oder ein Präpro-Protein codieren, das ein Vorläufer für ein Proprotein ist, mit einer Leitsequenz und einer oder mehreren Prosequenzen, die allgemein während der Reifungsschritte entfernt werden, die aktive und reife Formen des Polypeptids erzeugen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung für therapeutische oder prophylaktische Zwecke bereitgestellt, insbesondere zur genetischen Immunisierung.
Die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung in der genetischen Immunisierung wird bevorzugt ein geeignetes Übertragungsverfahren einsetzen, wie die Direktinjektion von Plasmid-DNA in Muskeln (Wolff et al., Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), die Übertragung von mit spezifischen Proteinträgern komplexierter DNA (Wu et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), die Kopräzipitation von DNA mit Calciumphosphat (Benvenisty & Reshef, PNAS USA (1986) 83: 9551), die Verkapselung von DNA in verschiedenen Formen von Liposomen (Kaneda et al., Science (1989) 243: 375), Teilchenbeschuß (Tang et al., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) und In-vivo-Infektion unter Verwendung klonierter retroviraler Vektoren (Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).
Vektoren, Wirtszellen, Expressionssysteme
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vektoren, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, Wirtszellen, die gentechnisch mit Vektoren der Erfindung verändert sind, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls zur Erzeugung solcher Proteine unter Verwendung von RNAs eingesetzt werden, die aus den DNA-Konstrukten der Erfindung stammen.
Rekombinante Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch den Fachleuten allgemein bekannte Verfahren aus gentechnisch veränderten Wirtszellen hergestellt werden, die Expressionssysteme umfassen. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt Expressionssysteme, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die gentechnisch mit solchen Expressionssystemen verändert sind, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken.
Zur rekombinanten Erzeugung der Polypeptide der Erfindung können Wirtszellen gentechnisch verändert werden, um Expressionssysteme oder Teile davon oder Polynukleotide der Erfindung aufzunehmen. Die Einführung eines Polynukleotids in die Wirtszelle kann durch in vielen Standardlaborhandbüchern beschriebene Verfahren bewirkt werden, wie Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), wie Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextranvermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion, mit kationischem Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Scrape Loading, ballistische Einführung und Infektion.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte schließen bakterielle Zellen ein, wie Zellen von Streptococci, Staphylococci, Enterococci, E. coli, Streptomyces, Cyanobakterien, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis und Moraxella catarrhalis; Pilzzellen, wie Zellen einer Hefe, Kluveromyces, Saccharomyces, eine Basidiomycete, Candida albicans und Aspergillus; Insektenzellen, wie Zellen von Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; Tierzellen, wie CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 und Bowes-Melanom zellen; und Pflanzenzellen, wie Zellen eines Nacktsamers oder Bedecktsamers.
Eine große Vielzahl von Expressionssystemen kann zur Erzeugung der Polypeptide der Erfindung verwendet werden. Solche Vektoren schließen u.a. chromosomal, episomal und Virus-abgeleitete Vektoren ein, z.B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, aus Bakteriophagen, aus Transposonen, aus Hefeepisomen, aus Insertionselementen, aus chromosomalen Hefeelementen, aus Viren, wie Baculoviren, Papovaviren wie SV40, Vakzinia-Viren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabies-Viren, Picornaviren, Retroviren und Alphaviren, stammen, und aus Kombinationen daraus stammende Vektoren, wie diejenigen, die aus genetischen Plasmid- und Bakteriophagenelementen stammen, wie Cosmide und Phagemide. Die Expressionssystemkonstrukte können Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren sowie hervorrufen. Allgemein kann jedes System oder jeder Vektor, das/der zur Aufrechterhaltung, Vermehrung oder Expression von Polynukleotiden und/oder zur Expression eines Polypeptids in einem Wirt geeignet ist, zur Expression in dieser Hinsicht verwendet werden. Die entsprechende DNA-Sequenz kann in das Expressionssystem durch jede einer Vielzahl allgemein bekannter und routinemäßiger Techniken insertiert werden, wie z.B. durch diejenigen, die dargestellt werden in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (siehe oben).
In rekombinanten Expressionssystemen in Eukaryonten können zur Sezernierung eines translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung entsprechende Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingefügt werden. Diese Signale können für das Polypeptid endogen sein oder sie können heterologe Signale sein.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können aus rekombinanten Zellkulturen durch allgemein bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lectinchromatographie. Am meisten bevorzugt wird Ionenmetall-Affinitätschromatographie (IMAC) zur Reinigung eingesetzt. Allgemein bekannte Techniken zur Neufaltung von Proteinen können eingesetzt werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der intrazellulären Synthese, Isolation und/oder Reinigung denaturiert wird.
Das Expressionssystem kann ebenfalls ein rekombinanter lebender Mikroorganismus sein, wie ein Virus oder Bakterium. Das interessierende Gen kann in das Genom eines lebenden rekombinanten Virus oder Bakteriums inseriert werden. Die Impfung und In-vivo-Infektion mit diesem Lebendvektor wird zur In-vivo-Expression des Antigens und zur Induzierung von Immunreaktionen führen. Viren und Bakterien, die für diesen Zweck verwendet werden, sind z.B.: Pockenviren (z.B. Vakzinia, Geflügelpocken, Kanarienpocken), Alphaviren (Sindbis-Virus, Semliki-Forest-Virus, venezolanisches Pferdeenzephalitis-Virus), Adenoviren, Adeno-assoziiertes Virus, Picornaviren (Poliovirus, Rhinovirus), Herpesviren (Varicella zoster-Virus etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Diese Viren und Bakterien können virulent oder abgeschwächt in verschiedenen Weisen sein, um Lebendimpfstoffe zu erhalten. Solche Lebendimpfstoffe bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Antikörper
Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung oder Varianten davon oder Zellen, die dieselben exprimieren, können als Immunogene zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die immunspezifisch für solche Polypeptide bzw. Polynukleotide sind.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Antikörper gegen BASB034-Polypeptide bereitgestellt.
Gegen die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung erzeugte Antikörper können durch Verabreichen der Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung oder von Epitop-tragenden Fragmenten von einem oder beiden davon, von Analoga von einem oder beiden davon oder von Zellen, die eines oder beide exprimieren, an ein Tier, bevorzugt ein nicht-menschliches Tier, unter Verwendung von Routineprotokollen erhalten werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper kann jede fachbekannte Technik verwendet werden, die durch kontinuierliche Zellinienkulturen erzeugte Antikörper bereitstellt. Beispiele schließen verschiedene Techniken ein, wie diejenigen in G. Kohler und C. Milstein, Nature 256: 495–497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., S. 77–96, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).
Techniken zur Herstellung von einkettigen Antikörpern (US-PS 4 946 778) können angepaßt werden, um einkettige Antikörper gegen Polypeptide oder Polynukleotide dieser Erfindung zu erzeugen. Ebenfalls können transgene Mäuse oder andere Organismen oder Tiere, wie andere Säugetiere, zur Expression humanisierter Antikörper verwendet werden, die immunspezifisch für die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung sind.
Alternativ kann die Phagen-Display-Technik verwendet werden, um Antikörpergene mit Bindungsaktivitäten für ein Polypeptid der Erfindung auszuwählen, entweder aus Sammlungen von PCR-amplifizierten v-Genen von Lymphozyten aus Menschen, die auf Besitz von Anti-BASB034 durchmustert wurden, oder aus naiven Bibliotheken (McCafferty et al., (1990) Nature 348, 552–554; Marks et al., (1992) Biotechnology 10, 779–783). Die Affinität dieser Antikörper kann ebenfalls durch z.B. Chain Shuffling verbessert werden (Clackson et al., (1991) Nature 352: 628).
Die oben beschriebenen Antikörper können eingesetzt werden, um Klone zu isolieren oder zu identifizieren, die die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung exprimieren, um die Polypeptide oder Polynukleotide durch z.B. Affinitätschromatographie zu reinigen.
So können u.a. Antikörper gegen BASB034-Polypeptid oder BASB034-Polynukleotid zur Behandlung von Infektionen eingesetzt werden, insbesondere von bakteriellen Infektionen.
Polypeptidvarianten, die antigenisch, epitopisch oder immunologisch äquivalente Varianten einschließen, bilden einen besonderen Aspekt dieser Erfindung.
Bevorzugt wird der Antikörper oder die Variante davon modifiziert, um ihn/sie weniger immunogen im Individuum zu machen. Falls das Individuum ein Mensch ist, kann der Antikörper z.B. höchst vorzugsweise "humanisiert" werden, wobei die die Komplementarität bestimmende Region oder Regionen des Hybridom-abgeleiteten Antikörpers in einen humanen monoklonalen Antikörper transplantiert wurden, z.B. wie beschrieben in Jones et al., (1986), Nature 321, 522–525, oder Tempest et al. (1991) Biotechnology 9, 266–273.
Impfstoffe
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, insbesondere einem Säugetier, vorzugsweise Menschen, welches das Impfen des Individuums mit BASB034-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon umfaßt, ausreichend zu Erzeugung von Antikörper und/oder T-Zell-Immunreaktion, um das Individuum vor Infektion zu schützen, insbesondere vor bakterieller Infektion und ganz besonders vor Infektion mit Moraxella catarrhalis. Ebenfalls bereitgestellt werden Verwendungen, durch die eine solche immunologische Reaktion die bakterielle Vermehrung verlangsamt. Noch ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine Verwendung zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, welche das Übertragen eines Nukleinsäurevektors, einer Sequenz oder eines Ribozyms auf ein solches Individuum umfaßt, um die Expression von BASB034-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon auszurichten, zur Expression von BASB034-Polynukleotid und/oder Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon in vivo, um eine immunologische Reaktion zu induzieren, wie zur Erzeugung von Antikörper- und/oder T-Zell-Immunreaktion, einschließlich z.B. Cytokin-erzeugender T-Zellen oder cytotoxischer T-Zellen, um das Individuum, bevorzugt einen Menschen, vor Krankheit zu schützen, unabhängig davon, ob diese Krankheit bereits im Individuum etabliert ist oder nicht. Ein Beispiel für die Verabreichung des Gens ist durch seine Beschleunigung in die gewünschten Zellen als Überzug auf Partikeln oder in anderer Weise. Ein solcher Nukleinsäurevektor kann DNA, RNA, ein Ribozym, eine modifizierte Nukleinsäure, ein DNA/RNA-Hybrid, einen DNA-Protein-Komplex oder einen RNA-Protein-Komplex umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine immunologische Zusammensetzung, die bei Einführung in ein Individuum, bevorzugt einen Menschen, in dem eine immunologische Reaktion induziert werden kann, eine immunologische Reaktion in einem solchen Individuum gegen ein BASB034-Polynukleotid und/oder ein daraus codiertes Polypeptid induziert, worin die Zusammensetzung ein rekombinantes BASB034-Polynukleotid und/oder daraus codiertes Polypeptid umfaßt und/oder DNA und/oder RNA umfaßt, die ein Antigen des BASB034-Polynukleotids, daraus codierten Polypeptids oder eines anderen Polypeptids der Erfindung codiert und exprimiert. Die immunologische Reaktion kann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden und kann die Form von Antikörperimmunität und/oder zellulärer Immunität annehmen, wie zelluläre Immunität, die aus CTL oder CD4+ T-Zellen entstammt.
Ein BASB034-Polypeptid oder ein Fragment davon kann mit Coprotein oder einer chemischen Einheit fusioniert werden, die selbst Antikörper erzeugen kann oder nicht, aber das erste Protein stabilisieren kann und ein fusioniertes oder modifiziertes Protein erzeugen kann, das antigene und/oder immunogene Eigenschaften und bevorzugt Schutzeigenschaften aufweisen wird. Daher umfaßt fusioniertes rekombinantes Protein bevorzugt zusätzlich ein antigenes Coprotein, wie Lipoprotein D aus Haemophilus influenzae, Glutathion-S-Transferase (GST) oder beta-Galactosidase, oder jedes andere relativ große Coprotein, das das Protein solubilisiert und seine Erzeugung und Reinigung erleichtert. Außerdem kann das Coprotein als Hilfsstoff im Sinne der Bereitstellung einer allgemeinen Stimulierung des Immunsystems des Organismus wirken, der das Protein empfängt. Das Coprotein kann entweder an den Amino- oder Carboxy-Terminus des ersten Proteins gebunden werden.
Bereitgestellt durch diese Erfindung werden Zusammensetzungen, insbesondere Impfstoffzusammensetzungen, und Verfahren, die die Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung und immunstimulierende DNA-Sequenzen umfassen, wie die in Y. Sato et al. beschriebenen, Science 273: 352 (1996).
Ebenfalls bereitgestellt durch diese Erfindung werden Verfahren unter Verwendung des beschriebenen Polynukleotids oder besonderer Fragmente davon, von denen gezeigt wurde, daß sie nicht-variable Regionen von bakteriellen Zelloberflächenproteinen codieren, in Polynukleotidkonstrukten, die in solchen genetischen Immunisierungsexperimenten in Tiermodellen der Infektion mit Moraxella catarrhalis verwendet werden. Solche Experimente werden besonders nützlich zur Identifizierung von Proteinepitopen sein, die eine prophylaktische oder therapeutische Immunreaktion hervorrufen können. Es wird angenommen, daß dieser Ansatz die anschließende Herstellung monoklonaler Antikörper von besonderem Wert erlauben wird, die aus dem notwendigen Organ des Tieres stammen, das erfolgreich einer Infektion widersteht oder diese klärt, zur Entwicklung von prophylaktischen Mitteln oder therapeutischen Behandlungen bakterieller Infektionen, insbesondere Infektionen mit Moraxella catarrhalis, in Säugetieren, insbesondere Menschen.
Die Erfindung schließt ebenfalls eine Impfstofformulierung ein, die ein immunogenes rekombinantes Polypeptid und/oder Polynukleotid der Erfindung zusammen mit einem geeigneten Träger, wie mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, umfaßt. Da die Polypeptide und Polynukleotide im Magen abgebaut werden können, wird jedes bevorzugt parenteral verabreicht, einschließlich z.B. einer Verabreichung, die subkutan, intramuskulär, intravenös oder intradermal ist. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidantien, Puffer, bakteriostatische Verbindungen und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch zur Körperflüssigkeit, bevorzugt dem Blut, des Individuums machen; und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel oder Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern angeboten werden, z.B. versiegelten Ampullen und Fläschchen, und können in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers unmittelbar vor der Verwendung erfordert.
Die Impfstofformulierung der Erfindung kann ebenfalls Hilfsstoffsysteme zur Steigerung der Immunogenität der Formulierung einschließen. Bevorzugt ruft das Hilfsstoffsystem vorzugsweise eine Reaktion vom TH1-Typ hervor.
Eine Immunreaktion kann allgemein in zwei extreme Kategorien unterteilt werden, die eine humorale oder eine zellvermittelte Immunreaktion sind (traditionell durch Antikörper- bzw. zelluläre Effektormechanismen des Schutzes gekennzeichnet). Diese Kategorien der Reaktion werden als Reaktionen vom TH1-Typ (zellvermittelte Reaktion) und Immunreaktion vom TH2-Typ (humorale Reaktion) bezeichnet.
Extreme Immunreaktionen vom TH1-Typ können durch die Erzeugung von antigenspezifischen, Haplotyp-beschränkten cytotoxischen T-Lymphozyten und natürliche Killerzell-Reaktionen gekennzeichnet sein. In Mäusen sind Reaktionen vom TH1-Typ häufig durch die Erzeugung von Antikörpern vom IgG2a-Untertyp gekennzeichnet, während diese im Menschen Antikörpern vom IgG1-Typ entsprechen. Immunreaktionen vom TH2-Typ sind durch die Erzeugung einer großen Reihe von Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet, in Mäusen einschließlich IgG1, IgA und IgM.
Man kann annehmen, daß die treibende Kraft hinter der Entwicklung dieser zwei Typen von Immunreaktionen Cytokine sind. Hohe Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ neigen dazu, die Induzierung von zellvermittelten Immunreaktionen auf ein gegebenes Antigen zu begünstigen, während hohe Mengen von Cytokinen vom TH2-Typ dazu neigen, die Induzierung humoraler Immunreaktionen gegen das Antigen zu begünstigen.
Die Unterscheidung von Immunreaktionen vom TH1- und TH2-Typ ist nicht absolut. In der Realität wird ein Individuum eine Immunreaktion unterstützen, die als vorherrschend TH1 oder vorherrschend TH2 beschrieben wird. Jedoch ist es häufig zweckmäßig, die Familien von Cytokinen in bezug auf das zu betrachten, was in murinen CD4 +ve T-Zell-Klonen von Mosmann und Coffman beschrieben wurde (T. R. Mosmann und R. L. Coffman (1989), TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, S. 145–173). Traditionell sind Reaktionen vom TH1-Typ mit der Erzeugung der INF-γ- und IL-2-Cytokinen durch T-Lymphozyten verbunden. Andere Cytokine, die häufig direkt mit der Induzierung von Immunreaktionen vom TH1-Typ verbunden sind, werden nicht durch T-Zellen erzeugt, wie IL-12. Im Gegensatz sind Reaktionen vom TH2-Typ mit der Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13 verbunden.
Es ist bekannt, daß bestimmte Impfstoffhilfsstoffe besonders geeignet zur Stimulation von Cytokinreaktionen vom entweder TH1- oder TH2-Typ sind. Traditionell schließen die besten Indikatoren des TH1:TH2-Gleichgewichts der Immunreaktion nach einer Impfung oder Infektion die direkte Messung der Erzeugung von TH1- oder TH2-Cytokinen durch T-Lymphozyten in vitro nach Restimulation mit Antigen und/oder die Messung des IgG1:IgG2a-Verhältnisses von antigenspezifischen Antikörperreaktionen ein.
So ist ein Hilfsstoff vom TH1-Typ ein solcher, der vorzugsweise isolierte T-Zell-Populationen stimuliert, um hohe Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ bei Restimulation mit Antigen in vitro zu erzeugen, und die Entwicklung von sowohl CD8+ cytotoxischen T-Lymphozyten als auch antigenspezifischen Immunglobulinreaktionen fördert, die mit dem Isotyp vom TH1-Typ verbunden sind.
Hilfsstoffe, die vorzugsweise die TH1-Zellreaktion stimulieren können, werden in WO 94/00153 und WO 95/17209 beschrieben.
3-Des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL) ist ein solcher Hilfsstoff. Dies ist aus GB 2220211 (Ribi) bekannt. Chemisch ist es eine Mischung aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten und wird von Ribi Immunochem, Montana, hergestellt. Eine bevorzugte Form von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A wird in EP 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA) offenbart.
Bevorzugt sind die Partikel von 3D-MPL klein genug, um durch eine 0,22 μm-Membran sterilfiltriert zu werden ( EP 0 689 454 ). 3D-MPL wird im Bereich von 10 bis 100 μg, bevorzugt 25 bis 50 μg pro Dosis vorhanden sein, worin das Antigen typischerweise in einem Bereich von 2 bis 50 μg pro Dosis vorhanden sein wird.
Ein anderer bevorzugter Hilfsstoff umfaßt QS21, eine HPLC-gereinigte nicht-toxische Fraktion, die aus der Rinde von Quillaja Saponaria Molina stammt. Gegebenenfalls kann dies mit 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL) vermischt werden, gegebenenfalls zusammen mit einem Träger.
Das Verfahren zur Herstellung von QS21 wird in US-PS 5 057 540 offenbart.
Nicht-reaktogene Hilfsstofformulierungen, die QS21 enthalten, wurden zuvor beschrieben (WO 96/33739). Es wurde gezeigt, daß solche Formulierungen, die QS21 und Cholesterin umfassen, erfolgreiche TH1-stimulierende Hilfsstoffe sind, wenn sie zusammen mit einem Antigen formuliert werden.
Weitere Hilfsstoffe, die bevorzugte Stimulatoren der TH1-Zellreaktion sind, schließen immunmodulatorische Oligonukleotide ein, z.B. unmethylierte CpG-Sequenzen, wie in WO 96/02555 offenbart.
Kombinationen unterschiedlicher TH1-stimulierender Hilfsstoffe, wie die hier oben genannten, werden ebenfalls als Bereitstellung eines Hilfs stoffs erwogen, der ein vorzugsweiser Stimulator der TH1-Zellreaktion ist. Z.B. kann QS21 zusammen mit 3D-MPL formuliert werden. Das Verhältnis von QS21:3D-MPL wird typischerweise in der Größenordnung von 1:10 bis 10:1 sein, bevorzugt 1:5 bis 5:1 und häufig im wesentlichen 1:1. Der bevorzugte Bereich für einen optimalen Synergismus ist 2,5:1 bis 1:1 3D-MPL:QS21.
Bevorzugt ist ebenfalls ein Träger in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung vorhanden. Der Träger kann eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder ein Aluminiumsalz sein, wie Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid.
Eine bevorzugte Öl-in-Wasser-Emulsion umfaßt ein metabolisierbares Öl, wie Squalen, alpha-Tocopherol und Tween 80. In einem besonders bevorzugten Aspekt werden die Antigene in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung mit QS21 und 3D-MPL in einer solchen Emulsion kombiniert. Zusätzlich kann die Öl-in-Wasser-Emulsion Span 85 und/oder Lecithin und/oder Tricaprylin enthalten.
Typischerweise werden QS21 und 3D-MPL für die menschliche Verabreichung in einem Impfstoff im Bereich von 1 bis 200 μg, wie 10 bis 100 μg, bevorzugt 10 bis 50 μg pro Dosis vorhanden sein. Typischerweise wird die Öl-in-Wasser-Emulsion 2 bis 10% Squalen, 2 bis 10% alpha-Tocopherol und 0,3 bis 3% Tween 80 umfassen. Bevorzugt ist das Verhältnis von Squalen:alpha-Tocopherol gleich oder weniger als 1, da dies eine stabilere Emulsion liefert. Span 85 kann ebenfalls in einer Menge von 1% vorhanden sein. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, daß die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung ferner einen Stabilisator enthalten.
Nicht-toxische Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten bevorzugt ein nicht-toxisches Öl, z.B. Squalan oder Squalen, einen Emulgator, z.B. Tween 80, in einem wäßrigen Träger. Der wäßrige Träger kann z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung sein.
Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine polyvalente Impfstoffzusammensetzung bereit, die eine Impfstofformulierung der Erfindung in Kombination mit anderen Antigenen umfaßt, insbesondere Antigenen, die zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten und verwandten Zuständen nützlich sind. Eine solche polyvalente Impfstoffzusammensetzung kann einen TH1-induzierenden Hilfsstoff wie hier zuvor beschrieben einschließen.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte BASB034-Polypeptide und -Polynukleotide beschrieben wurde, versteht es sich, daß dies Fragmente der natürlich vorkommenden Polypeptide und Polynukleotide und ähnliche Polypeptide und Polynukleotide mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen umfaßt, die nicht substantiell die immunogenen Eigenschaften der rekombinanten Polypeptide oder Polynukleotide beeinträchtigen.
Zusammensetzungen, Kits und Verabreichung
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein BASB034-Polynukleotid und/oder ein BASB034-Polypeptid zur Verabreichung an eine Zelle oder an einen mehrzelligen Organismus umfassen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Zusammensetzungen, die ein Polynukleotid und/oder ein Polypeptid wie hier erörtert umfassen. Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können in Kombination mit (einem) nicht-sterilen oder sterilen Träger(n) zur Verwendung mit Zellen, Geweben oder Organismen eingesetzt werden, wie mit einem pharmazeutischen Träger, der zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist. Solche Zusammensetzungen umfassen z.B. ein Medienadditiv oder eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten. Solche Träger können ohne Beschränkung einschließen: Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol oder Kombinationen daraus. Die Formulierung sollte für den Verabreichungsmodus passen. Die Erfindung betrifft ferner diagnostische und pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvorgenannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind.
Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie mit therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in jeder effektiven, zweckmäßigen Weise verabreicht werden, einschließlich z.B. Verabreichung durch u.a. topische, orale, anale, vaginale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intranasale oder intradermale Wege.
In der Therapie oder als Prophylaktikum kann der Wirkstoff an ein Individuum als injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, z.B. als sterile wäßrige Dispersion, bevorzugt isotonisch.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids, wie die lösliche Form eines Polypeptids und/oder Polynukleotids der vorliegenden Erfindung, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten umfassen. Solche Träger schließen ohne Beschränkung Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen daraus ein. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind. Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie mit therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die Zusammensetzung wird dem Verabreichungsweg angepaßt werden, z.B. auf einem systemischen oder oralen Weg. Bevorzugte Formen der systemischen Verabreichung schließen die Injektion ein, typischerweise durch intravenöse Injektion. Andere Injektionswege, wie die subkutane, intramuskuläre oder intraperitoneale, können verwendet werden. Alternative Mittel zur systemischen Verabreichung schließen die transmukosale und transdermale Verabreichung unter Verwendung von Durchdringungsmitteln ein, wie Gallensalzen oder Fusidinsäure oder anderen Detergenzien. Falls ein Polypeptid oder andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer enterischen oder einer verkapselten Formulierung formuliert werden können, kann zusätzlich ebenfalls die orale Verabreichung möglich sein. Die Verabreichung dieser Verbindungen kann ebenfalls topisch und/oder lokalisiert sein, in Form von Salben, Pasten, Gelen, Lösungen, Pulvern und dgl.
Zur Verabreichung an Säugetiere und insbesondere Menschen wird erwartet, daß die tägliche Dosierungsmenge des aktiven Mittels 0,01 bis 10 mg/kg sein wird, typischerweise ca. 1 mg/kg. Der Arzt wird in jedem Fall die tatsächliche Dosierung bestimmen, die für ein Individuum am besten geeignet ist und mit dem Alter, Gewicht und der Reaktion des besonderen Individuums variieren wird. Die obigen Dosierungen sind exemplarisch für den durchschnittlichen Fall. Es kann natürlich individuelle Fälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche angezeigt sind, und solche sind im Umfang dieser Erfindung.
Der erforderliche Dosierungsbereich hängt von der Wahl des Peptids, dem Verabreichungsweg, der Natur der Formulierung, der Natur des Zustands des Patienten und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Geeignete Dosierungen sind jedoch im Bereich von 0,1–100 μg/kg Patient.
Eine Impfstoffzusammensetzung ist zweckmäßig in injizierbarer Form. Zweckmäßige Hilfsstoffe können eingesetzt werden, um die Immunreaktion zu steigern. Eine geeignete Einheitsdosis zur Impfung beträgt 0,5–5 μg/kg von Antigen, und eine solche Dosis wird bevorzugt 1- bis 3-mal und mit einem Intervall von 1 bis 3 Wochen verabreicht. Mit dem angegebenen Dosisbereich werden keine nachteiligen toxikologischen Wirkungen für die Verbindungen der Erfindung beobachtet werden, die ihre Verabreichung an geeignete Individuen ausschließen würden.
Weitere Variationen der erforderlichen Dosierung werden jedoch im Hinblick auf die Variabilität der verfügbaren Verbindungen und die unterschiedlichen Wirksamkeiten der verschiedenen Verabreichungswege erwartet. Zum Beispiel würde erwartet, daß die orale Verabreichung höhere Dosierungen als die Verabreichung durch intravenöse Injektion erfordern würde. Variationen dieser Dosierungsmengen können unter Verwendung empirischer Standardroutinen zur Optimierung eingestellt werden, wie es allgemein fachbekannt ist.
Sequenzdatenbanken, Sequenzen in einem faßbaren Medium und Algorithmen
Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen bilden eine wertvolle Informationsquelle, mit der ihre 2- und 3-dimensionalen Strukturen bestimmt sowie weitere Sequenzen ähnlicher Homologie identifiziert werden können. Diese Ansätze werden am leichtesten durch Speicherung der Sequenz in einem computerlesbaren Medium und anschließende Verwendung der gespeicherten Daten in einem bekannten makromolekularen Strukturprogramm oder zur Recherche in einer Sequenzdatenbank unter Verwendung allgemein bekannter Recherchenwerkzeuge, wie mit dem GCG-Programmpaket, erleichtert.
Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung werden Verfahren zur Analyse von Merkmalssequenzen oder -ketten, insbesondere genetischen Sequenzen oder codierten Proteinsequenzen. Bevorzugte Verfahren der Sequenzanalyse schließen z.B. Verfahren der Sequenzhomologieanalyse ein, wie Identitäts- und Ähnlichkeitsanalyse, DNA-, RNA- und Proteinstrukturanalyse, Sequenzaufbau, kladistische Analyse, Sequenzmotivanalyse, Bestimmung des offenen Leserasters, Nukleinsäure-Basenzählung, Analyse der Codonenverwendung, Zurechtstutzen der Nukleinsäurebasen und sequenziere0nde Chromatogrammpeakanalyse.
Ein computerbasiertes Verfahren wird zur Durchführung der Homologieidentifizierung bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte aus: Bereitstellen einer ersten Polynukleotidsequenz, die die Sequenz eines Polynukleotids der Erfindung umfaßt, in einem computerlesbaren Medium; und Vergleichen der ersten Polynukleotidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung von Homologie.
Ein computerbasiertes Verfahren wird ebenfalls zur Durchführung der Homologieidentifikation bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt aus: Bereitstellen einer ersten Polypeptidsequenz, die die Sequenz eines Polypeptids der Erfindung umfaßt, in einem computerlesbaren Medium; und Vergleichen der ersten Polypeptidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung von Homologie.
Alle Veröffentlichungen und Literaturstellen, die ohne Beschränkung Patente und Patentanmeldungen einschließen, die in dieser Beschreibung zitiert werden, werden hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Literaturstelle spezifisch und individuell als durch Verweis hier vollständig eingeführt angegeben wäre. Jede Patentanmeldung, deren Priorität diese Anmeldung beansprucht, wird ebenfalls durch Verweis in ihrer Gesamtheit in der oben für Veröffentlichungen und Literaturstellen beschrieben Weise eingeführt.
Definitionen
"Identität", wie es fachbekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, wie sie durch Vergleich der Sequenzen bestimmt wird. Auf diesem Gebiet bezeichnet "Identität" ebenfalls den Grad der Sequenzverwandtheit zwischen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, wie es durch die Übereinstimmung zwischen Ketten solcher Sequenzen bestimmt wird. "Identität" kann leicht durch bekannte Verfahren berechnet werden, die ohne Beschränkung diejenigen einschließen, die beschrieben werden in "Computational Molecular Biology", A. M. Lesk, Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, D. W. Smith, Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, A. M. Griffin und H. G. Griffin, Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heine, Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, M. Gribskov und J. Devereux, Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991; und H. Carillo und D. Lipman, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Verfahren zur Identitätsbestimmung werden geschaffen, um die größte Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen zu ergeben. Außerdem sind Verfahren zur Identitätsbestimmung in öffentlich verfügbaren Computerprogrammen codifiziert. Computerprogrammverfahren zur Identitätsbestimmung zwischen zwei Sequenzen schließen ohne Beschränkung das GAP-Programm im GCG-Programmpaket (J. Devereux et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (S. F. Altschul et al., J. Molec. Biol. 215: 403–410 (1990)) und FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444–2448 (1988)) ein. Die BLAST-Familie von Programmen ist öffentlich erhältlich von NCBI und aus anderen Quellen (BLAST Manual, S. Altschul et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; S. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990)). Der allgemein bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenfalls zur Identitätsbestimmung verwendet werden.
Parameter für den Polypeptid-Sequenzvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443–453 (1970)
Vergleichsmatrix: BLOSSUM62 von Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915–10919 (1992)
Lücken-Strafpunkte: 8
Lückenlänge-Strafpunkte: 2
Ein für diese Parameter nützliches Programm ist öffentlich verfügbar als "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison WI. Die zuvor genannten Parameter sind die Standardparameter für Peptidvergleiche (neben keinem Strafpunkt für Endlücken).
Parameter für den Polynukleotidvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443–453 (1970)
Vergleichsmatrix: Übereinstimmungen = +10, Fehlübereinstimmung = 0
Lücken-Strafpunkte: 50
Lückenlänge-Strafpunkte: 3
Verfügbar als "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison WI. Dies sind die Standardparameter für Nukleinsäurevergleiche.
Eine bevorzugte Bedeutung von "Identität" für Polynukleotide und Polypeptide, je nach Fall, wird nachfolgend unter den Ziffern (1) und (2) bereitgestellt.

(1) Polynukleotid-Ausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polynukleotid ein, das eine Polynukleotidsequenz mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100% Identität mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO: 1 umfaßt, worin die Polynukleotidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO: 1 sein kann oder bis zu einer bestimmten ganzzahligen Anzahl von Nukleotidveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Nukleotiddeletion, -substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenznukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleotiden in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl von Nukleotidveränderungen durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO: 1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO: 1 bestimmt wird, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl von Nukleotidveränderungen ist, x_n die Gesamtzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO: 1 ist, y 0,50 für 50%, 0,60 für 60%, 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85%, 0,90 für 905, 0,95 für 95%, 0,97 für 97% oder 1,00 für 100% ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_n abgerundet wird. Veränderungen einer Polynukleotidsequenz, die das Polypeptid mit SEQ ID NO: 2 codiert, können Unsinn-, Fehlsinn- oder Rasterverschiebungsmutationen in dieser codierenden Sequenz erzeugen und dadurch das Polypeptid verändern, das durch das Polynukleotid im Anschluß an solche Veränderungen codiert wird.

Als Beispiel kann eine Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO: 1 sein, d.h. sie kann zu 100% identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzzahligen Anzahl von Nukleinsäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100% Identität ist. Solche Veränderungen sind aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Nukleinsäuredeletion, -substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenz-Polynukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleinsäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO: 1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO: 1 bestimmt, oder: nn ≤ xn – (xn·y), worin n_n die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen ist, x_n die Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO: 1 ist, y z.B. 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85% etc. ist, · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_n abgerundet wird.

(2) Polypeptidausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polypeptid ein, das ein Polypeptid mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100% Identität mit einer Polypeptid-Referenzsequenz von SEQ ID NO: 2 umfaßt, worin die Polypeptidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO: 2 sein kann oder bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativen und nicht-konservativen Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenz-Polypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl von Aminosäureveränderungen durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO: 2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO: 2 bestimmt wird, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO: 2 ist, y 0,50 für 50%, 0,60 für 60%, 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85%, 0,90 für 90%, 0,95 für 95%, 0,97 für 97% oder 1,00 für 100% ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_a abgerundet wird.

Als Beispiel kann eine Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO: 2 sein, d.h. sie kann zu 100% identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100% Identität ist. Solche Veränderungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativen und nicht-konservativen Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenz-Polypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Aminosäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO: 2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO: 2 bestimmt, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO: 2 ist, y z.B. 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85% etc. ist, und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_a abgerundet wird.
"Individuum"/"Individuen", wenn hier mit Bezug auf einen Organismus verwendet, bezeichnet einen mehrzelligen Eukaryonten, der ohne Beschränkung ein Metazoon, ein Säugetier, ein Rind, Ziege/Schaf, einen Affen, einen Primaten und einen Menschen einschließt.
"Isoliert" bedeutet "mit menschlicher Hand" aus seinem natürlichen Zustand verändert, d.h. falls es in der Natur vorkommt, wurde es aus seiner natürlichen Umgebung verändert oder entfernt oder beides. Z.B. ist ein in einem lebenden Organismus natürlich vorhandenes Polynukleotid oder Polypeptid nicht "isoliert", aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, das von den koexistierenden Materialien seines natürlichen Zustands getrennt wird, ist "isoliert", wie der Begriff hier eingesetzt wird. Außerdem ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, das in einen Organismus durch Transformation, genetische Manipulation oder durch jedes andere rekombinante Verfahren eingeführt wird, "isoliert", selbst wenn es noch in dem Organismus vorhanden ist, wobei der Organismus lebend oder nicht-lebend sein kann.
"Polynukleotid(e)" bezeichnet allgemein jedes Polyribonukleotid oder Polydesoxyribonukleotid, das unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann, einschließlich ein- und doppelsträngiger Regionen.
"Variante" bezeichnet ein Polynukleotid oder Polypeptid, das sich von einem Referenz-Polynukleotid oder -Polypeptid unterscheidet, aber wesent liche Eigenschaften beibehält. Eine typische Variante eines Polynukleotids unterscheidet sich von einem anderen Referenz-Polynukleotid in der Nukleotidsequenz. Veränderungen in der Nukleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch das Referenz-Polynukleotid codiert wird, verändern oder nicht. Nukleotidveränderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und -trunkierungen im Polypeptid führen, das durch die Referenzsequenz codiert wird, wie nachfolgend erörtert. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich von einem anderen Referenz-Polypeptid in der Aminosäuresequenz. Allgemein sind Unterschiede beschränkt, so daß die Sequenzen des Referenz-Polypeptids und der Variante sehr ähnlich insgesamt und in vielen Regionen identisch sind. Eine Variante und ein Referenz-Polypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen in jeder Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder inserierter Aminosäurerest kann ein solcher sein, der durch den genetischen Code codiert wird oder nicht. Eine Variante eines Polynukleotids oder Polypeptids kann eine natürlich vorkommende sein, wie eine Allelvariante, oder sie kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, daß sie natürlich auftritt. Nicht-natürlich auftretende Varianten von Polynukleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenesetechniken oder durch direkte Synthese hergestellt werden.
"Krankheit(en)" bezeichnet jede Krankheit, die durch Infektion mit einem Bakterium verursacht wird oder damit verbunden ist, einschließlich z.B. Mittelohrentzündung bei Kleinkindern und Kindern, Lungenentzündung bei älteren Menschen, Sinusitis, Krankenhausinfektionen und invasive Krankheiten, chronische Mittelohrentzündung mit Gehörverlust, Flüssigkeitsansammlung im Mittelohr, Hörnervschädigung, Verzögerung des Spracherlernens, Infektion der oberen Atemwege und Entzündung des Mittelohrs.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für die Fachleute allgemein bekannt und Routine sind, außer wenn im Detail anders beschrieben. Die Beispiele sind illustrativ, aber beschränken nicht die Erfindung.
Beispiel 1:
Auffinden und bestätigende DNA-Sequenzierung des BASB034-Gens aus Moraxella catarrhalis Stamm ATCC 43617
Das BASB034-Gen wurde zuerst in der Incyte PathoSeq-Datenbank gefunden, die unvollständige genomische DNA-Sequenzen des Moraxella catarrhalis- Stammes ATCC 43617 (ebenfalls als Stamm Mc2931 bezeichnet) enthält. Die Translation der BASB034-Polynukleotidsequenz zeigte eine signifikante Ähnlichkeit (42% Identität in einer Überlappung mit 214 Aminosäuren) mit einem Phospholipase A-Protein der äußeren Membran von Klebsiella pneumoniae.
Die Sequenz des BASB034-Gens wurde weiter experimentell bestätigt. Für diesen Zweck wurde genomische DNA aus 10¹⁰ Zellen der M. catarrhalis-Zellen (Stamm ATCC 43617) unter Verwendung des genomischen DNA-Extraktions-Kits von QIAGEN (Qiagen GmbH) extrahiert, und 1 μg dieses Materials wurde der Polymerasekettenreaktion-DNA-Amplifikation unter Verwendung der Primer E481124 (5'-GAT-TTA-AGA-GTA-TGT-TAT-GAT-3') [SEQ ID NO: 9] und E481125 (5'-GTA-TGG-GTT-GAT-CAA-ATA-CAG-3') [SEQ ID NO: 10] unterworfen. Dieses PCR-Produkt wurde an einer Vorrichtung Biorobot 9600 (Qiagen GmbH) gereinigt und der DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Big Dye Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer) und eines DNA-Sequenzierers ABI 377/PRISM unterworfen. Die DNA-Sequenzierung wurde an beiden Strängen mit einer Redundanz von 2 durchgeführt, und die Sequenz voller Länge wurde unter Verwendung der Sequen cher^TM-Software (Applied Biosystems) zusammengesetzt. Die resultierende DNA-Sequenz erwies sich als 100% identisch mit SEQ ID NO: 1.
Beispiel 2:
Variabilitätsanalyse des BASB034-Gens zwischen mehreren Moraxella catarrhalis-Stämmen
2A: Restriktionsfragmentlängenanalyse (RFLP)
Genomische DNA wurde aus 16 M. catarrhalis-Stämmen (dargestellt in Tabelle 1) wie nachfolgend beschrieben extrahiert. M. catarrhalis wurde auf einzelne Kolonien auf BHI-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Drei oder vier einzelne Kolonien wurden gepickt und zur Impfung einer ~1,5 ml BHI-(Hirn-Herz-Infusion)-Bouillon-Impfkultur verwendet, die über Nacht in einem Schüttelinkubator mit ~300 U/min bei 37°C gezüchtet wurde. Ein 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, der ~150 ml BHI-Bouillon enthielt, wurde mit der Impfkultur geimpft und für ~12 bis 16 Stunden bei 37°C in einem Schüttelinkubator mit ~175 U/min gezüchtet, um Zellmasse zur DNA-Isolierung zu erzeugen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren in einem Sorvall GSA-Rotor mit ~2000 × g für 15 Minuten bei Raumtemperatur aufgefangen. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet in ~5,0 ml sterilem Wasser suspendiert. Ein gleiches Volumen von Lysepuffer (200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5% (G/V) SDS, 0,5% (V/V) 2-Mercaptoethanol und 250 μg/ml Proteinase K) wurde hinzugegeben und die Zellen durch vorsichtiges Bewegen und Verreiben suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann ~12 Stunden bei 50°C inkubiert, um die Bakterien zu lysieren und chromosomale DNA freizusetzen. Proteinhaltiges Material wurde durch Zugabe von 5,0 ml gesättigtem NaCl (~6,0 M in sterilem Wasser) und Zentrifugieren mit ~5 500 × g in einem Sorvall SS34-Rotor bei Raumtemperatur ausgefällt. Chromosomale DNA wurde aus dem geklärten Überstand durch Zugabe von 2 Volumina 100% Ethanol ausgefällt. Aggregierte DNA wurde aufgefangen und unter vorsichtigem Bewegen in einem kleinen Volumen einer 70%igen Ethanol-Lösung gewaschen. Gereinigte chromosomale DNA wurde in sterilem Wasser suspendiert und über Nacht bei 4°C durch vorsichtiges Schaukeln gelöst/dispergiert. Die Konzentration von gelöster DNA wurden spektrophotometrisch bei 260 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,0 O.D.-Einheiten ~50 μg/ml bestimmt.
Dieses Material wurde als nächstes der PCR-Amplifikation unterworfen, wobei die MC-Pla-BamF-Oligonukleotide (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC CAA GCT GTA CCA AAT CCT GTG GCA TTT GTT G-3') [SEQ ID NO: 11] und MC-Pla-SalRC (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TAG ACC CAT CCA GTC GTT AAG CAT AAG-3') [SEQ ID NO: 12] verwendet wurden. Die entsprechenden BASB034-Gen-Amplicons wurden dann unabhängig unter Verwendung von Restriktionsenzymen (HphI, AluI, RsaI, EcoRV, Sau3A1) der Hydrolyse unterworfen, und die Restriktionsprodukte wurden durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie getrennt, wie beschrieben in "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", zweite Auflage, Hrsg.: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Press 1989. Die Photographien der resultierenden Elektrophoresegele sind in 1 dargestellt. Für jeden Stamm wurden RFLP-Muster, die den 6 Restriktionsenzymen entsprechen, bewertet und kombiniert. Gruppen von Stämmen, die eine identische Kombination von RFLP-Mustern teilen, wurden dann definiert. Unter Verwendung dieser Methodik fielen die in dieser Untersuchung getesteten Stämme in 3 genomische Gruppen (Gruppe 1: Mc2931, Mc2904, Mc2905, Mc2907, Mc2909, Mc2910, Mc2911, Mc2912, Mc2926, Mc2931, Mc2956, Mc2969, Mc2975; Gruppe 2: Mc2906, Mc2913; Gruppe 3: Mc2908). (Mc2960 versagte in der Amplifikation und wurde entsprechend nicht klassifiziert.) Diese Daten stützen, daß die in dieser Untersuchung verwendete Population von Moraxella catarrhalis eine beschränkte Nukleotidsequenz-Diversität für das BASB034-Gen zeigt.
2B: DNA-Sequenzzierung in anderen Stämmen
Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen experimentellen Verfahrens wurde die Sequenz des BASB034-Gens auch für drei zusätzliche Moraxella catarrhalis-Stämme bestimmt. Die Nukleotidsequenzen des BASB034-Gens der Stämme Mc2908, Mc2913 und Mc2969, die repräsentativ für die drei zuvor identifizierten genomischen Gruppen sind, sind in SEQ ID NO: 3, 5 bzw. 7 gezeigt. Diese Nukleotidsequenzen wurden zu Aminosäuresequenzen translatiert, die in SEQ ID NO: 4, 6 bzw. 8 gezeigt sind. Unter Verwendung des MegAlign-Programms aus dem DNASTAR Lasergene-Paket wurde eine multiple Angleichung der Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 1, 3, 5 und 7 durchgeführt und ist in 2 gezeigt. Ein paarweiser Vergleich der Identitäten ist in Tabelle 2 zusammengefaßt, die zeigt, daß die vier Gensequenzen der BASB034-Nukleotide alle ähnlich auf einer Identitätsebene von größer als 98% sind. Unter Verwendung des gleichen Programms wurde eine multiple Angleichung der Proteinsequenzen von SEQ ID NO: 2, 4, 6 und 8 durchgeführt und ist in 3 gezeigt. Ein paarweiser Vergleich der Identitäten ist in Tabelle 3 zusammengefaßt, die zeigt, daß die vier BASB034-Proteinsequenzen alle ähnlich auf einer Identitätsebene von größer als 98% sind. Zusammen zeigen diese Daten eine sehr starke Sequenzerhaltung des BASB034-Gens unter Moraxella catarrhalis-Stämmen.
Tabelle 1: Merkmale der in dieser Untersuchung verwendeten Moraxella catarrhalis-Stämme
Tabelle 2: Paarweise Identitäten der BASB034-Polynukleotidsequenzen (in %)
Tabelle 3: Paarweise Identitäten der BASB034-Polypeptidsequenzen (in %)
Beispiel 3: Konstruktion von Plasmid zur Expression von rekombinantem BAS8034
A: Klonierung von BASB034
Die BamHI- und SalI-Restriktionsorte, konstruiert in die vorwärts ([SEQ ID NO: 11]) bzw. reversen ([SEQ ID NO: 12]) Amplifikationsprimer erlaubten eine direktionale Klonierung eines BASB034-PCR-Produkts in das kommerziell erhältliche E. coli-Expressionsplasmid pQE30 (QiaGen, ampicillinresistent), so daß ein reifes BASB034-Protein als ein Fusionsprotein exprimiert werden konnte, das ein (His)6-Affinitätschromatographie-Tag am N-Terminus enthielt. Das BASB034-PCR-Produkt wurde aus der Amplifikationsreaktion unter Verwendung von Spin-Säulen auf Gelbasis (QiaGen) gemäß Herstelleranleitungen gereinigt. Zur Erzeugung der erforderlichen BamHI- und SalI-Enden, die zur Klonierung notwendig sind, wurde gereinigtes PCR-Produkt sequenziell vollständig mit BamHI- und SalI-Restriktionsenzymen gemäß Herstellerempfehlungen (Life Technologies) verdaut. Nach dem ersten Restriktionsverdau wurde das PCR-Produkt über eine Spin-Säule wie oben gereinigt, um Salze zu entfernen, und in sterilem Wasser vor dem zweiten Enzymverdau eluiert. Das verdaute DNA-Fragment wurde erneut unter Verwendung von Spin-Säulen auf Kieselgelbasis vor der Ligation mit dem pQE30-Plasmid gereinigt.
B: Erzeugung von Expressionsvektor
Zur Herstellung des Expressionsplasmids pQE30 zur Ligation wurde es in ähnlicher Weise zur Vollständigkeit mit sowohl BamHI als auch SalI verdaut und dann mit Kälberdarmphosphatase (CIP, ~0,02 Einheiten/pmol des 5'-Endes, Life Technologies) gemäß Herstelleranweisung behandelt, um eine Selbstligation zu verhindern. Ein etwa 5-facher molarer Überschuß des verdauten Fragments zum hergestellten Vektor wurde zur Programmierung der Ligationsreaktion verwendet. Eine standardmäßige Ligationsreaktion mit ~20 μl (~16°C, ~16 Stunden) unter Verwendung von fachbekannten Verfahren wurde unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (~2,0 Einheiten/Reaktion, Life Technologies) durchgeführt. Eine Teilmenge der Ligation (~5 μl) wurde zur Transformation von elektrokompetenten M15(pREP4)-Zellen gemäß allgemein fachbekannten Verfahren verwendet. Nach einem ~2- bis 3-stündigigen Auswachszeitraum bei 37°C in ~1,0 ml LB-Bouillon wurden transformierte Zellen auf LB-Agarplatten ausplattiert, die Kanamycin (50 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) enthielten. Beide Antibiotika wurden in den Selektionsmedien eingeschlossen um sicherzustellen, daß alle transformierten Zellen sowohl das pREP4-Plasmid (KnR), das das lacIq-Gen trägt, das zur Unterdrückung der Expression zur IPTG-induzierbaren Expression der Proteine an pQE30 erforderlich ist, als auch das pQE30-BASB034-Plasmid (ApR) trugen. Platten wurden über Nacht bei 37°C für ~16 Stunden inkubiert. Individuelle KnR/ApR-Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern gepickt und zum "Patch"-Überimpfen von frischen LB KnR/ApR-Platten sowie einer ~1,0 ml LB KnR/ApR-Bouillonkultur verwendet. Sowohl die Patch-Platten als auch die Bouillonkultur wurden über Nacht bei 37°C in entweder einem Standardinkubator (Platten) oder einem Schüttel-Wasserbad inkubiert.
Eine PCR-Analyse auf Vollzellbasis wurde zur Verifizierung eingesetzt, das die Transformanten das BASB034-DNA-Insert enthielten. Hier wurde die ~1,0 ml Übernacht-LB Kn/Ap-Bouillonkultur in ein 1,5 ml-Polypropylenröhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugieren in einer Beckmann-Mikrozentrifuge aufgefangen (~3 min, Raumtemperatur, ~12 000 × g). Das Zellpellet wurde in ~200 μl sterilem Wasser suspendiert und eine ~10 μl Teilemenge verwendet, um eine PCR-Reaktion mit ~50 μl Endvolumen zu programmieren, die sowohl BASB034-Vorwärts- als auch -Rückwärts-Amplifikationsprimer enthielt. Die Endkonzentrationen der PCR-Reaktionskomponenten waren im wesentlichen die gleichen wie die in Beispiel 2 angegebenen, außer daß ~5,0 Einheiten Taq-Polymerase verwendet wurden. Der anfängliche Denaturierungsschritt mit 95°C wurde auf 3 Minuten erhöht, um eine thermische Zerstörung der bakteriellen Zellen und Freisetzung von Plasmid-DNA sicherzustellen. Ein Thermocycler ABI Modell 9700 und 32 Durchläufe eines dreistufigen thermischen Amplifikationsprofils, d.h. 95°C, 45 s; 55–58°C, 45 s; 72°C, 1 min, wurden zur Amplifikation des BASB034-Fragments aus den lysierten Transformantenproben verwendet. Nach der thermischen Amplifikation wurde eine Teilmenge von ~20 μl der Reaktion durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert (0,8% Agarose in einem Tris-Acetat-EDTA-(TAE)-Puffer). DNA-Fragmente wurden durch UV-Beleuchtung nach der Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärbung sichtbar gemacht. Ein DNA-Molekülgrößenstandard (1 Kb-Stufe, Life Technologies) wurde parallel zu den Testproben elektrophoretisch behandelt und verwendet, um die Größe der PCR-Produkte abzuschätzen. Transformanten, die das erwartete PCR-Produkt erzeugten, wurden als Stämme identifiziert, die ein BASB034-Expressionskonstrukt enthalten. Expressionsplasmid enthaltende Stämme wurden dann auf die induzierbare Expression von rekombinantem BASB034 analysiert.
C: Expressionsanalyse von PCR-positiven Transformanten
Für jede oben identifizierte PCR-positive Transformante wurden ~5,0 ml von LB-Bouillon, die Kanamycin (50 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) ent hielt, mit Zellen aus der Patch-Platte geimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln (~250 U/min) gezüchtet. Eine Teilmenge der Übernacht-Impfkultur (~1,0 ml) wurde in einen 125 ml-Erlenmeyerkolben übergeimpft, der ~25 ml LB Kn/Ap-Bouillon enthielt, und bei 37°C unter Schütteln (~250 U/min) gezüchtet, bis die Kulturturbidität einen OD 600-Wert von ~0,5 erreichte, das heißt die mittlere Log-Phase (gewöhnlich ca. 1,5–2,0 Stunden). Zu diesem Zeitpunkt wurde etwa die Hälfte der Kultur (~12,5 ml) in einen zweiten 125 ml-Kolben überführt und die Expression von rekombinantem BASB034-Protein durch Zugabe von IPTG (1,0 M Vorrat, hergestellt in sterilem Wasser, Sigma) auf eine Endkonzentration von 1,0 mM induziert. Die Inkubation sowohl der IPTG-induzierten als auch nicht-induzierten Kulturen setzte sich für weitere ~4 Stunden bei 37°C unter Schütteln fort. Proben (~1,0 ml) von sowohl induzierten als auch nicht-induzierten Kulturen wurden nach dem Induktionszeitraum entfernt und die Zellen durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für ~3 Minuten aufgefangen. Individuelle Zellpellets wurden in ~50 ml sterilem Wasser suspendiert, dann mit einem gleichen Volumen von 2 × Laemelli SDS-PAGE-Probenpuffer vermischt, der 2-Mercaptoethanol enthielt, und in ein siedendes Wasserbad für ~3 min zur Denaturierung des Proteins gehalten. Gleiche Volumina (~15 μl) sowohl der rohen IPTG-induzierten als auch der nicht-induzierten Zelllysate wurden auf 12% Tris/Glycin-Polyacrylamidgel (1 mm dicke Mini-Gele, Novex) in zweifacher Ausführung aufgetragen. Die induzierten und nicht-induzierten Lysatproben wurden zusammen mit vorangefärbten Molekulargewichtsmarkern (See-Blue, Novex) unter herkömmlichen Bedingungen unter Verwendung eines standardmäßigen SDS/Tris/Glycin-Laufpuffers (BioRad) elektrophoretisch behandelt. Nach der Elektrophorese wurde ein Gel mit Coomassie Brilliant Blue R250 (BioRad) angefärbt und dann entfärbt, um neue(s) BASB034 IPTG-induzierbare(s) Protein(e) zu visualisieren. Das zweite Gel wurde auf eine PVDF-Membran (0,45 μm Porengröße, Novex) für ~2 h bei 4°C unter Verwendung einer BioRad Mini-Protean II-Blotting-Vorrichtung und Towbin-Methanol (20%) Transferpuffer elektrogeblottet. Die Blockierung der Membran und Antikörperinkubationen wurden gemäß allgemein fachbekannten Verfahren durchgeführt. Ein monoklonaler Anti-RGS(His)3-Antikörper, gefolgt von einem zweiten Kaninchen-anti-Maus-Antikörper, konjugiert mit HRP (QiaGen), wurde zur Bestätigung der Expression und Identität des rekombinanten BASB034-Proteins verwendet. Visualisierung des Anti-His-Antikörper-reaktiven Musters wurde unter Verwendung entweder eines ABT-unlöslichen Substrats oder unter Verwendung von Hyperfilm mit dem Amersham ECL-Chemilumineszenzsystem erreicht.
D: Sequenzbestätigung
Zur weiteren Verifizierung, daß das IPTG-induzierbare rekombinante BASB034-Protein, das exprimiert wird, im richtigen offenen Leseraster und nicht ein falsches Molekül ist, das aus einem Klonierungsartefakt herrührt (d.h. eine Rasterverschiebung), wurde die DNA-Sequenz des klonierten Inserts bestimmt. Die DNA-Sequenz für das M. catarrhalis-BASB034-Gen wurde aus einem Strang unter Verwendung herkömmlicher asymmetrischer PCR-Cyclussequenzierungsmethodiken erhalten (ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Sequenzierungsreaktionen wurden mit unverdauter Expressionsplasmid-DNA (~0,5 μg/Reaktion (rxn)) als Matrize und angemessenen pQE30-Vektor-spezifischen und ORF-spezifischen Sequenzierungsprimern (~3,5 pmol/Reaktion (rxn)) programmiert. Zusätzlich zur Matrize und Sequenzierungsprimer enthielt jede Sequenzierungsreaktion (~20 μl) die vier unterschiedlichen dNTPs (d.h. A, G, C und T) und die vier entsprechenden ddNTPs (d.h. ddA, ddG, ddC und ddT) Terminatornukleotide; wobei jeder Terminator an einen der vier Fluoreszenzfarbstoffe Joe, Tam, Rox oder Fam konjugiert war. Einsträngige Sequenzierungsverlängerungsprodukte wurden an zufälligen Positionen entlang der Matrize durch Einbau der Farbstoff-markierten ddNTP-Terminatoren beendet. Fluoreszenzfarbstoff-markierte Terminationsprodukte wurden unter Verwendung von Mikrozentrifugen-Größenausschlußchromatographiesäulen (Princeton Genetics) gereinigt, im Vakuum getrocknet, in einem Template Resuspension Buffer (Perkin-Elmer) für die Kapillarelektrophorese oder in entionisiertem Formamid für PAGE suspendiert, bei 95°C für ~5 min denaturiert und durch hochauflösende Kapillarelektrophorese (ABI 310 Automated DNA Sequenator, Perkin-Elmer) oder hochauflösendes PAGE (ABI 377 Automated DNA Sequenator) gemäß Herstellerempfehlungen analysiert. Die aus den individuellen Reaktionen erzeugten DNA-Sequenzdaten wurden gesammelt und die relativen Fluoreszenzpeakintensitäten automatisch an einem PowerMAC-Computer unter Verwendung von ABI Sequence Analysis Software (Perkin-Elmer) analysiert. Individuell autoanalysierte DNA-Sequenzen wurden manuell auf Genauigkeit editiert, bevor sie in einer Consensus-Einzelstrangsequenz ("string") unter Verwendung von Auto-Assembler-Software (Perkin-Elmer) zusammengefügt wurden. Die Sequenzierung bestimmte, daß das Expressionsplasmid die korrekte Sequenz im korrekten offenen Leseraster enthielt.
Beispiel 4: Erzeugung von rekombinantem BASB034
Bakterieller Stamm
Ein rekombinanter Expressionsstamm von E. coli M15 (pREP4), der ein Plasmid enthielt (pQE30), das BASB034 aus M. catarrhalis codiert, wurde zur Erzeugung von Zellmasse zur Reinigung von rekombinantem Protein verwendet. Der Expressionsstamm wurde an LB-Agarplatten kultiviert, die 50 μg/ml Kanamycin ("Kn") und 100 μg/ml Ampicillin ("Ap") enthielten, um die Aufrechterhaltung sowohl des pREP4 lacIq-Kontrollplasmids als auch des pQE30-BASB034-Expressionskonstrukts sicherzustellen. Zur Gefrierkonservierung bei –80°C wurde der Stamm in LB-Bouillon vermehrt, die die gleiche Konzentration von Antibiotika enthielt, und dann mit einem gleichen Volumen von LB-Bouillon vermischt, die 30% (G/V) Glycerin enthielt.
Medien
Das zur Erzeugung des rekombinanten Proteins verwendete Fermentationsmedium bestand aus 2 × YT-Bouillon (Difco), die 50 μg/ml Kn und 100 μg/ml Ap enthielt. Antischaummittel wurde zum Medium für den Fermenter mit 0,25 ml/l hinzugegeben (Antifoam 204, Sigma). Zur Induzierung der Expression des rekombinanten BASB034-Proteins wurde IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zum Fermenter hinzugegeben (1 mM Endkonzentration).
Fermentation
Ein 500 ml-Erlenmeyer-Impfkolben, der 50 ml Arbeitsvolumen enthielt, wurde mit 0,3 ml der schnell aufgetauten gefrorenen Kultur oder mehreren Kolonien aus einer selektiven Agarplattenkultur geimpft und für ca. 12 Stunden bei 37 ± 1°C auf einem Schütteltisch mit 150 U/min (Innova 2100, New Brunswick Scientific) inkubiert. Diese Impfkultur wurde dann zur Impfung eines Fermenters mit 5 l Arbeitsvolumen verwendet, der 2 × YT-Bouillon und sowohl Kn- als auch Ap-Antibiotika enthielt. Der Fermenter (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) wurde bei 37 ± 1°C, 0,2–0,4 VVM Lufteinblasung, 250 U/min in Rushton-Flügelrädern betrieben. Der pH wurde weder in der Kolben-Impfkultur noch im Fermenter kontrolliert. Während der Fermentation lag der pH im Bereich von 6,5 bis 7,3 im Fermenter. IPTG (1,0 M Vorrat, hergestellt in sterilem Wasser) wurde zum Fermenter hinzugegeben, als die Kultur die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreichte (~0,7 O.D. 600-Einheiten). Die Zellen wurden für 2–4 Stunden induziert und dann durch Zentrifugieren unter Verwendung entweder einer 28RS Heraeus-(Sepatech) oder RC5C-Superspeed-Zentrifuge (Sorvall Instruments) geerntet. Zellpaste wurde bei –20°C bis zur Verarbeitung gelagert.
Reinigung
Chemikalien und Materialien
Imidazol, Guanidinhydrochlorid, Tris (Hydroxymethyl) und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) von Biotechnologiequalität oder besser wurden alle von Ameresco Chemical, Solon, Ohio erhalten. Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol), einbasiges Natriumphosphat und Harnstoff waren von Analysenqualität oder besser und wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri erhalten. Eisessig und Salzsäure wurden von Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, New Jersey erhalten. Methanol wurde von Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey erhalten. Pefabloc^®SC (4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid), komplette Proteaseinhibitor-Cocktail-Tabletten und PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) wurden von Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana erhalten. Bestatin, Pepstatin A und E-64-Proteaseinhibitor wurden von Calbiochem, LaJolla, California, erhalten. Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1 × PBS) wurde von Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland erhalten. Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10 × PBS) wurde von BioWhittaker, Walkersville, Maryland erhalten. Penta-His-Antikörper, BSA-frei, wurde von QiaGen, Valencia, California erhalten. Peroxidase-konjugiertes AffiniPure Ziege-Anti-Maus-IgG wurde von Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. erhalten. AEC-Einfachlösung wurde von Zymed, South San Francisco, California erhalten. Alle andere Chemikalien waren von Analysenqualität oder besser.
Ni-NTA-Superflow-Harz wurde von QiaGen Inc., Valencia, California erhalten. Vorgegossene Tris-Glycin 4–20% und 10–20% Polyacrylamidgele, alle Laufpuffer und Lösungen, SeeBlue vorangefärbte Standards, MultiMark mehrfarbige Standards und PVDF-Transfermembranen wurden von Novex, San Diego, California erhalten. SDS-PAGE Silver Stain-Kits wurden von Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokyo, Japan erhalten. Coomassie-Anfärbungslösung wurde von Bio-Rad Laboratories, Hercules, California erhalten. Acrodisc^® PF 0,2 μm-Spritzenfilter wurden von Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan erhalten. GD/X 25 mm-Einwegspritzenfilter wurden von Whatman Inc., Clifton, New Jersey erhalten. Dialyseschläuche 8000 MWCO wurden von BioDesign Inc. Od New York, Carmal New York erhalten. BCA-Proteintestreagenzien und Snake Skin-Dialyseschläuche 3500 MWCO wurde von Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois erhalten.
Extraktionsprotokoll
Zellpaste wurde bei Raumtemperatur für 30–60 Minuten aufgetaut. 5 bis 6 g des Materials wurden in einen 50 ml-Einwegzentrifugenschlauch einge wogen. Dazu wurden 5 ml/g von Guanidinhydrochlorid-(Gu-HCl)-Puffer gegeben (6 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05% Triton X-100, pH 8,0). Zellpaste wurde unter Verwendung eines PRO300D-Proscientific-Homogenisators mit 3/4 der Leistung der für eine Minute resuspendiert. Die Extraktionsmischung wurde dann unter vorsichtigem Rühren für 60 bis 90 Minuten auf Raumtemperatur gebracht. Nach 60 bis 90 Minuten wurde die Extraktionsmischung mit 15 800 × g für 15 Minuten zentrifugiert (Sorvall RC5C-Zentrifuge, 11 500 U/min). Der Überstand (S1) wurde abdekantiert und für eine zusätzliche Reinigung aufbewahrt. Das Pellet (P1) wurde zur Analyse aufbewahrt.
Bindung von BASB034 an Nickel-NTA-Harz
Zu dem S1 werden 3 bis 4 ml Ni-NTA-Harz gegeben. Dies wird dann unter vorsichtigem Rühren für eine Stunde auf Raumtemperatur gebracht. Nach einer Stunde wird das S1/Ni-NTA in eine XK16-Pharmacia-Säule gepackt. Die Säule wird dann mit 1 M Gu-HCl-Puffer gewaschen (1 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05% Triton X-100, pH 8,0). Diesem schließt sich eine Spülung mit Phosphatpuffer an (100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05% Triton X-100, pH 6,3). Das Protein wird dann aus der Säule mit 250 mM Imidazolpuffer eluiert (250 mM Imidazol, 100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05% Triton X-100, pH 5,9).
Endformulierung
BASB034 wurde durch Dialyse über Nacht gegen drei Wechsel von 0,1% Triton X-100 und 1 × PBS, pH 7,4 formuliert, um verbleibendes Gu-HCl und Imidazol zu entfernen. Das gereinigte Protein wurde charakterisiert und zur Erzeugung von Antikörpern wie nachfolgend beschrieben verwendet.
Biochemische Charakterisierungen
SDS-PAGE und Western Blot-Analyse
Das rekombinante gereinigte Protein wurde an 4–20% Polyacrylamidgelen aufgetrennt und elektrophoretisch auf PVDF-Membranen mit 100 V für 1 Stunde wie zuvor beschrieben übertragen (Thebaine et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350–4354). Die PVDF-Membranen wurden dann mit 25 ml von Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 5% Trockenmagermilch enthielt, vorbehandelt. Alle anschließenden Inkubationen wurden unter Verwendung dieses Vorbehandlungspuffers durchgeführt.
PVDF-Membranen wurden mit 25 ml einer 1:500-Verdünnung von Vorimmunserum oder Kaninchen-Anti-His-Immunserum für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. PVDF-Membranen wurden dann zweimal mit Waschpuffer gewaschen (20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 150 mM Natriumchlorid und 0,05% Tween-20 enthielt). PVDF-Membranen wurden mit 25 ml einer 1:5000-Verdünnung von Peroxidase-markiertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. PVDF-Membranen wurden dann 4-mal mit Waschpuffer gewaschen und mit 3-Amino-9-ethylcarbazol und Harnstoffperoxid wie von Zymed (San Francisco, CA) geliefert für jeweils 10 Minuten entwickelt.
Die Ergebnisse eines SDS-PAGE (4) zeigen ein Protein von ca. 60 kDa, das reaktiv gegenüber einem Anti-RGS(His)-Antikörper durch Western Blots (5) des SDS-PAGE ist.
Proteinsequenzierung
Eine Amino-terminale Aminosäuresequenzierung des gereinigten Proteins wurde zur Bestätigung der Erzeugung des korrekten rekombinanten Proteins unter Verwendung wohldefinierter chemischer Protokolle an einem Hewlett-Packard Modell G1000A Sequenzer mit einem Modell 1090 LC und einem Hewlett-Packard Modell 241 Sequenzer mit einem Modell 1100 LC durchgeführt.
Beispiel 5: Erzeugung von Antiseren gegen rekombinantes BASB034
Polyvalente, gegen das BASB034-Protein gerichtete Antiseren wurden durch Impfung von zwei Kaninchen mit dem gereinigten rekombinanten BASB034-Protein erzeugt. Jedem Tier werden insgesamt drei Immunisierungen intramuskulär (i.m.) von ca. 20 μg BASB034-Protein pro Injektion (beginnend mit komplettem Freund-Adjuvans und gefolgt von unvollständigem Freund-Adjuvans) in etwa 21-tägigen Intervallen gegeben. Den Tieren wurde Blut vor der ersten Immunisierung ("Vorblutung") und an den Tagen 35 und 57 entnommen.
Anti-BASB034-Proteintiter wurden durch ELISA unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem BASB034-Protein (0,5 μg/Vertiefung) gemessen. Der Titer wird als die die höchste Verdünnung gleich oder größer als 0,1 definiert, gemäß Berechnung mit der folgenden Gleichung: Durchschnitts-OD von zwei Testproben der Antiseren – Durchschnitts-OD von zwei Testproben von Puffer. Die Titer nach drei Immunisierungen waren um 1.000.000.
Die Antiseren wurden als erster Antikörper zur Identifizierung des Proteins in einem Western Blot wie in Beispiel 4 oben beschrieben verwendet. Der Western Blot zeigte die Gegenwart von Anti-BASB034-Antikörper in den Seren von immunisierten Tieren (6).
Beispiel 6: Analyse der nicht-codierenden flankierenden Regionen des BASB034-Gens und Ausnutzung zur modulierten BASB034-Genexpression
Die nicht-codierenden flankierenden Regionen des BASB034-Gens enthalten regulatorische Elemente, die wichtig in der Expression des Gens sind. Diese Regulation findet sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene statt. Die Sequenz dieser Regionen, entweder stromaufwärts oder stromabwärts des offenen Leserasters des Gens, kann durch DNA-Sequenzierung erhalten werden. Diese Sequenzinformation erlaut die Bestimmung der potentiellen regulatorischen Motive wie der unterschiedlichen Promotorelemente, Terminatorsequenzen, induzierbaren Sequenzelemente, Repressoren, Elemente, die für die Phasenvariation verantwortlich sind, Shine-Dalgarno-Sequenz, Regionen mit potentieller Sekundärstruktur, die an der Regulation beteiligt sind, sowie anderer Typen von regulatorischen Motiven oder Sequenzen.
Diese Sequenzinformation erlaubt die Modulation der natürlichen Expression des Gens BASB034. Die Aufregulation der Genexpression kann durch Veränderung des Promotors, der Shine-Dalgarno-Sequenz, potentieller Repressor- oder Operatorelemente oder beliebiger anderer beteiligter Elemente erreicht werden. In gleicher Weise kann die Abregulation der Expression durch ähnliche Typen von Modifikationen erreicht werden. Alternativ kann die Expression des Gens durch Veränderung von Phasenvariationssequenzen unter eine Phasenvariationskontrolle gestellt werden oder kann von dieser Regulation entkoppelt werden. In einem anderen Ansatz kann die Expression des Gens unter die Kontrolle eines oder mehrerer induzierbarer Elemente gestellt werden, die eine regulierte Expression erlauben. Beispiele für eine solche Regulation schließen ohne Beschränkung die Induktion durch Temperaturverschiebung, Zugabe von Induktorsubstraten wie ausgewählten Kohlehydraten oder ihren Derivaten, Spurenelementen, Vitaminen, Co-Faktoren, Metallionen etc. ein.
Solche Modifikationen wie oben beschrieben können durch verschiedene unterschiedliche Mittel eingeführt werden. Die Modifikation von Sequenzen, die an der Genexpression beteiligt sind, kann in vivo durch zufällige Mutagenese gefolgt von Selektion auf den gewünschten Phänotyp erfolgen. Ein anderer Ansatz besteht in der Isolierung der interessierenden Region und ihrer Modifizierung durch zufällige Mutagenese oder ortsgerichtete Mutagenese, Insertions- oder Deletionsmutagenese. Die modifizierte Region kann dann in das bakterielle Genom durch homologe Rekombination wieder eingeführt werden, und die Wirkung auf die Genexpression kann untersucht werden. In einem anderen Ansatz kann das Sequenzwissen über die interessierende Region verwendet werden, um alle oder einen Teil der natürlichen regulatorischen Sequenzen zu ersetzen oder zu deletieren. In diesem Fall wird die beabsichtigte regulatorische Region isoliert und so modifiziert, daß sie die regulatorischen Elemente aus einem anderen Gen, eine Kombination regulatorischer Elemente aus unterschiedlichen Genen, eine synthetische regulatorische Region oder eine beliebige andere regulatorische Region enthält, oder um ausgewählte Teile der regulatorischen Sequenzen vom Wildtyp zu deletieren. Diese modifizierten Sequenzen können dann in das Bakterium über homologe Rekombination in das Genom wieder eingeführt werden. Eine nicht erschöpfende Liste von bevorzugten Promotoren, die zur Aufregulation der Genexpression verwendet werden könnten, schließt den Promotor porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB aus N. meningitidis oder N. gonorrhoeae ein.
In einem Beispiel kann die Expression des Gens durch Austauschen seines Promotors mit einem stärkeren Promotor moduliert werden (durch Isolieren der Sequenz stromaufwärts des Gens, in-vitro-Modifikation dieser Sequenz und Wiedereinführung in das Genom durch homologe Rekombination). Eine auf regulierte Expression kann sowohl im Bakterium als auch in den aus dem Bakterium abgesonderten (oder durch es hergestellten) äußeren Membranvesikeln erhalten werden. In anderen Beispielen können die beschriebenen Ansätze verwendet werden, um rekombinante bakterielle Stämme mit verbesserten Eigenschaften für Impfstoffanwendungen zu erzeugen. Diese können ohne Beschränkung abgeschwächte Stämme, Stämme mit einer erhöhten Expression ausgewählter Antigene, Stämme mit Knock-Outs (oder verringerter Expression) von Genen, die mit der Immunreaktion Wechselwirken, Stämme mit modulierter Expression immundominanter Proteine oder Stämme mit modulierter Absonderung von äußeren Membranvesikeln sein.
Eine Region direkt stromaufwärts des BASB034-Gens ist in der Sequenz von SEQ ID NO: 13 angegeben. Diese Sequenz ist ein weiterer Aspekt der Erfindung.
BASB034-Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen Sequenzinformation
Hinterlegte Materialien
Eine Hinterlegung, die einen Moraxella catarrhalis Catlin-Stamm enthält, wurde bei der American Type Culture Collection (nachfolgend "ATCC") am 21. Juni 1997 hinterlegt und der Hinterlegungsnummer 43617 zugewiesen. Die Hinterlegung wurde als Branhamella catarrhalis (Frosch und Kolle) beschrieben und ist eine gefriergetrocknete 1,5–2,9 kb Insert-Bibliothek, konstruiert aus M. catarrhalis-Isolat, erhalten aus einem transtrachealen Aspirat eines Kohlengrubenarbeiters mit chronischer Bronchitis. Die Hinterlegung wird in Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506–508 (1982) beschrieben.
Die Hinterlegung des Moraxella catarrhalis-Stammes wird hier als "der hinterlegte Stamm" oder als "die DNA des hinterlegten Stammes" bezeichnet. Der hinterlegte Stamm enthält ein BASB034-Gen voller Länge.
Eine Hinterlegung des Vektors pMC-PLA1, der aus Moraxella catarrhalis-DNA besteht, inseriert in PQE30, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 12. Februar 1999 hinterlegt und der Hinterlegungsnummer 207099 zugewiesen.
Die Sequenz der in dem hinterlegten Stamm enthaltenen Polynukleotide sowie die Aminosäuresequenz von jedem dadurch codierten Polypeptid sind bestimmend im Fall eines Konflikts mit der vorliegenden Beschreibung von Sequenzen.
Die Hinterlegung des hinterlegten Stammes/Klons wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vorgenommen. Die hinterlegten Stämme werden unwiderruflich und ohne Beschränkung oder Bedingung für die Öffentlichkeit bei Patenterteilung freigegeben. Die hinterlegten Stämme werden bloß als Erleichterung für die Fachleute bereitgestellt und sind kein Zugeständnis, daß eine Hinterlegung für die Ausführbarkeit erforderlich ist, wie dies gemäß 35 U.S.C. §112 erforderlich ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 besteht.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, das aus einer Sequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 besteht.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid gemäß jedem vorhergehenden Anspruch codiert.
Isoliertes Polynukleotid, das das Polynukleotid von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 umfaßt.
Expressionsvektor oder rekombinanter lebender Mikroorganismus, der ein isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 3 oder 4 umfaßt.
Rekombinanter lebender Mikroorganismus, der einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 5 umfaßt.
Wirtszelle, die den Expressionsvektor gemäß Anspruch 5 umfaßt.
Moraxella catarrhalis-Wirtszelle, die einen Expressionsvektor umfaßt, der ein isoliertes Polynukleotid umfaßt, das ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 hat, oder ein Fragment davon codiert, das (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger) eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt.
Äußere Membran eines rekombinanten Mikroorganismus gemäß Anspruch 6, der ein isoliertes Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 besteht.
Äußere Membran eines rekombinanten Mikroorganismus, der eine aufregulierte Expression eines isolierten Polypeptids aufweist, das eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 hat, oder ein Fragment davon umfaßt, das (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger) eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt.
Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 7 unter Bedingungen, die ausreichend zur Erzeugung des Polypeptids sind, und Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium.
Verfahren zur Erzeugung eines immunogenen Fragments des Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das immunogene Fragment eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 umfaßt und eine Immunreaktion hervorrufen kann (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger), die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 8 unter Bedingungen, die ausreichend zur Erzeugung des immunogenen Fragments sind, und Gewinnen des immunogenen Fragments aus dem Kulturmedium.
Verfahren zum Exprimieren eines Polynukleotids gemäß Anspruch 3 oder 4, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der wenigstens eines der Polynukleotide umfaßt, und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die ausreichend zur Expression eines beliebigen der Polynukleotide sind.
Verfahren zum Exprimieren eines Polynukleotids, das ein immunogenes Fragment des Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert, worin das immunogene Fragment eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 umfaßt und eine Immunreaktion hervorrufen kann (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger), die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt, umfassend das Transformieren einer Moraxella catarrhalis-Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der wenigstens eines der Polynukleotide umfaßt, und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die ausreichend für ein beliebiges der Polynukleotide sind.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge eines isolierten Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 85% Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 hat, oder ein Fragment davon umfaßt, das (falls notwendig bei Kopplung an einen Träger) eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge eines isolierten Polynukleotids, das eine Nukleotidsequenz, die wenigstens 85% Identität mit derjenigen von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7 hat, oder eine Nukleotidsequenz umfaßt, die komplementär zu dem isolierten Polynukleotid ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 15 oder 16, worin die Zusammensetzung wenigstens ein anderes Moraxella catarrhalis-Antigen umfaßt.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines isolierten Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 umfaßt, oder ein Fragment eines isolierten Polypeptids umfaßt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85% Identität mit den Aminosäuresequenzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 hat, worin das Fragment an einen Träger gekoppelt ist und eine Immunreaktion hervorrufen kann, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 8 erkennt, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Erzeugung einer Immunreaktion in einem Tier.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines isolierten Polynukleotids, das eine Nukleotidsequenz, die wenigstens 85% Identität mit derjenigen von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 über die gesamte Länge von SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 7 hat, oder eine Nukleotidsequenz umfaßt, die komplementär zu dem isolierten Polynukleotid ist, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Erzeugung einer Immunreaktion in einem Tier.
Antikörper, der immunspezifisch für das Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 ist.