CN1326509A - 粘膜炎莫拉氏菌basb034多肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供BASB034多肽及编码该多肽的多核苷酸,以及通过重组技术生产该多肽的方法。也提供其在疾病诊断,预防及治疗方面的应用。
Description
发明领域:
本发明涉及多核苷酸(这里指“BASB034多核苷酸”),由其编码的多肽(此处指“BASB034”或“BASB034多肽”),用于这些产物的重组材料及方法。另一方面,本发明涉及应用这些多肽及多核苷酸的方法,包括抗细菌感染的疫苗。进一方面,本发明涉及用于检测特定病原感染的诊断分析。
发明背景
粘膜炎莫拉氏菌(Morxella catarrhalis)(也叫做粘膜炎布兰汉氏菌(Branhmella catarrhalis))是一种革兰氏阴性细菌,时常从人上呼吸道分离得到。对许多病变主要为婴儿及儿童的中耳炎及中年人的肺炎,该细菌都有参与。它也参与窦炎,医院感染及少量侵入性的疾病。
中耳炎对于儿童期讲,无论从病例数量还是其发病潜势上看,都是一种重要病变。在美国据报道每年该病例超过350万,并估计80%的儿童在3岁前会经历至少一次耳炎(Klein,JO(1994)Clin.Inf.Dis19:823)。不处理或变成慢性,该病可导致暂时性(假如流体在中耳积聚)或永久性(如果听神经损伤)听力丧失。在婴儿中这样的听力丧失可导致语言学习的推迟。
从患有中耳炎的儿童中分离得到了3个主要细菌品种:肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae),非典型的流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)(NTHi)及粘膜炎莫拉氏菌(M.catarrhalis)。在60-90%病例中它们都存在。近期研究的一篇综述显示在中耳炎病例中,肺炎链球菌及HTHi占了其中的30%,粘膜炎莫拉氏菌占了其中的约15%(Murphy,TF(1996)Microbiol.Rev.60:267)。其它细菌也可从中耳中分离得到(乙型流感嗜血杆菌,酿脓链球菌(S.pyogenes)等),但只占较小频率(此病例的2%或更少)。
流行病资料显示,对于在中耳中发现的病原菌,在上呼吸道建群是形成耳炎的绝对的先决条件;然而也需要其它条件导致疾病发生(Dickinson,DP等(1988)J.Infect.Dis.158:205,Faden,HL等(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100:612)。这些对引起细菌通过咽鼓管迁移进入中耳是重要的,并随之启动炎症过程。这些因素现在是已知的。例如,假定一短暂的伴随病毒感染的免疫系统不正常,能引起呼吸道生殖菌群控制的失常(Faden,HL等(1994)J.Infect.Dis.169:1312)。另一个解释为暴露于环境因素允许一些儿童更重要的菌群建群,他们因为中耳病原菌的持继存在随之变成对形成中耳炎易感(Murphy,TF(1996)Microbiol.Rev.60:267)。
对粘膜炎莫拉氏菌的免疫反应的特征描述不足,对从0到2岁婴儿鼻咽中连续分离到的菌株的分析表明,他们时常地获得及去除新菌株。这指示一种对该细菌的有效免疫反应被菌群建的儿童所运用(Faden,HL等(1994)J.Infect.Dis.169:1312)。
在许多被检测的成人中,已鉴定出了一些杀菌抗体(Chapman,AJ等(1985)J.Infect.Dis.15:878)。粘膜炎莫拉氏菌菌株在它们的能力范围内以各种变异存在以抵抗血清活性:一般来讲,从有病个体中分离到的病菌比仅简单建群中分离到的病菌抵抗力更强(Hol,C等(1993)Lancet 341:1281,Jordan,KL等(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A):28S)。因此,血清抗性可被认作该细菌的一种毒力因素。在从中耳炎恢复过来的儿童的血清中还观察到一种受调理的活性。
被这些人中不同免疫反应定位的抗原没有被鉴定,除了OMP B1,一种表达受铁调控的84kDa蛋白质外,并且它是通过肺炎病人的血清鉴定出的(Sethi,S,等(1995),Infect.Immun.63:1516)及UspAl,UspA2除外(Chen D.等(1999),Infect.Immun.67:1310)。
一些存在于粘膜炎莫拉氏菌表面的其它膜蛋白的已用生化方法或因为它们在诱导保护免疫反应(见综述,Murphy,TF(1996)Microbiol.Rev.60:267)中的潜在的运用而定性。在小鼠肺炎模型中,对它们(UspA,CopB)中的一些,产生了抗体,还会导致肺部感染更快的清除。另一多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌株中是高度保守的,并与铜绿假单孢菌属(Pseudomonasaeruginosa)的一种膜孔蛋白的(porin)存在同源性,该膜孔蛋白已经在动物模型中被证明对此细菌是有效的。
在过去的几十年中,粘膜炎莫拉氏菌感染率显著升高。这是由于多药抗性细菌株系的出现及弱免疫系统的人群的增加。分离对一些或全部标准抗生素具有抗性的粘膜炎莫拉氏菌株已经是很平常的事了。这一现象使医疗需求得不到满足,并导致需要得到针对该微生物的新的抗菌剂、疫苗、药物筛选方法和诊断测试。
发明概述:
发明涉及BASB034,尤其BASB034多肽及BASB034多核苷酸,重组材料及其生产方法。另一方面,本发明涉及使用这些多肽及多核苷酸的方法,包括预防及治疗微生物疾病。另一方面,发明涉及用于检测微生物感染相关疾病及与这些感染相关的环境条件的诊断分析,例如检测BASB034多核苷酸或多肽的表达或活性。
通过阅读下面的说明书和本公开的其它部分,在本发明所公开的精神和范围之内的各种变化和修饰对本领域的技术人员来说将是显而易见的。
发明描述
本发明涉及如下更详细描述的BASB034多肽及多核苷酸。本发明尤其涉及粘膜炎莫拉氏菌BASB034的多肽及多核苷酸,它与肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)外膜磷脂酶A蛋白的氨基酸序列同源相关。本发明尤其涉及分别具有SEQ ID NO:1,3,5或7的核苷酸序列及SEQ ID NO:2,4,6或8所示氨基酸序列的BASB034。可以理解,在下述序列表中详述的序列如DNA仅代表本发明一个实施方案,因为那些普通技术人员能认识到这些序列普遍地能很有用地应用在多核苷酸中,包括核糖多核苷酸(ribopolynucleotides)。多肽
在本发明的一个方面,提供了本文称为“BASB034”和“BASB034多肽”的粘膜炎莫拉氏菌多肽以及其中的生物学,诊断学、预防学、临床或治疗上有用的变体,以及含有该物质的组合物。本发明进一步提供:
(a)一种分离的多肽,包括与SEQ ID NO:2,4,6或8中序列至少85%一致,优选至少90%一致,更优选至少95%一致,最优选至少97-99%一致或完全一致的氨基酸序列;
(b)一种由分离的多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸包括分别与SEQ ID NO:1,3,5或7就全长来说有至少85%一致,优选至少90%一致,更优选至少95%一致,最优选至少97-99%一致或完全一致的多核苷酸序列;或
(c)一种由分离的多核苷酸编码的多肽,它含有一多核苷酸序列,其所编码的多肽与SEQ ID NO:2,4,6或8的氨基酸序列至少85%一致,优选至少90%一致,更优选至少95%一致,更优选至少97-99%一致或完全一致。
SEQ ID NO:2,4,6或8中的BASB034多肽是来源于粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC 43617),Mc2913及Mc2969的BASB034多肽。
本发明也提供一种BASB034多肽免疫原性片段,即,一个连续的BASB034多肽部分,它具有与含有SEQ ID NO:2,4,6或8中氨基酸序列的多肽一致或基本上一致的免疫原性活性,也就是说,该片段(如果必要,可与载体偶联)能够提高识别BASB034多肽的免疫反应。这样一种免疫原性片段可包括,例如,缺少N-端导肽序列和/或跨膜区和/或C-端锚定结构域的BASB034多肽。在一优选的方面,本发明的BASB034免疫原性片段包括该多肽的全部胞外结构域,该多肽就全长来说与SEQ ID NO:2,4,6或8至少85%一致,优选至少90%一致,更优选至少95%一致,最优选至少97-99%一致。
片段是指具有与本发明中任何一多肽部分但不是任何氨基酸序列的全部完全一致的氨基酸序列。如对于BASB034多肽,片段可以是“自由存在的”(“free-standig”),或包含在一较大多肽内,在多肽中,片段形成一部分或区域,最优选地为在单一较大多肽内作为单一的连续的区域。
优选的片段包括,例如,截短的多肽,它们具有SEQ ID NO:2,4,6或8中氨基酸或其变体的一部分,例如包括氨基和/或羧基末端氨基酸序列的一种连续系列残基。由宿主细胞或在宿主细胞内形成的本发明中的多肽的降解形式,也是优选的。更优选的是通过结构及功能属性定性的片段,如片段含有α-螺旋及α-螺旋形成区域,β-片层及β-片层形成区域,转角及转角形成区域,卷曲及卷曲形成区域,亲水区域,疏水区域,α-两性区域,β-两性区域,柔性区域,表面形成区域,底物结合区域,高抗原指数区域(high antigenic indexregions)。
更进一步优选的片段包括一种分离的多肽,它包括具有SEQ IDNO:2,4,6或8的氨基酸序列中至少15,20,30,40,50或100个连续的氨基酸的氨基酸序列;或一种分离的多肽,它包括具有SEQ IDNO:2,4,6或8的氨基酸序列截短或缺失的序列中至少15,20,30,40,50或100个连续的氨基酸的序列。
本发明的多肽片段通过肽的合成可用于产生相应全长的多肽;因此,这些片段可用作产生本发明中全长多肽的中间物。
尤其优选的是变体,其中几个,5-10个,1-5个,1-3个,1-2个或1个氨基酸被替换,缺失或加入,可以任意组合。
本发明中的多肽,或免疫原性片段,可以是“成熟”蛋白形式或可以是较大蛋白的一部分,如前体或融合蛋白。包括一种额外的氨基酸序列,它含有分泌或导肽序列,原序列(pro-sequences),帮助纯化,如多组氨酸残基的序列,或一种在重组体制作过程中起稳定作用的序列是经常有用的。而且,外源多肽添加物或脂类尾巴或多核苷酸序列用以增加最终分子的免疫力也是被考虑的。
一方面,本发明涉及通过遗传工程产生可溶性融合蛋白,该蛋白包括本发明的多肽,或其片段,及各种亚类(IgG,IgM,IgA,IgE)免疫球蛋白的重链或轻链恒定区域的各个部分。优选的作为免疫球蛋白的是人IgG重链恒定区部分,尤其是IgG1,其中融合发生在铰链区。在一具体的实施方案中,FC部分可以通过掺入切割序列简便地移去,该切割序列可被掺入凝血因子Xa。
此外,本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法,以及在药物筛选,诊断和治疗中的应用。本发明的再一方面也涉及编码这些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白的技术的实例可在国际专利申请号WO94/29458及WO94/22914中查到。
蛋白可以是化学缀合(conjugated),或作为重组融合蛋白表达以允许与非融合蛋白相比,在表达体系中产生高水平的表达产物。该融合配对体(partner)可帮助提供T辅助表位(免疫融合配对体),优选地被人识别的T辅助表位,或帮助该蛋白比天然重组蛋白提高表达产量(表达增强)。优选地,该融合配对体将是免疫融合配对体及表达增强配对体。
融合配对体包括源于嗜血流感杆菌的蛋白D及源于流感病毒,NS1(血凝素)的非结构蛋白。另一融合配对体是已知的LytA蛋白。优选地使用分子的C-末端部分。LytA由肺炎链球菌得来,该菌合成一种N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶,酰胺酶LytA(由LytA基因{Gene,43(1986),265-272}编码),一种特异降解肽聚糖骨架特定键的自溶素(autolysin)。LytA蛋白的C-末端结构域对于胆碱或如DEAE等一些胆碱类似物的亲合力方面有重要作用。该特性已被用来开发融合蛋白表达有用的大肠杆菌C-LytA表达质粒。在其N-末端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化已被描述(Biotehnology:10,(1992):795-798)。利用LytA分子的重复部分是可能的,这些重复部分发现于C-末端始于残基178位处,如残基188-305。
本发明还包括前述多肽的变体,即通过保守氨基酸替换的上述多肽,由此一个残基被另一个相似特性残基替换。典型的这样替换发生在Ala,Val,Leu及Ile间;Ser及Thr间;酸性残基Asp及Glu间;Asn及Gln间;以及碱性残基Lys及Arg间;或芳香残基Phe及Tyr间。
本发明的多肽可以以任何恰当的方式制备。这样的多肽包括分离天然存在的多肽,重组制备的多肽,合成的多肽或通过这些方法的联用产生的多肽。制备这样多肽的方法为本领域所熟知。
最优选本发明的多肽来源于粘膜炎莫拉氏菌,然而,优选地也可以从分类上相同的其它生物体得来。例如,本发明的多肽也可以从分类上相同的科或目的生物体中获得。多核苷酸
本发明的目的之一是提供编码BASB034多肽的多核苷酸,特别地是本文称为BASB034的多核苷酸。
在本发明的一个具体优选的实施方案中,多核苷酸包括编码BASB034多肽的区域,它包含括SEQ ID NO:1,3,5或7的包括全长基因的序列,或其变体。
SEQ ID NO:1,3,5或7中提供的BASB034多核苷酸是来源于粘膜炎莫拉氏菌株Mc2931(ATCC 43617),Mc2908,Mc2913及Mc2969的BASB034多核苷酸。
作为本发明的更进一个方面,提供分离的核酸分子,它编码和/或表达BASB034多肽和多核苷酸,尤其粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽和多核苷酸,包括,如未加工的RNAs,mRNAs,cDNAs,基因组DNAs,B-及Z-DNAs。本发明更进一步的实施方案包括生物学,诊断学,预防性地,临床或治疗上有用的多核苷酸及多肽,及其变体,及含有上述成分的组合物。
本发明的另一方面涉及分离的多核苷酸,包括至少一种全长基因,它编码具有SEQ ID NO:2,4,6或8中的推测的氨基酸序列及与此紧密相关的多核苷酸,以及其变体。
在本发明另一个特别优选的实施方案中,有一种来源于粘膜炎莫拉氏菌的BASB034多肽,它包括SEQ ID NO:2,4,6或8的氨基酸序列或者其变体,或者由其组成。
使用本文提供的信息,例如SEQ ID NO:1,3,5或7中的多核苷酸序列,本发明编码BASB034多肽的多核苷酸可用标准的克隆及筛选方法获得,例如那些用粘膜炎莫拉氏菌Catlin细胞作为起始材料来从细菌中克隆及测序染色体片段,随之获得一个全长克隆。例如,为获得本发明的多核苷酸序列,如在SEQ ID NO:1,3,5或7中给出的多核苷酸序列,典型地,用来源于部分序列的放射性标记寡核苷酸作为探针,优选地17-聚体或更长去探测在大肠杆菌或一些其它适宜宿主中的粘膜炎莫拉氏菌Catlin染色体DNA克隆文库。携带与上述探针一致DNA序列的克隆可以随后用严格的杂交条件鉴定。通过测序杂交确定的独立克隆,用从原始多肽或多核苷酸序列设计的测序列物,随后向两方向延长多核苷酸序列以确定全长基因序列是可能的。方便地,这样的测序可被完成,例如,用变性从质粒克隆制备的双链DNA。适宜的技术由Maniatis T.,Fritsch,E.F.及Sambrook等,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第2版;Cold Spring HarborLaboratory出版;Cold Spring Harbor,New York(1989)。(尤其见1.90通过杂交筛选及13.70测序变性双链DNA模板)。用直接的基因组DNA测序也可以获得全长基因序列。对于本发明,SEQ ID NO:1,3,5或7中列出的每一多核苷酸是从来源于粘膜炎莫拉氏菌的DNA文库中发现的。
而且,SEQ ID NO:1,3,5或7中列出的每一DNA序列都含有一开放阅读框架(ORF),它编码的蛋白质具有约SEQ ID NO:2,4,6或8中列出的数目的氨基酸残基,其推断的分子量能用本领域的技术人员所熟知的氨基酸残基分子量值计算。
SEQ ID NO:1中的多核苷酸,在起始密码即1位核苷酸及SEQ IDNO:1中1327位核苷酸的终止密码之间的序列,编码SEQ ID NO:2中的多肽。
SEQ ID NO:3中的多核苷酸,在起始密码即1位核苷酸及SEQ IDNO:3中1327位核苷酸的终止密码之间的序列,编码SEQ ID NO:4中的多肽。
SEQ ID NO:5中的多核苷酸,在起始密码即1位核苷酸及SEQ IDNO:5中1327位核苷酸的终止密码之间的序列,编码SEQ ID NO:6中的多肽。
SEQ IDNO:7中的多核苷酸,在起始密码即1位核苷酸及SEQ IDNO:7中1327位核苷酸的终止密码之间的序列,编码SEQ ID NO:8中的多肽。
在进一方面,本发明提供分离的多核苷酸,它包含或由以下所述序列组成:
(a)一种多核苷酸序列,它就全长来说分别与SEQ ID NO:1,3,5或7的序列至少85%一致,优选至少90%一致,更优选至少95%一致,更进一步优选至少97-99%一致或完全一致;或者
(b)一种编码多肽的多核苷酸序列,该多肽就全长来说分别与SEQID NO:2,4,6或8的氨基酸序列至少85%一致,优选至少90%一致,更优选至少95%一致,更进一步优选至少97-99%一致或100%一致。
编码本发明的多肽的多核苷酸,包括来源于非粘膜炎莫拉氏菌品系的同系物和直向同源物(orthologs),可通过一定方法获得,这方法包括在严格杂交条件下(例如,用45-65℃温度及0.1-1%的SDS)用一标记或可检测到的探针筛选适宜的文库,该探针包括或由SEQ IDNO:1,3,5或7中或其中的片段组成;以及分离全长的含有所说多核苷酸序列的基因和/或基因组克隆。
本发明提供了就全长来说与ESQ ID NO:1,3,5或7中的编码序列(开放阅读框架ORF)一致的多核苷酸序列。本发明还提供一种成熟肽或其片段的编码序列自身以及在阅读框内有其它编码序列的成熟肽或其片段的编码序列,其它编码序列有例如,编码导肽或分泌信号序列的序列,一种前-或原-,或前原-蛋白序列。本发明的多肽也可含有至少一种非编码序列,包括如,但不限于至少一个非编码的5′及3′序列,例如,转录但不翻译序列,终止信号(如rho-依赖及rho-非依赖终止信号),核糖体结合位点,Kozak序列,稳定mRNA的序列,内含子及聚腺苷酸化信号。多核苷酸序列也可以包含编码额外氨基酸的额外编码序列。例如,一种可以使被编码的融合多肽容易纯化的标记序列。在本发明的一个具体实施方案中,标记序列为一种pQE载体提供的六组氨酸肽(Qiagen公司)及在Gentz等Proc.Natl.Acad.Sci.,USA86:821-824(1989)中描述的标记,或一种HA肽标记(Wilson等;Cell 37:767(1984),两者在对与其融合的多肽序列纯化中都很有用。本发明之多核苷酸也包括,但不限于,含有一结构基因及控制基因表达的天然序列的多核苷酸。
编码SEQ ID NO:2,4,6或8中BASB034多肽的核酸序列可以是与分别含有SEQ ID NO:1,3,5或7中1到1326核苷酸的多肽编码序列一致的。可选择地,它可以是一种序列,它作为一种遗传密码冗余(简并性)的结果,也编码SEQ ID NO:2,4,6或8中的多肽。
这里用术语“编码多肽的多核苷酸”包含含有编码本发明多肽序列的多核苷酸,尤其是细菌多肽,更尤其是具有SEQ ID NO:2,4,6或8中列出的氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌多肽。该术语也包含含有与附加区域一起的单独连续区域或编码多肽的不连续区域(例如多核苷酸被整合噬菌体,一种整合插入序列,一种整合载体序列,一种整合转座子序列或RNA编辑,或者基因组DNA重组所打断)的多核苷酸,也可含有编码和/或非编码序列。
本发明进一步涉及这里所述的多核苷酸的变体,它编码具有SEQID NO:2,4,6或8中的推断氨基酸序列的多肽变体。本发明中的多核苷酸片段也可用于,如,合成本发明的全长多核苷酸。
进一步特别优选的实施方案为编码BASB034变体的多核苷酸,该变体具有SEQ ID NO:2,4,6或8中BASB034多肽氨基酸序列,其中有一些,几个,5到10,1到5,1到3,2个或1个或没有氨基酸残基被替代,修饰,缺失和/或增加,可以任意组合。这些中特别优选的是沉默替换,增加及缺失,它们不改变BASB034多肽的性质及活性。
本发明进一步优选的实施方案为与编码具有SEQ ID NO:2,4,6或8中列出的氨基酸序列的BASB034多肽的多核苷酸至少就全长来说有85%一致的多核苷酸,以及与这些多核苷酸互补的多核苷酸。可选择地,最优选的是,多核苷酸含有一区域,其全长至少有90%与编码BASB034多肽的多核苷酸一致或与此互补。在这方面,就全长来说至少有95%与其上述多核苷酸一致的多核苷酸是特别优选的。而且,在至少95%一致中,至少97%一致的那些多核苷酸是更优选的,这些中至少98%及至少99%一致是特别优选的,至少99%一致是更优选的。
优选的实施方案为编码多肽的多核苷酸,该多肽与SEQ ID NO:1,3,5或7的DNA编码的成熟多肽相比,基本上保持了一致生物学功能或活性。
根据本发明的特定优选的实施方案,提供了多核苷酸,它可以,特别在严格条件下,与BASB034多核苷酸序列,例如在SEQ ID NO:1,3,5或7中列出的那些多核苷酸序列杂交。
本发明进一步涉及与这里提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。在这方面,本发明特别涉及在严格条件下与这里描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如这里所用的,术语“严格条件”及“严格杂交条件”指杂交仅为序列间至少95%及优选地至少97%一致才可发生。严格杂交条件的一个具体例子是在42℃下,在含有下述试剂的溶液中过夜孵育,溶液中含有:50%甲酰胺,5×SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠,50mM磷酸钠(pH7.6),5×Denhardt′s浓液,10%硫酸葡聚糖及20mg/ml的变性剪切的鲑精DNA,随之在65℃,0.1×SSC中洗涤杂交膜。杂交及洗涤条件是广为人知的并在Sambrook等,MolecularCloning:A Labortory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),特别是其中的第11章也进行了示例。溶液杂交也可用于本发明提供的多核苷酸序列。
本发明也提供一种由下述的多核苷酸序列组成或包括下述多核苷酸序列的多核苷酸,这个多核苷酸通过在严格条件下,用具有SEQ IDNO:1,3,5或7中列出的多核苷酸或其中的片段作为探针,筛选适宜的含有SEQ ID NO:1,3,5或7中列出的多核苷酸的完整基因的文库而获得;并分离所说的多核苷酸序列。用于获得这样一种多核苷酸的片段包括,如,探针及引物这里到处都进行完整描述。
如这里随处讨论的关于发明中多核苷酸分析方法,例如,本发明中的多核苷酸,可被用作杂交探针而与RNA,cDNA及基因组DNA杂交以分离全长cDNAs及编码BASB034的基因组克隆,分离与BASB034基因有高度同源性,尤其高的序列一致性的其它基因的cDNA及基因组克隆。这样的探针一般将包含至少15个核苷酸残基或碱基对。优选地,这样的探针将具有至少30个核苷酸残基或碱基对并也可以具有至少50个核苷酸残基或碱基对。特别优选的探针将具有至少20个核苷酸残基或碱基对并将具有少于30个的核苷酸残基或碱基对。
BASB034的编码区可用SEQ ID NO:1,3,5或7中提供的一种DNA序列合成寡核苷酸探针通过筛选而分离。与本发明之相关基因具有互补序列的标记寡核苷酸随后用于筛选cDNA文库,基因组DNA或mRNA以确定探针与文库中的哪一个成员杂交。
有许多可以得到并为本领域的技术人员所熟知的方法用以获得全长DNAs或延伸短DNAs,例如那些基于快速扩增cDNA末端(RACE)的方法(见,如,Frohman,等PNAS,USA85:8998-9002,1988)。近期对该技术的修饰,例如由MarathonTMtechnology(ClontechLaboratories Inc.)示例,已明显减化了对较长cDNAs的搜索。在MarathonTM技术中,cDNA从选出的组织中提取的mRNA来制备,并且在每一末端连接一个“接头”(adaptor)序列。然后用核酸扩增(PCR)技术,以一种基因特异的和接头特异的寡核苷酸引物的组合扩增5′端“丢失”(missing)的DNA。然后用“巢式”引物,即引物设计为与扩增的产物退火(典型地一种进一步与接头序列3′端退火的接头特异引物及进一步与选择的基因序列到5′端退火的一种基因特异性引物)重复以上PCR反应。随后用DNA测序分析这一反应产物,并且或者通过直接接合PCR产物与存在的DNA以给出一完整序列,或者用新的序列信息设计5′引物完成全长基因的PCR来构建一条全长的DNA。
本发明中的多核苷酸及多肽可以被用作,例如,作为研究试剂或材料用以对疾病进行治疗及诊断,特别是人类疾病,如进一步在此讨论的与多核苷酸分析相关的内容。
本发明中的多核苷酸为从SEQ ID NOS:1-8中的序列得来的寡核苷酸,它可用于下述的方法中,但优选地用于PCR,以确定是否在此鉴定的全长或部分多核苷酸在被细菌感染的组织中进行了转录。已认识到,这样的序列在病原已达到了感染阶段及感染类型的诊断中也将是很有用的。
本发明也提供编码一种成熟蛋白加额外氨基酸或羧基末端氨基酸,或成熟氨基酸内部的氨基酸(例如,当成熟形式有不止一条的多肽链时)的多核苷酸。这样的序列可能在蛋白质从前体到成熟形式的加工过程中在起重要作用,可允许蛋白转运,可加长或缩短半寿期或可使用于分析或生产的蛋白容易操作,或其它事情中起作用。一般地是在体内的情况,额外的氨基酸可被细胞内的酶从成熟蛋白末端中剪切除去。
对于每一个及任何本发明中的多核苷酸,提供了与之互补的一种多核苷酸。这些互补的多核苷酸对与它们互补的每一个多核苷酸是完全互补的,这种情况是优选的。
一种前体蛋白,具有融合一或多个原序列(prosequenes)多肽的成熟形式可以是该多肽的钝化形式。当原序列去除后,这样钝化了前体通常被激活。一些或全部的原序列可在激活前除去。通常地,这样的前体被称为原蛋白。
除了标准的A,G,C,T/U代表核苷酸外,术语“N”也可在本发明中用于描述一定的多核苷酸。“N”指四种DNA或RNA核苷酸中的任一种,可出现在DNA或RNA序列中指定的位置,优选地,除了当与临近的核苷酸位置结合时,N不是一种核酸。当以正确框架读码时,将在这样的读框中具有产生过早终止密码的结果。概括起来,本发明中的多核苷酸可编码成熟蛋白,成熟蛋白加导肽序列(它可表示为原蛋白),具有一或多个不是蛋白导肽序列的前序列(prosequences)的成熟蛋白前体,或者前原蛋白(preproprotein),它是蛋白的前体,具有导肽序列及一或多个前序列,导肽及前序列通常在产生活性及成熟形式多肽的加工步骤中被除去。
根据本发明的一个方面,提供了本发明中的多核苷酸在治疗或预防,尤其在遗传免疫上的应用。
本发明的多核苷酸在遗传免疫中的应用,优选地使用适宜的运送方法,例如直接将质粒DNA注射进入肌肉(Wolff等,Hum Mol Genet(1993)1:363,Manthorpe等,Hum.Gene Ther(1983)4:419),运送用特异蛋白的载体复合的DNA(Wu等,J Biol Chem(1989)264:16985),用磷酸钙共沉淀DNA(Benvenisty & Reshef,PNAS USA(1986)83:9551),用各种形式的脂质体包裹DNA(Kaneda等,Science(1989)243:375),微弹轰击(Tang等,Nature(1992)356:152,Eisenbraun等,DNA Cell Biol(1993)12:791)及用克隆的逆病毒载体在活体内感染(Seeger等,PNAS USA(1984)81:5849)。载体,缩主细胞,表达体系
本发明也涉及包含本发明的一或多个多核苷酸的载体,用该载体进行遗传工程改造的宿主细胞及通过重组技术产生的本发明中的多肽产物。也可使用无细胞翻译系统以用从本发明的DNA构建物中得来的RNAs产生这样的蛋白质。
本发明中的重组多肽可通过本领域中的技术人员所熟知的遗传工程改造含有表达系统的宿主细胞的方法制备。相应地,在进一方面中,本发明涉及表达系统,它包括本发明中的一个或多个多核苷酸,还涉及宿主细胞,它是用这样的表达系统通过遗传工程改造过的,以及涉及通过重组技术产生的发明的多肽产物。
对于本发明的多肽重组产物,宿主细胞能被通过遗传工程改造以掺入表达系统或其部分或本发明的多核苷酸。向宿主细胞中引入多核苷酸能通过在许多标准实验手册所述的方法实现,例如,Davis等,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)及Sambrook等,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Sprin Harbor,N.Y.(1989),例如,磷酸钙转染,DEAE-葡聚糖介导的感染,转位,显微注射,阳离子脂介导的转染,电穿孔,转导,Scrape loading,生物打靶(bauistic)导入及感染。
适宜宿主的代表实例包括细菌细胞,如链球菌(streptococci),葡萄球菌(staphylococci),链霉菌(streptomyces),肠道球菌(enterococci),大肠杆菌(E.coci),蓝细菌(cyanobacteria),枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)及粘膜炎莫拉氏菌;真菌细胞,例如,一种酵母细胞,克鲁维酵母菌属(kluveromyces),糖酵母菌属(Saccharomyces),担子菌(basidiomycete),白色念球菌(candida albicans)及曲霉属(Aspergillus);昆虫细胞,例如果蝇属S2(Drosophila S2)及草地夜蛾Sf9;动物细胞如CHO,COS,Hela,C127,3T3,293,CV-1及布氏黑色素瘤细胞;及植物细胞如裸子植物及被子植物细胞。
一系列表达系统可用来制备发明中的多肽。这样的载体包括,染色体的附加体及病毒得来的染色体,除次之外还有其他。例如,从细菌质粒来源的载体,从细菌噬菌体,转座元,酵母附加体(episoes),插入元件,酵母染色体元件,病毒如杆状病毒,乳多空病毒,例如SV40,牛痘病毒,腺病毒,家禽水痘病毒,假性狂犬病病毒,微小RNA病毒,反转录病毒及α-病毒及来源于其中联合形式的载体,如来源于质粒及细菌噬菌体遗传成分,粘粒及噬粒的载体。表达系统构建物可含有控制区域,它调节同时也产生表达。通常,任何在宿主细胞中适于维持,繁殖或表达多核苷酸和/或表达一种多肽的系统或载体,在这一方面,都可用于表达。适宜的DNA序列可通过任何一系列已知及常规技术插入表达系统中,例如,在Sambrook等,Molecular Cloniag,ALaboratory Manual,(上文)中所指出的技术。
在真核生物重组表达系统中,对于一种翻译的蛋白分泌进入内质网内腔,进入周质腔,或进入胞外环境中,正确的分泌信号可掺入表达的多肽中。这些信号可以是对多肽来讲内源的,也可以是异源信号。
本发明中的多肽可以从重组细胞培养物中重组及纯化,重组及纯化方法是广为人知的,包括硫酸铵或乙醇沉淀,酸抽提,阴或阳离子交换层析法,磷酸纤维素(phosphocellose)层析法,疏水互作层析法,亲和层析法,羟基磷灰石层析法,及凝集素层析法。最优选地,离子金属亲和层析(INAC)用于纯化过程中。广为人知的蛋白质再折叠技术,当多肽在细胞内合成,分离和/或纯化时变性,可被用于再生活性构象形式。
表达系统也可是重组活的微生物,如病毒或细菌。目标基因能被插入到活的重组细菌或病毒的基因组中。用这种活的载体接种及体内感染将导致抗原的体内表达并诱导免疫反应。用于该目的细胞或病毒如痘病毒(例如,牛痘,家禽水痘,金丝小痘(canarypox),α-病毒(辛德比斯病毒,Semliki Forest病毒,委内瑞拉马脑膜炎病毒),腺病毒,腺相关病毒,微小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒,(rhinovirus)),疱病病毒(带状疱诊病毒等),李斯特菌属,沙门低菌属,志贺菌属,BCG。这些病毒或细菌可以是有毒力的,或者以各种方式减毒以便获得活的疫苗。这样的活疫苗也形成本发明的部分。诊断,预防,血清分型及突变分析
本发明也涉及使用BASB034多肽及发明的多肽作诊断试剂。在真核生物中,尤其在哺乳动物中,特别是人中检测BASB034多核苷酸和/或多肽,将提供一种对疾病、病程或感染生物对药物反应的诊断方法。真核生物,尤其哺乳动物,特别是人,特别是那些感染或被怀疑感染含有BASB034基因或蛋白的有机体,可在核酸或氨基酸水平,通过广为人知的技术以及这里提供的方法检测到。
用于预后,诊断或其它分析的多肽及多核苷酸可以从一假定的感染和/或感染的个体之身体材料中获得。任何这些来源的多核苷酸,特别是DNA或RNA,可以直接用于检测或可以在分析前通过PCR或者任何其它扩增技术进行扩增。RNA,尤其mRNA,cDNA及基因组DNA也可用于同样的方式进行分析。通过扩增,体中的感染或驻留生物体的种类和体系,有机体一种选定的多核苷酸的基因型而获得。缺失及插入能通过扩增产物大小与从相关生物体中选择出的一种参考序列的基因型相比较而检测到,相关生物体优选地为相同属的不同种或相同种的不同株。点突变可以用标记的BASB034多核苷酸序列杂交扩增的DNA来鉴定。用DNase或RNase分别消化DNA或RNA,可以从不完整或比较明显错配的双螺旋中区分出完整或明显配对的序列,或通过检测变性温度(解链温度)及复性动力学的不同也可对配对正确与否加以区分。多核苷酸序列的不同也可以通过与参考序列在凝胶中的电泳迁移率改变加以检测。可以使用或不用变性试剂。多核苷酸的差异也可以通过直接对DNA或RNA进行测序来检测。见,如,Myers等Science,230:1242(1985)。在特异座位的序列变化也可以通过核酸酶保护分析来揭示,如RNase,V1及S1保护分析或化学裂解方法。见,如,Cotton等PNAS.USA,85:4397-4401(1985)。
在另一个实施方案中,包括BASB034核酸序列或其中片段的寡核苷酸探针阵列可以被构建以完成如遗传突变,血型分型,分类学如上的分类或鉴定的有效筛选。阵列技术方法是已知的并已有普遍的应用,它可用于解决一系列遗传学包括基因表达,遗传连锁,及遗传变异方面的问题(见,如,Chee等,Science,274:610(1996))。
这样在另一方面,发明涉及诊断试剂盒,它包括:
(a)本发明的多核苷酸,优选地为SEQ ID NO:1,3,5或7中的核酸序列,或其片段;
(b)与(a)中序列互补的核苷酸序列;
(c)本发明的多肽,优选地为SEQ ID NO:2,4,6或8中的多肽或其片段;或者
(d)本发明之多肽的抗体,优选地抗多肽SEQ ID NO:2,4,6或8。
应该意识到在每一个这样的试剂盒中,(a)、(b)、(c)或(d)可包括基本的组分。这样试剂盒可用于诊断疾病或疾病的易感染性。
本发明也涉及使用本发明的多核苷酸作为诊断试剂。通过检测与疾病或致病性相关的本发明的多核苷酸,优选SEQ ID NO:1,3,5或7的突变形式,将会提供一种能增加或确定疾病的诊断、病程的预后,疾病名称的确定或疾病易感染性的工具,这是基于多核苷酸的表达低下、过表达或表达变化而得出的结论。可以通过各种技术,如本文其它地方描述的各种技术在多核苷酸水平检测到在该多核苷酸中有突变的生物体,特别是感染的生物体。
来自本发明的多核苷酸和/或多肽上携带突变或多形性(等位基因变异)的生物体的细胞,也可以通过一系列技术,如,血清分型,在多核苷酸或多肽水平被检测到。例如,RT-PCR能用于在RNA水平检测突变。尤其优选的是用RT-PCR与自动检测系统,例如,GeneScan相结合使用。RNA,cDNA或基因组,DNA也可用于一致的目的,PCR。作为一个实例,与编码BASB034多肽的多核苷酸互补的PCR引物可用于鉴定及分析突变。
本发明进一步提供从5′和/或3′端移去1,2,3,或4个核苷酸的引物。这些引物可以用于,在其它事例之中,扩增来源于个体的样品,如身体材料中分离到的BASB034 DNA和/或RNA。引物可以用于扩增从感染的个体中分离的多核苷酸。这样,该多核苷酸可随后用各种各样的技术阐明其序列。这样的话,多核苷酸中的突变可以被检测到并且可以用于感染的诊断和/或预后,或其阶段或病程,或感染原的血清分型和/或分类。
本发明进一步提供一种疾病的诊断方法,优选地细菌感染的诊断方法,更优选地由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染,包括确定来源于个体的样品,例如身体原料中多核苷酸表达水平的升高,其中该多核苷酸具有SEQ ID NO:1,3,5或7的序列。BASB034多核苷酸的表达升高或降低可用本领域中技术人员所熟知的任何方法测量以定量多核苷酸,例如,扩增,PCR,RT-PCR,RNase保护,Northern印迹,光谱或其它杂交方法。
另外,本发明用于检测,与正常对照组织样品相比较,过表达的BASB034多肽的诊断分析可用于检测感染的存在与否。能够用于确定从宿主,例如身体材料得来的样品中BASB034多肽水平的分析技术为本领域中的技术人员所熟知。这样的分析方法包括放射免疫分析,竞争性结合分析;Western杂交分析,抗体夹心分析,抗体检测及ELISA分析。
本发明的多核苷酸可用作多核苷酸阵列的成分,优选地高密度阵列或载网(grids)。这些高密度阵列对诊断及预后的研究方面特别有用。例如,每一个都含有一种不同基因的一系列点,并进一步包括本发明的一种或多种多核苷酸,可用作探针进行检测,例如用杂交或核酸扩增,用从身体材料获得或来源的探针来确定在个体中特定的多核苷酸序列或相关序列的存在与否。这样的一种存在可指示一种病原的存在,尤其是粘膜炎莫拉氏菌的存在,并且在诊断和/或预后疾病或病程中很有用。包括一定数量的SEQ ID NO:1,3,5或7中的多核苷酸序列的变体的载网是优选的。也优选的是包括一定数量的编码SEQID NO:2,4,6或8中多肽序列的多核苷酸之变体的载网。抗体
本发明的多肽及多核苷酸或其变体,或其表达细胞,可用作免疫原以产生分别对这样的多肽或多核苷酸具有免疫特异性的抗体。
在发明的一些特定的优选实施方案中,提供了抗BASB034多肽或多核苷酸的抗体。
抗本发明的多核苷酸或多肽的抗体,可通过给动物,优选非人动物施用本发明的多肽和/或多核苷酸,或两者之一或两者的表位指带片段,两者之一或两者的类似物,表达两者之一或两者的细胞,通过常规方法而得到。对于制备单克隆抗体,任何本领域中所熟知的提供通过连续细胞系培养制备抗体的技术都是可用的。包括各种各样技术的实例,例如在Kohler G.及Milstein,C.Nature256:495-497(1975);Kozbor等,Immunology Today4:72(1983);Cole等,MonoclonalAntibodies And Cancer Therary,Alan R.Liss,Inc.(1985)77-96页中所描述的。
制备单链抗体的技术(U.S.专利4,946,778号)可适用于制备本发明的多肽或多核苷酸的抗体。同样地,转基因小鼠,或其它机体或动物,如其它哺乳动物,可用于表达对本发明中的多肽或多核苷酸免疫特异性的人源化抗体。
可选择地,噬菌体展示技术可以用于从或者人淋巴细胞中筛选含有抗-BASB034的PCR扩增的v-基因的所有组分中或者从原初文库中(McCafferty等,(1990),Nature348,552-554;Marks等,(1992)Biotechnology10,779-783)选择与本发明的多肽可特异性结合的抗体基因。这些抗体的亲和性也可通过链改组而得到改善(Clackson等,(1991)Nature352:628)。
以上描述的抗体可用于分离或鉴定表达本发明的多肽或多核苷酸的克隆,或通过亲合层析纯化该多肽或多核苷酸。
这样,抗BASB034多肽或BASB034多核苷酸的抗体可用于治疗感染,这只是其中之一,尤其细菌感染。
多肽变体包括抗原性,表位性或免疫性等效的变体,形成本发明的一个特别的方面。
优选地,抗体或其变体被修饰以使其在个体中的致免疫性降低。例如,如果个体为人,抗体将最优选地是“人源化”的。其中该互补决定区或杂交瘤来源的抗体区域已被移植到人的单克隆抗体中,如,像在Jones等(1986),Nature321,522-525或Tempest等,(1991)Biotechnology9,266-273中所描述的那样。拮抗剂及激动剂-分析及分子:
本发明中的多肽及多核苷酸也可用于评价在细胞,无细胞制备物,化学文库,及天然产物混合物中小分子底物及配体的结合。这些底物及配体可以是天然底物及配体或者可以是结构及功能模拟物,见,如Coligan等,Current Prolocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)。
筛选方法可简单地通过一种直接或间接地与候选化合物相关的标记测量一种候选化合物与该多肽或多核苷酸,或与携带多肽或多核苷酸的细胞或膜,或该多肽的一种融合蛋白的结合。可选择地,筛选方法可包括与一种标记竞争物的竞争。进一步,用含有该多肽或多核苷酸的适宜细胞的检测系统,这些筛选方法可测试是否这个候选化合物通过多肽或多核苷酸的激活或抑制导致一种信号产生。活化抑制剂通常在一种已知的激动剂存在下进行分析,并且可以观察到在候选化合物存在下通过激动剂激活的效果。组成性活化的多肽或/和组成性表达的多肽及多核苷酸在一种激动剂或抑制子存在下,通过测试是否该候选化合物导致了多肽或多核苷酸的抑制或激活,可用在筛选方法中以逆转激动剂或抑制剂。进一步,筛选方法可简单地包括以下步骤:将含有本发明的多肽或多核苷酸的溶液与候选化合物混合以形成一种混合物,比较混合物中BASB034多肽和/或多核苷酸与标准物的活性。融合蛋白,如此前所述的由Fc部分与BASB034多肽构成的那些融合蛋白,也能用于高通量筛选分析中以鉴定发明中多肽的拮抗剂,同时也可鉴定系统发育和/或功能上相关的多肽(见D.Bennett等,J MolRecognition,8:52-58(1995);及K.Johanson等,J Biol Chem.270(16):9459-9471(1995))。
多核苷酸,多肽以及与发明中的一种多肽结合和/或相互作用的抗体也可用作检测细胞中增加的化合物对mRNA和/或多肽产生影响的构型筛选方法。例如,可建立一种ELISA分析,用本领域中熟知的标准方法,以单克隆及多克隆抗体测量分泌的或细胞相关水平的多肽。这能够用于从适当的构建细胞或组织中发现抑制或增强多肽产生的试剂(也分别叫做拮抗剂或激动剂)。
本发明也提供一种筛选化合物以鉴定那些增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)BASB034多肽活性或多核苷酸活性,特别是那些制菌的和/或杀菌的化合物的方法。该筛选方法可以包括高通量技术。例如,筛选激动剂或拮抗剂,一种合成的反应混合物,一种细胞间隔,如一种膜,细胞膜或细胞壁,或任何其中一种制备物,在可能为BASB034激动剂或拮抗剂的候选分子存在或缺失下孵育含有BASB034多肽及标记底物或该多肽的配体。候选分子激动或拮抗BASB034多肽的能力反映在降低的标记配体的结合或从这种底物产生的产物的降低中。天然结合的分子,也就是,没有诱导BASB034多肽的效果是最好的拮抗剂。结合好的分子,或事实可能如此,生高从底物产生产物的速率,升高信号传递能力,或升高化学通道活性的分子为激动剂。检测从底物产生的产物,信号传导或化学通道活性的速率或水平可通过用一种报告系统而增强。报告系统在该方面有用,报告系统包括但不限于比色,标记的底物转变成为产物,对BASB034多肽或多核苷酸活性变化敏感的一种报告基团,以及本领域中所熟知的结合分析。
用于BASB034激动剂分析的另一实例是一种竞争性分析,它结合于BASB034及BASB034-结合分子的潜在激动剂,重组的BASB034结合分子,天然底物或配体,或底物或配体模拟物,在适当的条件下用于竞争性抑制分析。BASB034能够被标记,如通过放射活性或一种比色化合物,这样,与结合分子结合的BASB034分子数量或转变成产物的数量能被精密地检测到以评价该潜在的拮抗剂的效果。
潜在的拮抗剂包括,除下面列举之外还有其它的,小的有机分子,肽,多肽及与本发明的多核苷酸和/或多肽结合的抗体,并因此抑制或灭绝其活性或表达。潜在的拮抗剂也可以是小的有机分子,肽,多肽如紧密相关的蛋白或在结合分子上结合一致位点的抗体,如结合分子,没有诱导BASB034诱导的活性,因此通过从结合中去除BASB034多肽和/或多核苷酸而阻止BASB034多肽和/或多核苷酸的活性或表达。
潜在的拮抗剂包括一种小的分子,它结合多肽并占据该多肽上的结合位点,因此阻止和细胞结合分子的结合,由此导致正常的生物学活性被抑制。小分子的实例包括但不限于小的有机分子,肽或肽样分子。其它潜在的拮抗剂包括反义分子(见Okano,J.Neurochem,56:560(1991);Oligodeoxynucleotides As Antisense Inhibitors of GeneExpression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988),描述了这些分子)。优选的潜在拮抗剂包括与BASB034相关的化合物及其变体。
在进一方面中,发明涉及通过遗传工程生产包括发明的多肽,或其片段,以及各种亚类(IgG,IgM,IgA,IgE)的免疫球蛋白的重链或轻链恒定区各个部分的可溶性融合蛋白。优选的作为免疫球蛋白是人IgG重链恒定区部分,特别是IgG1,其中融合发生在铰链区。在一具体的实施方案中,Fc部分可简单地通过掺入一种断裂序列而被去除,该断裂序列可用凝血因子Xa切断。而且,本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法,以及涉及使用其中的融合蛋白进行药物筛选,诊断及治疗。本发明的进一方面也涉及编码此类融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的实例可在国际专利申请WO94/29458及WO94/22914中找到。
这里提供的每一多核苷酸序列可用于抗菌化合物的发现及开发。表达之后,所编码的蛋白质,也可用作抗菌药物筛选的靶。此外,编码该编码蛋白的氨基末端区域或SD(shine-Delgarno)或各自mRNA的其它翻译帮助序列的多核苷酸序列能被用于构建反义序列以控制目标编码序列的表达。
本发明也提供了其中的多肽,多核苷酸,激动剂或拮抗剂在干扰一或多种病原和作为感染宿主的真核生物优选哺乳动物的初始生理相互作用中的应用。特别地,发明中的分子可用于:阻止细菌,特别是革格氏阳性和/或阴性细菌,粘附到真核细胞,优选地为哺乳动物,在内在装置上的胞外基质蛋白或在伤口中的胞外基质蛋白;阻止真核细胞,优选地哺乳动物,胞外基质蛋白和介导组织损伤的细菌BASB034蛋白间的粘附;和/或阻止有感染性的致病机理的进展启动而不是通过植入内在装置或通过其它的外科技术。
根据本发明的另一方面,还提供了BASB034激动剂及拮抗剂,优选地杀菌的或制菌的激动剂和拮抗剂。
本发明中的拮抗剂及激动剂可以用于,例如,阻止,抑制和/或治疗疾病。
在进一步的一个方面中,本发明涉及本发明多肽的模拟肽(mimotopes)。模拟肽是一种肽序列,与天然肽(序列或结构上)足够相似,它可以被识别天然肽的抗体所识别;或当与一种适宜的载体偶联时它能够富聚(raising)识别天然肽的抗体。
通过对选定的氨基酸增加,缺失或替换可以设计出用于特殊目的的模拟肽。这样,可因与一蛋白载体容易结合的目的而修饰肽。例如,用一些化学接合方法来加入末端半胱氨酸是可取的。此外,对于肽接入一种含有远离该肽接合末端的疏水端的蛋白载体也是可取的,这样该肽的游离未结合末端保持与该载体蛋白表面相联系。由此呈现该肽的一种构象,该构象与上下文中可见的全部天然分子的肽的构象最大地相似。例如该肽可以改变成具有N-末端半胱氨酸及C-末端疏水酰胺尾巴。可选择地,一或多个氨基酸的D-立体异构型的增加或替换可以被完成以创造一有益的衍生物,例如增强肽的稳定性。
可选择地,模拟肽可用抗体以如噬菌体展示技术(EP0552267B1)等技术加以鉴定,该抗体可与本发明的多肽结合。这一技术,产生大量的肽序列,这些肽序列与天然肽的结构相似并因此能够与抗天然肽抗体结合,但不要它们自己与天然肽享有显著的序列同源性。疫苗
发明的另一方面涉及一种在个体,尤其哺乳动物,优选地人中诱导免疫反应的方法,包括用BASB034多核苷酸和/或多肽,或其片段或其变体接种该个体,足够产生抗体和/或T细胞免疫反应以保护该个体免受感染,特别是细菌感染,最特别地是粘膜炎莫拉氏菌感染。也提供该免疫反应减慢细菌复制的方法。发明的另一方面涉及在个体中诱导免疫反应的方法,包括向该个体导入一种核酸载体,序列或核酶以指导BASB034多核苷酸和/或多肽或其片段或其变体的表达,以使在体内表达BASA034多核苷酸或/和多肽,或其片段或其变体以诱导免疫反应,如,产生抗体和/或T细胞免疫反应,包括,例如,细胞因子产生T细胞或细胞毒T细胞,以保护该个体,优选地是人,免受疾病侵害,无论该疾病已经存在与否。一种导入基因的实例是通过作为一种粒子或其它材料的包被而被加速导入靶细胞中。这样的核酸载体可包括DNA,RNA,核酶,修饰的核酸,DNA/RNA杂交分子,DNA-蛋白质化合物或RNA-蛋白质化合物。
本发明的进一步涉及一种免疫组合物,当导入一个体,优选地是人中时,能够在其内诱导免疫反应,在这样的个体中诱导一种对BASB034多核苷酸和/或其编码的多肽的免疫反应,其中该组合物包括重组的BASB034多核苷酸和/或其编码的多肽和/或包括DNA和/或RNA,该DNA和/或RNA编码及表达所说的BASB034多核苷酸,其编码的多肽,或本发明中其它的多肽的抗原。免疫反应可用于治疗或预防并可产生抗体免疫和/或细胞免疫形式,例如发生于CTL或OD4+T细胞中的细胞免疫。
BASB034多肽或其片段可与辅助蛋白(co-protein)或化学部分(chemical moiety)融合,该辅助蛋白或化学部分可以或不可以通过它们自己产生抗体,但它却能够稳定第一蛋白并产生一种融合或修饰的蛋白,它将具有抗原和/或免疫原的特性,并优选地保护特性。这样融合的重组蛋白,优选地进一步含有一种抗原性辅助蛋白,如来源于嗜血流杆菌的脂蛋白D,谷胱甘肽S转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶,或任何其它相关的稳定该蛋白并使制备及纯化容易的大的辅助蛋白。而且,在提供一种接受该蛋白的有机体的免疫系统综合刺激的意义上,该辅助蛋白可扮演一种佐剂的角色。该辅助蛋白可以附着在第一蛋白的氨基端或其羧基末端。
由本发明提供的是组合物,特别是疫苗组合物,及含有本发明中的多肽和/或多核苷酸的方法,以及免疫刺激性DNA序列,如那些在Sato,Y等Science273:352(1996)中所述的。
本发明也提供使用所述的多核苷酸或特别是其中的片段的方法,它们已被证明编码细菌细胞表面蛋白非变化区域,这些多核苷酸或其中的片段用在多核苷酸构建物中以用于粘膜炎莫拉氏菌感染的动物模型中的遗传免疫实验。这样的实验在鉴定能够引起预防或治疗免疫反应的蛋白表位中将是特别有用的。据信,该方法将考虑到随后的特殊价值的单克隆抗体的制备,从成功地抵抗或清除感染的动物需要的组织得来的,用于开发预防性试剂或细菌感染的治疗试剂,尤其是在哺乳动物,优选地为人中,粘膜炎莫拉氏菌感染。
本发明也包括一种疫苗制剂,它包含本发明的致免疫重组多肽和/或多核苷酸,和一种适宜的载体,例如一种药学上可接受的载体。由于多肽及多核苷酸在胃中可被破坏(break down),优选地不经肠胃给药,包括,例如,经皮下,肌肉内,静脉,皮肤内给药。适于皮下给药的形式包括水及非水无菌注射液,它可含有抗氧化剂,缓冲液,制菌化合物及溶解物,它使该制剂和体液等渗,优选地与血液等渗;并且水及非水的无菌悬浮液可包括悬浮剂或稠化剂。该制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中,例如,密封于安瓿瓶及玻璃小瓶中并可贮存于冻干条件下,只是在使用前需要时加入无菌水载体。
本发明的疫苗制剂也包括用以增强该制剂的致免疫性的佐剂体系。优选地该佐剂体系优先升高一种TH1型的反应。
免疫反应可以概括地区分成两种极端的类别,即一种体液或细胞介导的免疫反应(传统地分别通过抗体及保护细胞效应机制来辨别)。这些反应的类别被称作TH1型反应(细胞介导的反应),及TH2型免疫反应(体液反应)。
极端的TH1免疫应答可能以产生以下两种细胞为特点:抗原特异性的单元型限制性细胞毒T淋巴细胞和天然杀伤细胞,在小鼠中TH1类型应答经常以产生抗体IgG2a亚型为特点、而在人体中相应的是IgG1类型的抗体,TH1类型免疫应答以产生多种免疫球蛋白同位型为特点,在鼠类中包括IgG1、IgA和IgM。
可以认为在这两种类型免疫应答产生的背后的原动力是细胞因子,高水平的TH1类型细胞因子有利于诱导针对特定抗原的由细胞介导的免疫应答,而TH1类型免疫应答的高水平倾向于促进诱导针对性的体液免疫应答。
TH1类型和TH2类型免疫应答之间的区别并不是绝对的,实际上一个个体会产生一种主要是TH1或主要是TH2类型的免疫应答。然而,通过使用Mosmann和Coffman在鼠的CD4+veT细胞克隆中的条件去研究细胞因子的类型将会很方便。见(Mosmann,T.R.and Coffman,R.L.(1989)TH1和TH2细胞:不同类型的淋巴因子导致不同的功能特征Annual Review of Immunology,7,p145-173)。一般情况下,TH1类型应答与T淋巴细胞产生和TNF-γ和IL-2细胞因子相联系。其他直接与TH1类型免疫应答诱导相关的细胞因子不是由T细胞产生的,如IL-12。对应的,TH2类型应答与IL-4,IL-5,IL-6和IL-13的分泌相关。
已知一些疫苗佐剂非常适于诱发TH1或TH2类型的细胞因子应答。一般情况下,在接种或感染之后免疫应答TH1∶TH2平衡的最好标志包括以下两种:用抗原再次诱发后在体外对由T淋巴细胞产生的TH1或TH2细胞因子进行直接测量,和/或测量抗原特异性抗体应答IgG1∶IgG2a比例。
这样,TH1类型佐剂就是一种佐剂当在体外用抗原再次诱发时它可以优先地诱导分离的T细胞群产生高水平和TH1类型细胞因子并且促进产生CD8+细胞毒T淋巴细胞和与TH1类型同位型相关的抗原特异性免疫球蛋白应答。
能够优先地诱导TH1细胞应答的佐剂参见国际专利申请WO94/00153和WO95/17209。
3De-O-酰基化单磷酸酯A(3D-MPL)就是这样一种佐剂,这是由GB 2220211(Ribi)得知的,化学上它是3De-O-酰基化单磷酸酯A和4,5,6酰化链的混合物。由Ribi Immunochem,Montana生产。3De-O-酰化单磷酸酯A的一种优选形式见欧洲专利0689454B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)。
3D-MPL颗粒最好足够小以便滤过0.22微米的膜进行除菌(欧洲专利0689454)每剂中3D-MPL应在10μg~100μg之间,最好在25~50μg,每剂量中的抗原一般在2~50μg范围内。
另一种优选的佐剂包括QS21,它是由Quilluja Saponaria Molina树皮得到的一种Hplc纯化的无毒成分。任选地,可与3De-O-酰基化单磷酸酯A(3D-MPL)混合使用,任选联用一种载体。
QS21的生产方法见US patent No.5,057,540。包含QS21的非反应原性的佐剂以前有过叙述(WO96/33739)。这些包含QS21和胆固醇的制剂当与一种抗原配合时是成功的TH1诱发佐剂。
TH1细胞应答的另外一些优选诱发佐剂包括免疫调节寡核苷酸,如非甲基化的CpG序列见WO96/02555。
我们也研究了把上述提到的不同的TH1诱发佐剂进行组合产生TH1细胞应答的优先诱发剂。例如,QS21可与3D-MPL配制。QS21∶3D-MPL比例一般是1∶10到10∶1,最好在1∶5到5∶1,经常是基本上1∶1,最佳协作的合适范围为3D-MPL∶QS212.5∶1到1∶1。
候选地,在本发明的疫苗组合物中包含一种载体,这种载体可以是水包油乳剂,或是铝盐如铝磷酸盐或氢氧化铝。
水包油乳剂最好包含一种可代谢的油,如角鲨烯,α生育酚和吐温80。根据本发明,疫苗组合物中的抗原非常适合在这种乳剂中与QS21和3D-MPL混合,另外,水包油乳剂中的油可能包含斯潘85(span85)和/或卵磷酯和/或三辛酸甘油酯。
一般情况下对人用药QS21和3D-NPL在疫苗中应为1μg~200μg,如10~100μg,最好每剂量含10μg~50μg。一般情况下水包油乳剂会含有2~10%的角鲨烯,2~10%的α生育酚和0.3~3%的吐温80。角鲨烯:α生育酚的比例最好等于或小于1,这样可以形成更稳定一些的乳剂。还可以含有1%水平的斯潘85。在一些情况下,本发明的疫苗中进一步含有一种稳定剂可能效果不错。
无毒性水包油乳剂最好在水性载体中包含一种无毒油,如角鲨烷或角鲨烯,一种乳化剂,如吐温80。水性载体可以是,例如,磷酸缓冲盐水。
一种非常强力的佐剂制剂在水包油乳剂中包含QS21,3D-MPL和生育酚,见WO95/17210。
本发明还提供了一种多价疫苗组合物,它包括本发明的疫苗制剂,和其它抗原,尤其是一些对治疗癌症,自体免疫疾病和相关疾病有用的抗原。这样的多价疫苗可能包括上面描述的TH1诱导佐剂。
本发明虽然参照一些BASB034多肽和多核酸进行描述,应该认识到它们不仅包含天然生成的多肽和多核苷酸片段还包括类似的多肽和多核苷酸,后者虽含有插入、缺失或替换,但并没有显著改变重组多肽或多核苷酸的免疫原性。组合物,试剂盒和给药
本发明的另一方面提供了包含BASB034多肽和/或BASB034多核苷酸的组合物,用于细胞或一种多细胞生物。
本发明还涉及包括多核苷酸和/或多肽或它们的溴子动剂或拮抗药的组合物。本发明的多肽和多核苷酸可与下列载体结合使用:未灭菌的和无菌的载体或用于细胞、组织或生物体的载体,如适于对生物个体用药用载体。这些组合物包括,例如,一种媒介添加物或有效治疗量的本发明的多肽和/或多核苷酸和可药用的载体或赋形剂。这些载体可包括,但不仅限于,盐水,缓冲盐水,右旋糖,水,甘油,乙醇和它们的组合。制剂应适于用药的方式。本发明进一步涉及诊断和药用包装和试剂盒,包括装有本发明前面提到的组分中的一种或多种的一个或多个容器。
本发明的多肽,多核苷酸和其它化合物可单独使用也可与其他化合物如治疗化合物联用。
这些药物组合物可通过任何有效方便的方法进行用药,包括,例如局部的,口服的,肛门的,阴道的,静脉的,腹膜内的,肌内的,皮下的,鼻内的,真皮内的用药。
在治疗和预防中,该具有活性的药剂可作为可注射成分用于生物个体,例如无毒的水性分散体,最好是等渗的。
另一方面,本发明提供了药组合物,该组合物包括治疗有效量的多肽和/或多核苷酸,例如本发明的多肽和/或多核苷酸的可溶形式,增效或拮抗多肽或小分子化合物,以及药用的载体或赋形剂。这些载体包括,但不仅限于,盐水,缓冲盐水,右旋糖,水,甘油,乙醇和它们的组合。本发明进一步有关于药盒和试剂盒,包括装有本发明前面提到的组分中的一种或多种成分的一个或多个容器。多肽,多核苷酸和本发明的其他化合物可以单独使用或与其他化合物如治疗化合物结合使用。
组合物应根据用药方式,如全身的或口服的,进行调整。优选的全身用药方式包括注射,一般是静脉注射。也可使用其它的注射方式,如皮下,肌内或腹膜内注射。全身用药的其它可选方式包括使用渗透剂,如胆汁盐或夫西地酸或其它去垢剂进行跨粘膜和跨真皮用药。另外,如果本发明的多肽或其它化合物可制成肠衣或胶囊制品,口服也是可以的。这些化合物的用药也可以是局部的,如使用软膏,膏药,凝胶,溶液,粉末等形式。
对哺乳动物,尤其对人进行用药,该活性药剂的日剂量水平应为0.01mg/kg到10mg/kg,一般在1mg/kg左右。医师无论如何应确定生物个体的最适实际用量,该用量随特定个体的年龄、体重和应答而变化。以上的剂量只是平均水平,当然会出现超出以上范围的情况,这一情况属于本发明的范畴。
所需剂量范围取决于选取的多肽,用药的方式,制剂的性质,受治疗者的情况和医师的判断。然而,合适的剂量在0.1~100μg/kg范围内。
疫苗组合物很容易制成可注射的形式。可使用传统的佐剂增强免疫应答。用于接种的适当单位剂量为0.5~5mg/kg抗原,这种剂量最好间隔1~3周,用药1~3次,使用指定范围的剂量不会观察到本发明化合物的不利毒理反应,进而可用于合适的生物个体。
由于存在多种可使用的化合物并且不同用药方式的效率不同,导致所需剂量的大范围变化。例如,口服用药将会需要的剂量多于静脉注射。这些剂量水平的变化可使用标准的经验程序调节优化,这在本领域内为人们熟知。序列数据库,实体介质中的序列,和算法
多核苷酸和多肽序列形成一种很有价值的信息来源用于确定它们的二维和三维结构同时可用于鉴定类似的同源物的序列。通过以下过程可以大大加速上述进程:把序列存储于一种计算机可读介质中,用一种已知的大分子结构程序处理存储的数据或者使用熟知的搜索工具,如GCG套装软件去在序列数据库中进行搜索。
本发明还提供了用于分析特征序列或字串的方法尤其是基因序列和编码的蛋白序列。优选的序列分析方法包括,例如,序列同源分析方法,如一致性和相似性分析,DNA、RNA和蛋白的结构分析、序列组装,分支分析,序列基元分析,开放阅读框架确定,核酸碱基使用(calling),密码子使用分析,核酸碱基修饰和序列色谱图峰值分析。
提供了一种基于计算机的方法进行同源性鉴定。这一方法包括以下步骤:以计算机可读媒介提供原始多核酸序列,包括本发明的多核苷酸序列;把该原始序列与至少一种其他的多核苷酸或多肽序列进行比较,确定同源性。
还提供了一种基于计算机的用于鉴定同源性的方法,该方法包含以下步骤:以计算机可读介质提供原始多肽序列,包括本发明的多肽序列;把该原始多肽序列与至少一种其他的多核苷酸或多肽序列进行比较,确定同源性。
本说明书中引用的所有出版物和参考文献,包括但不限于专利和专利申请,在这里以整体形式被参考引入,在被全面阐述的过程中,似乎每一个单独的出版物或参考文献都被明确地单独地提出是在这里作为参考被引入的,被本申请要求优先权的任何专利申请也以上述同样方式作为整体参考引入。定义
“一致性”在本领域中是指两个或多个多肽序列之间或两个或多个多核苷酸之间的关系,它可通过比较序列确定,在本领域中,“一致性”同时指多肽或多核苷酸序列之间相关性的程度。可通过这些序列字串的相配进行确定,“一致性”可通过已知的方法方便地计算出来,这些方法包括但不仅限于下列文献中所描述的方法(ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxfoxd University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heine,G.,AcademicPress,1987;and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;and Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。确定一致性的方法被设计给出被测序列间的最大的相配,另外,确定一致性的方法被编写进入公共可以得到的计算机程序中。用于确定两序列间一致性的计算机程序包括但不限于,在GCG套装软件中的GAP程序(Devereux,J.,et al,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)),BLASTP,BLASTN(Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.215:403-410(1990),and FASTA(Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85;2444-2448(1998)。BLAST家族程序可从NCBI和其他来源公开得到(BLASTManual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894;Altschul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。大家熟知的SmithWaterman算法也可用于确定一致性。多肽序列比较包括以下参数:算法:Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)比较模型:BLOSSUM62 from tlenikoff and tlenikoff,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA.89:10915-10919(1992)。Gap Penalty:8Gap Length Penalty:2使用这些参数的程序可从Genetics Computer Group,Madison WI.以“gap”程序公开得到,前面提到的参数是多肽比较的默认参数(对于末端的gaps,没有penalty)。多核苷酸比较包括以下参数:算法:Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)比较模型:相配=+10,错配=0Gap Penalty:50Gap Length Penalty:3可从Genetics Computer Group,Madison WI.的“Gap”程序得到,这些参数是核酸比较的默认参数。
对于多核苷酸和多肽“一致性”的优选解释见以下(1)和(2)。
(1)多核苷酸实施方案进一步包括一种分离的多核苷酸,它包含一多核苷酸序列,该序列与SEQ ID No:1这一参照序列至少有50,60,70,80,85,90,95,97或100%的一致性。多核苷酸序列可能与参照序列SEQ ID No:1一致或者可能与参照序列相比有一定整数个数的核苷酸变化,其中这样变化至少包括一个核苷酸缺失,替换,包括转换和颠换,或插入。其中该变化可能发生在参照核苷酸序列的5′或3‘末端位置或两末端之间的任意位置,这些位置要么分散于参照序列的核苷酸中,要么在参照核苷酸序列的一个或多个连续组中,其中核苷酸变化的数目通过以下过程得来:用参照序列SEQ ID No:1的核苷酸总数去乘以用整数表示的一致性百分数除以100然后用SEQ ID No:1的核苷酸数目减去以上得到的乘积数值,即:nn≤xn-(xn· y)。其中nn是核苷酸变化的数目,xn是SEQ ID No:1中核苷酸的总数,y是0.50代表50%,0.60代表60%,0.70代表70%,0.80代表80%,0.85代表85%,0.90代表90%,0.95代表95%,0.97代表97%或者1.00代表100%。·是相乘运算的表示符号,其中xn和y的乘积在从xn中减去之前四舍五入至最接近的整数。SEQ ID No:2是编码多肽的多核苷酸序列,它的变化会导致编码序列中的无义,错义或读框偏移突变,进而改变由该多核苷酸编码的多肽。
作为实例,本发明的多核苷酸序列可能与参照序列SEQ ID No:1一致,也就是可能100%一致,或者它与参照序列相比可能包含一定整数个数的核苷酸变化,以致一致性百分比小于100%。这种变化至少包括一个核苷酸缺失,替换,包括转换和颠换,或插入。其中该变化可能发生在参照核苷酸序列的5′或3‘末端位置或两末端之间的任意位置,这些位置要么分散于参照序列的核苷酸中,要么处于参照序列的一个或多个连续组中。特定的一致性百分比的核苷酸变化数目可由以下过程得出:用参照序列SEQ ID No:1的核苷酸总数去乘以用整数表示的一致性百分数除以100,然后再用SEQ ID No:1的核苷酸总数减去以上得到的乘积,即:nn≤xn-(xn·y),其中nn是核苷酸变化的数目,xn是SEQ ID No:1中核苷酸的总数,y是,例如,0.70代表70%,0.80代表80%,0.85代表85%等,·是乘法运算的表示符号,其中xn和y的乘积在从xn中减去之前四舍五入至最相近的整数。
(2)多肽实施方案进一步包括一种分离的多肽,包含的多肽与多肽参照序列SEQ ID No:2至少有50,60,70,80,85,90,95,97或100%的一致性。该多肽序列与参照序列SEQ ID No:2可能一致或者可能包含一定整数数目的与参照序列不同的氨基酸。这些改变至少包括一个氨基酸缺失,替换,包括保守和非保守替换,或者插入。该变化可能发生在参照序列的氨基端或羧基端位置或者在两端之间的任意位置。它们独立地分散于参照序列的氨基酸中或位于参照序列的一个或多个连续组中,该氨基酸变化的数目可通过以下过程得到:用参照SEQ ID No:2中氨基酸的总数去乘整数表示的一致性百分数除以100,然后从SEQ ID No:2的氨基酸总数中减去该乘积,即:na≤xa-(xa· y),其中na是氨基酸变化的数目,xa是SEQ ID No:2中氨基酸的总数,y是0.50代表50%,0.60代表60%,0.70代表70%,0.80代表80%,0.85代表85%,0.90代表90%,0.95代表95%,0.97代表97%或1.00代表100%。·是乘法运算的表示符号。xa和y的任何非整数乘积在从xa中减去之前要四舍五入至最接近的整数。
作为实例,本发明的一种多肽可能与参照序列SEQ ID No:2一致,也就是100%一致,或者它可能包含与参照序列相比一定整数数目的氨基酸变化,以致一致性百分比小于100%。这些变化包括至少一个氨基酸缺失,替换,包括保守和非保守替换,或者插入。该变化可能发生在参照多肽序列的氨基或羧基末端位置或这两个末端之间的任意位置。它们独立地分散于参照序列的氨基酸中或者位于参照序列的一个或多个连续组中,特定一致性百分比的氨基酸变化数目可由以下方法算出:用SEQ ID No:2中氨基酸的总数去乘整数表示的一致性百分数除以100,然后从SEQ ID No:2的氨基酸总数中减去该乘积,即:na≤xa-(xa· y),其中na是氨基酸变化的数目,xa是SEQ ID No:2中氨基酸的总数,y是,例如,0.70代表70%,0.80代表80%,0.85代表85%等,·是乘法运算的表示符号。xa和y的任何非整数乘积在从xa中减去之前要四舍五入至最接近的整数。
“个体”当在这里用来指一种生物体的时候,是一种多细胞真核生物,包括但不仅限于后生动物,哺乳动物,卵生的(ovid),卵胎生(bovid),猿,灵长类动物和人类。
“分离的”是指从其自然状态经“人类的手”发生改变,也就是,如果它存在于自然界,它被改变或者从其原始环境移出或者两者都存在。例如,天然存在于生活着的生物体内的多核苷酸或多肽不是“分离的”,但同样的多核苷酸或多肽从其自然状态下的共存物质中分离出来则是“分离的”,正如该名词在这里的使用。另外,通过转染,遗传操作或任何其他重组方法转入的多核苷酸或多肽都是“分离的”,尽管它仍存在于该生物体中,后者可能是活的也可能是死的。
“多核苷酸”一般是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸,可能是未经修饰的RNA或DNA或是经过修饰的RNA或DNA,包括其单链和双链区域。
“变体”是指不同于参照多核苷酸或多肽的一种多核苷酸或多肽,但仍保持根本的性质,典型的多核苷酸变异体在核苷酸序列上与参照杠杆不同,变异体中核苷酸序列的改变可能会也可能不会改变参照多核苷酸所编码有多肽的氨基酸序列,如下所述,核苷酸的变化可能会导致参照序列编码多肽中氨基酸的替换,添加,缺失,融合和截短。典型的多肽变异体在氨基酸序列上与参照多肽不同,一般情况下,这种不同是有限的以便使变异体和参照多肽在总体上很相似并在一些区域内完全一致。变异体和参照序列氨基酸的不同可以是一个或多个替换,添加,缺失的任何组合,一个替换的或插入的氨基酸残基可能是也可能不是由遗传密码所编码的。多核苷酸和多肽的变异体可能是自然发生的,如等位变异体,或者也可能不是自然发生的,多核苷酸和多肽的自然发生的变异体可通过突变技术或直接合成而得到。
“疾病”是指任何由细菌感染引起的或与其相关的疾病,包括,例如,婴儿和儿童的中耳炎,中老年人的肺炎,窦炎,医院的感染和侵入性疾病,伴随听力丧失的慢性中耳炎,中耳积水,听神经损伤,语言学习滞后,上呼吸道感染和中耳炎症。
实施例:
下面的实施例使用标准的技术实施,除了那些详细描述的技术,这些技术对于本领域的技术人员来说是熟知和常规的,这些实施例用于说明而不是对本发明起限制作用。
实施例1:
从粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617发现和确认BASB034基因的DNA序列。
BASB034基因首次在Incyte PathoSeq数据库中发现,该数据库中含有粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC 43617(也叫菌株MC2931)的未完成的基因组DNA序列。BASB034多核苷酸的翻译表现出与肺炎克雷伯氏菌外膜磷脂酶A蛋白的很强的同源性(214个氨基酸重叠中有42%一致)。
BASB034基因的序列通过实验得到进一步的确证,为了这一目的,使用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒(Qiagen Gmbh),从1010个粘膜炎莫拉氏菌(菌株ATCC43617)细胞中提取基因组DNA。其中的1μg用于聚合酶链式反应DNA扩增,使用引物E481124(5′-GATTTA AGA GTA TGT TAT GAT G-3′)(SEQ ID NO:9〕和E481125(5′-GTA TGG GTT GAT CAA ATA CAG-3′)〔SEQ ID NO:10〕PCR产物用Biorobot9600(Qiagen Gmbh)设备纯化然后使用Big Dye CycleSequencing试剂盒(Perkin-Elmer)和ABI377/PRISM DNA测序仪进行测序。DNA测序使用丰度2在两条链上同时进行,全长序列使用SequencherTM软件(Applied Biosytems)进行装配,得到的DNA序列与SEQ ID NO:1100%一致。
实施例2:BASB034基因在几种粘膜炎莫拉氏菌菌株中的变异性分析2A:限制性片段长度多态性分析(RFLP)
如下所述从几种粘膜炎莫拉氏菌菌株(见表1)中提取基因组DNA。粘膜炎莫拉氏菌在BHI琼脂平板上划线,37℃过夜培养以获得单菌落。选取3至4个单菌落在约1.5ml BHI(脑-心浸液)肉汤接种培养物中接种并在37℃下约300rpm的摇床内培养过夜。在室温下,细胞通过Sorvall GSA转子约2000×g离心15分钟进行收集,用接种培养物在含有约150ml BHI肉汤的500ml锥形瓶中进行接种,在37℃下,约175rpm的摇床内培养约12~16小时以产生用于DNA提取的细胞团,在室温下,细胞通过Sorvall GSA转子约2000×g离心15分钟进行收集,去除上清,细胞颗粒物用约5ml的无菌水进行悬浮,再加入等体积的裂解缓冲溶液(200mM NaCl,20mM EDTA,40mMTris-HCl,pH8.0,0.5%(w/v)SDS,0.5%(v/v)2-巯基乙醇,和250μg/ml的蛋白酶K)并轻轻捣碎搅动进行悬浮,细胞悬浮液在50℃下培养约12小时以裂解细菌并释放染色体DNA,加入5.0ml的饱和NaCl(约6.0M,无菌水),并在室温下用转子Sorvall SS34约5500×g离心使蛋白物质沉淀。加入2倍体积的100%乙醇对澄清的上清液中的DNA进行沉淀,收集聚集的DNA,使用少量70%的乙醇溶液轻轻摇动冲洗。纯化的染色体DNA用无菌水悬浮并在4℃下摇动过夜以溶解/分配。使用分光光度计在260nm下用1.0OD值消光系数约50μg/ml来确定溶解的DNA的浓度。
得到的DNA用于PCR扩增,使用寡核苷酸MC-Pla-BamF(5′-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC CAA GCT GTA CCAAAT CCT GTG GCA TTT GTT G-3′)〔SEQ ID NO:11〕和MC-Pla-SalRC(5′-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTATAG ACC CAT CCA GTC GTT AAG CAT AAG-3′)〔SEQ ID NO:12〕使用限制性内切酶(HphI,AluI,RsaI,EcoRV,Sau3AI)对相应BASB034基因的扩增产物分别水解得到的限制性酶切产物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,所使用的标准的生物学方法参见“MolecularCloning,a Laboratory Manual,Second Edition,Eds:Sambrook,Fritsch&Maniatis,Cold Spring Harbor press1989“得到的凝胶电泳图见图1,对于每种菌株,相应于这6种限制性内切酶的图谱被记录并合并,然后划分出有着一致合并RFLP图谱的菌株组。使用这一方法,本研究所测菌株被分为3组(组1:Mc2931、Mc2904、Mc2905、Mc2907、Mc2909、Mc2910、Mc2911、Mc2912、Mc2926、Mc2931、Mc2956、Mc2969、Mc2975;组2:Mc2906、Mc2913;组3:Mc2908。(Mc2960未能扩增因此无法分类)。这些数据支持说明本研究所使用的粘膜炎莫拉氏菌种群表现出对于BASB034基因的核苷酸序列多样性。2B:其他菌株的DNA测序。
使用实施例1中描述的实验方法,确定了另外三种粘膜炎莫拉氏菌菌株中BASB034基因的序列。菌株Mc2908,Mc2913和Mc2969中的BASB034基因的核苷酸序列分别参见SEQ ID NO:3,5和7,它们分别代表以前分类的三组菌株。这些核苷酸序列被翻译成氨基酸序列,分别参见SEQ ID NO:4,6和8。使用DNASTAR Lasergene套装软件的MegAlign程序形成核苷酸序列SEQ ID NO:1,3,5,7的多重排列,见图2。一致性的成对比较概括于表2,表明这四种BASB034基因序列相似性均在98%以上。使用同样的程序形成蛋白序列SEQ IDNO:2,4,6和8的多重排列,见图3。一致性的成对比较概括于表3,表明这四种BASB034蛋白序列的相似性水平均在98%以上。综上所述,这些数据表明粘膜炎莫拉氏菌菌株间BASB034基因有着非常强的序列保守性。
表1:本研究中所使用的粘膜炎莫拉氏菌菌株的特征
菌株 | 分离于: | (分离)从: |
Mc2904 | 美国 | 鼓室硬化 |
Mc2905 | 美国 | 鼓室硬化 |
Mc2906 | 美国 | 鼓室硬化 |
Mc2907 | 美国 | 鼓室硬化 |
Mc2908 | 美国 | 急性耳炎鼓室硬化 |
Mc2909 | 美国 | 鼓室硬化 |
Mc2910 | 美国 | 鼓室硬化 |
Mc2911 | 美国 | 急性耳炎鼓室硬化 |
Mc2912 | 美国 | 急性耳炎鼓室硬化 |
Mc2913 | 美国 | 急性耳炎鼓室硬化 |
Mc2926 | 美国 | 鼓室硬化 |
Mc2931/ATCC43617 | 美国 | 跨气管吸出物 |
Mc2956 | 芬兰 | 中耳分泌液 |
Mc2960 | 芬兰 | 中耳分泌液 |
Mc2969 | 挪威 | 鼻咽(咽炎-鼻炎) |
Mc2975 | 挪威 | 鼻咽(鼻炎) |
表2:BASB034多核苷酸序列成对一致性比较(以%)
SeqID No:3 | SeqID No:5 | SeqID No:7 | |
SeqID No:1 | 98.7 | 99.2 | 99.7 |
SeqID No:3 | 99.3 | 98.7 | |
SeqID No:5 | 99.1 |
表3:BASB034多核苷酸序列成对一致性比较(以%)
实施例3:构建质粒表达重组的BASB034A:BASB034的克隆
SeqID No:4 | SeqID No:6 | SeqID No:8 | |
SeqID No:2 | 98.6 | 99.3 | 99.5 |
SeqID No:4 | 98.9 | 99.1 | |
SeqID No:6 | 99.3 |
BamHI和SalI限制性酶切位点分别加到上游(〔SEQ ID NO:11〕)和下游(〔SEQ ID NO:12〕)扩增引物中,使得BASB034的PCR产物能够定向地克隆到市场上可购得的E.coli表达质粒pQE30(QiaGen,氨苄抗性)上。成熟的BASB034蛋白可以融合表达并在N-端带有一个6(组氨酸)的亲和层析标记。根据厂家说明,使用硅胶基自旋柱(Silica gel-based spin columns)(QiaGen)对扩增反应中的BASB034 PCR产物进行纯化。为了获得克隆所必需的BamHI和SalI末端,根据厂家建议(Life Technologies)使用BamHI和SalI限制性酶对纯化得到的PCR产物进行完全地酶解。在使用第二种酶消化之前,再用上述的自旋柱对第一次酶解后的PCR产物进行纯化并用无菌水洗脱以去除盐份。消化的DNA片段在与pQE30质粒连接之前要再次使用硅胶基自旋柱对其进行纯化。B:表达载体的制备
为了制备用于连接的表达质粒pQE30,类似地用BamHI和Sall进行完全的酶解然后根据厂家说明用牛小肠磷酸酶(CIP,~0.02单位/pmole 5′末端,Life Technologies)处理以防止自身连接。大概使用6倍于制备好的载体的摩尔量的酶解用于连接反应,使用本领域熟知的方法,用T4 DNA连接酶(~2.0单位/反应,Life Technologies)进行标准的~20μl连接反应(~16℃,~16小时)。使用本领域内熟知的方法把等量的连接产物(~5μl)转入电穿孔感受态(electro-competent)M15(pREP4)细胞。经过37℃在~1.0ml LB肉汁培养基2-3小时的快速生长时期,转化的细胞被铺在含卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上,选择培养基上含有两种抗生素以确保所有转化的细胞既含pREP4质粒(KnR),该质粒含有lacIq基因,为抑制pQE30上IPTG诱导的蛋白表达所必需,又含有pQE30-BASB034质粒(ApR)。平板在37℃下培养过夜约16小时。用灭菌牙签挑取单个的KnR/ApR菌落然后“斑“接种新鲜的LBKnR/ApR平板和~1.0ml LB KnR/ApR肉汁培养物,它们均在标准培养箱(平板)或振荡水浴内37℃培养过夜。
使用一种完全基于细胞的PCR分析以确证转化体内含有BASB034DNA插入,在这里,把~1.0ml过夜LB Kn/Ap肉汁培养物转到一支1.5ml的聚丙烯试管中,用Beckman微量离心机(~3min,室温,~12000×g)离心收集细胞。细胞沉淀用~200μl的无菌水悬浮,使用~10μl等分级分用于含BASB034上、下游引物的~50μl体系PCR反应,PCR反应成分的终浓度与实例2中所指定的基本一致,除了这里使用~5.0单位的Taq聚合酶。开始的95℃变性步骤延长至3分钟以确保细菌的热裂解和质粒DNA的释放。使用ABI Model9700热循环仪和32循环3步骤热扩增,即95℃,45秒;55~58℃,45秒,72℃,1分钟,对来自裂解转化样品中的BASB034 PCR片段进行扩增,热扩增之后,用琼脂糖凝胶电泳(0.8%琼脂糖,Tris-酯酸盐-EDTA(TAE)缓冲液)。对~20μl等分级分的反应物进行分析,凝胶电泳、溴化乙淀染色后在UV光照下可观察DNA片段。一种DNA分子大小标准(1Kb梯,LifeTechnologies)与测试样品同时电泳过胶以估计PCR产物的大小,产生预计PCR产物的转化子被鉴定为含有BASB034表达构建体的菌株。然后对这些菌株进行分析以对重组BASB034进行诱导表达。C:PCR-阳性转化子的表达分析
对于以上鉴定出来的每一种PCR阳性转化子,用来自斑点平板的细胞接种含卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素的~5.0ml的LB肉汁培养基并在37℃摇晃(~250rpm)过夜培养,用等份(~1.0ml)的过夜接种培养物接种到含有~25ml LB Kn/Ap肉汁的锥形瓶中37℃振荡(~250rpm)培养直至培养物浑浊度达到OD600约0.5,也就是对数期中间(通常约1.5~2.0小时)。这时把大约一半的培养物(~12.5ml)转移到另一支125ml的锥形瓶中并加入IPTG(1.0M无菌水贮液,Sigma)至终浓度1.0mM以诱导重组BASB034蛋白的表达,把经IPTG诱导的和未经IPTG诱导的培养物在37℃继续振荡培养约4小时。诱导期后,取出经诱导的和未经诱导的样品(约1.0ml),用微量离心管在室温下离心约3分钟收集细胞。用~50μl的无菌水悬浮细胞颗粒,然后与等体积的含2-巯基乙醇的2×Laemelli SDS-PAGE样品缓冲液混合,置于沸水浴中3分钟以使蛋白变性,把等体积(~15μl)的粗IPTG诱导的和未诱导的细胞裂解物加样到完全一致的12%Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(1mm厚的Mini-gels,Novex),使用标准的SDS/Tris/甘氨酸电泳缓冲液(BioRad)在通常条件下把诱导和未诱导的裂解样品与预染色的分子量标记(SeeBlue,Novex)一起跑电泳。电泳后,一块胶用考马斯亮蓝R250(BioRad)染色再脱色以观察IPTG诱导的独特的BASB034蛋白。第二块胶使用BioRad Mini-Protean II杂交设备和Towbin′s甲醇(20%)转移缓冲液在4℃下经过2小时电转膜至PVDF膜上(0.45微米孔径,Novex)。根据本领域熟知的方法进行膜封闭和抗体培养,把二次免抗鼠抗体与HRP(QiaGen)结合后,使用单克隆的抗-RGS(His)3抗体来确证BASB034重组蛋白的表达和鉴定。用ABT不溶底物或Hyperfilm和Amersham ECL化学系统观察抗组氨酸抗体的反应方式。D:序列确认
为了进一步证实表达的IPTG诱导的重组BASB034蛋白是正确的阅读框架而不是克隆假阳性产生的假分子,所以确定了克隆插入的DNA序列。使用常规的不对称PCR循环测序方法(ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing,Perkin-Elmer)由一条链测得粘膜炎莫拉氏菌BASB034基因的DNA序列。测序反应使用未消化的表达质粒DNA(~0.5μg/rxn)作为模板,合适的pQE30载体特异性的和ORF特异性的测序引物(~3.5pmol/rxn),除了模板和测序引物,每一个测序反应物(~20μl)还含有四种不同的dNTP(即A,G,C和T)和四种相应的ddNTPs(即ddA、ddG、ddC和ddT)终止核苷酸。每种终止核苷酸均与四种荧光染剂:Joe,Tam,Rox或Fam中的一种相结合。单链测序延伸产物由于染料标记的ddNTP终止物的引入而沿模板在随机位置上发生终止。荧光染色标记的终止产物通过使用微离心大小排除色谱柱(Princeton Genetics)进行纯化,然后真空干燥,用模板重悬缓冲液(Perkin-Elmer)悬浮以用于毛细电泳或去离子甲酰胺PAGE在95℃下5分钟变性,然后用高分辨率毛细电泳(ABI310 AutomatedDNA Sequenator)依据厂商说明进行分析。以每个反应中收集DNA序列数据然后用ABI Sequence Analysis Software(Perkin-Elmer)在一台PowerMAC计算机上自动分析相对荧光峰值强度,在使用AutoAssembler软件(Perkin-Elmer)之前要对单个的自动分析DNA序列进行人工编辑以确保精确性,测序表明表达质粒包含正确的序列和正确的开放阅读框架。实施例4:制备重组的BASB034细菌菌株
一种E.coli M15(pREP4)重组表达菌株被用于制备细胞团进一步纯化重组的蛋白,它含有一种编码来自粘膜炎莫拉氏菌的BASB034的质粒(pQE30)。表达的菌株培养于含50μg/ml卡那霉素(“Kn”)和100μl/ml氨苄青霉素(“Ap”)的LB琼脂平板上以确保该菌株同时含有pREP4 lacIq调控质粒和pQE30-BASB034表达构建体。-80℃冷冻保存时,把菌株在含有一致抗生素浓度的LB肉汁培养基中扩繁然后与同体的含30%(w/v)的LB肉汁培养混合。培养基
用于制备重组蛋白的发酵培养基中含有2X YT肉汤(Difco),含50μg/ml Kn和100μg/ml的Ap,往发酵罐中加入0.25ml/L的抗沫剂(Antifoam 204,Sigma)。为了诱导BASB034重组蛋白的表达,还要往发酵罐中加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(终浓度1mM)。发酵
用0.3ml快速冻融的冷冻培养物或使用选择琼脂平板培养物上的若干菌落去接种含50ml工作体积的500ml锥形接种瓶。37±1℃下在振荡平台(150rpm,Innova2100,New Brunswick Scientific)上培养约12小时,这一接种培养基然后用于接种含2X YT肉汤和Kn、Ap抗生素的工作容积为5L的发酵罐。该发酵罐(Bioflo3000,New BrunswickScientific)的操作条件为:37±1℃,空气喷射0.2~0.4VVM,250rpm的Rushton叶轮。在锥形瓶和接种罐中pH值均无需调节,发酵过程中,发酵罐中的pH值范围为6.5至7.3当培养物达到对数生长中期(~0.7OD600)时,往发酵罐中加入IPTG(1.0M贮液,在无菌水中制备),细菌诱导2~4小时然后使用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速离心机(Seorvall Instruments)收集,细胞浆存贮在-20℃直到用于处理。纯化化学试剂和材料
咪唑,盐酸胍,Tris(羟甲基)和EDTA(乙二胺四乙酸)的生物工程纯或更纯均购于Ameresco Chemical,Solon,Ohio。试剂纯或更纯的三硝基甲苯(叔-辛基苯氧基聚氧乙醇),磷酸二氢钠和尿素都购自Sigma Chemical Company,St.Louis,Missouri。冰醋酸和盐酸购自Mallincrodt Baker Inc.,Phillipsburg,New Jersey。甲醇购自FisherScientific,Fairlawn,New Jersey.PefablocSC(4-(2-氨乙基)-苯亚磺酰氟),完全蛋白酶鸡尾酒药片和PMSF(苯甲基磺酰氟)均购自Rocho Diagnostics Corporation,Indianapolis,Indiana.苯丁抑制素、胃蛋白酶抑制剂A和E-64蛋白酶抑制剂购自Calibio chem,LaJolla,California。Dulbecco′s磷酸缓冲盐水(1×PBS)购自Quality Biological,Inc.,Gaithersburg,Maryland。Dulbecco′s磷酸缓冲盐水(10×PBS)购自BioWhittaker,Walkersville,Maryland。五-组氨酸抗体、BSA购自Qiagen,Valencia,California。与过氧化物酶结合的亲和纯羊抗鼠IgG购自Jackson Immuno Research,West Grove,Penn。AEC单溶液购自Zymed,South San Francisco,Califomia。所有其他的化学试剂均为试剂纯或更纯。
Ni-NTA Superflow树脂购自QiaGen,Inc.Valencia,California。预制的Tris-甘氨酸4~20%和10~20%聚丙烯酰胺凝胶及所有的缓冲液和溶液,SeeBlue预染色标准,MultiMark Multi-Colored Standards和PVDF转移膜购自Novex,San Diego,California。SDS-PAGE SilverStain试剂盒购自Daiichi Pure Chemicals Company Limited,Tokyo,Japan。考马斯染液购自Bio-Red Laboratories,Hercules,California。AcrodiscPF0.2m注射器过滤器购自Whatman,Inc.,Clifton NewJersey。透析管8,000MWCO购自BioDesign Inc.Od NeW York,CarmalNew York,BCA蛋白鉴定试剂Snake Skin透析管3,500MWCO购自Pierce Chemical Co.,Rockford,Illinois。提取方案
细胞沉淀置于室温下30至60分钟进行冻融,称量5至6克材料移至50ml一次性离心管中,加入5mls/gram的盐酸胍(Gu-HCl)缓冲液(6M盐酸胍,100mM磷酸二氢钠,10mM Tris和0.05%TritonX-100,pH8.0)。使用PRO300D proseientific均浆器在3/4马力重悬细胞浆1分钟提取混合物在室温下轻轻振荡60至90分钟。之后把提取混合物在15800×g下离心15分钟(Sorvall RC5C离心机,11,500rpm)。上清(S1)轻轻移出并贮存用于进一步纯化,颗粒沉淀保存用于分析。把BASB034结合到Nickel-NTA树脂上
往S1中加入3~4ml的Ni-NTA树脂,然后在室温下轻轻振荡l小时,接着把S1/Ni-NTA加到XK16 Pharmacia柱上,用1M的Gu-HCl缓冲液(1M盐酸胍,100mM磷酸二氢钠,10mM Tris和0.05的Triton X-100,pH8.0)进行洗脱,然后再用磷酸缓冲液(100mM磷酸二氢钠,10mM Tris和0.05%Triston X-100,pH6.3)洗脱。最后用250mM的咪唑缓冲液(250mM咪唑,100mM磷酸二氢钠,10mMTris和0.05%Triton X-100,pH5.9)把蛋白从柱上洗脱下来。最终形式
以0.1%Triton X-100和1X PBS,pH7.4为背景对BASB034进行过夜透析以去除残留的盐酸胍和咪唑,纯化得到的蛋白进行鉴定并按以下叙述的方法去制备抗体。生化鉴定SDS-PAGE和Western杂交分析
纯化的重组蛋白溶入4~20%的聚丙烯酰胺凝胶然后电转移到PVDF膜上,如前所述100V下1个小时(Thebaine et al.1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:4350~4354)。PVDF膜用含有5%不含脂肪的干牛奶的25ml Dulbecco′s磷酸缓冲盐水进行预处理,以后的所有培养均使用这一预处理缓冲液。PVDF膜在室温下用25ml 1∶500稀释的免疫前血清或兔抗组氨酸免疫血清培养1小时,然后用洗脱缓冲液(20mMTris缓冲液,pH 7.5,含150mM氯化钠和0.05%Tween-20)洗脱两次。PVDF膜在室温下用25ml 1∶500稀释的过氧化物酶标记的羊-抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)培养30分钟,然后用洗脱缓冲液洗脱四次再对每个PVDF膜用Zymed(San Francisco,CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和尿素过氧化物显影10分钟。
SDS-PAGE(图4)的结果显示了一种大约60Kda大小的蛋白,该蛋白通过Western杂交(图5)可与抗-RGS(组氨酸)抗体发生反应。蛋白测序
使用明确规定的化学方法,对纯化的蛋白进行氨基末端测序以确证制备的重组蛋白的正确。使用的测序仪为Hewlett-Packard241测序仪和1100LC。实施例5:重组BASB034的抗血清制备
通过使用纯化的重组BASB034蛋白接种2只兔子以制备BASB034蛋白的多价抗血清每只兔子进行总共三次肌内免疫,每隔约21天注射一次,每次约20μg BASB034蛋白(开始用完全Freund佐剂,接下来用不完全的Freund佐剂,在首次免疫前(“预抽血”)和35天及57天对兔子进行抽血。使用纯化的重组BASB034蛋白(0.5μg/well)进行ELISA以确定抗-BASB034蛋白效价。效价定义为等于或大于0.1的最大稀释,通过下式进行计算:二个抗血清测试样品的平均OD-二个缓冲液测样品的平均OD,三次免疫后的效价大约在1000000附近。
如实施例4所述,抗血清被用作Western杂交中鉴定蛋白的第一抗体。Western杂交表明免疫动物的血清中存在抗-BASB034抗体(图6)。实施例6:BASB034基因非编码侧翼序列分析及其利用来调控BASB034基因表达
BASB034基因的非编码侧翼序列含有对基因表达有重要作用的调控元件,这一调控在转录和翻译水平上均有发生。这些区域的序列,该基因开放阅读框架的上游或下游,可通过DNA测试得到。这些序列信息使得确定可能的调控基元成为可能,例如不同的启动子元件,终止子序列,诱导序列元件,阻遏子,可能的导致时相变化的序列,Shine-dalgarno序列,二级结构可能参与调控的区域,还有其它类型的调控基元或序列。这些序列信息使得基因BASB034能够调控其自然表达。基因表达的上游调控可通过改变以下序列实现:启动子,Shine-dalgarno序列,可能的阻遏子或操纵元件或其他的相关元件,相应的,表达的下游调控可通过类似类型的修饰来实现,另外,通过改变时相变化序列,基因的表达可被置于时相变化的控制下或者与这一调控解耦联。在另外一种方法中,可把基因的表达置于一个或多个诱导元件的控制下以调控表达。这些调控的例子包括,但不仅限于,温度变化诱导,加入诱导底物如选择的碳水化合物及其衍生物。痕量元素,维生素,辅因子,金属离子等。
以上所述的改变可通过几种不同的途径完成,参与基因表达的序列的改变可在体内通过随机突变完成,然后挑选目的表型。另一种方法包括分离感兴趣的区域,通过随机突变或定点突变,插入或缺失突变使其改变,改变的区域可通过同源重组转入细菌的基因组,然后分析基因表达的效果。另一种方法是利用感兴趣区域的序列知识替换或去除全部或部分天然调控序列,在这种情况下,目标调控区域被分离并改变以包括以下不同来源的调控元件:来自另外一个基因或来自不同基因调控元件组合或来自一段合成的调控序列或来自任何其他的调控序列或去除野生型调控序列的选定部分。然后,这些改变的序列可通过同源重组转入细菌的基因组。以下是可用于基因表达上游调控的优选启动子不完全清单:来自脑膜炎奈瑟代球菌(N.meningitidis)或淋病奈瑟氏球菌(N.gonorroheae)的启动子porA,porB,ldpB,tbpB,p110,lst,hpuAB。
在一个例子中,基因的表达可通过把其启动子与一种较强的启动子交换而得以改变(分离该基因的上游序列,体外改变该序列再通过同源重组使其重新进入基因组,上游调控的表达产物可在细菌中和由细菌脱落(或产生)的外膜囊泡中得到。在其他的例子中,这些描述的方法可用于制备家具有改良接种特性的重组细菌菌株。它们是,但不仅限于,减弱菌株,目的抗原增强表达的菌株,干预免疫应答的基因踢除(或减弱表达)的菌株,免疫优势蛋白调控表达的菌株,外膜囊泡调控脱落的菌株。
直接在BASB034基因上游的一段区域由SEQ ID NO:13序列给出,该序列是本发明的又一方面。序列信息BASB034多核苷酸和多肽序列SEQ ID NO:1菌株ATCC43617中的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多核苷酸序列ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCTATTTTGTCATGTTTTGCTATCCTAGCCATTCAGCAAGCACAAGCTGTACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTGAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACCCATTGATGTCCAAAGTGCGACACAATCAGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTTTAGAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCTCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCATGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAACCCCAGGTTATCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCCAAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCACTTTGGTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCAGTCATGAAGCAAAACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCTCCCGAGCTAAAATTTCAGGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCTGCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGATATACACAGCAATCGCACTGGCAGATTTTTAATGGAAAAAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGACTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTATACTCAGACTTACCATGGGATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAATCGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGCTAGTGGCAGCCAGCCAGATGATAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTGCGTTTTTTATATCAACTAGAAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTATCCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAAGGCTATGGGCAGTCTTTGATTGATTATAATCATGAGGCGACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAASEQ ID NO:2由SEQ ID NO:1的多核苷酸推导出的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽序列SEQ ID NO:3菌种Mc2908中的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多核苷酸序列ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCTATTTTGCCATGTTTTGCTATCCTAGCCATTCAGCAAGCACAAGCTGTACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTAAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACTCATTGGTGTACAAAGTGCGACACAATCAGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTTTAGAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCTCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCATGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAACCCCAGGTTGTCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCCAAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCGCTTTGGTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCAGTCATGAAGCAAGACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCCCCTGAATTAAAATTTCAAGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCTGCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGGTATACACAGCAATCGCACTGGCAGATTTTTAATGGAAAAAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGATTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTGTACTCAGACTTACCATGGGATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAATCGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGGTAGTGGCAGCCAGCCAGATGACAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTGCGTTTTTTATATCAACTAGAAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTATCCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAGGCTATGGGCAGTCTTTGATTGATTATAATCATGAGGCGACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAASEQ ID NO:4由SEQ ID NO:3的多核苷酸序列推导出的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽序列SEQ ID NO:5菌株Mc2913中的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多核苷酸序列ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCTATTTTGTCATGTTTTGCTATCCTAGCCATTCAGCAAGCAAAAGCTGTACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTGAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACCCATTGATGTCCAAAGTGCGACACAATCAGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTTTAGAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCTCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCATGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAACCCCAGGTTGTCTATCAAGAAACGACAGATCCCATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCCAAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCACTTTGGTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCAGTCATGAAGCAAGACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCCCCTGAATTAAAATTTCAAGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCTGCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGATATACACAGCAATCGCACTCGCAGATTTTTAATGGAAAAAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGATTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTATACTCAGACTTACCATGGGATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAATCGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGGTAGTGGCAGCCAGCCAGATGACAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTGCGTTTTTTATATCAACTAGAAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTATCCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAGGCTATGGGCAGTCTTTGATTGATTATAATCATGAGGCGACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAASEQ ID NO:6由SEQ ID NO:5的多核苷酸推导出的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽序列SEQ ID NO:7菌株Mc2969中的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多核苷酸序列ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCTATTTTGCCATGTTTTGCCATCCTAGCCATTCAGCAAGCACAAGCTGTACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTGAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACCCATTGATGTCCAAAGTGCGACACAATCGGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTTTAGAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCTCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCATGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAACCCCAGGTTGTCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCCAAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCACTTTGGTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCAGTCATGAAGCAAAACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCTCCCGAGCTAAAATTTCAGGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCTGCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGATATACACAGCAATCGCACTGGCAGATTTTTAATGGAAAAAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGACTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTATACTCAGACTTACCATGGGATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAATCGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGGTAGTGGCAGCCAGCCAGATGATAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTCCGTTTTTTATATCAACTAGAAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTATCCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAGGCTATGGGCAGTCTTTGATTGATTATAATCATGAGGCGACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAASEQ ID NO:8由SEQ ID NO:7的多核苷酸推导出的粘膜炎莫拉氏菌BASB034多肽序列MKVSLSTLTLSILPCFAILAIQQAQAVPNPVAFVDEVRSENDLGQDNELPIDVQSATQSASTDTANPLDEHEPELYTTALENKTMLINCSALNQDIMRLACYDTLVHGETPAVIKTKRSIRLDETIWQTIKGKPQVVYQETTDPIFLMGNEKGMLTKKDAKQLEYAAKQFTPLSLSFDLDRNNTPLWSSRPHNPMYVLPIFMHGKPNRSPNTPSHEAKQFIPNEFRAPELKFQVSVKVKAAEDLWGTDSDLWFGYTQQSHWQIFNGKNSRPFRVHDYQPEIFLTQPVYSDLPWDGKVRMIGMGAVHHSNGESAKLSRSWNRAYLMAGMEWKNLTVMPRIWGRIFKEGSGSQPDDNPDILDYYGYGDVRFLYQLENKSNISGTVRYNPRSGKGALQLDYVYPLGKGISGYFQIFQGYGQSLIDYNHEATSFGVGLMLNDWMGLSEQ ID NO:9GAT TTA AGA GTA TGT TAT GAT GSEQ ID NO:10GTA TGG GTT GAT CAA ATA CAGSEQ ID NO:11AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC CAA GCT GTA CCA AAT CCTGTG GCA TTT GTT GSEQ ID NO:12AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TAG ACC CAT CCAGTC GTT AAG CAT AAGSEQ ID NO:13ACTTGGCGAAAATACCATTTATATCGATTGTGATGTTATACAGGCAGATGGCGGTACACGCACAGCCAGTATCAGTGGTGCTGCGGTGGCACTTATTGATGCTTTAGAACACTTGCAGCGTCGTAAAAAGCTTACCCAAGATCCGCTTTTGGGCTTGGTGGCAGCGGTTTCTGTGGGTGTTAATCAAGGCCGTGTATTGCTTGATTTGGATTATGCTGAAGATTCAACTTGTGATACCGATTTAAATGTGGTCATGACGCAGGCAGGTGGGTTTATTGAGATTCAAGGCACAGCAGAAGAAAAGCCATTTACTCGTGCTGAAGCTAATGCGATGCTTGATTTGGCAGAGCTGGGAATTGGGCAGATTATCGAAGCCCAAAAGCAAGTATTAGGCTGGTGATATGCTAATCGTTGAAGATAATGGCGTGATCATCACATTAAATGGACAAGTAAAAGACCCATTATTTTGGTGGTCGATGATATTGCTGCTGCTGGGTGTCTTGGTGGCAATCATTTGTTTGATTGCACCCGTTTTTTATGCAATCGGTGCGTTGGCTTTATTTGCAGTTGTGGTATTTGTGTTTAATATTCAAAGGCAAAAAGCCAAAACTTGTCATATGTTTTCACAAGGTCGCTTGAAGATTACGTCCAAACGCTTTGAGATTCATAACAAATCACTAACCTTATCAGCATCGGCAACAATATCTGCTAAAGATAACAAAATGACAATTGTTGATCGGGGCATTGAATATCATTTTACAGGTTTTGCTGATGACCGTGAAATTAATATAGCCAAACAGGTACTTTTGGGAAAGTCAATCAAAACCAATGCGGTGGCGGTAACATTGGCTAAGTAGTTGTTGTGATACAGACAGGTTGGATGGTCTTTAACTCCACCCACCTAACTTTTTCTTTGTTTGGATTTAAGAGTATGTTATGATGGGCAGGATTTTATTTTAAGTCATCATTTAATGCAATCAGTTGTCCAGAGTAGCCGTTC保藏材料
一种含有粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis Catlin)菌株的保藏物于1997年6月21日保藏于美国典型培养物保藏中心(这里的“ATCC”),分配的保藏号为43617存贮描述为Branhame lla catarrholis(Frosch and kolle)冷冻干燥,来源于一位患有慢性支气管炎煤矿工人的跨气管吸出物中的粘膜炎莫拉氏菌并由此构建的1.5~2.9kb插入片段的文库。该保藏物描述于Antimicrod Agents Chemother21:506~508(1982)。
这里的“保藏的菌株”或“保藏的菌株的DNA”指的是粘膜炎莫拉氏菌菌种保藏物。
保藏的菌株包含全长的BASB034基因。
由粘膜炎莫拉氏菌DNA插入pQE30形成的载体pMC-PLA1的保藏物于1999年2月12日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),分配的保藏号为207099。
如果与这里的序列描述发生冲突,要以保藏的菌株或保藏的克隆中的多核苷酸序列及其编码的多肽序列为准。
保藏的菌种/克隆保藏物的制备符合布达佩斯条约中关于用于专利程序目的的分子生物保藏的规定。专利一旦公开,保藏的菌株将无限制或条件地向公众发放且不会改变,保藏的菌种只是为了本领域内技术人员的方便而不是必须保藏,如35U.S.C.§112。
序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals S.A.<120>新化合物<130>BM45332<160>13<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1329<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌
<400>1atgaaagttt cactgtctac attgacttta tctattttgt catgttttgc tatcctagcc 60attcagcaag cacaagctgt accaaatcct gtggcatttg ttgacgaagt acgcagtgaa 120aatgatcttg ggcaagacaa tgaattaccc attgatgtcc aaagtgcgac acaatcagcg 180tctactgata cggccaatcc tttagacgaa catgaaccag agctttatac gacagcttta 240gaaaataaaa ccatgctgat taactgctca gcacttaatc aagatatcat gcgtttggcg 300tgctatgaca ctttggtgca tggtgagacg ccagcggtaa ttaaaaccaa gcgttccatt 360cgccttgatg aaacaatttg gcagaccatc aaaggcaaac cccaggttat ctatcaagaa 420acgacagatc cgattttttt aatgggtaat gaaaaaggca tgctgaccaa aaaagatgcc 480aaacagcttg aatatgcagc caaacagttt acaccactga gcttatcatt tgatttagac 540cgaaataata caccactttg gtcatcacga ccacacaatc cgatgtatgt attgcccata 600tttatgcacg gtaagcctaa tcgaagccca aatacgccca gtcatgaagc aaaacaattt 660accccaaatg aatttcgtgc tcccgagcta aaatttcagg tttctgttaa ggttaaagct 720gctgaggatt tatgggggac ggattcagat ttatggtttg gatatacaca gcaatcgcac 780tggcagattc ttaatggaaa aaactcccgt ccttttagag tacatgacta ccagccagag 840attttcttaa ctcaacctgt atactcagac ttaccatggg atggcaaagt ccgcatgatc 900ggcatgggcg cggtacatca tcccaatggt gaaagtgcca aactgtctcg ctcatggaat 950cgtgcttatt tgatggcagg catggaatgg aaaaacccga ctgtcatgcc acgcatttgg 1020gggcgtatct ttaaagaggg tagtggcagc cagccagatg ataatcctga tatcttggac 1080tattatggtt atggtgacgt gcgtttttta tatcaactag aaaataaaag taatatttca 1140ggtacggtac gctataatcc acgctcaggc aaaggtgcgt tgcaacttga ctacgtctat 1200ccgcttggta agggaattag tggctatttt caaatatttc aaggctatgg gcagtctttg 1260attgattata atcatgaggc gacaagcttt ggcgtcggac ttatgcttaa cgactggatg 1320ggtctataa 1329<210>2<211>442<212>蛋白质<213>粘膜炎莫拉氏菌
<400>2Met Lys Val Ser Leu Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ile Leu Ser Cys Phe1 5 10 15Ala Ila Leu Ala Ile Gln Gln Ala Gln Ala Val Pro Asn Pro Val Ala
20 25 30Phe Va1 Asp Glu Val Arg Ser Glu Asn Asp Leu Gly Gln Asp Asn Glu
35 40 45Leu Pro Ile Asp Val Gln Ser Ala Thr Gln Sar Ala Ser Thr Asp Thr
50 55 60Ala Asn Pro Leu Asp Glu His Glu Pro Glu Leu Tyr Thr Thr Ala Leu65 70 75 80Glu Asn Lys Thr Met Leu Ile Asn Cys Ser Ala Leu Asn Gln Asp Ile
85 90 95Met Arg Leu Ala Cys Tyr Asp Thr Leu Val His Gly Glu Thr Pro Ala
100 105 110Val Ile Lys Thr Lys Arg Ser Ile Arg Leu Asp Glu Thr Ile Trp Gln
115 120 125Thr Ile Lys Gly Lys Pro Gln Val Ila Tyr Gln Glu Thr Thr Asp Pro
130 135 140Ile Phe Leu Met Gly Asn Glu Lys Gly Ket Leu Thr Lys Lys Asp Ala145 150 155 160Lys Gln Leu Glu Tyr Ala Ala Lys Gln Phe Thr Pro Leu Ser Leu Ser
165 170 175Phe Asp Leu Asp Arg Asn Asn Thr Pro Leu Trp Ser Ser Arg Pro His
180 185 190Asn Pro Met Tyr Val Leu Pro Ile Phe Met His Gly Lys Pro Asn Arg
195 200 205Ser Pro Asn Thr Pro Ser His Glu Ala Lys Gln Phe Thr Pro Asn Glu
210 215 220Phe Arg Ala Pro Glu Leu Lys Phe Gln Val Ser Val Lys Val Lys Ala225 230 235 240Ala Glu Asp Leu Trp Gly Thr Asp Ser Asp Leu Trp Phe Gly Tyr Thr
245 250 255Gln Gln Sar His Trp Gln Ile Phe Asn Gly Lys Asn Ser Arg Pro Phe
260 265 270Arg Val His Asp Tyr Gln Pro Glu Ile Phe Leu Thr Gln Pro Val Tyr
275 280 285Ser Asp Leu Pro Trp Asp Gly Lys Val Arg Met Ile Gly Met Gly Ala
290 295 300Val His His Ser Asn Gly Glu Ser Als Lys Leu Ser Arg Ser Trp Asn305 310 315 220Arg Ala Tyr Leu Met Ala Gly Met Glu Trp Lys Asn Leu Thr Val Met
325 330 335pro Arg Ile Trp Gly Arg Ile Phe Lys Glu Gly Ser Gly Ser Gln pro
340 345 350Asp Asp Asn Pro Asp Ile Leu Asp Tyr Tyr Gly Tyr Gly Asp Val Arg
355 360 365Phe Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Lys Ser Asn Ile Ser Gly Thr Val Arg
370 375 380Tyr Asn Pro Arg Ser Gly Lys Gly Ala Leu Gln Leu Asp Tyr Val Tyr385 390 395 400Pro Leu G1y Lys Gly Ile Ser Gly Tyr phe Gln Ile Phe Gln Gly Tyr
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<212> DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌
<400>3atgaaagttt cactgtctac attgacttta tctattttgc catgttttgc tatcctagcc 60attcagcaag cacaagctgt accaaatcct gtggcatttg ttgacgaagt acgcagtaaa 120aatgatcttg ggcaagacaa tgaattactc attggtgtac aaagtgcgac acaatcagcg 180tccactgaca cggctaatcc tttagacgaa catgaaccag agctttatac gacagcttta 240gaaaataaaa ccatgctgat taactgctca gcacttaatc aagatatcat gcgtttggcg 300tgctatgaca ctttggtgca tggtgagacg ccagcggtaa ttaaaaccaa gcgttccatt 360cgccttgatg aaacaatttg gcagaccatc aaaggcaaac cccaggttgt ctatcaagaa 420acgacagatc cgattttttt aatgggtaat gaaaaaggca gtctgaccaa aaaagatgcc 480aaacagcttg aatatgcagc caaacagttt acaccactga gcttatcatt tgatttagac 540cgaaataata caccgctttg gtcatcacga ccacacaatc cgatgtatgt attgcccata 600tttatgcacg gtaagcctaa tcgaagccca aatacgccca gtcatgaagc aagacaattt 660accccaaatg aatttcgtgc ccctgaatta aaatttcaag tctctgttaa ggttaaagct 720gctgaggatt tatgggggac ggattcagat ttatggtttg ggtatacaca gcaatcgcac 780tggcagattt ttaatggaaa aaactctcgt ccttttagag tacatgatta ccagccagag 840attttcttaa ctcaacctgt gtactcagac ttaccatggg atggcaaagt ccgcatgatt 900ggcatgggtg cggtacatca ttccaatggt gaaagtgcca aactgtctcg ctcatggaat 960cgtgcttatt tgatggcagg catggaatgg aaaaacctga ctgtcatgcc acgcatttgg 1020gggcgtatct ttaaagaggg tagtggcagc cagccagatg acaatcctga tatcttggac 1080tattatggtt atggtgatgt gcgtttttta tatcaactag aaaataaaag taatatttca 1140ggtacggtac gctataatcc acgctcaggc aaaggtgcgt tgcaacttga ctatgtctat 1200ccgcttggta agggaattag tggctatttt caaatatttc aaggctatgg gcagtctttg 1260attgattata atcatgaggc gacaagcttt ggcgtcggac ttatgcttaa cgactggatg 1320ggtctataa 1329<210>4<211>442<212>蛋白质<213>粘膜炎莫拉氏菌
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Claims (24)
1.一种分离的多肽,包括与选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列有至少85%一致的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的多肽,其中的氨基酸序列与选自SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列有至少95%一致。
3.权利要求1的多肽,包括选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的分离的多肽。
5.一种权利要求1到4中任一项的多肽的免疫原性片段,其中该免疫原性片段的免疫原性活性与多肽SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8基本一致。
6.一种分离的多核苷酸,包含一段核苷酸序列,该核苷酸序列编码的多肽分别与SEQ ID NO:2,4,6,8的氨基酸序列在全长范围内有至少85%一致;或者与该分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
7.一种分离的多核苷酸,包含一段核苷酸序列,该核苷酸序列与编码多肽SEQ ID NO:2,4,6,8的核苷酸序列在整个编码区内有至少85%一致;或者与该分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
8.一种分离的多核苷酸,包含一段核苷酸序列,该序列分别与SEQID NO:1,3,5,7在全长范围内有至少85%一致;或者与该分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
9.权利要求6到8中任一项的分离的多核苷酸,其中它与SEQ IDNO:1,3,5,7至少有95%一致。
10.一种分离的多核苷酸,包括编码多肽SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
11.一种分离的多核苷酸,包括多核苷酸SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7。
12.一种分离的多核苷酸,包含编码多肽SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的核苷酸序列,它可通过使用含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7序列或其片段的探针在严格的杂交条件下筛选合适的文库而得到。
13.一种表达载体或重组活微生物,包括权利要求6~12中任一项的分离的多核苷酸。
14.一种包括权利要求13的表达载体的宿主细胞,或所说宿主细胞的表达分离多肽的膜,所说的分离多肽包括与选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中的氨基酸序列有至少85%一致的氨基酸序列。
15.一种制备多肽的方法,该多肽包括选自SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中的氨基酸序列有至少85%一致的氨基酸序列,该方法包括在足以制备该多肽的条件下,培养权利要求15的宿主细胞和从培养基中收集多肽。
16.一种表达权利要求6~12中任一项的多核苷酸的方法,包括用含有至少一种所说多核苷酸的表达载体转化宿主细胞和在足以使该多核苷酸中任何一个发生表达的条件下培养该宿主细胞。
17.一种疫苗组合物,包括有效量的权利要求1至5中任一项的多肽和一种可药用载体。
18.一种疫苗组合物,包括有效量的权利要求6-12中任一项的多核苷酸和可药用载体。
19.权利要求17或18的疫苗组合物,其中该组合物包括至少一种其他的粘膜炎莫拉氏菌抗原。
20.一种抗体,它对于权利要求1至5中任一项的多肽或免疫片段具有免疫专一性。
21.一种诊断莫拉氏菌感染的方法,包括鉴定权利要求1-5中任一项的多肽,或者鉴定对于该多肽具有免疫专一性的抗体,它们存在于可能感染的动物的生物样品中。
22.包括有效量的权利要求1-5中任一项的多肽的组合物在制备用于在动物中产生免疫反应的药物中的应用。
23.包括有效量的权利要求6-12中任一项的多核苷酸的组合物在制备用于在动物中产生免疫反应的药物中的应用。
24.一种用于治疗患有粘膜炎莫拉氏菌病的人类患者的治疗组合物,包括至少一种抗权利要求1-5中任一项的多肽的抗体和合适的药物载体。
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