CN1367790A - 粘膜炎莫拉氏菌basb114多肽抗原及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供BASB114多肽和编码BASB114多肽的多核苷酸以及通过重组技术生产这种多肽的方法。本发明还提供诊断性、预防性和治疗性的应用。

Description

粘膜炎莫拉氏菌BASB114多肽抗原及其用途

                       发明领域

本发明涉及多核苷酸(本文中称“BASB114多核苷酸”)、它们编码的多肽(本文中称“BASB114”或“BASB114多肽”)、重组物质以及它们的制备方法。在另一个方面，本发明涉及使用这种多肽和多核苷酸包括抵抗细菌感染的疫苗的方法。再一方面，本发明涉及检测某些病原体感染的诊断试验。

                       发明背景

粘膜炎莫拉氏菌(粘膜炎布兰汉氏球菌)是一种能经常从人的上呼吸道分离到的革兰氏阴性细菌。它导致几种疾病，主要是婴幼儿中耳炎和老年人肺炎。它也引起鼻窦炎和医院内感染，偶尔还会引起侵袭性疾病。

中耳炎从病例数量和其后遗症来讲是重要的儿童疾病。在美国年发病350万例以上，据估计80％的儿童在3岁之前会罹患中耳炎至少一次(Klein，JO(1994)Clin.Inf.Dis.，19：823)。如未得到治疗或转为慢性，会导致暂时(中耳积液时)或永久(听神经损害)的听力丧失。在婴儿中，这种听力丧失会导致说话延迟。

从患有中耳炎的儿童中耳分离的菌株主要有三种：肺炎链球菌、非典型性流感嗜血杆菌(NTHi)和粘膜炎莫拉氏菌。它们在60％到90％的病例中存在。近期研究表明，中耳炎病例中，肺炎链球菌和非典型性流感嗜血杆菌均占约30％，粘膜炎莫拉氏菌约占15％(Mruphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60：267)。从中耳中也可分离到其它细菌(B型流感嗜血杆菌、酿脓链球菌等)，但频度低得多(2％或更低)。

流行病数据显示，中耳中发现的病原体引起中耳炎必需首先定居在上呼吸道；但是，发病还必需有其它因素(Dickinson，DP et al.(1988)J.Infect.Dis.，158：205，Faden，HL et al.，(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100：612)。这对引起细菌经咽鼓管迁移到中耳然后开始炎症至关重要。这些因素迄今仍不清楚。据推测，诸如病毒感染后免疫系统暂时性异常可能引起不能控制呼吸道定居(Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.169：1312)。另一种解释是，暴露于环境因素之下使某些儿童中更为重要的定居得以发生，而这些儿童因为中耳中持续存在病原体而对中耳炎更为敏感(Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60：267)。

对粘膜炎莫拉氏菌的免疫应答知之甚少。按时从0到2岁的幼儿鼻咽分离的菌株的分析表明，他们经常获得和清除新菌株。这表明在细菌定居的儿童中建立了针对该细菌的有效免疫应答(Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.169：1312)。

在大部分测试的成人中鉴定到了杀菌抗体(Chapman，AJ et al.(1985)J.Infect.Dis.151：878)。粘膜炎莫拉氏菌不同菌株抵抗血清杀菌活性的能力存在差异：一般，从患病个体中分离的菌株较仅仅携带该细菌的个体分离的菌株的抗性更强(Hol，C et al(1993)Lancet341：1281，Jordan，KL et al.(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A)：23S)。血清抗性因此可以被认为是细菌毒力因子。中耳炎病愈后的儿童血清中可以见到调理活性。

除了OMP B1、UspA1和UspA2(Chen D.et al.(1999)，Infect.Immuno.67：1310)外，人体中这些不同的免疫应答针对的抗原尚未鉴定，OMP B1是一种84kDa的蛋白，其表达受铁调控，可以被肺炎患者血清识别(Sethi，S，et al.(1995)Infect.Immuno.63：1516)。

粘膜炎莫拉氏菌表面存在的一些其它膜蛋白已经使用生化方法鉴定，或者揭示了他们在诱导保护性免疫中的潜在意义(综述见Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60：267)。在小鼠肺炎模型中，针对其中的一些成员(UspA，copB)的抗体的存在有利于迅速清除肺炎感染。另一种多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中高度保守，与铜绿假单胞菌的孔蛋白具有同源性，而后者已被证实对动物模型中的该细菌有效。

在过去几十年中，粘膜炎莫拉氏菌的发病率有了很大的提高。这已被归咎为多重抗生素抗性菌株的出现和具有较弱的免疫系统的人群体的增加。分离到对某些或所有标准抗生素具有抗性的菌株已不再鲜见。这种现象就使我们产生了针对这种微生物的新型抗微生物试剂、疫苗、药物筛选方法和诊断试验的永不满足的需求。

                        发明简述

本发明涉及BASB114特别是BASB114多肽和BASB114多核苷酸、重组物质以及它们的制备方法。在另一个方面，本发明涉及使用这种多肽和多核苷酸的方法，包括微生物疾病的预防与治疗及其他。在一个进一步的方面，本发明涉及检测与微生物感染有关的疾病及与这样的感染有关的症状的诊断试验，例如检测BASB114多核苷酸或多肽的表达或活性的试验。

通过阅读下面的描述和本公开的其他部分，本领域的技术人员将很容易理解在本发明公开的精神和范围之内的各种改变和修饰。

                     发明详述

如下文的详细介绍，本发明涉及BASB114多肽和多核苷酸。具体地说，本发明涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB114的多肽和多核苷酸，根据氨基酸序列同源性它与大肠杆菌外膜脂蛋白(NlpE)相关。本发明尤其涉及具有分别列于SEQ ID NO：1或3和SEQ ID NO：2或4的核苷酸和氨基酸序列的BASB114。应当理解，在后面的序列表中列举为“DNA”的序列代表本发明的一个实施方案的举例，因为普通的技术人员知道，这样的序列通常被用作多核苷酸，包括多核糖核苷酸。多肽

在本发明的一个方面，提供了在这里被称为“BASB114”和“BASB114多肽”的粘膜炎莫拉氏菌的多肽，及其在生物学、诊断、预防、临床或治疗上有用的变体，以及含有它们的组合物。本发明进一步提供：(a)含有这样一种氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO：2或4的氨基酸序列至少有85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或完全相同；(b)由含有如下一种多核苷酸序列的分离多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸序列分别与SEQ ID NO：1或3的整个长度具有至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或完全相同；或者(c)由含有如下一种多核苷酸序列的分离多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸序列编码这样一种多肽，这种多肽与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列至少有85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或完全相同；

SEQ ID NO：2或4中提供的BASB114多肽是来自粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC 43617)的BASB114多肽。

本发明还提供BASB114多肽的一种免疫原性片段，即BASB114多肽的一个连续的部分，它与含有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的多肽具有相同或基本上相同的免疫原性活性。也就是说，该片段(必要时可与一种载体偶联)能够产生能识别BASB114多肽的免疫应答。这种免疫原性片段可包括诸如缺少N-末端前导序列和/或跨膜区域和/或C-末端锚定区域的BASB114多肽。在一个优选的方面，根据本发明的BASB114的免疫原性片段包含基本上一种多肽的所有胞外结构域，其中该多肽与SEQ ID NO：2或4在SEQ ID NO：2或4的整个长度上至少有85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性。

片段是这样一种多肽，它具有与本发明的任何多肽的任何氨基酸序列的一部分而不是全部完全相同的氨基酸序列。就BASB114多肽而言，片段可以是“独立存在”，或处于一个较大的多肽中，在一个单独的较大多肽中组成一个部分或区域，优选是一种单个的连续区域。

优选的片段包括，诸如具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的一个部分的截短的多肽或其变体，例如包括氨基末端和或羧基末端氨基酸序列的连续残基系列。用或在一种宿主细胞中制备的本发明的多肽的降解形式也是优选的。更优选的是具有结构或功能特征的片段，例如含有α螺旋和α螺旋形成区域、β折叠和β折叠形成区域、转角和转角形成区域、线团和线团形成区域、亲水区域、疏水区域、α两亲性区域、β两亲性区域、柔性区域、表面形成区域、底物结合区域和高抗原性区域的片段。

更优选的片段包括含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列具有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的至少15、20、30、40、50或100个连续氨基酸；或含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列具有从SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列截短或缺失的至少15、20、30、40、50或100个连续氨基酸。

本发明的多肽片段可用于通过肽合成制备相应的全长多肽；因此，这些片段可用作制备本发明的全长多肽的中间体。

特别优选的是变体，其中以任何组合方式取代、缺失或添加了几个、5-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸。

本发明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是一种较大蛋白如前体或融合蛋白的一部分。通常优选包含含有分泌或前导序列、前序列、能协助纯化的序列如多组氨酸残基，或能在重组制备过程中起稳定作用的额外序列。而且，还考虑加入外源性多肽或脂类尾巴或多核苷酸序列以增加最终分子的免疫原性能力。

在一个方面，本发明涉及遗传工程制备的可溶性融合蛋白，这种融合蛋白含有本发明的一种多肽或其片段以及各亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链的恒定区的各种部分。优选的是，免疫球蛋白是人IgG特别是IgG1的恒定区部分，而融合发生在铰链区。在一个特别的实施方案中，Fc部分可简单地通过引入一个切割序列而去除，这种切割序列可用血凝因子Xa切割。

而且，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，以及涉及它们在药物筛选、诊断和治疗中的应用。本发明的一个进一步的方面还涉及编码这种融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可在国际专利申请Nos.WO94/29458和WO94/22914中发现。

蛋白质可通过化学方法接合，或以重组融合蛋白的形式表达，这种融合蛋白形式能比非融合蛋白在一种表达系统以较高水平制备。融合配体可帮助提供T辅助表位(免疫性融合配体)，优选的是能被人识别的T辅助表位；或者能帮助蛋白比原来的重组蛋白以较高产量进行表达的T辅助表位(表达增强子)。融合配体优选既是一种免疫性融合配体，又是表达增强子配体。

融合配体包括来自流感嗜血杆菌的蛋白D和来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。另一种融合配体是被称为LytA的蛋白。优选使用该分子的C末端部分。LytA来自肺炎链球菌，它合成一种N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶---LytA酰胺酶(由lytA基因编码{《基因》43(1986)265-272页})，后者是一种自溶素，它特异性地降解肽聚糖骨架中的某些键。LytA蛋白的C末端区域负责与胆碱或某些胆碱类似物如DEAE的亲和性。这种特性已被用于发展能用于融合蛋白表达的大肠杆菌C-LytA表达质粒。在其氨基端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化已经有介绍{《生物技术》10卷(1992)795-798页}。可以使用LytA分子中在C末端发现的重复部分，从残基178开始，例如残基188-305。

本发明还包括前面提到的多肽的变体，即通过保守性氨基酸取代与参照物不同的多肽，其中一种残基被另一种具有相似特征的残基取代。典型的这种取代在如下氨基酸之间：Ala、Val、Leu和Ile；Ser和Thr；酸性残基Asp和Glu；Asn和Gln；碱性残基Lys和Arg；或芳族残基Phe和Tyr。

本发明的多肽可以任何合适的方式进行制备。这种多肽包括分离的天然产生的多肽、重组制备的多肽、合成制备的多肽、或用这些方法的组合制备的多肽。制备这种多肽的方法在本领域是熟知的。

本发明的多肽更优选来自粘膜炎莫拉氏菌，但它也优选可获自相同分类学属的其他生物体。本发明的多肽还可获自诸如相同分类学科或目的生物体。多核苷酸

本发明的一个目的是提供编码BASB114多肽的多核苷酸，特别是编码这里被称为BASB114的多肽的多核苷酸。

在本发明的特别优选的实施方案中，多核苷酸包含一个编码BASB114多肽的区域，该区域包含一个列于SEQ ID NO：1或3的序列，它包括一个全长的基因或其变体。

SEQ ID NO：1或3中提供的BASB114多核苷酸是来自粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC 43617)的BASB114多核苷酸。

本发明的一个进一步的方面提供了编码和/或表达BASB114多肽和多核苷酸特别是粘膜炎莫拉氏菌的BASB114多肽和多核苷酸的分离核酸分子，包括诸如未加工的RNAs、核酶RNAs、mRNAs、cDNAs、基因组DNAs、B-和Z-DNAs。本发明的进一步的实施方案包括在生物性、诊断性、预防性、临床或治疗性有用的多核苷酸和多肽以及含有它们的组合物。

本发明的另一个方面涉及至少包括一个全长基因的分离多核苷酸，该基因编码一种具有SEQ ID NO：2或4的推定氨基酸序列的BASB114，以及与其密切相关的多核苷酸及其变体。

在本发明的另一个特别优选的实施方案中，提供了一种来自粘膜炎莫拉氏菌的BASB114多肽，它包括或由SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列或其变体组成。

使用这里提供的信息，例如SEQ ID NO：1或3列出的多核苷酸序列，本发明的编码BASB114多肽的多核苷酸可使用标准的克隆和筛选方法获得，例如使用那些用于从细菌中克隆和测序染色体DNA片段的方法以粘膜炎莫拉氏菌作为起始物质，接着获得一个全长克隆。例如，为获得本发明的一种多核苷酸序列，例如SEQ ID NO：1或3中给出的多核苷酸序列，通常使用一种来自部分序列的放射性标记的寡核苷酸，优选17-mer或更长，对大肠杆菌或其他合适宿主中的粘膜炎莫拉氏菌的染色体DNA克隆文库进行筛选。携带与探针相同DNA的克隆接着用严紧杂交条件进行区分。通过用根据原来的多肽或多核苷酸序列设计的测序引物对这样用杂交方法鉴定的单个克隆进行测序，就有可能在两个方向延伸多核苷酸序列，从而确定全长的基因序列。这种测序常规使用诸如由质粒克隆制备的变性的双链DNA来进行。合适的技术见Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等《分子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)。(具体见杂交筛选1.90和变性双链DNA模板测序13.70)。也可应用直接的基因组DNA测序来获得全长的基因序列。为说明本发明，SEQ ID NO：1或3列出的每个多核苷酸都从来自粘膜炎莫拉氏菌的DNA文库中发现。

而且，SEQ ID NO：1或3中列出的每个DNA序列都含有一个编码如下蛋白的开放阅读框，该蛋白含有SEQ ID NO：2或4中列出的氨基酸残基数目，其推导的分子量可使用本领域技术人员熟知的氨基酸残基的分子量数值进行计算。

SEQ ID NO：1的多核苷酸位于SEQ ID NO：1的起始密码子的核苷酸1和从核苷酸508开始的终止密码子之间，编码SEQ ID NO：2的多肽。

SEQ ID NO：3的多核苷酸位于SEQ ID NO：1的起始密码子的核苷酸1和从核苷酸505开始的末位密码子之间，编码SEQ ID NO：4的多肽。

在一个进一步的方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，该核苷酸包括或由以下组成：(a)一种多核苷酸序列，它与SEQ ID NO：1或3分别在SEQ ID NO：1或3的整个长度上至少有85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或完全相同；或(b)一种编码一种多肽的多核苷酸序列，该多肽与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：2或4的整个长度上具有至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或100％完全相同。

编码本发明的一种多肽的多核苷酸，包括来自除粘膜炎莫拉氏菌以外的种类的同源物或同源进化物，可通过一种包括以下步骤的方法来获得：在严紧杂交条件下(例如使用45-65℃的温度范围，SDS的浓度为0.1-1％)用一种标记的或可检测的探针对合适的文库进行筛选，其中探针包含或由SEQ ID NO：1或3的序列或其一个片段组成，并分离含有所说多核苷酸序列的全长基因和/或基因组克隆。

本发明提供一种在其整个长度上与SEQ ID NO：1或3的编码序列(开放阅读框)相同的多核苷酸序列。本发明还提供单独的成熟多肽或其片段的编码序列以及与另一个编码序列在一个阅读框内的成熟多肽或其片段的编码序列，另一个编码序列的例子为编码一种前导或分泌序列、前-、原-或前原-蛋白的序列。本发明的多核苷酸也可含有至少一种非编码序列，包括但不限于，诸如至少一种非编码的5’和3’序列，例如转录但不翻译的序列、终止信号(例如rho-依赖和非rho-依赖的终止信号)、核糖体结合位点、Kozak序列、稳定mRNA的序列、内含子和聚腺苷酸化信号。多核苷酸序列也可包含编码额外氨基酸的额外编码序列。例如，可以编码一种能促进融合多肽纯化的标记序列。在本发明的某些实施方案中，标记序列是一种6组氨酸肽，由pQE载体提供(Qiagen，Inc.)，见Gentz等《美国科学院院刊》86：821-824，(1989)中的介绍；或是一种HA肽尾巴(Wilson等，《细胞》37：767(1984)；两种标记序列都可用于纯化与它们融合的多肽。本发明的多核苷酸还包括但不限于，包含一种结构基因和其天然相连的控制基因表达的序列。

编码SEQ ID NO：2或4的BASB114多肽的核苷酸序列可以与SEQID NO：1或3的核苷酸1至828所含的多肽编码序列相同。另外，它可以是这样一种序列，即由于遗传密码丰余(简并性)也编码SEQ IDNO：2或4的多肽。

用于此处，“编码一种多肽的多核苷酸”一词涉及包括一种编码本发明的多肽的序列的多核苷酸，本发明的多肽具体说是一种细菌多肽，更具体说是粘膜炎莫拉氏菌BASB114多肽，它具有SEQ ID NO：2或4所列的氨基酸序列。该词还涉及这样一种多核苷酸，它包括编码该肽的一个单一的连续区域或非连续区域(例如被整合的噬菌体、整合的插入序列、整合的载体序列、整合的转座子序列或因RNA编辑或基因组DNA重排所打断的多核苷酸)以及另外的区域，这种另外的区域也可含有编码和/或非编码序列。

本发明进一步涉及这里介绍的多核苷酸的变体，这种变体能编码具有SEQ ID NO：2或4的推定氨基酸序列的多肽的变体。本发明的多核苷酸的片段可用于诸如合成本发明的全长多核苷酸。

更加特别优选的实施方案是编码BASB114变体的多核苷酸，该变体具有在SEQ ID NO：2或4中几个、少数、5至10、1至5、1至3、2、1或没有氨基酸被以任何组合方式取代、修饰、缺失和/或添加的BASB114多肽的氨基酸序列。在它们中尤其优选的是并不改变BASB114多肽的特性和活性的沉默取代、添加和缺失。

本发明的更优选的实施方案是与编码具有SEQ ID NO：2或4列出的氨基酸序列的BASB114多肽的多核苷酸在其整个长度上至少有85％相同的多核苷酸；以及与这种多核苷酸互补的多核苷酸。就此而言，特别优选的是在整个长度上至少有90％的同一性的多核苷酸，而在这些特别优选多核苷酸中，至少有95％的同一性的多核苷酸更为优选，而且在这些至少有95％的同一性的多核苷酸中，至少有97％相同的多核苷酸更优选，同样在它们中，至少有98％和至少有99％相同的多核苷酸尤其更加优选，其中至少有99％相同的多核苷酸更优选。

优选的实施方案是编码基本上保留了SEQ ID NO：1或3的DNA编码的成熟多肽的相同生物功能或活性的多肽的多核苷酸。

根据本发明的特定优选实施方案，本发明提供能与BASB114多核苷酸序列例如SEQ ID NO：1或3的多核苷酸序列杂交，尤其是在严紧条件下杂交的多核苷酸。

本发明进一步涉及能与这里提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。就此而言，本发明特别涉及能在严紧条件下与这里介绍的多核苷酸杂交的多核苷酸。用于此处，“严紧条件”和“严紧杂交条件”的意思是杂交只发生在序列之间至少有95％优选至少有97％相同时。严紧杂交条件的一个具体例子是在42℃在一种溶液中温育过夜，该溶液包括：50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml的变性剪切鲑精DNA，接着在0.1x SSC中在约65℃时洗涤杂交支持物。杂交和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook等《分子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)中特别是11章中举例。溶液杂交也可用本发明提供的多核苷酸序列进行。

本发明还提供含有或由这样一种多核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸序列通过用一种探针在严紧杂交条件下筛选一种合适的文库并分离所述多核苷酸序列来获得，其中文库含有SEQ ID NO：1或3列出的多核苷酸序列的完整基因，而探针具有SEQ ID NO：1或3列出的所说多核苷酸序列的序列。可用于获得这样一种多核苷酸的片段包括诸如本文的其他部分详细介绍的探针和引物。

如本发明在这里的其他部分对多核苷酸试验的讨论，例如，本发明的多核苷酸可用作RNA、cDNA和基因组DNA的杂交探针来分离编码BASB114的全长cDNAs和基因组克隆，并分离与BASB114基因具有高同一性特别是高序列同一性的其他基因的cDNA和基因组克隆。这种探针一般具有至少15个核苷酸残基或碱基对，这种探针优选具有至少30个核苷酸残基或碱基对，也可具有至少50个核苷酸残基或碱基对。特别优选的探针具有至少20个核苷酸残基或碱基对，并少于至少30个核苷酸残基或碱基对。

BASB114基因的编码区可通过使用SEQ ID NO：1或3提供的DNA序列合成一种寡核苷酸探针进行筛选来分离。然后使用与本发明的基因序列互补的标记寡核苷酸筛选一种cDNA、基因组DNA或mRNA文库，来确定该探针杂交的文库成员。

对本领域的技术人员来说，有几种方法是可以使用和熟知的，可以用来获得全长DNAs或延伸短的DNAs，例如以cDNA末端快速扩增(RACE)方法为基础的方法(见诸如Frohman等，《美国科学院院刊》85：8998-9002，1988)。这种技术的最近修改，例如Marathon^TM技术(Clontech Laboratories Inc.)，明显简化了对较长cDNAs的寻找。在Marathon^TM技术中，cDNAs用从一种选择的组织中抽提的mRNA制备，并在每个末端连上一种“接头”。然后使用基因特异的和接头特异的寡核苷酸组合进行核酸扩增(PCR)来扩增“丢失”的DNA的5’末端。然后使用“巢式”引物重复PCR反应，巢式引物即设计来与扩增产物的内部退火的引物(通常为与接头序列的3’退火的一种接头特异性引物和与所选择的基因序列的5’退火的一种基因特异性引物)。然后用DNA测序对该反应的产物进行分析，通过将产物直接与已有的DNA连接产生一个完整的序列，或者使用设计5’引物的新序列信息进行一个单独的全长PCR，来构建一个全长的DNA。

本发明的多核苷酸和多肽可用作诸如发现疾病特别是人疾病的治疗和诊断的研究试剂和物质，如同这里与多核苷酸试验有关的讨论。

本发明的多核苷酸是衍生自SEQ ID NO：1或3序列的寡核苷酸，它们可用于这里介绍的方法，但更优选用于PCR，用来确定这里鉴定的多核苷酸是否全部或部分能在细菌或感染组织中转录。应当理解，这种序列也可用于诊断感染的阶段和所获得病原体的感染类型。

本发明也提供编码这样一种多肽的多核苷酸，这种多肽是一种成熟蛋白加上另外的氨基或羧基末端氨基酸、或成熟多肽内部的氨基酸(例如，当成熟形式含有一个以上的多肽链时)。这种序列可在将一种蛋白从前体加工成成熟形式时起作用，可允许蛋白运输，可延长或缩短蛋白的半寿期，或可便于蛋白用于试验或制备时的操作。通常在体内时，另外的氨基酸可通过细胞酶从成熟蛋白上加工除去。

对于本发明的每一种和所有的多核苷酸，都提供一种与之互补的多核苷酸。这些互补多核苷酸优选与它们互补的每一种多核苷酸完全互补。

一种含有多肽的成熟形式与一种或多种原序列融合的前体蛋白可能是该多肽的无活性形式。当除去原序列时，这种无活性的前体一般被激活。在活化前，一些或所有的原序列可被除去。这种前体一般被称为蛋白原。

核苷酸除了用标准的A、G、C、T/U表示外，“N”也可用来描述本发明的特定多核苷酸。“N”指4种DNA或RNA核苷酸的任何一个都可出现在DNA或RNA序列的该指定位点，但优选N不是一种核酸，当它与相邻的核苷酸位置组合在一起，当按正确的阅读框阅读时，在该阅读框中产生一种成熟前的终止密码子。

总而言之，本发明的多核苷酸可编码一种成熟蛋白、一种成熟蛋白加一种前导序列(它可被称为一种前蛋白)、含有一种或多种非前蛋白的前导序列的原序列的成熟蛋白的前体、或原蛋白的前体前原蛋白，其具有一种前导序列和一种或多种原序列，它们通常在产生多肽的活性和成熟形式的加工过程中被除去。

根据本发明的一个方面，提供本发明的多核苷酸在治疗性或预防性目的特别是遗传免疫方面的应用。

本发明的多核苷酸在遗传免疫方面的应用优选使用一种合适的传递方法，例如直接将质粒DNA注射进肌肉(Wolff等《人类分子遗传学》(1992)1：363，Manthorpe等，《人类基因治疗》(1983)4：419)；将DNA与特异性蛋白载体复合后进行传递(Wu等，《生物化学杂志》(1989)264：16985)，将DNA与磷酸钙共沉淀(Benvenisty&Reshef，《美国科学院院刊》(1986)83：9551)；将DNA用各种形式的脂质体包裹(Kaneda等，《科学》(1989)243：375)；粒子轰击(Tang等，《自然》(1992)356：152，Eisenbraun等《DNA与细胞生物学》(1993)12：791)以及使用克隆的逆转录载体进行体内感染(Seeger等，《美国科学院院刊》81：5949)。载体、宿主细胞、表达系统

本发明还涉及含有本发明的多核苷酸的载体、用本发明的载体进行了遗传工程改造的宿主细胞以及通过重组技术制备本发明的多肽。无细胞翻译系统也可用于使用来自本发明的DNA结构物的RNAs制备这样的蛋白。

本发明的重组多肽可使用本领域技术人员熟知的方法由含有表达系统的遗传工程宿主细胞进行制备。因此，在一个进一步的方面，本发明涉及含有本发明的多核苷酸的表达系统、用这种表达系统遗传工程改造的宿主细胞以及用重组技术制备本发明的多肽。

为进行本发明的多肽的重组制备，宿主细胞可通过遗传工程改造来整合表达系统或其部分或本发明的多核苷酸。将多核苷酸导入宿主细胞可通过多种标准实验室手册介绍的方法来完成，例如Davis等《分子生物学基本方法》(1986)和Sambrook等《分子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、载体转染(transvection)、显微注射、阳离子脂介导的转染、电穿孔、转导、划痕接种、轰击导入和感染。

合适宿主的代表性例子包括细菌细胞如链球菌、葡萄球菌、肠球菌、大肠杆菌、链霉菌、蓝细菌、枯草芽孢杆菌、粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血杆菌和粘膜炎莫拉氏菌的细胞；真菌细胞如克鲁维氏酵母、糖酵母等酵母、白色假丝酵母和曲霉等担子菌的细胞；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9的细胞；动物细胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞如裸子植物或被子植物的细胞。

多种表达系统可用于制备本发明的多肽。这种载体包括染色体型、游离型、病毒型衍生载体，例如由细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、酵母游离体、插入元件、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病毒、微小RNA病毒、逆转录病毒和甲型病毒衍生的载体或由它们的组合物衍生的载体，例如由质粒和噬菌体遗传元件衍生的载体，如粘粒和噬菌粒。表达系统结构物可含有调节以及引起表达的控制区域。就这个方面一般来说，任何适合于维持、增殖或表达多核苷酸和/或在一种宿主中表达一种多肽的系统或载体都可用于表达。合适的DNA序列可通过任何熟知的和常规的技术插入到表达系统中，例如Sambrook等《分子克隆实验室指南》(上文)中列出的技术。

在真核细胞重组表达系统中，为使翻译蛋白分泌到内质网层中、周质间或胞外环境中，可将合适的分泌信号整合到表达的多肽中。这些信号对多肽来说可以是内源性的，或者也可以是异源性的。

本发明的多肽可通过熟知的技术从重组细胞培养物中回收和纯化，这些技术包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。更优选将金属离子亲和层析(IMAC)用于纯化。熟知的用于蛋白重新折叠的技术可用于当多肽在胞内合成、分离和/或纯化过程中变性时活性构象的再生。

表达系统也可是一种重组的活微生物，例如一种病毒或细菌。目标基因可插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。接种和体内感染这种活的载体将导致抗原的体内表达和免疫应答诱导。用于此目的的病毒和细菌是诸如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀禽痘病毒)、甲病毒(辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、微小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒等)、李斯特氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、奈瑟氏菌、BCG。这些病毒和细菌可以是毒性的、或用各种方法减毒来获得一种活疫苗。这种活疫苗也是本发明的一个部分。

诊断、预测、血清分型和突变试验

本发明还涉及将本发明的BASB114多核苷酸和多肽用作诊断试剂。在真核细胞特别是哺乳动物细胞尤其是人细胞中检测BASB114多核苷酸和/或多肽可为诊断疾病、疾病阶段或感染生物体对药物的应答提供一种诊断方法。真核细胞，特别是哺乳动物细胞，尤其是人细胞，特别是那些感染或怀疑感染了含有BASB114基因或蛋白的生物体的细胞，可在核酸或氨基酸水平通过多种熟知的技术以及这里提供的方法进行检测。

用于预测、诊断或其他分析的多肽和多核苷酸可获自假定感染和/或感染个体的机体物质。来自任何这些来源的多核苷酸尤其是DNA或RNA可直接用于检测，或者可在分析前使用PCR或其他任何扩增技术进行酶促扩增。RNA特别是mRNA、cDNA和基因组DNA也可以相同方式使用。使用扩增方法，通过对生物体的所选多核苷酸的基因型进行分析，可对感染性或个体中存在的定居生物体的种类和菌株进行鉴定。缺失和插入可通过扩增产物与一种选自相关生物体的参考序列的基因型相比的大小变化进行检测，优选与相同属的不同种或相同种的不同株进行比较。点突变可通过将扩增DNA与标记的BASB114多核苷酸序列进行杂交来鉴定。对于DNA或RNA来说，通过DNase或RNase消化分别可将非常或明显匹配的序列与匹配不佳或明显错配的双体区分开来，或者通过检测融解温度或复性动力学的差异进行区分。多核苷酸序列差异也可通过多核苷酸片段在凝胶中与一种参考序列相比的电泳迁移的改变来检测。这可使用或不使用变性试剂。多核苷酸差异也可通过直接的DNA或RNA测序来检测。见诸如Myers等，《科学》230：1242(1985)。特殊位置的序列改变也可通过核酸酶保护试验如RNase、V1和S1保护试验或化学裂解方法来显示。见诸如Cotton等《美国科学院院刊》85：4397-4401(1985)。

在另一个实施方案中，可以构建一系列含有BASB114核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针，来对诸如遗传突变、血清型、分类或鉴定进行有效的筛选。平行技术方法是众所周知的，具有通用性，可用来解决分子遗传学中的多种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异(见诸如Chee等《科学》274：610(1996)。

因此，在另一个方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，它包括

(a)本发明的一种多核苷酸，优选SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列或其片段；

(b)与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(c)本发明的一种多肽，优选SEQ ID NO：2或4的多肽或其片段；或

(d)针对本发明的多肽的抗体，优选针对SEQ ID NO：2或4的多肽的抗体。

在任何这样一种试剂盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可优选含有一种基本组分。这种试剂盒可用于疾病或对疾病的易感性的诊断或其他。

本发明还涉及将本发明的多核苷酸用作诊断试剂。对本发明的多核苷酸优选SEQ ID NO：1或3的与一种疾病或致病性相关的突变形式的检测，可提供一种诊断手段，这种诊断手段可增加或限定由于该多核苷酸的低表达、过量表达或表达改变而引起的一种疾病的诊断、疾病过程的预测、疾病阶段、或疾病的易感性的确定。在这样的多核苷酸中带有突变的生物体特别是感染性生物体可通过各种技术例如这里任何地方介绍的技术在多核苷酸水平进行检测。

来自在本发明的多核苷酸和/或多肽中带有突变或多态性(等位突变)的生物体的细胞也可用来使用多种技术在多核苷酸或多肽水平进行检测，从而进行诸如血清学分型。例如，RT-PCR可用来检测RNA中的突变。优选将RT-PCR与自动检测系统如GeneScan结合起来进行使用。RNA、cDNA或基因组DNA也可用于相同的目的---PCR。例如，与编码BASB114多肽的多核苷酸互补的PCR引物可用来鉴定和分析突变。

本发明进一步提供从5’和/或3’末端除去1、2、3或4个核苷酸的引物。这些引物可与其他材料一起用于扩增从个体获得的一种样品如机体物质中分离的BASB114 DNA和/或RNA。这些引物可用于扩增从感染个体中分离的一种多核苷酸，这样，该多核苷酸可随后通过各种技术来阐明多核苷酸序列。通过这种方法，可检测多核苷酸序列中的突变，并用于诊断和/或预测感染或其阶段或过程，或进行感染因子的血清学分型和/或分类。

本发明进一步提供诊断疾病，优选是细菌感染，更优选是由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染的方法，这包括在从个体获得的样品如一种机体物质中检测具有SEQ ID NO：1或3序列的多核苷酸的表达水平的提高。BASB114多核苷酸表达的增加或减少可使用本领域任何已知的用于多核苷酸定量的方法进行检测，例如扩增、PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹、分光光度和其他杂交方法。

此外，根据本发明的用于检测BASB114多肽与正常对照组织样品相比过量表达的诊断试验可用来检测例如一种感染的存在。可用来测定BASB114多肽在来自一种宿主如一种机体物质中的水平的试验技术对本领域的技术人员来说是熟知的。这种试验方法包括放射免疫试验、竞争结合试验、Western印迹、抗体夹心试验、抗体检测和ELISA试验。

本发明的多核苷酸可用作多核苷酸列阵优选是高密度列阵或载网的组分。这些高密度列阵对于诊断和预测目的特别有用。例如，各含一种不同基因并进一步含有本发明的多核苷酸的一套点可用于探针检测，例如使用杂交或核酸扩增，使用来自或衍生自一种机体样品的探针，来检测一种特别的寡核苷酸序列或相关序列在一个个体中的存在。这种存在可说明一种病原体尤其是粘膜炎莫拉氏菌的存在，并可用来诊断和/或预测疾病或疾病过程。优选的是一种含有多种SEQ IDNO：1或3的核苷酸序列的变体的载网。含有编码SEQ ID NO：2或4的多肽序列的多核苷酸序列的多种变体的载网也是优选的。

抗体

本发明的多肽和多核苷酸或其变体或者表达它们的细胞可用作免疫原来制备分别针对这种多肽或多核苷酸的抗体。“免疫特异性”是指抗体对本发明多肽的亲和力显著高于对现有技术的其它相关抗体的亲和力。

在本发明的特定优选实施方案中，提供针对BASB114多肽或多核苷酸的抗体。

针对本发明的多肽或多核苷酸制备的抗体可通过使用传统的方法获得，即将本发明的多肽和/或多核苷酸、或它们之一或两者的携带表位的片段、它们之一或两者的类似物、或表达它们之一或两者的细胞给药于一种动物，优选是一种非人类的动物。本领域任何能提供用连续细胞系培养制备的抗体的技术都可以使用。例子包括各种技术，例如Kohler，G.和Milstein，C.《自然》256：495-497(1975)；Kozbor等《今日免疫学》4：72(1983)；Cole等《单克隆抗体和癌症治疗》，AlanR.Liss，Inc.(1985)的77-96页。

制备单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)可修改来制备针对本发明的多肽或多核苷酸的单链抗体。转基因鼠或其他生物体或动物如其他哺乳动物也可用来表达对本发明的多肽或多核苷酸免疫特异的人源化抗体。

另外，噬菌体显示技术可用来从含有抗BASB114的人淋巴细胞的PCR扩增的V-基因文库或天然文库中选择对本发明的多肽具有结合活性的抗体基因(McCafferty等(1990)《自然》348：552-554；Marks等(1992)《生物技术》10：779-783)。这些抗体的亲和性也可通过诸如链置换技术进行提高(Clackson等，(1991)《自然》352：628)。

上面介绍的抗体可用来分离或鉴定能够表达本发明的多肽或多核苷酸的克隆，来通过诸如亲和层析纯化这些多肽或多核苷酸。

这些抗体以及其他针对BASB114多肽或BASB114多核苷酸的抗体可用来治疗感染，特别是细菌感染。

多肽变体包括抗原性、表位性或免疫性等价的变体，它们组成了本发明的一个特别的方面。

抗体或其片段优选通过修饰，使之在个体中具有较小的免疫原性。例如，如果个体是人，抗体可更优选是一种“人源化”的抗体，其中杂交瘤来源抗体的互补决定区被移植到人单克隆抗体中，例如Jones等(1986)《自然》321，522-525或Tempest等(1991)《生物技术》9，266-273中的介绍。

拮抗剂和激动剂---试验和分子

本发明的多肽和多核苷酸还可用来评价小分子底物与配体在诸如细胞、无细胞抽提物、化学文库和天然产物混合物中的结合。这些底物和配体可以是天然底物和配体，或者可以是结构或功能模拟物，见诸如Coligan等《当代免疫学方法》1(2)：5章(1991)。

筛选方法可通过一种直接或间接与候选化合物连接的标记简单地测量候选化合物与多肽或多核苷酸、或者携带多肽或多核苷酸的细胞或膜、或者多肽的融合蛋白的结合。此外，筛选方法可包括与一种标记的竞争物进行竞争。而且，这些筛选方法可检测候选化合物是否导致一种由多肽或多核苷酸的活化产生的信号，这可使用与含有多肽或多核苷酸的细胞适宜的检测系统来进行。活化的抑制剂一般在存在一种已知激动剂的情况下进行试验，并观察候选化合物对激动剂活化作用的影响。组成型活性多肽和/或组成型表达的多肽和多核苷酸可根据需要，在没有一种激动剂或拮抗剂的情况下，用于逆转激动剂或抑制剂的筛选方法，这可通过检测候选化合物是否导致多肽或多核苷酸的活化的抑制来进行。而且，筛选方法可简单地包括以下步骤，将一种候选化合物与含有本发明的一种多肽或多核苷酸的溶液混合，形成一种混合物；检测混合物中BASB114多肽和/或多核苷酸的活性；将混合物中BASB114多肽和/或多核苷酸的活性与一种标准进行比较。融合蛋白如这里介绍的Fc部分与BASB114多肽制备的融合蛋白也可用于高通量的筛选试验，用来鉴定本发明的多肽的拮抗剂以及系统发育和/或功能上相关的多肽(见D.Bennett等《分子识别杂志》8：52-58(1995)和K.Johanson等《生物化学杂志》270(16)：9459-9471(1995))。

能够与本发明的一种多肽结合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗体也可用于设计检测加入的化合物对细胞中mRNA和/或多肽产生的影响的筛选方法。例如，可以设计一种ELISA试验，使用单克隆和多克隆抗体，按照本领域的标准方法，测量多肽的分泌或细胞结合水平。这可用来发现能抑制或增强多肽在合适的操作细胞或组织中产生的试剂(分别也被称为拮抗剂或激动剂)。

本发明还提供一种筛选化合物的方法，用来鉴定能够增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)BASB114多肽或多核苷酸的作用的化合物，尤其是能够抑菌和/或杀菌的化合物。这种筛选方法可使用高通量技术。例如，为筛选激动剂或拮抗剂，将一种合成反应混合物、一种细胞组分如膜、细胞包膜或细胞壁、或者它们的任何制备物、包括BASB114多肽和一种标记底物或这种多肽的配体，在一种可能是BASB114激动剂或拮抗剂的候选分子存在或不存在的条件下，进行温育。候选化合物激动或拮抗BASB114多肽的能力反映于标记配体的结合降低或这种底物的产物的产生减少。无效结合即不诱导BASB114多肽的效果的分子很可能是优秀的拮抗剂。根据情况，结合良好并增加产物由底物产生的速率、增加信号转导或增加化学通道活性的的分子即是激动剂。根据情况，产物由底物产生、信号传导或化学通道活性的速率或水平的检测可通过使用一种报告系统来增强。可用于此目的报告系统包括但不限于比色、标记底物转变成产物、一种对BASB114多核苷酸或多肽的变化应答的报告基因以及本领域熟知的结合试验。

BASB114激动剂试验的另一个例子是一种竞争试验，该试验将BASB114和一种可能的激动剂与BASB114结合分子、重组BASB114结合分子、天然底物或配体、或底物或配体的模拟物组合在一起，在合适的条件下进行竞争抑制试验。BASB114可进行标记，例如用放射活性或比色化合物标记，使结合到一种结合分子上或转化成产物的BASB114分子的数目可以精确测定，来评价可能的拮抗剂的作用。

可能的拮抗剂包括能与本发明的多核苷酸和/或多肽结合并因而抑制或压制其活性或表达的小有机分子、肽、多肽以及抗体及其他。可能的拮抗剂也可以是这样的小有机分子、肽、多肽如密切相关的蛋白或抗体，它们结合在结合分子的相同位点，例如一种结合分子，但不诱导BASB114诱导的活性，从而通过阻止BASB114多肽和/或多核苷酸结合来抑制BASB114多肽和/或多核苷酸的活化或表达。

可能的拮抗剂包括这样的小分子，它们结合和占据多肽的结合位点，因而阻止其与细胞结合分子结合，从而抑制正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小有机分子、肽或肽样分子。其他可能的拮抗剂包括反义分子(见Okano，《神经化学杂志》56：560(1991)；《寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂》CRC Press，Boca Raton，FL(1988)，对这些分子的介绍)。优选的可能的拮抗剂包括与BASB114及其变体有关的化合物。

在一个进一步的方面，本发明涉及遗传工程的可溶性融合蛋白，这种蛋白包括本发明的一种多肽或其片段以及各种亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链恒定区的各种部分。优选的免疫球蛋白是人IgG特别是IgG1重链的恒定区部分，其中融合发生于铰链区。在一个特别的实施方案中，Fc部分可通过以下方法简单地除去：引入一个切割序列，该序列可用血液凝集因子Xa。而且，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，并涉及将其用于药物筛选、诊断和治疗。本发明的一个进一步的方面还涉及编码这种融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可见于国际专利申请Nos.WO94/29458和WO94/22914。

这里提供的每个多核苷酸序列可用于发现和开发抗菌化合物。编码蛋白通过表达可用作筛选抗菌药物的靶。此外，编码所编码蛋白的氨基末端区域或相应mRNA的SD或其他翻译促进区域的多核苷酸序列可用于构建反义序列来控制目标编码序列的表达。

本发明还提供将本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂用于干扰一种病原体或多种病原体与一种对感染继发症敏感的真核生物优选是哺乳动物宿主之间的最初生理相互作用。具体地说，本发明的分子可用于：抑制细菌具体说是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌粘附于真核生物优选是哺乳动物的深埋装置的细胞外基质蛋白或粘附于伤口的细胞外基质蛋白；阻断真核生物优选是哺乳动物的细胞外基质蛋白与细菌BASB114蛋白之间的细菌性粘附，后者介导组织损伤；和/或阻断不管是深埋装置植入还是其他外科技术引起的感染的正常致病过程。

根据本发明的另一个方面，提供BASB114激动剂和拮抗剂，优选是抑菌或杀菌性激动剂和拮抗剂。

本发明的拮抗剂和激动剂可用于例如阻止、抑制和/或治疗疾病。

在一个进一步的方面，本发明涉及本发明的多肽的模拟表位。模拟表位是一种肽序列，与天然肽足够相似(序列上或结构上)，它能被识别天然肽的抗体识别，或在与一种合适载体偶联时能够产生识别天然肽的抗体。

肽模拟表位可通过添加、缺失或取代所选择的氨基酸用于特别的目的。因此，肽可被修饰以易于与一种蛋白载体连接。例如，对于某些化学结合方法，需要含有一个末端半胱氨酸。此外，对于肽与一种蛋白载体结合，需要包含一个远离肽结合末端的疏水末端，使肽的未结合的游离末端保持与载体蛋白表面的相互作用。从而使肽具有一种构象，这种构象与肽在整个天然分子结构中具有的构象非常相似。例如，肽可被修改来具有一个N末端半胱氨酸和一个C末端疏水的酰胺化的尾巴。另外，可以进行一种或多种氨基酸的D立体异构体的添加或取代，来制备一种有用的衍生物，用来例如增强肽的稳定性。

此外，肽模拟表位可通过诸如噬菌体显示技术(EP 0552267B1)使用能与本发明的多肽结合的抗体来鉴定。这种技术产生大量的模拟天然肽的结构的肽序列，这些肽序列因此能够结合抗天然肽的抗体，但可能不足以与天然多肽具有明显的序列同源性。

疫苗

本发明的另一个方面涉及在个体特别是哺乳动物优选是人中诱导免疫应答的方法，这种方法包括用BASB114多核苷酸和/或多肽或其片段或变体接种个体，它们足以产生抗体和/或T细胞免疫应答，保护个体不被感染，特别是细菌感染，尤其是粘膜炎莫拉氏菌感染。本发明还提供产生这种免疫应答以延缓细菌复制的方法。本发明的另一个方面涉及在个体中诱导免疫应答的方法，包括给予这种个体一种指导BASB114多核苷酸和/或多肽表达或其片段或变体表达的核酸载体、序列或核酶，来在体内表达BASB114多核苷酸和/或多肽表达或其片段或变体，从而诱导一种免疫应答，例如产生抗体和/或T细胞免疫应答，包括诸如产细胞因子T细胞或细胞毒T细胞，来保护所述个体，优选是人免于患病，而不管这种疾病是已经在个体中存在还是不存在。基因给药的一个例子是将其作为颗粒或其他物质的包被物来促进其进入所需的细胞。这种核酸载体可包括DNA、RNA、核酶、修饰的核酸、DNA/RNA杂合体、DNA蛋白复合物或RNA-蛋白复合物。

本发明的一个进一步的方面涉及一种免疫组合物，该组合物在导入个体优选是人时，能够诱导一种免疫应答，即在该个体中诱导针对BASB114多核苷酸和/或由其编码的多肽的免疫应答。其中组合物包含重组的BASB114多核苷酸和/或由其编码的多肽；和/或包含能够编码和表达所述BASB114多核苷酸、由其编码的多肽或本发明的其他多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫应答可用于治疗或预防目的，并且可采用抗体免疫和/或细胞免疫的形式，例如由CTL或CD4+T细胞引起的细胞免疫。

因此，BASB114多肽或其片段可与辅助蛋白或化学半分子融合，辅助蛋白或化学半分子能够或不能自身产生抗体，但能够使第一种蛋白稳定，并产生一种融合的或修饰的蛋白，后者具有抗原性和/或免疫原性，优选是保护性。这样的融合重组蛋白优选进一步含有一种抗原性辅助蛋白，例如来自流感嗜血杆菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶或其他任何能够稳定蛋白并促进其制备和纯化的大辅助蛋白。而且，辅助蛋白在对接受该蛋白的生物体的免疫系统提供一种标准刺激时，可用作一种佐剂。辅助蛋白可连接在第一种蛋白的氨基端或羧基端。

在本发明的疫苗组合物中，BASB114多肽和/或多核苷酸或其片段、模拟表位(mimotope)、或变体可以存在于一种载体中，如上述活细菌载体等活重组载体。

BASB114多肽的无生命载体也是合适的，例如细菌外膜囊泡(vesicle)或“小泡(bleb)”。OM小泡衍生自革兰氏阴性细菌双层膜的外膜，已在多种革兰氏阴性细菌包括C.trachomatis和C.psittaci中报导(Zhou，L等，1998，FEMS微生物通讯，163：223-228)。据报导产生小泡的细菌病原体的非限制性实例也包括：百日咳博德特氏菌、布氏疏螺旋体、马尔他布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、淋病奈瑟氏菌、粘膜炎莫拉氏菌、铜绿假单胞菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。

小泡的优势是以天然构象提供外膜蛋白，因此在疫苗中特别有用。小泡也可以通过工程改造细菌以改变外膜上一个或多个分子的表达而用于疫苗。因此，例如可以引入或上调(如通过改变启动子)BASB114多肽等所需的免疫原性蛋白在外膜的表达。另一种方式或者进一步，不相关(如非保护性抗原或免疫优势但可变的蛋白)或有害(如LPS等毒性分子，或自身免疫应答的潜在诱导物)的外膜分子的包括可以被下调。这些方式以下详述。

BASB114基因的非编码旁侧区含有基因表达中重要的调控元件。这种调控既存在于转录水平又存在于翻译水平。这些区域(无论是基因开放阅读框的上游还是下游)的序列可以通过DNA测序获得。这种序列信息可以确定潜在的调控基元，如不同的启动子元件、终止子序列、可诱导序列元件、阻遏物、负责相转变的元件，核糖体结合序列、具有参与调控的潜在二级结构，以及其它类型的调控基元或序列。该序列是本发明的另一方面。

该序列信息允许调节BASB114基因的天然表达。基因表达的上调也可通过改变启动子、核糖体结合序列、潜在阻遏物或操纵基因元件或任何其它有关元件。同样，表达的下调可以通过类似的调控实现。或者，通过改变相转变序列，基因的表达可以置于相转变控制之下，或者可以与这种调控解偶联。另一种途径是，该基因的表达可以置于一个或多个允许调节表达的可诱导元件的控制之下。这种调节的实例包括但不限于通过温度转变的诱导，加入选定碳水化合物或其衍生物等诱导底物、痕量元素、维生素、辅因子、金属离子等。

上述改变可以通过几种不同方式导入。改变参与基因表达的序列可以通过体内随机诱变然后选择所需表型来实现。另一种途径是分离目标区域，通过随机诱变或定点置换、插入或缺失诱变改变之。改变的区域可以通过同源重组重新导入细菌基因组，基因表达的效果可以被评价。另一种途径是，目标区域的序列知识可以用于置换或缺失天然调控序列的全部或部分。这种情况下，分离和改变目标调控区，以包括来自其它基因的调控元件，来自不同基因的调控元件的组合，合成调控区，或任何其它调控区，或缺失野生型调控序列的选定部分。这些改变的序列可以通过同源重组被重新导入细菌基因组中。可以用于上调基因表达的优选启动子的非限制性实例包括来自粘膜炎莫拉氏菌或淋病奈瑟氏菌的启动子proA，proB，lbpB，tbpB，p110，1st，hpuAB；来自M.Catarrhalis的TbpB；来自流感嗜血杆菌的p1，p2，p4，p5，p6，lpD，tbpB，D15，Hia，Hmw1，Hmw2。

在一个实例中，基因表达可以通过将其启动子换成较强的启动子(通过分离该基因的上游序列，体外修饰该序列，通过同源重组再导入基因组中)加以改变。上调的表达可以在细菌以及来自该细菌的外膜囊泡中实现。

在一个实例中，上述途径可以用来产生疫苗应用中性能改进的重组细菌菌株。这些可以是减毒菌株，选定抗原的表达增加的菌株，干预免疫应答的基因敲除(或表达降低)的菌株，免疫优势蛋白的表达改变的菌株，外膜囊泡的脱落改变的菌株，但不限于此。

因此，本发明也提供BASB114基因的改变的上游区，这些改变的区域也含有异源调控元件，其改变位于外膜蛋白的BASB114蛋白的表达水平。本发明这方面的上游区包括BASB114基因的上游序列。上游区始于BASB114基因的上游，通常延伸至ATG起始密码子上游不到约1000bp处。在基因位于多顺反子序列(操纵子)中时，上游区可以刚好始于目的基因之前，或操纵子第一个基因之前。优选，本发明这方面的改变上游区含有位于ATG上游500到700bp位置处的异源启动子。

因此，本发明提供在改变的细菌小泡中的BASB114多肽。本发明也提供能够产生基于非生命膜的小泡载体的修饰宿主细胞。本发明还提供含有BASB114基因的核酸载体，所述基因具有含有异源调控元件的改变上游区。

本发明还提供制备本发明的宿主细胞和细菌小泡的方法。

本发明也提供含有本发明的多肽和/或多核苷酸以及免疫调节DNA序列如Sato，Y.《科学》273：352(1996)中介绍的DNA序列的组合物，特别是疫苗组合物，以及方法。

本发明还提供在粘膜炎莫拉氏菌感染的动物模型的这种遗传免疫实验中所用的多核苷酸结构物中使用所介绍的多核苷酸或其特殊片段的方法，其中多核苷酸或其特殊片段已经显示编码细菌细胞表面蛋白的非可变区。这种实验可特别用于鉴定能够激发预防性或治疗性免疫应答的蛋白表位。可以相信，这种方法将能够用于随后由成功地抵抗或清除了感染的动物的必需的器官，制备有特殊价值的单克隆抗体，用于发展哺乳动物特别是人的治疗细菌性感染特别是奈瑟氏菌感染的预防性试剂或治疗性试剂。

本发明还包括疫苗制剂，这种制剂包括本发明的一种免疫原性重组多肽和/或多核苷酸以及一种合适的载体，例如一种可药用载体。因为多肽和多核苷酸可能在胃中会被打断，它们都优选经肠道外给药，包括诸如皮下、肌肉、静脉或皮内，适用于肠道外给药的制剂包括水和非水的无菌注射溶液，它们可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和能够使制剂与个体的体液优选是血液等渗的溶剂，以及可包含悬浮剂或增稠剂的水和非水无菌悬液。制剂可置于单剂量或多剂量的容器内，例如密封的安瓶和小瓶，并可贮存于冷冻干燥的环境，只需在使用前加入无菌的液体载体。

本发明的疫苗制剂也可包括佐剂系统，用来增强制剂的免疫原性。优选佐剂系统优先引发TH1型应答。

免疫应答大体上可分为两个典型的种类，即体液或细胞介导的免疫应答(一般分别用其保护作用的抗体和细胞效应机制来区分)。这些应答种类被称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。

典型的TH1型免疫应答的特征是产生抗原特异的单元型限制的细胞毒T淋巴细胞和自然杀伤型细胞应答。在小鼠中，TH1型应答的特征通常是产生IgG2a亚型的抗体，而在人中，它们的对应物是IgG1型抗体。TH2型免疫应答的特征是产生广谱的免疫球蛋白同种型，在小鼠中包括IgG1、IgA和IgM。

可以想象得到，这两种类型的免疫应答之后的驱动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子优先诱导针对所给抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的TH2型细胞因子优先诱导针对抗原的体液免疫应答。

TH1和TH2型免疫应答的区分不是绝对的。事实上，一个个体可以支持一种被描述为TH1优势或TH2优势的免疫应答。但是，通常方便地按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T细胞克隆中的介绍来考虑细胞因子的家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)，TH1和TH2细胞：淋巴因子的不同分泌模式导致不同的功能特性。《免疫学年鉴》7卷，145-173页)。通常，TH1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子相关。其他通常直接与TH1型免疫应答诱导有关的细胞因子如IL-12不由T细胞产生。相反，TH2型应答与IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有关。

已知特定的疫苗佐剂特别适合于刺激TH1或TH2型细胞因子应答。疫苗接种或感染后免疫应答的TH1∶TH2平衡的最佳指标通常包括在体外用抗原再刺激后直接测量T淋巴细胞产生的TH1或TH2细胞因子，和/或测量抗原特异的抗体应答的IgG1∶IgG2a比率。

因此，TH1型佐剂是在体外用抗原再刺激时优先刺激分离的T细胞群体产生高水平的TH1型细胞因子和促进CD8+细胞毒T淋巴细胞和与TH1型同种型相关的抗原特异的免疫球蛋白应答产生的佐剂。

能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂在国际专利申请No.WO94/00153和WO95/17209中介绍。

3 De-O-酰化单磷酰类脂A(3D-MPL)是一种这样的佐剂。这可由GB2220211(Ribi)知道。它在化学上是3 De-O酰化单磷酰类脂A与4、5或6酰基链的混合物，并由Ribi Immunochem，Montana制造。3 De-O-酰化单磷酰类脂A的一种优选形式在欧洲专利0 689 454(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公开。

3D-MPL颗粒优选小到足以通过一个0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌(欧洲专利0689454)。

3D-MPL以每剂10μg-100μg，优选是20-25μg的范围存在，而抗原通常以每剂2-50μg的范围存在。

另一个优选的佐剂包含QS21，它是一种来自Quillaja SaponariaMolina的茎的Hplc纯化的无毒组分。它可选用来与3 De-O-酰化单磷酰类脂A(3D-MPL)混合，并可与一种载体一起使用。

制备QS21的方法在美国专利No.5,057,540中公开。

含有QS21的非反应性的佐剂制剂在以前已有介绍(WO96/33739)。含有QS21和胆甾醇的这种制剂在与抗原一起配制时已显示是成功的TH1刺激佐剂。

优先刺激TH1型细胞应答的进一步的佐剂包括免疫调节性的寡核苷酸，例如非甲基化的CpG序列，如WO 96/02555中的公开。

不同TH1刺激性佐剂如上文所介绍的佐剂的组合也被认为是能提供一种优先刺激TH1型细胞应答的佐剂。例如，QS21可与3D-MPL组合配制。OS21∶3D-MPL的比率通常为1∶10至10∶1，优选为1∶5至5∶1，并且通常为大约1∶1。优选的最佳组合范围是2.5∶1至1∶1的3D-MPL∶QS21。

根据本发明，疫苗组合物还优选含有一种载体。载体可以是一种水包油乳剂，或一种铝盐如磷酸铝或氢氧化铝。

水包油乳剂优选包含一种可代谢的油，例如角鲨烯、α-生育酚和Tween 80。在一个特别优选的方面，根据本发明，疫苗组合物中的抗原与QS21和3D-MPL在这样一种乳剂中组合。另外，该水包油乳剂可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛精。

在对人给药时，疫苗中QS21和3D-MPL的范围是每剂1μg-200μg，例如10-100μg，优选是10μg-50μg。水包油通常含有2至10％的角鲨烯、2至10％的α-生育酚和0.3至3％的Tween 80。在以更稳定的乳剂形式提供时，角鲨烯：α-生育酚：Tween 80的比例优选相同或少于1。还可包含1％水平的Span85。在某些情况下，本发明的疫苗优选进一步含有一种稳定剂。

非毒性的水包油乳剂优选在一种水载体中含有一种非毒性的油如角鲨烷或角鲨烯、一种乳化剂如Tween 80。水载体可以是例如磷酸缓冲盐水。

WO 95/17210中介绍了一种特别强有力的佐剂制剂，它含有在一种水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚。

本发明还提供一种多价的疫苗组合物，它含有本发明的疫苗制剂以及其他抗原，特别是对治疗癌症、自身免疫疾病和相关病症有用的抗原。这样一种多价疫苗组合物可包括一种如前所述的TH1诱导型佐剂。

虽然本发明对特定的BASB114多肽和多核苷酸进行了介绍，但应当理解它们覆盖了天然产生的多肽和多核苷酸以及含有添加、缺失或取代的相似多肽和多核苷酸，这些添加、缺失或取代基本上不影响重组多肽或多核苷酸的免疫原特征。

组合物、试剂盒和给药

在本发明的一个进一步的方面，提供含有用于对一个细胞或一个多细胞生物体给药的BASB114多核苷酸和/或BASB114多肽的组合物。

本发明还涉及含有这里讨论的多核苷酸和/或多肽或它们的激动剂或拮抗剂的组合物。本发明的多肽和多核苷酸可与一种非无菌或无菌载体或用于细胞、组织或生物体的载体，例如一种适用于对个体给药的药用载体组合使用。这种组合物包括例如一种介质添加剂或一种治疗有效剂量的本发明的多肽和/或多核苷酸以及一种可药用载体或赋形剂。这种载体可包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合物。制剂应适合于给药模式。本发明进一步涉及诊断和药用包装和试剂盒，它们含有一种或多种容器，容器中装有一种或多种本发明的上面提到的成分。

本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可单独或与其他化合物例如治疗性化合物一起使用。

药用组合物可通过任何有效、传统的方式进行给药，包括诸如通过局部、口、肛门、阴道、静脉内、腹膜内、肌肉、皮下、鼻内或皮内途径及其他途径进行给药。

在用于治疗或预防时，活性试剂可以一种可注射的组合物的形式给药于个体，例如以无菌水分散物优选是等渗的形式给药。

在一个进一步的方面，本发明提供药用组合物，它包含一种治疗有效剂量的多肽和/或多核苷酸例如本发明的多肽和/或多核苷酸的可溶形式、激动剂或拮抗剂或小分子化合物、以及一种可药用载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合物。本发明进一步涉及药用包装和试剂盒，它们含有一种或多种容器，容器中装有一种或多种本发明的上面提到的成分。本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可单独或与其他化合物例如治疗性化合物一起使用。

组合物应采用一种给药途径，例如通过一种全身性或经口途径。全身性给药的优选形式包括注射，通常通过静脉注射。其他的注射途径例如皮下、肌肉或腹膜都可以采用。全身性给药的其他方法包括使用渗透剂如胆盐或梭链孢酸或其他去污剂经粘膜和皮肤给药。此外，如果本发明的一种多肽或其他化合物可配制成一种肠溶或一种胶囊制剂，经口途径也可以使用。这些化合物的给药也可经表皮和/或局部，以药膏、帖膏、凝胶、溶液、粉末等形式使用。

为对哺乳动物特别是人进行给药，活性试剂的每日剂量水平应从0.01mg/kg至10mg/kg，通常为1mg/kg左右。在任何情况下，医生应确定最适合于个体的实际剂量，并根据年龄、体重和特殊个体的应答而不同。当然，在个体情况时，可以使用更高或更低的剂量范围，这些也都在本发明的范围内。

所需的剂量范围依赖于所选择的肽、给药途径、制剂的性质、用药者病症的性质以及医师的判断。但合适的剂量为每kg0.1-100μg的范围。

疫苗组合物一般采用注射形式。传统的佐剂可用来增强免疫应答。疫苗接种的合适单位剂量为0.5-5μg/kg的抗原，这样的剂量优选给药1-3次、间隔1-3周。对于指定的剂量范围，本发明的化合物在给药于合适的个体时，不会观察到毒副作用。

但考虑到可以使用不同的化合物以及不同给药途径可产生不同的效果，所需的剂量有广泛的变化。例如，口服途径比静脉注射需要更高的剂量。这些剂量水平的变化可按照本领域熟知的方法使用标准的优化实践途径进行调整。

序列数据库、有形介质中的序列以及算法

多核苷酸和多肽序列组成了有价值的信息来源，用来确定它们的二维和三维结构以及进一步鉴定相似同源的序列。这些方法可很方便地通过下述步骤来进行，即将它们存入计算机可读介质，然后将数据存入一个已知的大分子结构程序或使用熟知的搜索工具如GCG程序包搜索一个序列数据库。

本发明还提供分析特征序列或链特别是基因序列或编码蛋白序列的方法。优选的序列分析的方法包括：诸如序列同源性分析方法如同一性和相似性分析、DNA、RNA和蛋白结构分析、序列排列、进化分析、序列基元分析、开放阅读框确定、核酸碱基召唤、密码子使用分析、核酸碱基整理、和序列层析峰分析。

本发明提供了一种以计算机为基础的方法，用于进行同源性鉴定。此方法包括以下步骤：提供在一种计算机可读介质中的含有本发明的一种多核苷酸序列的第一个多核苷酸序列，将所述第一个多核苷酸与至少一种第二个多核苷酸或多肽序列比较，来确定同源性。

本发明提供了一种以计算机为基础的方法，用于进行同源性鉴定。所述方法包括以下步骤：提供在一种计算机可读介质中的含有本发明的一种多肽序列的第一个多肽序列，将所述第一个多肽序列与至少一种第二个多核苷酸或多肽序列比较，来确定同源性。

本申请书中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，在这里都全文引入作为参考，如同它们各自都特别地和个别地在此全文列出。本申请要求优先权的任何专利申请也以与上面对出版物和参考所介绍的相同方式在此全文引入作为参考。

定义

“同一性”如同本领域所熟知的，是两种或多种多肽序列或两种或多种多核苷酸序列之间的相关性，根据具体情况，可通过序列比较来确定。在本领域，“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度，根据具体情况，可通过这些序列的链的匹配来确定。“同一性”可使用已知的方法方便地计算，包括但不限于(《计算分子生物学》，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，New York，1988；《生物计算机：信息和基因组计划》Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；《序列数据的计算机分析》I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，HumanaPress，New Jersey，1994；《分子生物学中的序列分析》von Heine，G.，Academic Press，1987；和《序列分析引物》Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，《SIAM J.Applied Math》48：1073(1988)。测定同一性的方法被设计来给出检测序列之间的最大匹配。而且，测定同一性的方法在公众可获得的计算机程序中编码。用来测定两种序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.等《核酸研究》12(1)：387(1984)、BLASTP、BLASTN(Altschul，S.F.等《分子生物学杂志》215：403-410(1990)以及FASTA(Pearson和Lipman《美国科学院院刊》85：2444-2448(1988)。BLAST程序家族可从NCBI和其他来源获得(《BLAST手册》Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等《分子生物学杂志》215：403-410(1990)。著名的Smith Waterman算法也可用来测定同一性。

多肽序列比较的参数包括以下：

算法：Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》48：443-453(1970)

比较矩阵：Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62

《美国科学院院刊》89：10915-10919(1992)

缺口补偿：8

缺口长度补偿：2

使用这些参数的程序可以从Genetics Computer Group，Madison WI以“缺口”程序的形式获得。上述参数是多肽比较的缺省参数(对末端缺口无补偿)。

多核苷酸序列比较的参数包括以下：

算法：Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》48：443-453(1970)

比较矩阵：匹配＝+10，不匹配＝0

缺口补偿：50

缺口长度补偿：3

来源：Genetics Computer Group，Madison WI的“缺口”程序。上述参数是核酸比较的缺省参数。

多核苷酸和多肽的“同一性”的优选含义根据情况在下面(1)和(2)中提供。

(1)多核苷酸实施方案进一步包括含有如下核苷酸序列的分离多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1或3的参考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1或3的参考序列相同，或者与参考序列相比，可包括一定数量的核苷酸改变，其中这种改变可以选自至少一个核苷酸缺失、置换(包括转换和颠换)或插入，其中所述改变可以发生在参照多核苷酸序列的5′或3′末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在参照序列的核苷酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列中，其中核苷酸改变的数量如下确定：SEQ ID NO：1或3中的总核苷酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQID NO：1或3的总核苷酸数中减除，或者：

n_n≤x_n-(x_n·y)

其中n_n是核苷酸改变的数目，x_n是SEQ ID NO：1或3中的核苷酸总数，y对50％来说是0.50，对60％来说是0.60，对70％来说是0.70，对80％来说是0.80，对85％来说是0.85，对90％来说是0.90，对95％来说是0.95，对97％来说是0.97，对100％来说是1.00，而·是乘法运算的符号，对x_n和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从x_n中减除。编码SEQ ID NO：2或4的多肽的多核苷酸的改变可能在该编码序列中产生无义、错义或移码突变，因此改变后的多核苷酸编码的多肽会发生变化。

例如，本发明的多核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1或3的参照序列相同，即同一性为100％，或者与参照序列相比包括一定数量的核苷酸改变，因此同一性小于100％。这种改变可以选自至少一个核苷酸缺失、置换(包括转换和颠换)或插入，其中所述改变可以发生在参照多核苷酸序列的5′或3′末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在参照序列的核苷酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列中。核苷酸改变的数量如下确定：SEQ ID NO：1或3中的总核苷酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ IDNO：1或3的总核苷酸数中减除，或者：

n_n≤x_n-(x_n·y)

其中n_n为核苷酸改变数量，x_n为SEQ ID NO：1或3的总核苷酸数，y值在70％时为0.70，在80％时为0.80，在85％时为0.85，依此类推，·为乘法运算的符号，其中若x_n和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从x_n中减除。

(2)多肽实施方案进一步包括含有如下多肽序列的分离多肽，该多肽序列与SEQ ID NO：2或4的参考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多肽序列可以与SEQ IDNO：2或4的参考序列相同，或者与参考序列相比，可包括一定数量的氨基酸改变，其中所述改变选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守性或非保守性取代)或插入，而且所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何地方、分别散布在参考序列的氨基酸中或者以一个或多个毗连群散布在参考序列中，并且所述氨基酸改变的数目如下确定：SEQ ID NO：2或4中的总氨基酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ IDNO：2或4的总氨基酸数中减除，或者：

n_a≤x_a-(x_a·y)

其中n_a为氨基酸改变数量，x_a为SEQ ID NO：2或4中的氨基酸总数，y对50％来说是0.50，对60％来说是0.60，对70％来说是0.70，对80％来说是0.80，对85％来说是0.85，对90％来说是0.90，对95％来说是0.95，对97％来说是0.97，对100％来说是1.00，而·是乘法运算的符号，若x_a和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从x_a中减除。

例如，本发明的多肽序列可以与SEQ ID NO：2或4的参照序列相同，即同一性为100％，或者与参照序列相比包括一定数量的氨基酸改变，因此同一性小于100％。这种改变可以选自至少一个氨基酸缺失、置换(包括保守和非保守置换)或插入，其中所述改变可以发生在参照多肽序列的氨基或羧基末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在参照序列的氨基酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列中。同一性百分数一定时氨基酸改变的数量如下确定：SEQ IDNO：2或4中的总氨基酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ ID NO：2或4的总氨基酸数中减除，或者：

n_a≤x_a-(x_a·y)

其中n_a为氨基酸改变数量，x_a为SEQ ID NO：2或4的总氨基酸数，y值在70％时为0.70，在80％时为0.80，在85％时为0.85，依此类推，而·是乘法运算的符号，其中若x_a和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从x_a中减除。

“个体”在用于此处指示一种生物体时，是指一种多细胞真核生物，包括但不限于后生动物、哺乳动物、卵生动物、牛科、猿、灵长动物和人。

“分离的”表示“通过人工”改变其天然状态，即如果“分离的”组合物或物质在自然界中存在，则它已经从其原始环境改变或取出或者已经取出并改变。例如，在本文中使用该术语时，在活动物体内存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但已经与天然状态下共存的物质分开的同样多核苷酸或多肽就是“分离的”。而且，一种多核苷酸或多肽在通过转化、遗传操作或任何其他重组方法导入一种生物体时，即使它仍然存在于所述生物体中，它也是“分离”的，该生物体可以是活的或死的。

“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它可以是修饰或非修饰的RNA或DNA，包括单链和双链区域。

“变体”指不同于参照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸变体的核苷酸序列与参照多核苷酸不同。变体核苷酸序列的变化可能改变或不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改变可能导致参照序列编码的多肽中氨基酸的置换、添加、缺失、融合和截短。一般多肽变体的氨基酸序列与参照多肽不同。通常，差异有限，因此参照多肽和变体的序列在总体上是极其近似的，在许多区域是相同的。变体和参照多肽在氨基酸序列上可以有任何组合形式的一个或多个置换、添加、缺失的区别。置换或插入的氨基酸残基可以是或不是遗传密码编码的氨基酸。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，如等位变体，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽变体可以通过诱变技术或直接合成制备。

“疾病”是指任何由细菌感染导致或与之有关的疾病，包括诸如婴幼儿中耳炎、老年人肺炎、鼻窦炎、医院内感染和侵袭性疾病、伴有听力丧失的慢性中耳炎、中耳积液、听神经损害、说话延迟、上呼吸道感染和中耳炎症。

                        实施例

下面的实施例使用标准的技术进行，这些技术对本领域的技术人员来说是熟知的和常规的，除非它们在其他地方详细介绍。实施例是说明性的，不能限制本发明。

实施例1：粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC 43617中BASB114基因的DNA测序

A：粘膜炎莫拉氏菌菌株中的BASB114

SEQ ID NO：1的BASB114基因来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617。BASB114多核苷酸序列的翻译结果示于SEQ ID NO：。

B：粘膜炎莫拉氏菌43617菌株中的BASB114

BASB114基因的序列在粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617中验证。为此，含有编码成熟粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617的BASB114的基因区域的质粒DNA(见实施例2A)被用作PCR模板。该材料然后进行聚合酶链反应DNA扩增，使用引物pTLZF5′TGA CAA TTA ATCATC GGC TCG-3′[SEQ ID NO：5]和反向pTLZ RV.2 5′GGC TGA AAATCT TCT CTC ATC C-3′[SEQ ID NO：6]。然后使用Big Dyes试剂盒对PCR扩增子进行DNA测序(Applied biosystems)，在ABI 373/A DNA测序仪上按照厂商要求的条件分析。结果，得到了多核苷酸序列SEQ IDNO：3和推测的多肽序列SEQ ID NO：4。这些序列不包括信号序列，因为信号序列已从质粒中除去。

使用DNASTAR软件包的MegAlign程序进行SEQ ID NO：1和3的多核苷酸序列比较，并显示在图1中；同一性的成对比较表明两个BASB114多核苷酸基因序列成熟蛋白编码区是100％相同的。使用相同的MegAlign程序，进行了SEQ ID NO：4的多肽序列比较；并显示在图2中；同一性的成对比较表明两个BASB114蛋白序列成熟蛋白编码区是100％相同的

实施例2：表达重组BASB114的质粒的构建

A：BASB114的克隆

将EcoRI和SalI限制位点分别插入正向MC-Lip6-Fn/t-RI(5′-AGGCAG AGG GAA TTC ATG AAT ATG AAA TCA TCA TTA GTA C-3′，SEQ ID NO：7)和反向MC-Lip6RCh/t-Sal(5′-AGG CAG AGG GTC GACTTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AGG ATT GAC CAA AAG CAGGGT GTG-3′，SEQ ID NO：8)扩增引物，它们允许PCR产物定向克隆至大肠杆菌表达质粒pTLZ2中，使得BASB114蛋白可以表达成C末端含有(His)6亲和层析标志的融合蛋白。BASB114 PCR产物使用硅胶基自旋柱(QiaGen)按照厂商说明由扩增产物中纯化。为了产生克隆所需的EcoRI和SalI末端，纯化的PCR产物用EcoRI和SalI限制酶按照厂商(Life Technologies)说明依次消化完全。

第一次限制消化后，PCR产物同上通过自旋柱纯化以除去盐，在第二次酶消化之前，用无菌水洗脱。消化的DNA片段在与pTLZ2质粒连接前使用硅胶基自旋柱再次纯化。

B：表达载体制备

为了制备连接用的表达质粒pTLZ2，将其用EcoRI和SalI同样消化完全，然后按照厂商说明用牛肠磷酸酶(CIP，约0.02单位/皮摩尔5′末端，Life Technologies)处理以防止自身连接。将相对制备的载体约5倍摩尔过量的消化片段用来进行连接反应。标准的20μl连接反应(约16℃，约16小时)利用本领域已知的技术使用T4 DNA连接酶(约2.0单位/反应，Life Technologies)进行。连接反应(约5μl)的等分试样按照本领域已知技术用来转化电感受态JM109细胞。在约1.0毫升LB培养液中37℃下生长约2-3小时后，转化细胞涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上。在选择培养基中包括抗生素。平板在37℃温育约16小时。单独的ApR菌落用无菌牙签挑出，“片状”接种新鲜LB ApR平板以及约1.0ml LB ApRR培养液。片状平板和培养液在标准温育箱(平板)或水浴摇床上37℃温育。

进行全细胞PCR分析以确证转化子含有BASB114 DNA插入物。将约1.0毫升LB Ap过夜培养物转移到1.5毫升聚丙烯管中，在Beckman离心机中离心收集细胞(约3分钟，室温，约12000×g)。细胞沉淀重悬于约200μl无菌水中，约10μl等分试样用于进行终体积约50μl的PCR反应，其中含有BASB114正向和反向扩增引物。PCR反应成分的终浓度基本上与实施例2中相同，但使用约5单位Taq聚合酶。开始的95℃变性步骤增加到3分钟以确保细菌细胞的热裂解和质粒DNA的释放。使用ABI 9700型热循环仪，进行32循环的3步热循环，循环条件为：95℃ 45秒；55-58℃ 45秒；72℃ 1分钟，以扩增裂解的转化子样品的BASB114 PCR片段。热循环后，取约20μl反应等分试样通过琼脂糖凝胶电泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)缓冲液中的0.8％琼脂糖)进行分析。凝胶电泳后使用UV照射和溴化乙锭染色显示DNA片段。DNA分子量标准(1Kb梯度，Life Technologies)与试样平行电泳，用于估计PCR产物的大小。产生预期PCR产物的转化子鉴定为含有BASB114表达构建体的菌株。然后分析含有表达质粒的菌株中重组BASB114的诱导表达。

C：PCR阳性转化子的表达分析

对于以上鉴定的每一个PCR阳性转化子，约5毫升含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养液用来自片状平板的细胞接种，37℃振荡(约250rpm)生长过夜。过夜种子培养物的等分试样(约1.0ml)接种含有约25毫升LB Ap培养液的125毫升烧瓶中，37℃振荡(约250rpm)生长过夜，直至培养物浊度达到O.D.600约为0.5，即中对数期(通常需约1.5到2.0小时)。此时，约一般培养物(约12.5ml)被转移到第二个125毫升烧瓶中，通过加入IPTG(无菌水中制备的1.0M原液，Sigma)至终浓度1.0mM诱导重组BASB114蛋白的表达。IPTG诱导和未诱导培养物在37℃下再振荡温育约4小时。诱导和未诱导培养物样品(约1.0毫升)在诱导期后取出，室温下在离心机中离心约3分钟收集细胞。单独的细胞沉淀悬浮于约50μl无菌水中，然后与等体积含有2-巯基乙醇的2×Laemmli SDS-PAGE样品缓冲液混合，置于沸水浴中约3分钟以变性蛋白。等体积(约15μl)IPTG诱导和未诱导细胞粗裂解物上样于两块12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(1mm厚Mini-gels，Novex)。诱导和未诱导裂解物样品与预先染色的分子量标记(SeeBlue，Novex)在常规条件下一起电泳，使用标准SDS/Tris/甘氨酸电泳缓冲液(BioRad)。电泳后，一块凝胶用考马斯亮蓝R250(BioRad)染色，然后脱色以显示新的BASB114 IPTG诱导蛋白。第二块凝胶使用BioRad Mini-Protean II印迹装置和Towbin甲醇(20％)转移缓冲液在4℃下电印迹约2小时转移到PVDF膜(0.45微米孔径，Novex)。膜的封闭和抗体温育按照本领域已知技术进行。使用单克隆抗RGS(His)3抗体，然后是辍合有HRP(QiaGen)的兔抗小鼠抗体，以确证BASB114重组蛋白的表达和身份。使用ABT不溶底物或使用Amersham ECL化学发光系统的Hyperfilm显示抗His抗体反应性特征。

实施例3：产生重组BASB114

细菌菌株

含有编码粘膜炎莫拉氏菌BASB114的质粒(pTLZ2)的大肠杆菌JM109重组表达菌株被用来产生纯化重组蛋白的细胞群体。表达菌株在LB琼脂平板上培养，平板中含有100μg/ml氨苄青霉素(Ap)以确保pTLZ2质粒存在。为了在-80℃下冷藏，菌株在含有相同浓度的抗生素的LB培养液中增殖，然后与等体积含有30％(w/v)甘油的LB培养液混合。

培养基

用于产生重组蛋白的发酵培养基为含有100μg/ml Ap的2X YT培养液(Difco)。向发酵罐中的培养基加入消泡剂至0.25ml/L(Antifoam204，Sigma)。为了诱导BASB114重组蛋白的表达，向发酵罐中加入IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃苷)(1mM，终浓度)。

发酵

含有50毫升工作体积的500毫升种子培养烧瓶中接种0.3毫升迅速解冻的冰冻培养物或来自选择性琼脂平板上的几个菌落，在摇床(Innova 2100，New Brunswick Scientific)上以150rpm在37±1℃温育约12小时。该种子培养物用来接种含有2X YT培养液和Ap、工作体积为5升的发酵罐。发酵罐(Bioflo 3000，New Brunswick Scientific)的运行条件为37±1℃、0.2-0.4VVM通气、Rushton叶轮250rpm。烧瓶种子培养物和发酵罐中的pH无需控制。发酵期间，发酵罐中的pH为6.5到7.3。当培养物达到生长的中对数期时(O.D.600为约0.7单位)，向发酵罐中加入IPTG(1.0M原液，在无菌水中制备)。诱导细胞2-4小时，然后，使用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速离心机(Srovall Instruments)离心收集细胞。细胞沉淀保存在-20℃待用。

纯化

化学药品和材料

咪唑和Triton X-100均购自Merck。抑酶肽和Triton X-114获自Sigma Chemical Company。AEBSF来自ICN-Biochemicals。所有其它化学药品均为试剂级或更优级别。

无BSA的Ni-NTA Superflow树脂和Penta-His抗体获自Qiagen。MicroBCA试验获自Pierce；Amicon 3滤器获自Millipore。透析膜(MWCO12-14000)获自MFPI，USA。分子量标志(BenchMarkladder)获自Life-technologies。

实施例4：由大肠杆菌中纯化重组BASB114

提取纯化

来自750毫升IPTG诱导培养物(约4小时，OD620＝0.5)的细胞沉淀重悬于60毫升磷酸缓冲液，pH7.5，含有1mM AEBSF和1mM抑酶肽作为蛋白酶抑制剂。细胞在细胞破碎器中裂解。裂解物4℃下使用1.5％Triton X-114进行洗涤剂分离2小时，4℃下3000g离心30分钟。提取物加热到37℃ 15分钟，20℃下1000g离心10分钟。Triton相(下相)用含有0.3M氯化钠、0.005％Triton X-100，10％甘油(缓冲液A)的磷酸缓冲液，pH7.5稀释到15毫升，并分批上样到Ni-NTASuperflow树脂(过夜温育)。树脂用缓冲液A洗涤。蛋白用缓冲液A洗脱，缓冲液中依次含有50mM，100mM和200mM咪唑。含有BASB114蛋白的级分合并并对含有0.1％Triton X-100的PBS缓冲液pH7.4透析。

纯化的BASB114蛋白使用Micro BCA试验试剂定量。得到了3毫克纯化蛋白，终浓度为175μg/ml。如图3A所示，纯化BASB114蛋白在SDS-PAGE分析中是一个以约30kDa(估计相对分子量)迁移的主带。纯度估计大于80％。BASB114蛋白与小鼠抗6组氨酸基元单克隆抗体有反应(图3B)。

实施例5：产生重组BASB114抗血清

多价抗BASB114蛋白血清通过用纯化重组BASB114蛋白免疫六只小鼠产生。每只动物通过皮下注射给予3次免疫，每次10μg BASB114蛋白，间隔约14天。在首次免疫之前(前血样)和最后一次免疫后一周，由动物取血。

抗BASB114蛋白滴度使用纯化重组BASB114蛋白(4μg/孔)通过ELISA测定。该滴度定义为使用XL Fit软件通过4参数逻辑模型计算的中点滴度。小鼠血清中，免疫后滴度为1∶1720。

实施例6：免疫鉴定：蛋白质印迹分析

粘膜炎莫拉氏菌216于36℃在Muller Hinton琼脂平板上培养24小时。几个菌落用来接种250毫升烧瓶中的50毫升BHI培养液。培养物在200rpm培养约5小时，直至A620为约0.6，然后收集离心。细胞浓缩10倍，4×10⁸CFU在150微升PAGE样品缓冲液中溶解(360mM Tris缓冲液，pH8.8，含有4％十二烷基硫酸钠和20％甘油)。100℃温育悬液5分钟。溶解的细胞在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上分离，分离的蛋白如前所述(Thebaine et al.1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：4350-4354)100伏1小时电转移到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜然后用50毫升含有3％牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco磷酸缓冲盐水预处理。随后所有温育使用该预处理缓冲液进行。

硝酸纤维素膜用1∶10稀释的免疫前血清或小鼠免疫血清250微升室温温育2小时。硝酸纤维素膜然后用洗涤缓冲液(含有150mM氯化钠和0.05％Tween-20的20mM Tris缓冲液，pH7.5)洗涤3次。硝酸纤维素膜用50毫升1∶500稀释的生物素标记绵羊抗小鼠Ig(Amersham Life Science Products)室温温育60分钟。硝酸纤维素膜然后用洗涤缓冲液洗涤3次，用50毫升1∶1000稀释的链亲和素-过氧化物酶(Amersham)室温温育60分钟。硝酸纤维素膜然后用洗涤缓冲液洗涤3次，用4-氯-1-萘酚(Sigma)各显色10分钟。

在莫拉氏菌216菌株中检测到与抗血清反应的约20kDa(相当于BASB114预期的分子量)蛋白(图4，箭头所示为泳道)。

实施例8：BASB114疫苗的效力：提高小鼠中粘膜炎莫拉氏菌的肺清除

该小鼠模型基于免疫小鼠标准鼻内攻击后粘膜炎莫拉氏菌肺侵入的分析。每组6只BALB/c小鼠(雌性、6周龄)用100μl相当于10μg剂量的疫苗皮下免疫，2周后加强免疫。加强免疫后一周，在麻醉下(小鼠用盐酸氯胺酮和赛拉嗪麻醉剂麻醉，100μl麻醉剂包括0.24mg赛拉嗪(Rompun)和0.8mg盐酸氯胺酮(Imalgene))通过向左鼻滴注50微升细菌悬液(5 10⁵CFU/50μl)攻击小鼠。攻击后4小时处死小鼠，无菌取出肺，单独匀浆。将20微升5倍系列稀释的匀浆物涂布于Mueller-Hinton琼脂平板上，通过计数平板上生长的菌落确定log10加权平均CFU/肺。计算各组中log10加权平均CFU/肺的算术平均值和标准差。

设定差异等值(通过Brown和Forsythe测试)和常态(使用Shapiro-Wilk测试)后，通过运用1通路ANOVA对结果进行统计学分析。组间差异使用Dunnet测试、Tukey学生氏化全距测试(HSD)和Student-Newman-Keuls测试分析。试验组小鼠用吸附在AlPO4上的BASB114(10μg BASB114吸附到100μg AlPO4上)或吸附在AlPO4上的粘膜炎莫拉氏菌ATCC43617菌株的灭活全细胞(kwc)制剂(5 10⁸细胞吸附到100μg AlPO4上)或无抗原的100μg AlPO4免疫。小鼠用5 10⁵CFU粘膜炎莫拉氏菌ATCC43617活细菌攻击。攻击后4小时计算各组中log10加权平均CFU/肺和标准差。假免疫小鼠攻击后4小时具有5.41(+/-0.2)的log10 CFU/肺。与对照组相比，kwc制剂诱导显著的肺清除(1.6log差异)。与对照组相比，BASB114疫苗诱导的肺清除差异为1.45log，这与对照明显不同。

保藏材料

含有粘膜炎莫拉氏菌Catlin菌株的保藏物已于1997年6月21日在美国典型培养物保藏中心(这里表示为“ATCC”)进行保藏，保藏号为43617。该保藏物为粘膜炎布兰汉氏球菌(Frosch和Kolle)，是一种从患有慢性支气管炎的矿工气管吸出物获得的粘膜炎莫拉氏菌分离物构建的1.5-2.9kb插入文库的冻干物。该保藏物在Antimicrob.Agents Chemother.21：506-508(1982)中介绍。

该粘膜炎莫拉氏菌菌株保藏物在此被称为“保藏菌株”或“保藏菌株的DNA”。

保藏菌株含有全长的BASB114基因。

由粘膜炎莫拉氏菌DNA插入pQE30组成的载体pMC-D15于1999年2月12日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为207105。

保藏菌株/克隆中所含的多核苷酸以及编码的任何多肽的氨基酸序列与本文的序列描述不一致时，以前者为准。

保藏菌株的保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约》的条款进行的。在专利被授予时，该菌株即可不受限制地无条件向公众发放。提供该保藏菌株仅为方便本领域技术人员，并不表明本发明的实施需要该保藏材料，如同35U.S.C.ξ112的要求。

序列信息

BASB114多核苷酸和多肽序列SEQ ID NO：1粘膜炎莫拉氏菌ATCC43617菌株BASB114多核苷酸序列ATGAATATGAAATCATCATTAGTGCTAGTGATGCTGGCAGGCTTATCATTGAGTGCATGTAATAAAAAAGAAGAAACCGTTGTTCAGCCCAATGAACCTGTTACCGCCACAGCTGATGCTGCTGTCGTTGATGCTACCGCTACCACTGGTACGCACCAGCCTGAGGTTGCTGTTGTTGATGGTGTGGGTGTTGTATTACCACAATCAACTTATACAGGTACTTTGCCTTGTGCTGACTGCTCTGGCGTTCAAACTGACCTAACGCTTAACTCTGATGGCACATTTGTGATGAAGCAGGATTATTTGGGCAAGCCGAACGGTCAAGTAACCACTCAAGGTACTTATGACATCAATGGCGTGGATAATCAATATGTCCTACTACACCCTAATGATCATGCTGACACGCCTCCTTATTTGATTTATATGGATAAAGACAGTGTTCAATTTCGTGATTTAGAAAATGGCGAAACACCGACACCTAGCCACACCCTGCTTTTGGTCAATCCTTAASEQ ID NO：2由SEQ ID NO：1多核苷酸序列推导的粘膜炎莫拉氏菌BASB114多肽序列MNMKSSLVLVMLAGLSLSACNKKEETVVQPNEPVTATADAAVVDATATTGTHQPEVAVVDGVGVVLPQSTYTGTLPCADCSGVQTDLTLNSDGTFVMKQDYLGKPNGQVTTQGTYDINGVDNQYVLLHPNDHADTPPYLIYMDKDSVQFRDLENGETPTPSHTLLLVNPSEQ ID NO：3粘膜炎莫拉氏菌ATCC43617菌株BASB114多核苷酸序列ATGAATATGAAATCATCATTAGTGCTAGTGATGCTGGCAGGCTTATCATTGAGTGCATGTAATAAAAAAGAAGAAACCGTTGTTCAGCCCAATGAACCTGTTACCGCCACAGCTGATGCTGCTGTCGTTGATGCTACCGCTACCACTGGTACGCACCAGCCTGAGGTTGCTGTTGTTGATGGTGTGGGTGTTGTATTACCACAATCAACTTATACAGGTACTTTGCCTTGTGCTGACTGCTCTGGCGTTCAAACTGACCTAACGCTTAACTCTGATGGCACATTTGTGATGAAGCAGGATTATTTGGGCAAGCCGAACGGTCAAGTAACCACTCAAGGTACTTATGACATCAATGGCGTGGATAATCAATATGTCCTACTACACCCTAATGATCATGCTGACACGCCTCCTTATTTGATTTATATGGATAAAGACAGTGTTCAATTTCGTGATTTAGAAAATGGCGAAACACCGACACCTAGCCACACCCTGCTTTTGGTCAATCCTSEQ ID NO：4由SEQ ID NO：3多核苷酸序列推导的粘膜炎莫拉氏菌BASB114多肽序列MNMKSSLVLVMLAGLSLSACNKKEETVVQPNEPVTATADAAVVDATATTGTHQPEVAVVDGVGVVLPQSTYTGTLPCADCSGVQTDLTLNSDGTFVMKQDYLGKPNGQVTTQGTYDINGVDNQYVLLHPNDHADTPPYLIYMDKDSVQFRDLENGETPTPSHTLLLVNPSEQ ID NO：5TGA CAA TTA ATC ATC GGC TCGSEQ ID NO：6GGC TGA AAA TCT TCT CTC ATC CSEQ ID NO：7AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAT ATG AAA TCA TCA TTA GTG CSEQ ID NO：8AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AGG ATT GACCAA AAG CAG GGT GTG

                   序列表<110>史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司(SmithKline Beecham Biologicals SA)

<120>新化合物(Nove1 compounds)

<130>BM45405

<160>8

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

<210>1

<211>510

<212>DNA

<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)

<400>1atgaatatga aatcatcatt agtgctagtg atgctggcag gcttatcatt gagtgcatgt     60aataaaaaag aagaaaccgt tgttcagccc aatgaacctg ttaccgccac agctgatgct    120gctgtcgttg atgctaccgc taccactggt acgcaccagc ctgaggttgc tgttgttgat    180ggtgtgggtg ttgtattacc acaatcaact tatacaggta ctttgccttg tgctgactgc    240tctggcgttc aaactgacct aacgcttaac tctgatggca catttgtgat gaagcaggat    300tatttgggca agccgaacgg tcaagtaacc actcaaggta cttatgacat caatggcgtg    360gataatcaat atgtcctact acaccctaat gatcatgctg acacgcctcc ttatttgatt    420tatatggata aagacagtgt tcaatttcgt gatttagaaa atggcgaaac accgacacct    480agccacaccc tgcttttggt caatccttaa                                     510

<210>2

<211>169

<212>PRT

<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellla catarrhalis)

<400>2Met Asn Met Lys Ser Ser Leu Val Leu Val Met Leu Ala Gly Leu Ser1               5                  10                  15Leu Ser Ala Cys Asn Lys Lys Glu Glu Thr Val Val Gln Pro Asn Glu

        20                  25                  30Pro Val Thr Ala Thr Ala Asp Ala Ala Val Val Asp Ala Thr Ala Thr

    35                  40                  45Thr Gly Thr His Gln Pro Glu Val Ala Val Val Asp Gly Val Gly Val

50                  55                  60Val Leu Pro Gln Ser Thr Tyr Thr Gly Thr Leu Pro Cys Ala Asp Cys65                  70                  75                  80Ser Gly Val Gln Thr Asp Leu Thr Leu Asn Ser Asp Gly Thr Phe Val

            85                  90                  95Met Lys Gln Asp Tyr Leu Gly Lys Pro Asn Gly Gln Val Thr Thr Gln

        100                 105                 110Gly Thr Tyr Asp Ile Asn Gly Val Asp Asn Gln Tyr Val Leu Leu His

    115                 120                 125Pro Asn Asp His Ala Asp Thr Pro Pro Tyr Leu Ile Tyr Met Asp Lys

130                 135                 140Asp Ser Val Gln Phe Arg Asp Leu Glu Asn Gly Glu Thr Pro Thr Pro145                 150                 155                 160Ser His Thr Leu Leu Leu Val Asn Pro

            165

<210>3

<211>507

<212>DNA

<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)

<400>3atgaatatga aatcatcatt agtgctagtg atgctggcag gcttatcatt gagtgcatgt     60aataaaaaag aagaaaccgt tgttcagccc aatgaacctg ttaccgccac agctgatgct    120gctgtcgttg atgctaccgc taccactggt acgcaccagc ctgaggttgc tgttgttgat    180ggtgtgggtg ttgtattacc acaatcaact tatacaggta ctttgccttg tgctgactgc    240tctggcgttc aaactgacct aacgcttaac tctgatggca catttgtgat gaagcaggat    300tatttgggca agccgaacgg tcaagtaacc actcaaggta cttatgacat caatggcgtg    360gataatcaat atgtcctact acaccctaat gatcatgctg acacgcctcc ttatttgatt    420tatatggata aagacagtgt tcaatttcgt gatttagaaa atggcgaaac accgacacct    480agccacaccc tgcttttggt caatcct                                        507

<210>4

<211>169

<212>PRT

<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)

<400>4Met Asn Met Lys Ser Ser Leu Val Leu Val Met Leu Ala Gly Leu Ser1               5                  10                  15Leu Ser Ala Cys Asn Lys Lys Glu Glu Thr Val Val Gln Pro Asn Glu

        20                  25                  30Pro Val Thr Ala Thr Ala Asp Ala Ala Val Val Asp Ala Thr Ala Thr

    35                  40                  45Thr Gly Thr His Gln Pro Glu Val Ala Val Val Asp Gly Val Gly Val

50                  55                  60Val Leu Pro Gln Ser Thr Tyr Thr Gly Thr Leu Pro Cys Ala Asp Cys65                  70                  75                  80Ser Gly Val Gln Thr Asp Leu Thr Leu Asn Ser Asp Gly Thr Phe Val

            85                  90                  95Met Lys Gln Asp Tyr Leu Gly Lys Pro Asn Gly Gln Val Thr Thr Gln

        100                 105                 110Gly Thr Tyr Asp Ile Asn Gly Val Asp Asn Gln Tyr Val Leu Leu His

    115                 120                 125Pro Asn Asp His Ala Asp Thr Pro Pro Tyr Leu Ile Tyr Met Asp Lys

130                 135                 140Asp Ser Val Gln Phe Arg Asp Leu Glu Asn Gly Glu Thr Pro Thr Pro145                 150                 155                 160Ser His Thr Leu Leu Leu Val Asn Pro

            165

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5tgacaattaa tcatcggctc g                                      21

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6ggctgaaaat cttctctcat cc                                             22

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7aggcagaggg aattcatgaa tatgaaatca tcattagtgc                          40

<210>8

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8aggcagaggg tcgacttaat ggtgatggtg atggtgagga ttgaccaaaa gcagggtgtg    60

Claims (26)

1.含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列与选自SEQID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列全长序列具有至少85％的同一性。

2.权利要求1的分离多肽，其中氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列全长序列具有至少95％的同一性。

3.权利要求1的分离多肽，含有选自SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：4的氨基酸序列。

4.SEQ ID NO：2或4的分离多肽。

5.权利要求1-4任一项的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段的免疫原活性基本上与SEQ ID NO：2或4的多肽相同。

6.权利要求1-5任一项的多肽，其中所述多肽是较大融合蛋白的一部分。

7.编码权利要求1-6任一项的多肽的分离多核苷酸。

8.含有编码与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列全长序列具有至少85％的同一性的核苷酸序列的分离多核苷酸；或与该分离多核苷酸互补的核苷酸序列。

9.含有与编码SEQ ID NO：2或4的多肽全部编码区的核苷酸序列具有至少85％的同一性的核苷酸序列的分离多核苷酸；或与该分离多核苷酸互补的核苷酸序列。

10.含有与SEQ ID NO：1或3的全长序列具有至少85％的同一性的核苷酸序列的分离多核苷酸；或与该分离多核苷酸互补的核苷酸序列。

11.权利要求7-10任一项的分离多核苷酸，其中与SEQ ID NO：1或3的同一性为至少95％。

12.含有编码SEQ ID NO：2或4的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸。

13.含有SEQ ID NO：1或3的多核苷酸的分离多核苷酸。

14.含有编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸，它可通过在严紧杂交条件下，用具有SEQ ID NO：1或3或其片段的序列的标记探针筛选合适的文库获得。

15.含有权利要求7-14任一项的分离多核苷酸的表达载体或重组的活微生物。

16.含有权利要求15的表达载体的宿主细胞或表达一种分离多肽的该宿主细胞的亚细胞级分或膜，所述分离多肽含有与选自SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％的同一性的氨基酸序列。

17.生产权利要求1-6的多肽的方法，包括在足以产生所述多肽的条件下培养权利要求16的宿主细胞并从培养基中回收该多肽。

18.表达权利要求7-14任一项的多核苷酸的方法，包括用含有至少一种所述多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，并在足以表达任何一种所说多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。

19.含有有效量的权利要求1至6任一项的多肽和可药用载体的疫苗组合物。

20.含有有效量的权利要求7至14任一项的多核苷酸和可药用载体的疫苗组合物。

21.权利要求19或20任一项的疫苗组合物，其中所述组合物至少含有一种另外的粘膜炎莫拉氏菌抗原。

22.对权利要求1至6任一项的多肽或免疫性片段具有免疫特异性的抗体。

23.诊断莫拉氏菌感染的方法，包括鉴定在来自怀疑具有这种感染的动物的生物样品中存在的权利要求1-6任一项的多肽、或对所述多肽具有免疫特异性的抗体。

24.含有免疫有效量的权利要求1-6任一项的多肽的组合物在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的用途。

25.含有免疫有效量的权利要求7-14任一项的多核苷酸的组合物在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的用途。

26.用于治疗患有粘膜炎莫拉氏菌疾病的人的治疗组合物，它包括至少一种抗权利要求1-6的多肽的抗体以及合适的药用载体。

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