CN1245419C

CN1245419C - 脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的多核苷酸和多肽BASB033及其用途

Info

Publication number: CN1245419C
Application number: CNB99813242XA
Authority: CN
Inventors: J·－L·吕勒
Original assignee: SmithKline Beecham Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2006-03-15
Anticipated expiration: 2019-09-09
Also published as: ATE270332T1; US20050272091A1; DE69918446D1; US20080219986A1; EP1112366A1; CA2343314A1; US6627204B1; WO2000015801A1; US7071321B2; US20030224012A1; HK1038041A1; GB9820003D0; DE69918446T2; PT1112366E; DK1112366T3; CN1326508A; JP2002528057A; EP1112366B1; AU5862299A; ES2226438T3

Abstract

本发明提供了BASB033多肽和编码BASB033多肽的多核苷酸，以及通过重组技术生产这种多肽的方法。也提供了诊断的、预防的和治疗的用途。

Description

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis) 的多核苷酸和多肽BASB033及其用途

发明领域

本发明涉及多核苷酸(此处指“BASB033多核苷酸”)，其编码的多肽(此处指“BASB033”或者“BASB033多肽”)，重组物质，以及它们的生产方法。另一方面，本发明涉及使用这些多肽和多核苷酸的方法，包括抗细菌感染的疫苗。另一方面，本发明涉及检测某些病原体感染的诊断分析。

发明背景

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(脑膜炎球菌)是一种常见的从人上呼吸道分离得到的革兰氏阴性菌。它有时会造成侵袭性细菌疾病，例如菌血症和脑膜炎。脑膜炎球菌疾病(meningococcal disease)的发生率表现出地区性的季节差异和年度差异(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.；临床微生物学研究(Clin.Microbiol.Rev.)2(增刊)，S18-S24，1989)。温暖国家中的大多数这种疾病是由于血清组B菌株引起的，其发生率从1-10/100,000/年总人口之间变化，有时更高(Kaczmarski，E.B.(1997)，Commun.Dis.Rep.Rev.7：R55-9，1995；Scholten，R.J.P.M.，Bijlmer，H.A.，Poolman，J.T.等，临床感染疾病(Clin.Infect.Dis.)16：237-246，1993；Cruz，C.，Pavez，G.，Aguilar，E.，等，流行性感染(Epidemiol.Infect.)105：119-126，1990)。

血清组A脑膜炎球菌控制的流行病，大多发生在中部非洲，该病有时会达到1000/100,000/年的水平(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.临床微生物学研究(Clin.Microbiol.Rev.)2(增刊)，S18-S24，1989)。几乎所有的脑膜炎球菌疾病都是由血清组A，B，C，W-135和Y脑膜炎球菌造成的，四价的A，C，W-135，Y多糖疫苗对此有效(Armand，J.，Arminjon，F.，Mynard，M.C.，Lafaix，C.，J.Biol.Stand.10：335-339，1982)。

现在多糖疫苗通过将其化学结合到载体蛋白质上而得到了改进(Lieberman，J.M.，Chiu，S.S.，Wong，V.K.，等，JAMA 275：1499-1503，1996)。

血清组B疫苗是不可用的，因为发现B荚膜多糖是没有免疫原性的，很可能是因为它与宿主成分有共同的结构相似性(wyle，F.A.，Artenstein，M.S.，Brandt，M.L.等，传染病杂志(J.Infect.Dis.)126：514-522，1972：Finne，J.M.，Leinonen，M.，Mkel，P.M.，Lancet ii.：355-357，1983)。

多年以来，发起并进行了很多的研究工作，以开发基于脑膜炎球菌外膜的疫苗(de Moraes，J.c.，Perkins，B.，Camargo，M.C.等，Lancet 340：1074-1078，1992：Bjune，G..，Hoiby，E.A.，Gronnesby，J.K.等，338：1093-1096，1991)。这种疫苗经证实对于年龄较大的儿童(4岁以上)和成年人有57％-85％的功效。

许多细菌外膜成分出现在这些疫苗中，例如PorA，PorB，Rmp，Opc，Opa，FrpB，而且这些组分对于所观察到的保护作用仍需要进一步确定。其他细菌外膜成分，通过使用动物或者人体的与诱导保护性免疫潜在相关的抗体得以确定，例如TbpB和Nspa(Martin，D.，Cadieux，N.，Hamel，J.，Brodeux，B.R.，实验药物杂志(J.Exp.Med.)185：1173-1183，1997：Lissolo，L.，

-Wilmotte，C.，Dumas，p.等，感染免疫(Inf.Immun.)63：884-890，1995).保护性免疫的机制包括抗体介导的杀菌活性和调理素噬菌作用(opsonophagocytosis)。

使用了一种茵血症动物模型，该模型同时具有所有抗体介导的机制(Saukkonen，K.，Leinonen，M.，Abdillahi，H.，Poolman，J.T.，疫苗(Vaccine)7：325-328，1989)。通常认为，后补体成分介导的杀菌机制对于抗脑膜炎球菌疾病的免疫是至关重要的(Ross，S.C.，Rosenthai P，J.，Berberic，H.M.，Densen，P.传染病杂志(J.Infect.Dis.)155：1266-1275，1987)。

脑膜炎奈瑟氏球菌感染发生的频率在过去几十年中有大幅度升高。这是由于抗生素抗性菌株增殖的出现，以及免疫系统较弱的人口数量的增加。分离出抵抗部分或者全部标准抗生素的脑膜炎奈瑟氏球菌已不再罕有。这种现象造成了未满足的医疗需求和对新的抗微生物药剂、疫苗、药物筛选方法和对该生物体诊断测试的需要。

发明概述

本发明涉及BASB033，特别是BASB033多肽和BASB033多核苷酸，重组物质，以及它们的生产方法。另一方面，本发明涉及使用这些多肽和多核苷酸的方法，包括对微生物疾病的预防和治疗，以及其他。另一方面，本发明涉及检测与微生物感染相关的疾病的诊断分析，以及检测与这些感染相关的症状诊断分析，例如检测BASB033多核苷酸或多肽表达或者活性的分析。

通过阅读以下叙述以及本公开内容的其他部分，在本公开发明精神和范畴内的各种变化和修改，对于本领域技术人员是很明显的。

发明内容

本发明涉及BASB033多肽和多核苷酸，下面有对其更详细的描述。特别是，本发明涉及脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB033多肽和多核苷酸，它们与肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)外膜磷脂酶A蛋白质在氨基酸序列同源性上相关。本发明尤其涉及BASB033，其核苷酸序列和氨基酸序列分别陈述于SEQ ID NO：1，3和SEQ ID NO：2，4。在下面序列表中作为“DNA”的序列，被认为是代表本发明一种实施方案的范例，因为具有一般技术的人可以认识到这些序列通常可用于多核苷酸，包括多聚核糖核苷酸。

多肽

本发明一方面提供了脑膜炎奈瑟氏球菌的多肽，此处指“BASB033”和“BASB033多肽”，以及其生物的、诊断的、预防的、临床的或治疗的有用变体，和包含该成分的组合物。

本发明进一步提供了：

(a)一种分离出的多肽，该多肽包含一段氨基酸序列，这段氨基酸序列与SEQ ID NO：2，4有至少85％同一性，更优选有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或者完全同一；

(b)一种由分离出的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸包含一段多核苷酸序列，这段多核苷酸序列与SEQ ID NO：1，3，就SEQ IDNO：1，3全长而言，分别有至少85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者完全同一；

(c)一种由分离出的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸包含一段多核苷酸序列，这段多核苷酸序列编码的多肽与SEQ ID NO：2，4的氨基酸序列有至少85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者完全同一；

在SEQ ID NO：2，4中提供的BASB033多肽，是来自脑膜炎奈瑟氏球菌ATCC13090菌株和H44/76菌株的BASB033多肽。

本发明也提供了一种BASB033多肽的免疫原性片段，该片段是BASB033多肽的一段连续部分，它具有与包含SEQ ID NO：2，4氨基酸序列的多肽相同的或者基本相同的免疫原性。这就是说，该片段(如需要可结合到载体上)可以引起识别BASB033多肽的免疫反应。这样的免疫原性片段可以包括，例如缺少N-末端前导序列的BASB033多肽，和/或缺少跨膜结构域的BASB033多肽和/或缺少C-末端锚定结构域的BASB033多肽。在一个优选方面，根据本发明，BASB033的免疫原性片段基本上包含一种多肽全部的细胞外结构域，该多肽与SEQID NO：2，4在SEQ ID NO：2全长上有至少85％同一性，更优选有至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或者完全同一。

一段片段是指一段多肽，该多肽包含与本发明任何多肽的一部分完全相同的氨基酸序列，但是并不包含其全部的氨基酸序列。至于BASB033多肽，片段可以是分离的，或者是被包含在一段更大的多肽中构成其一部分或者一个区域，最优选是作为单个更大多肽的一段单独连续区域。

优选的片段包括，例如包含部分SEQ ID NO：2，4氨基酸序列或其变体的截断多肽，例如一系列包含氨基-和/或羧基-末端氨基酸序列的残基。由宿主细胞或者在宿主细胞中产生的本发明多肽的降解形式也是优选的。更优选的片段是具有结构或者功能属性特征的片段，例如包含以下结构区域的片段：α-螺旋和α-螺旋形成区域(α-helixforming regions)，β-折叠和β-折叠形成区域(β-sheet-formingregions)，转角和转角形成区域(turn-forming regions)，卷曲和卷曲形成区域(coil-forming regions)，亲水区域，疏水区域，α两亲性区域，β两亲性区域，柔性区域，表面形成区域，底物结合区域，以及高度抗原标志区域(high antigenic index regions)。

更优选的片段包括一种分离出的多肽，该多肽包含至少15，20，30，40，50，或者100个来自SEQ ID NO：2，4氨基酸序列中的连续氨基酸的氨基酸序列，或者包括一种分离出的多肽，该多肽包含至少15，20，30，40，50，或者100个从SEQ ID NO：2，4氨基酸序列中截取或删除的连续氨基酸的氨基酸序列。

通过多肽合成，本发明多肽的片段可以用于生产相应的全长多肽；因此，这些片段可以用作生产本发明全长多肽的中间体。

特别优选的是其中的几个，5-10，1-5，1-3，1-2或1个氨基酸以任意组合被置换、删除或者添加的变体。

本发明的多肽或者免疫原性片段，可以以“成熟的”蛋白质形式存在或者可以是较大蛋白质，例如前体或者融合蛋白的一部分。包含一段额外的氨基酸序列常常是有利的，这种额外的氨基酸序列包括分泌或者前导序列，原序列(pro-sequence)，像多个组氨酸残基这样有助于纯化的序列，或者生产重组体时助于稳定的额外序列。另外，也考虑了附加外源多肽或者脂质尾部或者多核苷酸序列，以增加最终分子免疫原性的潜力。

另一方面，本发明涉及遗传工程制备的包含本发明多肽或者其片段的可溶性融合蛋白，以及各种免疫球蛋白亚类(IgG，IgM，IgA，IgE)的重链或者轻链的恒定区的各部分。优选的免疫球蛋白是人类IgG的重链不变部分，特别是IgG1的重链不变部分，融合发生在铰链区。在一个特殊的实施方案中，Fc部分可以通过结合一段切割序列而简单地除去，这段切割序列可以被凝血因子Xa切开。

另外，本发明涉及用遗传工程制备这些融合蛋白的方法，以及这些融合蛋白在药物筛选、诊断和治疗上的用途。本发明的另一方面也涉及编码这些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的实例可以在国际专利申请WO94/29458和WO94/22914中找到。

这些蛋白质可以化学结合，也可以作为重组融合蛋白表达，融合蛋白与非融合蛋白相比，可以增加在表达系统中的产量。融合配偶体可以有助于提供T辅助抗原决定簇(免疫融合配偶体)，最好是可以被人体识别的T辅助抗原决定簇，或者有助于蛋白质以高于天然重组蛋白的产量表达(表达增强子)。优选融合配偶体既是免疫融合配偶体又是表达增强配偶体。

融合配偶体包括来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白质D和来自流感病毒的非结构蛋白质，NS1(红血球凝聚素，hemagglutinin)。另一种融合配偶体是称为LytA的蛋白质。优选使用该分子的C末端部分。LytA来自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，该菌合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，酰胺酶LytA，(由lytA基因{Gene，43(1986)265-272页}编码)一种专一性裂解肽聚糖骨架中特定键的自溶素。LytA蛋白质C末端结构域负责与胆碱或者象是DEAE等胆碱类似物亲和。这一特性已经用于开发用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LytA表达质粒。氨基末端包含C-LytA片段的杂合蛋白的纯化已经有所描述{生物技术(Biotechnology)：10，(1992)795-798页}。可以利用LytA分子C末端起始于178残基的重复部分，例如188-305残基。

本发明也包括上述多肽的变体，即通过保守氨基酸置换而与原多肽不同的多肽，由此一个残基被另一个具有相似特性的残基所置换。典型的这种置换发生在丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸之间；丝氨酸和苏氨酸之间；酸性残基天冬氨酸和谷氨酸之间；天冬酰胺和谷氨酰胺之间；以及碱性残基赖氨酸和精氨酸之间；或者芳香族残基苯丙氨酸和酪氨酸之间。

本发明的多肽可以用任何合适的方式制备。这样的多肽包括分离出的天然存在的多肽，重组产生的多肽，合成产生的多肽，或者这些方法结合产生的多肽。制备这些多肽的方法在本领域是熟知的。

本发明最优选的多肽来自脑膜炎奈瑟氏球菌，然而，这种多肽也可以优选得自同分类属的其他生物。例如，本发明的多肽也可以得自同分类科或者同目的其他生物。

多核苷酸

本发明的一个目标是提供编码BASB033多肽的多核苷酸，特别是编码此处命名为BASB033的多肽的多核苷酸。

在本发明一个特别优选的实施方案中，所述多核苷酸包括一段编码BASB033多肽的区域，该段区域包括一段陈述于SEQ ID NO：1，3的序列，该序列包括全长的基因，或者其变体。

SEQ ID NO：1，3中提供的BASB033多核苷酸，是来自脑膜炎奈瑟氏球菌ATCC13090菌株和H44/76菌株的BASB033多核苷酸。

本发明的一个方面，提供了分离出的编码和/或表达BASB033多肽的核酸分子以及多核苷酸，特别是脑膜炎奈瑟氏球菌BASB033多肽和多核苷酸，例如包括未加工的RNA，核酶RNA，mRNA，cDNA，基因组DNA，B-DNA和Z-DNA。本发明其他实施方案包括，生物的、诊断的、预防的、临床的或治疗的有用多核苷酸和多肽，以及其变体，和包含该成分的组合物。

本发明的另一个方面，涉及分离出的编码BASB033多肽的多核苷酸，与其密切相关的多核苷酸，以及其变体，其中该多核苷酸包括至少一个全长基因，该BASB033多肽具有推导出的SEQ ID NO：2，4氨基酸序列。

在本发明另一个特别优选的实施方案中，存在包含或者由SEQ IDNO：2，4氨基酸序列组成的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB033多肽，或者其变体。

使用此处提供的信息，本发明编码BASB033多肽的多核苷酸，例如陈述于SEQ ID NO：1，3的多核苷酸序列，可以通过使用标准的克隆和筛选方法得到，例如使用脑膜炎奈瑟氏球菌细胞作为起始材料，从细菌中克隆和筛选染色体DNA片段，接着获得全长克隆的方法。例如，为得到象在SEQ ID NO：1，3中给出的多核苷酸序列这样的本发明的多核苷酸序列，在大肠杆菌或者一些其他合适宿主中典型的脑膜炎奈瑟氏球菌染色体DNA克隆文库，用来自部分序列的放射性标记的寡聚核苷酸进行探测，该寡聚核苷酸优选是17-链节或者更长。然后，使用严格杂交条件，可以辨别出携带有与探针DNA相同的DNA的克隆。通过使用按原始多肽序列或者多核苷酸序列设计的测序引物，对经杂交鉴定的单个克隆进行测序，有可能对多核苷酸序列向两个方向进行扩增，以确定全长基因序列。例如，方便起见，使用由质粒克隆制备的变性的双链DNA进行测序。Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLONE，A LABORATORYMANUAL)，第二版；冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约(1989)中对合适的方法进行了描述。(特别参见通过杂交1.90和对变性的双链DNA模板测序13.70来筛选(Screening By Hybridization 1.90andSequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.701)。也可以进行直接基因组DNA测序，来获得全长基因序列。本发明的图例中，陈述于SEQ ID NO：1，3的多核苷酸在脑膜炎奈瑟氏球菌DNA文库中公开。

此外，陈述于SEQ ID NO：1，3的各DNA序列，包含编码蛋白质的开放阅读框架，该蛋白质具有陈述于SEQ ID NO：2，4中的大约氨基酸残基数目，并具有推导出的分子量，该分子量可以通过技术熟练者熟知的氨基酸残基分子量进行计算。

SEQ ID NO：1的多核苷酸，在起始密码子与终止密码子之间编码SEQ ID NO：2的多肽，起始密码子对准SEQ ID NO：1的编码为1的核苷酸，终止密码子开始于SEQ ID NO：1的编码为1126的核苷酸。

SEQ ID NO：3的多核苷酸，在起始密码子与终止密码子之间编码SEQ ID NO：4的多肽，起始密码子对准SEQ ID NO：3的编码为1的核苷酸，终止密码子开始于SEQ ID NO：3的编码为1123的核苷酸。

另一方面，本发明提供了一种分离出的多核苷酸，该多核苷酸包括或者由下面的多核苷酸序列组成：

(a)一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列与SEQ ID NO：1，3就SEQ ID NO：1，3全长而言，分别有至少85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者完全同一；或者

(b)一种编码一种多肽的多核苷酸序列，该多肽与SEQ IDNO：2，4的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：2，4全长上有至少85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者100％同一。

可以通过一种方法得到编码本发明多肽的多核苷酸，包括其来自脑膜炎奈瑟氏球菌以外物种的同系物和直系同源物，该方法包括以下步骤：在严格杂交条件(例如，使用45-65℃的温度范围，以及0.1-1％的SDS浓度)下，用包含或者由SEQ ID NO：1，3的序列或者其片段组成的标记探针或可探测探针筛选合适的文库；分离包含所述多核苷酸序列的全长基因和/或基因组克隆。

本发明提供了一种多核苷酸序列，其全长与SEQ ID NO：1，3中的编码序列(开放阅读框架)同一。本发明也提供了一段编码成熟多肽或者其片段的序列本身，以及阅读框架中有另一段编码序列，例如编码前导序列或者分泌序列，前蛋白质序列，或原蛋白质序列，或前原蛋白质序列的序列的编码成熟多肽或者其片段的编码序列。本发明的多核苷酸也包括至少一段非编码序列，例如包括但并不局限于至少一段5’和3’非编码序列，象转录但并不翻译的序列，终止信号(例如rho-依赖的终止信号和rho-不依赖的终止信号)，核糖体结合位点，Kozak序列，稳定mRNA的序列，内含子，以及多腺苷酸化信号。

多核苷酸序列也可以包含编码额外氨基酸的额外编码序列。例如，可以编码一段有助于纯化融合多肽的标记序列。在本发明的特定实施方案中，标记序列是一段六组氨酸肽，这段六组氨酸肽在pQE载体(Qiagen，Inc.)中有提供，在Gentz等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)86：821-824(1989)中有描述，或者是一段HA肽标记物(Wilson等，细胞(Cell)37：767(1984))，这两种标记序列都有助于纯化与之融合的多肽序列。本发明的多核苷酸也包括但不局限于，包含结构基因和控制基因表达的天然结合序列的多核苷酸。

编码SEQ ID NO：2，4的BASB033多肽的核苷酸序列，可以分别与包含于SEQ ID NO：1中1到1125位核苷酸的多肽编码序列同一；或者包含于SEQ ID NO：3中1到1122位核苷酸的多肽编码序列同一。换句话说，它可以是一段编码SEQ ID NO：2，4的多肽的序列，该序列是遗传密码冗余(简并)的结果。

此处用的名词“编码多肽的多核苷酸”包括编码本发明多肽的序列的多核苷酸，尤其是细菌多肽，最好是在SEQ ID NO：2，4中公布了氨基酸序列的脑膜炎奈瑟氏球菌BASB033多肽。该名词也包括这样的多肽，该多肽包括编码多肽的单独连续区域或者不连续区域(例如，被整合相间断的多核苷酸，整合插入序列，整合载体序列，整合转座子序列，或者由于RNA编辑或基因组DNA重组)，以及也包含编码和/或非编码序列的额外区域。

此外，本发明涉及此处描述的多核苷酸的变体，它们编码SEQ IDNO：2，4的推导的氨基酸序列多肽的变体。

例如，可以使用本发明多核苷酸的片段来合成本发明全长的多核苷酸。

此外，特别优选的实施方案是编码BASB033变体的多核苷酸，这些变体具有SEQ ID NO：2，4的BASB033多肽的氨基酸序列，其中的几个，少数，5-10个，1-5个，1-3个，2个，1个氨基酸或没有氨基酸，以任意组合被置换、修饰，删除和/或添加。其中特别优选的是不改变BASB033多肽的性质和活性的隐性置换、删除和添加。

此外，本发明优选的实施方案是多核苷酸以及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，该多核苷酸在其全长上，与编码在SEQ ID NO：2，4中公布了氨基酸序列的BASB033多肽的多核苷酸，有至少85％的同一性。在这点上，在其全长上与上述多核苷酸有至少90％同一性的多核苷酸是特别优选的，在这些特别优选的多核苷酸中，那些有至少95％同一性的多核苷酸是尤其优选的。另外，在那些有至少95％同一性的多核苷酸中，有至少97％同一性的多核苷酸是高度优选的，在这些有至少97％同一性的多核苷酸中，有至少98％和至少99％同一性的多核苷酸是特别高度优选的，有至少99％同一性的多核苷酸是更首选的。

优选的实施方案是编码这样多肽的多核苷酸，该多肽基本上保留了与SEQ ID NO：1，3的DNA编码的成熟多肽相同的生物功能或者活性。

依照本发明一些优选实施方案，提供的多核苷酸可以与BASB033多核苷酸序列，例如SEQ ID NO：1，3中的多核苷酸序列，进行杂交，特别是在严格条件下进行杂交。

此外，本发明涉及与此处提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。在这点上，本发明尤其涉及，在严格条件下与此处描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。此处使用的名词“严格条件”和“严格杂交条件”是指，只有当序列之间有至少95％的同一性并且优选有97％的同一性时才发生的杂交。严格杂交条件的一个具体实例是，在包含下列成分的溶液中42℃孵育过夜：50％甲酰胺，5xSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖，和20微克/ml经剪切的变性鲑鱼精子DNA，接着在大约65℃ 0.1xSSC中清洗杂交支持物。杂交和清洗条件是公知的并且在Sambrook等，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，第二版，冷泉港，纽约(1989)中示例，特别是在其第11章中。溶液杂交也可使用本发明提供的多核苷酸序列。

本发明也提供了包含或由这样的多核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸序列是通过在严格杂交条件下，用具有所说的在SEQID NO：1，3中公布的多核苷酸序列或者其片段的探针筛选适当的文库得到的，该文库包含在SEQ ID NO：1，3中公布的多核苷酸序列的完整基因；并且分离该多核苷酸序列。例如，用于获得这种多核苷酸的片段包括在本文其他地方充分描述的探针和引物。

例如，正如在本文其他地方描述的关于本发明的多核苷酸分析，本发明的多核苷酸可以用作RNA，cDNA和基因组DNA的杂交探针，以分离编码BASB033的全长cDNA和基因组克隆，分离与BASB033有高度同一性，尤其是高度序列同一性的其他基因的cDNA和基因组克隆。这种探针通常包含至少15个核苷酸残基或者碱基对。优选地，这种探针包含至少30个核苷酸残基或者碱基对，并且可以包含至少50个核苷酸残基或者碱基对。特别优选的探针包含至少20个核苷酸残基或者碱基对，并且具有少于30个核苷酸残基或者碱基对。

BASB033基因的编码区域，可以通过使用SEQ ID NO：1，3中提供的DNA来合成一段寡聚核苷酸探针进行筛选而分离。具有与本发明基因互补序列的已标记寡核苷酸，然后用于筛选cDNA文库，基因组DNA或m RNA文库，以鉴定探针与文库中的哪个成员杂交。

有几种本领域技术人员可用的和熟知的方法，可用于获得全长的DNA，或者延伸短的DNA，例如那些基于快速扩增cDNA末端(RACE)方法(例如参见，Frohman，等，PNAS USA 85：8998-9002，1998)获得的DNA.技术上新近的修改，例如以Marathon^TM技术(ClontechLaboratories Inc.)作为例子，大大地简化了对长cDNA的搜索。在Marathon^TM技术中，用从所选组织中提取的mRNA制备cDNA，把“连接物”序列连接到每个末端。接着，使用结合了基因特异性和连接物特异性的寡聚核苷酸引物进行核酸扩增(PCR)，以扩增DNA“缺失的”5’末端。然后，使用“嵌套”引物，即设计的用于在扩增产物中退火的引物(典型的连接物特异引物在连接物序列3’以外退火，基因特异的引物在所选择基因序列的5’以外退火)，重复进行PCR反应。接着，该反应的产物可以用DNA测序进行分析，通过把产物与已存在的DNA直接连接以产生完整序列，或者通过使用设计5’引物的新的序列信息来进行单独的全长PCR，来构建全长DNA。

正如本文关于多核苷酸分析更进一步的讨论，本发明的多核苷酸和多肽可以用作，例如研究试剂，以及用于发现疾病，特别是人类疾病的治疗和诊断的材料。

本发明的多核苷酸，即来自SEQ ID NOS：1-4序列的寡聚核苷酸，可以用于此处描述的方法中，而且优选可以用于PCR中，以确定在被感染组织的细菌中，此处确定的多核苷酸是否全部或者部分被转录。我们认为，这种序列在感染阶段的诊断和病原体造成的感染类型的诊断中也是具有用途的。

本发明也提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽是成熟的蛋白质加额外的氨基端或羧基端氨基酸，或者加成熟多肽内部的氨基酸(例如，当成熟形式有不止一条多肽链时)。这种序列可以在把蛋白质从其前体加工成成熟形式中发挥作用，可以允许蛋白质运输，可以增长或者缩短蛋白质的半衰期或者可以有利于为分析或生产的蛋白质的操纵，以及其他用途。正如体内通常发生的情况，多余的氨基酸可以被细胞酶类从成熟蛋白质中加工除去。

对本发明的每一个多核苷酸，提供了与之互补的多核苷酸。优选的是这些互补多核苷酸与每一个其与之互补的多核苷酸完全互补。

前体蛋白质可以是多肽的非活性形式，它是具有成熟形式的融合了一段或者多段前序列的多肽。当前序列被除去，这种非活性前体通常被激活。部分或者全部前序列在激活前可以被除去。通常，这种前体被称为蛋白原。

除了标准的A，G，C，T/U代表核苷酸以外，术语“N”也可以用于描述本发明特定的多核苷酸。“N”意味着，在DNA或者RNA序列中，DNA或者RNA四个核苷酸中的任何一个可以出现在这样一个指定位置上，除了参与和相邻核苷酸位置结合时以外，当阅读正确的阅读框架时，N优选不是可以造成在这种阅读框架中产生成熟前终止密码子作用的核苷酸。

总之，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白质，成熟蛋白质加前导序列(可以称为前蛋白质)，具有一段或者多段前序列的成熟蛋白质前体，这种前序列并不是前蛋白质的前导序列，或者前蛋白原，它是蛋白原的前体，具有一段前导序列和一段或者多段前序列，这些序列通常在产生多肽的活性和成熟形式的加工步骤中被除去。

根据本发明的一个方面，提供了本发明多核苷酸治疗或者预防目的的用途，尤其是遗传免疫。

本发明多核苷酸在遗传免疫中的使用，优选利用合适的递送方法，例如把质粒DNA直接注射到肌肉中(Wolff等，人类分子遗传学(Hum Mol Genet)(1992)1：363，Manthorpe等，Hum Gene Ther.(1983)4：419)，递送与特定蛋白质载体结合的DNA(Wu等，生物化学杂志(J.Biol Chem.)(1989)264：16985)，DNA与硫酸钙共沉淀(Benvenisy & Reshef，PNAS USA，(1986)83：9551)，把DNA封装到各种形式的脂质体中(Kaneda等，科学(Science)(1989)243：375)，粒子轰击(Tang等，自然(Nature)(1992)356：152，Eisenbraun等，DNA细胞生物学(DNA Cell Biol)(1993)12：791)和使用克隆的逆转录病毒载体在体内感染(Seeger等，PNAS USA(1984)81：5849)。

载体，宿主细胞，表达系统

本发明也涉及包含本发明一种或几种多核苷酸的载体，用本发明载体遗传工程操纵的宿主细胞，以及通过重组技术制备本发明多肽。使用来自本发明DNA构建体的RNA，也可以利用无细胞翻译体系生产这种蛋白质。

可以从包含表达系统的遗传工程操纵的宿主细胞，通过本领域技术熟练者熟知的方法制备本发明的重组多肽。因此，在另一方面，本发明涉及包含本发明一种或几种多核苷酸的表达系统，涉及用这些表达系统遗传工程操纵的宿主细胞，以及涉及通过重组技术生产本发明的多肽。

对于本发明多肽的重组生产，对宿主细胞可以经遗传工程操作插入表达系统或者其部分或者本发明的多核苷酸一起进行遗传操作。把多核苷酸引入宿主细胞可以通过许多在标准实验室手册中叙述的方法进行，例如Davis等，分子生物学基础方法(BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY)，(1986)和Sambrook，等，分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)，第二版；冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约(1989)，例如磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，转位，微注射，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，刮擦装载，弹道介入和感染。

适当宿主的代表性实例包括细菌细胞，例如链球菌细胞，葡萄球菌细胞，肠道球菌细胞，大肠杆菌细胞，链霉菌细胞，蓝细菌细胞，枯草芽孢杆菌细胞，粘膜炎莫拉氏菌细胞，流感嗜血杆菌细胞以及脑膜炎奈瑟氏球菌细胞；真菌细胞，例如酵母细胞，克鲁维酵母菌细胞，酿酒酵母细胞，担子菌细胞，白色念珠菌细胞以及曲霉菌细胞；昆虫细胞，例如果蝇S2细胞和斜纹夜蛾Sf9细胞；动物细胞，例如CHO，COS，Hela，C127，3T3，BHK，293，CV-1和Bowes黑素瘤细胞；植物细胞，例如裸子植物细胞或被子植物细胞。

可以使用各种各样的表达体系制备本发明的多肽。这样的载体其中包括，染色体来源的载体，游离体来源的载体和病毒来源的载体，例如来源于细菌质粒的载体，来源于噬菌体的载体，来源于转座子的载体，来源于酵母游离体的载体，来源于插入元件的载体，来源于酵母染色体元件的载体，来源于病毒的载体，象是杆状病毒，乳多空病毒，象是SV40，痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病病毒，细小核糖核酸病毒，逆转录病毒和甲病毒，以及其结合来源的载体，例如来自质粒和噬菌体遗传元件的的载体，象是粘粒和噬菌粒。表达系统构建体可以包含调节以及引起表达的控制区域。通常来说，在宿主中可以适当维持、繁殖或者表达多核苷酸和/或表达多肽的任何系统或者载体，在这点上都可以用于表达。使用各种各样已知的和常规的技术，例如象是公布在Sambrook，等，分子克隆：实验手册(MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL)，(见前)中的技术，可以把合适的DNA序列插入到表达体系中。

在真核细胞重组表达系统中，为了把翻译出的蛋白质分泌到内质网内腔中，分泌到周质间隙或者细胞外环境中，可以把适当的分泌信号插入到表达多肽上。这些信号对于该多肽可以是内源的或者它们也可以是异源的信号。

本发明多肽，可以用熟知的方法从重组细胞培养中回收和纯化，这些方法包括硫酸铵沉淀或者乙醇沉淀，酸提取，阴离子或者阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选的是用金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化。当多肽在细胞内合成、分离和/或纯化中变性时，用于蛋白质再折叠的熟知技术可以用于再生活性构象。

表达系统也可以是一种活的重组微生物，例如病毒或者细菌。感兴趣的基因可以被插入到活的重组病毒或者细菌的基因组中。用这种活的载体进行接种或者体内感染，将导致在体内表达抗原并且诱导免疫反应。例如，用于这一目的的病毒或者细菌有：痘病毒(例如，痘苗病毒，禽痘病毒，金丝雀痘病毒)，甲病毒(Sindbis病毒，SemlikiForest病毒，Venezuelian Equine Encephalitis病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，细小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒，鼻病毒)，疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒等)，李斯特菌，沙门氏菌，志贺菌，奈瑟球菌，卡介苗。这些病毒和细菌可以是有毒性的，或者是为了获得活疫苗的各种方法减毒的。这些活的疫苗构成了本发明的一部分。

诊断，预测，血清型和突变分析

本发明也涉及把本发明BASB033多核苷酸和多肽作为诊断试剂的用途。真核细胞中，特别是哺乳动物中，尤其是人体中，BASB033多核苷酸和/或多肽的检测，提供了一种诊断方法来诊断这种疾病，诊断疾病病期或者诊断感染生物体对药剂的反应。可以用各种各样熟知的技术以及此处提供的方法，可以在核酸或者氨基酸水平上诊断真核细胞，特别是哺乳动物，尤其是人体，特别是那些被包含BASB033基因或者蛋白质的生物体感染了或者怀疑被其感染了的那些。

用于预测、诊断或者其他分析的多肽和多核苷酸，可以从推定被感染了的和/或已经被感染了的个体身体材料中获取。这些来源的多核苷酸，特别是DNA或RNA，可以直接用于检测或者可以在分析之前先用PCR或其他扩增技术进行酶促扩增。RNA，尤其是mRNA，cDNA和基因组DNA也可以用同样的方式使用。使用扩增，通过分析生物所选多核苷酸的基因型，可以获得出现在个体中的感染生物体或者常驻生物体的物种和菌株的表征。通过改变扩增产物的大小可以检测出缺失或者插入，这种扩增产物的大小是相对于相关生物体的，优选同属不同种的或者是同种不同株的生物的，所选对照序列的基因型来说的。通过扩增的DNA与标记BASB033多核苷酸序列的杂交，可以鉴定点突变。对于DNA或者RNA，分别用DNase或者RNase酶解，或者通过检测熔融温度或复性动力学差异，可以把完美匹配或者较好匹配的序列与不是完美匹配或者更显著错配的双链区分开来。也可以通过比较多核苷酸片段与对照序列在凝胶中电泳迁移率的变化，来检测多核苷酸序列的差别。这可以通过使用变性试剂进行，或者也可以不使用变性试剂进行。多核苷酸的差别也可以通过直接DNA或者RNA测序来检测。例如参见Myers等，Science，230：1242(1985)。在特殊位置的序列改变，也可以通过核酸酶保护分析来揭示，例如RNase，V1和S1保护分析，或者化学裂解方法。例如参见，Cotton等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，85：4397-4401(1985)。

在另一个实施方案中，可以构建一种包含BASB033核苷酸序列或者其片段的寡聚核苷酸探针的排列，以便对例如遗传突变、血清型、分类学分类或者鉴定进行有效的筛选。排列技术的方法是熟知的，有广泛的适用性，可用于处理分子遗传学的包括基因表达、遗传连锁和遗传多样性的各种各样的问题(例如参见，Chee等，Science，274：610(1996))。

因此，在另一方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，它包括：

(a)一种本发明的多核苷酸，优选SEQ ID NO：1，3的核酸序列或者其片段；

(b)与(a)的多核酸序列互补的多核酸序列；

(c)一种本发明的多肽，优选SEQ ID NO：2，4的多肽或者其片段；或者

(d)一种抗本发明多肽的抗体，优选抗SEQ ID NO：2，4的多肽的抗体。

应当意识到，在任何这样的试剂盒中，(a)，(b)，(c)或者(d)可以包含一种基本组分。这样的试剂盒可用于其中包括诊断疾病或者诊断疾病的易感性。

本发明也涉及本发明多核苷酸作为诊断试剂的用途。本发明多核苷酸突变型，优选SEQ ID NO：1，3的突变型，是与疾病或者致病性相关联的，对于这种突变型的检测提供了一种诊断工具，它可以增加或者确定由于多核苷酸不足表达、过量表达或者变化的表达引起的疾病的诊断、疾病过程预测、疾病阶段确定、或者疾病易感性。携带有这种多核苷酸的突变的生物体，尤其是传染性生物体，可以通过各种技术在多核苷酸水平上检测，例如在本文其他地方描述的技术。

携带有本发明多核苷酸和/或多肽的突变或者多态性(等位基因变体)的生物体的细胞，也可以通过各种技术在多核苷酸水平或者多肽水平上检测，例如使用于血清型。例如，RT-PCR可用于检测RNA突变。结合象GeneScan这样的自动监测系统使用RT-PCR是特别优选的。RNA，cDNA或者基因组DNA也可用于同样的目的，PCR。作为例子，与编码BASB033多肽的多核苷酸互补的PCR引物可以用来鉴定和分析突变。

此外，本发明提供了从5’端和/或3’端去掉1，2，3或4个核苷酸的引物。这些引物可以用于扩增从个体样本中，例如身体材料中，分离出的BASB033 DNA和/或RNA，以及其他用途。这些引物可以用于扩增从受感染个体中分离出的多核苷酸，以至于这些多核苷酸可以接着适用于各种阐明多核苷酸序列的技术。以这种方式，可以检测多核苷酸序列中的突变，并且可以使用这些多核苷酸序列中的突变来诊断和/或预测感染或者感染的阶段或过程，或者血清型和/或分类感染物质。

此外，本发明提供了一种诊断疾病的方法，优选诊断细菌感染，更优选诊断由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的感染，该方法包括测定个体样品中，例如身体材料中，具有SEQ ID NO：1，3序列的多核苷酸增高的表达水平。BASB033多核苷酸增加的或者降低的表达，可以使用本领域熟知的多核苷酸定量测定方法进行测定，例如，扩增，PCR，RT-PCR，RNase保护，Northern印迹，光谱测定法和其他杂交方法。

另外，一种依照本发明的用于检测BASB033多肽相对于正常控制组织样品过量表达的诊断分析，可以用于例如检测感染的存在。用于确定身体材料这样的宿主样品中BASB033多肽水平的分析技术，对于本领域技术熟练者是熟知的。这种分析方法包括放射免疫分析，竞争性结合分析，Western印迹分析，抗体夹层分析，抗体检测和ELISA测定。

本发明的多核苷酸可以用作多核苷酸排列的组分，优选高密度排列或者网格。这些高密度排列用于诊断和预测特别有效。例如，各自包含不同基因的，此外包含本发明多核苷酸的一系列点，可以用于探测，例如使用杂交或者核酸扩增，使用从身体样品获得的探针，来确定在个体中特殊多核苷酸序列或者相关序列的存在。这种存在可以表明病原体的存在，特别是脑膜炎奈瑟氏球菌的存在，并且在诊断和/或预测疾病或疾病过程中是有用的。包含大量SEQ ID NO：1，3的多核苷酸序列的变体的载网是优选的。包含大量编码SEQ ID NO：2，4多肽序列的多核苷酸序列的变体的载网也是优选的。

抗体

本发明的多肽和多核苷酸或者其变体，或者表达它们的细胞，可以作为免疫原以产生分别对这些多肽或者多核苷酸具有免疫特异的抗体。

在本发明特定的优选实施方案中，提供了抗BASB033多肽或者多核苷酸的抗体。

产生的抗本发明多肽或者多核苷酸的抗体，可以对动物，优选不是人类，使用常规方案，施用本发明多肽和/或多核苷酸，或者其一或两者的带有抗原决定簇的片段，其一或两者的类似物，或者表达其一或两者的细胞，而获得。为了制备单克隆抗体，任何本领域公知的通过连续细胞系培养生产抗体的技术都是可以使用的。实例包括各种技术，例如Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，今日免疫学(Immunology Today)4：72(1983)；Cole等，pg.77-96，单克隆抗体和癌症治疗(MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY)，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的那些技术。

生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)适合生产针对本发明多肽或者多核苷酸的单链抗体。转基因小鼠，或者其他生物或动物，例如其他哺乳动物，也可以用于表达对本发明多肽或者多核苷酸有免疫特异性的人源化抗体。

另一种选择，从筛选出的包含抗-BASB033的PCR扩增的人体淋巴细胞v-基因库中，或者从天然文库中，可以使用噬菌体展示技术选择对本发明多肽有结合活性的抗体基因(McCafferty，等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，等，(1992)生物技术(Biotechnology)10，779-783)。可以增进这些抗体的亲和性，例如，通过链改组(Clackson等，(1991)Nature 352：628)。

上述抗体可以用于分离或者鉴定表达本发明多肽或者多核苷酸的克隆，用于纯化多肽或者多核苷酸，例如，使用亲和层析。

因此，抗BASB033-多肽或者BASB033-多核苷酸的抗体，可以用于治疗感染，尤其是细菌感染，以及其他用途。

多肽变体包括抗原等价的、抗原决定簇等价的或者免疫等价的变体，这组成了本发明的一个特殊方面。

改变抗体或者其变体，使其在个体中免疫原性更低是优选的。例如，如果个体是人类，则抗体最优选被“人源化”，该互补决定区或杂交瘤来源抗体的互补性决定区已经被移植到人类单克隆抗体中，正如在Jones等，(1986)，Nature 321，522-525或者Tempest等，(1991)生物技术(Biotechnology)9，266-273中描述的。

拮抗剂和激动剂-分析和分子

本发明多肽和多核苷酸也可以用于确定小分子底物和配体的结合，例如在细胞中，在无细胞制剂中，化学库中，以及天然产物混合物中。这些底物和配体可以是天然底物和配体，也可以是结构或者功能模拟物。参见，例如，Coligan等，免疫学常规方法(CurrentProtocols in Immunology)1(2)：第5章(1991)。

通过把标记直接或者间接地连接到候选化合物上，筛选方法可以简单地测定候选化合物与多肽或者多核苷酸的结合，或者与携带有多肽或者多核苷酸的细胞或膜的结合，或者与多肽的融合蛋白质的结合。另一方面，筛选方法可能涉及与标记竞争物的竞争。此外，使用对包含多肽或者多核苷酸的细胞合适的检测系统，这些筛选方法就可以检测，是否候选化合物导致了通过激活或者抑制多肽或者多核苷酸而产生信号。通常在存在已知激动剂的情况下分析激活抑制剂，并且观察候选化合物的存在对于激动剂激活的作用。构成型活性多肽和/或构成型表达多肽和多核苷酸，可用在针对相反激动剂或抑制剂的筛选方法中，当不存在激动剂或抑制剂时，检测是否候选化合物导致了对多肽或者多核苷酸激活的抑制，视具体情况而定。此外，筛选方法可以简单的包括以下步骤：把候选化合物与包含本发明多肽或者多核苷酸的溶液混合形成一种混合物，测定混合物中的BASB033多肽和/或多核苷酸的活性，以及把该混合物的BASBOSS多肽和/或多核苷酸活性与标准进行比较。融合蛋白质，例如那些由Fc部分与BASB033多肽制得的融合蛋白质，如前所述，也可以用于高容量筛选分析，这种筛选分析可以用于鉴定本发明多肽的拮抗剂，以及鉴定系统发生相关多肽和/或功能相关多肽的拮抗剂(参见D.Bennett等，分子识别杂志(J Mol Recognition)，8：52-58(1995)；和K.Johanson等，生物化学杂志(J Biol Chem)，270(16)：9459-9471(1995))。

多核苷酸，多肽以及与本发明多肽结合和/或相互作用的抗体，也可以用于配置筛选方法，该筛选方法是用于检测加入的化合物对于细胞内mRNA和/或多肽产生的作用。例如，根据本领域已知的标准方法，使用单克隆或者多克隆抗体，可以构建ELISA测定来测定多肽的分泌水平或者细胞结合水平。这可以用于发现这样的物质，这种物质可以抑制或者增强适当操作的细胞或者组织中的多肽的产生(也分别称作拮抗剂或者激动剂)。

本发明也提供筛选化合物的方法，以用于鉴定那些增强(激动剂)或者阻断(拮抗剂)BASB033多肽或者多核苷酸的作用的化合物，特别是那些抑制菌的和/或杀菌的化合物。该筛选方法可以涉及高流通量技术。例如，为了筛选激动剂或者拮抗剂，在可能是BASB033激动剂或者拮抗剂的候选分子存在或者不存在的情况下，把包含BASB033多肽的合成反应混合物，细胞区室，例如膜，细胞质膜或者细胞壁，或者它们的制剂，与这种多肽的标记底物或者配体共同孵育。标记配体结合的减少，或者这种底物的产物产量的减少，反映了候选分子促进或者拮抗BASB033多肽的能力。义务结合的分子，即，无需诱导BASB033多肽的效应，很可能是好的拮抗剂。结合较好的分子，视具体情况而定，也增加从底物到产物的产率，增加信号传导或者增强化学通道活性，这种分子是激动剂。通过使用报告基因系统，视具体情况而定，可以增强从底物到产物的产量，信号传导，或者化学通道活性的比率或者水平的检测。在这点上有效的报告基因系统，包括但不局限于转化成产物的显色的标记底物，对BASB033多核苷酸和/或多肽的活性改变有反应的报告基因，以及本领域已知的结合分析。

分析BASB033激动剂的另一个实例是一种竞争性分析，该分析在竞争性抑制分析的合适条件下，把BASB033和一种潜在的激动剂与下列分子结合：BASB033结合分子，重组BASB033结合分子，天然底物或者配体，或者底物或者配体模拟物。可以标记BASB033，例如用放射活性的或者显色的化合物标记，于是可以准确的确定结合到结合分子上的或者转化为产物的BASB033分子的数目，从而确定潜在拮抗剂的有效性。

潜在的拮抗剂，其中包括，结合到本发明多核苷酸和/或多肽上并从而抑制或者压制其活性或者表达的小有机分子，肽，多肽和抗体。潜在的拮抗剂也可以是小有机分子，肽，多肽，例如在结合分子上结合相同位点的紧密相关的蛋白质或者抗体，例如结合分子，该分子不引起BASB033诱导的活性，它通过排斥BASB033多肽和/或多核苷酸的结合，从而阻止BASB033多肽和/或多核苷酸的活性或者表达。

潜在的拮抗剂包括一种小分子，该小分子结合或者占据了多肽的结合位点，因而阻止了与细胞结合分子的结合，于是阻止了正常的生物活性。小分子的实例包括但不局限于小有机分子，肽或者肽类似分子。其他潜在的拮抗剂包括反义分子(参见Okano，J.Neurochem，56：560(1991)；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸(OLIGODEOXYNUCLEOOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENEEXPRESSION)，CRC Press，Boca Raton，FL(1998)，有对这些分子的描述)。优选的潜在拮抗剂包括与BASB033相关的化合物和BASB033变体。

另一方面，本发明涉及遗传工程设计的包含本发明多肽或者其片段的可溶性融合蛋白，以及各种免疫球蛋白亚类(IgG，IgM，IgA，IgE)重链或者轻链恒定区的各部分。优选的免疫球蛋白是人类IgG的重链恒定部分，特别是IgG1的重链恒定部分，融合发生在铰链区。在一个特殊的实施方案中，Fc部分可以通过结合一段切割序列而简单地除去，这段切割序列可以被血液凝结因子Xa切开。另外，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，以及其在药物筛选、诊断和治疗中的用途。本发明更深层的方面也涉及编码这些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白质技术的实例可以在国际专利申请WO94/29458和WO94/22914中找到。

此处提供的每一条多核苷酸序列都可以用于发现和开发抗细菌化合物。编码的蛋白质，一经表达，都可以用作筛选抗细菌药物的目标对象。另外，编码编码蛋白质氨基端区域的多核苷酸序列，或者相应mRNA的Shine-Delgarno序列或其他促进翻译的序列，可用于构建反义链，该反义链可以控制感兴趣的编码序列的表达。

本发明也提供了本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或者拮抗剂的用途，该用途是干扰病原体与真核的，优选哺乳动物的，具有感染后遗症的宿主之间原始的物理相互作用。尤其是，本发明的分子也可以用于：阻止细菌，特别是革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌，与埋植装置上的真核的，优选哺乳动物的细胞外基质蛋白质之间的粘附，或者与伤口上的细胞外基质蛋白质之间的粘附；阻止真核的，优选哺乳动物的细胞外基质蛋白质与介导组织损伤的细菌BASB033蛋白质之间的细菌粘附，和/或；阻止感染发病机理的正常进展，这种进展不是由植入埋植装置或者其他手术技术引起的。

依据本发明的另一方面，提供了BASB033激动剂和拮抗剂，优选是抑菌的和/或杀菌的激动剂或者拮抗剂。

本发明的激动剂和拮抗剂，可以用于例如防止、抑制和/或治疗疾病。

另一方面，本发明涉及本发明多肽的模拟型(mimotope)。模拟型是一段与天然多肽(序列上或者结构上)十分相似的多肽序列，它能够被可以识别天然多肽的抗体识别；或者当与合适的载体偶联时，它能够产生可以识别天然多肽的抗体。

为了特殊的目的，可以通过添加、缺失或者置换所选的氨基酸来设计多肽模拟型。因此，可以为了易于同蛋白质载体结合的目的而修饰多肽。例如，用一些化学结合方法来包含一个末端半胱氨酸是值得做的。另外，在结合到载体蛋白质上的多肽的结合端远端，结合一段疏水末端也是值得做的，于是多肽游离的未结合末端保持与载体蛋白质的表面结合。因此，提供了这种多肽，该多肽的构象与上下文中出现的多肽的整个天然分子的构象非常相似。例如，可以改变多肽，使其具有N-末端半胱氨酸和C-末端疏水酰胺化尾部。另一种选择，可以进行一个或几个氨基酸的D-立体异构体形式的添加或取代来产生有益的衍生物，例如来提高肽的稳定性。

另一种选择，可以利用本身能结合本发明多肽的抗体，使用例如噬菌体展示技术(EP 0 552 267 B1)的技术来鉴定多肽模拟型。该技术可以产生大量模拟天然多肽结构的多肽序列，因此，该多肽序列能够与抗天然多肽的抗体结合，但是该多肽本身可以不必要与天然多肽有显著的序列同源性。

疫苗

本发明的另一方面涉及一种方法，该方法可以在个体中，特别是哺乳动物，优选在人体中，诱导免疫反应，该方法包括给个体接种足够引起抗体和/或T细胞免疫反应的BASB033多核苷酸和/或多肽，或者其片断或其变体，引起的抗体和/或T细胞免疫反应可以保护该个体免于感染，特别是细菌感染，尤其是脑膜炎奈瑟氏球菌感染。由此，也提供了这样的方法，这种免疫反应减慢细菌的复制。然而，本发明的另一方面涉及一种方法，该方法可以在个体中诱导免疫反应，该方法包括传递给该个体一种核酸载体，指导BASB033多核苷酸和/或多肽或者其片断或变体表述的序列或者核酶，为了在体内表达BASB033多核苷酸和/或多肽或者其片断或变体，以便诱导免疫反应，例如，产生抗体和/或T细胞免疫反应，例如包括产细胞因子T细胞或者细胞毒性T细胞，该免疫反应可以保护所说的个体，优选人体免于疾病，无论该疾病是否已经存在于该个体中。施用基因的一个实例是，将其作为微粒的包被或类似物，促进其进入目的细胞。这种核酸载体可以包括DNA，RNA，核酶，经修饰的核酸，DNA/RNA杂交体，DNA-蛋白质复合物或者RNA-蛋白质复合物。

本发明另一方面涉及一种免疫组合物，该组合物能够在个体中引起免疫反应，当该组合物被引入个体，特别是人体中时，它便在该个体中引起针对BASB033多核苷酸和/或其编码的多肽的免疫反应，其中，该组合物包括重组的BASB033多核苷酸和/或其编码的多肽，和/或包括编码和表达所说的BASB033多核苷酸、其编码的多肽或者本发明的其它多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫反应可以用于治疗和预防，免疫反应的形式有抗体免疫和/或细胞免疫，例如CTL或者CD4+T细胞产生的细胞免疫。

BASB033多肽或者其片断，可以与辅蛋白质或者化学部分融合，这种辅蛋白质或者化学部分可以或者不可以自身产生抗体，但是能够稳定第一蛋白质，并且能够产生融合的或者修饰的蛋白质，而后者具有抗原和/或免疫原特性，以及优选保护特性。因此，融合重组蛋白质，优选还包含一种抗原辅蛋白质，例如来自流感嗜血杆菌的脂蛋白D，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或者β-半乳糖苷酶，或者其他相关的稳定蛋白质并且有利于其制备和纯化的大的辅蛋白质。另外，在给接受该蛋白质的有机体的免疫系统提供普遍性刺激方面，辅蛋白质可以作为佐剂。辅蛋白质可以结合在第一蛋白质的氨基-或者羧基-末端。

本发明提供了组合物，特别是疫苗组合物，以及包含本发明多肽和/或多核苷酸和免疫刺激DNA序列的方法，例如在Sato，Y.等，Science 273：352(1996)中描述的。

本发明也提供了这样的方法，该方法在遗传免疫试验里使用的多核苷酸构建体中使用所述的多核苷酸或者其特殊片断，该多核苷酸或者其特殊片断已表明是编码细菌细胞表面蛋白质不变区的，而该遗传免疫试验是在感染了脑膜炎奈瑟氏球菌的动物模型中进行的。这种试验特别有助于鉴定能够引起预防或者治疗免疫反应的蛋白质抗原决定簇。相信，该方法允许随后制备有特殊价值的单克隆抗体，该抗体得自成功抵抗感染或者完全没有被感染的动物的必需器官，该抗体的特殊价值在于开发哺乳动物，特别是人体中细菌感染，特别是脑膜炎奈瑟氏球菌感染的预防试剂或者治疗疗法。

本发明也包括疫苗制剂，该疫苗制剂包含一种与适当载体，例如药物接受载体组合的本发明免疫原性重组多肽和/或多核苷酸。因为多肽和多核苷酸可以在胃中降解，所以它们优选进行肠胃外用药，例如包括皮下用药、肌肉内用药、静脉内用药或者皮内用药。适合肠胃外用药的制剂包括，水性的和非水性的无菌注射溶液，该溶液可以包含抗氧化剂、缓冲液，抑制细菌化合物和溶质，该溶质使得制剂与个体的体液，特别是血液等渗；以及水性的和非水性的无菌悬浮液，该悬浮液可以包含悬浮剂或者增稠剂。制剂可以存放于单位剂量容器或者多剂量容器中，例如封装的安瓿和小瓶，也可以在冷冻干燥情况下贮存，只是在使用前需要另外的无菌液体载体。

本发明疫苗制剂也可以包含用于增强制剂免疫原性的佐剂系统。优选的佐剂系统优先引起TH1型反应。

免疫反应可以在广义上分为两种极端的类型，即体液免疫反应或者细胞介导的免疫反应(其传统特征分别是抗体和保护的细胞效应物机制)。这些反应类型被称作TH1-型反应(细胞介导的反应)，和TH2-型免疫反应(体液反应)。

极端TH1-型免疫反应的特征是，产生抗原特异的单倍型限制性细胞毒性T淋巴细胞，以及产生天然杀伤细胞反应。在小鼠中，TH1-型免疫反应的经常特征是，产生IgG2a亚型抗体，该抗体相应于人体中的IgG1型抗体。TH2-型免疫反应的特征是，产生广谱的免疫球蛋白同种型，包括小鼠的IgGI，IgA和IgM。

可以认为，开发这两种类型的免疫反应背后的驱动力是细胞因子。TH1-型细胞因子的高水平，有助于促进针对所给抗原的细胞介导的免疫反应的诱导，同时，TH2-型细胞因子的高水平，有助于促进针对所给抗原的体液免疫反应的诱导。

TH1-型和TH2-型免疫反应的区别不是绝对的。实际上，个体会维持一种免疫反应，该反应被描述为TH1占优势或者TH2占优势。然而，按照Mosmann和Coffman在鼠类CD4+ve细胞克隆中所描述的那样考虑细胞因子家族，通常是很合适的(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞：导致不同功能性质的淋巴因子分泌的不同模式(TH1 and TH2 cells：different patterns of lymphokinesecretion lead to different functional properties).免疫学年鉴(Annual Review of Immunology)，7，p145-173)。TH1-型反应传统上是与T淋巴细胞产生INF-γ细胞因子和IL-2细胞因子联系在一起的。经常直接与诱导TH1-型免疫反应相联系的其他细胞因子，例如IL-12，不是由T-细胞产生的。相反的，TH2-型免疫反应是与IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌相联系的。

已知特定的疫苗佐剂特别适合于刺激TH1或者TH2-型细胞因子反应。传统上，接种或者感染之后的免疫反应中的TH1：TH2平衡最好的指标包括，在用抗原再次刺激之后在体外直接测定T淋巴细胞产生的TH1或者TH2-型细胞因子，和/或测定抗原特异性抗体反应的IgG1∶IgG2a的比率。

因此，TH1-型佐剂可以在体外用抗原再次刺激时，优先刺激分离出的T细胞群体产生高水平的TH1-型细胞因子，并且可以促进与TH1-型同种型相关的CD8+细胞毒性T淋巴细胞的发育和抗原特异的免疫球蛋白反应的发生。

能够优先刺激TH1细胞反应的佐剂，在国际专利申请.WO94/00153和WO 95/17209中有描述。

3 De-O-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)是一种这样的佐剂。这在GB2220211(Ribi)中可知。在化学上，它是一种具有4，5或6酰化链的3 De-O-酰化单磷酰脂A的混合物，是Ribi Immunochem，Montana生产的。3 De-O-酰化单磷酰脂A的优选形式在欧洲专利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中有描述。

优选地，3D-MPL粒子应当足够小，以便通过0.22微米的膜进行无菌过滤(欧洲专利号0 689 454)。

每剂量的3D-MPL在10μg-100μg范围内，尤其是25-50μg，其中典型的抗原剂量在2-50μg范围内。

另一种优选的佐剂包括QS21，用Hplc从Quillaja SaponariaMolina的树皮中纯化出的一种无毒组分。任选地它可以与3 De-O-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)混合，任选择地与载体混合。

生产QS21的方法公开在美国专利No.5,057,540中。

包含QS21的无反应原性制剂以前有描述(WO 96/33739)。包含QS21和胆固醇的这种制剂，当与一种抗原一起配制时，是一种成功的TH1刺激佐剂。

TH1细胞反应优先刺激剂的其他佐剂，包括免疫调节寡聚核苷酸，例如在WO 96/02555中公布的未甲基化的CpG序列。

不同的TH1刺激佐剂的组合物，例如在上文描述的那些组合物，也可以预期提供一种是TH1细胞反应优先刺激剂的佐剂。例如，QS21可以与3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的典型比率在1∶10到10∶1等级之间；优选1∶5到5∶1，基本上经常是1∶1。3D-MPL∶QS21对于最佳协同作用的范围是2.5∶1到1∶1。

依据本发明，载体优选也出现在疫苗组合物中。载体可以是水包油乳状液，或者铝盐，例如磷酸铝或者氢氧化铝。

优选的水包油乳状剂包含一种可代谢的油，例如鲨烯，α生育酚和吐温80。根据本发明特别优选的方面，疫苗组合物中的抗原在这种乳状剂中与QS21和3D-MPL混合在一起。

对于典型的人类用药，疫苗中的QS21和3D-MPL在每剂量1μg-200μg范围内，例如每剂量10μg-100μg，优选每剂量10μg-50μg。典型的水包油包含2-10％的鲨烯，2-10％的α生育酚和0.3-3％的吐温80。鲨烯∶α生育酚的比率优选是等于或者小于1，这可以提供一种更稳定的乳状剂。Span 85也可以以1％的水平出现。在有的情况下，本发明的疫苗中另外包含一种稳定剂可能是有利的。

无毒的水包油乳状剂优选在水性载体中包含一种无毒的油，例如鲨烷或者鲨烯，一种乳化剂，例如吐温80。水性载体可以是例如磷酸缓冲液。

WO 95/17210中描述了水包油乳状液中含有QS21，3D-MPL和生育酚的特别有效的佐剂制剂。

本发明也提供了一种多价疫苗组合物，该疫苗组合物包含一种与其它抗原结合的本发明的疫苗制剂，特别是用于治疗癌症、自身免疫疾病和相关疾病的抗原。这样的多价疫苗组合物，可以包含一种在上文描述的TH-1诱导佐剂。

当本发明被描述为与特定的BASB033多肽和多核苷酸有关时，应当认为这包括了天然存在的多肽和多核苷酸的片段，以及经过添加、缺失或者置换的相似多肽和多核苷酸，这些添加、缺失或者置换基本上不影响重组多肽或者多核苷酸的免疫原性。

抗原也可以以完整细菌(活的或者死的)或者亚细胞成分的形式送递，这些可能性包括脑膜炎奈瑟氏球菌本身。

组合物，试剂盒和用药

本发明的另一方面也提供了这样的组合物，该组合物包含给细胞或者多细胞生物体用药的BASB033多核苷酸和/或BASB033多肽。

本发明也涉及这样的组合物，该组合物包含此处讨论的多核苷酸和/或多肽或者它们的激动剂和拮抗剂。本发明的多肽和多核苷酸可以与有菌或者无菌的载体一起使用，这种载体是用于细胞、组织或者生物体的，例如适用于给个体用药的药物载体。例如，这种组合物包括，介质添加数量或者治疗有效量的本发明多肽和/或多核苷酸以及药物可接受载体或者赋形剂。这种载体可以包括但是不局限于盐水，缓冲液，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它们的混合物。制剂应当适合用药的方式。此外，本发明涉及诊断的和药物的包和试剂盒，这种包和试剂盒包括一个或者多个容器，其中装有一种或者多种本发明前述组合物的成分。

本发明药物组合物可以以任何有效方便的方式给药，例如其中包括局部用药，口服，肛门用药，阴道用药，静脉内用药，腹膜内用药，肌内用药，皮下用药，鼻内用药或皮内用药途径。

在治疗中或者作为预防，活性药剂可以作为注射组合物给个体使用，例如以无菌的水性分散形式，优选等渗形式。

另一方面，本发明提供了药物组合物，该组合物包括治疗有效量的多肽和/或多核苷酸，例如本发明多肽和/或多核苷酸的可溶性形式，激动剂或者拮抗剂肽或者小分子化合物，结合以药物可接受载体或者赋形剂。这种载体包括但是不局限于盐水，缓冲液，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它们的混合物。此外，本发明涉及药物包和试剂盒，这种包和试剂盒包括一个或者多个容器，其中装有一种或者多种本发明前述组合物的成分。本发明的多肽，多核苷酸和其它化合物，可以单独使用，或者与其它化合物联合使用，例如治疗化合物。

该组合物应适合于用药途径，例如全身途径或者口服途径。优选的全身给药形式包括注射，典型的是静脉注射。其他注射方式也可以使用，例如皮下注射、肌肉内注射或者腹膜下注射。可供选择的全身用药方式包括，使用渗透剂的跨粘膜用药和跨皮肤用药，渗透剂例如胆盐或者梭链孢酸或者其他去垢剂。另外，如果本发明的多肽或者其他化合物可以配制成肠溶性剂型或者胶囊剂型，口服用药也是可行的。这些化合物的用药可以是局部和/或定位的，其形式可以是药膏，糊膏剂，凝胶，溶液，粉末等等。

给哺乳动物特别是人类用药，预期的活性药剂的日剂量水平是从0.01mg/kg到10mg/kg，典型的是大约1mg/kg。在任何情况下，个体最适合的实际剂量要由医生确定，该实际剂量根据具体个体的年龄、体重和反应而有所变化。以上剂量是对于普通病例是典型的。当然，可以有一些个体实例，更高或者更低的剂量范围对其是适合的，这也在本发明的范畴内。

必需的剂量范围依赖于肽的选择，用药途径，制剂性质，患者病情的特征，以及主治医生的判断。然而，适当的剂量在0.1-100μg/kg患者范围内。

疫苗组合物以注射形式存在是方便的。传统的佐剂可以用于增强免疫反应。用于接种的合适的单位剂量是05.-5微克/kg抗原，这种剂量优选施用1-3次，间隔1-3周。使用指出的剂量范围，观察不到本发明化合物不利的毒副作用，该毒性作用会阻止对合适个体的服药。

然而，考虑到可用化合物的多样性和各种用药途径的不同效果，可以预期所需剂量有广阔的变化程度。例如，口服用药预期需要比静脉注射用药更高的剂量。可以通过使用用于最佳化的标准经验程序来调整这些剂量水平的变化，该程序在本领域中熟知。

序列数据库，有形媒介中的序列，以及算法

多核苷酸和多肽的序列构成了一种有价值的信息资源，用该信息可以确定它们的2-维和3-维结构，以及鉴定更多的类似同源性的序列。通过把这些序列存储在计算机可读媒介中，然后使用在已知大分子结构程序中储存的数据，或者使用已知搜索工具，例如GCG程序包搜索序列数据库，可以最容易地易化这些方法。

本发明也提供了分析特征序列或者链的方法，特别是遗传序列或者编码的蛋白质的序列。优选的序列分析方法包括，例如，分析序列同源性的方法，例如同一性和相似性分析，DNA，RNA和蛋白质结构分析，序列组装，分支分析，序列基元分析，开放阅读框架确定，核酸碱基调用，密码子使用分析，核酸碱基修饰，以及测序色谱峰分析。

提供了一种基于计算机的方法以进行同源性鉴定。该方法包括这些步骤：在计算机可读媒介中，提供包含本发明多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；以及比较该第一多核苷酸序列与至少一种第二多核苷酸或多肽序列，以鉴定同源性。

也提供了一种基于计算机的方法以进行同源性鉴定，该方法包括这些步骤：在计算机可读媒介中，提供包含本发明多肽序列的第一多肽序列；以及比较该第一多肽序列与至少一种第二多核苷酸或多肽序列，以鉴定同源性。

在本说明书中引用的所有的出版物和参考文献，包括但是不局限于专利和专利申请，在此引入作为参考，好像每一篇出版物或者参考文献都是特异地和单独地作为全面陈述而在此引入作为参考的。本申请声称对其拥有优先权的任何专利申请，也通过上述对出版物和参考文献的方式在此引入作为参考。

定义

“同一性”，正如本领域已知的，是指两条或者多条多肽序列或者两条或者多条多核苷酸序列之间的关系，视具体情况而定，该关系是通过比较序列确定的。在本领域，“同一性”也意味着多肽或者多核苷酸序列之间序列相关性的程度，视具体情况而定，该关系是通过这些序列的链之间的匹配确定的。“同一性”可以容易地通过已知的方法计算，包括但是不局限于描述在(计算分子生物学(Computational Molecular Biology)Lesk.A.M.，编.，OxfordUniversity Press，纽约，1988；生物计算：信息和基因组课题(Biocomouting：Informatics and Genome Projects)，Smith.D.W.，编.，科学出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析，I部(ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I)，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编.，Humana Press，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，vonHeine，G.，科学出版社，1987；和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.和Devereux，J.，编.，M Stockton Press，纽约，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1998)中的那些方法。设计确定同一性的方法，以给出被测序列之间最大的匹配。另外，确定同一性的方法被编码到公开可用的计算机程序中。确定两条序列之间同一性的计算机程序方法，包括但是不局限于，GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，等，核酸研究(Necleic Acids Research)12(1)：387(1984)).BLASTP.BLASTN(Altschul.S.F.等。，分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)215：403-410(1990).和FASTA(Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444-2448(1988).从NCBI和其它来源、公众可获得程序的BLAST族(BLAST Manual Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD20894：Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。熟知的Smith Waterman算法也可以用于确定同一性。

多肽序列比较的参数包括以下各项：

算法：Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443-453(1970)

比较矩阵：来自Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62

美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89：10915-10919(1992)

Gap Penalty：8

Gap Length Penalty：2

一种公开提供的可以使用这些参数的程序是Genetics ComputerGroup，Madison WI的“gap”程序。上述参数是多肽比较的缺省参数(对于末端缺口没有损失)。

多核苷酸序列比较的参数包括以下：

算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)

比较母式矩阵：匹配＝+10，不匹配＝0

Gap Penalty：50

Gap Length Penalty：3

提供为：Genetics Computer Group，Madison WI的“gap”程序。这些是核酸比较的缺省参数。

多核苷酸和多肽“同一性”优选意思，视具体情况而定，提供在下面的(1)和(2)中。

(1)多核苷酸实施方案此外还包括分离出的多核苷酸，该多核苷酸包含一段多核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO：1的对照序列有至少50，60，70，80，85，90，95，97或者100％的同一性，其中该多核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1对照序列完全同一，或者与对照序列比较可以包含一定整数个数的核苷酸改变，其中所说的改变选自至少一个核苷酸的缺失，置换，包括转位和颠换，或者插入，并且其中该改变可以发生在对照核苷酸序列的5’或者3’末端位置，或者那些末端位置之间的任何位置，这些改变单个地可以分布在对照序列的核苷酸中，或者以一个或者多个连续群体分布在对照序列中，而且其中所说的核苷酸改变的数目通过以下方法确定：把SEQ ID NO：1中全部核苷酸数目乘以定义百分同一性的整数除以100，然后从该SEQ IDNO：1中全部核苷酸数目中减去该乘积，或者：

n_n＜x_n-(x_n·y)，

其中n_n是核苷酸改变的数目，x_n是SEQ ID NO：1中全部核苷酸数目，y对于50％是0.50，对于60％是0.60，对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85，对于90％是0.90，对于95％是0.95，对于97％是0.97或者对于100％是1.00，·是乘法算符的符号，而且其中x_n和y的非整数乘积，在被从x_n中减去之前四舍五入为最接近的整数。编码SEQ ID NO：2多肽的多核苷酸序列的改变，可能在该编码序列中产生无义、错义或者移码突变，因此改变经过这种改变的多核苷酸编码的多肽。

作为实例，本发明的多核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1对照序列完全同一，即可以是100％的同一，或者与对照序列比较，它可以包含一定整数数目的核酸改变，例如百分同一性小于100％同一性。这种改变选自至少一个核酸的缺失，置换，包括转位和颠换，或者插入，并且其中该改变可以发生在对照多核苷酸序列的5’或者3’末端位置，或者那些末端位置之间的任何位置，这些改变单个地可以分布在对照序列的核酸中，或者以一个或者多个连续群体分布在对照序列中。所给百分同一性的核酸改变数目通过以下方法确定：把SEQ ID NO：1中全部核酸数目乘以定义百分同一性的整数除以100，然后从该SEQID NO：1中全部核酸数目中减去该乘积，或者：

n_n＜x_n-(x_n·y)，

其中n_n是核酸改变的数目，x_n是SEQ ID NO：1中全部核酸数目，y是，例如对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85等等，是乘法算符的符号，而且其中x_n和y的非整数乘积，在被从x_n中减去之前四舍五入为最接近的整数。

(2)多肽实施方案此外还包括分离出的多肽，该多肽包含一段与SEQ ID NO：2对照序列有至少50，60，70，80，85，90，95，97或者100％的同一性的多肽，其中该多肽序列可以与SEQ ID NO：2对照序列完全同一，或者与对照序列比较可以包含一定整数个数的氨基酸改变，其中所说的改变选自至少一个氨基酸的缺失，置换，包括保守和非保守置换，或者插入，并且其中该改变可以发生在对照多肽序列的氨基-或者羧基-末端位置，或者那些末端位置之间的任何位置，这些改变单个地可以分布在对照序列的氨基酸中，或者以一个或者多个连续群体分布在对照序列中，而且其中所说的氨基酸改变的数目通过以下方法确定：把SEQ ID NO：2中全部氨基酸数目乘以定义百分同一性的整数除以100，然后从该SEQ ID NO：2中全部氨基酸数目中减去该乘积，或者：

n_a＜x_a-(x_a·y)，

其中n_a是氨基酸改变的数目，x_a是SEQ ID NO：2中全部氨基酸数目，y对于50％是0.50，对于60％是0.60，对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85，对于90％是0.90，对于95％是0.95，对于97％是0.97或者对于100％是1.00，·是乘法算符的符号，而且其中x_a和y的非整数乘积，在被从x_a中减去之前四舍五入为最接近的整数。

作为实例，本发明的多肽序列可以与SEQ ID NO：2对照序列完全同一，即可以是100％的同一，或者与对照序列比较，它可以包含一定整数数目的氨基酸改变，例如百分同一性小于100％同一性。这种改变选自至少一个氨基酸的缺失，置换，包括保守和非保守置换，或者插入，并且其中该改变可以发生在对照多肽序列的氨基-或者羧基-末端位置，或者那些末端位置之间的任何位置，这些改变单个地可以分布在对照序列的氨基酸中，或者以一个或者多个连续群体分布在对照序列中。所给％同一性的氨基酸改变数目通过以下方法确定：把SEQ IDNO：2中全部氨基酸数目乘以定义百分同一性的整数除以100，然后从该SEQ ID NO：2中全部氨基酸数目中减去该乘积，或者：

n_a＜x_a-(x_a·y)，

其中n_a是氨基酸改变的数目，x_a是SEQ ID NO：2中全部氨基酸数目，y是，例如对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85等等，·是乘法算符的符号，而且其中x_a和y的非整数乘积，在被从x_a中减去之前四舍五入为最接近的整数。

“个体”，在此处使用时是关于生物体的，意味着多细胞真核生物，包括但是不局限于包括后生动物，哺乳动物，ovid，牛科动物，猿，灵长类，和人类。

“分离出的”意味着被从其天然状态中“通过人手”而改变，即，如果它存在于天然状态中，它被从其初始环境中改变或者移动，或者既改变也移动。例如，天然存在于活的生物体中的多核苷酸或者多肽不是“分离出的”，但是从其天然状态共存的材料中分离出的同样的多核苷酸或者多肽是“分离出的”，正如此处使用的该术语。此外，通过转化，遗传操作或者其他重组方法引入到生物体中的多核苷酸或者多肽是“分离出的”，即使它仍然出现在该生物体中，该生物体可以是活的或者死的。

“多核苷酸”通常指的是多核糖核苷酸或者多脱氧核糖核苷酸，可以是未经修饰的RNA或DNA或者经过修饰的RNA或DNA，包括单链和双链区域。

“变体”指的是与对照多核苷酸或者多肽不同但是保留了基本性质的多核苷酸或者多肽。典型的多核苷酸变体与另一条多核苷酸，对照多核苷酸在核苷酸序列上不同。变体核苷酸序列的改变，可以改变或者也可以不改变对照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸改变，可以导致如下所述的，对照多核苷酸编码的多肽的氨基酸置换、添加、缺失、融合和平截。典型的多肽变体与另一条多肽，对照多肽在氨基酸序列上不同。通常，不同是有限的，于是对照多肽序列和变体总体上是非常相似的，并且在许多区域是同一的。通过任意组合的一个或者多个置换、添加、缺失，变体和对照多肽可以在氨基酸序列上不同。一个置换或者插入的氨基酸残基可以是也可以不是遗传密码子编码的。多核苷酸或者多肽的变体，可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者它可能是一种不是已知天然存在的变体。非天然存在的多核苷酸或者多肽变体，可以通过诱变技术或者通过直接合成产生。

“疾病”指任何由细菌感染引起的或者与之相关的疾病，例如包括，上呼吸道感染，侵袭性细菌疾病，例如菌血症和脑膜炎。

实例：

以下实例是用标准技术进行的，这些技术，除了另外详细描述的以外，对于本领域技术人员来说都是熟知的和常规的。实施例是说明性的，但是不限制本发明。

实施例1：两株脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中的BASB033基因的发现和证实性DNA测序。

A：脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株ATCC13090中的BASB033

SEQ ID NO：1的BASB033基因最早发现于Incyte PathoSeq数据库，其中包含脑膜炎奈瑟氏球菌ATCC13090菌株的未完成基因组DNA序列。显示在SEQ ID NO：2中的BASB033多核苷酸序列的翻译，显示了与肺炎克氏杆菌外膜磷脂酶A蛋白质显著的相似性(292个重叠氨基酸中35％的同一性)。BASB033基因的序列被进一步实验证实。为此目的，使用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒(Qiagen Gmbh)，从10¹⁰个脑膜炎奈瑟氏球菌细胞(ATCC13090菌株)中提取基因组DNA，1μg这种材料用于聚合酶链反应DNA扩增，引物使用的是包含NdeI内切酶位点(下划线标出)的Pla-01(5’-GGT CGA C CA TAT GAA TATACG GAA TAT GCG CTA-3’)[SEQ ID NO：5]和包含XhoI内切酶位点(下划线标出)的Pla-02(5’-CGC CG C TCG AGG ATG CCG TCC AAG TCGTTG-3’)[SEQ ID NO：6]。PCR产物经凝胶纯化，用于DNA测序，测序使用的是Big Dye Cycle测序试剂盒(Perkin-Elmer)和ABI373A/PRISM DNA测序仪。DNA测序在两条链进行，冗余度为2，全长序列通过DNASTAR Lasergene软件包中的SeqMan程序装配。最后得到的DNA序列证明与SEQ ID NO：1 100％同一。

B：脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株H44/76中的BASB033

BASB033基因的序列在另一种脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株，H44/76菌株中也得到确定。为此目的，使用实施例1中给出的实验条件，从脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76菌株中提取基因组DNA。然后，这种材料(1μg)被用于聚合酶链反应DNA扩增，扩增使用了对BASB033基因特异的引物Pla-01和Pla-02。使用标准分子生物学技术(分子克隆，实验手册(Molecular Cloning，a Laboratory Manual)，第二版，编者：Sambrook，Fritsch & Maniatis，冷泉港出版社1989)，得到一段～1100bp的DNA片段，用NdeI/XhoI限制性内切酶酶解，并插入到pE7-24b克隆/表达载体(Novagen)的相应位点。然后，使用Big Dye试剂盒(Applied biosystems)对重组体pE7-24b/BASB033进行DNA测序，并使用ABI 373/A DNA测序仪在供应商所述的条件下进行分析。从而得到多核苷酸和推导出的多肽序列，分别被称为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。使用DNAST AR Lasergene package中的MegAlign程序完成了SEQ ID NO：1和3多核苷酸序列的序列对比，并显示在图1中；如程序确定的，它们的同一性水平等于99.3％。使用相同的Meg Align程序，完成了SEQ ID NO：2和4的多肽序列的序列对比，并显示在图2中；如该程序确定的，它们的同一性水平等于98.9％。

总之，这些数据表明，这两种脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株中的BASB033基因具有强烈的序列保守性。

实例2：重组BASB033蛋白质在大肠杆菌中的表达和纯化

pE7-24b/BASB033克隆/表达载体的构建体描述在实施例1B中。该载体接入从H44/76菌株中分离出的BASB033基因，该基因融合了一段6个组氨酸残基的序列，并被置于噬菌体T7基因10强启动子的控制之下。为了研究表达，该载体被引入大肠杆菌菌株Novablue(DE3)(Novagen)中，其中，T7聚合酶基因被置于异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-调节的lac启动子控制之下。Novablue(DE3)[pET-24b/BASB033]大肠杆菌重组菌株的液体培养物(100ml)在37℃摇动培养，直至600nm光密度(OD600)达到0.6。在这一时间点，加入IPTG至终浓度1mM，然后培养物再生长4个小时。然后，以10,000rpm离心培养物，沉淀在-20℃冷冻至少10小时。

融化后，沉淀(3升培养物)在pH 8.0每毫升包含20单位benzonase的20mM磷酸缓冲液中重悬，在22℃孵育30分钟。裂解的细胞在4℃，15,000rpm离心30分钟得沉淀(Beckman J2-HS离心机，JA-20转头)。重组蛋白质BASB033/His6在4℃用pH 8.0的8M脲，20mM磷酸盐溶解过夜。细胞碎片在4℃，用JA-20转头15,000rpm离心30分钟得沉淀。样品以1ml/min流速加样到4ml的Fractogel EMD S03 650S柱子(Merck)上。柱子用pH 8.0的8M脲，20mM磷酸盐平衡。流通通过之后，柱子用平衡缓冲液清洗，直至达到基线。用pH 8.0的100mM NaCl，8M脲，20mM磷酸盐以1ml/min从柱子上洗脱重组蛋白质。洗脱的样品在4℃用含0.5M精氨酸的PBS透析。如显示在图3(6道)中的，浓缩的(在CBB染色的SDS-PAGE上，估计的纯度是50％纯)BASB033/His6蛋白质被从柱子上洗脱下来，它迁移到43kDa(估计的相对分子量)。该多肽对于抗5-组氨酸基元的小鼠单克隆抗体是有活性的(参见图4，6道)。总之，这些数据表明，BASB033基因可以以重组形式(BASB033/His6)在大肠杆菌中的表达和纯化。

实例3：用重组BASB033免疫小鼠

部分纯化的在大肠杆菌中表达的重组BASB033，在第0，14，28天分3次注射到Balb/C小鼠中(10只动物/组)。通过皮下途径给动物注射吸附到100μg AlPO₄上的5μg抗原。包括只用SBAS2佐剂免疫小鼠的阴性对照组也被增加到试验中。为了检测抗-BASB033的特异抗体，小鼠在第28天(Post II 14天)和第35天(Post III 7天)取血。对于重组BASB033蛋白质和大肠杆菌蛋白质用混合血清Elisa来测定抗-BASB033的特异抗体。使用重组抗原通过蛋白质印迹也评价了抗-BASB033反应。

对包被有BASB033的Elisa结果显示在下面，表明BASB033抗原尽管是部分纯化的，它在小鼠内有明显的免疫原性，虽然比较弱(图5)。特异的BASB033反应和大肠杆菌反应之间可观察到的不同，是由于抗-BASB033的特异抗体。阴性对照组的小鼠没有特异的BASB033反应。这也清楚地证明在图6中，其中有在大约43kD检测到的清楚的BASB033泳带。Post II或者Post III取血得到的血清用于这些分析。

通过蛋白质印迹识别不同NmB菌株中的BASB033抗原决定簇

在检测中，经免疫的小鼠血清(混合的)用蛋白质印迹进行检测，以识别六种不同脑膜炎奈瑟氏球菌B菌株中的BASB033抗原决定簇：H44/76(B：15：P：1.7，16，谱系ET-5)，M97250687(B：4：P1.15)，BZ10(B：2b：P1.2，谱系A4)，BZ198(B：NT*：-，谱系3)，和EG328(B：NT*，谱系ST-18)，以及部分纯化的重组BASB033蛋白质。(*：NT：未定型(Not Typed))。

简而言之，每种样品15μl(＞10⁸个细胞/道)经用样品缓冲液处理后(95℃10分钟)，加样到SDS-PAGE梯度凝胶(Tris-甘氨酸4-20％，Novex，code n°EC6028)。电泳迁移发生在35mA/凝胶90分钟。然后，在100伏使用Bio-rad Trans-blot系统(code n°170-3930)，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(0.45μm，Bio-rad coden°162-0114)。在与包含抗-BASB033抗体的小鼠血清一起孵育前，滤膜在室温用PBS-0.05％吐温20封闭过夜。这些血清在PBS-0.05％吐温20中稀释100倍，使用mini-blotter系统(Miniprotean，Bio-rad code n°170-4017)将血清在硝酸纤维素膜上室温下孵育两小时，轻轻摇动。重复3次清洗步骤，每次在PBS-0.05％吐温20中清洗5分钟，然后，硝酸纤维素膜在室温下与合适的偶联物(来自绵羊的生物素化的抗小鼠Ig抗体，Amersham code n°RPN1001)孵育1小时，轻轻摇动，该偶联物在相同的清洗缓冲液中稀释到1/500。再象前面那样把膜清洗3次，使用链霉抗生物素蛋白质-过氧化物酶复合物(Amersham code n°1051)摇动孵育30分钟，链霉抗生物素蛋白质-过氧化物酶复合物需要在清洗缓冲液中稀释到1/1000。在最后3次重复清洗步骤之后，在50ml包含30mg 4-氯-1-萘酚(Sigma)，10ml甲醇，40ml PBS，以及30μl H₂O₂的溶液中进行孵育，显色发生在20分钟孵育时间里。在蒸馏水中清洗薄膜几次，终止染色。

图解在图7和图8中的结果表明，几乎所有的被试菌株都呈现出一条大约43kD的条带，意味着抗重组BASB033蛋白质的抗体识别脑膜炎奈瑟氏球菌B细胞表面的天然蛋白质(此情况下，6/7菌株被识别)。于是，BASB033蛋白质可能在大多数脑膜炎奈瑟氏球菌B菌株中表达。所有其它条带可能是由于抗BASB033聚合产物抗体(如在大约90-100kD观察到的产物)，相关产物，或者大肠杆菌与脑膜炎奈瑟氏球菌B细菌之间的交叉反应抗原，因为用于免疫的制剂仍包含大肠杆菌的杂质。在大肠杆菌蛋白质中，观察不到43kD的反应条带，意味着抗原不存在于大肠杆菌中。

实例4：恢复期患者血清中出现抗-BASB033抗体

在检测中，通过识别纯化的重组BASB033蛋白质的蛋白质印迹检测几种恢复期血清。

简而言之，24μg部分纯化的BASB033蛋白质被加样到用于电泳迁移的SDS-PAGE梯度凝胶上(4-20％，Novex，code n°EC6029)。在100伏使用Bio-rad Trans-blot系统(code n°170-3930)，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(0.45μm，Bio-rad code n°162-0114)。此后，在与人血清一起孵育前，滤膜在室温用PBS-0.05％吐温20封闭过夜。这些血清在PBS-0.05％吐温20中稀释至1/50，使用mini-blotter系统(Miniprotean，Bio-rad code n°170-4017)将血清在硝酸纤维素膜上室温下孵育两小时，轻轻摇动。重复3次在PBS-0.05％吐温20中清洗5分钟清洗步骤之后，硝酸纤维素膜在室温下与合适的偶联物(来自绵羊的生物素化的抗人Ig抗体，Amershamcode n°RPN1003)孵育1小时，轻轻摇动，该偶联物在相同的清洗缓冲液中稀释到1/500。再象前面那样把膜清洗3次，使用链霉抗生物素蛋白质-过氧化物酶复合物(Amersham code n°1051)摇动孵育30分钟，链霉抗生物素蛋白质-过氧化物酶复合物需要在清洗缓冲液中稀释到1/1000。在最后3次重复清洗步骤之后，在50ml包含30mg4-氯-1-萘酚(Sigma)，10ml甲醇，40ml PBS，以及30μl H₂O₂的溶液中进行孵育，显色发生在20分钟孵育时间里。在蒸馏水中清洗薄膜几次，终止染色。

图解在图9(B部分)中的结果表明，所有的被试恢复期血清都在大约43kD与BASB033重组蛋白质反应，BASB033条带清楚可见。260601恢复期血清反应最弱。这种反应支持了BASB033抗原作为疫苗成分的潜在用途。在蛋白质印迹的A部分，如前所述，我们证实小鼠血清对于完整的重组BASB033蛋白质的识别非常好。

实例5：BASB033基因非编码侧翼区的分析，及其调节BASB033基因表达的利用

BASB033基因非编码侧翼区包含对基因表达重要的调节元件。这种调节发生在转录水平和翻译水平。这些区域位于基因开放阅读框架的上游或者下游，其序列可以通过DNA测序得到。这些序列信息允许确定潜在的调节基元，例如不同的启动子元件，终止子序列，诱导序列元件，阻抑物，负责相转变的元件，shine-delgarno序列，具有与调节有关的潜在二级结构的区域，以及其它类型的调节基元或者序列。

这些序列信息允许调节BASB033基因的天然表达。通过改变启动子，shine-delgarno序列，潜在阻抑物或者操纵基因元件，或者其他任何有关元件，可以实现基因表达的正调节。同样的，通过相似类型的改变，可以实现基因表达的负调节。作为选择，通过改变相转变序列，基因表达可以置于相转变的控制之下，或者可以与这种调节分离。用另一种方法，基因表达可以置于一种或者多种调节表达的诱导型元件控制之下。这种调节表达的实例，包括但是不局限于，通过温度改变诱导，加入象是挑选的糖类或者其衍生物那样的诱导物质，微量元素，维生素，辅因子，金属离子，等等。

上述这样的改变可以通过若干不同的方式引入。涉及基因表达的序列改变，可以通过体内随机诱变实现，诱变之后要对期望表型进行选择。另一种方法是分离出感兴趣的区域，通过随机诱变，或者定点诱变，插入或者缺失诱变对其进行修改。然后，经改变的区域可通过同源重组重新引入细菌基因组，并且可以估计其对于基因表达的效果。用另一种方法，感兴趣区域的序列知识可用于置换或者缺失全部或者部分的天然调节序列。这样的话，目标调节区域被分离和修改，使得它包含来自其他基因的调节元件，来自不同基因的调节元件的组合，合成的调节区域，或者任何其他调节区域，或者使其缺失野生型调节序列中挑选的部分。这些经改变的序列可通过同源重组重新引入细菌基因组。可用于基因表达正调节的优选启动子的一份不完全列表包括，来自脑膜炎奈瑟氏球菌或者淋病奈瑟氏球菌的启动子porA，porB，lbpB，tbpB，p110，lst，hpuAB。

在另一个实施例中，可以通过将其启动子换为一种更强的启动子而调节基因的表达(通过分离基因的上游序列，在体外修改该序列，并通过同源重组重新引入基因组)。在细菌中以及从细菌脱落(或者制备)的外膜囊泡中可以得到正调节的表达。在其他实施例中，所说的方法可用于产生重组细菌菌株，该菌株对于疫苗应用具有改良的特性。这些可以是，但是不局限于，减毒菌株，增加表达所选抗原的菌株，敲除(或者降低表达)涉及免疫反应的基因的菌株，免疫显性蛋白表达经过调节的菌株，外膜囊泡脱落经过调节的菌株。

直接位于BASB033基因上游的一段区域在SEQ ID NO：7的序列中给出。该序列是本发明的另一个方面。

图例

图3：

基本上纯化的(估计50％)BASB033蛋白质级分在SDS-PAGE条件下在4-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(NOVEX)中得以分离，与之平行的是蛋白质分子量标准(1道)，然后用考马斯蓝染色。6道清楚地显示了在大约43kD浓缩的BASB033(2道和3道是全部细胞蛋白质提取物，4道是流通(flowthrough)，5至10道是洗脱分布图)。

图4：

基本上纯化的(估计50％)BASB033蛋白质级分在SDS-PAGE条件下在4-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(NOVEX)中得以分离，与之平行的是蛋白质分子量标准(1道)，然后使用抗-His5小鼠单克隆抗体通过蛋白质印迹进行分析。6道清楚地显示了大约43kD的BASB033多肽(2道和3道是全部细胞蛋白质提取物，4道是流通，5至10道是洗脱分布图)。

BASB033多核苷酸和多肽序列

SEQ ID NO：1

脑膜炎奈瑟氏球菌BASB033多核苷酸序列

ATGAATATACGGAATATGCGCTATATCCTTTTGACAGGACTGTTGCCGACGGCATCCGCTTTTGGAGAGACCGCGCTGCA

ATGCGCCGCTTTGACGGACAATGTTACGCGTTTGGTGTGTTACGACAGGATTTTTGCGGCACAGCTTCCGTCTTCGGCAG

GGCAGGAAGGGCAGGAGTCGAAAGCCGTACTCAATCTGACGGAAACCGTCCGCAGCAGCCTGGATAAGGGCGAGGCGGTC

ATTGTTGTTGAAAAAGGCGGGGATGCGCTTCCTGCCGACAGTGCGGGCGAAACCGCCGACATCTATACGCCTTTGAGCCT

GATGTACGACTTGGACAAAAACGATTTGCGCGGGCTGTTGGGCGTACGCGAACACAATCCGATGTACCTTATGCCGCTCT

GGTACAACAATTCGCCCAACTATGCCCCGAGTTCGCCGACGCGCGGTACAACTGTACAGGAAAAATTCGGACAGCAGAAA

CGTGCGGAAACCAAATTGCAGGTTTCGTTCAAAAGCAAAATTGCCGAAGATTTGTTTAAAACCCGCGCGGATCTGTGGTT

CGGCTACACCCAAAGATCCGATTGGCAGATTTACAACCAAGGCAGGAAATCCGCGCCGTTCCGCAATACGGATTACAAAC

CTGAAATTTTCCTGACCCAGCCTGTGAAGGCGGATTTGCCGTTCGGCGGCAGGCTGCGTATGCTCGGTGCGGGTTTTGTC

CACCAGTCCAACGGACAGAGCCGTCCCGAATCGCGTTCGTGGAACAGGATTTACGCCATGGCAGGCATGGAATGGGGCAA

ATTGACGGTGATTCCGCGCGTGTGGGTGCGTGCGTTCGATCAGAGCGGCGATAAAAACGACAATCCCGATATTGCCGACT

ATATGGGGTATGGCGACGTGAAGCTGCAGTACCGCCTGAACGACAGGCAGAATGTGTATTCCGTATTGCGCTACAACCCC

AAAACGGGCTACGGCGCGATTGAAGCCGCCTACACGTTTCCGATTAAGGGCAAACTCAAAGGCGTGGTACGCGGATTCCA

CGGTTACGGCGAGAGCCTGATCGACTACAACCACAAGCAGAACGGTATCGGTATCGGGTTGATGTTCAACGACTTGGACG

GCATCTGA

SEQ ID NO：2

从SEQ ID NO：1的多核苷酸序列推导出的脑膜炎奈瑟氏球菌

BASB033多肽序列

MNIRNMRYTLLTGLLPTASAFGETALQCAALTDNVTRLVCYDRIFAAQLPSSAGQEGQESKAVLNLTETVRSSLDKGEAV

IVVEKGGDALPADSAGETADIYTPLSLMYDLDKNDLRGLLGVREHNPMYLMPLWYNNSPNYAPSSPTRGTTVQEKFGQQK

RAETKLQVSFKSKIAEDLFKTRADLWFGYTQRSDWQIYNQGRKSAPFRNTDYKPEIFLTQPVKADLPFGGRLRMLGAGFV

HQSNGQSRPESRSWNRIYAMAGMEWGKLTVIPRVWVRAFDQSGDKNDNPDIADYMGYGDVKLQYRLNDRQNVYSVLRYNP

KTGYGAIEAAYTFPIKGKLKGVVRGFHGYGESLIDYNHKQNGIGIGLMFNDLDGI

SEQ ID NO：3

来自H44/76菌株的脑膜炎奈瑟氏球菌BASB033多核苷酸序列

ATGAATATACGGAATCGCTATATTCTTTTGACAGGACTGTTGCCGATGCCATCCGCTTTTGGAGAGACCGCGCTGCAATG

CGCCGCTTTGACGGACAATGTTACGCGTTTGGCGTGTTACGACAGGATTTTTGCGGCACAGCTTCCGTCTTCGGCAGGGC

AGGAAGGGCAGGAGTCGAAAGCCGTACTCAATCTGACGGAAACCGTCCGCAGCAGCCTGGATAAGGGCGAGGCGGTCATT

GTTGTTGAAAAAGGCGGGGATGCGCTTCCTGCCGACAGTGCGGGCGAAACCGCCGACATCTATACGCCTTTGAGCCTGAT

GTACGACTTGGACAAAAACGATTTGCGCGGGCTGTTGGGCGTACGCGAACACAATCCGATGTACCTTATGCCGCTCTGGT

ACAACAATTCGCCCAACTATGCCCCGgGTTCGCCGACGCGCGGTACgACTGTACAGGAAAAATTCGGACAGCAGAAACGT

GCGGAAACCAAATTGCAGGTTTCGTTCAAAAGCAAAATTGCCGAAGATTTGTTTAAAACCCGCGCGGATCTGTGGTTCGG

CTACACCCAAAGATCCGATTGGCAGATTTACAACCAAGGCAGGAAATCCGCGCCGTTCCGCAATACGGATTACAAACCTG

AAATTTTCCTGACCCAGCCTGTGAAGGCGGATTTGCCGTTCGGCGGCAGGCTGCGTATGCTCGGTGCGGGTTTTGTCCAC

CAGTCCAACGGACAGAGCCGTCCCGAATCGCGTTCGTGGAACAGGATTTACGCCATGGCAGGCATGGAATGGGGCAAATT

GACGGTGATTCCGCGCGTGTGGGTGCGTGCGTTCGATCAGAGCGGCGATAAAAACGACAATCCCGATATTGCCGACTATA

TGGGGTATGGCGACGTGAAGCTGCAGTACCGCCTGAACGACAGGCAGAATGTGTATTCCGTATTGCGCTACAACCCCAAA

ACGGGCTACGGCGCGATTGAAGCCGCCTACACGTTTCCGATTAAGGGCAAACTCAAAGGCGTGGTACGCGGATTCCACGG

TTACGGCGAGAGCCTGATCGACTACAACCACAAGCAGAACGGTATCGGTATCGGGTTGATGTTCAACGACTTGGACGGCA

TCTGA

SEQ ID NO：4

从SEQ ID NO：3的多核苷酸序列推导出的脑膜炎奈瑟氏球菌

BASB033多肽序列

MNIRNRYILLTGLLPMASAFGETALQCAALTDNVTRLACYDRIFAAQLPSSAGQEGQESKAVLNLTETVRSSLDKGEAVI

VVEKGGDALPADSAGETADIYTPLSLMYDLDKNDLRGLLGVREHNPMYLMPLWYNNSPNYAPGSPTRGTTVQEKFGQQKR

AETKLQVSFKSKIAEDLFKTRAQLWFGYTQRSQWQIYNQGRKSAgFRNTDYKPEIFLTQPVKADLPFGGRLRMLGAGFVH

QSNGQSRPESRSNNRIYAMAGMEWGKLTVIPRVWVRAFDQSGDKNDNPDIADYMGYGDVKLQYRLNDRQNVYSVLRYNPK

TGYGAIEAAYTFPIKGKLKGVVRGFHGYGESLIDYNHKQNGIGIGLMFNDLDGI

SEQ ID NO：5

GGT CGA CCA TAT GAA TAT ACG GAA TAT GCG CTA

SEQ ID NO：6

CGC CGC TCG AGG ATG CCG TCC AAG TCG TTG

SEQ ID NO：7

CGTACCGCATTCCGCACTGCAGTGAAAAAAGTATTGAAAGCAGTCGAAGCAGGCGATAAAGCTGCCGCACAAGCGGTTTA

CCAAGAGTCCGTCAAAGTCATCGACCGCATCGCCGACAAGGGCGTGTTCCATAAAAACAAAGCGGCTCGCCACAAAACCC

GTTTGTCTCAAAAAGTAAAACCTTGGCTTGATTTTTGCAAAACCTGCAATCCGGTTTTCATCGTCGATTCCGAAAACCCC

TGAAGCCCGACGGTTTCGGGGTTTTCTGTATTGCGGGGACAAAATCCCGAAATGGCGGAAAGGGTGCGGTTTTTTATCCG

AATCCGCTATAAAATGCCGTCTGAAAACCAATATGCCGACAATGGGGGTGGAG

保藏的材料

包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株的保藏物，于1997年6月22日保藏在美国典型培养物保藏中心(AmericanType CultureCollection)(此处为“ATCC”)登记的保藏号为13090。保藏物被描述为脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)(Albrecht和Ghon)，是从脑膜炎奈瑟氏球菌隔离种群中构建的冻干的1.5-2.9kb插入文库。该保藏物描述于Int.Bull.Bacteriol.Nomencl.Taxon.8：1-15(1958)。

脑膜炎奈瑟氏球菌菌株保藏物在此处称为“保藏的菌株”或者“保藏的菌株的DNA”。

保藏的菌株包含全长BASB033基因。如果与此处任何序列的描述发生冲突的情况下，保藏的菌株中包含的多核苷酸序列，以及其编码的任何多肽的氨基酸序列是控制的。

根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约保藏了保藏的菌株。专利一旦颁布，菌株将不可取消地并且没有任何限制或者条件对公众公开。保藏的菌株只是为了方便而提供给那些本领域技术人员，并不承认为了赋予权利而要求的保藏，例如在35U.S.C.§112中所要求的。

序列表

<110>SmithKline Beecham Biologicals S.A.

<120>新化合物

<130>BM4S331

<160>6

<170>FastSEQ for Window Version 3.0

<210>1

<211>1128

<212>DNA

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌

<400>1

atgaatatac ggaatatgcg ctatatcctt ttgacaggac tgttgccgac ggcatccgcc 60

tttggagaga ccgcgctgca atgcgccgct ttgacggaca atgttacgcg tttggtgtgt 120

tacgacagga tttttgcggc acagcttccg tcttcggcag ggcaggaagg gcaggagtcg 180

aaagccgtac tcaatctgac ggaaaccgtc cgcagcagcc tggataaggg cgaggcggtc 240

attgttgttg aaaaaggcgg ggatgcgctt cctgccgaca gtgcgggcga aaccgccgac 300

atctatacgc ctttgagcct gatgtacgac ttggacaaaa acgatttgcg cgggctgttg 360

ggcgtacgcg aacacaatcc gatgtacctt atgccgctct ggtacaacaa ttcgcccaac 420

tatgccccga gttcgccgac gcgcggtaca actgtacagg aaaaattcgg acagcagaaa 480

cgtgcggaaa ccaaattgca ggtttcgttc aaaagcaaaa ttgccgaaga tttgtttaaa 540

acccgcgcgg atctgtggtt cggctacacc caaagatccg attggcagat ttacaaccaa 600

ggcaggaaat ccgcgccgtt ccgcaatacg gattacaaac ctgaaatttt cctgacccag 660

cctgtgaagg cggatttgcc gttcggcggc aggctgcgta tgctcggtgc gggttttgtc 720

caccagccca acggacagag ccgtcccgaa tcgcgttcgt ggaacaggat ttacgccatg 780

gcaggcatgg aatggggcaa attgacggtg attccgcgcg tgtgggtgcg tgcgttcgat 840

cagagcggcg ataAaaacga caatcccgat attgccgact atatggggta tggcgacgtg 900

aagctgcagt accgcctgaa cgacaggcag aatgtgtatt ccgtattgcg ctacaacccc 960

aaaacgggct acggcgcgat tgaagccgcc tacacgtttc cgattaaggg caaactcaaa 1020

ggcgtggtac gcggattcca cggttacggc gagagcctga tcgactacaa ccacaagcag 1080

aacggtatcg gtatcgggtt gatgttcaac gacttggacg gcatctga 1128

<210>2

<211>375

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌

<400>2

Met Asn Ile Arg Asn Met Arg Tyr Ile Leu Leu Thr Gly Leu Leu Pro

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ala Phe Gly Glu Thr Ala Leu Gln Cys Ala Ala Leu Thr

20 25 30

Asp Asn Val Thr Arg Leu Val Cys Tyr Asp Arg Ile Phe Ala Ala Gln

35 40 45

Leu Pro Ser Ser Ala Gly Gln Glu Gly Gln Glu Ser Lys Ala Val Leu

50 55 60

Asn Leu Thr Glu Thr Val Arg Ser Ser Leu Asp Lys Gly Glu Ala Val

65 70 75 80

Ile Val Val Glu Lys Gly Gly Asp Ala Leu Pro Ala Asp Ser Ala Gly

85 90 95

Glu Thr Ala Asp Ile Tyr Thr Pro Leu Ser Leu Met Tyr Asp Leu Asp

100 105 110

Lys Asn Asp Leu Arg Gly Leu Leu Gly Va1 Arg Glu His Asn Pro Met

115 120 125

Tyr Leu Met Pro Leu Trp Tyr Asn Asn Ser Pro Asn Tyr Ala Pro Ser

130 l35 140

Ser Pro Thr Arg Gly Thr Thr Val Gln Glu Lys Phe Gly Gln Gln Lys

145 150 155 160

Arg Ala Glu Thr Lys Leu Gln Val Ser Phe Lys Ser Lye Ile Ala Glu

165 170 175

Asp Leu Phe Lys Thr Arg Ala Asp Leu Trp Phe Gly Tyr Thr Gln Arg

180 185 190

Ser Asp Trp Gln Ile Tyr Asn Gln Gly Arg Lys Ser Ala Pro Phe Arg

195 200 205

Asn Thr Asp Tyr Lys Pro Glu Ile Phe Leu Thr Gln Pro Val Lys Ala

210 215 220

Asp Leu Pro Phe Gly Gly Arg Leu Arg Met Leu Gly Ala Gly Phe Val

225 230 235 240

His Gln Ser Asn Gly Gln Ser Arg Pro Glu Ser Arg Ser Trp Asn Arg

245 250 255

Ile Tyr Ala Met Ala Gly Met Glu Trp Gly Lys Leu Thr Val Ile Pro

260 265 270

Arg Val Trp Val Arg Ala Phe Asp Gln Ser Gly Asp Lys Asn Asp Asn

275 280 285

Pro Asp Ile Ala Asp Tyr Met Gly Tyr Gly Asp Val Lys Leu Gln Tyr

290 295 300

Arg Leu Asn Asp Arg Gln Asn Va1 Tyr Ser Val Leu Arg Tyr Asn Pro

305 310 315 320

Lys Thr Gly Tyr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Tyr Thr Phe Pro Ile Lys

325 330 335

Gly Lys Leu Lys Gly Val Val Arg Gly Phe His Gly Tyr Gly Glu Ser

340 345 350

Leu Ile Asp Tyr Asn His Lys Gln Asn Gly Ile Gly Ile Gly Leu Met

355 360 365

Phe Asn Asp Leu Asp Gly Ile

370 375

<210>3

<211>1125

<212>DNA

<2l3>脑膜炎奈瑟氏球菌

<400>3

atgaatatac ggaatcgcta tattcttttg acaggactgt tgccgatggc atccgctttt 60

ggagagaccg cgctgcaatg cgccgctttg acggacaatg ttacgcgttt ggcgtgttac 120

gacaggattt ttgcggcaca gcttccgtct tcggcagggc aggaagggca ggagtcgaaa 180

gccgtactca atctgacgga aaccgtccgc agcagcctgg ataagggcga ggcggtcatt 240

gttgttgaaa aaggcgggga tgcgcttcct gccgacagtg cgggcgaaac cgccgacatc 300

tatacgcctt tgagcctgat gtacgacttg gacaaaaacg atttgcgcgg gctgttgggc 360

gtacgcgaac acaatccgat gtaccttatg ccgctctggt acaacaattc gcccaactat 420

gccccgggtt cgccgacgcg cggtacgact gcacaggaaa aattcggaca gcagaaacgt 480

gcggaaacca aattgcaggt etcgttcaaa agcaaaateg ccgaagattt gtttaaaacc 540

cgcgcggatc tgtggttcgg ctacacccaa agatccgatt ggcagattta caaccaaggc 600

aggaaatccg cgccgttccg caatacggat tacaaacctg aaattttcct gacccagcct 660

gtgaaggcgg atttgccgtt cggcggcagg ctgcgtatgc tcggtgcggg ttttgtccac 720

cagtccaacg gacagagccg tcccgaatcg cgttcgtgga acaggattta cgccatggca 780

ggcatggaat ggggcaaatt gacggtgatt ccgcgcgtgt gggtgcgtgc gttcggacag 840

agcggcgata aaaacgacaa tcccgatatt gccgactata tggggtatgg cgacgtgaag 900

ctgcagtacc gcctgaacga caggcagaat gtgtattccg tattgcgcta caaccccaaa 960

acgggctacg gcgcgattga agccgcceac acgtttccga ttaagggcaa actcaaaggc 1020

gtggtacgcg gattccacgg ttacggcgag agcctgatcg actacaacca caagcagaac 1080

ggtatcggta tcgggttgat gttcaacgac ttggacggca tctga 1125

<210>4

<211>374

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌

<400>4

Met Asn Ile Arg Asn Arg Tyr Ile Leu Leu Thr Gly Leu Leu Pro Met

1 5 10 15

Ala Ser Ala Phe Gly Glu Thr Ala Leu Gln Cys Ala Ala Leu Thr Asp

20 25 30

Asn Val Thr Arg Leu Ala Cys Tyr Asp Arg Ile Phe Ala Ala Gln Leu

35 40 45

Pro Ser Ser Ala Gly Gln Glu Gly Gln Glu Ser Lys Ala Val Leu Asn

50 55 60

Leu Thr Glu Thr Val Arg Ser Ser Leu Asp Lys Gly Glu Ala Val Ile

65 70 75 80

Val Val Glu Lys Gly Gly Asp Ala Leu Pro Ala Asp Ser Ala Gly Glu

85 90 95

Thr Ala Asp Ile Tyr Thr Pro Leu Ser Leu Met Tyr Asp Leu Asp Lys

100 105 110

Asn Asp Leu Arg Gly Leu Leu Gly Val Arg Glu His Asn Pro Met Tyr

115 120 125

Leu Met Pro Leu Trp Tyr Asn Asn Ser Pro Asn Tyr Ala Pro Gly Ser

130 135 140

Pro Thr Arg Gly Thr Thr Val Gln Glu Lys Phe Gly Gln Gln Lys Arg

145 150 155 160

Ala Glu Thr Lys Leu Gln Val Ser Phe Lys Ser Lys Ile Ala Glu Asp

165 170 175

Leu Phe Lys Thr Arg Ala Asp Leu Trp Phe Gly Tyr Thr Gln Arg Ser

180 185 190

Asp Trp Gln Ile Tyr Asn Gln Gly Arg Lys Ser Ala Pro Phe Arg Asn

195 200 205

Thr Asp Tyr Lys Pro Glu Ile Phe Leu Thr Gln Pro Val Lys Ala Asp

210 215 220

Leu Pro Phe Gly Gly Arg Leu Arg Met Leu Gly Ala Gly Phe Val His

225 230 235 240

Gln Ser Asn Gly Gln Ser Arg Pro Glu Ser Arg Ser Trp Asn Arg Ile

245 250 255

Tyr Ala Met Ala Gly Met Glu Trp Gly Lys Leu Thr Val Ile Pro Arg

260 265 270

Val Trp Val Arg Ala Phe Asp Gln Ser Gly Asp Lys Asn Asp Asn Pro

275 280 285

Asp Ile Ala Asp Tyr Met Gly Tyr Gly Asp Val Lys Leu Gln Tyr Arg

290 295 300

Leu Asn Asp Arg Gln Asn Val Tyr Ser Val Leu Arg Tyr Aan Pro Lys

305 310 315 320

Thr Gly Tyr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Tyr Thr Phe Pro Ile Lys Gly

325 330 335

Lys Leu Lys Gly Val Val Arg Gly Phe His Gly Tyr Gly Glu Ser Leu

340 345 350

Ile Asp Tyr Asn His Lys Gln Asn Gly Ile Gly Ile Gly Leu Met Phe

355 360 365

Asn Asp Leu Asp Gly Ile

370

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物序列

<400>5

ggtcgaccat atgaatatac ggaatatgcg cta 33

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物序列

<400>6

cgccgctcga ggatgccgtc caagtcgttg 30

<210>7

<211>373

<212>DNA

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌

<400>7

cgtaccgcat tccgcactgc agtgaaaaaa gtattgaaag cagtcgaagc aggcgataaa 60

gctgccgcac aagcggttta ccaagagtcc gtcaaagtca tcgaccgcat cgccgacaag 120

ggcgtgttcc ataaaaacaa agcgggctcgc cacaaaaccc gtttgtctc aaaagtaaaa 180

ccttggcttg atttttgcaa aacctgcaat ccggttttca tcgtcgattc cgaaaacccc 240

tgaagcccga cggtttcggg gttttctgta ttgcggggac aaaatcccga aatggcggaa 300

agggtgcggt tttttatccg aatccgctat aaaatgccgt ctgaaaacca atatgccgac 360

aatgggggtg gag 373

Claims

1.一种分离出的多肽，该多肽由与选自SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：4的氨基酸序列有至少85％的同一性的氨基酸序列组成。

2.如权利要求1所述的分离出的多肽，其氨基酸序列与选自SEQID NO：2，SEQ ID NO：4的氨基酸序列有至少95％的同一性。

3.如权利要求1所述的多肽，该多肽由选自SEQ ID NO：2，SEQID NO：4的氨基酸序列组成。

4.分离出的SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4的多肽。

5.如权利要求1所述多肽的免疫原性片段，其中该免疫原性片段的免疫原活性与SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4的多肽的基本相同。

6.一种分离出的多核苷酸，该多核苷酸由编码一种多肽的核苷酸序列组成，该多肽与SEQ ID NO：2，4的氨基酸序列分别就SEQ ID NO：2，4全长而言有至少85％的同一性；或者与该分离出的多核苷酸互补的核苷酸序列。

7.一种分离出的多核苷酸，该多核苷酸由一种核苷酸序列组成，该核苷酸序列与编码SEQ ID NO：2，4的多肽的核苷酸序列就全部编码区域而言有至少85％的同一性；或者与该分离出的多核苷酸互补的核苷酸序列。

8.一种分离出的多核苷酸，该多核苷酸由一种核苷酸序列组成，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1，3分别就SEQ ID NO：1，3全长而言有至少85％的同一性；或者与该分离出的多核苷酸互补的核苷酸序列。

9.如权利要求6到8中任一权利要求所述的分离出的多核苷酸，它与SEQ ID NO：1，3有至少95％的同一性。

10.一种分离出的多核苷酸，该多核苷酸由编码SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4的多肽的核苷酸序列组成。

11.一种分离出的多核苷酸，该多核苷酸由SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：3的多核苷酸组成。

12.一种分离出的多核苷酸，该多核苷酸由编码SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4的多肽的核苷酸序列组成，该多核苷酸序列是通过在严格杂交条件下，用具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3的序列或者其片段的标记探针筛选适当的文库得到的。

13.一种表达载体，该载体包含权利要求8的分离出的多核苷酸。

14.一种活的重组微生物，该微生物包含权利要求8的分离出的多核苷酸。

15.包含权利要求13的表达载体的宿主细胞，所述宿主表达分离出的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：4的氨基酸序列有至少85％的同一性。

16.包含权利要求13的表达载体的宿主细胞的亚细胞部分或者膜，所述亚细胞部分或者膜表述分离出的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4的氨基酸序列有至少85％的同一性。

17.一种生产多肽的方法，所述多肽包含的氨基酸序列与选自SEQID NO：2，SEQ ID NO：4的氨基酸序列有至少85％的同一性，该方法包括，在足够该多肽产生的条件下培养权利要求15的宿主细胞，以及从培养基中回收该多肽。

18.一种表达权利要求8的多核苷酸的方法，该方法包括，用包含至少一种该多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，以及在足够表达任一该多核苷酸的条件下培养该宿主细胞。

19.一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含有效量的权利要求1的多肽，以及药物可接受载体。

2O.一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含有效量的权利要求8的多核苷酸，以及药物有效性载体。

21.如权利要求19或20所述的疫苗组合物，其中该组合物包含至少一种其他的脑膜炎奈瑟氏球菌抗原。

22.一种对如权利要求1所述的多肽有免疫特异性的抗体。

23.一种对如权利要求5所述的免疫片段有免疫特异性的抗体。

24.一种诊断脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，包括鉴定出现在生物样品中的如权利要求1所述的多肽，或者对该多肽有免疫特异性的抗体，该样品来自怀疑具有这种感染的动物。

25.包含免疫有效量的如权利要求1所述多肽的组合物在制备用于在动物中产生针对脑膜炎奈瑟球菌感染的免疫反应的药物的用途。

26.包含免疫有效量的如权利要求6所述多核苷酸的组合物在制备用于在动物中产生针对脑膜炎奈瑟球菌感染的免疫反应的药物的用途。

27.一种用于治疗有脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的人的治疗组合物，该组合物包含至少一种抗权利要求1的抗体，以及合适的药物载体。