CN1294632A - 得自母牛分枝杆菌的组合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供存在于或得自于母牛分枝杆菌的组合物及其用于治疗、防止和检测包括传染病、免疫紊乱和癌症的病症的方法。提供增强对抗原的免疫应答的方法,包括给予母牛分枝杆菌培养物滤液、去脂质母牛分枝杆菌细胞、耗尽分枝菌酸的去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌细胞、以及耗尽分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌细胞。
Description
技术领域
本发明总体涉及存在于或可以得自母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)的组合物及其在治疗、预防和检测包括传染病、免疫失调和癌症的疾病中的用途。具体地说,本发明涉及用于治疗呼吸系统疾病和皮肤疾病的组合物和方法,所述呼吸系统疾病诸如分枝杆菌感染、哮喘、肉样瘤病和肺癌,而所述皮肤疾病诸如牛皮癣、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、斑形脱发和皮肤癌基底细胞癌、扁平细胞癌和黑素瘤。本发明还涉及用作非特异性免疫应答增强剂的化合物、和这类非特异性免疫应答增强剂在针对传染病的疫苗接种或免疫治疗中以及某些免疫失调和癌症治疗中作为佐剂的用途。
发明背景
结核病是一种由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染引起的慢性传染病。它是发展中国家的主要疾病,也是世界发达地区中日益严重的问题,每年约有8百万个新病例,死亡人数约3百万。尽管这种感染可能在相当长的时间内无症状,但这种疾病最主要的表现是肺部慢性炎症,导致发热和呼吸系统症状。如果不治疗,可以导致相当高的发病率和死亡。
尽管结核病一般可以用延长的抗生素疗法来控制,但这种治疗不足以防止该疾病的传播。受感染个体可能无症状,但在一段时间内是接触传染性的。另外,尽管该治疗方案的顺从性是关键性的,但患者的行为难以监视。某些患者不完成治疗过程,这可能导致无效治疗并产生抗药性分枝杆菌。
抑制结核病的传播需要有效的疫苗接种和该疾病的准确的早期诊断。目前,经皮下或皮内注射活细菌进行接种是诱导保护性免疫的最有效的方法。为此最常用的分枝杆菌是卡介苗(BCG),是牛分枝杆菌(M.bovis)的一种无毒菌株。然而,BCG的安全性和功效是争论之源,某些国家诸如美国,未让一般公众接种。通常采用皮肤测试达到诊断结核分枝杆菌感染,皮肤测试涉及皮内接触结核菌素PPD(纯化蛋白的衍生物)。抗原特异性T细胞应答导致注射后48-72小时在注射部位可测量的硬结,由此表明接触了分枝杆菌抗原。然而,灵敏性和特异性已经成为该试验的问题,接种BCG的个体不能区别于感染个体。
了解较少的已经用于经皮下或皮内注射免疫治疗结核以及麻风的分枝杆菌是母牛分枝杆菌,它在人类中是非致病性的。然而,与BCG相比,几乎没有关于母牛分枝杆菌的功效的信息,母牛分枝杆菌尚未广泛用以对一般公众接种。相信牛分枝杆菌BCG和母牛分枝杆菌含有被暴露于结核分枝杆菌感染的个体的免疫系统识别的抗原化合物。
几个专利和其它出版物公开了通过给予包括母牛分枝杆菌的分枝杆菌或某些分枝杆菌组分治疗各种疾病。美国专利4,716,038公开了通过给予分枝杆菌(包括母牛分枝杆菌),诊断、接种和治疗各种类型的自身免疫病,包括关节炎。美国专利4,724,144公开了包含得自母牛分枝杆菌的抗原物质的免疫治疗剂,用于治疗分枝杆菌病,尤其是结核和麻风,以及用作化学治疗的佐剂。国际专利公布WO 91/01751公开了应用来自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物质作为免疫预防剂,以延迟和/或防止AIDS的发病。国际专利公布WO 94/06466公开了应用得自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物质,治疗患有或未患有AIDS以及伴有或未伴有结核的HIV感染。
美国专利5,599,545公开了应用分枝杆菌,尤其是完整的失活母牛分枝杆菌作为佐剂,用于与非母牛分枝杆菌内源的抗原一起给予。该公开的理论是,作为佐剂的有益效应是由热激蛋白65(hsp 65)引起的。国际专利公开WO 92/08484公开了应用得自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物质,用于治疗眼色素层炎。国际专利公布WO 93/16727公开了应用得自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物质治疗与感染引发的自身免疫反应相关的精神病。国际专利公布WO 95/26742公开了应用得自母牛分枝杆菌的抗原和/或免疫调节物质延迟或防止肿瘤的生长或传播。国际专利申请WO 91/02542公开了应用高压灭菌的母牛分枝杆菌治疗慢性炎症病症,在所述炎症病症中,患者表现出异常高的IL-6和/或TNF释放,或其中所述患者的IgG显示异常高比例的去半乳糖IgG(agalactosyl IgG)。在该出版物中提及的病症中,有牛皮癣、类风湿性关节炎、分枝杆菌病、节段性回肠炎、原发性胆汁性肝硬化、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、Guillain-Barre综合征、原发性糖尿病和移植排斥的某些方面。
在已知的分枝杆菌菌种中,母牛分枝杆菌显然是独特的,因为热灭活制剂保留疫苗和免疫治疗特性。例如,用于抗结核接种的结核分枝杆菌BCG疫苗使用活菌株。热灭菌牛分枝杆菌BCG和结核分枝杆菌在用于疫苗中时没有保护性特性。已经从各种各样的分枝杆菌菌种中分离出许多具有佐剂特性的化合物。这类佐剂效应基本上是刺激针对来自另一菌种的抗原的特定的免疫应答机制。
已经从分枝杆菌菌种中分离出呈现佐剂特性的两大类化合物。第一类是水溶性蜡D组分(R.G.White,I.Bernstock,R.G.S.Johns和E.Lederer,Immunoloyg,1:54,1958;美国专利4,036,953)。第二类是如美国专利3,956,481和4,036,953中所述的胞壁酰二肽基物质(约等摩尔量的N-乙酰-葡糖胺和N-羟乙酰基胞壁酸(glycolymuramic acid)。这些化合物在其组成的以下方面不同于本发明的去脂质和去糖脂的母牛分枝杆菌(DD-M.vaccae):
1.它们是水溶性药物,而DD-母牛分枝杆菌在水溶液中是不溶性的。
2.它们包含多种或者用各种溶剂从细菌中提取出、或者用酶从细胞壁中消化的小的分枝杆菌细胞壁单位的寡聚物。相比之下,DD-母牛分枝杆菌含有高度聚合的细胞壁。
3.已经通过用蛋白水解酶从其制剂中消化去除所有的蛋白。其制剂中的仅有组分是细胞壁肽聚糖结构,即丙氨酸、谷氨酸、二氨基庚二酸、N-乙酰葡糖胺和N-羟乙酰基胞壁酸。相比之下,DD-母牛分枝杆菌含有50%(w/w)的蛋白,包括多种特有的蛋白种类。
疫苗经鼻气雾剂传递到达肺组织,或经口传递至胃肠道一般限于减毒的病毒株。例如,因为研制出萨宾疫苗,抗脊髓灰质炎病毒的接种已经使用经口传递减毒的该病毒毒株。美国的Aviron Incorporatedand the National Institute of Allergy and Infectious Diseases最近已经报道成功地应用在鼻喷雾剂中给予的流感疫苗。在这种情况下,活的减毒流感病毒株在幼童中提供抗流感的93%保护。经鼻气雾剂或经口传递,没有传递包含灭活病毒或细菌疫苗或包含重组蛋白的疫苗。对此有几个原因。几乎没有报道采用经鼻给予的这些药物导致T细胞免疫或抗原合成的成功的免疫。此外,蛋白和灭活生物的经口传递通常导致产生耐受性,这正是寻求成功免疫的相反的结果。
肉样瘤病是原因未知的疾病,其特征为肉芽种性炎症,影响机体的许多器官,尤其是肺、淋巴结和肝脏。肉芽肿由单核吞噬细胞与中心的上皮样细胞和巨细胞以及T淋巴细胞组成。CD4 T淋巴细胞与上皮样细胞紧密相连,而CD4和CD8 T淋巴细胞在周边积累。肉样瘤病中的特征性免疫异常包括外周血和支气管肺泡灌洗高球蛋白,和皮肤中对结核菌素以及诸如念珠菌属和流行性腮腺炎的其它抗原的“延迟型”过敏反应降低。外周血淋巴细胞数降低,并且外周血的CD4∶CD8之比降低至约1-1.5∶1。没有全身性免疫缺陷表现,而是引起“区域化”于疾病活动部位的免疫活性增强。在肺肉样瘤病的患者,经支气管肺泡灌洗回收的细胞总数增加5-10倍,淋巴细胞比例从正常低于10-14%增至15-50%。回收的90%以上的淋巴细胞是T淋巴细胞,CD4∶CD8之比据报道从正常对照的1.8∶1增至10.5∶1。T淋巴细胞主要是产生IFN-γ和IL-2细胞因子的Th1类,而不是Th2类。治疗后,肉样瘤肺中Th1淋巴细胞的增加得到矫正。
肉样瘤病在几乎所有病例中均涉及肺。甚至当主要在其它器官中见到病灶时,通常存在亚临床肺的累及。尽管某些肉样瘤病病例自发消散,但约50%的患者具有至少轻度的永久性器官机能障碍。在严重的病例中,发生肺纤维变性,并进展为需要肺移植的肺衰竭。肉样瘤病的主要支持治疗是皮质类固醇。对皮质类固醇最初应答的患者常常复发,需要用诸如氨甲喋呤或环孢菌素的其它免疫抑制药治疗。
哮喘是一种常见病,在发达世界高度流行。哮喘的特征为气管支气管树对多种刺激的应答增加,主要的生理紊乱是可逆性气流限制,这可以是自发的或与药物相关,并且病理标志是气道炎症。在临床上,哮喘可以再分为外因性和内因性变型。
外因性哮喘有一种可鉴别的沉淀物,可以被认为是变应性、职业性和药物诱导性的。变应性哮喘与Th2型免疫应答增强相关,产生特异性免疫球蛋白E(IgE),对共同的气源性变应原的皮肤测试阳性和/或具有特应性症状。根据症状的季节性它可以再分为季节性和常年性形式。在外因性哮喘中气流阻塞由气道炎症引起的非特异性支气管过敏性而致。这种炎症由包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞在内的多种炎性细胞释放的化学物质介导的。这些介质的作用导致血管通透性增加、粘液分泌和支气管平滑肌收缩。在变应性哮喘中,产生气道炎症的免疫应答由分泌IL-4、IL-5和IL-10的Th2类T细胞引起。已经表明,变应性哮喘肺的淋巴细胞在激活时产生IL-4和IL-5。IL-4和IL-5均是Th2类的细胞因子,并且是IgE产生和哮喘中嗜酸性粒细胞介入所需的。职业性哮喘可能与产生针对蛋白半抗原的IgE有关,所述蛋白半抗原诸如在塑料工作者中的酸酐和在某些北美乔柏诱导的哮喘中的大侧柏酸,或者可能与非IgE相关机制有关,诸如在甲苯二异氰酸酯诱导的哮喘。药物诱导的哮喘可以在给予阿斯匹林或其它非类固醇抗炎药后见到,最常在某些亚群的可能表现出诸如鼻息肉病和鼻窦炎的其它特性的患者中见到。内因性或起因不明性哮喘据报道在上呼吸道感染后产生,但可以在中年人或老年人中从新发生,在这些人中这比外源性哮喘更难治疗。
理想的是通过避免触发变应原而预防哮喘,但这不总是可能的,触发免疫原也不总是容易鉴定出。哮喘的医学治疗基于应用皮质类固醇和支气管扩张药,以减少炎症和逆转气道阻塞。在慢性哮喘中,用皮质类固醇治疗导致不可接受的负面副作用。
具有与哮喘类似免疫异常的另一种病症是过敏性鼻炎。过敏性鼻炎是一种常见的病症,估计影响至少10%的人口。过敏性鼻炎可能是对花粉过敏季节性引起的(花粉病)。非季节性或常年性的鼻炎由对诸如室内尘螨或动物皮屑的抗原过敏引起的。
过敏性鼻炎中的异常免疫应答的特征为过量产生对所述免疫原特异性的IgE抗体。炎性反应发生在鼻粘膜,而不是如哮喘中进一步下到气道。同哮喘一样,受影响组织中的局部嗜酸性粒细胞是过敏性鼻炎的主要特征。该炎症的结果是,患者打喷嚏、流鼻涕和充血。在某些更严重的病例中,炎症扩展至眼睛(结膜炎)、腭和外耳。尽管过敏性鼻炎不危及生命,但它非常影响劳动能力,妨碍正常的活动,并干扰人的工作能力。目前的治疗涉及应用抗组胺、鼻减充血剂,以及同哮喘一样应用色甘酸钠和皮质类固醇。
肺癌是主要的癌症死因。肺癌的发生率持续上升,世界卫生组织估计,到公元2000年,每年将有两百万新病例。肺癌可以大致分为两类:代表所有肺癌的20-25%的小细胞肺癌(SCLC)和占其余75%的非小细胞肺癌(NSCLC)。大多数SCLC因吸烟引起。SCLC往往早期蔓延,90%的患者在诊断时累及胸部纵隔的淋巴结。SCLC用化学疗法治疗,或用化学疗法和放射疗法联合治疗。完全反应率10%至50%。对于没有累及淋巴结的极少数患者,手术后进行化学治疗可使治愈率超过60%。NSCLC的预后更令人沮丧,因为大多数患者诊断时已进入晚期。手术去除肿瘤在非常少数的患者中是可能的,NSCLC的5年存活率仅有5-10%。
导致发生肺癌的因素是复杂多样的。环境因素和遗传因素相互作用,引起连续增加的异常,导致不受控制的细胞增生、相邻组织的侵入和向远处传播。
已经表明,肺癌患者中细胞介导的免疫和体液免疫均受损。放疗和化疗进一步损害患者的免疫功能。已经尝试用灭活的肿瘤细胞或肿瘤抗原给患者免疫,以增强宿主抗肿瘤反应。已经在肺癌手术后将卡介苗(BCG)给入胸腔,以增强非特异性免疫。已经尝试通过给予患者用白介素-2离体处理的淋巴细胞来增强抗肿瘤免疫。这些淋巴因子活化的淋巴细胞获得了杀伤肿瘤细胞的能力。目前对肺癌的免疫治疗仍处于发展阶段,其用于肺癌标准治疗的效力尚未确立。
一方面,对于看来与影响称为Th1和Th2的胸腺来源(T)的免疫细胞平衡的因子有关的皮肤病症,本发明进行了治疗。这些T细胞由其细胞因子分泌表型而鉴定。治疗的共同特征是应用由母牛分枝杆菌制备的化合物,它们具有改变这些T细胞以及其它免疫细胞活性平衡的免疫调节特性。
牛皮癣是常见的慢性炎性皮肤病,在少数患者中可能伴随各种形式的关节炎。牛皮癣的缺陷看来是角质细胞过度快速生长,并且从皮肤表面脱落鳞屑。药物治疗的目标在于减慢该过程。这种疾病在任何年龄均可以出现。自发性缓解相对少见,通常必需终身治疗。牛皮癣皮肤表面上产生慢性鳞屑红斑。牛皮癣是非常显眼的疾病,通常影响面部、头皮、躯干和四肢。这种疾病在情绪上和机体上使患者衰弱,显著降低生活质量。在美国,一百万至三百万个体患有牛皮癣,每年出现近二十五万新病例。在美国,目前牛皮癣医护费用的保守估计为一年S248,000,000。
关于牛皮癣的发病机理有两种主要的假说。第一种假说是,遗传因素决定表皮角质细胞的异常增生。所述细胞不再对诸如参与维持表皮内环境稳定的外部刺激正常反应。细胞膜细胞因子受体的异常表达或异常的跨膜信号转导可能是细胞过度增生的基础。从过度增生的角质细胞释放促炎分子后继发与牛皮癣相关的炎症。
第二种假说是,在皮肤中与呈递抗原细胞相互作用的T细胞释放促炎的刺激角质细胞的细胞因子(Hancock,G.E.等,J.Exp.Med.168:1395-1402,1988)。仅有遗传上预定的个体的T细胞具有在这类环境下被激活的能力。所述角质细胞本身可以是呈递抗原细胞。牛皮癣病灶中的细胞浸润物表现出CD4+T细胞流入,更突出的是CD8+T细胞流入(Bos,J.D等,Arch.Dermatol.Res.281:23-3,1989;Baker,B.S.,Br.J.Bermatol.110:555-564,1984)。
因为大多数(90%)牛皮癣患者具有有限形式的病征,所以可以使用包括1,8,9-蒽三酚、焦油制剂、皮质类固醇和最近引入的维生素D3类似物(钙泊三醇、骨化三醇)的局部治疗。少数(10%)牛皮癣患者有更严重的病症,对此可利用许多系统治疗方式。具体的系统治疗包括UVB、PUVA、氨甲喋呤、维生素A衍生物(阿西曲丁)和诸如环孢菌素A的免疫抑制药。环孢菌素和FK-506对于治疗牛皮癣的效力为作为该疾病主因的T细胞假说提供了支持(Bos,J.D.等,Lancet Ⅱ:1500-1502,1989;Ackerman,C.等,J.Invest.Dermatol.96:536[摘要],1991)。
特应性皮炎是一种慢性瘙痒性炎性皮肤病,通常发生在有各种变应性病症(诸如过敏性鼻炎和哮喘)遗传素因的家族中。特应性皮炎发生在约10%的总人口中。主要症状是皮肤干燥、皮炎(湿疹),主要局限于面部、颈部和屈肌侧以及肢体折叠处,伴随着严重的瘙痒。它常规发生在生命的前两年内。在约90%的患者中,这种皮肤病在童年期消失,但症状可能持续到成年。这是世界范围内最常见的皮炎形式之一。人们普遍认为,在特应性和特应性皮炎中,T细胞异常是原发性的,并且正常调节IgE产生的T细胞功能异常是过量产生该免疫球蛋白的主要原因。
变应性接触性皮炎是一种常见的非传染性炎性皮肤病。在接触性皮炎中,只有机体被特定抗原致敏后,才产生免疫反应。随后皮肤暴露于该抗原并且T细胞识别这些抗原,导致各种细胞因子释放、T细胞增生和募集,最后导致皮炎(湿疹)。
变应性接触性皮炎病灶中仅小部分T细胞对相关抗原是特异性。活化的T细胞可能迁移至炎症部位,而与抗原特异性无关。仅有共享MHC Ⅱ类抗原的T细胞(CD4+细胞)能够转移延迟型过敏反应。对接触性变应原的“反应”可以由共享或者MHC Ⅰ类分子(CD8+细胞)或者Ⅱ类(CD4+细胞)分子的T细胞转移(Sunday,M.E.等,J.Immunol.125:1601-1605,1980)。角质细胞可以产生白介素-1,白介素-1可以促进抗原呈递至T细胞。在角质细胞和内皮上,由细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素-γ(IFN-γ)诱导表面抗原细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达。
如果可以鉴定所述原因,单独去除病因将治愈变应性接触性皮炎。在活动性炎症期间,局部皮质类固醇是有用的。在延迟型过敏反应中,观察到环孢菌素对体外已接触抗原的T细胞促炎功能的抑制效应(Shidani,B.等,Eur.J.Immunol.14:314-318,1984)。也已经报道了环mmunol.(Inst.Pasteur)135d:237-245,1984)。
斑形脱发是一种常见的毛发疾病,占美国皮肤科门诊病人临床咨询的2%。该疾病的特征是形成界限分明的圆形或椭圆形的无瘢痕形成脱发斑,脱发斑可能位于机体的任何毛发区内。该疾病可以发生在任何年龄。发病通常是突然的,临床进程是变化的。
现在,将斑形脱发的所有或实际上任何病例归因于单一原因是不可能的(Rook,A.和Dawber,R,Diseases of the Hair and Scalp;BlackwellScientific Publications 1982:272-30)。看来涉及许多因素。这些因素包括遗传因素、特应性、伴随怀疑自身免疫病因的疾病、Down综合征和情绪压力。斑形脱发患者中特应性占优势不断得到支持。有证据表明,斑形脱发是一种自身免疫病。该证据基于以下的一致的组织病理学发现:淋巴T细胞浸润到毛囊中或其周围,朗氏细胞数目增加;该证据也基于以下的观察:斑形脱发将对用免疫调节剂的治疗反应,并且在斑形脱发和各种各样的自身免疫病之间有统计学意义的相关性(Mitchell,A.J.等,J.Am.Acad.Dermatol.11:763-775,1984)。
对头皮活检样本的免疫表型研究显示:HLA-DR在斑形脱发活动性病灶的预定皮层和毛囊的表皮细胞上表达,以及具有高比例的辅助/诱导T细胞的T细胞浸润到毛囊中及其周围、朗氏细胞数增加和ICAM-1表达(Messenger,A.G.等,J.Invest.Dermatol.85:569-576,1985;Gupta,A.K.等,J.Am.Acad.Dermatol.22:242-250,1990)。
各种各样的斑形脱发治疗方式可以分为四类:(ⅰ)非特异性局部刺激物;(ⅱ)“免疫调节物”,诸如系统皮质类固醇和PUVA;(ⅲ)“免疫增强物”,诸如接触性皮炎诱导物、环孢菌素和异丙肌苷;和(ⅳ)作用未知的药物,诸如米诺地尔(Dawber,R.P.P.等,Textbook ofDermatology,Blackwell Scientific Publications,第5版,1982:2533-2638)。诸如1,8,9-蒽三酚的非特异性局部刺激物可以通过尚未鉴定的机制起作用,而不是诱发毛发再生长的局部刺激作用。局部皮质类固醇可能有效,但通常必需延长的治疗。已经证明病灶内类固醇更有效,但其应用局限于活动性较低的疾病的界限确定的斑,或在全部脱发中维持眉毛的再生长。可能通过改变功能性亚群的T细胞,已经证明光化学治疗是有效的。借助在头皮上诱导和维持变应性接触性皮炎的局部免疫治疗,可能使多达70%斑形脱发患者的毛发再生长。diphencyprone是无诱变活性的有效致敏剂。口服环孢菌素在短期内可能有效(Gupta,A.K.等,J.Am.Acad.Dermatol.22:242-250,1990)。已经使用了一种免疫刺激剂异丙肌苷,在开放性试验(open trial)中明显有效。已经报道局部施用的5%米诺地尔溶液能够在斑形脱发患者中诱导一定的毛发生长。其作用机制不明。
皮肤癌因其频率和它们引起的劳动能力丧失和毁形是一个主要的大众健康问题。皮肤癌主要见于在生命初期暴露于大量日光的个体中,尤其是大量脱皮的个体。每年治疗的费用和工作时间的损失仅在美国一年就超过$250,000,000。基底细胞癌、扁平细胞癌和黑素瘤这三种主要类型明显与日光暴露有关。
基底细胞癌是皮肤上皮肿瘤。它们主要出现在暴露的皮肤区。在最近的澳大利亚的研究中,基底细胞癌的发生率是每年每100,000人口653个新病例。这与160例扁平细胞癌或19例恶性素瘤形成对比(Giles,G.等,Br.Med.J.296:13-17,1988)。基底细胞癌是所有癌症中最常见的。通常手术去除病灶。变替治疗包括维甲酸类、5-氟尿嘧啶、冻干疗法和放射疗法。也已经表明α或γ干扰素在治疗基底细胞癌方面有效,为不适于手术或设法避免手术瘢痕的患者提供了一个有价值的替代方法(Cornell等J.Am.Acad.Dermatol.23:694-700,1990;Edwards,L.等,J.Am.Acad.Dermatol.22:496-500,1990)。
扁平细胞癌(SCC)是其次的最常见的皮肤癌,其频率日益增加。与多种潜在因素有关的晚期病例和转移病例数正在增加。目前,转移性SCC在美国导致每年超过2000人死亡;5年存活率为35%,3年时出现90%转移。转移总是发生在第一个淋巴流出站。显然晚期病例需要药物治疗。原发性皮肤SCC的成功的药物疗法应该消除潜在形成瘢痕和其它副作用的手术去除的需要。这种疗法的开发对于面部病灶尤其需要。
干扰素(IFN)因其体外的抗增生效应和免疫调节效应,也已经用于治疗黑素瘤(Kirkwood,J.M.等,J.Invest.Dermatol.95:180S-4S,1990)。用或者高剂量或者低剂量的系统IFN-α在转移性黑素瘤中获得的反应率范围为5-30%。最近,用IFN-α和DTIC组合获得了令人鼓舞的结果(30%反应)。初步观察显示出在高危黑素瘤患者中IFN-α在佐剂背景中的有益效应。尽管IFN单一疗法在转移性疾病中的效力低,但现在正在用IFN作为佐剂或结合化学疗法进行几项随机化前展性研究(McLeod,G.R.等,J.Invest.Dermatol.95:185S-7S,1990;Ho,V.C.等,J.Invest.Deramtol.22:159-76,1990)。
在所有可利用的治疗皮肤病毒性损伤的疗法中,仅干扰素由于再生机体对感染的免疫应答而具有特异性的抗病毒作用模式。然而,干扰素治疗不能根除所述病毒,尽管它在干扰某些感染表现方面有帮助。干扰素治疗还伴有系统副作用,需要多次注射到每个单个疣中,并具有相当大的经济费用(Kraus,S.J.等,Review of Infectious Diseases2(6):S620-S632,1990;Frazer,I.H.,Current Opinion in Immunology8(4):484-491,1996)。
发明概述
简而言之,本发明提供存在于或得自母牛分枝杆菌的组合物及其在预防、治疗和诊断疾病方面的使用方法,所述疾病包括分枝杆菌感染、呼吸系统免疫病和皮肤病。本方法包括给予具有抗原特性和/或佐剂特性的组合物。可以用本发明组合物治疗的呼吸系统疾病包括分枝杆菌感染(诸如感染结核分枝杆菌和/或鸟分枝杆菌)、哮喘、肉样瘤病和肺癌。可以用本发明组合物治疗的皮肤病包括牛皮癣、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、斑形脱发和皮肤癌基底细胞癌、扁平细胞癌和黑素瘤。也提供用于传染病和癌症的疫苗或免疫疗法的佐剂。
第一方面,提供分离的得自母牛分枝杆菌的多肽,包括抗原的免疫原性部分或这种抗原的变异体。在具体的实施方案中,所述抗原包括选自以下的氨基酸序列:(a)在以下SEQ ID NO中所述的序列:143、145、147、152、154、156、158、160、162、165、166、170、172、174、177、178、181、182、184、186、187、192、194、196、197、199、201、203、205和207;(b)与以下SEQ ID NO中所述序列具有至少约50%相同残基的序列:143、145、147、152、154、156、158、160、162、165、166、170、172、174、177、178、181、182、184、186、187、192、194、196、197、199、201、203、205和207;(c)与以下SEQ ID NO中所述序列具有至少约75%相同残基的序列:143、145、147、152、154、156、158、160、162、165、166、170、172、174、177、178、181、182、184、186、187、192、194、196、197、199、201、203、205和207;和(d)与以下SEQ ID NO中所述序列具有至少约95%相同残基的序列:143、145、147、152、154、156、158、160、162、165、166、170、172、174、177、178、181、182、184、186、187、192、194、196、197、199、201、203、205和207,采用如下所述的计算机算法BLASTP产生的序列对比来进行测量。
也提供编码本发明多肽的DNA序列、包含这些DNA序列的表达载体、以及用这类表达载体转化或转染的宿主细胞。另一方面,本发明提供包含至少一种本发明多肽的融合蛋白。
在其它方面,本发明提供药用组合物,所述药用组合物包含至少一种本发明多肽、或编码这样一种多肽的DNA分子和生理上可接受的载体。本发明也提供包含至少一种上述多肽或至少一种编码这类多肽的DNA序列和非特异性免疫应答增强剂。在某些实施方案中,所述非特异性免疫应答增强剂选自:去脂质和去糖脂的母牛分枝杆菌;失活的母牛分枝杆菌细胞;去脂质和去糖脂的耗尽分枝菌酸的母牛分枝杆菌细胞;去脂质和去糖脂的耗尽分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的母牛分枝杆菌;和母牛分枝杆菌培养物滤液。
再一方面,提供用于增强患者免疫应答的方法,包括给予患者有效量的一种或多种上述药用组合物和/或疫苗。在一个实施方案中,所述免疫应答是Th1应答。在本发明的其它方面,提供治疗患者病症的方法,包括给予所述患者本发明的药用组合物或疫苗。在某些实施方案中,所述病症选自免疫病、传染病、皮肤病和呼吸系统疾病。这类疾病的实例包括分枝杆菌感染、哮喘和牛皮癣。
在其它方面,本发明提供治疗免疫病、传染病、皮肤病或呼吸系统疾病的方法,包括给予包含失活母牛分枝杆菌细胞、去脂质和去糖脂的母牛分枝杆菌细胞或母牛分枝杆菌培养物滤液的组合物。
也提供增强对抗原免疫应答的方法。在一个实施方案中,这类方法包括给予包含母牛分枝杆菌抗原包括SEQ ID NO:89或201或其变异体的免疫原性部分的多肽。在再一实施方案中,这类方法包括给予包含选自以下一种组分的组合物:去脂质和去糖脂的耗尽分枝菌酸的母牛分枝杆菌细胞、以及去脂质和去糖脂的耗尽分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的母牛分枝杆菌细胞。
在本发明的其它方面,提供检测患者分枝杆菌感染的方法和诊断试剂盒。在第一个实施方案中,该方法包括使患者的皮肤细胞与一种或多种上述多肽接触,并检测对所述患者皮肤的免疫应答。在第二个实施方案中,该方法包括使生物样品与至少一种上述多肽接触;并检测样品中结合于所述多肽的抗体的存在,由此检测该生物样品中结核分枝杆菌感染。合适的生物样品包括全血、痰、血清、血浆、唾液、脑脊髓液和尿。
提供诊断试剂盒,所述试剂盒包括一种或多种上述多肽与足以使所述多肽与患者皮肤细胞接触的装置。本发明也提供包含一种或多种本发明多肽和检测试剂的诊断试剂盒。
再一方面,本发明提供与上述多肽结合的多克隆抗体和单克隆抗体、及其在检测分枝杆菌感染中的用法。
参考以下详细描述和附图,本发明的这些方面和其它方面将是显而易见的。本文公开的所有参考文献如同每个参考文献单独引入结合一样,通过整体引用结合到本文中。
附图简述
图1A和1B描述了在用活结核分枝杆菌H37Rv感染之前,分别用高压灭菌的母牛分枝杆菌或未分级分离的母牛分枝杆菌培养物滤液免疫小鼠的保护性效应。
图2A和2B显示了与对照小鼠相比,在用卵清蛋白攻击前4周,分别用或者10μg或1000μg热灭活母牛分枝杆菌、或者200-100μgDD-母牛分枝杆菌鼻内免疫小鼠中嗜酸性粒细胞的百分比。图2C和2D显示了在迟至用卵清蛋白攻击前1周,分别用或者100μg热灭活母牛分枝杆菌或200μg DD-母牛分枝杆菌鼻内免疫小鼠中嗜酸性粒细胞的百分比。图2E显示了在用卵清蛋白攻击前,用或者巴斯德菌株的BCG(BCG-P)、Connought菌株的BCG(BCG-C)、1mg热灭活母牛分枝杆菌或200μg DD-母牛分枝杆菌或者鼻内(i.n.)或者皮下(s.c.)免疫小鼠中嗜酸性粒细胞的百分比。
图3A说明了在感染结核之前,用热灭活母牛分枝杆菌或去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌(DD-母牛分枝杆菌)免疫小鼠的效应。图3B说明了在感染结核之前,用热灭活母牛分枝杆菌、重组母牛分枝杆菌蛋白、或热灭活母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌重组蛋白联合免疫小鼠的效应。
图4说明了用高压灭菌的母牛分枝杆菌、冻干的母牛分枝杆菌、去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌糖脂对IL-12的诱导。
图5比较了不同浓度的热灭活(高压灭菌)母牛分枝杆菌、去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌糖脂对重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠的脾细胞中干扰素-γ生产的体外刺激。
图6A、6B和6C说明了在C57BL/6小鼠(图6A)、BALB/C小鼠(图6B)或C3H/HeJ小鼠(图6C)的腹膜巨噬细胞中,不同浓度的母牛分枝杆菌重组蛋白、热灭活母牛分枝杆菌、去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌(在该图中称为“去脂质母牛分枝杆菌”)、母牛分枝杆菌糖脂和脂多糖对干扰素-γ生产的刺激。
图7A(ⅰ)-(ⅳ)说明了10μg、100μg和1mg高压灭菌母牛分枝杆菌和75μg未分级分离的母牛分枝杆菌培养物滤液分别的非特异性免疫扩增效应。图7B(ⅰ)和(ⅱ)说明了高压灭菌母牛分枝杆菌和去脂质及去糖脂母牛分枝杆菌分别的非特异性免疫扩增效应。图7C(ⅰ)说明了完整的高压灭菌母牛分枝杆菌的非特异性免疫扩增效应。图7C(ⅱ)说明了用SDS从去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌提取的可溶性母牛分枝杆菌蛋白的非特异性免疫扩增效应。图7C(ⅲ)说明了用蛋白水解酶链霉蛋白酶处理破坏的图7C(ⅱ)制剂的非特异性免疫扩增效应。图7D说明了热灭活母牛分枝杆菌(图7D(ⅰ))的非特异性免疫扩增效应,而用结核分枝杆菌(图7D(ⅱ))、牛分枝杆菌BCG(图7D(ⅲ))、草分枝杆菌(M.phlei)(图7D(ⅳ))和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(图7D(ⅴ))的热灭活制剂没有观察到非特异性的免疫扩增效应。
图8A和8B说明了分别用母牛分枝杆菌蛋白GV23、Th1诱导型佐剂MPL/TDM/CWS和CpG ODN、和Th2诱导型佐剂氢氧化铝和霍乱毒素对αβT细胞、γδT细胞和NK细胞上CD69表达的刺激。
图9A-D说明了热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌重组蛋白分别对人PBMC产生IL-1β、TNF-α、IL-12和IFN-γ的效应。
图10-C说明了不同浓度重组母牛分枝杆菌蛋白GV-23和GV-45对人PBMC分别产生IL-1β、TNF-α和IL-12的效应。
图11A-D说明了用母牛分枝杆菌蛋白GV23、Th1诱导型佐剂MPL/TDM/CWS和CpG ODN、和Th2诱导型佐剂氢氧化铝和霍乱毒素对人PBMC分别产生IL-1β、TNF-α、IL-12和IFN-γ的刺激。
图12A-C说明了不同浓度的重组母牛分枝杆菌蛋白GV-23和GV-45对树突细胞分别表达CD40、CD80和CD86的效应。
图13说明了重组母牛分枝杆菌蛋白GV-23对树突细胞混合白细胞反应的增强。
发明详述
如上所述,本发明一般涉及用于预防、治疗和诊断传染病和免疫失调的组合物和方法。可以用本发明组合物有效治疗的病症包括呼吸系统疾病,诸如分枝杆菌感染、哮喘、肉样瘤病和肺癌;皮肤病,诸如牛皮癣、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、斑形脱发和皮肤癌基底细胞癌、扁平细胞癌和黑素瘤。
提供抵抗传染性微生物的保护的有效疫苗含有至少两种功能不同的组分。第一种组分是抗原,其性质上可以是多肽或糖类,它可以被巨噬细胞和其它呈递抗原细胞加工,并呈递给CD4+T细胞或CD8+T细胞。这种抗原形成免疫应答的“特定的”靶。第二种疫苗组分是一种非特异性免疫应答增强剂,称为佐剂,将其与所述抗原混合,或将其掺入抗原中。佐剂增强对结构上不相关的化合物或多肽的或者细胞介导的免疫应答,或者抗体免疫应答。几种已知的佐剂由诸如百日咳博得特氏菌(Bordetella pertussis)、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG的微生物制备。佐剂也可以含有设计用以保护多肽抗原免遭降解的组分,诸如氢氧化铝或矿物油。尽管疫苗的所述抗原组分含有指导针对特定病原体诸如结核分枝杆菌的免疫攻击的多肽,所述佐剂通常能够广泛用于不同的疫苗制剂中。某些已知的蛋白,诸如细菌肠毒素,既可以作为诱发特异性免疫应答的抗原也可以作为增强对不相关蛋白的免疫应答的佐剂而起作用。
称为细胞介导免疫的CD4+T细胞和CD8+T细胞导向的免疫攻击,有效地防范某些病原体诸如结核分枝杆菌以及某些癌症。其它病原体诸如脊髓灰质炎病毒也需要B细胞产生的抗体来防范。不同亚群的CD4+T细胞,通常称为Th1或Th2细胞,控制这些不同类别的免疫攻击(T细胞或B细胞)。佐剂的理想特性是能够选择性增强或者Th1或者Th2群体CD4+T细胞的功能。许多皮肤病包括牛皮癣、特应性皮炎、脱发和皮肤癌,看来受这些Th细胞亚群活性差异的影响。
这两种类型的Th细胞亚群已经在鼠模型中很好地特征鉴定,并根据它们激活时释放的细胞因子来定义。Th1亚群分泌IL-2、IFN-γ和肿瘤坏死因子,介导巨噬细胞激活和延迟型过敏反应。Th2亚群释放IL-4、IL-5、IL-6和IL-10,刺激B细胞激活。Th1和Th2亚群互相抑制,因此IL-4抑制Th1型应答,而IFN-γ抑制Th2型应答。已经在人类中发现相似的Th1和Th2亚群,释放在鼠模型中观察到的相同的细胞因子。具体地说,得自特应性人淋巴细胞的大多数T细胞克隆类似产生IL-4的鼠Th2细胞,而非常少数的克隆产生1FN-γ。因此,Th2亚群选择性表达、随后IL-4产生而IFN-γ产生细胞的水平降低,可能导致优先增加IgE的产生。对于包括诸如肺结核、肉样瘤病、哮喘、过敏性鼻炎和肺癌的呼吸系统疾病在内的许多病症中疾病状态的逆转,Th1型免疫应答的增强是重要的。
失活的母牛分枝杆菌和得自母牛分枝杆菌的许多化合物具有抗原特性和用以增强Th1型免疫应答的佐剂特性。本发明的方法使用得自母牛分枝杆菌的一种或多种这样的抗原和佐剂化合物和/或其培养物滤液,以再引导患者T细胞的免疫活性。这类化合物的混合物在本文公开的方法中特别有效。尽管众所周知,所有分枝杆菌均含有许多交叉反应抗原,但不知它们是否含有共同的佐剂化合物。如下所示,已经发现失活的母牛分枝杆菌和修饰(去脂质和去糖脂)形式的失活母牛分枝杆菌具有多种其它分枝杆菌菌种不享有的Th1型佐剂特性。此外,已经发现,母牛分枝杆菌在其自身的培养物滤液中,产生增强对同样发现于培养物滤液中的母牛分枝杆菌抗原以及对其它来源抗原的免疫应答的化合物。
一方面,本发明提供用于免疫治疗患者的呼吸系统和/或肺部病症的方法,以增强Th1型免疫应答,所述病症包括肺结核、肉样瘤病、哮喘、过敏性鼻炎和肺癌。在一个实施方案中,将所述组合物直接传递至导入和/或在肺中的气道粘膜表面。然而,所述组合物也可以通过皮内或皮下途径给予。可以有用地用于这类方法中的组合物包括至少一种以下组分:失活母牛分枝杆菌细胞;母牛分枝杆菌培养物滤液、去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌细胞(DD-母牛分枝杆菌);和存在于或得自母牛分枝杆菌和/或其培养物滤液中的化合物。如下所述,这类组合物的给予,导致特异性T细胞免疫应答并导致抵抗结核分枝杆菌感染的保护增强,在治疗哮喘方面也有效。尽管尚不知这些组合物在诸如哮喘的疾病治疗中准确的作用模式,但认为它们抑制哮喘诱导的Th2免疫应答。
本文所用的术语“呼吸系统”是指肺、鼻通道、气管和支气管通道。
本文所用的术语“导至肺或位于肺中的气道”包括鼻通道、口、扁桃体组织、气管和支气管通道。
本文所用的“患者”是指任何温血动物,最好是人类。这种患者可以是患病的,或可以无可检测的疾病。换句话说,本发明方法可以用以诱导保护性免疫以预防或治疗疾病。
另一方面,本发明提供免疫治疗患者皮肤病包括牛皮癣、特应性皮炎、脱发和皮肤癌的方法,其中免疫治疗剂用来通过改变T细胞功能为Th1型免疫应答而改变或再引导免疫活性的现有状态。可以有用地用于本发明方法的组合物包括至少一种以下组分:失活母牛分枝杆菌细胞;母牛分枝杆菌培养物滤液、修饰的母牛分枝杆菌细胞;和存在于或得自母牛分枝杆菌和/或其培养物滤液中的组分和化合物。如下详述,已经表明,多次给予这类组合物,最好是经皮内注射给予,在治疗牛皮癣中高度有效。
本文所用的术语“失活母牛分枝杆菌”是指或者如以下实施例7详述利用热灭活、或者经过诸如2.5兆拉德剂量的60钴的辐射灭活的母牛分枝杆菌。本文所用的术语“修饰的母牛分枝杆菌”包括去脂质母牛分枝杆菌细胞、去糖脂母牛分枝杆菌细胞和已经去脂质和去糖脂的母牛分枝杆菌细胞(DD-母牛分枝杆菌)。
DD-母牛分枝杆菌的制备及其化学组成在以下实施例7中描述。如下详述,本发明人已经表明,从母牛分枝杆菌去除糖脂组分导致去除刺激在天然杀伤(NK)细胞中产生干扰素-γ的分子组分,由此显著减少具有许多有害副作用的细胞因子的非特异性产生。
又一方面,本发明提供分离的多肽,它包含母牛分枝杆菌抗原的至少一个免疫原性部分、或其变异体、或母牛分枝杆菌蛋白的至少一个佐剂部分。在具体的实施方案中,这类多肽包括抗原的免疫原性部分或其变异体,其中所述抗原包括选自以下的序列:SEQ ID NO:1-4、9-16、18-21、23、25、26、28、29、44、45、47、52-55、63、64、70、75、89、94、98、100-105、109、110、112、121、124、125、134、135、140、141、143、145、147、152、154、156、158、160、165、166、170、172、174、177、178、181、182、184、186、187、192、194、201、203、205和207。
本文所用的术语“多肽”包括任何长度的氨基酸链,包括全长蛋白(即抗原),其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。因此,包含一种上述抗原的一个免疫原性部分的多肽可以全部由所述免疫原性部分组成,或可以含有额外的序列。所述额外的序列可以得自天然母牛分枝杆菌抗原,或可以是异源抗原,这类序列可以(但不必)具免疫原性。如下详述,本发明的多肽可以分离自母牛分枝杆菌细胞或培养物滤液,或可以通过合成或重组方法制备。
本文所用的“免疫原性的”是指能够在患者诸如人类中、或在生物样品中诱发免疫应答。具体地说,免疫原性抗原能够在生物样品中刺激细胞增生、白介素-12的产生或干扰素-γ的产生,所述生物样品包括一种或多种选自以下的细胞:T细胞、NK细胞、B细胞和巨噬细胞,其中所述细胞得自结核分枝杆菌免疫个体。暴露于免疫原性抗原一般导致产生免疫记忆,因此在再暴露于该抗原时,发生增强的和更快速的应答。
本文所述抗原的免疫原性部分可以采用熟知的技术制备和鉴定,所述技术诸如概述于Paul,Fundamental Immunology,第3版,RavenPress,1993,第243-247页。这类技术包括筛选所述天然抗原或蛋白的免疫原性特性的多肽部分。在这些筛选中,可以采用本文所述的典型增殖和细胞因子产生测定。抗原的免疫原性部分是在这种代表性测定中产生大致类似于全长抗原产生的免疫应答(例如细胞增生、干扰素-γ的产生或白介素-12的产生)的部分。换句话说,抗原的免疫原性部分可以在本文所述的典型增生测定中产生至少约20%、最好约65%、最优选约100%所述全长抗原诱导的增生。在本文所述的典型测定中,免疫原性部分也可以刺激、或者替代产生至少约20%、优选至少约65%、最优选约100%的由所述全长抗原诱导的干扰素-γ和/或白介素-12。
母牛分枝杆菌佐剂是发现于母牛分枝杆菌细胞或母牛分枝杆菌培养物滤液中的、非特异性刺激免疫应答的化合物。佐剂增强对免疫原性抗原的免疫应答和记忆形成过程。在母牛分枝杆菌蛋白的情况下,这些记忆应答促进Th1型免疫。佐剂还能够在生物样品中刺激白介素-12或干扰素-γ产生,所述生物样品包含一种或多种选自以下的细胞:T细胞、NK细胞、B细胞和巨噬细胞,所述细胞得自健康个体。佐剂也可以刺激或不刺激细胞增生。这类母牛分枝杆菌佐剂包括例如包含SEQ ID NO:89、117、160、162或201中所述序列的多肽。
本文所述术语“多核苷酸”是指单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基聚合物,包括DNA和相应的RNA分子,包括HnRNA和mRNA分子,包括有义链和反义链,也包括comprehends cDNA、基因组DNA和重组DNA以及全合成或部分合成的多核苷酸。HnRNA分子含有内含子,一般以一对一的方式对应于DNA分子。mRNA分子对应于已经去除内含子的HnRNA和DNA分子。多核苷酸可以包含完整的基因或其任何部分。可操作的反义多核苷酸可以包括所述相应多核苷酸的片段,因此“多核苷酸”的定义包括所有这类可操作的反义片段。
本发明的组合物和方法也包括上述多肽和多核苷酸的变异体。本文所用的术语“变异体”包括与本发明序列有至少约40%、更优选至少约60%、再更优选至少约75%、最优选至少约90%相同残基(或者核苷酸或者氨基酸)的任何序列。通过将待比较的两个序列进行序列对比,测定序列对比部分中相同残基数,将该数除以本发明序列或所查询序列的总长度残基数,再将结果乘以100,确定相同残基的百分比。
可以对多核苷酸或多肽序列进行序列对比,可以采用公众可得到的计算机算法,对另一多核苷酸序列测定特定区域内的相同核苷酸百分比。对多核苷酸序列进行序列对比并鉴定相似性的两种典型算法为BLASTN和FLASTP算法。可以采用BLASTP算法检查多肽序列的相似性。BLASTN和BLASTP软件均可在/blast/executables/下于NCBI无名称的FTP服务器(ftp://ncbi.nlm.nih.gov)得到。优选设定至文件中所述并呈所述算法分布的默认参数的BLASTN算法2.0.4版[1998年2月24日],用于测定按照本发明的变异体。包括BLASTN和BLASTP在内的BLAST算法系列描述于NCBI的URLhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html的网址和描述于Altschul,Stephen F.等(1997)的出版物“Gapped BLAST and PSI-BLAST:新一代蛋白数据库检索程序”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402。计算机算法FASTA可在frp网址ftp://ftp:viginia.edu/pub/fasta/的互联网上得到。优选设定至文件中所述并呈所述算法分布的默认参数的版本2.0u4[1996年2月],用于测定按照本发明的变异体。FASTA算法的用法描述于W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列分析的改进的工具”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448(1988)和W.R.Pearson的“用FASTP和FASTA的快速而灵敏的序列比较”,Methods inEnzymology 183:63-98(1990)。
优选以下运行参数用于测定序列对比和相似性,采用BLASTN得出E值和相同百分比:Unix运行要求:blastall-p blastn-d embldb-e 10-G l-E 1-r 2-v 50-b 50-i queryseq-o结果;而参数默认值为:-p程序名称[String]-d数据库[String]-e预期值(E)[Real]-G打开一个间隙(gap)的费用(O请求默认行为)[Integer]-E扩展一个间隙的费用(O请求默认行为)[Integer]-r核苷酸匹配结果(Reward)(blastn only)[Integer]-v一行(one-line)描述的数目(V)[Integer]-b显示序列对比数(B)[Integer]-i查询文件(Query File)[File In]-o BLAST报告输出文件[File Out]任选的
对于BLASTP来说,优选以下运行参数:blastall-p blastp-dswissprotdb-e 10-G 1-E 1-v 50-b 50-i queryseq-o结果-p程序名称[String]-d数据库[String]-e预期值(E)[Real]-G打开一个间隙的费用(0请求默认行为)[Integer]-E扩展一个间隙的费用(0请求默认行为)[Integer]-v一行描述的数目(v)[Integer]-b显示序列对比数(b)[Integer]-I查询文件[File In]-o BLAST报告输出文件[File Out]任选的
BLASTN、BLASTP、FASTA或相似算法产生的所查询序列对于一个或多个数据库序列进行“命中”,从而进行序列对比并鉴定序列的相似部分。所述命中以相似性程度和序列重叠长度的顺序排列。对于数据库序列的命中一般代表仅所查询序列序列长度一部分上的重叠。
BLASTN和FASTA算法也产生序列对比的“预期”值。预期值(E)表示当检索一定大小的数据库时人们可以“预期”在一定数目连续序列中偶然见到的命中数。该预期值用作确定对数据库诸如优选的EMBL数据库的该命中是否指示真实的相似性的显著性阈值。例如,赋值于命中的0.1的E值的意义解释为:在所述大小的EMBL数据库的一个数据库中,人们可以预期在所述序列对比部分中仅偶然见到与具有相似计分的序列的匹配为0.1。采用该标准,则所述序列的序列对比和匹配部分为同一部分的可能性为90%。对于序列对比和匹配部分中E值为0.01或更低的序列,采用BLASTN或FASTA算法在EMBL数据库中偶然发现一个匹配的可能性为1%或更低。
按照一个实施方案,相对于本发明每个多核苷酸的“变异的”多核苷酸最好包含核酸数与每一本发明多核苷酸相同和比其少的序列,并且所述序列当与本发明的多核苷酸相比时产生的E值为0.01或更低。亦即,变异的多核苷酸是这样一种序列,它与本发明的多核苷酸相同的可能性为至少99%,用设定于默认参数的BLASTN或FASTA算法测定为E值0.01或更低。按照优选的实施方案,变异的多核苷酸是与本发明的多核苷酸相比核酸数相同或较少的序列,它与本发明的多核苷酸相同的可能性为至少99%,用设定于默认参数的BLASTN或FASTA算法测定为E值0.01或更低。
变异的多核苷酸序列一般在严格条件下将杂交至所述的多核苷酸序列。本文所用的“严格条件”是指在6X SSC,0.2%SDS溶液中预洗涤;于65℃、6X SSC,0.2%SDS杂交过夜;然后在1X SSC,0.1%SDS中于65℃下洗涤2次,每次30分钟,并在0.2X SSC,0.1%SDS中于65℃下洗涤2次,每次30分钟。
可以通过合成或重组方法产生母牛分枝杆菌多肽的部分和其它变异体。少于约100个氨基酸、一般少于约50个氨基酸的合成多肽,可以用本领域技术人员熟知的技术产生。例如,这类多肽可以采用任一市售的固相技术合成,所述固相技术诸如Merrifield固相合成法,其中氨基酸依次加至生长的氨基酸链上。参见Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2146,1963。自动合成多肽的设备可从诸如PerkinElmer/Applied BioSystems,Inc.(Foster City,CA)供应商购得,可按照生产商的说明进行操作。可以采用诸如寡核苷酸指导的位点专一性诱变的标准诱变技术,制备天然抗原或佐剂的变异体。也可以采用标准技术去除DNA序列的部分,以允许制备截短的多核苷酸。
本发明的多肽可以于该蛋白N末端连接信号(或前导)序列,这在共同翻译或翻译后指导该蛋白的转移。所述多肽也可以连接于一个接头或其它序列,使得易于合成、纯化或鉴定所述多肽(例如poly-His),或用以增强所述多肽与固相支持体的结合。例如,可以将多肽结合于免疫球蛋白Fc区,
一般而言,可以采用多种方法中的任一种制备母牛分枝杆菌抗原和编码这类抗原的DNA序列。例如,可以如下所述从母牛分枝杆菌培养物滤液中分离可溶性抗原。也可以通过将编码抗原的DNA序列插入表达载体中,并在合适的宿主中表达所述抗原,来重组产生所述抗原。可以使用多种本领域技术人员已知的表达载体中的任一种。可以在用含编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的任何合适的宿主细胞中达到表达。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高等真核细胞。最好是,所用的宿主细胞是大肠杆菌、分枝杆菌、昆虫、酵母或哺乳动物细胞系诸如COS或CHO。以该方式表达的DNA序列可以编码天然存在的抗原、天然存在的抗原的部分、或其其它变异体。
通过对合适的母牛分枝杆菌cDNA或基因组DNA文库筛选杂交至得自分离的可溶性抗原部分氨基酸序列的简并寡核苷酸的DNA序列,可以获得编码母牛分枝杆菌抗原的DNA序列。可以设计并合成合适的简并寡核苷酸,可以如例如Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY,1989中所述进行筛选。如下所述,可以采用聚合酶链式反应(PCR),从基因组DNA或cDNA或基因组DNA文库中分离核酸探针。然后用分离的探针进行文库筛选。也可以通过用针对母牛分枝杆菌抗原特异性产生的抗血清(例如兔或猴)筛选合适的母牛分枝杆菌表达文库,分离编码母牛分枝杆菌抗原的DNA分子。
无论是何种制备方法,本文所述的抗原均具有诱导免疫原性应答的能力。更具体地讲,所述抗原具有在得自结核分枝杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞或巨噬细胞中诱导细胞增殖和/或细胞因子产生(例如干扰素-γ和/或白介素-12的产生)的能力。结核分枝杆菌免疫个体是由于已建立对结核分枝杆菌有效的T细胞应答而被认为对肺结核的发生具有抗性的个体。可以根据肺结核蛋白(PPD)皮内皮肤测试应答强阳性(即硬结直径大于约10mm)并且缺乏结核感染症状来鉴定这类个体。例如可以采用以下数种方法,进行关于细胞增生和T细胞、NK细胞、B细胞或巨噬细胞中产生细胞因子的测定。用于评价对抗原的免疫原性应答的细胞类型的选择将取决于所需的应答。例如,采用可以用本领域熟知的方法制备的、含有得自结核分枝杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞和巨噬细胞的制剂,可以最容易地评价白介素-12的产生。例如,可以不用进一步分离组分细胞而使用外周血单核细胞(PBMC)的制剂。可以例如采用通过FicollTM(Winthrop Laboratories,NY)的密度离心制备PBMC。用于本文所述测定的T细胞可以直接从PBMC中纯化。或者,可以使用富集的对分枝杆菌蛋白具反应性的T细胞系、或对单独的分枝杆菌蛋白具反应性的T细胞克隆。通过例如将得自结核分枝杆菌免疫个体的PBMC与分枝杆菌蛋白一起培养2-4周,可以产生这类T细胞克隆。这使得仅分枝杆菌蛋白特异性T细胞得以扩增,产生仅包含这类细胞的细胞系。然后可以采用本领域熟知的方法将这些细胞克隆并用单独的蛋白测试,以更精确地限定各种T细胞特异性。
一般而言,无论何种制备方法,本文公开的多肽均以分离的、大致纯形式制备。最好是,所述多肽的纯度至少为约80%,更优至少为约90%,最优选至少为约99%。在以下详述的某些优选实施方案中,将所述大致纯的多肽掺入药用组合物或疫苗中,以用于一种或多种本文公开的方法中。
本发明也提供融合蛋白以及这类融合蛋白的变异体,所述融合蛋白包含第一和第二本发明多肽,或者包含一种本发明的多肽和一种已知的结核分枝杆菌抗原,诸如Andersen和Hansen在Infect.Immun.57:2481-2488,1989中所述的38kDa抗原。本发明的融合蛋白在第一多肽和第二多肽之间也可以包括一个接头肽。
用已知的重组DNA技术将编码第一多肽和第二多肽的DNA序列分别装配到合适的表达载体中,构建编码本发明融合蛋白的DNA序列。编码所述第一多肽的DNA序列的3’端与肽接头连接或不连接,连接至编码所述第二多肽的DNA序列的5’端,使得所述序列的读框在同一读框内,以使得所述两种DNA序列经mRNA翻译为单一的、保留第一多肽和第二多肽生物活性的融合蛋白。
可以用肽接头将所述第一多肽和所述第二多肽分开,其距离足以确保每种多肤折叠为其二级结构和三级结构。用本领域熟知的标准技术将这种肽接头序列掺入所述融合蛋白中。合适的肽接头序列可以根据以下因素选择:(1)它能够采取柔性伸展的构象;(2)它不能采取可以与所述第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构;和(3)缺乏可以与所述肽功能表位反应的疏水性残基或带电残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它近中性的氨基酸诸如Thr和Ala也可以用于接头序列中。可以有用地用作接头的氨基酸序列包括描述于以下文献中的氨基酸序列:Maratea等,Gene 40:39-46,1985;Murphy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262,1986;美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号。所述接头序列可以长1至约50个氨基酸。当所述第一和第二多肽具有可以用来分离所述功能域并防止立体干扰的非必需N末端氨基酸区时,不需要肽接头序列。可以采用本领域技术人员已知的技术,将连接的编码所述融合蛋白的DNA序列克隆入合适的表达载体系统中。
如下详述,本发明人已经证明,本发明的热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌和重组母牛分枝杆菌蛋白可以用以激活T细胞和NK细胞;刺激在人PBMC中产生细胞因子(特别是Th1类细胞因子);增强树突细胞和单核细胞上共同刺激分子的表达(由此增强激活);和增强树突细胞的成熟和功能。此外,本发明人已经证明,本发明的母牛分枝杆菌蛋白GV-23和两种已知的Th1诱导型佐剂之间的免疫学特性的相似性。GV-23因此可以用于治疗涉及Th1免疫应答增强的疾病。这类疾病的实例包括变应性疾病(例如哮喘和湿疹)、自身免疫病(例如系统性红斑狼疮)和传染病(例如结核和麻风)。另外,GV-23可以用作免疫缺陷病诸如HIV治疗中的树突细胞或NK细胞增强剂,以及用以增强免疫应答和对例如在癌症中和在免疫抑制的抗癌治疗诸如化学疗法之后的恶性细胞的细胞毒性应答。
关于用于本发明治疗方法,所述失活的母牛分枝杆菌、母牛分枝杆菌培养物滤液、修饰的母牛分枝杆菌细胞、母牛分枝杆菌多肽、融合蛋白(或编码这类多肽或融合蛋白的多核苷酸)一般存在于药用组合物或疫苗中。药用组合物可以包含一种或多种选自以下的组分:失活的母牛分枝杆菌细胞、母牛分枝杆菌培养物滤液、修饰的母牛分枝杆菌细胞、和存在于或得自母牛分枝杆菌和/或其培养物滤液的化合物;以及一种生理上可接受的载体。疫苗可以包含一种或多种选自以下的组分:失活的母牛分枝杆菌细胞、母牛分枝杆菌培养物滤液、修饰的母牛分枝杆菌细胞、和存在于或得自母牛分枝杆菌和/或其培养物滤液的化合物;以及一种非特异性免疫应答增强剂。这类药用组合物和疫苗也可以含有其它分枝杆菌抗原,所述抗原或者如上所述掺入融合蛋白中或存在于分离的多肽中。
或者,本发明的疫苗可以含有编码一种或多种如上所述的多肽的DNA,使得所述多肽在原位产生。在这类疫苗中,所述DNA可以存在于本领域技术人员已知的多种传递系统中的任一种中,包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。合适的核酸表达系统含有在所述患者中表达必需的DNA序列(诸如合适的启动子和终止子信号)。细菌传递系统包括给予其细胞表面表达所述多肽免疫原性部分的细菌(诸如卡介苗)。在一个优选的实施方案中,用病毒表达系统(例如痘苗病毒或其它痘病毒、反转录病毒或腺病毒)引入所述DNA,这可以包括使用非致病的、或缺陷的可复制病毒。用于将DNA加入这类表达系统的技术是本领域熟知的。所述DNA也可以是“裸露的”,如描述于Ulmer等,Science 259:1745-1749,1993,和由Cohen,Science 259:1619-1692,1993综述。可以通过将DNA包被在被有效转运到细胞中的生物可降解珠粒上,增加裸露DNA的摄入。
上述DNA疫苗可以与或者本发明多肽或者已知的分枝杆菌抗原诸如上述的38kDa抗原同时给予,或顺序给予。例如,可以在给予编码本发明多肽的DNA后给予抗原,以便增强所述疫苗的保护性免疫。
给药途径和给药频率以及剂量将随个体而变,可以类似于目前用于采用BCG免疫的给药途径和给药频率以及剂量。一般而言,所述药用组合物和疫苗可以经注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如经吸入)或经口给予。可以在1-36周内给予1-3个剂量次。最好是以3-4个月的间隔给予3个剂量次,此后可以定期给予加强接种。可变方案可能对于个别患者是合适的。合适的剂量是当如上所述给予时能够在患者中产生足以在至少1-2年内保护该患者抵抗分枝杆菌感染的免疫应答的多肽或DNA的量。一般而言,一剂中多肽的存在(或一剂所述DNA原位产生的)量的范围为每kg宿主约1pg至约100mg,通常为约10pg至约1mg,最好是约100pg至约1μg。合适的剂量大小随患者的体型大小而变,但范围通常为约0.1ml至约5ml。
在一个实施方案中,所述药用组合物或疫苗为适于传递至导入肺或在肺中的气道粘膜表面的形式。例如,可以将所述药用组合物或疫苗悬浮于液体制剂中,用来以气雾剂形式或利用类似于目前用于治疗哮喘的喷雾装置传递给患者。在其它实施方案中,所述药用组合物或疫苗为适于经注射(皮内、肌内、静脉内或皮下)或经口给予的形式。尽管本领域技术人员已知的任何合适的载体均可以用于本发明的药用组合物中,但载体的类型取决于对于所选给药途径的适合性。对于胃肠外给药诸如皮下注射,所述载体最好包含水、盐水、乙醇、脂质、蜡或缓冲液。对于口服,可以使用任一上述载体或固体载体,诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解小球体(例如polylactic galactide)也可以用作本发明药用组合物的载体。合适的生物可降解小球体公开于例如美国专利第4,897,268号和第5,075,109号。
多种佐剂中的任一种均可以用于本发明的疫苗中,以非特异性地增强所述免疫应答。大多数佐剂含有:设计用以保护所述抗原免于快速分解代谢的物质,诸如氢氧化铝或矿物油;和免疫应答给特异性刺激物,诸如脂质A、百日咳博得特氏菌、结核分枝杆菌或下述的母牛分枝杆菌。合适的佐剂是市售的,例如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories Detroit,MI)、和Merck佐剂65(Merck andCompany,Inc.,Rahway,NJ)。其它合适的佐剂包括明矾、生物可降解小球体、单磷脂酰脂质A和Quil A。
另一方面,本发明提供使用一种或多种本发明多肽采用皮肤测试诊断结核的方法。本文所述的“皮肤测试”是直接在患者上进行的、在皮内注射上述一种或多种多肽后测量延迟型过敏(DTH)反应(诸如肿胀、发红或皮炎)的任何测定。最好是,在注射后至少48小时,更优选在48-72小时,测量所述反应。
DTH反应是一个细胞介导的免疫应答,在先前已经暴露于测试抗原(即所用多肽的免疫原性部分或其变异体)的患者反应较大。该应答用尺以肉眼测量。一般而言,直径大于约0.5cm、最好大于约1.0cm的反应为阳性反应,指示结核感染。
为了用于皮肤测试,本发明的多肽最好配制为含有如上所述的一种多肽和一种生理上可接受的载体的药用组合物。这类组合物通常含有一种或多种的上述多肽,其在0.1ml体积中的量的范围为约1μg至约100μg,最好是约10μg至约50μg。用于这类药用组合物中的载体最好是含有合适防腐剂诸如苯酚和/或Tweem 80TM的盐水溶液。
在一个优选实施方案中,用于皮肤测试的多肽具有足够的大小,使得它在反应时间内保留在注射部位。一般而言,至少长9个氨基酸的多肽是足够的。该多肽也最好在注射后数小时内被巨噬细胞或树突细胞分解,以呈递至T细胞。这类多肽可以含有一种或多种上述序列或其它免疫原性或非免疫原性序列的重复。
另一方面,提供单独或结合使用一种或多种本发明多肽检测生物样品中分枝杆菌感染的方法。在使用多种多肽的实施方案中,可以包括本文具体描述诸如上述的38kDa抗原以外的多肽。本文所用的“生物样品”是得自患者的任何含抗体样品。所述样品最好是全血、痰、血清、血浆、唾液、脑脊髓液或尿。所述样品更优选为得自患者或血液供应的血液、血清或血浆样品。所述多肽用于如下所述的测定中,以测定所述样品中针对所述多肽的抗体相对于预定截止值的存在或不存在。存在这类抗体表明存在分枝杆菌感染。
在使用一种以上多肽的实施方案中,所用多肽最好是互补的(即一种组分的多肽往往检测样品中另一组分多肽可能检测不到的感染)。采用每种多肽单独评价得自已知感染分枝杆菌的一系列患者的血清样品,一般可以鉴定出互补多肽。在用每种多肽确定哪种样品测试阳性(如下所述)后,可以配制能够检测在大多数或所有测试样品中的感染的两种或两种以上多肽的组合物。例如,约25-30%的结核感染个体血清对于任何单个蛋白诸如上述38kDa抗原的抗体为阴性。因此,互补多肽可以结合38kDa抗原使用,以提高诊断试验的灵敏度。
使用一种或多种多肽检测样品中的抗体的多种测定形式是本领域众所周知的。参见例如Harlow和Lane,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。在一个优选实施方案中,该测定包括使用固定于固相支持体的多肽以结合于样品的所述抗体或从样品中取出所述抗体。然后结合抗体可以用含有报道基团的检测试剂检测。合适的检测试剂包括结合于所述抗体/多肽复合物的抗体以及用报道基团标记的游离多肽(例如在半竞争测定中)。或者,可以利用竞争测定,其中结合于所述多肽的抗体用一种报道基团标记,并在使所述抗原与样品一起温育后使其结合于固定化抗原。样品的所述组分抑制标记抗体与所述多肽结合的程度,为该样品与所述固定化多肽的反应性指标。
所述固相支持体可以是所述抗原可以结合的任何固体材料。合适的材料是本领域熟知的。例如,所述固相支持体可以是微量滴定板中的测试孔或硝化纤维素膜或其它合适的膜。或者,所述固相支持体可以是一种珠粒或圆盘,诸如玻璃、玻璃纤维、胶乳或塑料材料诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持体也可以是诸如公开于美国专利第5,359,681号中的磁性粒子或光纤传感器。
可以采用本领域熟知的多种技术将所述多肽可以结合于所述固相支持体。在本发明的正文中,术语“结合”是指非共价结合诸如吸附、以及可以在所述抗原和所述支持体上的官能团之间直接键合或通过交联剂键合的共价连接。最好是吸附结合至微量滴定板的孔上或结合至膜上。在这类情况下,通过使所述多肽在合适的缓冲液中与所述固相支持体接触合适的时间,可以达到吸附。接触时间随温度而变,但通常为约1小时至1天。一般而言,使塑料微量滴定板(诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔与约10ng至约1μg、最好是约100ng量的多肽接触,足以结合适量的抗原。
通过首先使固相支持体与同支持体和所述多肽上的一种官能团(诸如羟基或氨基)均反应的双官能试剂反应,一般可以达到多肽共价结合于固相支持体。例如,用苯醌或通过将支持体上的醛基团与多肽上的胺或活性氢缩合,可以将该多肽结合于具有合适聚合物涂层的支持体上(参见例如Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook,1991,A12-A13)。
在某些实施方案中,该测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。通过首先使已经固定在固相支持体上的多肽抗原与样品接触,使得让样品中抗所述多肽的抗体结合于固定化多肽,进行该测定。然后从固定化多肽中除去未结合的样品,并加入能够结合于固定化抗体-多肽复合物的检测试剂。然后用适于具体检测试剂的方法,测定保持结合于固相支持体的检测试剂的量。
更具体地讲,一旦将所述多肽固定于如上所述的支持体,则通常封闭支持体上其余的蛋白结合位点。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的封闭剂,诸如牛血清白蛋白或Tween 20TM(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO)。然后,所述固定化多肽与样品温育,让抗体结合于所述抗原上。在温育之前,用合适的稀释剂诸如磷酸缓冲盐水(PBS)稀释样品。一般而言,合适的接触时间或温育时间是足以检测结核分枝杆菌感染样品中抗体存在的时间。接触时间最好足以达到这样一种结合水平,该水平为达到结合和未结合抗体之间平衡的至少95%。通过分析在一段时间内发生的结合水平,可以容易地确定达到平衡必需的时间。于室温下,约30分钟的温育时间一般是足够的。
通过用合适的缓冲液,诸如含有0.1%Tween 20TM的PBS洗涤固相支持体,可以除去未结合的样品。然后可以将检测试剂加至固相支持体。合适的检测试剂是结合于固定化抗体-多肽复合物、并可以用本领域已知的多种方法中的任一种检测的任何化合物。检测试剂最好含有缀合一种报道基团的结合剂(诸如蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、凝集素或游离抗原)。优选的报道基团包括酶(诸如辣根过氧化物酶)、底物、辅因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。可以用本领域已知的标准方法达到结合剂与报道基团的缀合。普通的结合剂也可以是购自许多商业来源(例如Zymed Laboratories,San Francisco,CA和Pierce,Rockford,IL)的缀合于多种报道基团的结合剂。
将检测试剂与固定化抗体-多肽复合物一起温育足以检测结合抗体的时间。根据生产商的说明,或通过分析在一段时间内发生的结合水平,一般可以确定合适的时间长短。然后除去未结合的检测试剂,并用该报道基团检测结合的检测试剂。用于检测该报道基团的方法取决于所述报道基团的性质。对于放射性基团,闪烁计数或放射自显影方法一般是合适的。光谱法可以用来检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可以用偶联不同报道基团(通常为放射性基团或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白检测。酶报道基团可以通过加入底物(一般持续特定时间),然后光谱分析或其它分析反应产物来进行检测。
为了确定样品中抗分枝杆菌抗体的存在与否,一般将由保持结合于固相支持体的报道基团检测到的信号与对应于预定截止值的信号进行比较。在一个优选实施方案中,截止值为所述固定化抗原与未感染患者的样品温育时获得的平均信号。在一个替代优选实施方案中,按照Sckett等的方法(Clinical Epidemiology:A Basic Science for ClinicalMedicine,Little Brown and Co.,1985,第106-107页),用ReceiverOperator曲线测定截止值。一般而言,高于预定截止值的信号被认为是分枝杆菌感染阳性。
该测定也可以以快速流通或条试验形式进行,其中将所述抗原固定至诸如硝化纤维素的膜上。在流通试验中,当样品通过膜时,样品中的抗体结合于固定化多肽。然后,当含检测试剂的溶液流过膜时,检测试剂(例如蛋白A-胶体金)结合于所述抗体-多肽复合物。在条试验形式中,将多肽结合的膜的一端浸入含样品的溶液中。样品沿膜迁移通过含检测试剂的区域,并迁移至固定化多肽的区域。检测试剂在多肽处的浓缩指示样品中存在抗分枝杆菌抗体。通常,检测试剂在该位点的浓缩产生一种肉眼可见的图案,诸如一条线。不存在这种图案指示阴性结果。一般而言,选择固定在膜上的多肽的量,以在生物样品含有足以在上述的ELISA中产生阳性信号的抗体水平时,产生肉眼可分辨的图案。固定在膜上的多肽的量的范围最好为约25ng至约1μg,更优选为约50ng至约500ng。这类试验通常可以用非常少量(例如一滴)患者血清或血液来进行。
存在适用于本发明多肽的多种其它测定方案。以上描述仅仅为了举例说明。
本发明也提供抗本发明多肽的抗体。可用多种本领域技术人员已知技术中的任一种制备抗体。参见例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。在一个这样的技术中,最初将包含抗原多肽的免疫原注射入多种哺乳动物中的任何一种中(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊)。将该免疫原注射入该动物宿主中,最好根据预定的计划,加入一次或多次加强免疫,定期取动物的血液。然后,可以例如通过亲和层析,用偶联至合适固相支持体的所述多肽,从这类抗血清中纯化对所述多肽特异性的多克隆抗体。
可以例如采用Kohler和Milstein的技术(Eur.J.Immunol.6:511-519,1976)及其改进技术,制备对目的抗原多肽特异性的单克隆抗体。简而言之,这些方法包括制备能够产生具有所需特异性(即与目的多肽的反应性)抗体的无限增殖细胞系。例如可以由得自如上所述免疫的动物的脾细胞产生这类细胞系。然后通过用本领域熟知技术之一,将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合伴侣融合,将所述脾细胞无限增殖化,所述融合伴侣最好是与免疫动物同源的融合伴侣。
可以从所得杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。另外,各种技术可以用来提高得率,诸如将杂交瘤细胞系注射入合适脊椎动物宿主诸如小鼠的腹膜腔中。然后从腹水或血液中收获单克隆抗体。
抗体可以用于诊断试验,以用类似于以上详述的测定和本领域技术人员熟知的其它技术检测分枝杆菌抗原的存在,由此提供用于检测患者分枝杆菌感染(诸如结核分枝杆菌感染)的方法。
本发明的诊断试剂也可以包含编码一种或多种上述多肽的多核苷酸或其一个或多个部分。例如,包含本发明多核苷酸的至少10个相邻寡核苷酸的引物可以用于基于聚合酶链式反应(PCR)的试验中。同样,包含本发明多核苷酸的至少18个相邻的寡核苷酸的探针可以用以与特定序列杂交。基于PCR的试验和杂交试验的技术均是本领域众所周知的。因此引物或探针可以用以检测生物样品中结核分枝杆菌或其它分枝杆菌的感染,所述生物样品最好是痰、血液、血清、唾液、脑脊髓液或尿。上述包含寡核苷酸序列的DNA探针或引物可以单独使用或相互结合使用,或与先前鉴定的序列诸如上述38kDa抗原序列结合使用。
字“约”当用于本申请关于组合物的重量百分比时,设想了由所述百分比起至多10%单位的变化。当用于同一性百分比或可能性百分比时,字“约”设想了由所述百分比起至多1%单位的变化。
提供以下实施例是为了说明,不是为了限制。
实施例1
用母牛分枝杆菌免疫小鼠对结核的效应
该实施例说明了在用活结核分枝杆菌攻击之前,用热灭活母牛分枝杆菌或母牛分枝杆菌培养物滤液免疫小鼠的效应。
在无菌培养基90(酵母提取物,2.5g/l;胰蛋白胨,5g/l;葡萄糖,1g/l)中,于37℃培养母牛分枝杆菌(ATCC第15483号)。通过离心收获细胞,将其转移至含葡萄糖的无菌Middlebrook 7H9培养基(DifcoLaboratoies,Detroit,MI,美国),于37℃培养1天。然后将培养基离心以沉淀细菌,并除去培养物滤液。将细菌沉淀再悬浮液磷酸缓冲盐水中,浓度为10mg/ml,等于1010母牛分枝杆菌/ml。然后将细菌悬浮液于120℃高压灭菌15分钟。使培养物滤液通过0.45μm滤器收集入无菌瓶中。
如图1A所示,当用1mg、100μg或10μg母牛分枝杆菌免疫小鼠并在3周后用5×105菌落形成单位(CFU)活结核分枝杆菌H37Rv感染时,观察到对感染的显著保护。在该实施例中,在感染后3周收获小鼠的脾、肝和肺组织,并测定活杆菌(以CFU表示)。与非免疫对照小鼠相比,杆菌数的减少在肝组织和肺组织中超过20倍,在脾组织中超过10倍。用热灭活结核分枝杆菌H37Rv免疫小鼠对随后用活结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠没有明显的保护作用。
图1B显示,当用100μg母牛分枝杆菌培养物滤液免疫小鼠并在3周后用5×105CFU结核分枝杆菌H37Rv感染时,也观察到显著的保护作用。当在感染后3周收获小鼠的脾、肝和肺组织,并测定活杆菌数(CFU)时,与非免疫对照小鼠相比,观察到杆菌数减少10-20倍。
实施例2
用母牛分枝杆菌皮内和肺内途径的免疫
对短尾猴肺结核的效应
该实施例说明了在用活结核分枝杆菌攻击之前,用热灭活母牛分枝杆菌或母牛分枝杆菌培养物滤液通过皮内和肺内途径免疫短尾猴的效应。
如以上实施例1所述制备热灭活母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌培养物滤液。使用5组短尾猴,每组2只猴子。两组猴子用完整的热灭活母牛分枝杆菌或者皮内或者肺内免疫;两组猴子用母牛分枝杆菌培养物滤液或者皮内或者肺内免疫;而对照组不接受免疫。将有所有免疫原均溶于磷酸缓冲盐水中。表1提供了每组猴子用以免疫的组合物、免疫原的量和给予途径。在免疫之前,为所有猴子称重(Wtkg)、测量体温(temp),并且取血测定红细胞沉降速率(ESR mm/hr)和对用牛分枝杆菌制备的纯化蛋白(PPD)体外攻击的淋巴细胞增殖(LPA)。ESR和LPA均已经用作炎性T细胞应答的指标。在免疫后第33天,重复这些测量。第34天,所有的猴子均接受第二次免疫,采用与初次免疫相同的母牛分枝杆菌量和免疫途径。第62天测量体重、体温、ESR和对PPD的LPA,然后通过将该生物直接植入免疫动物的右肺,用103菌落形成单位的结核分枝杆菌的Erdman菌株感染所有猴子。感染后28天,测量所有猴子的体重、温度、ESR和对PPD的LPA,并拍摄肺X光片,以确定用活结核分枝杆菌感染是否已经导致肺炎发生。
表1
皮内和肺内途径免疫的比较组号 猴子的鉴别号 免疫原的量 免疫途径1 S3101-E 0 -(对照) 3144-B 0 -2 4080-B 500μg 皮内(用热灭活母牛 3586-B 500μg 皮内分枝杆菌免疫)3 3534-C 500μg 肺内(用热灭活母牛 3160-A 500μg 肺内分枝杆菌免疫)4 3564-B 100μg 皮内(用培养物滤液 3815-B 100μg 皮内免疫)5 4425-A 100μg 肺内(用培养物滤液 2779-D 100μg 肺内免疫)
在以下表2A-E中提供这些研究的结果,并概述如下:
表2A-用结核分枝杆菌Erdman感染后28天,对照(非免疫)猴子的胸部X光片显示在两只动物的右测肺门上(suprahilar)区模糊,表明有肺炎发生。这种情况继续发展,到感染后第56天,X光片显示两个肺均患病。正如预期的,由于疾病发展,两只对照动物均体重减轻,并显示出对PPD的显著LPA应答,表明对结核分枝杆菌的强T细胞反应性。SER测量结果是变化的,但与强免疫反应性一致。
表2B-用500μg母牛分枝杆菌皮内免疫2次的两只猴子在用结核分枝杆菌感染后84天没有显示出肺病病征。对PPD的LPA应答表明,对结核分枝杆菌有免疫反应性,并且2只动物均继续增重,这是无病的一致性指标。
表2C-用500μg母牛分枝杆菌肺内免疫2次的两只猴子显示的结果与表2B的动物几乎相同。在用结核分枝杆菌感染后84天没有显示出肺病的病征,并且一致性增重。两只动物在免疫期(第0-62天)中和感染后均显示出对PPD的LPA应答,表明由于用肺作为免疫途径和随后的感染,已经发展出强T细胞反应性。
用500μg完整母牛分枝杆菌免疫2次已经一致地显示抵抗随后用活结核分枝杆菌感染的保护性效应。表2D和2E中所示数据显示了用100μg母牛分枝杆菌培养物滤液免疫的效应。皮内免疫的猴子在感染后84天显示出发病的病征,而肺内免疫的猴子,一只在感染后56天显示疾病,而一只动物在感染后84天显示出疾病。疾病发生的显著延迟,表明免疫过程已经产生某些保护性免疫。
表2B用完整的热灭活母牛分枝杆菌(500μg)皮内免疫的猴子 ND=未进行
表2C用完整的热灭活母牛分枝杆菌(500μg)肺内免疫的猴子 ND=未进行
表2D用培养物滤液(100μg)皮内免疫的猴子 ND=未进行
实施例3
用母牛分枝杆菌免疫对小鼠哮喘的效应
该实施例说明了在用热灭活母牛分枝杆菌和DD-母牛分枝杆菌通过鼻内途径给予小鼠时,能够抑制肺部的变应性免疫应答。这在哮喘样变应原特异性肺病的小鼠模型中得到证实。这种变应性疾病的严重性反映在肺部中积累的大量嗜酸性粒细胞。
在时间0和14天时,经腹膜内途径给予C57BL/6J 小鼠100μl明矾佐剂中的2μg卵清蛋白,随后在第28天经鼻内途径给予50μl磷酸缓冲盐水(PBS)中的100μg卵清蛋白。通过用盐水洗涤麻醉小鼠的气道,收集洗涤液(支气管肺泡灌洗液或BAL),并对嗜酸性粒细胞计数而进行检测,小鼠在其肺中积累的嗜酸性粒细胞。
如图2A和2B所示,与对照小鼠相比,在用卵清蛋白鼻内攻击之前4周鼻内给予10或1000μg热灭活母牛分枝杆菌(图2A)、或者10、100或200μg如下制备的DD-母牛分枝杆菌(图2B)的各组(7只为一组)小鼠,在用卵清蛋白攻击后5天收集的BAL细胞中嗜酸性粒细胞的百分比降低。对照小鼠鼻内给予PBS。剂量为2×105菌落形成单位的活的牛分枝杆菌BCG也降低肺嗜酸性粒细胞。图2A和2B中的数据显示每组小鼠的平均值和SEM。
图2C和图2D表明,与对照小鼠相比,在迟至用卵清蛋白攻击前1周鼻内给予或者1000μg热灭活母牛分枝杆菌(图2C)、或者200μgDD-母牛分枝杆菌(图2D)的小鼠,其嗜酸性粒细胞的百分比降低。相反,在用卵清蛋白攻击前1周用活BCG治疗与对照小鼠相比时,不抑制肺嗜酸性粒细胞的发展。
如图2E所示,与给予PBS的对照动物相比,或者鼻内(i.n.)或者皮下(s.c.)给予或者1mg热灭活母牛分枝杆菌或者200μg DD-母牛分枝杆菌免疫,在用卵清蛋白攻击后,肺嗜酸性粒细胞降低。在同一实验中,在用卵清蛋白攻击之前用巴斯德BCG(BCG-P)和Connought(BCG-C)菌株的BCG免疫,也降低小鼠BAL中嗜酸性粒细胞的百分比。
嗜酸性粒细胞是变应性哮喘气道中主要的血细胞。嗜酸性粒细胞的分泌产物导致变应性哮喘气道中粘膜衬层肿胀和炎症。图2A-E的所示的数据表明,用热灭活母牛分枝杆菌或DD-母牛分枝杆菌治疗,降低肺嗜酸性粒细胞的积累,并且可用于减轻气道、鼻粘膜和上呼吸道中与嗜酸性粒细胞相关的炎症。耗尽分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的DD-母牛分枝杆菌
通过用氢氧化钾(0.5%KOH)的乙醇溶液于37℃处理48小时,耗尽DD-母牛分枝杆菌的分枝菌酸。然后,分枝菌酸耗尽的DD-母牛分枝杆菌细胞用乙醇和乙醚洗涤并干燥。通过用3%乙酸中的1%高碘酸再于室温下处理1小时,然后用硼氢化钠0.1M于室温下处理1小时,耗尽KOH处理的DD-母牛分枝杆菌的阿拉伯半乳聚糖。在阿拉伯半乳聚糖耗尽后,样品用水洗涤并冻干。如表3所示,将分枝菌酸酯耗尽的DD-母牛分枝杆菌以及分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖耗尽的DD-母牛分枝杆菌鼻内给予卵清蛋白致敏的小鼠,降低在用卵清蛋白攻击后支气管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒细胞的积累。
因此,给予热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌或耗尽分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的DD-母牛分枝杆菌,可以减轻哮喘和涉及类似免疫异常的疾病(诸如过敏性鼻炎)的严重程度。
另外,从图2E所示实验中的小鼠收集血清样品,通过标准酶联免疫测定(EIA)测定抗卵清蛋白的抗体。如以下表3A所示,用BCG感染的小鼠的血清,其卵清蛋白特异性IgGl的水平高于PBS对照的血清。相反,用母牛分枝杆菌或DD-母牛分枝杆菌免疫的小鼠的卵清蛋白特异性IgGl水平相似或较低。因为IgGl抗体是Th2免疫应答的特征,所以这些结果与热灭活母牛分枝杆菌和DD-母牛分枝杆菌对诱导哮喘的Th2免疫应答的抑制效应一致。
表3用分枝菌酸耗尽的DD-母牛分枝杆菌或分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖耗尽的DD-母牛分枝杆菌处理的小鼠中的肺嗜酸性粒细胞减少。
注释:每组至少7只小鼠。
实施例4
用母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌或重组母牛分枝
杆菌蛋白免疫小鼠对结核的效应
该实施例说明了用热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌或无额外佐剂的重组母牛分枝杆菌蛋白、或热灭活母牛分枝杆菌与得自母牛分枝杆菌的重组蛋白库的组合免疫的效应。
隔开3周的两个场合下,给小鼠腹膜内注射一种以下制剂:
a)磷酸缓冲盐水(PBS,对照);
b)热灭活母牛分枝杆菌(500ug);
c)DD-母牛分枝杆菌(50ug);
d)含有GV4P、GV7、GV9、GV27B、GV33蛋白(如下所述制备)各15ug的重组蛋白库;和
e)热灭活母牛分枝杆菌加重组蛋白库。
在最后一次腹膜内免疫后3周,用5×105活H37Rv结核分枝杆菌生物感染小鼠。再3周后,处死小鼠,将其脾匀浆,分析作为感染严重程度指标的结核分枝杆菌的菌落形成单位。
图3A和3B显示了其中每个点代表各个小鼠的数据。取从仅用PBS免疫的对照小鼠中回收的CFU数作为基线。得自实验小鼠的所有数据均以对照小鼠基线以下的CFU的对数(或log保护)表示。如图3A所示,用热灭活母牛分枝杆菌或DD-母牛分枝杆菌免疫的小鼠分别显示平均降低>1或0.5log CFU。
如图3B所示,用含有GV4P、GV7、GV9、GV27B和GV33的重组蛋白库免疫的小鼠的脾,其CFU略低于对照小鼠。然而,当将GV4P、GV7、GV9、GV27B和GV33与热灭活母牛分枝杆菌联合给予时,CFU的降低超过平均值>1.5log。
该数据证明了用母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌或得自母牛分枝杆菌的重组蛋白免疫对随后的结核感染的效力,并进一步表明母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌和重组蛋白可以研制为抗结核的疫苗。
实施例5
皮内注射热灭活分枝杆菌疫苗对人类患者的牛皮癣的效应
该实施例说明了2次皮内注射热灭活母牛分枝杆菌对人类患者牛皮癣的效应。
在无菌培养基90(酵母提取物,2.5g/l;胰蛋白胨,5g/l;葡萄糖,1g/l)中,于37℃培养母牛分枝杆菌(ATCC第15483号)。通过离心收获细胞,将其转移至含葡萄糖的无菌Middlebrook 7H9培养基(DifcoLaboratories,Detroit,MI,美国),于37℃培养1天。然后将培养基离心以沉淀细菌,并除去培养物滤液。将细菌沉淀再悬浮液磷酸缓冲盐水中,浓度为10mg/ml,等于1010母牛分枝杆菌生物/ml。然后将细菌悬浮液于120℃高压灭菌15分钟,并冻干贮存于-20℃。在使用前使母牛分枝杆菌解冻,在磷酸缓冲盐水中稀释至5mg/ml的浓度,于120℃高压灭菌15分钟,在无菌条件下以0.2ml等分分装入管制瓶中以用于患者。
准许24位男性和女性志愿牛皮癣患者进行治疗,这些患者年龄为15-61岁,无其它系统性疾病。不包括怀孕的患者。所述患者的PASI计分为12-35。PASI计分测量机体上牛皮癣病灶的位置、大小和皮肤脱屑程度。高于12的PASI计分说明在机体上存在广泛的疾病病灶。该研究开始进行4周的消除期,其间所述患者没有系统抗牛皮癣治疗或有效的局部治疗。
然后,给这24位患者皮内注射0.1ml母牛分枝杆菌(等于500μg)。3周后第二次皮内注射相同剂量的母牛分枝杆菌(500μg)。从初次注射热灭活母牛分枝杆菌前4周至首次注射后12周,如下评价牛皮癣:
A.在-4、0、3、6和12周时测定PASI计分;
B.在0、3、6和12周时完成患者调查表;
C.在0、3、6、9和12周时对牛皮癣病灶和每位患者拍照。
表4所示数据描述了每位患者的年龄、性别和临床背景。
表4研究母牛分枝杆菌在牛皮癣中效力的患者数据
代号 | 患者 | 年龄/性别 | 疾病持续时间 | 准入时APSI计分 |
PS-001 | D.C. | 49/F | 30年 | 28.8 |
PS-002 | E.S. | 41/F | 4个月 | 19.2 |
PS-003 | M.G. | 24/F | 8个月 | 18.5 |
PS-004 | D.B. | 54/M | 2年 | 12.2 |
PS-005 | C.E. | 58/F | 3个月 | 30.5 |
PS-006 | M.G. | 18/F | 3年 | 15.0 |
PS-007 | L.M. | 27/M | 3年 | 19.0 |
PS-008 | C.C | 21/F | 1个月 | 12.2 |
PS-009 | E.G | 42/F | 5个月 | 12.6 |
PS-010 | J.G | 28/M | 7年 | 19.4 |
PS-011 | J.U | 39/M | 1年 | 15.5 |
PS-012 | C.S | 47/M | 3年 | 30.9 |
PS-013 | H.B | 44/M | 10年 | 30.4 |
PS-014 | N.J | 41/M | 17年 | 26.7 |
PS-015 | J.T | 61/F | 15年 | 19.5 |
PS-016 | L.P | 44/M | 5年 | 30.2 |
PS-017 | E.N | 45/M | 5年 | 19.5 |
PS-018 | E.L | 28/F | 19年 | 16.0 |
PS-019 | B.A | 38/M | 17年 | 12.3 |
PS-020 | P.P | 58/F | 1年 | 13.6 |
PS-021 | L.I | 27/F | 8个月 | 22.0 |
PS-022 | A.C | 20/F | 7个月 | 26.5 |
PS-023 | C.A | 61/F | 10年 | 12.6 |
PS-024 | F.T | 39/M | 15年 | 29.5 |
所用的患者在注射部分均显示非溃疡的、局限的红软硬化反应。注意到没有副作用,或没有患者抱怨。以下表5所示数据是在首次和第二次注射热灭活母牛分枝杆菌后48小时、72小时和7天时于注射部位测量的皮肤反应。以下表6所示数据是首次注射母牛分枝杆菌(第0天)和此后3、6、9、12和24周时患者的PASI计分。
可以清楚地看到,到首次注射母牛分枝杆菌后9周时,24位患者中的16位显示PASI计分显著改进。已经完成24周跟踪随访的14位患者中的7位保持稳定,没有再发生严重疾病的临床病征。这些结果证明多次皮内注射失活的母牛分枝杆菌在治疗牛皮癣中的效力。低于10的PASI计分反映广泛的病灶治愈。皮肤活检的组织病理学表明恢复正常皮肤的结构。已经完成28周跟踪随访的前7位患者中仅1位复发。
表5皮肤反应测量结果(mm)
DNR=未报道。
表6注射母牛分枝杆菌后患者的临床状况(PASI计分)
代号 | 第0天 | 第3周 | 第6周 | 第9周 | 第12周 | 第24周 |
PS-001 | 28.8 | 14.5 | 10.7 | 2.2 | 0.7 | 0 |
PS-002 | 19.2 | 14.6 | 13.6 | 10.9 | 6.2 | 0.6 |
PS-003 | 18.5 | 17.2 | 10.5 | 2.7 | 1.6 | 0 |
PS-004 | 12.2 | 13.4 | 12.7 | 7.0 | 1.8 | 0.2 |
PS-005* | 30.5 | DNR | 18.7 | DNR | DNR | 0 |
PS-006 | 15.0 | 16.8 | 16.4 | 2.7 | 2.1 | 3.0 |
PS-007 | 19.0 | 15.7 | 11.6 | 5.6 | 2.2 | 0 |
PS-008 | 12.2 | 11.6 | 11.2 | 11.2 | 5.6 | 0 |
PS-009 | 12.6 | 13.4 | 13.9 | 14.4 | 15.3 | 13.0 |
PS-010 | 18.2 | 16.0 | 19.4 | 17.2 | 16.9 | 19.3 |
PS-011 | 17.2 | 16.9 | 16.7 | 16.5 | 16.5 | 15.5 |
PS-012 | 30.9 | 36.4 | 29.7 | 39.8** | ||
PS-013 | 19.5 | 19.2 | 18.9 | 17.8 | 14.7 | 17.8 |
PS-014 | 26.7 | 14.7 | 7.4 | 5.8 | 9.9 | 24.4*** |
PS-015 | 30.4 | 29.5 | 28.6 | 28.5 | 28.2 | 24.3 |
PS-016 | 30.2 | 16.8 | 5.7 | 3.2 | 0.8 | 3.3 |
PS-017 | 12.3 | 12.6 | 12.6 | 12.6 | 8.2 | 8.7 |
PS-018 | 16.0 | 13.6 | 13.4 | 13.4 | 13.2 | 12.8 |
PS-019 | 19.5 | 11.6 | 7.0 | DNR | DNR | DNR |
PS-020 | 13.6 | 13.5 | 12.4 | 12.7 | 12.4 | 4.4 |
PS-021 | 22.0 | 20.2 | 11.8 | 11.4 | 15.5 | 15.7 |
PS-022 | 26.5 | 25.8 | 20.7 | 11.1 | 8.3 | 5.6 |
PS-023 | 12.6 | 9.2 | 6.6 | 5.0 | 4.8 | 12.6 |
PS-024 | 29.5 | 27.5 | 20.9 | 19.0 | 29.8 | 21.2 |
● *患者PS-005仅接受一个剂量的高压灭菌母牛分枝杆菌。
● **从试验中除去患者PS-012,药物(青霉素)诱导的皮炎
● ***患者PS-014再接种疫苗
● DNR=未报道
用母牛分枝杆菌治疗的患者可以达到缓解(PASI计分=0)。缓解或PASI计分改进可以是长期持续的。例如患者PS-003到第20周达到缓解,在第80周时仍缓解。24位患者中共13位表现出PASI计分改进高于50%。
患者PS-001在第16周达到缓解,在第48周时复发(PASI2.7),再经注射母牛分枝杆菌接种,随后PASI改进,从17.8(第60周)降至0.8(第84周)。因此,患者可以从重复治疗中获益。
实施例6
皮内注射DD-母牛分枝杆菌对人类患者牛皮癣的效应
该实施例说明了2次皮内注射DD-母牛分枝杆菌对牛皮癣的效应。
准入7位志愿男性和女性牛皮癣患者治疗,这些患者年龄为18-45岁,无其它系统性疾病。不包括怀孕的患者。所述患者的PASI计分为12-24。如上所述,PASI计分是测量机体上牛皮癣病灶的位置、大小和皮肤脱落程度。高于12的PASI计分反映在机体上存在广泛的疾病病灶。该研究开始进行4周的消除期(whashout period),其间所述4位患者没有系统的抗牛皮癣治疗或有效的局部治疗。然后,给这7位患者皮内注射0.1ml DD-母牛分枝杆菌(等于100μg)。3周后第二次皮内注射相同剂量的DD-母牛分枝杆菌(100μg)。
从初次注射母牛分枝杆菌前4周至首次注射后6周,如下评价牛皮癣:
A.在-4、0、3和6周时测定PASI计分;
B.在0、3和6周时完成患者调查表;和
C.在0和3周时对牛皮癣病灶和每位患者拍照。
表7所示数据描述了每位患者的年龄、性别和临床背景。
表7研究DD-母牛分枝杆菌在牛皮癣中的效力的患者数据
代号 | 患者 | 年龄/性别 | 疾病持续时间 | 准入时APSI计分 |
PS-025 | A.S. | 25/F | 2年 | 12.2 |
PS-026 | M.B. | 45/F | 3个月 | 14.4 |
PS-027 | A.G. | 34/M | 14年 | 24.8 |
PS-028 | E.M. | 31/M | 4年 | 18.2 |
PS-029 | A.L. | 44/M | 5个月 | 18.6 |
PS-030 | V.B. | 42/M | 5年 | 21.3 |
PS-031 | R.A. | 18/M | 3个月 | 13.0 |
所有患者在注射部分均显示非溃疡的、局限的红斑软硬化反应。注意到没有副作用,或没有患者主诉。表8所示数据是在首次注射DD-母牛分枝杆菌后48小时、72小时和7天时和第二次注射后48小时和72小时于注射部位测量的皮肤反应。
表9所示数据是首次注射DD-母牛分枝杆菌(第0天)和此后3、6、12和24周时这7位患者的PASI计分。
表9注射DD-母牛分枝杆菌后患者的临床状况(PASI计分)
代号 | 第0天 | 第3周 | 第6周 | 第12周 | 第24周 |
PS-025 | 12.2 | 4.1 | 1.8 | 1.4 | 1.7 |
PS-026 | 14.4 | 11.8 | 6.0 | 6.9 | 1.4 |
PS-027 | 24.8 | 23.3 | 18.3 | 9.1 | 10.6 |
PS-028 | 18.2 | 24.1 | 28.6 | 脱落 | |
PS-029 | 18.6 | 9.9 | 7.4 | 3.6 | 0.8 |
PS-030 | 21.3 | 15.7 | 13.9 | 16.5 | 13.6 |
PS-031 | 13.0 | 5.1 | 2.1 | 1.6 | 0.3 |
可以清楚地看到,到首次注射DD-母牛分枝杆菌后3周时,5位患者显示PASI计分显著改进。到24周时,7位患者中的6位显示PASI计分显著改进。
例如,患者PS-031到第32周达到缓解(APSI计分=0),在第48周时仍缓解。患者PS-025的PASI计分在超过12周内降至1以下。当在第48周牛皮癣加重时(PASI=15.8),该患者用DD-母牛分枝杆菌再治疗并且迅速改进,PASI计分在第52周和第56周时分别降至6.8和0.6。
因此,用DD-母牛分枝杆菌治疗牛皮癣可以使疾病缓解或提供较长时间的益处。患者也可以从重复治疗中获益。
实施例7
从母牛分枝杆菌制备组合物
该实施例说明了母牛分枝杆菌不同组分的加工。去脂质和去糖脂(DD-)母牛分枝杆菌的制备和组成分析
按照以上实施例1中所述制备热灭活母牛分枝杆菌。为了制备去脂质母牛分枝杆菌,通过离心沉淀高压灭菌的母牛分枝杆菌,沉淀物用水洗涤,再次经离心收集,然后冷冻干燥。等分该冷冻干燥的母牛分枝杆菌,将其称为冻干母牛分枝杆菌。当用于试验时,将其再悬浮于PBS中至所需浓度。冷冻干燥的母牛分枝杆菌用氯仿/甲醇(2∶1)于室温下处理60分钟以抽提脂质,重复抽提一次。得自氯仿/甲醇抽提的去脂质残留物进一步用50%乙醇处理,以经回流2小时除去糖脂。重复2次50%乙醇抽提。合并的50%乙醇抽提物用作母牛分枝杆菌糖脂源(参见下文)。将得自50%乙醇抽提的残留物冷冻干燥并称重。制备的去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌的量等于所用母牛分枝杆菌起始湿重的11.1%。对于活检,将所述去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌(DD-母牛分枝杆菌)经超声处理再悬浮于磷酸缓冲盐水中,并经高压灭菌消毒。
热灭活母牛分枝杆菌和DD-母牛分枝杆菌的组成分析示于表9。与热灭活母牛分枝杆菌的不溶性部分相比,在DD-母牛分枝杆菌脂肪酸组成和氨基酸组成方面观察到主要变化。表9所示数据表明,热灭活母牛分枝杆菌的不溶性部分含有10%(w/w)脂质,总氨基酸含量为2750mmole/mg,或约33%(w/w)。DD-母牛分枝杆菌含有1.3%(w/w)脂质和4250mmole/mg氨基酸,约为51%(w/w)。
表9热灭活母牛分枝杆菌和DD-母牛分枝杆菌的组成分析单糖组成
糖的糖醇 | 母牛分枝杆菌 | DD-母牛分枝杆菌 |
肌醇 | 3.2% | 1.7% |
核糖醇 | 1.7% | 0.4% |
阿拉伯糖醇 | 22.7% | 27.0% |
甘露醇 | 8.3% | 3.3% |
半乳糖醇 | 11.5% | 12.6% |
葡萄糖醇 | 52.7% | 55.2% |
脂肪酸 | 母牛分枝杆菌 | DD-母牛分枝杆菌 |
C14∶0 | 3.9% | 10.0% |
C16∶0 | 21.1% | 7.3% |
C16∶1 | 14.0% | 3.3% |
C18∶0 | 4.0% | 1.5% |
C18∶1* | 1.2% | 2.7% |
C18∶1w9 | 20.6% | 3.1% |
C18∶1w7 | 12.5% | 5.9% |
C22∶0 | 12.1% | 43.0% |
C24∶1* | 6.5 | 22.9% |
热灭活母牛分枝杆菌的不溶性部分含有10%(w/w)脂质,而DD-母牛分枝杆菌含有1.3%(w/w)脂质。氨基酸组成
nmole/mg | 母牛分枝杆菌 | DD-母牛分枝杆菌 |
ASP | 231 | 361 |
THR | 170 | 266 |
SER | 131 | 199 |
GLU | 319 | 505 |
PRO | 216 | 262 |
GLY | 263 | 404 |
ALA | 416 | 621 |
CYS* | 24 | 26 |
VAL | 172 | 272 |
MET* | 72 | 94 |
ILE | 104 | 171 |
LEU | 209 | 340 |
TYR | 39 | 75 |
PHE | 76 | 132 |
GlcNH2 | 5 | 6 |
HIS | 44 | 77 |
LYS | 108 | 167 |
ARG | 147 | 272 |
热灭活母牛分枝杆菌的不溶性部分的总氨基酸含量为2750mmole/mg,或约33%(w/w)。DD-母牛分枝杆菌总氨基酸含量为4250mmole/mg,约为51%(w/w)。DD-母牛分枝杆菌与去脂质和去糖脂形式的结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的组成比较
用以上所述用于去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌的方法,制备去脂质和去糖脂结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌。如表10所示,DD-母牛分枝杆菌、DD-结核分枝杆菌和DD-耻垢分枝杆菌氨基酸百分组成的分布型显示没有显著差异。然而,蛋白总量是变化的,2批DD-母牛分枝杆菌分别含有34%和55%的蛋白,而DD-结核分枝杆菌和DD-耻垢分枝杆菌分别含有79%和72%的蛋白。
表10去脂质和去糖脂分枝杆菌的氨基酸组成氨基酸 DD-母牛 DD-母牛 DD-耻垢 DD-结核
分枝杆菌批1 分枝杆菌批2 分枝杆菌 分枝杆菌Asp 9.5 9.5 9.3 9.1Thr 6.0 5.9 5.0 5.3Ser 5.3 5.3 4.2 3.3Glu 11.1 11.2 11.1 12.5Pro 6.1 5.9 7.5 5.2Glv 9.9 9.7 9.4 9.8Ala 14.6 14.7 14.6 14.2Cys 0.5 0.5 0.3 0.5Val 6.3 6.4 7.2 7.8Met 1.9 1.9 1.9 1.9Ile 3.6 3.5 4.1 4.7Leu 7.8 7.9 8.2 8.3Tyr 1.4 1.7 1.8 1.8Phe 4.2 4.0 3.2 3.0His 1.9 1.8 2.0 1.9Lys 4.1 4.0 4.1 4.2Arg 5.8 5.9 6.2 6.4总蛋白% 55.1 33.8 72.1 78.5
单糖组成分析显示DD-母牛分枝杆菌和DD-结核分枝杆菌以及DD-耻垢分枝杆菌之间的显著差异。两批DD-母牛分枝杆菌的单糖组成相同,而不同于DD-结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的单糖组成。具体地说,发现DD-母牛分枝杆菌含有游离葡萄糖,而DD-结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌含有甘油,如表11所示。
表11
糖醇乙酸酯 wt% mol%DD-母牛分枝杆菌
批1
肌醇 0.0 0.0
阿拉伯糖 54.7 59.1
甘露糖 1.7 1.5
葡萄糖 31.1 28.1
半乳糖 12.5 11.3
100.0 100.0DD-母牛分枝杆菌
批2 0.0 0.0
肌醇 51.0 55.5
阿拉伯糖 2.0 1.8
甘露糖 34.7 31.6
葡萄糖 12.2 11.1
半乳糖 100.0 100.0DD-耻垢分枝杆菌
肌醇 0.0 0.0
甘油 15.2 15.5
阿拉伯糖 69.3 70.7
木糖 3.9 4.0
甘露糖 2.2 1.9
葡萄糖 0.0 0.0
半乳糖 9.4 8.0100.0 100.0DD-结核分枝杆菌
肌醇 0.0 0.0
甘油 9.5 9.7
阿拉伯糖 69.3 71.4
甘露糖 3.5 3.0
葡萄糖 1.5 1.3
半乳糖 12.4 10.7
96.2 96.0母牛分枝杆菌糖脂
上述的合并的50%乙醇抽提物经旋转蒸发干燥,再溶于水中并冷冻干燥。回收的糖脂量为所用母牛分枝杆菌起始湿重的1.2%。对于生物测定,将所述糖脂溶于磷酸缓冲盐水中。
实施例8去脂质和去糖脂的母牛分枝杆菌和得自母牛分枝杆菌的重组蛋白的免
疫调节特性
该实施例说明了不同母牛分枝杆菌组分的免疫调节特性。由巨噬细胞产生白介素-12
表明完整的热灭活母牛分枝杆菌和DD-母牛分枝杆菌具有不同的细胞因子刺激特性。通过由巨噬细胞产生白介素-12(IL-12)增强Th1免疫应答的刺激。如下证明不同母牛分枝杆菌制剂刺激IL-12产生的能力。
一组C57BL/6J小鼠腹膜内注射DIFCO硫基乙醇酸盐,3天后收集腹膜内巨噬细胞并置于含有干扰素-γ的细胞培养基中3小时。更换所述培养基并加入各种浓度的如上所述制备的完整的热灭活(高压灭菌)母牛分枝杆菌、冻干母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌糖脂。再于37℃培养3天后,分析所述培养物上清液中巨噬细胞产生的白介素-12的存在。如图4所示,母牛分枝杆菌制剂刺激巨噬细胞产生IL-12。
相比之下,检查相同母牛分枝杆菌制剂刺激天然杀伤(NK)细胞产生干扰素-γ的能力。由重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠制备脾细胞。这些细胞群含有75-80%NK细胞。所述脾细胞在含有不同浓度的热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌或母牛分枝杆菌糖脂的培养基中于37℃培养。图5所示的数据说明,热灭活母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌糖脂刺激产生干扰素-γ,而DD-母牛分枝杆菌较少刺激干扰素-γ。图4和图5的数据一起表明,与完整热灭活母牛分枝杆菌相比,与DD-母牛分枝杆菌对于干扰素-γ相比,DD-母牛分枝杆菌对于IL-12是较好的刺激剂。
这些发现说明,去除母牛分枝杆菌的脂质糖脂组分导致去除刺激NK产生干扰素-γ的分子组分,因此有效消除了具有许多有害副作用的细胞因子的重要细胞来源。DD-母牛分枝杆菌因此保留了通过刺激IL-12产生而增强Th1免疫的能力,但是丧失了可以通过刺激NK细胞产生干扰素-γ产生的非特异性效应。
通过测定刺激鼠腹膜巨噬细胞分泌IL-12,测定如下所述制备的本发明的DD-母牛分枝杆菌和许多母牛分枝杆菌重组抗原的佐剂效应。图6A、6B和6C说明了其中将DIFCO硫基乙醇酸盐腹膜内给予C57BL/6小鼠(图6A)、BALB/c小鼠(图6B)或C3H/HeJ小鼠(图6C)的各个实验的数据。3天后,收集腹膜巨噬细胞并置于含有干扰素-γ的培养物中3小时。更换所述培养基并加入各种浓度的母牛分枝杆菌重组蛋白GVs-3(GV-3)、GV-4P(GV-4P)、GVc-7(GV-7)、GV-23、GV-27、热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌(在图A、B和C中称为去脂质母牛分枝杆菌)、母牛分枝杆菌糖脂或脂多糖。于37℃三天后,分析所述培养物上清液中巨噬细胞产生的IL-12的存在。如图6A、6B和6C所示,重组蛋白和母牛分枝杆菌制剂刺激巨噬细胞产生IL-12。
在后继实验中,用40ug/ml母牛分枝杆菌重组蛋白在培养基中刺激IFNγ激活的BALB/c小鼠的腹膜巨噬细胞3天,分析巨噬细胞产生的IL-12的存在。如图7所示,在这些实验中,IFNγ激活的巨噬细胞当与为对照蛋白的卵清蛋白(Ova)培养时产生IL-12。然而,重组蛋白GV24B、38BP、38AP、27、5、27B、3、23和22B刺激的IL-12的量较在对照巨噬细胞培养中检测到的量高2倍以上。得自完整母牛分枝杆菌和母牛分枝杆菌培养物滤液的非特异性免疫增强剂的检测
测试如上制备的母牛分枝杆菌培养物上清液(S/N)、灭活的母牛分枝杆菌、去脂质母牛分枝杆菌以及去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌(DD-母牛分枝杆菌)在小鼠中对一种结构不相关蛋白卵清蛋白产生细胞毒性T细胞免疫应答中的佐剂活性。如下检测所述抗卵清蛋白特异性细胞毒性应答。用100μg卵清蛋白和以下的试验佐剂腹膜内注射免疫C57BL/6小鼠(2只/组):高压灭菌的母牛分枝杆菌;去脂质的母牛分枝杆菌;去脂质、还被提取糖脂的母牛分枝杆菌(DD-母牛分枝杆菌)和用SDS提取的蛋白;用链霉蛋白酶(一种降解蛋白的酶)处理的SDS蛋白提取物;完整的母牛分枝杆菌培养物滤液;和热灭活的结核分枝杆菌或热灭活的牛分枝杆菌卡介苗、草分枝杆菌或耻垢分枝杆菌或母牛分枝杆菌培养物滤液。10天后,用所述卵清蛋白基因转染EL4细胞(C57BL/6来源的T细胞淋巴瘤)的E.G7细胞再体外刺激脾细胞6天,因此表达卵清蛋白。然后分析所述脾细胞的非特异性杀伤EL4靶细胞或特异性杀伤E.G7表达卵清蛋白的细胞的能力。通过在杀伤分析前,用以标记(100μCi/2×106)EL4和E.G7细胞的51Cr的释放检测杀伤活性。采用以下公式将杀伤活性或细胞毒性活性表示为特异性裂解(%):
一般已知卵清蛋白特异性细胞毒性细胞只在用卵清蛋白和一种佐剂免疫的小鼠中才产生,而不会在单独用卵清蛋白免疫的小鼠中产生。
构成图7的图说明了各种母牛分枝杆菌来源的佐剂制剂对在C57BL/6小鼠中产生对卵清蛋白的细胞毒性T细胞的效应。如图7A所示,细胞毒性细胞在用(ⅰ)10μg,(ⅱ)100μg或(ⅲ)1mg高压灭菌的母牛分枝杆菌或(ⅳ)75μg母牛分枝杆菌培养物滤液免疫的小鼠中产生。图7B说明了细胞毒性细胞在用(ⅰ)1mg完整的高压灭菌的母牛分枝杆菌或(ⅱ)1mg去脂质和去糖脂的(DD-)母牛分枝杆菌免疫的小鼠中产生。如图7C(ⅰ)所示,细胞毒性细胞在用1mg完整高压灭菌的母牛分枝杆菌免疫的小鼠中产生;图7C(ⅱ)说明了用SDS从DD-母牛分枝杆菌中提取的母牛分枝杆菌可溶蛋白中的活性物质。图7C(ⅲ)说明了通过用蛋白酶解酶链霉蛋白酶处理,破坏了图7C(ⅱ)佐剂制剂中的活性物质。通过比较发现,100μgSDS提取的蛋白的免疫增强能力(图7C(ⅱ))明显强于1mg完整的高压灭菌母牛分枝杆菌(图7C(ⅰ))。
用1mg热灭活的母牛分枝杆菌免疫的小鼠(图7D(ⅰ))产生对卵清蛋白的细胞毒性细胞,但是单独用1mg热灭活的结核分枝杆菌(图7D(ⅱ))、1mg牛分枝杆菌卡介苗(图7D(ⅲ))、1mg草分枝杆菌(图7D(ⅳ))或1mg耻垢分枝杆菌(图7D(ⅴ))免疫的小鼠不能产生细胞毒性细胞。
这些发现说明了,热灭活的母牛分枝杆菌和DD-母牛分枝杆菌具有在其它分枝杆菌中未见到的佐剂特性。而且,母牛分枝杆菌的去脂质作用和去糖脂作用消除了NK细胞刺激活性,但是不会导致T细胞刺激活性的丧失。
在单独的试验中,用卵清蛋白加200μg耗尽分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的DD-母牛分枝杆菌免疫的小鼠也能够产生细胞毒性细胞(与单独用卵清蛋白免疫的对照小鼠特异性裂解<8%相比,其最大特异性裂解为28%-46%)。
通过等电聚焦分级分离上述的母牛分枝杆菌培养物滤液,并分析所述分离流分在上述C57BL/6小鼠中抗卵清蛋白特异性细胞毒性应答测定中的佐剂活性。在对应于pI4.2-4.32(分离流分第7-9号)、4.49-4.57(分离流分第13-17号)和4.81-5.98(分离流分第23-27号)的分离流分中证实了峰值佐剂活性。用抗体鉴定DD-母牛分枝杆菌中的蛋白
腹膜内注射50μgDD-母牛分枝杆菌,每周一次,连续5周,免疫BALB/c小鼠。在第6周时处死小鼠并收集其血清。用标准酶联免疫测定测试血清中对如下制备的重组母牛分枝杆菌衍生的蛋白的抗体。
所述抗血清既不与几种母牛分枝杆菌重组蛋白反应也不与卵清蛋白反应,所述卵清蛋白用作酶联测定中的不相关的阴性对照蛋白(数据未显示)。得自用DD-母牛分枝杆菌免疫的小鼠的抗血清与12种母牛分枝杆菌来源的GV抗原反应。结果示于以下的表12中。因此,所述抗血清鉴定了存在于DD-母牛分枝杆菌中的GV3、5P、5、7、9、22B、24、27、27A、27B、33和45。
表12DD-母牛分枝杆菌抗血清与母牛分枝杆菌来源的GV抗原的反应性 *表示为显示活性高于得自非免疫小鼠的血清的、DD-母牛分枝杆菌免疫小鼠的血清的最大稀释度。通过T细胞应答鉴定DD-母牛分枝杆菌中的蛋白
在BALB/c小鼠的足垫注射100μgDD-母牛分枝杆菌和不完全弗氏佐剂,10天后处死小鼠以获得腘淋巴结细胞。体外用重组母牛分枝杆菌衍生的GV蛋白刺激免疫小鼠和非免疫对照小鼠的细胞。3天后,评价细胞增殖和IFNγ的产生。得自DD-母牛分枝杆菌免疫小鼠的淋巴结细胞对GV蛋白的T细胞增值应答
得自DD-母牛分枝杆菌免疫小鼠的淋巴结细胞在应答不相关蛋白卵清蛋白中不发生增殖(数据未显示)。如表13中所示,得自免疫小鼠的淋巴结细胞显示出对GV3、7、9、23、27、27B和33的增殖性应答。得自非免疫小鼠的相应的细胞显示出在应答这些GV蛋白中不发生增殖,说明已经用这些蛋白免疫了DD-母牛分枝杆菌免疫的小鼠。因此,所述母牛分枝杆菌衍生的蛋白GV3、7、9、23、27、27B和33可能存在于DD-母牛分枝杆菌中。
表13得自DD-母牛分枝杆菌免疫小鼠和对照小鼠的淋巴结细胞对GV蛋白的体外增殖性应答 *刺激指数=在GV蛋白存在下氚标记胸苷摄取的cpm/不存在GV蛋白时的cpm在用GV蛋白体外攻击后DD-母牛分枝杆菌免疫小鼠的淋巴结细胞的IFNγ产生
得自非免疫小鼠的淋巴结细胞在用GV蛋白刺激时不产生IFNγ。如以下表14所示,得自DD-母牛分枝杆菌免疫小鼠的淋巴结细胞当用GV3、5、23、27A、27B、33、45或46刺激时以剂量依赖方式分泌IFNγ,提示已经用这些蛋白免疫了所述小鼠。当用不相关蛋白卵清蛋白刺激得自免疫小鼠的细胞时没有检测到IFNγ的产生(数据未显示)。因此,蛋白GV3、5、23、27、27B、33、45或46可能存在于DD-母牛分枝杆菌中。
在后续的试验中,5种蛋白GV27、27A、27B、23和45用作非特异性免疫增强剂与卵清蛋白抗原一起按上述实施例6中所述免疫小鼠。如图12所示,50μg的重组蛋白GV27、27A、27B、23和45中的任何一种当与50-100μg卵清蛋白一起注射时,在能够产生对卵清蛋白的细胞毒性细胞方面证实了佐剂特性。
实施例9高压灭菌的母牛分枝杆菌产生针对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的细
胞毒性CD8 T细胞
该实施例说明了灭活的母牛分枝杆菌刺激优先杀伤已经用结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的细胞毒性CD8 T细胞的能力。
通过腹膜内注射500μg如实施例1所述制备的灭活母牛分枝杆菌来免疫小鼠。免疫后2周,使免疫小鼠的脾细胞通过CD8 T细胞的富集柱(R&D Systems,St.Paul,MN,USA)。已经表明从该柱回收的脾细胞富集至高达90%的CD8 T细胞。测试这些T细胞以及得自非免疫小鼠脾的CD8 T细胞杀伤未感染的巨噬细胞或已经用结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的能力。
在小鼠已经腹膜内给予1ml 3%硫乙醇酸酯后5天,从小鼠腹膜腔获得巨噬细胞。所述巨噬细胞用结核分枝杆菌以2个分枝杆菌/巨噬细胞的比率感染过夜。所有巨噬细胞制剂均用51Cr以2μCi/104巨噬细胞进行标记。然后将所述巨噬细胞与CD8 T细胞以杀伤细胞:靶细胞的30∶1比率培养过夜(16小时)。通过释放的51Cr检测特异性杀伤,并按实施例5计算表示为特异性裂解(%)。
CD8 T细胞与巨噬细胞共培养3天后IFN-γ的产生及其在培养基中的释放用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定。ELISA板用针对小鼠IFN-γ的大鼠单克隆抗体(Pharmigen,San Diego,CA,USA)的PBS溶液于4℃包被4小时。用含有0.2%吐温20的PBS在室温下封闭各孔1小时。然后将所述板在含有0.2%吐温20的PBS中洗涤4次,将ELISA板的培养基中以1∶2稀释的样品于室温下温育过夜。再次洗涤所述板,并且每孔中加入在PBS中稀释为1μg/ml的生物素酰化的单克隆大鼠抗小鼠IFN-γ抗体(Pharmigen)。然后在室温下将所述板温育1小时,洗涤,以在PBS中1∶4,000稀释度加入辣根过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白D(Sigrma A-3151)。在室温下再温育1小时后,洗涤板并加入OPD底物。10分钟后用10%(v/v)盐酸终止反应。于490nm测定光密度。两个复份的OD均高于单独在培养基中培养的细胞的平均OD值2倍的流分被认为是阳性。
如表15所示,得自用母牛分枝杆菌免疫小鼠的脾的CD8 T细胞对用结核分枝杆菌感染的巨噬细胞具有细胞毒性,但是不会裂解未感染的巨噬细胞。得自非免疫小鼠的CD8 T细胞不会裂解巨噬细胞。得自未经实验的小鼠或非免疫小鼠的CD8 T细胞当与感染的巨噬细胞共培养时的确产生IFN-γ。在共培养物中产生的IFN-γ量高于得自母牛分枝杆菌免疫小鼠的CD8 T细胞。
表15关于结核分枝杆菌感染的巨噬细胞和未感染的巨噬细胞的作用
CD8T细胞 | 巨噬细胞的特异性裂解(%) | [FN-γ(ng/ml) | ||
未感染 | 感染 | 未感染 | 感染 | |
对照 | 0 | 0 | 0.7 | 24.6 |
母牛分枝杆菌免疫 | 0 | 95 | 2.2 | 43.8 |
实施例10
得自母牛分枝杆菌培养物滤液的多肽的纯化和特征鉴定
该实施例说明了从培养物滤液制备母牛分枝杆菌可溶性蛋白。除非另有说明,否则在以下实施例中的所有百分率均为重量/体积。
将母牛分枝杆菌(ATCC第15483号)在无菌培养基90中于37℃培养。离心收获细胞,并将其转移到含有葡萄糖的无菌Middlebrook 7H9培养基中于37℃培养1天。然后离心培养基(留下大量细胞),通过0.45μm滤膜过滤到无菌的瓶中。
冻干浓缩所述培养物滤液,并再溶解于MilliQ水中。通过0.45μm滤膜过滤去除少量的不溶性物质。在含有3kDa分子量截留(MWCO)膜的400ml Amicon搅拌池中通过膜过滤,对所述培养物滤液进行脱盐。用氮气将压力维持于50psi。通过膜过滤重复浓缩所述培养物滤液,并以水稀释直到所述样品的传导率小于1.0mS。该步骤将20l体积减小至约50ml。用Bradford蛋白测定(Bio-Rad,Hercules,CA,美国)测定蛋白浓度。
所述脱盐的培养物滤液在用10mM Tris HCl缓冲液pH8.0平衡的Q-Sepharose(Pharmacia Biotech,Uppsala,瑞典)(16×100mm)柱上通过离子交换层析进行分级分离。用在上述缓冲液系统中的0-1.0MNaCl线性梯度洗脱多肽。于280nm波长下监测柱洗脱液。
在含有3kDa MWCO膜的400ml Amicon搅拌池中浓缩从所述离子交换柱洗脱的合并的多肽。用氮气将压力维持于50psi。通过膜过滤重复浓缩所述多肽,并用1%甘氨酸稀释直到所述样品的传导率小于0.1mS。
然后在Rotofor设备(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中通过制备性等电聚焦分级分离所述纯化多肽。用含有1.6%pH3.5-5.0两性电解质和0.4% pH5.0-7.0两性电解质的两性电解质混合物(Pharmacia Biotech)建立pH梯度。乙酸(0.5M)用作阳极电解液,而0.5M乙醇胺用作阴极电解液。按照生产商的说明在12W恒定功率下进行等电聚焦6小时。获得20种分级分离流分。
合并得自等电聚焦的流分,在Vydac C4柱(Separations Group,Hesperia,CA,USA)300埃孔径大小、5μm颗粒大小(10×250mm)上纯化所述多肽。用在0.05%(v/v)三氟乙酸(TFA)中线性梯度的乙腈(0-80%v/v)从所述柱洗脱多肽。流速为2.0ml/min,并在220nm监测HPLC洗脱液。收集含有多肽的流分以使各个样品的纯度最大。
在Vydac C4柱(Separations Group)300埃孔大小、5μm颗粒大小(4.6×250mm)上再层析纯化较多多肽的流分。以1.0ml/min流速用在0.05%(v/v)TFA中的线性梯度的20-60%(v/v)的乙腈从所述柱洗脱多肽。于220nm监测柱洗脱液。收集含有所洗脱多肽的流分以使各个样品的纯度最大。获得约20个多肽样品,按照Laemmli的方法(Laemmli,U.K.,Nature 277:680-685,1970)在聚丙烯酰胺凝胶上分析它们的纯度。
用Mono Q柱(Pharmacia Biotech)10μm颗粒大小(5×50mm)或Vydac Diphenyl柱(Separations Group)300埃孔大小、5μm颗粒大小(4.6×250mm)进一步纯化表明含有明显杂质的多肽流分。用在10mM TrisHCl pH8.0中线性梯度0-0.5M NaCl从Mono Q柱洗脱多肽。用在0.1%TFA中的线性梯度的乙腈(20-60% v/v)从Vydac Diphenyl柱洗脱多肽。流速为1.0ml/min,并于220nm监测两个柱的柱洗脱液。收集所述多肽的峰流分,在如上所述的15%聚丙烯酰胺凝胶上分析纯度。
为了测序,将所述多肽各自干燥在BiobreneTM(Perkin Elmer/Applied BioSystems Division,Foster City,CA)处理的玻璃纤维滤膜上。将含有多肽的滤膜上样至Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492蛋白测序仪,采用传统的Edmam化学从氨基末端对所述多肽进行测序。通过比较PTH氨基酸衍生物对于合适的PTH衍生物标准的保留时间,确定每一多肽的氨基酸序列。
此外,通过用末端蛋白酶Lys-C消化所述抗原或用溴化氰化学切割所述抗原,测定某些抗原的内部序列。在Vydac C18柱上用0.05%(v/v)三氟乙酸和含有0.05%(v/v)TFA的乙腈梯度的流动相(1%/min),通过反相HPLC分离这两种方法之一产生的肽。在214nm监测所述洗脱液。用其UV吸光度鉴定主要内部肽,并如上所述检测其N-末端序列。
采用上述方法,分离出称为GVc-1、GVc-2、GVc-7、GVc-13、GVc-20和GVc-22的6种可溶性母牛分枝杆菌抗原。所测定的GVc-1的N-末端序列和内部序列分别示于SEQ ID NO:1、2和3;GVc-2的N-末端序列示于SEQ ID NO:4;GVc-7的内部序列示于SEQ ID NO:5-8;GVc-13的内部序列示于SEQ ID NO:9-11;GVc-20的内部序列示于SEQ ID NO:12;和GVc-22的N-末端序列和内部序列分别示于SEQID NO:56-59。本文所提供的每个内部肽序列起始于根据溴化氰(Met)或Lys-C(Lys)已知的切割特异性推导存在于所述多肽的该位置的氨基酸残基。
除了上述的制备性等电聚焦方法外,采用制备性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化步骤,分离出另外3种称为GVc-16、GVc-18和GVc-21的多肽。更准确地说,在15%聚丙烯酰胺凝胶上通过制备性SDS-PAGE纯化含有得自上述制备性等电聚焦纯化步骤的多肽混合物的流分。将所述样品溶解于还原样品缓冲液中,并加样于所述凝胶。通过在含有10%(v/v)甲醇的10mM 3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)缓冲液pH11中进行电印迹,将所分离的蛋白转移至聚二氟乙烯(PVDF)膜上。用考马斯蓝染色所述PVDF膜鉴定所转移的蛋白带。切出含有最大丰度多肽种类的PVDF膜区域,直接加入Perkin Elmer/Applied BioSystems Procise 492蛋白测序仪的样品柱。如上所述测定蛋白序列。GVc-16、GVc-18和GVc-21的N-末端序列分别示于SEQ ID NO:13、14和15。
除了上述的层析方法外,采用制备性SDS-PAGE纯化步骤,分离出称为GVc-12、GVc-14、GVc-15、GVc-17和GVc-19的另外的抗原。更准确地说,在聚丙烯酰胺凝胶上通过制备性SDS-PAGE分级分离含有得自上述Vydac C4 HPLC纯化步骤的抗原混合物的流分。将所述样品溶解于非还原样品缓冲液中,并加样于所述凝胶。通过在含有10%(v/v)甲醇的10mM CAPS缓冲液pH11中进行电印迹将所分离的蛋白转移至PVDF膜上。用考马斯蓝染色所述PVDF膜来鉴定所转移的蛋白带。切出含有最大丰度多肽种类的PVDF膜区域,直接加入PerkinElmer/Applied BioSystems Procise 492蛋白测序仪的样品柱。如上所述测定蛋白序列。GVc-12、GVc-14、GVc-15、GVc-17和GVc-19的测定的N-末端序列分别示于SEQ ID NO:16-20。
采用GeneAssist系统将所有上述氨基酸序列与SwissProt数据库(R32版)中的已知氨基酸序列比较。对氨基酸序列GVc-2至GVc-22未获得某些显著的同源性。发现GVc-1的氨基酸序列与以前自牛分枝杆菌和结核分枝杆菌鉴定的序列具有一定的相似性。尤其是发现GVc-1与一种细胞表面蛋白结核分枝杆菌MPT83以及MPT70具有一定的同源性。这些蛋白构成一个蛋白家族的部分(Harboe等,Scand.J.Immunol.42∶46-51,1995)。
后续研究导致分离了GVc-13、GVc-14和GVc-22的DNA序列(分别为SEQ ID NO:142、107和108)。GVc-13、GVc-14和GVc-22的相应的所推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:143、109和110。所测定的编码GVc-13的全长基因的DNA序列示于SEQ ID NO:195,而相应的所推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:196。
用GVc-22的进一步研究提示克隆了仅一部分的编码GVc-22的基因。当亚克隆入表达载体pET16时,没有获得蛋白表达。用不完整的基因片段随后筛选母牛分枝杆菌BamHI基因组DNA文库,使得分离了编码GVc-22的完整的基因。为了区别全长克隆和部分的GVc-22,将全长基因表达的抗原称为GV-22B。所测定的编码GV-22B的基因的核苷酸序列和所推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:144和145。
由GVc-1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和结核分枝杆菌MPT70基因序列设计了扩增引物AD86和AD112(分别为SEQ ID NO:60和61)。用这些引物从母牛分枝杆菌基因组DNA扩增310bp片段,并将其克隆入EcoRV-消化的载体pBluescript Ⅱ SK+(Stratagene)。所克隆的插入片段的序列示于SEQ ID NO:62。该克隆的插入片段用来筛选在λZAP-Express(Stratagene,La Jolla,CA)中构建的母牛分枝杆菌基因组DNA文库。所分离的克隆含有与结核分枝杆菌抗原MPT83同源的可读框,并将其重命名为GV-1/83。该基因与牛分枝杆菌抗原MPB83也具有同源性。所测定的核苷酸序列和所推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:146和147。
根据示于SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列设计了简并的寡核苷酸EV59和EV61(分别为SEQ ID NO:148和149)。采用PCR扩增了100bp的片段,克隆入质粒pBluescript Ⅱ SK+并按照标准方法(Sambrook等,同上)测序(SEQ ID NO:150)。所克隆的插入片段用来筛选在λZAP-Express中构建的母牛分枝杆菌基因组DNA文库。所分离的克隆与结核分枝杆菌抗原MPT70和牛分枝杆菌抗原MPB70具有同源性,命名为GV-1/70。GV-1/70的所测定的核苷酸序列和所推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:151和152。
将编码GV1/83、GV1/70、GVc-13、GVc-14和GV-22B的基因亚克隆入表达载体pET16(Novagen,Madison,WI)以进行表达和纯化。按照生产商的方案进行表达和纯化。
根据在得自免疫人类供体外周血中诱导T细胞增殖和IFN-γ的能力筛选所纯化的多肽。已知这些供体是PPD(得自结核分枝杆菌的纯化的蛋白衍生物)皮肤试验阳性,表示其T细胞在应答PPD中产生增殖。在包含添加10%(v/v)自体血清、青霉素(60μg/ml)、链霉素(100μg/ml)和谷胺酰胺(2mM)的RPMI1640的培养基中培养供体PBMC和得自母牛分枝杆菌培养物滤液的粗的可溶性蛋白。
3天后,从每个孔取出50μl培养基以如下所述检测IFN-γ水平。将所述板再培养4天,然后再用氚标记的胸苷1μCi/孔施以脉冲处理48小时,收获细胞,用闪烁计数器测定氚的摄取。在复份中刺激增殖均较在单独用培养基培养的细胞中观察到的增殖高2倍的流分被认为是阳性。
用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定IFN-γ。ELISA板用针对人IFN-γ的小鼠单克隆抗体(Endogen,Wobural,MA)1μg/ml的磷酸缓冲盐溶液(PBS)于4℃包被4小时。用含有0.2%吐温20的PBS在室温下封闭各孔1小时。然后将所述板在PBS/0.2%吐温20中洗涤4次,在ELISA板的培养基中以1∶2稀释的样品于室温下温育过夜。再次洗涤所述板,于每孔加入在PBS中稀释为1μg/ml的生物素酰化的多克隆兔抗人IFN-γ血清(Endogen)。然后在室温下将所述板温育1小时,洗涤,加入在PBS中以1∶4,000稀释度的辣根过氧化物酶偶联的抗生物素蛋白A(Vector Laboratories,Burlingame,CA)。在室温下再温育1小时后,洗涤所述板并加入邻苯二胺(OPD)底物。10分钟后用10%(v/v)盐酸终止反应。于490nm测定光密度(OD)。两个复份的OD均较在单独的培养基中培养细胞的平均OD值高2倍的流分被认为是阳性。
含有刺激外周血单核细胞(PBMC)T细胞增殖和产生IFN-γ的序列的多肽的实例示于表16,其中(-)表示缺乏活性,(+/-)表示结果较对照培养基的背景活性高不足2倍的多肽,(+)表示活性高于背景2-4倍的多肽,(++)表示活性高于背景4倍以上的多肽。
表16
抗原 增殖 IFN-γ
GVc-1 ++ +/-
GVc-2 + ++
GVc-7 +/- -
GVc-13 + ++
GVc-14 ++ +
GVc-15 + +
GVc-20 + +
实施例11通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化和特征鉴定得自母牛分枝杆菌培养
物滤液的多肽
如下所述用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳从培养物滤液分离母牛分枝杆菌可溶性蛋白。除非另有说明,以下实施例中的所有百分率均为重量/体积。
在无菌培养基90中于37℃培养母牛分枝杆菌(ATCC第15483号)。在含有吐温80和油酸/白蛋白/葡萄糖/催化酶添加物的无菌Middlebrook 7H9培养基(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)中培养结核分枝杆菌菌株H37Rv(ATCC第27294号)。离心收获细胞,并转移入含有葡萄糖的无菌Middlebrook 7H9培养基于37℃培养1天。然后离心培养基(留下大量细胞)并通过0.45μm滤膜过滤到无菌瓶中。通过冷冻干燥浓缩所述培养物过滤物,再溶解于MilliQ水中。通过0.45μm膜滤器过滤去除少量的不溶性物质。
在含有3kDa MWCO膜的400ml Amicon搅拌池中通过膜过滤对所述培养物滤液进行脱盐。用氮气将压力维持于60psi。通过膜过滤重复浓缩所述培养物滤液,并以水稀释直到所述样品的传导率小于1.0mS。该方法将20l体积降低至约50ml。用Bradford蛋白测定(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)测定蛋白浓度。
所述脱盐的培养物滤液在用10mM Tris HCl缓冲液pH8.0平衡的Q-Sepharose(Pharmacia Biotech)(16×100mm)柱上通过离子交换层析进行分级分离。用在上述缓冲液系统中的0-1.0M NaCl线性梯度洗脱多肽。于280nm波长下监测柱洗脱液。
通过制备性双向凝胶电泳对从所述离子交换柱洗脱的多肽库进行分级分离。在8M尿素中制备含有200-500μg多肽的样品,加样于聚丙烯酰胺等电聚焦棒状凝胶(直径2mm,长150mm,pH5-7)。在等电聚焦步骤之后,第一向凝胶用还原缓冲液平衡,并上样于第2向凝胶(16%聚丙烯酰胺凝胶)上。通过在含有10%(v/v)甲醇的10mMCAPS缓冲液pH11中进行电印迹,将得自于第二向分离的多肽转移至PVDF膜上。用考马斯蓝染色所述PVDF膜的蛋白。切出含有目的多肽的PVDF膜区域,直接加入Perkin Elmer/Applied BioSystemsProcise 492蛋白测序仪的样品柱。采用传统的Edmam化学从氨基末端对所述多肽进行测序。通过比较PTH氨基酸衍生物对于合适的PTH衍生物标准的保留时间,确定每一多肽的氨基酸序列。采用这些方法,分离出称为GVs-1、GVs-3、GVs-4、GVs-5、GVs-6、GVs-8、GVs-9、GVs-10、GVs-11、GV-34和GV-35的11种多肽。所测定的这些肽的N-末端序列分别示于SEQ ID NO:21-29、63和64。用上述纯化方法,纯化更多的蛋白,延伸先前获得的GVs-9的氨基酸序列。所延伸的GVs-9的氨基酸序列示于SEQ ID NO:65。进一步的研究导致分离了GVs-9(SEQ ID NO:111)和GV-35(SEQ ID NO:155)的DNA序列。相应的所推定氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:156。所延伸的GVs-9的DNA序列示于SEQ ID NO:153,而相应的所推定氨基酸序列示于SEQ ID NO:154。在SEQ ID NO:197中已经修正了GVs-9的所推定氨基酸序列。
将所有这些氨基酸序列与SwissProt数据库(R35版加修改)中的已知氨基酸序列比较。除了GVs-3、GVs-4、GVs-5和GVs-9外,未获得明显同源性。发现GVs-9与以前鉴定的2种结核分枝杆菌蛋白即结核分枝杆菌cutinase前体和推测的结核分枝杆菌22.6kDa蛋白具有一定的同源性。发现GVs-3、GVs-4和GVs-5与得自麻风分枝杆菌(分别为SEQ ID NO:30和31)、结核分枝杆菌(分别为SEQ ID NO:32和33)和牛分枝杆菌(分别为SEQ ID NO:34和35)的抗原85A和85B蛋白以及得自麻风分枝杆菌(SEQ ID NO:36)和结核分枝杆菌(SEQ ID NO:37)的抗原85C蛋白具有一定的相似性。
实施例12
母牛分枝杆菌抗原85系列的DNA克隆策略
采用针对在给定的分枝杆菌菌种中的家族成员之间和在分枝杆菌菌种之间保守的抗原85基因组序列的区域设计的简并寡核苷酸(SEQ ID NO:38和39),通过聚合酶链式反应(PCR)制备抗原85A、85B和85C的探针。这些寡核苷酸在还原的严格条件下用来从母牛分枝杆菌基因组DNA扩增靶序列。鉴定、纯化合适大小的485bp带,并克隆入加T尾的pBluescript Ⅱ SK(Stratagene,La Jolla,CA)中。随机筛选24个存在抗原85PCR产物的单独的菌落,然后采用PerkinElmer/Applied BioSystems 377型自动测序仪和基于M13的引物T3和T7测序。GenBank数据库的同源性检索表明,23个克隆含有与得自结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的公开的抗原85基因具有明显同源性的插入片段。约1/2与抗原85C基因序列具有最大同源性,而其余部分更相似于抗原85B序列。另外,这两种推定的母牛分枝杆菌抗原85基因组序列80%彼此同源。因为这种高度相似性,所以选择抗原85C PCR片段来在低严格性下筛选母牛分枝杆菌基因组文库中的所有3种抗原85基因。
通过将BamHI部分消化的母牛分枝杆菌基因组DNA克隆入同样消化的λ载体,在λZap-Express(Stratagene,La Jolla,CA)中产生母牛分枝杆菌基因组文库,产生3.4×105独立的噬菌斑形成单位。为了筛选,以低密度将得自该非扩增的文库的27,000个噬菌斑平板接种在8个100mm2平板上。对于每个板,将复份的噬菌斑影印物转移至Hybond-N+尼龙膜(Amersham International,英国)上,并在降低的严格条件(55℃)下杂交至放射性标记的抗原85C PCR产物。放射性自显影证实,在这些条件下79个噬菌斑一致地与抗原85C探针杂交。随机选择13个阳性杂交噬菌斑用于进一步分析,并从所述文库平板取出,每个阳性克隆用来产生含有约200个噬菌斑的次级筛选平板。用Hybond-N+尼龙膜进行每个的复份转移,在初次筛选中所用的条件下杂交。在所筛选的13个平板的每一个上鉴定了多个阳性杂交噬菌斑。从每个次级板上挑选出2个良好分离的阳性噬菌斑用于进一步的分析。采用体外切割,将26个噬菌斑转入噬菌粒并进行限制酶切作图。根据该作图可以将克隆分为4类。采用Perkin Elmer/Applied BioSystems 377型自动测序仪和T3及T7引物,获得得自每组的数个代表的插入片段的5’和3’端的序列数据。用BLASTN分析EMBL数据库确定序列的同源性。发现这两组克隆中的2个与牛分枝杆菌和结核分枝杆菌抗原85A基因同源,每个含有母牛分枝杆菌基因的5’或3’端(因为它含有一个内部的BamHI位点,所以在文库构建中该基因被切割)。发现其余的克隆含有与得自许多分枝杆菌菌种的抗原85B和85C同源的序列。为了测定每个基因其余的核苷酸序列,构建并测序合适的亚克隆。用DNA Strider软件对重叠序列进行序列对比。所测定的母牛分枝杆菌抗原85A、85B和85C的DNA序列分别示于SEQ ID NO:40-42,所推定氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:43-45。
如下表达并纯化母牛分枝杆菌抗原GVs-3和GVs-5。采用推定的前导序列和所述克隆的3’端下游的序列数据,由GVs-3和GVs-5的插入片段序列(分别为SEQ ID NO:40和42)设计扩增引物。GVs-3的引物的序列示于SEQ ID NO:66和67,GVs-5的引物的序列示于SEQID NO:68和69。将XhoI限制性位点加入GVs-3的引物,将EcoRI和BamHI限制性位点加入GVs-5的引物以便于进行克隆。由基因组母牛分枝杆菌DNA扩增后,将片段克隆入pProEX HT原核表达载体(Gibco BRL,Life Technologies,Gaithersburg,MD)的合适位点,经测序证实正确的读框和方向。按照生产商的方案进行重组蛋白的表达和纯化。
如下进行母牛分枝杆菌抗原GVs-4的片段(抗原85B同系物)的表达。如上所述的引物AD58和AD59用来从母牛分枝杆菌基因组DNA扩增485bp片段。该片段用标准技术凝胶纯化并克隆入含有加入dTTP残基的EcoRV-消化的pBluescript中。测定得自5个克隆的插入片段的碱基序列并发现彼此相同。这些插入片段与得自结核分枝杆菌的Ag85B具有最大同源性。将克隆之一的插入片段亚克隆入pProEX HT原核表达载体(Gibco BRL)的EcoRI/XhoI位点,按照生产商的方案表达纯化。因为仅所述基因的一部分表达,所以将该克隆重命名为GV-4P。该部分克隆GV-4P的氨基酸序列和DNA序列分别示于SEQ ID NO:70和106。
类似于GV-4P的克隆,扩增引物AD58和AD59用来由含有GVs-5(SEQ ID NO:42)的克隆扩增485bp片段。将该片段克隆入表达载体pET16并命名为GV-5P。所测定的GV-5P的核苷酸序列和推定氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:157和158。
在后续研究中,用类似于上述的方法,将GVs-3、GV-4P和GVs-5再克隆入替代载体pET16(Novagen,Madison,WI)。
如上所述分析纯化的重组GVs-3、GV-4P和GVs-5在得自PPD-阳性健康供体的人PBL中刺激T细胞增殖和干扰素-γ产生的能力。该分析的结果示于表17,其中(-)表示缺乏活性,(+/-)表示结果较对照培养基的背景活性高不足2倍的多肽,(+)表示活性高于背景2-4倍的多肽,(++)表示活性高于背景4倍以上的多肽。
表17
实施例13母牛分枝杆菌抗原的DNA克隆策略
用针对测定的GVc-7的氨基酸序列设计的简并寡核苷酸(SEQ IDNO:5-8),扩增母牛分枝杆菌抗原GVc-7的84bp探针。该探针用来按实施例12中所述筛选母牛分枝杆菌基因组DNA文库。测定的GVc-7的核苷酸序列示于SEQ ID NO:46,推定的氨基酸示于SEQ ID NO:47。比较这些序列与数据库的序列显示,与推定的15.8kDa结核分枝杆菌膜蛋白同源。
SEQ ID NO:46的序列用来采用所述推定的前导序列下游的序列资料设计表达克隆GVc-7基因的扩增引物(示于SEQ ID NO:71和72)。将XhoI限制性位点加入引物以便于进行克隆。由基因组母牛分枝杆菌DNA扩增后,将片段克隆入pProEX HT原核表达载体(GibcoBRL)的XhoI位点,经测序证实正确的读框和方向。按照生产商的方案进行融合蛋白的表达和纯化。在随后研究中,将GVc-7再克隆入载体pET16(Novagen)中。
如上所述分析纯化的重组GVc-7在得自PPD-阳性健康供体的人PBL中刺激T细胞增殖和干扰素-γ产生的能力。结果示于表18,其中(-)表示缺乏活性,(+/-)表示结果较对照培养基的背景活性高不足2倍的多肽,(+)表示活性高于背景2-4倍的多肽,(++)表示活性高于背景4倍以上的多肽。
表18
供体 | 增殖 | 干扰素-γ |
G97005 | ++ | +/- |
G97008 | ++ | + |
G97009 | + | +/- |
G97010 | +/- | ++ |
针对示于SEQ ID NO:26的GVs-8肽序列设计丰余的寡核苷酸探针(SEQ ID NO 73;称为MPG15),用来利用标准方案筛选母牛分枝杆菌基因组DNA文库。分离出含有编码4种不同抗原的基因的2种基因组克隆。测定的GVs-8A(重命名为GV-30)、GVs-8B(重命名为GV-31)、GVs-8C(重命名为GV-32)和GVs-8D(重命名为GV-33)的DNA序列分别示于SEQ ID NO:48-51,相应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:52-55。GV-30含有与已知原核生物的缬氨酰基-tRNA合成酶显示一定相似性的区段;GV-31显示与耻垢分枝杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶基因具有一定的相似性;GV-32显示与流感嗜血杆菌(H.Influentza)叶酰多谷氨酸合酶基因具有一定相似性。GV-33含有显示与以前在结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌中鉴定的序列具有一定的相似性的可读框,但是仍未鉴定其功能。
所测定的GV-33的部分DNA序列示于SEQ ID NO:74,而相应的推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:75。所述充隆的3’末端的序列数据显示同源于先前鉴定的结核分枝杆菌的40.6 kDa外膜蛋白。随后的研究使得分离了GV一33的全长DNA序列(SEQ ID NO:193)。相应的推定的氨基酸序列示于SEO ID NO:194。
用基于所测定的核苷酸序列的引物由母牛分枝杆菌基因组DNA扩增编码GV-33的基因。将该DNA片段克隆入EcoRI消化的pBllIescriptII SK+(Stratagene),然后转移到pETl6表达载体。按照生产商的方案纯化重组蛋白。
如上所述分析纯化的重组GV-33在人PBL中刺激T细胞增殖和刺激干扰索一γ产生的能力。结果示于表19,其中(-)表示缺乏活性,(+/-)表示结果较对照培养基的背景活性高不足2倍的多肽,(+)表示活性高于背景2-4倍的多肽,(++)表示活性高于背景4倍以上的多肽。
表19
多肽的刺激活性
供体 | 增值 | 干扰素-γ |
G97005 | ++ | + |
G97006 | ++ | ++ |
G97007 | - | +/- |
G97008 | +/- | - |
G97009 | +/- | - |
G97010 | +/- | ++ |
实施例14
从DD一母牛分枝杆菌分离蛋白
如实施例1中所述培养、离心沉淀和高压灭菌母牛分枝杆菌细菌,活母牛分枝杆菌的培养物滤液是指母牛分枝杆菌在含有葡萄糖的7H9培养甚中的24小时培养物的上清液。采用Virsonic声处理仪(Vinis,Disa,USA)在冰上进行30秒的4次冲击性超声处理高压灭菌的母牛分枝杆菌,制备去脂质形式的母牛分枝杆菌。然后离心(9000rpm,20分钟,JA10转头,制动(brake)=5)所述物质。所得的沉淀物再浮于100ml氯仿/甲醇(2∶1),在室温下温育1小时,再离心,重复所述氯仿/甲醇提取。离心获得的沉淀物,真空干燥,称重,以5mg(干重)/ml的去脂质母牛分枝杆菌再悬浮于PBS中。
在50%(v/v)乙醇中回流2小时由去脂质母牛分枝杆菌制剂去除糖脂。离心(10,000rpm,JA20转头,15分钟,制动(brake)=5)收集不溶性物质。再重复两次回流下用50%(v/v)乙醇的提取。离心收集不溶性物质,在PBS中洗涤。于56℃将所述沉淀物再悬浮于2%SDS的PBS中2小时,从而提取蛋白。离心收集不溶性物质,再重复两次于56℃用2%SDS/PBS的提取。将合并的SDS提取物冷却至4℃,离心(10,000rpm,JA20转头,15分钟,制动(brake)=5)去除沉淀的SDS。通过加入等体积的丙酮和于-20℃温育2小时,从所述上清液中再沉淀蛋白。离心收集所沉淀的蛋白,在50%(v/v)丙酮中洗涤,真空干燥,再溶解于PBS中。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得自DD-母牛分枝杆菌的SDS-提取的蛋白。用银染色后观察到3个主要带。在随后的试验中,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析较大量的SDS提取蛋白。所述蛋白在用考马斯蓝染色时显示数条带。将分子量约30kDa带代表的蛋白命名为GV-45。所测定的GV-45的N-末端序列示于SEQID NO:187。分子量约14kDa的蛋白命名为GV-46。所测定的GV-46的N-末端序列示于SEQ ID NO:208。
在随后的研究中,在BioRad Prep Cell(Hercules,CA)上通过制备性SDS-PAGE制备了更多的上述SDS提取的蛋白。分析在上述的C57BL/6小鼠的抗卵清蛋白特异性细胞毒性应答检测中的佐剂活性之前,通过三氯乙酸沉淀相应分子量范围的部分从而去除SDS。佐剂活性在60-70kDa部分中最高。通过将SDS-PAGE印迹到聚二氟乙烯(PVDF)膜纯化该大小范围中最丰余的蛋白,然后测序。前10个氨基酸残基的序列示于SEQ ID NO:76。如上所述比较该序列和所述基因库的序列,显示与得自结核分枝杆菌的热激蛋白65(GroEL)基因同源,表明该蛋白是GroEL家族的母牛分枝杆菌成员。
用如上所述制备的母牛分枝杆菌分泌蛋白免疫短尾猴的血清,筛选在BamHl-λZAP-Express(Stratagene)中的母牛分枝杆菌基因组DNA的表达文库。用比色系统鉴定阳性噬菌斑。再筛选这些噬菌斑直至噬菌斑按照标准方法是纯的。按照生产商的方案在ExAssist辅助噬菌体存在下从λZAP Express(Stratagene)载体切取含有插入片段的pBK-CMV噬菌粒2-1。在Perkin Elmer/Applied BioSystems Division自动测序仪上用荧光引物采用Sanger测序,确定该克隆的插入片段5’端碱基序列,此后该序列称为GV-27。所测定的部分的母牛分枝杆菌GroEL同源克隆GV-27的核苷酸序列示于SEQ ID NO:77,所推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:78。发现该克隆与结核分枝杆菌GroEL具有同源性。Kapur等(Arch.Pathol.Lab.Med.119:131-138,1995)已经公开了母牛分枝杆菌的65kDa热激蛋白的部分序列。Kapur等片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO:79,所推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:80。
在随后的研究中获得了GV-27的延伸的(除了所推定的51个末端核苷酸外的全长)DNA序列。相应的推定氨基酸序列示于SEQ ID NO:114。进一步的研究导致分离了GV-27的全长DNA序列(SEQ ID NO:159)。相应的推定氨基酸序列示于SEQ ID NO:160。发现GV-27的93.7%氨基酸与结核分枝杆菌GroEL相同。
采用本领域公知的技术制备包括GV-27的N-末端序列(此后称为GV-27A)和羧基端序列(此后称为GV-27B)的两种肽片段。GV-27A和GV-27B的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116,相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO:117和118。随后的研究导致分离了GV-27B的延伸的DNA序列。该序列示于SEQ ID NO:161,相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO:162。GV-27A序列的95.8%相同于结核分枝杆菌GroEL序列,并含有上述Kapur等的较短的母牛分枝杆菌序列。GV-27B序列约92.2%与结核分枝杆菌HSP65的相应区相同。按照分离GV-27的相同方案,分离pBK-CMV噬菌粒3-1。该DNA编码的抗原命名为GV-29。所测定的该基因的5’端和3’端的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO:163和164,所推定的相应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:165和166。GV-29显示与酵母尿素酰胺酶(arnidolyase)同源。所测定的编码GV-29的全长基因的DNA序列示于SEQ ID NO:198,相应的推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:199。将编码GV-29的DNA亚克隆入载体pET16(Novagen,Madison,WI)以按照标准方案表达和纯化。
实施例15母牛分枝杆菌抗原GV-23、GV-24、GV-25、GV-26、GV-38A和GV-38B的DNA克隆策略
母牛分枝杆菌(ATCC第15483号)在无菌培养基90中于37℃生长4天,并离心收获。将细胞再悬浮于1ml Trizol(Gibco BRL,LifeTechnologies,Gaithersburg,Maryland),并按照生产商的标准方案提取RNA。结核分枝杆菌菌株H37Rv(ATCC第27294号)在含有吐温80和油酸/清蛋白/葡萄糖/催化酶添加物的无菌Middlebrook 7H9培养基(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)中于37℃生长,并在合适实验安全条件下收获细胞。将细胞再悬浮于1ml Trizol(Gibco BRL),并按照生产商的标准方案提取RNA。
通过将总RNA部分杂交至与结核分枝杆菌rRNA互补的寡核苷酸AD10和AD11(SEQ ID NO:81和82),从总结核分枝杆菌和母牛分枝杆菌RNA去除16S和23S核糖体RNA(rRNA)。根据Bottger(FEMSMicrobiol.Lett.65:171-176,1989)公开的分枝杆菌16S rRNA序列和保存在数据库中的序列设计这些寡核苷酸。通过将总RNA杂交至与固定在尼龙膜(HybondN,Amersharn International,英国)上的寡核苷酸AD10和AD11进行去除。重复杂交直到在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上见不到rRNA带为止。利用RNA连接酶将20个dATP残基组成的寡核苷酸AD12(SEQ ID NO:83)连接至富集mRNA的部分的3’端。用含有聚(dT)序列的寡核苷酸AD7(SEQ ID NO:84)按照标准方案进行第一链cDNA合成。
结核分枝杆菌和母牛分枝杆菌cDNA用作单侧特异性PCR(3S-PCR)的模板。根据保守的前导序列和膜蛋白序列设计简并寡核苷酸AD1(SEQ ID NO:85)用于该方案。用引物AD1作5’-引物和AD7作3’-引物扩增30个循环后,在尿素/聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。切取母牛分枝杆菌特有的DNA带,用引物AD1和AD7再扩增。凝胶纯化后,将各个带克隆入pGEM-T(Promega),并测定碱基序列。
用所测定的带12B21的核苷酸和推定的氨基酸序列(分别为SEQID NO:86和87)检索表明,它与Furuchi等(Jnl.Biol.Chem.266:20928-20933,1991)公开的编码亚精胺/腐胺ABC转运蛋白复合物的ATP结合蛋白的大肠杆菌pota基因同源。大肠杆菌的亚精胺/腐胺转运蛋白复合物包括4个基因,是ABC转运蛋白家族的一个成员。该ABC(ATP结合盒)转运蛋白通常包括4个基因:一个ATP结合基因、一个周质或底物结合基因和两个跨膜基因。所述跨膜基因编码每个的特征为具有6个跨膜区的蛋白。在流感嗜血杆菌(Fleischmann等,Science 269:496-512,1995)和生殖道支原体(Fraser等,Science,270:397-403,1995)的基因组中已经鉴定了该ABC转运蛋白的同系物(根据相似性)。
按照标准方案用放射性标记的238bp带12B21探测在BamHl-消化的λZAP Express(Stratagene)中构建的母牛分枝杆菌基因组DNA文库。通过重复筛选将噬菌斑纯化至纯,通过DNA印迹和杂交鉴定含有4.5kb插入片段的噬菌粒。通过亚克隆4.5kb片段和进行碱基测序鉴定pota(ATP结合蛋白)的全长母牛分枝杆菌同系物的核苷酸序列。该基因由1449bp组成,包括含有推定的-10和-35启动子元件的320bp的不翻译的5’区。母牛分枝杆菌pota同系物的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:88和89。
母牛分枝杆菌pota基因的核苷酸序列用来设计引物EV24和EV25(SEQ ID NO:90和91)以表达克隆。将所扩增的DNA片段克隆入pProEX HT原核生物表达系统(Gibco BRL),并通过加入0.6mM异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)从而诱导在合适的大肠杆菌宿主中表达。该重组蛋白命名为GV-23,并按照生产商的方案从包含体中纯化。在随后的研究中,将GV-23(SEQ ID NO:88)再克隆入替代载体pET16(Novagen)中。SEQ ID NO:89的氨基酸序列于残基34-41含有一个ATP结合位点。在SEQ ID NO:89的残基116-163中,具有发现于蛋白的ATP转运蛋白家族的保守区。这些发现提示GV-23是一个ATP结合蛋白。
在上述4.5kb插入片段的3’端的322bp Sall-BamHl亚克隆显示与大肠杆菌的亚精胺/腐胺ABC转运蛋白复合物的pota基因(周质蛋白)同源。该亚克隆的核苷酸序列示于SEQ ID NO:92。为了鉴定该基因,该亚克隆的放射性标记的插入片段用来按照标准方案探测在λZapExpress(Stratagene)的Sall-位点中构建的母牛分枝杆菌基因组文库。鉴定其1342bp显示与大肠杆菌的potd基因同源的克隆。通过亚克隆和碱基测序鉴定母牛分枝杆菌的potd同系物。所测定的核苷酸序列和所推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:93和94。
为了表达克隆,根据所测定的母牛分枝杆菌potd同系物设计引物EV-26和EV-27(SEQ ID NO:95-96)。将所扩增的片段克隆入pProEXHT原核生物表达系统(Gibco BRL)。通过加入0.6mM IPTG诱导在合适的大肠杆菌宿主中表达,该重组蛋白命名为GV-24。按照供应商的方案从包含体纯化重组抗原。在随后的研究中,将GV-24(SEQ ID NO:93)再克隆入替代的载体pET16(Novagen)。
为了改进所述纯化重组抗原的溶解性,采用扩增引物EV101和EV102(SEQ ID NO:167和168)将编码GV-24的基因但是不包括信号肽再克隆入所述表达载体。该构建物称为GV-24B。GV-24B的核苷酸序列示于SEQ ID NO:169,所推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:170。将该片段克隆入pET16以按照生产商的方案表达和纯化GV-24B。
如上所述测定纯化的重组蛋白GV-23和GV-24在人PBL中刺激T细胞增殖和干扰素-γ产生的能力。这些分析的结果示于表20,其中(-)表示缺乏活性,(+/-)表示结果较对照培养基的背景活性高不足2倍的多肽,(-)表示活性高于背景2-4倍的多肽,(++)表示活性高于背景4倍以上的多肽,ND表示未测定。
发现邻近母牛分枝杆菌potd基因同系物的碱基序列表现出与大肠杆菌的亚精胺/腐胺ABC转运蛋白复合物的potb基因同源,potb是ABC转运蛋白复合物中的两种跨膜蛋白之一。通过进一步的亚克隆和碱基测序鉴定母牛分枝杆菌potb同系物(称为GV-25)。所测定GV-25的核苷酸序列和所推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:97和98。
进一步亚克隆和碱基序列分析相邻的509bp不能表明与为大肠杆菌的第二种跨膜蛋白的PotC同源,说明在母牛分枝杆菌同系物中不存在ABC转运蛋白的第二种跨膜蛋白。然而,鉴定了起始于所述跨膜蛋白下游的530bp的与结核分枝杆菌乙酰CoA乙酰转移酶同源的可读框,该翻译的蛋白命名为GV-26。所测定的GV-26的部分核苷酸序列和所推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:99和100。
采用类似于上述分离GV-23的方案,3S-PCR带12B28(SEQ IDNO:119)用来筛选在λZAP Express(Stratagene)的BamHI-位点中构建的母牛分枝杆菌基因组文库。从该文库分离的克隆含有一种新的可读框,该基因编码的抗原命名为GV-38A。所测定的GV-38A的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:120和121。随后的研究导致分离了GV-38A延长的DNA序列,示于SEQ ID NO:171。相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO:172。比较这些序列和基因库中的序列,发现与以前在粘粒MTCY428.12中鉴定的未知结核分枝杆菌蛋白(SPTREMBL:P71915)具有一定的同源性。
鉴定了GV-38A基因上游的第二个新的可读框,该基因编码的抗原命名为GV-38B。所测定的GV-38B的5’和3’核苷酸序列分别示于SEQ ID NO:122和123,相应的推定氨基酸序列分别示于SEQ IDNO:124和125。进一步的研究导致分离了GV-38B的全长DNA序列,示于SEQ ID NO:173。相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO:174。发现该蛋白与在粘粒MTCY428.1中鉴定的未知的结核分枝杆菌蛋白(SPTREMBL:P71914)具有一定的同源性。
扩增GV-38A和GV-38B抗原以表达克隆入pET16(Novagen)。用引物KR11和KR12(SEQ ID NO:126和127)扩增GV-38A,用引物KR13和KR14(SEQ ID NO:128和129)扩增GV-38B。用1mM IPTG诱导在宿主细胞BL21(DE3)中表达蛋白,然而从这些构建物没有获得蛋白表达。在抗原GV-38A和GV-38B的N-末端中鉴定了可能抑制这些构建物表达的疏水区。在GV-38A中存在的疏水区被鉴定为具有6个跨膜区的可能的跨膜基元。为了表达不具有所述疏水区的抗原,设计了GV-38A的引物KR20(SEQ ID NO:130)和GV-38B的引物KR21(SEQ ID NO:131)。用引物KR20和KR12扩增截短的GV-38A基因,用引物KR21和KR14扩增截短的GV-38B基因。所测定的截短的GV-38A和GV-38B的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO:132和133,相应的推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:134和135。截短的GV-38A和GV-38B的延长的DNA序列分别示于SEQ ID NO:175和176,相应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:177和178。
实施例16通过制备性等电聚焦和制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳从母牛分枝杆菌培养物滤液纯化和特征鉴定多肽
如下所述采用制备性等电聚焦和制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳从培养物滤液分离母牛分枝杆菌可溶性蛋白。除非另作说明,在以下实施例中的所有百分率均为重量/体积。
在已经通过超滤分级分离去除所有分子量高于10kDa的蛋白的250l无菌培养基90中培养母牛分枝杆菌(ATCC第15483号)。离心所述培养液去除细菌,并通过0.45μm滤器过滤除菌。在10kDa分子量截留膜上超滤浓缩无菌滤液。
通过用10%三氯乙酸沉淀从所述浓缩培养物滤液分离蛋白。将所沉淀的蛋白重新溶解于100mM Tris HCl pH8.0中,通过加入等体积的丙酮再沉淀。将丙酮沉淀物溶解于水,加入等体积氯仿∶甲醇2∶1(v/v)再次沉淀蛋白。将氯仿∶甲醇沉淀物溶解于水中,冷冻干燥该溶液。
将冷冻干燥的蛋白溶解于含有8M去离子的尿素、2% Triton X-100、10mM二硫苏糖醇和2%两性电解质的等电聚焦缓冲液(pH2.5-5.0)中。在Ultrodex凝胶的水平床上用制备性等电聚焦以8瓦恒定功率分级分离样品16小时。用水从凝胶床部分洗脱蛋白,并通过用10%三氯乙酸沉淀进行浓缩。
用分析性聚丙酰胺凝胶电泳鉴定含有目的蛋白的合并部分,并通过制备性聚丙酰胺凝胶电泳分级分离。在12.5%SDS-PAGE凝胶上分级分离样品,电印迹到硝化纤维素膜上。用Ponceau Red染色在膜上定位蛋白,用水脱色,用40%乙腈/0.1M碳酸氢铵pH8.9从膜上洗脱后通过冷冻干燥浓缩蛋白。
如以下详述,分析洗脱蛋白的诱导免疫供体的外周血淋巴细胞增殖和分泌干扰素-γ能力。选择在这些分析中诱导强应答的蛋白用于进一步研究。
采用三氟乙酸-乙腈系统,在Vydac Protein C4柱上通过反相层析进一步纯化所选定的蛋白。制备纯化蛋白以用于通过SDS-聚丙酰胺凝胶电泳的蛋白序列测定,而且电印迹到PVDF膜上。如实施例3测定蛋白序列。所述蛋白命名为GV-40、GV-41、GV-42、GV-43和GV-44。所测定的这些多肽的N-末端序列分别示于SEQ ID NO:101-105。后续研究导致分离了GV-42的5’、中间片段和3’DNA序列(分别为SEQID NO:136、137和138)。对应的推定氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:139、140和141。
按照实施例13中所述的标准DNA扩增和克隆方法,克隆编码GV-41和GV-42的基因。所测定的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO:179和180,推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:181和182。进一步的实验克隆了称为GV-41B的编码GV-41的全长基因。所测定的GV-41B的核苷酸序列和推定的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:202和203。GV-41与结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌的核糖体再循环因子具有同源性,GV-42与鸟分枝杆菌(M.Avium)纤连蛋白粘附蛋白FAP-A具有同源性。在GV-42的全长序列中,鉴定了所测定的GV-43的氨基酸序列(SEQ ID NO:104),表明从同一种蛋白获得了GV-42和GV-43的氨基酸序列。
按照标准方法制备抗GV-40和GV-44的鼠多克隆抗血清。这些抗血清用来筛选随机剪切的DNA片段组成的母牛分枝杆菌基因组DNA文库。鉴定并测序编码GV-40和GV-44的克隆。所测定的编码GV-40的部分基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:183,推定的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:184。未克隆到编码GV-40的完整基因,该部分基因编码的抗原命名为GV-40P。延长的GV-40P DNA序列在SEQID NO:206中提供,对应的推定氨基酸序列示于SEQ ID NO:207。所测定的编码GV-44的基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:185,推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:186。进一步测序获得了所测定的编码GV-44的全长基因的DNA序列,示于SEQ ID NO:204,相应的推定氨基酸序列示于SEQ ID NO:205。发现GV-40与麻风分枝杆菌延长因子G同源,GV-44与麻风分枝杆菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源。
实施例17 DD-母牛分枝杆菌抗原GV-45和GV-46的分离
通过悬浮于10ml 2% SDS/PBS并加热至50℃维持2小时从DD-母牛分枝杆菌(500mg;如上所述制备)提取蛋白。离心去除不溶性残留物,通过加入等体积的丙酮并于-20℃温育1小时从所述上清液沉淀蛋白。离心收集沉淀的蛋白,溶解于还原样品缓冲液中,通过制备性SDS-聚丙酰胺凝胶电泳进行分级分离。所分离的蛋白在10mM CAPS/0.01%SDS pH11.0中电印迹到PVDF膜,在气相序列分析仪中测定N-末端序列。
从这些实验分离一条分子量约30kDa的带代表的蛋白,称为GV-45。所测定的GV-45的N-末端序列示于SEQ ID NO:187。从相同的实验中获得一种分子量约14kDa蛋白,称为GV-46。所测定的GV-46的N-末端序列示于SEQ ID NO:208。GV-46与结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌高度保守的分枝杆菌宿主整合因子同源。
由GV-45的氨基酸序列设计了简并寡核苷酸KR32和KR33(分别为SEQ ID NO:188和199)。扩增100bp片段,克隆入质粒pBluescriptⅡ SK+(Stratagene,La Jolla,CA)并按照标准方法(Sambrook,同上)测序(SEQ ID NO:190)。所克隆的插入片段用来筛选在λZAP-Express(Stratagene)的BamHI位点中构建的母牛分枝杆菌基因组文库。所分离的克隆显示与在N-末端含有细菌组蛋白样基元以及由5个氨基酸基本重复序列组成的独特的C-末端的35kDa结核分枝杆菌蛋白和22kDa麻风分枝杆菌蛋白。所测定的GV-45的核苷酸序列示于SEQ ID NO:191,相应的推定氨基酸序列示于SEQ ID NO:192。进一步测序获得了所测定的编码GV-45的全长基因的DNA序列,示于SEQ ID NO:200,相应的推定氨基酸序列示于SEQ ID NO:201。
实施例18得自母牛分枝杆菌的重组蛋白的免疫原性和免疫调节特性A.T细胞增殖和IFN-γ产生的诱导
通过在雌性BALB/cByJ小鼠每只后足垫注射10μg乳化于不完全弗氏佐剂(IFA)中的重组GV蛋白,测试母牛分枝杆菌重组蛋白(GV重组蛋白)的免疫原性。对照小鼠接受IFA中的磷酸缓冲盐溶液。10天后,取出引流的腘淋巴结,由其获得的细胞用免疫GV蛋白刺激,通过测定氚标记的胸苷的摄取分析增殖作用。用标准酶联免疫测定分析这些细胞产生并分泌入培养物上清液的干扰素γ(IFNγ)量。
如总结增殖性应答的表12所示,发现所有GV蛋白均诱导T细胞增殖性应答。得自免疫小鼠的淋巴结T细胞在应答免疫中所用的特定GV蛋白中发生增殖。得自非免疫小鼠的淋巴结细胞在应答GV蛋白中不发生增殖。说明IFNγ产生的表22的数据表明,大多数GV蛋白刺激用相应GV蛋白免疫小鼠的淋巴结细胞产生IFNγ。当得自非免疫小鼠的淋巴结细胞与各个GV蛋白培养时,检测不到IFNγ的产生。
因为当皮下注射给予所述GV蛋白时能够刺激T细胞增殖和/或IFNγ产生,所以所述GV蛋白具有免疫原性。对T细胞增殖和IFNγ产生的抗原特异性刺激作用是结核候选疫苗的两个有利特性。
通过检测CD69(一种在活化的细胞上表达的表面蛋白)表达的向上调节,测定本发明的重组母牛分枝杆菌蛋白、热灭活母牛分枝杆菌和DD-母牛分枝杆菌激活淋巴细胞亚群能力。
用或者热灭活母牛分枝杆菌细胞、DD-母牛分枝杆菌或者重组GV-22B(SEQ ID NO:145)、GV-23(SEQ ID NO:89)、GV-27(SEQ ID NO:160)、GV27A(SEQ ID NO:117)、GV-27B(SEQ ID NO:162)或GV-45(SEQ ID NO:201)20μg/ml刺激正常供体的PBMC(5×106细胞/ml)24小时。通过用抗CD56、αβT细胞或γδ T细胞的单克隆抗体联合抗CD69的单克隆抗体染色培养的细胞,从而检测CD69表达,然后进行流式细胞仪分析。
表23说明了在用热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌或重组母牛分枝杆菌蛋白刺激后表达CD69的αβT细胞、γδT细胞和NK细胞的百分比。这些结果证明,与对照(未刺激的细胞)相比,热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌和GV-23在所测试的淋巴细胞亚群中刺激表达CD69,在NK细胞中观察到特别高水平的CD69表达。发现GV-45向上调节αβT细胞表达CD69。
表23刺激CD69表达
αβT细胞 | γδT细胞 | NK细胞 | |
对照 | 3.8 | 6.2 | 4.8 |
热灭活母牛分枝杆菌 | 8.3 | 10.2 | 40.3 |
DD-母牛分枝杆菌 | 10.1 | 17.5 | 49.9 |
GV-22B | 5.6 | 3.9 | 8.6 |
GV-23 | 5.8 | 10.0 | 46.8 |
GV-27 | 5.5 | 4.4 | 13.3 |
GV-27A | 5.5 | 4.4 | 13.3 |
GV-27B | 4.4 | 2.8 | 7.1 |
GV-45 | 11.7 | 4.9 | 6.3 |
采用上述方法,比较重组蛋白GV-23(20μg/ml)与已知Th1-诱导型佐剂MPL/TDM/CWS(单磷酰脂质a/海藻糖6’6’二分枝菌酸;Sigma,St.Louis,MO;最终稀释度为1∶20)和CpG ODN(Promega,Madison,WI;20μg/ml)以及已知的Th2诱导型佐剂氢氧化铝(SuperfosBiosector,Kvistgard,Denmark;最终稀释度为1∶400)和霍乱毒素(20μg/ml)诱导淋巴细胞亚群表达CD69的能力。MPL/TDM/CWS和氢氧化铝以不引起细胞毒性的最大浓度使用。图8A-C说明了刺激分别在αβT细胞、γδT细胞和NK细胞上表达CD69。GVF-23、MPL/TDM/CWS和CpG ODN诱导在NK细胞上表达CD69,而氢氧化铝和霍乱毒素没有此效应。C.刺激产生细胞因子的作用
如下检测本发明的重组母牛分枝杆菌蛋白刺激在PBMC中产生细胞因子的能力。用或者热灭活母牛分枝杆菌细胞、DD-母牛分枝杆菌或者重组GV-22B(SEQ ID NO:145)、GV-23(SEQ ID NO:89)、GV-27(SEQ ID NO:160)、GV27A(SEQ ID NO:117)、GV-27B(SEQ ID NO:162)或GV-45(SEQ ID NO:201)20μg/ml刺激正常供体的PBMC(5×106细胞/ml)24小时。收获培养物上清液并用标准ELISA试剂盒(Genzyme,Cambridge,MA)按照生产商的说明测试IL-1β、TNF-α、IL-12和IFN-γ的产生。图9A-D说明分别刺激产生IL-1β、TNF-α、IL-12和IFN-γ的作用。发现热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌刺激产生所检测全部4种细胞因子,而重组GV-23和GV-45刺激产生IL-1β、TNF-α和IL-12。图10A-C说明了不同浓度的GV-23和GV-45分别刺激人PBMC产生IL-1β、TNF-α和IL-12的作用(如上所述测定)。
图11A-D说明了GV-23与佐剂MPL/TDM/CWS(最终稀释度为1∶20)、CpG ODN(20μg/ml)、氢氧化铝(最终稀释度为1∶400)和霍乱毒素(20μg/ml)比较,分别刺激PBMC产生IL-1β、TNF-α、IL-12和IFN-γ的作用。GV-23、MPL/TDM/CWS和CpG ODN诱导显著水平的所检测的全部4种细胞因子,而用GV-23观察到比任何已知佐剂都高的IL-1β产生水平。氢氧化铝和霍乱毒素仅诱导可忽略量的4种细胞因子。D.活化抗原提呈细胞的作用
如下检测热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌或者重组母牛分枝杆菌蛋白增强共同刺激分子CD40、CD80和CD86在B细胞、单核细胞和树突细胞上表达的能力。
用或者热灭活母牛分枝杆菌细胞、DD-母牛分枝杆菌或者重组GV-22B(SEQ ID NO:145)、GV-23(SEQ ID NO:89)、GV-27(SEQ ID NO:160)、GV27A(SEQ ID NO:117)、GV-27B(SEQ ID NO:162)或GV-45(SEQ ID NO:201)20μg/ml刺激去除T细胞和主要包括B细胞、单核细胞和树突细胞的外周血单核48小时。收获刺激的细胞并用3色流式细胞仪分析CD40、CD80和CD86的向上调节。表24、25和26说明了树突细胞、单核细胞和B细胞的平均荧光强度分别相对于对照(非刺激细胞)的成倍增加。
表24刺激树突细胞上表达CD40、CD80和CD86的作用
CD40 | CD80 | CD86 | |
对照 | 0 | 0 | 0 |
热灭活母牛分枝杆菌 | 6.1 | 3.8 | 1.6 |
DD-母牛分枝杆菌 | 6.6 | 4.2 | 1.6 |
GV-22B | 4.6 | 1.9 | 1.6 |
GV-23 | 6.0 | 4.5 | 1.8 |
GV-27 | 5.2 | 1.9 | 1.6 |
GV-27A | 2.3 | 0.9 | 1.0 |
GV-27B | 2.6 | 1.1 | 1.1 |
GV-45 | 5.8 | 3.0 | 3.1 |
表25刺激单核细胞上表达CD40、CD80和CD86的作用
CD40 | CD80 | CD86 | |
对照 | 0 | 0 | 0 |
热灭活母牛分枝杆菌 | 2.3 | 1.8 | 0.7 |
DD-母牛分枝杆菌 | 1.9 | 1.5 | 0.7 |
GV-22B | 0.7 | 0.9 | 1.1 |
GV-23 | 2.3 | 1.5 | 0.7 |
GV-27 | 1.5 | 1.4 | 1.2 |
GV-27A | 1.4 | 1.4 | 1.4 |
GV-27B | 1.6 | 1.2 | 1.2 |
GV-45 | 1.6 | 1.2 | 1.0 |
表26刺激B细胞上表达CD40、CD80和CD86的作用
CD40 | CD80 | CD86 | |
对照 | 0 | 0 | 0 |
热灭活母牛分枝杆菌 | 1.6 | 1.0 | 1.7 |
DD-母牛分枝杆菌 | 1.5 | 0.9 | 1.7 |
GV-22B | 1.1 | 0.9 | 1.2 |
GV-23 | 1.2 | 1.1 | 1.4 |
GV-27 | 1.1 | 0.9 | 1.1 |
GV-27A | 1.0 | 1.1 | 0.9 |
GV-27B | 1.0 | 0.9 | 0.9 |
GV-45 | 1.2 | 1.1 | 1.3 |
如上所示,用所测试的所有组成组分在树突细胞、单核细胞和B细胞中均观察到增高水平的CD40、CD80和CD86表达。在树突细胞中表达水平增高最多,用热灭活母牛分枝杆菌、DD-母牛分枝杆菌、GV-23和GV-45获得最高水平的表达。图12A-C说明不同浓度的GV-23和GV-45分别刺激树突细胞表达CD40、CD80和CD86的作用。
比较GV-23与Thl诱导型佐剂MPL/TDM/CWS(最终稀释度为1∶20)和CpG ODN(20μg/ml)以及已知Th2诱导型佐剂氢氧化铝(最终稀释度为1∶400)和霍乱毒素(20μg/ml)刺激树突细胞表达CD40、CD80和CD86的能力。GV-23、MPL/TDM/CWS和CpG ODN引起显著向上调节CD40、CD80和CD86,而霍乱毒素和氢氧化铝分别诱导中度或可忽略的树突细胞激活。E.树突细胞的成熟和功能
如下检测重组母牛分枝杆菌蛋白GV-23对树突细胞的成熟和功能的影响。
用GV-23(20μg/ml)或作为阳性对照的LPS(10μg/ml)刺激纯化的树突细胞(5×104-105细胞/ml)。培养细胞20小时,然后用流式细胞仪分析CD83(一种成熟标记)和CD80的表达。非刺激的细胞用作阴性对照。结果示于以下的表27。
表27刺激树突细胞表达CD83的作用
处理 | %CD83阳性树突细胞 | %CD80阳性树突细胞 |
对照 | 15±8 | 9±6.6 |
GV-23 | 35±13.2 | 24.7±14.2 |
LPS | 36.3±14.8 | 27.7±13 |
用混合淋巴结细胞反应(MLR)测定检测GV-23增强树突细胞的抗原提呈细胞功能的能力。纯化树突细胞在单独的培养基或含有GV-23(20μg/ml)的培养基中培养18-20小时,然后用同种异型T细胞(2×105细胞/孔)刺激。温育3天后,加入(3H)-胸苷。1天后收获细胞,测定摄取的放射活性。图13说明随着树突细胞与T细胞之比增高,摄取的(3H)-胸苷逐渐增加。与非刺激细胞相比,在GV-23刺激的树突细胞中观察到明显较高水平的放射性摄入,表明GV-23增强树突细胞混合白细胞反应。
尽管为了清楚地理解已经通过说明和实施例相当详细地描述了本发明,但可以进行未偏离仅由后附权利要求书范围限定的本发明范围的变化和改进。
序列表
<110>Tan,Paul L.J.
Watson, James D.
Visser, Elizabeth S.
Skinner, Margot A.
Prestidge, Ross L.
<120>得自母牛分枝杆菌的组合物及其使用方法
<130>11000.1002c2PCT
<150>09/205,426
<151>1998-12-04
<150>09/156,181
<151>1998-09-17
<150>09/095,855
<151>1998-06-11
<150>08/996,624
<151>1997-12-23
<150>08/997,362
<151>1997-12-23
<150>08/997,080
<151>1997-12-23
<160>208
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
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<212>PRT
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<213>母牛分枝杆菌
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<222>(3)...(3)
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
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<213>麻风分枝杆菌
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35 40 45Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile
50 55 60Lys Val Gln Phe Gln Asn Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu65 70 75 80Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn
85 90 95Thr Thr Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Ile Ser Val Val Met
100 105 110Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala
115 120 125Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr
130 135 140Ser Glu Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Ser Asn Lys Gln Ile Lys Pro Thr145 150 155 160Gly Ser Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ala Gly Leu Ser Ala Leu Thr
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<211>327
<212>PRT
<213>麻风分枝杆菌
<400>31Met Ile Asp Val Ser Gly Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Trp Leu Leu1 5 10 15Val Gly Ala Ala Ala Thr Leu Pro Ser Leu Ile Ser Leu Ala Gly Gly
20 25 30Ala Ala Thr Ala Ser Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr
35 40 45Leu Gln Val Pro Ser Glu Ala Met Gly Arg Thr Ile Lys Val Gln Phe
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100 105 110Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala
115 120 125Gly Cys Thr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro
130 135 140Lys Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ser Val Lys Ser Thr Gly Ser Ala Val145 150 155 160Val Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Ala Tyr
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325
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<212>PRT
<213>结核分枝杆菌
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290 295 300His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Pro Asp305 310 315 320Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr Gly Pro Ala Pro Gln
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<212>PRT
<213>结核分枝杆菌
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<212>PRT
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备的探针
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
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<212>PRT
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<213>母牛分枝杆菌
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<211>334
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<213>母牛分枝杆菌
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35 40 45Leu Pro Val Glu Tyr Leu Asp Val Phe Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp
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85 90 95Pro Ala Phe Glu Trp Phe Tyr Glu Ser Gly Leu Ser Thr Ile Met Pro
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115 120 125Gly Asn Gly Gln Asn Tyr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Gln
130 135 140Glu Leu Pro Thr Trp Leu Glu Ala Asn Arg Gly Val Ser Arg Thr Gly145 150 155 160Asn Ala Phe Val Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ala Ala Leu Thr Tyr
165 170 175Ala Ile His His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Ser Ser Leu Ser Gly
180 185 190Phe Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp Pro Met Leu Ile Gly Leu Ala
195 200 205Met Asn Asp Ala Gly Gly Phe Asn Ala Glu Ser Met Trp Gly Pro Ser
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
<400>47Met Arg Thr Ala Thr Thr Lys Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala1 5 10 15Leu Val Ala Ala Thr Gly Met Val Ser Ala Ala Thr Ala Asn Ala Gln
20 25 30Glu Gly His Gln Val Arg Tyr Thr Leu Thr Ser Ala Gly Ala Tyr Glu
35 40 45Phe Asp Leu Phe Tyr Leu Thr Thr Gln Pro Pro Ser Met Gln Ala Phe
50 55 60Asn Ala Asp Ala Tyr Ala Phe Ala Lys Arg Glu Lys Val Ser Leu Ala65 70 75 80Pro Gly Val Pro Trp Val Phe Glu Thr Thr Met Ala Asp Pro Asn Trp
85 90 95Ala Ile Leu Gln Val Ser Ser Thr Thr Arg Gly Gly Gln Ala Ala Pro
100 105 110Asn Ala His Cys Asp Ile Ala Val Asp Gly Gln Glu Val Leu Ser Gln
115 120 125His Asp Asp Pro Tyr Asn Val Arg Cys Gln Leu Gly Gln Trp
130 135 140
<210>48
<211>300
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>48gccagtgcgc caacggtttt catcgatgcc gcacacaacc ccggtgggcc ctgcgcttgc 60cgaaggctgc gcgacgagtt cgacttccgg tatctcgtcg gcgtcgtctc ggtgatgggg 120gacaaggacg tggacgggat ccgccaggac ccgggcgtgc cggacgggcg cggtctcgca 180ctgttcgtct cgggcgacaa ccttcgaaag ggtgcggcgc tcaacacgat ccagatcgcc 240gagctgctgg ccgcccagtt gtaagtgttc cgccgaaatt gcattccacg ccgataatcg 300
<210>49
<211>563
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>49ggatcctcgg ccggctcaag agtccgcgcc gaggtggatg tgacgctgga cggctacgag 60ttcagtcggg cctgcgaggc gctgtaccac ttcgcctggg acgagttctg cgactggtat 120gtcgagcttg ccaaagtgca actgggtgaa ggtttctcgc acaccacggc cgtgttggcc 180accgtgctcg atgtgctgct caagcttctg cacccggtca tgccgttcgt caccgaggtg 240ctgtggaagg ccctgaccgg gcgggccggc gcgagcgaac gtctgggaaa tgtggagtca 300ctggtcgtcg cggactggcc cacgcccacc ggatacgcgc tggatcaggc tgccgcacaa 360cggatcgccg acacccagaa gttgatcacc gaggtgcgcc ggttccgcag cgatcagggt 420ctggccgacc gccagcgggt gcctgcccgg ttgtccggca tcgacaccgc gggtctggac 480gcccatgtcc cggcggtgcg cgcgctggcc tggcttgacc gagggtgatg agggcttcac 540cgcgtccgaa tcggtcgagg tgc 563
<210>50
<211>434
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>50gggccgggcc cgaggatgag caagttcgaa gtcgtcaccg ggatggcgtt cgcggctttc 60gccgacgcgc ccatcgacgt cgccgtcgtc gaggtcgggc tcggtggtcg ctgggacgcg 120acgaacgtgg tgaacgcacc ggtcgcggtc atcaccccga tcggggtgga ccacaccgac 180tacctcggtg acacgatcgc cgagatcgcc ggggagaagg ccggaaatca tcacccgcca 240gccgacgacc tggtgccgac cgacaccgtc gccgtgctgg cgcggcaggt tcccgaggcc 300atggaggtgc tgctggccca ggcggtgcgc tcggatgcgg ctgtagcgcg cgaggattcg 360gagtgcgcgg tgctgggccg tcaggtcgcc atcggcggca gctgctccgg ttgcaggggc 420tcggtggcgt ctac 434
<210>51
<211>438
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>51ggatcccact cccgcgccgg cggcggccag ctggtacggc cattccagcg tgctgatcga 60ggtcgacggc taccgcgtgc tggccgaccc ggtgtggagc aacagatgtt cgccctcacg 120ggcggtcgga ccgcagcgca tgcacgacgt cccggtgccg ctggaggcgc ttcccgccgt 180ggacgcggtg gtgatcgcca acgaccacta cgaccacctc gacatcgaca ccatcgtcgc 240gttggcgcac acccagcggg ccccgttcgt ggtgccgttg ggcatcggcg cacacctgcg 300caagtggggc gtccccgagg cgcggatcgt cgagttggac tggcacgaag cccaccgcat 360cgacgacctg acgctggtct gcacccccgc ccggcacttc tccggccggt tgttctcccg 420cgactcgacg ctgtgggc 438
<210>52
<211>87
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>52Ala Ser Ala Pro Thr Val Phe Ile Asp Ala Ala His Asn Pro Gly Gly1 5 10 15Pro Cys Ala Cys Arg Arg Leu Arg Asp Glu Phe Asp Phe Arg Tyr Leu
20 25 30Val Gly Val Val Ser Val Met Gly Asp Lys Asp Val Asp Gly Ile Arg
35 40 45Gln Asp Pro Gly Val Pro Asp Gly Arg Gly Leu Ala Leu Phe Val Ser
50 55 60Gly Asp Asn Leu Arg Lys Gly Ala Ala Leu Asn Thr Ile Gln Ile Ala65 70 75 80Glu Leu Leu Ala Ala Gln Leu
85
<210>53
<211>175
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>53Gly Ser Ser Ala Gly Ser Arg Val Arg Ala Glu Val Asp Val Thr Leu1 5 10 15Asp Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ala Cys Glu Ala Leu Tyr His Phe Ala
20 25 30Trp Asp Glu Phe Cys Asp Trp Tyr Val Glu Leu Ala Lys Val Gln Leu
35 40 45Gly Glu Gly Phe Ser His Thr Thr Ala Val Leu Ala Thr Val Leu Asp
50 55 60Val Leu Leu Lys Leu Leu His Pro Val Met Pro Phe Val Thr Glu Val65 70 75 80Leu Trp Lys Ala Leu Thr Gly Arg Ala Gly Ala Ser Glu Arg Leu Gly
85 90 95Asn Val Glu Ser Leu Val Val Ala Asp Trp Pro Thr Pro Thr Gly Tyr
100 105 110Ala Leu Asp Gln Ala Ala Ala Gln Arg Ile Ala Asp Thr Gln Lys Leu
115 120 125Ile Thr Glu Val Arg Arg Phe Arg Ser Asp Gln Gly Leu Ala Asp Arg
130 135 140Gln Arg Val Pro Ala Arg Leu Ser Gly Ile Asp Thr Ala Gly Leu Asp145 150 155 160Ala His Val Pro Ala Val Arg Ala Leu Ala Trp Leu Asp Arg Gly
165 170 175
<210>54
<21l>144
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>54Gly Pro Gly Pro Arg Asn Ser Lys Phe Glu Val Val Thr Gly Met Ala1 5 10 15Phe Ala Ala Phe Ala Asp Ala Pro Ile Asp Val Ala Val Val Glu Val
20 25 30Gly Leu Gly Gly Arg Trp Asp Ala Thr Asn Val Val Asn Ala Pro Val
35 40 45Ala Val Ile Thr Pro Ile Gly Val Asp His Thr Asp Tyr Leu Gly Asp
50 55 60Thr Ile Ala Glu Ile Ala Gly Glu Lys Ala Gly Asn His His Pro Pro65 70 75 80Ala Asp Asp Leu Val Pro Thr Asp Thr Val Ala Val Leu Ala Arg Gln
85 90 95Val Pro Glu Ala Asn Glu Val Leu Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Asp
100 105 110Ala Ala Val Ala Arg Glu Asp Ser Glu Cys Ala Val Leu Gly Arg Gln
115 120 125Val Ala Ile Gly Gly Ser Cys Ser Gly Cys Arg Gly Ser Val Ala Ser
130 135 140
<210>55
<211>145
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>55Asp Pro Thr Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ser Trp Tyr Gly His Ser Ser1 5 10 15Val Leu Ile Glu Val Asp Gly Tyr Arg Val Leu Ala Asp Pro Val Trp
20 25 30Ser Asn Arg Cys Ser Pro Ser Arg Ala Val Gly Pro Gln Arg Met His
35 40 45Asp Val Pro Val Pro Leu Glu Ala Leu Pro Ala Val Asp Ala Val Val
50 55 60Ile Ser Asn Asp His Tyr Asp His Leu Asp Ile Asp Thr Ile Val Ala65 70 75 80Leu Ala His Thr Gln Arg Ala Pro Phe Val Val Pro Leu Gly Ile Gly
85 90 95Ala His Leu Arg Lys Trp Gly Val Pro Glu Ala Arg Ile Val Glu Leu
100 105 110Asp Trp His Glu Ala His Arg Ile Asp Asp Leu Thr Leu Val Cys Thr
115 120 125Pro Ala Arg His Phe Ser Gly Arg Leu Phe Ser Arg Asp Ser Thr Leu
130 135 140Trp145
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(1)...(1)
<223>残基可以为Gly,Ile,Leu或Val
<221>不确定
<222>(2)...(2)
<223>残基可以为Ile,Leu,Gly,或Ala
<221>不确定
<222>(5)...(5)
<22l>不确定
<222>(9)...(9)
<400>56Xaa Xaa Ala Pro Xaa Gly Asp Ala Xaa Arg1 5 l0
<210>57
<211>8
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(7)...(7)
<223>残基可以为Ile或Leu
<400>57Pro Glu Ala Glu Ala Asn Xaa Arg1 5
<210>58
<211>11
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(4)...(4)
<223>残基可以为Gln或Gly
<221>不确定
<222>(5)...(5)
<223>残基可以为Gly或Gln
<400>58Thr Ala Asn Xaa Xaa Glu Tyr Tyr Asp Asn Arg1 5 10
<210>59
<211>34
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>59Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Glu Ala Asn Leu Arg Gly Tyr Phe Thr1 5 10 15Ala Asn Pro Ala Glu Tyr Tyr Asp Leu Arg Gly Ile Leu Ala Pro Ile
20 25 30Gly Asp
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>60ccggtgggcc cgggctgcgc 20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>61tggccggcca ccacgtggta 20
<210>62
<211>313
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>62gccggtgggc ccgggctgcg cggaatacgc ggcagccaat cccactgggc cggcctcggt 60gcagggaatg tcgcaggacc cggtcgcggt ggcggcctcg aacaatccgg agttgacaac 120gctgtacggc tgcactgtcg ggccagctca atccgcaagt aaacctggtg gacaccctca 180acagcggtca gtacacggtg ttcgcaccga ccaacgcggc atttagcaag ctgccggcat 240ccacgatcga cgagctcaag accaattcgt cactgctgac cagcatcctg acctaccacg 300tggtggccgg cca 313
<210>63
<211>18
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(7)...(17)
<400>63Glu Pro Ala Gly Pro Leu Pro Xaa Tyr Asn Glu Arg Leu His Thr Leu1 5 10 15Xaa Gln
<210>64
<211>25
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<22l>不确定
<222>(21)...(21)
<400>64Gly Leu Asp Asn Glu Leu Ser Leu Val Asp Gly Gln Gly Arg Thr Leu1 5 10 15Thr Val Gln Gln Xaa Asp Thr Phe Leu
20 25
<210>65
<211>26
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(3)...(3)
<221>不确定
<222>(21)...(22)
<221>不确定
<222>(24)...(24)
<400>65Asp Pro Xaa Pro Asp Ile Glu Val Glu Phe Ala Arg Gly Thr Gly Ala1 5 10 15Glu Pro Gly Leu Xaa Xaa Val Xaa Asp Ala
20 25
<210>66
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>66accgccctcg agttctcccg gccaggtctg cc 32
<210>67
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>67aagcacgagc tcagtctctt ccacgcggac gt 32
<210>68
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>68catggatcca ttctcccggc ccggtcttcc 30
<210>69
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>69tttgaattct aggcggtggc ctgagc 26
<210>70
<211>161
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>70Set Gly Trp Asp Ile Asn Thr Ala Ala Phe Glu Trp Tyr Val Asp Ser1 5 10 15Gly Leu Ala Val Ile Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser
20 25 30Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys
35 40 45Trp Glu Thr Phe Leu Thr Gln Glu Leu Pro Ala Tyr Leu Ala Ala Asn
50 55 60Lys Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ala65 70 75 80Gly Ser Ala Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Gln
85 90 95Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Gly Tyr Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp
l00 105 110Pro Met Leu Ile Asn Ile Ser Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala
115 120 125Asn Asp Met Trp Gly Arg Thr Glu Asp Pro Ser Ser Ala Trp Lys Arg
130 135 140Asn Asp Pro Met Val Asn Ile Gly Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Pro145 150 155 160Leu
<210>71
<21l>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>71gagagactcg agaacgccca ggaagggcac cag 33
<210>72
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>72gagagactcg agtgactcac cactgaccga gc 32
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<221>不确定
<222>(3)...(3)
<22l>不确定
<222>(6)...(6)
<221>不确定
<222>(9)...(9)
<221>不确定
<222>(15)...(15)
<400>73ggngcngcnc argcngarcc 20
<210>74
<211>825
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>74ttggatccca ctcccgcgcc ggcggcggcc agctggtacg gccattccag cgtgctgatc 60gaggtcgacg gctaccgcgt gctggccgac ccggtgtgga gcaacagatg ttcgccctca 120cgggcggtcg gaccgcagcg catgcacgac gtcccggtgc cgctggaggc gcttcccgcc 180gtggacgcgg tggtgatcag ccacgaccac tacgaccacc tcgacatcga caccatcgtc 240gcgttggcgc acacccagcg ggccccgttc gtggtgccgt tgggcatcgg cgcacacctg 300cgcaagtggg gcgtccccga ggcgcggatc gtcgagttgg actggcacga agcccaccgc 360atagacgacc tgacgctggt ctgcaccccc gcccggcact tctccggacg gttgttctcc 420cgcgactcga cgctgtgggc gtcgtgggtg gtcaccggct cgtcgcacaa ggcgttcttc 480ggtggcgaca ccggatacac gaagagcttc gccgagatcg gcgacgagta cggtccgttc 540gatctgaccc tgctgccgat cggggcctac catcccgcgt tcgccgacat ccacatgaac 600cccgaggagg cggtgcgcgc ccatctggac ctgaccgagg tggacaacag cctgatggtg 660cccatccact gggcgacatt ccgcctcgcc ccgcatccgt ggtccgagcc cgccgaacgc 720ctgctgaccg ctgccgacgc cgagcgggta cgcctgaccg tgccgattcc cggtcagcgg 780gtggacccgg agtcgacgtt cgacccgtgg tggcggttct gaacc 825
<210>75
<211>273
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>75Leu Asp Pro Thr Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ser Trp Tyr Gly His Ser1 5 10 15Ser Val Leu Ile Glu Val Asp Gly Tyr Arg Val Leu Ala Asp Pro Val
20 25 30Trp Ser Asn Arg Cys Ser Pro Ser Arg Ala Val Gly Pro Gln Arg Met
35 40 45His Asp Val Pro Val Pro Leu Glu Ala Leu Pro Ala Val Asp Ala Val
50 55 60Val Ile Ser His Asp His Tyr Asp His Leu Asp lle Asp Thr Ile Val65 70 75 80Ala Leu Ala His Thr Gln Arg Ala Pro Phe Val Val Pro Leu Gly Ile
85 90 95Gly Ala His Leu Arg Lys Trp Gly Val Pro Glu Ala Arg Ile Val Glu
100 105 110Leu Asp Trp His Glu Ala His Arg Ile Asp Asp Leu Thr Leu Val Cys
115 120 125Thr Pro Ala Arg His Phe Ser Gly Arg Leu Phe Ser Arg Asp Ser Thr
130 135 140Leu Trp Ala Ser Trp Val Val Thr Gly Ser Ser His Lys Ala Phe Phe145 150 155 160Gly Gly Asp Thr Gly Tyr Thr Lys Ser Phe Ala Glu Ile Gly Asp Glu
165 170 175Tyr Gly Pro Phe Asp Leu Thr Leu Leu Pro Ile Gly Ala Tyr His Pro
180 185 190Ala Phe Ala Asp Ile His Met Asn Pro Glu Glu Ala Val Arg Ala His
195 200 205Leu Asp Leu Thr Glu Val Asp Asn Ser Leu Met Val Pro Ile His Trp
210 215 220Ala Thr Phe Arg Leu Ala Pro His Pro Trp Ser Glu Pro Ala Glu Arg225 230 235 240Leu Leu Thr Ala Ala Asp Ala Glu Arg Val Arg Leu Thr Val Pro Ile
245 250 255Pro Gly Gln Arg Val Asp Pro Glu Ser Thr Phe Asp Pro Trp Trp Arg
260 265 270Phe
<210>76
<211>10
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>76Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala1 5 10
<210>77
<211>337
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>77gatccctaca tcctgctggt cagctccaag gtgtcgaccg tcaaggatct gctcccgctg 60ctggagaagg tcatccaggc cggcaagccg ctgctgatca tcgccgagga cgtcgagggc 120gaggccctgt ccacgctggt ggtcaacaag atccgcggca ccttcaagtc cgtcgccgtc 180aaggctccgg gcttcggtga ccgccgcaag gcgatgctgc aggacatggc catcctcacc 240ggtggtcagg tcgtcagcga aagagtcggg ctgtccctgg agaccgccga cgtctcgctg 300ctgggccagg cccgcaaggt cgtcgtcacc aaggaca 337
<210>78
<211>112
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>78Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp1 5 10 15Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gln Ala Gly Lys Pro Leu Leu
20 25 30Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val
35 40 45Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly
50 55 60Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr65 70 75 80Gly Gly Gln Val Val Ser Glu Arg Val Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala
85 90 95Asp Val Ser Leu Leu Gly Gln Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp
100 105 110
<210>79
<211>360
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>79ccgtacgaga agatcggcgc tgagctggtc aaagaggtcg ccaagaagac cgacgacgtc 60gcgggcgacg gcaccaccac cgccaccgtg ctcgctcagg ctctggttcg cgaaggcctg 120cgcaacgtcg cagccggcgc caacccgctc ggcctcaagc gtggcatcga gaaggctgtc 180gaggctgtca cccagtcgct gctgaagtcg gccaaggagg tcgagaccaa ggagcagatt 240tctgccaccg cggcgatctc cgccggcgac acccagatcg gcgagctcat cgccgaggcc 300atggacaagg tcggcaacga gggtgtcatc accgtcgagg agtcgaacac cttcggcctg 360
<210>80
<211>120
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>80Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys1 5 10 15Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala
20 25 30Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn
35 40 45Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Ala Val Thr
50 55 60Gln Ser Leu Leu Lys Ser Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile65 70 75 80Ser Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Thr Gln Ile Gly Glu Leu
85 90 95Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val
100 105 110Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu
115 120
<210>81
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>81actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tag 43
<210>82
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>82cgacaaggaa cttcgctacc ttaggaccgt catagttacg ggc 43
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>83aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20
<210>84
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>84ggaaggaagc ggccgctttt tttttttttt t 31
<210>85
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>85gagagagagc ccgggcatgc tsctsctsct s 31
<210>86
<211>238
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>86ctcgatgaac cgctcggagc gctcgacctg aagctgcgcc acgtcatgca gttcgagctc 60aagcgcatcc agcgggaggt cgggatcacg ttcatctacg tgacccacga ccaggaagag 120gcgctcacga tgagtgaccg catcgcggtg atgaacgccg gcaacgtcga acagatcggc 180agcccgaccg agatctacga ccgtcccgcg acggtgttcg tcgccagctt catcgaat 238
<210>87
<211>79
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>87Leu Asp Glu Pro Leu Gly Ala Leu Asp Leu Lys Leu Arg His Val Met1 5 10 15Gln Phe Glu Leu Lys Arg Ile Gln Arg Glu Val Gly Ile Thr Phe Ile
20 25 30Tyr Val Thr His Asp Gln Glu Glu Ala Leu Thr Met Ser Asp Arg Ile
35 40 45Ala Val Met Asn Ala Gly Asn Val Glu Gln Ile Gly Ser Pro Thr Glu
50 55 60Ile Tyr Asp Arg Pro Ala Thr Val Phe Val Ala Ser Phe Ile Glu65 70 75
<210>88
<211>1518
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>88cactcgccat gggtgttaca ataccccacc agttcctcga agtaaacgaa cagaaccgtg 60acatccagct gagaaaatat tcacagcgac gaagcccggc cgatgcctga tggggtccgg 120catcagtaca gcgcgctttc ctgcgcggat tctattgtcg agtccggggt gtgacgaagg 180aatccattgt cgaaatgtaa attcgttgcg gaatcacttg cataggtccg tcagatccgc 240gaaggtttac cccacagcca cgacggctgt ccccgaggag gacctgccct gaccggcaca 300cacatcaccg ctgcagaacc tgcagaacag acggcggatt ccgcggcacc gcccaagggc 360gcgccggtga tcgagatcga ccatgtcacg aagcgcttcg gcgactacct ggccgtcgcg 420gacgcagact tctccatcgc gcccggggag ttcttctcca tgctcggccc gtccgggtgt 480gggaagacga ccacgttgcg catgatcgcg ggattcgaga ccccgactga aggggcgatc 540cgcctcgaag gcgccgacgt gtcgaggacc ccacccaaca agcgcaacgt caacacggtg 600ttccagcact acgcgctgtt cccgcacatg acggtctggg acaacgtcgc gtacggcccg 660cgcagcaaga aactcggcaa aggcgaggtc cgcaagcgcg tcgacgagct gctggagatc 720gtccggctga ccgaatttgc cgagcgcagg cccgcccagc tgtccggcgg gcagcagcag 780cgggtggcgt tggcccgggc actggtgaac taccccagcg cgctgctgct cgatgaaccg 840ctcggagcgc tcgacctgaa gctgcgccac gtcatgcagt tcgagctcaa gcgcatccag 900cgggaggtcg ggatcacgtt catctacgtg acccacgacc aggaagaggc gctcacgatg 960agtgaccgca tcgcggtgat gaacgccggc aacgtcgaac agatcggcag cccgaccgag 1020atctacgacc gtcccgcgac ggtgttcgtc gccagcttca tcggacaggc caacctctgg 1080gcgggccggt gcaccggccg ctccaaccgc gattacgtcg agatcgacgt tctcggctcg 1140acgctgaagg cacgcccggg cgagaccacg atcgagcccg gcgggcacgc caccctgatg 1200gtgcgtccgg aacgcatccg ggtcaccccg ggctcccagg acgcgccgac cggtgacgtc 1260gcctgcgtgc gtgccaccgt caccgacctg accttccaag gtccggtggt gcggctctcg 1320ctggccgctc cggacgactc gaccgtgatc gcccacgtcg gccccgagca ggatctgccg 1380ctgctgcgcc ccggcgacga cgtgtacgtc agctgggcac cggaagcctc cctggtgctt 1440cccggcgacg acatccccac caccgaggac ctcgaagaga tgctcgacga ctcctgagtc 1500acgcttcccg attgccga 1518
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>89Val Ile Glu Ile Asp His Val Thr Lys Arg Phe Gly Asp Tyr Leu Ala1 5 10 15Val Ala Asp Ala Asp Phe Ser Ile Ala Pro Gly Glu Phe Phe Ser Met
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50 55 60Val Ser Arg Thr Pro Pro Asn Lys Arg Asn Val Asn Thr Val Phe Gln65 70 75 80His Tyr Ala Leu Phe Pro His Met Thr Val Trp Asp Asn Val Ala Tyr
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260 265 270Gly His Ala Thr Leu Met Val Arg Pro Glu Arg Ile Arg Val Thr Pro
275 280 285Gly Ser Gln Asp Ala Pro Thr Gly Asp Val Ala Cys Val Arg Ala Thr
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370 375
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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195 200 205Thr Gln Thr Thr Met Ile Gly Asn Val Ile Gln Lys Gln Phe Leu Val
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<212>PRT
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<220>
<221>不确定
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<221>不确定
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<223>残基可以为Pro或Glu
<221>不确定
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<221>不确定
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<221>不确定
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20
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<221>不确定
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<213>母牛分枝杆菌
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<222>(1)...(1)
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
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<221>不确定
<222>(450)...(450)
<400>107atgccggtgc gacgtgcgcg cagtgcgctt gcgtccgtga ccttcgtcgc ggccgcgtgc 60gtgggcgctg agggcaccgc actggcggcg acgccggact ggagcgggcg ctacacggtg 120gtgacgttcg cctccgacaa actcggcacg agtgtggccg cccgccagcc agaacccgac 180ttcagcggtc agtacacctt cagcacgtcc tgtgtgggca cctgcgtggc caccgcgtcc 240gacggcccgg cgccgtcgaa cccgacgatt ccgcagcccg cgcgctacac ctgggacggc 300aggcagtggg tgttcaacta caactggcag tgggagtgct tccgcggcgc cgacgtcccg 360cgcgagtacg ccgccgcgcg ttcgctggtg ttctacgccc cgaccgccga cgggtcgatg 420ttcggcacct ggcgcaccga natcctggan ggcctctgca agggcaccgt gatcatgccg 480gtcgcggcct atccggcgta g 501
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
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<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(119)...(119)
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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180 185 190Ala Phe Asn Asp Met Ser Arg Asn Leu Ser Ile Lys Asp Glu Leu Leu
195 200 205Gly Glu Glu Arg Ala Glu Asn Gln Arg Leu Met Leu Ser Leu Met Pro
210 215 220Glu Pro Val Met Gln Arg Tyr Leu Asp Gly Glu Glu Thr Ile Ala Gln225 230 235 240Asp His Lys Asn Val Thr Val Ile Phe Ala Asp Met Met Gly Leu Asp
245 250 255Glu Leu Ser Arg Met Leu Thr Ser Glu Glu Leu Met Val Val Val Asn
260 265 270Asp Leu Thr Arg Gln Phe Asp Ala Ala Ala Glu Ser Leu Gly Val Asp
275 280 285His Val Arg Thr Leu His Asp Gly Tyr Leu Ala Ser Cys Gly Leu Gly
290 295 300Val Pro Arg Leu Asp Asn Val Arg Arg Thr Val Asn Phe Ala Ile Glu305 310 315 320Met Asp Arg Ile Ile Asp Arg His Ala Ala Glu Ser Gly His Asp Leu
325 330 335Arg Leu Arg Ala Gly Ile Asp Thr Gly Ser Ala Ala Ser Gly Leu Val
340 345 350Gly Arg Ser Thr Leu Ala Tyr Asp Met Trp Gly Ser Ala Val Asp Val
355 360 365Ala Tyr Gln Val Gln Arg Gly Ser Pro Gln Pro Gly Ile Tyr Val Thr
370 375 380Ser Arg Val His Glu Val Met Gln Glu Thr Leu Asp Phe Val Ala Ala385 390 395 400Gly Glu Val Val Gly Glu Arg Gly Val Glu Thr Val Trp Arg Leu Gln
405 410 415Gly His Pro
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
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<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>128ccggatccaa tgacatttct gccctggaat gcg 33
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<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>129ccggatccat tcggtggccc tgcaaccgcc ag 32
<210>130
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>130ccggatccgg agcaaccgtt ccggctc 27
<210>131
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>131ccggatcccg gctatcagtc cggacgg 27
<210>132
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>132gagcaaccgt tccggctcgg cgactggatc accgtcccca ccgcggcggg ccggccgtcc 60gcccacggcc gcgtggtgga agtcaactgg cgtgcaacac atatcgacac cggcggcaac 120ctgctggtaa tgcccaacgc cgaactcgcc ggcgcgtcgt tcaccaatta cagccggccc 180gtgggagagc accggctgac cgtcgtcacc accttcaacg ccgcggacac ccccgatgat 240gtctgcgaga tgctgtcgtc ggtcgcggcg tcgctgcccg aactgcgcac cgacggacag 300atcgccacgc tctatctcgg tgcggccgaa tacgagaagt cgatcccgtt gcacacaccc 360gcggtggacg actcggtcag gagcacgtac ctgcgatggg tctggtacgc cgcgcgccgg 420caggaacttc gcctaacggc gtcgccgacg attcgacacg ccggaacgga tcgcctcggc 480catgcgggct gtggcgtcca cactgcgctt ggcagacgac gaacagcagg agatcgccga 540cgtggtgcgt ctggtccgtt acggcaacgg ggaacgcctc cagcagccgg gtcaggtacc 600gaccgggatg aggttcatcg tagacggcag ggtgagtctg tccgtgatcg atcaggacgg 660cgacgtgatc ccggcgcggg tgctcgagcg tggcgacttc ctggggcaga ccacgctgac 720gcgggaaccg gtactggcga ccgcgcacgc gctggaggaa gtcaccgtgc tggagatggc 780ccgtgacgag atcgagcgcc tggtgcaccg aaagccgatc ctgctgcacg tgatcggggc 840cgtg
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<211>742
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
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<210>134
<211>282
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(145)...(145)
<221>不确定
<222>(151)...(151)
<400>134Glu Gln Pro Phe Arg Leu Gly Asp Trp Ile Thr Val Pro Thr Ala Ala1 5 10 15Gly Arg Pro Ser Ala His Gly Arg Val Val Glu Val Asn Trp Arg Ala
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130 135 140Xaa Asn Gly Val Ala Asp Xaa Phe Asp Thr Pro Glu Arg Ile Ala Ser145 150 155 160Ala Met Arg Ala Val Ala Ser Thr Leu Arg Leu Ala Asp Asp Glu Gln
165 170 175Gln Glu Ile Ala Asp Val Val Arg Leu Val Arg Tyr Gly Asn Gly Glu
180 185 190Arg Leu Gln Gln Pro Gly Gln Val Pro Thr Gly Met Arg Phe Ile Val
195 200 205Asp Gly Arg Val Ser Leu Ser Val Ile Asp Gln Asp Gly Asp Val Ile
210 215 220Pro Ala Arg Val Leu Glu Arg Gly Asp Phe Leu Gly Gln Thr Thr Leu225 230 235 240Thr Arg Glu Pro Val Leu Ala Thr Ala His Ala Leu Glu Glu Val Thr
245 250 255Val Leu Glu Met Ala Arg Asp Glu Ile Glu Arg Leu Val His Arg Lys
260 265 270Pro Ile Leu Leu His Val Ile Gly Ala Val
275 280
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<211>247
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>135Gly Tyr Gln Ser Gly Arg Ser Ser Leu Arg Ala Ser Val Phe Asp Arg1 5 10 15Leu Thr Asp Ile Arg Glu Ser Gln Ser Arg Gly Leu Glu Asn Gln Phe
20 25 30Ala Asp Leu Lys Asn Ser Met Val Ile Tyr Ser Arg Gly Ser Thr Ala
35 40 45Thr Glu Ala Ile Gly Ala Phe Ser Asp Gly Phe Arg Gln Leu Gly Asp
50 55 60Ala Thr Ile Asn Thr Gly Gln Ala Ala Ser Leu Arg Arg Tyr Tyr Asp65 70 75 80Arg Thr Phe Ala Asn Thr Thr Leu Asp Asp Ser Gly Asn Arg Val Asp
85 90 95Val Arg Ala Leu Ile Pro Lys Ser Asn Pro Gln Arg Tyr Leu Gln Ala
100 105 110Leu Tyr Thr Pro Pro Phe Gln Asn Trp Glu Lys Ala Ile Ala Phe Asp
115 120 125Asp Ala Arg Asp Gly Ser Ala Trp Ser Ala Ala Asn Ala Arg Phe Asn
130 135 140Glu Phe Phe Arg Glu Ile Val His Arg Phe Asn Phe Glu Asp Leu Met145 150 155 160Leu Leu Asp Leu Glu Gly Asn Val Val Tyr Ser Ala Tyr Lys Gly Pro
165 170 175Asp Leu Gly Thr Asn Ile Val Asn Gly Pro Tyr Arg Asn Arg Glu Leu
180 185 190Ser Glu Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Ser Asn Ser Ile Asp Tyr Val
195 200 205Gly Val Thr Asp Phe Gly Trp Tyr Leu Pro Ala Glu Glu pro Thr Ala
210 215 220Trp Phe Leu Ser Pro Val Gly Leu Lys Asp Arg Val Asp Gly Val Met225 230 235 240Ala Val Gln Phe Pro Gly Ile
245
<210>136
<211>45
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
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<22l>不确定
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
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<210>139
<211>15
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(96)...(96)
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20 25 30Pro Ala Thr Ser Gly Thr Leu Ser Glu Phe Phe Ala Ala Lys Gly Val
35 40 45Thr Met Glu Pro Gln Ser Ser Arg Asp Phe Arg Ala Leu Asn Ile Val
50 55 60Leu Pro Lys Pro Arg Gly Trp Glu His Ile Pro Asp Pro Asn Val Pro65 70 75 80Asp Ala Phe Ala Val Leu Ala Asp Arg Val Gly Gly Lys Gly Gln Xaa
85 90 95Ser Thr Asn Ala His Val Val Val Asp Lys His Val Gly Glu Phe Asp
100 105 110Gly
<210>141
<211>73
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>141Val Thr Thr Ser Val Glu Gln Val Val Ala Ala Ala Asp Ala Thr Glu1 5 10 15Ala Ile Val Asn Gly Phe Lys Val Ser Val Pro Gly Pro Gly Pro Ala
20 25 30Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Gly Val Pro Pro Ala Pro Gly
35 40 45Ala Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Val
50 55 60Pro Ala Val Ala Pro Ala Pro Gln Leu65 70
<210>142
<211>273
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
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<210>143
<211>91
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>143Ala Thr Tyr Val Gln Gly Gly Leu Gly Arg Ile Glu Ala Arg Val Ala1 5 10 15Asp Ser Gly Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Lys Gly Tyr Phe Pro Leu Ser
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35 40 45Val Thr Ala Ala Ala Pro Thr Gly Ala Val Ala Thr Gln Pro Leu Thr
50 55 60Phe Ile Ala Gly Pro Ser Pro Thr Gly Trp Gln Leu Ser Lys Gln Ser65 70 75 80Ala Leu Ala Leu Met Ser Ala Val Ile Ala Ala
85 90
<210>144
<211>554
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>144gatgtcacgc ccggagaatg taacgttcga ccggagaacg ccgtcggcac aacgagttac 60gtttgagcac ttcagatctc ggttaccttg gatttcaggc gggggaagca gtaaccgatc 120caagattcga aggacccaaa caacatgaaa ttcactggaa tgaccgtgcg cgcaagccgc 180gcgccctggc cggcgtcggg gcggcatgtc tgttcggcgg cgtggccgcg gcaaccgtgg 240cggcacagat ggcgggcgcc cagccggccg agtgcaacgc cagctcactc accggcaccg 300tcagctcggt gaccggtcag gcgcgtcagt acctagacac ccacccgggc gccaaccagg 360ccgtcaccgc ggcgatgaac cagccgcggc ccgaggccga ggcgaacctg cggggctact 420tcaccgccaa cccggcggag tactacgacc tgcggggcat cctcgccccg atcggtgacg 480cgcagcgcaa ctgcaacatc accgtgctgc cggtagagct gcagacggcc tacgacacgt 540tcatggccgg ctga 554
<210>145
<211>136
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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20 25 30Ala Ala Gln Met Ala Gly Ala Gln Pro Ala Glu Cys Asn Ala Ser Ser
35 40 45Leu Thr Gly Thr Val Ser Ser Val Thr Gly Gln Ala Arg Gln Tyr Leu
50 55 60Asp Thr His Pro Gly Ala Asn Gln Ala Val Thr Ala Ala Met Asn Gln65 70 75 80Pro Arg Pro Glu Ala Glu Ala Asn Leu Arg Gly Tyr Phe Thr Ala Asn
85 90 95Pro Ala Glu Tyr Tyr Asp Leu Arg Gly Ile Leu Ala Pro Ile Gly Asp
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130 135
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<211>808
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(15)...(15)
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<210>147
<211>228
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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20 25 30Thr Ala Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ala Ser Ser Ala Met Glu Ser Ala
35 40 45Thr Asp Glu Met Thr Thr Ser Ser Ala Ala Pro Ser Ala Asp Pro Ala
50 55 60Ala Asn Leu Ile Gly Ser Gly Cys Ala Ala Tyr Ala Glu Gln Val Pro65 70 75 80Glu Gly Pro Gly Ser Val Ala Gly Met Ala Ala Asp Pro Val Thr Val
85 90 95Ala Ala Ser Asn Asn Pro Met Leu Gln Thr Leu Ser Gln Ala Leu Ser
100 105 110Gly Gln Leu Asn Pro Gln Val Asn Leu Val Asp Thr Leu Asp Gly Gly
115 120 125Glu Phe Thr Val Phe Ala Pro Thr Asp Asp Ala Phe Ala Lys Ile Asp
130 135 140Pro Ala Thr Leu Glu Thr Leu Lys Thr Asp Ser Asp Met Leu Thr Asn145 150 155 160Ile Leu Thr Tyr His Val Val Pro Gly Gln Ala Ala Pro Asp Gln Val
165 170 175Val Gly Glu His Val Thr Val Glu Gly Ala Pro Val Thr Val Ser Gly
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<221>不确定
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<221>不确定
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<221>不确定
<222>(10)...(10)
<221>不确定
<222>(13)...(13)
<221>不确定
<222>(16)...(16)
<221>不确定
<222>(20)...(20)
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<210>150
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在实验室制备
<400>150gcccccgtcg gccccggctg tgcggcctac gtgcaacagg tgccggacgg gccgggatcg 60gtgcagggca tggcgagctc gcccgtagcg accgccgcgt at 102
<210>151
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<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
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<211>231
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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35 40 45Gly Ser Ala Ala Ala Ala Pro Val Gly Pro Gly Cys Ala Ala Tyr Val
50 55 60Gln Gln Val Pro Asp Gly Pro Gly Ser Val Gln Gly Met Ala Ser Ser65 70 75 80Pro Val Ala Thr Ala Ala Ala Asp Asn Pro Leu Leu Thr Thr Leu Ser
85 90 95Gln Ala Ile Ser Gly Gln Leu Asn Pro Asn Val Asn Leu Val Asp Thr
100 105 110Phe Asn Gly Gly Gln Phe Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Asp Ala Phe
115 120 125Ala Lys Ile Asp Pro Ala Thr Leu Glu Thr Leu Lys Thr Asp Ser Asp
130 135 140Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Tyr His Val Val Pro Gly Gln Ala Ala145 150 155 160Pro Asp Gln Val Val Gly Glu His Val Thr Val Glu Gly Ala Pro Val
165 170 175Thr Val Ser Gly Met Ala Asp Gln Leu Lys Val Asn Asp Ala Ser Val
180 185 190Val Cys Gly Gly Val Gln Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr Leu Ile Asp
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<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(358)...(358)
<400>153atgcaggtgc ggcgtgttct gggcagtgtc ggtgcagcag tcgcggtttc ggccgcgtta 60tggcagacgg gggtttcgat accgaccgcc tcagcggatc cgtgtccgga catcgaggtg 120atcttcgcgc gcgggaccgg tgcggaaccc ggcctcgggt gggtcggtga tgcgttcgtc 180aacgcgctgc ggcccaaggt cggtgagcag tcggtgggca cctacgcggt gaactacccg 240gcaggattcg gacttcgaca aatcggcgcc catgggcgcg gccgacgcat cggggcgggt 300gcagtggatg gccgacaact gcccggacac caagcttgtc ctgggcggca tgtcgcangg 360cgccggcgtc atcgacctga tcaccgtcga tccgcgaccg ctgggccggt tcacccccac 420cccgatgccg ccccgcgtcg ccgaccacgt ggccgccgtt gtggtcttcg gaaatccgtt 480gcgcgacatc cgtggtggcg gtccgctgcc gcagatgagc ggcacctacg ggccgaagtc 540gatcgatctg tgtgcgctcg acgatccgtt ctgctcgccc ggcttcaacc tgccggccca 600cttcgcctac gccgacaacg gcatggtgga ggaagccgcg aacttcgccc gcctggaacc 660gggccagagc gtcgagctgc ccgaggcgcc ctacctgcac ctgttcgtcc cgcggggcga 720ggtaacgctg gaggacgccg gaccgctgcg cgaaggcgac gcagtgcgtt tcaccgcatc 780gggcggccag cgggtgaccg ccaccgcgcc cgcggagatc ctcgtctggg agatgcatgc 840gggactcggt gcggcataag cgaataggag tcctgctggc cggcgcagca ctgctcgccg 900gatgcacatc cgaacctgga cccgggccgt cggcggcacc ggccccgacg agcacaaccg 960agagcgcacc cggtcccgga ctcgtcccgg tgaccgtcgc ggtcgacgaa cctctggccg 1020acgcgccgtt cgaccagccc cgggaggccc tggtgccgca gggttggacg ctgtcggtgt 1080gggcgcggac cgcccggccg cggctggccg cgtgggcccc ggacg 1125
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(119)...(119)
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<213>母牛分枝杆菌
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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<220>
<223>在实验室制备
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<213>母牛分枝杆菌
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245 250 255Gly Gln Trp Arg Asp Thr Gly Met Gly Asp Thr Gly Glu Thr Ile Leu
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<213>母牛分枝杆菌
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<221>不确定
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<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
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<220>
<221>不确定
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<221>不确定
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<213>母牛分枝杆菌
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<221>不确定
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<213>母牛分枝杆菌
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<213>母牛分枝杆菌
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20 25 30Asp Pro Cys Pro Asp Ile Glu Val Ile Phe Ala Arg Gly Thr Gly Ala
35 40 45Glu Pro Gly Leu Gly Trp Val Gly Asp Ala Phe Val Asn Ala Leu Arg
50 55 60Pro Lys Val Gly Glu Gln Ser Val Gly Thr Tyr Ala Val Asn Tyr Pro65 70 75 80Ala Gly Phe Asp Phe Asp Lys Ser Ala Pro Met Gly Ala Ala Asp Ala
85 90 95Ser Gly Arg Val Gln Trp Met Ala Asp Asn Cys Pro Asp Thr Lys Leu
100 105 110Val Leu Gly Gly Met Ser Gln Gly Ala Gly Val Ile Asp Leu Ile Thr
115 120 125Val Asp Pro Arg Pro Leu Gly Arg Phe Thr Pro Thr Pro Met Pro Pro
130 135 140Arg Val Ala Asp His Val Ala Ala Val Val Val Phe Gly Asn Pro Leu145 150 155 160Arg Asp Ile Arg Gly Gly Gly Pro Leu Pro Gln Met Ser Gly Thr Tyr
165 170 175Gly Pro Lys Ser Ile Asp Leu Cys Ala Leu Asp Asp Pro Phe Cys Ser
180 185 190Pro Gly Phe Asn Leu Pro Ala His Phe Ala Tyr Ala Asp Asn Gly Met
195 200 205Val Glu Glu Ala Ala Asn Phe Ala Arg Leu Glu Pro Gly Gln Ser Val
210 215 220Glu Leu Pro Glu Ala Pro Tyr Leu His Leu Phe Val Pro Arg Gly Glu225 230 235 240Val Thr Leu Glu Asp Ala Gly Pro Leu Arg Glu Gly Asp Ala Val Arg
245 250 255Phe Thr Ala Ser Gly Gly Gln Arg Val Thr Ala Thr Ala Pro Ala Glu
260 265 270Ile Leu Val Trp Glu Met His Ala Gly Leu Gly Ala Ala
275 280 285
<210>198
<211>743
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>198ggatccgcgg caccggctgg tgacgaccaa gtacaacccg gcccgcacct ggacggccga 60gaactccgtc ggcatcggcg gcgcgtacct gtgcatctac gggatggagg gccccggcgg 120ctatcagttc gtcggccgca ccacccaggt gtggagtcgt taccgccaca cggcgccgtt 180cgaacccgga agtccctggc tgctgcggtt tttcgaccga atttcgtggt atccggtgtc 240ggccgaggag ctgctggaat tgcgagccga catggccgca ggccggggct cggtcgacat 300caccgacggc gtgttctccc tcgccgagca cgaacggttc ctggccgaca acgccgacga 360catcgccgcg ttccgttccc ggcaggcggc cgcgttctcc gccgagcgga ccgcgtgggc 420ggccgccggc gagttcgacc gcgccgagaa agccgcgtcg aaggccaccg acgccgatac 480cggggacctg gtgctctacg acggtgacga gcgggtcgac gctccgttcg cgtcgagcgt 540gtggaaggtc gacgtcgccg tcggtgaccg ggtggtggcc ggacagccgt tgctggcgct 600ggaggcgatg aagatggaga ccgtgctgcg cgccccggcc gacggggtgg tcacccagat 660cctggtctcc gctgggcatc tcgtcgatcc cggcacccca ctggtcgtgg tcggcaccgg 720agtgcgcgca tgagcgccgt cga 743
<210>199
<211>243
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>199Asp Pro Arg His Arg Leu Val Thr Thr Lys Tyr Asn Pro Ala Arg Thr1 5 10 15Trp Thr Ala Glu Asn Ser Val Gly Ile Gly Gly Ala Tyr Leu Cys Ile
20 25 30Tyr Gly Met Glu Gly Pro Gly Gly Tyr Gln Phe Val Gly Arg Thr Thr
35 40 45Gln Val Trp Ser Arg Tyr Arg His Thr Ala Pro Phe Glu Pro Gly Ser
50 55 60Pro Trp Leu Leu Arg Phe Phe Asp Arg Ile Ser Trp Tyr Pro Val Ser65 70 75 80Ala Glu Glu Leu Leu Glu Leu Arg Ala Asp Met Ala Ala Gly Arg Gly
85 90 95Ser Val Asp Ile Thr Asp Gly Val Phe Ser Leu Ala Glu His Glu Arg
100 105 110Phe Leu Ala Asp Asn Ala Asp Asp Ile Ala Ala Phe Arg Ser Arg Gln
115 120 125Ala Ala Ala Phe Ser Ala Glu Arg Thr Ala Trp Ala Ala Ala Gly Glu
130 135 140Phe Asp Arg Ala Glu Lys Ala Ala Ser Lys Ala Thr Asp Ala Asp Thr145 150 155 160Gly Asp Leu Val Leu Tyr Asp Gly Asp Glu Arg Val Asp Ala Pro Phe
165 170 175Ala Ser Ser Val Trp Lys Val Asp Val Ala Val Gly Asp Arg Val Val
180 185 190Ala Gly Gln Pro Leu Leu Ala Leu Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Val
195 200 205Leu Arg Ala Pro Ala Asp Gly Val Val Thr Gln Ile Leu Val Ser Ala
210 215 220Gly His Leu Val Asp Pro Gly Thr Pro Leu Val Val Val Gly Thr Gly225 230 235 240Val Arg Ala
<210>200
<211>858
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>200gaaatcccgc gtctgaaacc ctcttttcgc ggcgcccctc aggacggtaa gggggccaag 60cggattgaaa aatgttcgct gaatgagcct gaaattgcgc gtggctcttg gaaatcagca 120gcgatgggtt taccgtgtcc actagtcggt ccaaagagga ccactggttt tcggaggttt 180tgcatgaaca aagcagagct catcgacgta ctcactgaga agctgggctc ggatcgtcgg 240caagcgactg cggcggtgga gaacgttgtc gacaccatcg tgcgcgccgt gcacaagggt 300gagagcgtca ccatcacggg cttcggtgtt ttcgagcagc gtcgtcgcgc agcacgcgtg 360gcacgcaatc cgcgcaccgg cgagaccgtg aaggtcaagc ccacctcagt cccggcattc 420cgtcccggcg ctcagttcaa ggctgttgtc tctggcgcac agaagcttcc ggccgagggt 480ccggcggtca agcgcggtgt gaccgcgacg agcaccgccc gcaaggcagc caagaaggct 540ccggccaaga aggctgccgc gaagaaggcc gcgccggcca agaaggctcc ggcgaagaag 600gctgcgacca aggctgcacc ggccaagaag gccactgccg ccaagaaggc cgcgccggcc 660aagaaggcca ctgccgccaa gaaggctgca ccggccaaga aggctccggc caagaaggct 720gcgaccaagg ctgcaccggc caagaaggct ccggccaaga aggccgcgac caaggctgca 780ccggccaaga aggctccggc cgccaagaag gcgcccgcca agaaggctcc ggccaagcgc 840ggcggacgca agtaagtc 858
<210>201
<211>223
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>201Met Asn Lys Ala Glu Leu Ile Asp Val Leu Thr Glu Lys Leu Gly Ser1 5 10 15Asp Arg Arg Gln Ala Thr Ala Ala Val Glu Asn Val Val Asp Thr Ile
20 25 30Val Arg Ala Val His Lys Gly Glu Ser Val Thr Ile Thr Gly Phe Gly
35 40 45Val Phe Glu Gln Arg Arg Arg Ala Ala Arg Val Ala Arg Asn Pro Arg
50 55 60Thr Gly Glu Thr Val Lys Val Lys Pro Thr Ser Val Pro Ala Phe Arg65 70 75 80Pro Gly Ala Gln Phe Lys Ala Val Val Ser Gly Ala Gln Lys Leu Pro
85 90 95Ala Glu Gly Pro Ala Val Lys Arg Gly Val Thr Ala Thr Ser Thr Ala
100 105 110Arg Lys Ala Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys
115 120 125Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Thr Lys Ala
130 135 140Ala Pro Ala Lys Lys Ala Thr Ala Ala Lys Lys Ala Ala Pro Ala Lys145 150 155 160Lys Ala Thr Ala Ala Lys Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala
165 170 175Lys Lys Ala Ala Thr Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys
180 185 190Lys Ala Ala Thr Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala Ala Lys
195 200 205Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Arg Gly Gly Arg Lys
210 215 220
<210>202
<211>570
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>202agacagacag tgatcgacga aaccctcttc catgccgagg agaagatgga gaaggccgtc 60tcggtggcac ccgacgacct ggcgtcgatt cgtaccggcc gcgcgaaccc cggcatgttc 120aaccggatca acatcgacta ctacggcgcc tccaccccga tcacgcagct gtccagcatc 180aacgtgcccg aggcgcgcat ggtggtgatc aagccctacg aggcgagcca gctgcgcctc 240atcgaggatg cgatccgcaa ctccgacctc ggcgtcaatc cgaccaacga cggcaacatc 300atccgggtgt cgatcccgca gctcaccgag gagcgccgcc gcgacctggt caagcaggcc 360aaggccaagg gcgaggacgc caaggtgtcg gtgcgcaaca tccgtcgcaa ggcgatggag 420gaactctccc ggatcaagaa ggacggcgac gccggcgaag accaagtgac ccgcgccgag 480aaggatctcg acaagagcac ccaccagtac acgaatcaga tcgacgaact ggtcaagcac 540aaggaaggcg agttgctgga ggtctgacca 570
<210>203
<211>187
<212> PRT
<213>母牛分枝杆菌
<220>
<221>不确定
<222>(186)...(186)
<400>203Val Ile Asp Glu Thr Leu Phe His Ala Glu Glu Lys Met Glu Lys Ala1 5 10 15Val Ser Val Ala Pro Asp Asp Leu Ala Ser Ile Arg Thr Gly Arg Ala
20 25 30Asn Pro Gly Met Phe Asn Arg Ile Asn Ile Asp Tyr Tyr Gly Ala Ser
35 40 45Thr Pro Ile Thr Gln Leu Ser Ser Ile Asn Val Pro Glu Ala Arg Met
50 55 60Val Val Ile Lys Pro Tyr Glu Ala Ser Gln Leu Arg Leu Ile Glu Asp65 70 75 80Ala Ile Arg Asn Ser Asp Leu Gly Val Asn Pro Thr Asn Asp Gly Asn
85 90 95Ile Ile Arg Val Ser Ile Pro Gln Leu Thr Glu Glu Arg Arg Arg Asp
100 105 110Leu Val Lys Gln Ala Lys Ala Lys Gly Glu Asp Ala Lys Val Ser Val
115 120 125Arg Asn Ile Arg Arg Lys Ala Met Glu Glu Leu Ser Arg Ile Lys Lys
130 135 140Asp Gly Asp Ala Gly Glu Asp Glu Val Thr Arg Ala Glu Lys Asp Leu145 150 155 160Asp Lys Ser Thr His Gln Tyr Thr Asn Gln Ile Asp Glu Leu Val Lys
165 170 175His Lys Glu Gly Glu Leu Leu Glu Val Xaa Pro
180 185
<210>204
<211>1364
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>204cgacctccac ccgggcgtga ggccaaccac taggctggtc accagtagtc gacggcacac 60ttcaccgaaa aaatgaggac agaggagaca cccgtgacga tccgtgttgg tgtgaacggc 120ttcggccgta tcggacgcaa cttcttccgc gcgctggacg cgcagaaggc cgaaggcaag 180aacaaggaca tcgagatcgt cgcggtcaac gacctcaccg acaacgccac gctggcgcac 240ctgctgaagt tcgactcgat cctgggccgg ctgccctacg acgtgagcct cgaaggcgag 300gacaccatcg tcgtcggcag caccaagatc aaggcgctcg aggtcaagga aggcccggcg 360gcgctgccct ggggcgacct gggcgtcgac gtcgtcgtcg agtccaccgg catcttcacc 420aagcgcgaca aggcccaggg ccacctcgac gcgggcgcca agaaggtcat catctccgcg 480ccggccaccg atgaggacat caccatcgtg ctcggcgtca acgacgacaa gtacgacggc 540agccagaaca tcatctccaa cgcgtcgtgc accacgaact gcctcggccc gctggcgaag 600gtcatcaacg acgagttcgg catcgtcaag ggcctgatga ccaccatcca cgcctacacc 660caggtccaga acctgcagga cggcccgcac aaggatctgc gccgggcccg cgccgccgcg 720ctgaacatcg tgccgacctc caccggtgcc gccaaggcca tcggactggt gctgcccgag 780ctgaagggca agctcgacgg ctacgcgctg cgggtgccga tccccaccgg ctcggtcacc 840gacctgaccg ccgagctggg caagtcggcc accgtggacg agatcaacgc cgcgatgaag 900gctgcggccg agggcccgct caagggcatc ctcaagtact acgacgcccc gatcgtgtcc 960agcgacatcg tcaccgatcc gcacagctcg atcttcgact cgggtctgac caaggtcatc 1020gacaaccagg ccaaggtcgt gtcctggtac gacaacgagt ggggctactc caaccgcctc 1080gtcgacctgg tcgccctggt cggcaagtcg ctgtaggggc gagcgaagcg acgggagaac 1140agaggcgcca tggcgatcaa gtcactcgac gaccttctgt ccgaaggggt gacggggcgg 1200ggcgtactcg tgcgctccga cctgaacgtc cccctcgacg gcgacacgat caccgacccg 1260gggcgcatca tcgcctcggt gccgacgttg aaggcgttga gtgacgccgg cgccaaggtg 1320gtcgtcaccg cgcatctggg caggcccaag ggtgagccgg atcc 1364
<210>205
<211>340
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>205Val Thr Ile Arg Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Asn1 5 10 15Phe Phe Arg Ala Leu Asp Ala Gln Lys Ala Glu Gly Lys Asn Lys Asp
20 25 30Ile Glu Ile Val Ala Val Asn Asp Leu Thr Asp Asn Ala Thr Leu Ala
35 40 45His Leu Leu Lys Phe Asp Ser Ile Leu Gly Arg Leu Pro Tyr Asp Val
50 55 60Ser Leu Glu Gly Glu Asp Thr Ile Val Val Gly Ser Thr Lys Ile Lys65 70 75 80Ala Leu Glu Val Lys Glu Gly Pro Ala Ala Leu Pro Trp Gly Asp Leu
85 90 95Gly Val Asp Val Val Val Glu Ser Thr Gly Ile Phe Thr Lys Arg Asp
100 105 110Lys Ala Gln Gly His Leu Asp Ala Gly Ala Lys Lys Val Ile Ile Ser
115 120 125Ala Pro Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ile Val Leu Gly Val Asn Asp
130 135 140Asp Lys Tyr Asp Gly Ser Gln Asn Ile Ile Ser Asn Ala Ser Cys Thr145 150 155 160Thr Asn Cys Leu Gly Pro Leu Ala Lys Val Ile Asn Asp Glu Phe Gly
165 170 175Ile Val Lys Gly Leu Met Thr Thr Ile His Ala Tyr Thr Gln Val Gln
180 185 190Asn Leu Gln Asp Gly Pro His Lys Asp Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala
195 200 205Ala Leu Asn Ile Val Pro Thr Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Ile Gly
210 215 220Leu Val Leu Pro Glu Leu Lys Gly Lys Leu Asp Gly Tyr Ala Leu Arg225 230 235 240Val Pro Ile Pro Thr Gly Ser Val Thr Asp Leu Thr Ala Glu Leu Gly
245 250 255Lys Ser Ala Thr Val Asp Glu Ile Asn Ala Ala Met Lys Ala Ala Ala
260 265 270Glu Gly Pro Leu Lys Gly Ile Leu Lys Tyr Tyr Asp Ala Pro Ile Val
275 280 285Ser Ser Asp Ile Val Thr Asp Pro His Ser Ser Ile Phe Asp Ser Gly
290 295 300Leu Thr Lys Val Ile Asp Asn Gln Ala Lys Val Val Ser Trp Tyr Asp305 310 315 320Asn Glu Trp Gly Tyr Ser Asn Arg Leu Val Asp Leu Val Ala Leu Val
325 330 335Gly Lys Ser Leu
340
<210>206
<211>522
<212>DNA
<213>母牛分枝杆菌
<400>206acctacgagt tcgagaacaa ggtcacgggc ggccgcatcc cgcgcgagta catcccgtcg 60gtggatgccg gcgcgcagga cgccatgcag tacggcgtgc tggccggcta cccgctggtt 120aacgtcaagc tgacgctgct cgacggtgcc taccacgaag tcgactcgtc ggaaatggca 180ttcaaggttg ccggctccca ggtcatgaag aaggctgccg cccaggcgca gccggtgatc 240ctggagccag tgatggcggt cgaggtcacg acgcccgagg attacatggg tgaagtgagc 300ggcgacctga actcccgccg tggtcagatc caggccatgg aggagcggag cggtgctcgt 360gtcgtgaagg cgcaggttcc gctgtcggag atgttcggct acgtcggaga ccttcggtcg 420aagacccagg gccgggccaa ctactccatg gtgttcgact cgtacgccga agttccggcg 480aacgtgtcga aggagatcat cgcgaaggcg acgggccagt aa 522
<210>207
<211>173
<212> PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>207Thr Tyr Glu Phe Glu Asn Lys Val Thr Gly Gly Arg Ile Pro Arg Glu1 5 10 15Tyr Ile Pro Ser Val Asp Ala Gly Ala Gln Asp Ala Met Gln Tyr Gly
20 25 30Val Leu Ala Gly Tyr Pro Leu Val Asn Val Lys Leu Thr Leu Leu Asp
35 40 45Gly Ala Tyr His Glu Val Asp Ser Ser Glu Met Ala Phe Lys Val Ala
50 55 60Gly Ser Gln Val Met Lys Lys Ala Ala Ala Gln Ala Gln Pro Val Ile65 70 75 80Leu Glu Pro Val Met Ala Val Glu Val Thr Thr Pro Glu Asp Tyr Met
85 90 95Gly Glu Val Ile Gly Asp Leu Asn Ser Arg Arg Gly Gln Ile Gln Ala
100 105 110Met Glu Glu Arg Ser Gly Ala Arg Val Val Lys Ala Gln Val Pro Leu
115 120 125Ser Glu Met Phe Gly Tyr Val Gly Asp Leu Arg Ser Lys Thr Gln Gly
130 135 140Arg Ala Asn Tyr Ser Met Val Phe Asp Ser Tyr Ala Glu Val Pro Ala145 150 155 160Asn Val Ser Lys Glu Ile Ile Ala Lys Ala Thr Gly Gln
165 170
<210>208
<211>12
<212>PRT
<213>母牛分枝杆菌
<400>208Ala Leu Pro Gln Leu Thr Asp Glu Gln Arg Ala Ala1 5 10
Claims (43)
1.包括分离的母牛分枝杆菌抗原的免疫原性部分的多肽,其中所述抗原包括一种选自以下的序列:SEQ ID NO:143、145、147、152、154、156、158、160、162、165、166、170、172、174、177、178、181、182、184、186、187、192、194、196、197、199、201、203、205和207所述的序列。
2.包括分离的母牛分枝杆菌抗原的免疫原性部分的多肽,其中所述抗原包括一种选自以下的序列:
(a)按照计算机算法BLASTP测定,与SEQ ID NO:143、145、147、152、154、156、158、160、162、165、166、170、172、174、177、178、181、182、184、186、187、192、194、196、197、199、201、203、205和207所述的一种序列至少约50%残基相同的序列;
(b)按照计算机算法BLASTP测定,与SEQ ID NO:143、145、147、152、154、156、158、160、162、165、166、170、172、174、177、178、181、182、184、186、187、192、194、196、197、199、201、203、205和207所述的一种序列至少约75%残基相同的序列;和
(c)按照计算机算法BLASTP测定,与SEQ ID NO:143、145、147、152、154、156、158、160、162、165、166、170、172、174、177、178、181、182、184、186、187、192、194、196、197、199、201、203、205和207所述的一种序列至少约95%残基相同的序列;
3.包括分离的母牛分枝杆菌抗原的免疫原性部分的多肽,其中所述抗原包括一种选自以下的多核苷酸编码的氨基酸序列:
(a)SEQ ID NO:142、144、146、151、153、155、157、159、161、163、164、169、171、173、175、176、179、180、183、185、191、193、195、198和200所述的序列;
(b)SEQ ID NO:142、144、146、151、153、155、157、159、161、163、164、169、171、173、175、176、179、180、183、185、191、193、195、198和200所述序列的互补序列;和
(c)按照计算机算法BLASTP测定,与(a)或(b)的一种序列相同的可能性至少约99%的序列。
4.包括编码按照权利要求1-3中任一项的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸。
5.包括按照权利要求4的多核苷酸的表达载体。
6.用按照权利要求5的表达载体转化的宿主细胞。
7.权利要求6的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自大肠杆菌、分枝细菌、昆虫、酵母和哺乳动物细胞。
8.包括至少一种按照权利要求1-3中任一项的多肽的融合蛋白。
9.包括至少一种按照权利要求1-3中任一项的多肽和一种生理上可接受的载体的药用组合物。
10.包括一种按照权利要求4的多核苷酸和一种生理上可接受的载体的药用组合物。
11.包括一种按照权利要求8的融合蛋白和一种生理上可接受的载体的药用组合物。
12.包括按照权利要求1-3中任一项的多肽和一种非特异性免疫应答增强剂的疫苗。
13.包括按照权利要求4的多核苷酸和一种非特异性免疫应答增强剂的疫苗。
14.包括一种按照权利要求8的融合蛋白和一种非特异性免疫应答增强剂的疫苗。
15.按照权利要求12-14中任一项的疫苗,其中所述非特异性免疫应答增强剂是一种佐剂。
16.按照权利要求12-14中任一项的疫苗,其中所述非特异性免疫应答增强剂选自:
(a)去脂质和去糖脂的母牛分枝杆菌细胞;
(b)灭活的母牛分枝杆菌细胞;和
(c)母牛分枝杆菌培养物滤液。
17.增强患者免疫应答的方法,包括给予患者按照权利要求9-11中任一项的药物组合物。
18.增强患者免疫应答的方法,包括给予患者按照权利要求12-14中任一项的疫苗。
19.权利要求17和18中任一项的方法,其中所述免疫应答为Th1应答。
20.治疗患者病症的方法,包括给予所述患者按照权利要求9-11中任一项的药物组合物。
21.治疗患者病症的方法,包括给予所述患者按照权利要求12-14中任一项的疫苗。
22.权利要求20和21中任一项的方法,其中所述病症选自免疫紊乱、感染性疾病、皮肤病和呼吸系统疾病。
23.权利要求23的方法,其中所述病症选自分枝杆菌感染、哮喘和牛皮癣。
24.治疗患者疾病的方法,该方法包括给予包含一种选自以下的组分的组合物:
(a)灭活的母牛分枝杆菌细胞;
(b)去脂质和去糖脂的母牛分枝杆菌细胞;
(c)耗尽分枝菌酸的去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌细胞;
(d)耗尽分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌细胞;和
(e)母牛分枝杆菌培养物滤液,
所述病症选自免疫紊乱、感染性疾病、皮肤病和呼吸系统疾病。
25.权利要求24的方法,其中所述病症选自分枝杆菌感染、哮喘和牛皮癣。
26.增强对抗原的非特异性免疫应答的方法,包括给予一种多肽,所述多肽包括母牛分枝杆菌抗原的免疫原性部分,其中所述母牛分枝杆菌抗原包括选自以下的一种序列:
(a)SEQ ID NO:89和201所述的序列;和
(b)按计算机算法BLASTP测定,至少约80%残基与SEQ ID NO:89和201所述序列相同的序列。
27.检测患者分枝杆菌感染的方法,包括:
(a)使患者皮肤细胞与按照权利要求1-3中任一项的一种或多种多肽接触;和
(b)检测所述患者皮肤上的免疫应答。
28.权利要求27的方法,其中所述免疫应答是硬结。
29.一种诊断试剂盒,包括:
(a)按照权利要求1-3中任一项的多肽;和
(b)足以使所述多肽与患者皮肤细胞接触的装置。
30.检测生物样品中的分枝杆菌感染的方法,包括:
(a)使所述生物样品与按照权利要求1-3中任一项的一种多肽接触;和
(b)检测在所述生物样品中结合到所述多肽的抗体的存在。
31.权利要求30的方法,其中所述多肽结合到一种固相支持体上。
32.权利要求30的方法,其中所述生物样品选自全血、血清、血浆、唾液、脑脊液和尿。
33.检测生物样品中的分枝杆菌感染的方法,包括:
(a)使所述生物样品与一种能够结合到按照权利要求1-3中任一项的一种多肽的结合剂接触;和
(b)检测所述生物样品中的结合到所述结合剂的一种蛋白或多肽。
34.权利要求33的方法,其中所述结合剂是一种单克隆抗体。
35.权利要求33的方法,其中所述结合剂是一种多克隆抗体。
36.一种诊断试剂盒,包括:
(a)至少一种按照权利要求1-3中任一项的多肽;和
(b)一种检测试剂。
37.权利要求36的试剂盒,其中所述多肽固定在一种固相支持体上。
38.权利要求36的试剂盒,其中所述检测试剂包括缀合到一种结合剂的一个报道基团。
39.权利要求38的试剂盒,其中所述结合剂选自抗-免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素。
40.权利要求38的试剂盒,其中所述报道基团选自放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、生物素和染料颗粒。
41.一种结合到按照权利要求1-3中任一项的多肽的单克隆抗体。
42.一种结合到按照权利要求1-3中任一项的多肽的多克隆抗体。
43.增强对抗原的非特异性免疫的方法,包括给予包含一种选自以下的组分的组合物:
(a)耗尽分枝菌酸的去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌细胞;
(b)耗尽分枝菌酸和阿拉伯半乳聚糖的去脂质和去糖脂母牛分枝杆菌细胞。
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