JP4415200B2

JP4415200B2 - 遅発育性抗酸菌ポリペプチド

Info

Publication number: JP4415200B2
Application number: JP02258899A
Authority: JP
Inventors: 毅山田; 壮吉松本
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2010-02-17
Anticipated expiration: 2019-01-29
Also published as: JP2000219699A; AU2320700A; WO2000044905A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遅発育性抗酸菌（マイコバクテリウム）の産生するポリペプチドおよびその誘導体、該ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】
ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis)、らい菌（Mycobacterium leprae）などの病原性抗酸菌（マイコバクテリウム）は非常に増殖の緩慢な菌で、人類の３分の１に感染しているといわれる。遅発育性は、細胞内寄生を可能にし、また薬剤に対する抵抗性を付与する。
【０００３】
本発明者は、病原性抗酸菌の遅発育メカニズムを解明し、結核等の病原性抗酸菌の新たな診断予防、ワクチン及び治療剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＢＣＧ東京株からの配列番号１で表されるポリペプチド（以下、ＭＤＰ１(MycobacteriumDNA BindingProtein1)と略す）を分離し、該ポリペプチドが遅発育性の原因であることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は以下の項１〜項４を提供するものである。
項１．１又は複数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失していてもよい配列番号１（２０５個のアミノ酸）で表される病原性抗酸菌に対する免疫原性を有するポリペプチド。
項２．項１に記載のポリペプチドをコードしてなるＤＮＡ。
項３．項２に記載のＤＮＡを含むベクターまたは該ベクターを含む形質転換体。
項４．項３に記載の形質転換体を培養することを特徴とする項１に記載のポリペプチドの製造法。
【０００６】
該ポリペプチド、特にリン酸化されたＭＤＰ１は、結核の診断およびワクチンの製造に有用である。該ポリペプチドは、糖鎖により修飾されていてもよい。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチドは、例えばＢＣＧ東京株から得ることができるが、該株に限定されず、他のＢＣＧ株、或いは結核菌、らい菌等のマイコバクテリウム属の菌から得られる蛋白質であっても本発明に包含される。
【０００８】
本発明の２０５個のアミノ酸からなるポリペプチドは、病原性抗酸菌に対する免疫原性を有する限り１又は複数個、好ましくは１〜数個のアミノ酸が特定の位置又はランダムに置換、付加又は欠失していても良い。また、本発明のポリペプチドはリン酸化されたものであるのが好ましい。なお、病原性抗酸菌に対する免疫原性を有するとは、該ポリペプチドを必要に応じて他のタンパク質などと組み合わせて哺乳動物に投与したときに病原性抗酸菌に対する抗体産生を誘導する能力を有することを意味する。
【０００９】
前記アミノ酸をコードするＤＮＡは、該ＤＮＡがコードするポリペプチドが病原性抗酸菌に対する免疫原性を有する限り１又は複数個、好ましくは１〜数個の核酸塩基が特定の位置又はランダムに置換、付加又は欠失していても良い。本発明のＤＮＡには、配列番号２のＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡを包含する。
【００１０】
特定のアミノ酸を置換、付加又は欠失する方法としては、ポイントミューテーション法、ＰＣＲを利用したdeletion/insertion法などの従来公知の方法が広く用いられる。
【００１１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、通常ハイブリダイズ法で用いられる条件を意味し、このような条件は、当業者であれば容易に理解できる。
【００１２】
本発明のポリペプチドは、例えば、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだベクターを細胞に導入して形質転換体とし、該形質転換体を培地中で培養することを特徴とする前記項１で表されるポリペプチドの製造法により製造される。
【００１３】
上記のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだベクターで形質転換される細胞としては、特に限定されず、従来公知の形質転換用の細胞が広く用いられるが、例えば大腸菌、ＢＣＧ菌等の細菌類、酵母などの真核微生物、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、等の各種哺乳動物の培養細胞が挙げられ、好ましくは細菌又は酵母が例示される。
【００１４】
大腸菌等へのベクターの導入も、公知の方法に従い行うことができる。
【００１５】
本発明のポリペプチドの製造に用いられるベクターとしては、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳に必要なプロモーター等を備えている限り特に限定されないが、例えば、pBluescript、pGEX等が挙げられる。
【００１６】
本発明は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだベクターが前記細胞に組み込まれた形質転換体にも関する。
【００１７】
該形質転換体が培養される培地は、形質転換される細胞の種類にもよるが、例えば大腸菌などの微生物の場合には、炭素源（グルコース等）、窒素源（硫酸アンモニウムなど）、無機物（リン酸ナトリウム、硫酸鉄、硫酸マンガンなど）を含む培地が挙げられる。温度、ｐＨ、時間などの培養条件は、各種細胞の通常の培養条件がそのまま用いられる。
【００１８】
本発明のポリペプチドを結核または抗酸菌の診断に用いる場合、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド中に含まれる数個から数十個のペプチドを抗原として用い、該抗原を、抗体を含む生物試料（血清など）とをin vitroで接触させ、次いで、得られた抗原抗体複合体を検出することにより結核または抗酸菌の診断を行うことができる。
ＭＤＰ１のワクチンへの応用
さまざまな難病の防御抗原（マラリア等の原虫感染症、肺炎球菌、クラミジア等の細菌感染症、ＨＩＶやインフルエンザ等のウイルス感染症など）が同定され、動物実験レベルでは感染防御効果を得ているが、ヒトに応用する場合、安全で有効なアジュバントが開発されていないため、十分な感染防御効果が得られず、ワクチンとして使用するに至っていない。
【００１９】
本発明者は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＤＰ１は、ＤＮＡと結合させることで免疫原性が増強され、抗体価が上がることを証明した。上記の防御抗原をＭＤＰ１内に組み込み、融合タンパク質としてＤＮＡとともに使用することで、感染性のない安全で有効なワクチンを製造できる。また、アジュバント活性が十分でない場合には、融合タンパク質を形質転換の宿主細胞としてのＢＣＧ菌内で発現させ、それをワクチンとして活用できる。ＢＣＧはアジュバント活性最大の生ワクチンであり、効果が持続し、また安全なワクチンとして現在も使用されている。
【００２０】
ＭＤＰ１のワクチンとしての使用の態様としては、
１．ＭＤＰ１内に異種抗原を発現させた融合蛋白質をＤＮＡとともにワクチンとして使用する；
２．上記融合タンパク質を，ＤＮＡ、既存アジュバントとともにワクチンとして使用する；
３．上記融合タンパク質をＢＣＧ菌内で発現させ、生ワクチンとして使用する；などが例示される。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、マイコバクテリウム、大腸菌などの細菌に対し遅発育性を示す新規ポリペプチドを単離し、その構造を明らかにした。
【００２２】
該ポリペプチドは、遺伝子工学の方法により容易に大量生産でき、結核、らい等の診断用の抗原、ワクチン開発等に応用可能である。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはリボソームに結合して増殖を遅延させるものであり、感染症ないし癌の治療にも使用できる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を具体的な実施態様を用いてより詳細に説明する。
製造例１
(1) バクテリア株、プラスミド、培養液
ＢＣＧ東京株、M.tuberculosis H37Rv及びM. smegmatis ATCC606は、ソートン培地または１０％ＡＤＣ濃縮物及び０．０５％ツイーン８０を添加したミドルブルック７Ｈ９ブロス（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、米国）中、３７℃で増殖させた。M. leprae 53タイ株は、マツオカ・マサノリ博士から得た。M. smegmatisは、プラスミドｐＳＯ２４６及びその誘導体の宿主として使用した。
【００２５】
組換えM. smegmatisクローンは、１０％ＯＡＤＣ濃縮物（ディフコラボラトリーズ）、０．５％グリセロール、ペニシリン４００単位／ｍｌ、シクロヘキシミド１００μｇ／ｍｌ７Ｈ１０アガー）を添加したミドルブルック７Ｈ１０アガー（ディフコラボラトリーズ）上で培養することにより選択した。大腸菌株XL1-Blueは、プラスミドpBluescript SK(+) (pBS SK+)（ストラタジーン・クローニング・システム、カリフォルニア、米国）またはｐＧＥＸ４Ｔ−３（ファルマシア・バイオテック、東京、日本）及びその誘導体の宿主として使用した。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥは、ｐＥＴ２２ｂ（＋）(Novagen Madison米国）、λＭＳＯＥｌｏｘ（アマシャム）及びその誘導体の宿主として使用した。すべての大腸菌株は、ＬＢブロスで増殖させた。
(2) ＢＣＧからのＭＤＰ１の精製
酸可溶性蛋白質を既述(Jhon et al., 1967)のいくつかの改変方法で沈殿させた。バクテリアは、５０ｍｌＴＭＮＳＨ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ＝７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、６０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ、及び６ｍＭ２−メルカプトエタノール）に再懸濁し、超音波により破砕した。３００００ｇで２時間遠心分離して得たペレットを、０．２５ＮＨＣｌに４℃で終夜攪拌することにより再懸濁し、２００００ｇで２０分間遠心分離した。上澄に０．１倍量の１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡを激しく攪拌しながら加えた。４℃で４時間静置して形成した沈殿を遠心分離により回収し、アセトン（２０ｍｌ）に０．０１ｍｌの濃塩酸を加えた酸性アセトンで１回洗浄し、アセトンで２回洗浄し、真空デシケーターで乾燥した。乾燥された沈殿を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に再懸濁した。次に、酸可溶性蛋白質を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中のグラニジン塩酸塩ＧｄｎＣｌの直線グラジエントによりファーストフローカラム（ベッドボリューム５ｍｌ；ファルマシア）Hitrap CM Sepharose上を用い室温でクロマトグラフィーにかけて分画した。グラジエントは、１５ｍｌの０及び５％ＧｄｎＣｌ溶液を充填したグラジエント装置で行った。１ｍｌ／ｍｉｎの流速に維持し、１ｍｌの各フラクションを集めた。精製されたＭＤＰ１を含むフラクションを５％ＧｄｎＣｌを含む０．２Ｍリン酸緩衝液に対して透析し、濃縮した。最後に、Hiload Seperdex 200 pgカラム（ファルマシア）上でのゲル濾過によりさらに精製した。蛋白質の純度は２２０ｎｍの吸光度の測定又はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析でモニターした。
(3) アミノ酸配列の決定
アミノ酸分析用の標品を、ＰＶＤＦ膜（ミリポア、マサチューセッツ、米国）からの蛋白質バンドを切り出すことにより得た。１２．５％ポリアクリルアミドゲル中の蛋白質は、０．０５％ＳＤＳを含む３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ；シグマ、セントルイスミズーリ）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１１）を用いてＰＶＤＦ膜上で電気泳動的にブロットした。ＣＢＢによる染色後、蛋白質のスポットをアプライドバイオシステム４７７Ａガスフェーズシークエンサー（アプライドバイオシステムズ）での自動エドマン分解によるアミノ末端配列の決定に供した。
(4) 遺伝子クローニング、ＤＮＡ配列決定及びコンピューター分析
ＢＣＧのゲノムＤＮＡをＤＮＡの主要部分が１〜５ｋｂｐになるまで注射針を繰り返し通すことにより断片化し、アマーシャム(Amersham)のｃＤＮＡラピッド・アダプター・ライゲーション・モジュールを用いてＥｃｏＲＩアダプターにライゲートし、λＭＯＳＥｌｏｘのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。コロニー・ハイブリダイゼーションを既述のように（マツオら、１９８８）、Ｎ末端アミノ酸配列と相同な２セットの［α−³²Ｐ］標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いて行った。プローブ１、２の配列は、５’−ＡＴＧＡＡＣＡＡＧＧＣ（Ｃ又はＧ）ＧＡＧＣＴ（Ｃ又はＧ）ＡＴＣＧＡＣＧＴ（Met-1〜Val-9に相当）及び５’−ＧＡＣＧＴ（Ｃ又はＧ）（Ｔ又はＣ）Ｔ（Ｃ又はＧ）ＡＣ（Ｃ又はＧ）ＣＡＧＡＡＧ（Ｔ又はＣ）Ｔ（Ｃ又はＧ）ＧＧ（Asp-8〜Gly-15に相当）であった。ＭＤＰ１遺伝子を含む挿入されたＤＮＡフラグメントは、タック・ダイ・プライマー・サイクル・シークエンシング・キット及び３７３Ａシステム（アプライド・バイオシステムズ）を用いて配列決定した。配列相同性のサーチは、ファスタプログラム(fasta program；ピアソン及びリップマン、１９８８)を用いたＤＤＢＪ（静岡）データベースを通して行った。
(5) 大腸菌におけるＧＳＴとの融合蛋白質としてのＭＤＰ１の発現
プライマーは、ＭＤＰ１遺伝子の増幅のために合成した。プライマーＡのＤＮＡ配列は、5'GGggatccGGGAGGGTTGGGATGAACAAAGCAG（センス鎖）であり、プライマーＢのＤＮＡ配列は5'GGGggatccAGCACGTGGGTGTTGTCGTTG（アンチセンス鎖）であった。小文字は、加えた制限酵素部位を示す。プライマーＡ及びＢにより増幅された生成物は、HindIII及びBamHIで消化され、ｐＧＥＸ４Ｔ−３の同じ部位に挿入された。最終構築物はｐＧＥＸＭＤＰ１と名付けられた。大腸菌はこのプラスミドにより形質転換された。ＧＳＴ−ＭＤＰ１の発現は、製造元（ファルマシア）の説明書に従い行った。
(6) ゲル遅延試験
１００ｎｇのｐＢＳＫＳ＋、HindIIIで消化されたｐＢＳＫＳ＋、または２４０ｎｇのＭＳ２ファージＲＮＡを、５％グリセロールを含むＰＢＳ６μｌ中に種々の量のＭＤＰ１（最終濃度；20，10，5，2.5，1.25，0，μＭ）と混合した。サンプルを３７℃で１０分間プレインキュベートし、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中、ＴＡＥ緩衝液を用いた電気泳動により分析し、エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）で染色した。核酸を紫外線下に可視化した。
(7) 免疫電子顕微鏡試験
免疫電子顕微鏡試験を既知のようにして行った（Ferreira等、１９９２）。
(8) ＢＣＧフラクションの調製
ソートン培地中３７℃で培養したＢＣＧをＴＭＮＳＨ緩衝液中で超音波により破砕した。破砕物を１０００ｇで４℃、５分間の遠心分離を２回行い、壊れていない細胞を除去した。次いで、細胞壁、細胞膜、リボソーム、細胞質画分既知の方法により調製した（大原ら、１９９７）。分泌タンパク質は既述のように調製した（松本ら、１９９６ｂ）。
(9) ＢＣＧの50Sリボソームサブユニット由来のリボソーム及びＭＤＰ１の精製
ＢＣＧ由来のリボソームの調製及びリボソームサブユニットの分離は、既に記載されている（山田ら、１９７２）。リボソーム蛋白質は、既知のように（ヒンデンナッハら、１９７１）、０．１ＭＭｇＣｌ₂の存在下に６６％酢酸を用いて５０Ｓサブユニットから抽出した。次いで、抽出物を５％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。抽出された蛋白質は、Ｃ₄カラムを用い日立Ｌ−６０００ＨＰＬＣシステムを用いた逆相−ＨＰＬＣにより分離した。２ｍｇの５０Ｓ総蛋白質を、０．１％ＴＦＡ中の３０〜７０％のアセトニトリルの直線グラジエントを用い、９０分間０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速でクロマトグラフを行った。溶離液は、２２０ｎｍの吸光度の測定又はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析でモニターした。
(10)免疫手法
ＭＤＰ１に対する抗血清を、フロイント不完全アジュバント中の２０μｇの精製ＭＤＰ１を雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに２回腹腔内免役して得た。ウエスタンブロット分析を既知のように行った（松本ら、１９９６ｂ）。
(11)ＭＤＰ１によるインビトロでのＤＮＡ合成の阻害。
【００２６】
インビトロでのＤＮＡ合成を既述のように（サムブルックら、１９８９）クレノウフラグメント（タカラ）を用いて行った。一本鎖ＤＮＡをｆ１ファージの感染によりｐＢＳＫＳ＋を有する大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅから調製した。反応前に、一本鎖ＤＮＡ（１μｇ）及び５ｐｍｏｌのＭ１３ファージの１２４４プライマー（日本ジーン）を８５℃で１０分間インキュベートし、２２℃までゆっくり冷却してアニーリングした。ＤＮＡ合成の延長反応は、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１２４４プライマーのアニールされたＤＮＡ鋳型０．６μｇ、０．９ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５０μＣｉの［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ、８ユニットのクレノウフラグメント、１０ｍＭのＤＴＴ中、ＭＤＰ１又はＢＳＡの存在下又は不存在下に行った。最終容量は３０μｌであった。延長反応は、８分間２２℃で行った。反応は０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を３０μｌ加えて停止させた。次いで、サンプルを６８℃でインキュベートし、クレノウフラグメントを不活性化した。各サンプル５μｌをグラスファイバーフィルター（Ｔｏｙｏ濾紙）上にスポットした。濾紙は２０ｍＭピロリン酸ナトリウムを含む５％ＴＣＡで３回洗浄した。濾紙を乾燥後、各サンプル中のＴＣＡ不溶性［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰをシンチレーションカウンターにより測定した。
(12)インビトロ転写分析
既述方法（ペダーソンら、１９９４）を改変してインビトロ転写分析を行った。各種の量（20，10，5，2.5，1.25及び0μＭ）のＰＢＳ中の精製ＭＤＰ１及びＢＳＡを０．１１ｐｍｏｌ（２００ｎｇ）のｐＢＳＫＳ＋と反応容量を２０μｌに調整して混合した。３７℃で１０分間インキュベート後、等容量の以下の溶液を加えた：０．０２％（ｗ／ｖ）ＤＥＰＣ；８０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１６ｍＭのＭｇＣｌ₂；４ｍＭのスペルミジン；１０ｍＭのＤＴＴ；１．８ｍＭのＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ及びＵＴＰ；１．８４Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤；１．４２Ｕ／ｍｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（タカラ）及び０．３６ｍＣｉ／ｍｌの［α−³²Ｐ］ＵＴＰ。インビトロ転写は、３７℃で３０分間行った。次いで、５μｌのサンプルをグラスファイバーフィルター上にスポットした。濾紙は２０ｍＭピロリン酸ナトリウムを含む５％ＴＣＡで３回洗浄した。グラスファイバーフィルターを乾燥後、各サンプル中のＴＣＡ不溶性［α−³²Ｐ］ＵＴＰをシンチレーションカウンティングにより測定した。
(13)インビトロ翻訳分析
インビトロ翻訳分析を、大腸菌Ｓ３０共役転写及び翻訳システム（プロメガ）を用いて行った。各量（最終濃度；20，10，5，2.5，1.25及び0μＭ）のＭＤＰ１又は卵白リゾチーム、７μｌのＳ３０抽出物、５０ｎＣｉ［³⁵Ｓ］−メチオニン、メチオニンを含まない１０μｌのプレミックス（プロメガ）、４μｇ（３．３３ｐｍｏｌ）のＭＳ２ＲＮＡ（ベーリンガーマンハイム、東京、日本）を混合した。最終反応容量は３４μｌであった。翻訳は３７℃で１時間行った。放射標識メチオニンの取り込みを評価するために、製造元の説明書に従い、５μｌのサンプルを取り、２４５μｌの１ＭＮａＯＨに溶解し、最終２０％のＴＣＡで沈殿させた。ＴＣＡ処理されたサンプルは、グラスファイバーフィルター上にトラップ後、５％ＴＣＡで３回洗浄した。膜を乾燥し、放射能を測定した。
(14)ＭＤＰ１のリン酸化の検出
１μｇの精製ＭＤＰ１をバクテリアのアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）を用い、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）及び１ｍＭＭｇＣｌ₂を含む溶液中、６５℃で１時間処理した。製造元の使用説明書に記載されたように、ＢＡＰで処理された或いは処理されていないＭＤＰ１の蛋白イムノブロットホスホスレオニン、ホスホセリン、ホスホチロシンに対する抗体（トランスダクション・ラボラトリーズ、ケンタッキー、米国）を用いてウェスタンブロット法を行った。
(15)速育性細菌におけるＭＤＰ１の発現
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ中でのＭＤＰ１（ＢＣＧ）の発現のために、センス鎖用のプライマーＣを合成した。該オリゴヌクレオチド配列は、5'GGGaagcttTTTGAGGGTGCGTGCGCGTACであった。プライマーＢ及びＣにより増幅したＭＤＰ１構造遺伝子及びその上流領域をコードする遺伝子をHindIII及びBaMHIの両方で消化し、ｐＢＳＫＳ＋の同じ部位（ｐＢＭＤＰ１と名付けられた）に挿入された。ｐＢＭＤＰ１はHindIII及びBamHIで消化され、ＭＤＰ１遺伝子を含む１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをｐＳＯ２４６（松本ら、１９９６ａ）の同じ部位に挿入した。それは、ｐＳＯＭＤＰ１と名付けられた。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを既述のように（松本ら、１９９６ｂ）エレクトロポレーションによりｐＳＯＭＤＰ１でトランスフォームした。大腸菌中で非融合形態のＭＤＰ１を発現するために、以下のプライマーを新たに合成した。センス鎖用のプライマーＤは、CcatatgAACAAAGCAGAGCTCATTGACであり、プライマーＥは、CaagcttCTATTTGCGACCCCGCCGAGCGGであった。ＭＤＰ１の構造遺伝子を含む増幅されたＤＮＡは、NdeIとHindIIIの両方で切断され、ｐＥＴ２２ｂ（＋）の同じ部位に挿入された。このプラスミドはｐＥＴ２２ＭＤＰ１と名付けられた。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを、ｐＥＴ２２ＭＤＰ１でトランスフォームした。トランスフォームされた細胞は、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含み、並びに、０．５ｍＭのＩＰＴＧを含むか又は含まないＬＢアガー上で増殖させた。
結果
(1) ＤＮＡ結合能を有する最も豊富な蛋白質の分析
ＢＣＧ中のＤＮＡ結合蛋白を同定するために、細胞ライゼートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＰＶＤＦ膜上にブロットした。該膜は次いで［α−³²Ｐ］標識pBluescript KS+(pBSKS+)と反応させ、蛋白−ＤＮＡ相互作用をオートラジオグラフで視覚化した。図１Ａに示されるように、強い反応が２８ｋＤａで観察された。この２８ｋＤａＤＮＡ結合蛋白を、ＭＤＰ１と名付けた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＭＤＰ１が最も豊富にある蛋白質であることを示した（図１Ｄのレーン１の矢印により示される）。本発明者は、上記のようにＭＤＰ１の精製を行った。最初に、ＭＤＰ１の豊富なサンプルは、ＢＣＧライゼートを０．２５Ｎ−ＨＣｌ（図１Ｄのレーン２）で処理し、次いでイオン交換カラムで精製して調製された。図１Ｂは、クロマトグラフのプロフィールを示し、主要ピークフラクションの蛋白質は図１Ｄのレーン３に視覚化された。このフラクションの蛋白質は、ゲル濾過カラムを通してさらに精製され（図１Ｃ）高度に精製されたＭＤＰ１が得られた（レーン４、図１Ｄ）。最終工程において、ＭＤＰ１は、１９５ｋＤａ蛋白として溶出された（図１Ｄ）。これは、ＭＤＰ１が多量体を形成していることを示すものである。ＭＤＰ１の最終収率は１００ｇのＢＣＧの新鮮湿重量から約５ｍｇであった。
【００２７】
精製されたＭＤＰ１のアミノ酸配列のＮ末端は、アミノ酸シークエンサーによりMNKAELIDVLYQKLG-Dと同定された。ＭＤＰ１をコードする遺伝子をクローン化するために、コロニーハイブリダイゼーションをＮ末端アミノ酸配列（実施例参照）に相当する２つの［α−³²Ｐ］標識されたセットのオリゴヌクレオチドプローブを用いて行った。２つのプローブでハイブリダイズされたＤＮＡフラグメントを得、配列決定した。図２Ａは、核酸配列及び推定アミノ酸配列を示す。ＤＮＡフラグメントは、２６５位にＡＴＧで始まり８８２位のＴＡＧ終止コドンで終わるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＭＤＰ１のＮ末端アミノ酸配列（図２Ａにおいて枠で囲まれた部分）はこのＯＲＦと完全に一致することが見出された。予期されたように、ＭＤＰ１は、極度に塩基性（等電点（ＰＩ）が１２．４）であり、アラニン、アルギニン、リシン、プロリン及びスレオニンを多量に含む。可能性のあるシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列は、開始コドン（図２Ａの下線部）の上流７ヌクレオチドの位置に観察された。バクテリアにおいて、いくつかの染色体結合蛋白に観察されたＤＮＡ結合モチーフは、４６位〜６５位みられた（図２Ａの太い下線）。この領域は、ＭＤＰ１のＤＮＡ結合部位と予測される。
【００２８】
ＭＤＰ１に相同ないくつかの蛋白質及びアミノ酸配列のアラインメントを示すコンピューター検索が、図２Ｂに示される。２つのＯＲＦでコードされる高い相同が、M.tuberculosis及びM.leprae由来のゲノムのコスミドライブラリーのＤＮＡ配列において観察された。ＭＤＰ１は、M.tuberculosisと９５％の相同性を有し、M.lepraeと８３％の相同性を有する。コンピューター分析は、ＭＤＰ１のＮ末端領域がバクテリア由来のＨＵに対し部分的な相同性を有し、Ｃ末端領域は真核細胞のヒストンＨ１クラスと部分的な相同性を有することを示した。代表例として、ＭＤＰ１と大腸菌のＨＵ２及びヒトのヒストンＨ１の比較を図２Ｂに示す。最初の９０アミノ酸の最良のアラインメントは、ＭＤＰ１とＨＵ２の間で４１％（Ｋａｎｏら、１９８７）、ＭＤＰ１とヒトヒストンＨ１の間で２５％（Ａｌｂｉｇら、１９９１）であった。
(2) ＭＤＰ１による核酸コンフォーメーションの認識
ＭＤＰ１のＤＮＡ結合能は、以下のように確認された。ＭＤＰ１はSchistosoma japonicum グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（ＧＳＴ−ＭＤＰ１）との融合蛋白質として発現された。大腸菌発現ＧＳＴ−ＭＤＰ１の全蛋白質は、膜に転写された。膜は［α−³²Ｐ］標識ｐＢＳＫＳ＋と反応し、そのオートラジオグラフが図３Ａに示される。付加的なバンドがレーン４とレーン５に観察され（図３Ａ上の矢印で示される）、抗ＭＤＰ１抗体（データは示さない）により認識された（データは示されていない）。これは、該遺伝子によりコードされる産物のＤＮＡ結合能を確認する。分解産物が観察され、この融合蛋白が大腸菌中で安定でないことを示す。ＭＤＰ１の核酸結合活性をより詳細に分析するために、ゲル遅延アッセイを次に行った。各種濃度の精製ＭＤＰ１を環状プラスミド、直鎖プラスミド、又はＲＮＡとともにインキュベーション後、複合体をアガロースゲル電気泳動で分析した（図３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄ）。ヌクレオチドがＭＤＰ１の濃度に依存してスロット中で遅延するので、該データは、ＭＤＰ１がＤＮＡ及びＲＮＡの両方に結合することを示した。ＭＤＰ１のニックを有するＤＮＡ（図３Ｂ）、直鎖形態のＤＮＡ（図３Ｃ）及びＲＮＡ（図３Ｄ）に対する結合能は、ほぼ同一であった。一方、他のものよりもスーパーコイルＤＮＡのゲルへの移動に対する優先的な阻害は、１０〜５μＭＭＤＰ１において観察された（図３Ｂ、３Ｃ）。これらは、ＭＤＰ１が核酸のコンフォーメーションを認識することを示す。
(3) 細胞中のＭＤＰ１の局在化
ＭＤＰ１の局在化を知るために、最初は、免疫電子顕微鏡試験をＢＣＧを標的として行った。結果は、ＭＤＰ１同族体が細胞壁、細胞膜、リボソーム領域、染色体ＤＮＡ領域に局在化することを示した（図４Ａ，パネルａ）。第２に、ＢＣＧ由来の各細胞下画分が調製された。これらのサンプルは、膜上に転写され、抗ＭＤＰ１抗体と反応された（図４Ｂ、パネルｂ）。強い反応が細胞壁、細胞膜、リボソーム画分の２８ｋＤａ蛋白で観察されたが、分泌蛋白及び細胞質蛋白では観察されなかった。同時に、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲル染色により視覚化され、推定ＭＤＰ１バンドが図４Ｂのパネルａにおいて矢印で示される。これらの生化学的観察は、ＢＣＧに関する免疫電子顕微鏡試験の結果と一致する。興味あることに、抗ＭＤＰ１抗体のいくつかは免疫電子顕微鏡分析において直接にリボソーム粒子と反応しているらしく、それらはリボソーム画分と強力に反応する（図４Ｂ、パネルｂ）。これらは、ＭＤＰ１がリボソームに結合する可能性を示す。この点を明らかにするために、リボソーム粒子（３０Ｓ及び５０Ｓサブユニット）をシュクロース密度勾配遠心により分離した。３０Ｓ又は５０Ｓサブユニットに由来する蛋白質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、転移した膜上で抗ＭＤＰ１抗体と反応された。該反応は、図４Ｂのパネルｂに示されるように、３０Ｓサブユニットではなく５０Ｓサブユニットの２８ｋＤａ及び２７ｋＤａ蛋白質において観察された。この結果を確認するために、５０Ｓサブユニットの蛋白質をＲＰ−ＨＰＬＣ（図４Ｃ、パネルａ）により分離された。各画分の蛋白は、ＣＢＢにより染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化され（図４Ｃ、パネルｂ）、或いはこれらは、膜上にブロッティングした後、抗ＭＤＰ１抗体と反応させた。結果は、２８ｋＤａ及び２７ｋＤａ蛋白質は各々約４７％（図４Ｃのパネルａの画分２７）および４０％（画分１８、１９）アセトニトリルの濃度で溶出した。アミノ酸シークエンサーによるＮ末端アミノ酸の配列決定は、２８ｋＤａの蛋白質がＭＤＰ１であることを示す。この結果は、５０ＳリボソームサブユニットはＭＤＰ１を含むことを示す。しかしながら、２７ｋＤａのＮ末端アミノ酸は配列決定されていない。従って、２７ｋＤａの蛋白質がＮ末端での修飾アミノ酸なのか、異なる遺伝子をコードする遺伝子の同族体なのかは明らかでない。
(4) ＭＤＰ１のインビトロにおける複製、転写及び翻訳の阻害
インビトロにおけるマクロ分子合成をＭＤＰ１の分子プロセスを解明するために研究した。第１に、ＤＮＡポリメラーゼＩの機能に関するＭＤＰ１の効果を、ＤＮＡ合成の伸長を見るために調べた（図５Ａ）ＤＮＡ合成は、ＭＤＰ１により用量依存的に抑制された。１．２５μＭのＭＤＰ１で９７％までの阻害が観察された。
【００２９】
第２に、本発明者は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写に対するＭＤＰ１の効果を評価した（図５Ｂ）。転写は、２．５μＭのＭＤＰ１でほぼ完全に阻害された。
【００３０】
第３に、翻訳に関するＭＤＰ１の効果をインビトロで調べた。インビトロでの翻訳分析は、大腸菌Ｓ３０抽出物を用いて行った（図５Ｃ）。３０分のインキュベーション後、蛋白合成をＭＳ２ファージＲＮＡの鋳型なしでさえ観察された。これは、大腸菌Ｓ３０抽出物の内因性天然ｍＲＮＡのためであるかもしれない。ＭＤＰ１による蛋白合成の阻害は、ＭＤＰ１の濃度に依存して観察された。１０μＭにおいて、ＭＤＰ１は翻訳をほぼ完全に阻害した。
(5) ＭＤＰ１によるバクテリアの増殖遅延
上記の結果から、ＭＤＰ１はＤＮＡ、ＲＮＡ及びリボソームに対する結合に依存してマクロ分子生合成の阻害により増殖遅延を起こかもしれない。本発明者は、この仮説を速やかに増殖するバクテリア中においてＭＤＰ１を発現させることにより調べた。ＭＤＰ１の非キメラ形態を発現するために、ｐＳＯＭＤＰ１及びｐＥＴＭＤＰ１を構築した（実施例参照）。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ及び大腸菌を、各プラスミドを用いてトランスフォームし、プレート上で集めた。図６に示すように、両方のバクテリアの増殖速度はＭＤＰ１の発現により劇的に減少し、ＭＤＰ１はバクテリアの増殖速度を減少することを示す。
(6) ＭＤＰ１蛋白のスレオニンリン酸化
リン酸化及び脱リン酸化は、真核細胞における細胞増殖を制御する主要なメカニズムの１つである。本発明者はＭＤＰ１がリン酸化蛋白かそうでないかを調べた。精製されたＭＤＰ１は、ホスホセリン、ホスホチロシン又はホスホスレオニンに対するモノクローナル抗体と反応させた。抗ホスホスレオニン抗体のみがＭＤＰ１と反応し、予期したようにこの反応は、反応前にバクテリアのアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）でＭＤＰ１を処理することにより消失した（データは示さない）。これらは、ＭＤＰ１がスレオニンリン酸化蛋白質であることを示す。
(7) 迅速及び遅延増殖マイコバクテリウム間の対数及び定常増殖期におけるＭＤＰ１の発現の比較
様々なマイコバクテリウム種のＭＤＰ１の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７Ａ）及びウエスタンブロット分析（図７Ｂ）により調べた。抗体は、ＢＣＧの２８ｋＤａの蛋白質（図７Ｂのレーン１及び２）、M.tuberculosisの３０ｋＤａの蛋白質（レーン３及び４）、M.lepraeの２６ｋＤａの蛋白質（レーン５）、M.smegmatisの３１ｋＤａの蛋白質（レーン６および７）と強く反応したが、大腸菌の蛋白質とは全く反応しなかった。対数及び定常増殖期におけるＢＣＧ及びM.tuberculosis由来のライゼートの豊富な蛋白バンドは、抗ＭＤＰ１血清反応バンドと同一である。M.lepraeは、バクテリア中で最も増殖が遅く、インビトロでの培養が未だ成功していない。ヌードマウスのフットパッドで増殖するM.lepraeは、図７に示すように多量のＭＤＰ１を発現する。一方、M.smegmatisにおいて、抗ＭＤＰ１血清を認識する蛋白は定常期においてのみ高度に発現される。本発明者は、これらＭＤＰ１同族体がＤＮＡに結合する能力を有することをサウスウエスタンブロット分析により確認した（データは示さない）。これらの結果は、ＭＤＰ１が広範囲のマイコバクテリウムにおいて保存されているが、ＭＤＰ１の発現量は遅い増殖菌と速い増殖菌で異なっている。遅い増殖菌は増殖期と無関係に多量のＭＤＰ１を発現するが、速い増殖菌は定常状態で主に発現され、対数増殖期では発現されない。
実施例１
６〜１０週齢の４種のマウス（C3H/He、C57BL/6、A/J、BALB/c）にＭＤＰ１をフレウントのインコンプリートアジュバントとともに５μｇずつ２回（２回目は３週後）免疫し（１回目は皮下、２回目は腹腔内）、４週後に採血して血清を１００倍に希釈し（希釈液：1%BSA in PBS)、一次抗体としてウェスタンブロットに用いた。抗原は、ＢＣＧのライゼートを用いた。ＭＤＰ１に対する抗体の産生が認められたマウスはBALB/cのみであった。
【００３１】
次に、ＢＣＧ菌を投与した３種のマウス（C3H/He、C57BL/6、A/J；１回目血中、２回目腹腔内；ＢＣＧ１０６ＣＦＵ）の血清を同様に反応させた結果、いずれのマウスにおいてもＭＤＰ１に対する抗体産生が確認された。また、抗体はＢＣＧ抗原のうちＭＤＰ１に最も強く反応した。
【００３２】
この実験結果から、菌体で免疫すると、ＭＤＰ１に対する抗体が強く誘導されることが明らかになった。
実施例２：患者血清との反応
ハンセン氏病患者３名、結核患者４名及び健常人血清を１００倍に希釈した。精製したＭＤＰ１をメンブレンに転写し、希釈抗体と反応させた。その結果、すべての抗酸菌症患者の血清中に、ＭＤＰ１を認識する抗体の存在が明らかになった。一方、健常人のサンプルには該抗体の存在は認められなかった。同じウェスタンブロットの系で、分泌蛋白質（８５コンプレックスを含む）に対して反応させると、ハンセン氏病患者の血清には反応するが、結核患者の血清とは反応しなかった。この結果は、ＭＤＰ１はＡｇ８５よりも抗酸菌症において抗原性が高いことを示している。
実験１
ＢＣＧ東京株を、ソートン培地で培養後、０．４５μｍ(Millipore)のフィルターに通し、菌体と分泌蛋白質を分離した。菌体はＳＤＳ−サンプルバッファーに溶解し、超音波で破砕し、１００℃で５分間煮沸した。分泌蛋白質は、培養濾過物に終濃度８０％になるように硫酸アンモニウムを加えてタンパク質を析出させ、それをＰＢＳ（ｐＨ７．２）に透析した。得られた分泌タンパク質にＳＤＳ−サンプルバッファーを加え、１００℃で５分間煮沸した。それぞれのサンプルを遠心し、その上清（タンパク質量２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２１．５％）にて電気泳動した後、タンパク質を電気的にポリビニリデンジフルオライド膜(ＰＶＤＦ膜；Millipore)上に転写した。ＰＶＤＦ膜を３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で３０分間浸し、ブロッキングを行った。抗体の調製は、ＢＣＧ東京株１０⁷ＣＦＵをＣ３Ｈ／Ｈｅ静脈に投与し、１ヶ月後同量の菌体を腹腔内に投与し、その１ヶ月後に血清を採取し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１００倍希釈した。調製した抗体を、ＢＳＡでブロッキングしたＰＶＤＦ膜と４℃で終夜反応させ、0.05%のNonidet P40 を含むＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識した抗マウス抗体と反応させ、上記洗浄液で洗浄後、２５ｍｇの3,3-ジアミノベンジジン・テトラヒドロクロライドを２０ｍＭＴｒｉｓ(pH7.5)１００ｍｌ中に溶解し、２９μｌのＨ₂Ｏ₂を加えた溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、抗体検出を行った。結果を図８に示す。図８に示されるように、菌体タンパク質ではＭＤＰ１に相当する分子量のタンパク質および４５〜４７ｋＤａのタンパク質に対する抗体が検出された。一方、分泌タンパク質に対する抗体は、この条件では検出されなかったことから、ＭＤＰ１は最も強い抗原性を有するといわれているＡｇ８５を上回る抗原性を有していると考えられた。
実験２
ＢＣＧ東京株（１０⁷ＣＦＵ）を、Ａ／ｊ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ、Ｃ５７ＢＬ／６に腹腔内投与し、１ヶ月後血清を採取し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１００倍希釈した。精製ＭＤＰ１を１μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜上に転写し、希釈血清と上記と同様の方法で反応させ、ＭＤＰ１に対する抗体の検出を行った。その結果、４種全てのマウスの血清中に抗ＭＤＰ１抗体が産生されていることが分かった。
実験３
ＢＣＧ菌（１０⁸ＣＦＵ）を、マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ：ｓｌｃ）に尾静脈より投与し、ＭＤＰ１（５μｇ）／ＲＡＳ（リビアジュバントシステム）、ＤＮＡ(M. tuberculosis DNA 0.5μｇ）／ＲＡＳ、ＭＤＰ１（５μｇ）＋ＤＮＡ（０．５μｇ）／ＲＡＳをマウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ：ｓｌｃ）に皮下投与し、３週間後に同用量を腹腔内投与した後、４週間後に血清を採取し、採取した血清をＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１００倍希釈した。精製ＭＤＰ１を１μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜上に転写し、希釈血清と反応させた。その結果（図９）、ＢＣＧ及びＭＤＰ１＋ＤＮＡで免疫したマウスにのみ抗体が産生されており、ＭＤＰ１単独、ＤＮＡ単独では抗体産生が認められず、ＭＤＰ１はＤＮＡと結合させることで免疫原性が増強され、抗体価が上がることが確認された。
実験４
ＭＤＰ１、ヒストンＨ１、Ｈ２、Ｈ３（ベーリンガーマンハイム、牛由来）をそれぞれ５μｇずつ、単独または結核菌由来ＤＮＡ（０．５μｇ）と混合して、リビアジュバント(RIBI immunochen Research, Inc. Hamilton, MT)を用い、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（初回免疫時、７週齢）に免疫した。サンプルは、ＰＢＳで希釈し、１匹のマウスに１００μｌとなるように調整した。免疫方法は、初回免疫を皮下投与で、３週間後の追加免疫を腹腔内投与により行った。追加免疫の１週間後のマウスより採血を行い、遠心分離により血清成分を得た。それぞれに抗原に対する抗体の検出は、ＥＬＩＳＡ法により行った。即ち、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートＨ（住友ベークライト株式会社）に、それぞれの抗原を２μｇ／ｍｌになるように０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で溶解し、１００μｌずつ各ウェルに分注し、室温で２時間放置し、抗原を個層化した。ブロッキングは、ＢＢＳ（ｐＨ８．０；ホウ酸１０．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ７．８３ｇ／Ｌ）でウェルを１回洗浄後、３％ＢＳＡを含むＢＢＳを３００μｌずつウェルに分注し、室温で２時間放置し、ＢＢＳで１回洗浄することで行った。それぞれの血清サンプルは、５０〜１０２４００倍まで、１％ＢＳＡを含むＢＢＳ溶液で希釈し、それぞれのウェルに１００μｌずつ加え、３０分間３７℃で反応させた。反応プレートをＨＢＢＳ（ｐＨ８．０；ホウ酸１０．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ２９．２２ｇ／Ｌ）を調製し、各ウェルを３００μｌずつ７回洗浄した。その後、ペルオキシダーゼ抗マウス抗体を、１％ＢＳＡを含むＢＢＳ溶液で２０００倍に希釈し、１００μｌずつ各ウェルに分注し、３０分間３７℃で培養した。その後、上記洗浄液で同様の洗浄を行い、オルト−フェニレンジアミン二塩酸塩を0.4mg/mlとなるように、８０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液に加え、その溶液１０ｍｌにつきＨ₂Ｏ₂を４μｌ加えた検出液を用い、発色を行った。３−５分間反応後、１Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度で測定した。その結果、図１０〜１３に示されるように、ＭＤＰ１とＤＮＡを混合して免疫し、得られたサンプルのみ吸光度の上昇が観察され、同じＤＮＡ結合タンパク質であるヒストンＨ１、Ｈ２、Ｈ３のいずれの場合にも吸光度の上昇は観察されなかった。このことから抗原性に関してはＭＤＰ１特異的であることが明らかになった。
実験５
精製したＭＤＰ１を１μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜上に転写し、らい患者（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、結核患者（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４）の血清希釈液と上記と同様にして反応させ、ＭＤＰ１に対する抗体の検出を行った。その結果（図１４）、試験した全ての患者血清中にＭＤＰ１に対する抗体が検出された。この結果から、ＭＤＰ１は結核、らい患者等の診断薬としての応用が考えられる。
ＭＤＰ１の診断薬への応用
ＭＤＰ１は抗酸菌に特異的なタンパク質であり、強い抗原性を有していることが上記実験より確認できた。特に実験１の結果より現在抗原性が最も強く、診断薬として検討されている抗酸菌特異的な抗原Ag85complexよりも強い抗原性を有することが明らかになった。従って、ＭＤＰ１に対する抗体を同定することで、結核による感染の有無を診断できる（実験５）。また、抗酸菌の種が異なればＭＤＰ１の配列も異なることから、種特異的な抗原またはペプチドを用いることで感染菌の同定の可能性もある。従って、結核菌を含む各種抗酸菌のＭＤＰ１およびそのＭＤＰ１中に含まれるペプチドは、診断薬の抗原として利用できる。
【００３３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは蛋白−ＤＮＡ相互作用をオートラジオグラフを示す。図１Ｂは、クロマトグラフのプロフィールを示す。図１Ｃはゲル濾過カラムの結果を示す。図１ＤはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図２】図２Ａは、核酸配列及び推定アミノ酸配列を示す。図２Ｂは、ＭＤＰ１に相同ないくつかの蛋白質及びアミノ酸配列のアラインメントを示すコンピューター検索結果を示す。
【図３】図３Ａは、オートラジオグラフ結果を示す。図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄは、アガロースゲル電気泳動の分析結果を示す。
【図４】図４Ａは免疫電子顕微鏡試験結果を示す。図４Ｂはサンプルと抗ＭＤＰ１抗体との反応結果を示す。図４ＣはＲＰ−ＨＰＬＣの結果（パネルａ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる視覚化（パネルｂ）を示す。
【図５】図５Ａは、ＤＮＡポリメラーゼＩの機能に関するＭＤＰ１の効果を示す。図５Ｂは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写に対するＭＤＰ１の効果を示す。図５Ｃは、翻訳に関するＭＤＰ１の効果を示す。
【図６】Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ及び大腸菌を、各プラスミドを用いてトランスフォームし、プレート上で集めた結果を示す。
【図７】図７ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。図７Ｂはウエスタンブロット分析結果を示す。
【図８】抗体検出結果を示す。
【図９】精製ＭＤＰ１と希釈血清の反応結果を示す。
【図１０】抗ＭＤＰ１血清を用いた結果を示す。
【図１１】抗ヒストンＨ１血清を用いた結果を示す。
【図１２】抗ヒストンＨ２血清を用いた結果を示す。
【図１３】抗ヒストンＨ３血清を用いた結果を示す。
【図１４】ＭＤＰ１に対する抗体の検出結果を示す。

Claims

下記の（a）または（b）のポリペプチド：
（a）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）上記(a)のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失してなるアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡ結合能及び増殖遅延能を有するポリペプチド。
リン酸化された請求項１に記載のポリペプチド。
請求項１に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
下記の（c）または（d）のＤＮＡ：
（c）配列番号２に示す核酸配列からなるＤＮＡ
（b）上記（c）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＤＮＡ結合能及び増殖遅延能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
請求項３又は４に記載するＤＮＡを含むベクター。
請求項５に記載するベクターを含む形質転換体。
請求項６に記載の形質転換体を培養することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの製造法。
請求項１又は２に記載するポリペプチドに結合する抗体。
請求項１又は２に記載するポリペプチド、または、当該ポリペプチド中に含まれる数十個のアミノ酸からなるペプチドであって請求項８に記載する抗体と抗原抗体複合体を形成するペプチドを含む、抗酸菌症の診断剤。
抗酸菌症が結核およびハンセン氏病からなる群から選ばれる請求項９に記載する診断剤。
生物試料に含まれる請求項８に記載する抗体を、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡ法によって検出するための、請求項９または１０に記載する診断剤。