JP2010535030A - ブラキスピラ・ヒオディセンテリアの新規な遺伝子とタンパク質及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
A.AA*+Ab1=AA* Ab1
B.AA+Ab1 *=AA Ab1 *
C.AA+Ab1+Ab2 *=Ab1 AA Ab2 *
(a)本明細書に記載のアミノ酸配列の内の1種又はその特異的結合パートナーを検出可能ラベルに直接的又は間接的に付着させることによって得た所定量の少なくとも1種の標識された免疫化学反応性成分;
(b)他の試薬類;
(c)前記キットの使用指示書
(a)一般には固相に結合されて免疫吸着剤を形成するか、或いは好適なタグに結合される既知量の本明細書にて上述のアミノ酸配列の1種(又はその結合パートナー)、又は複数のこのような最終産物等
(b)必要に応じて他の試薬類
(c)前記検査キットの使用指示書
(a)本明細書に記載のアミノ酸配列の1種を検出可能ラベルに結合させることによって得た標識成分
(b)1種以上の追加的免疫化学試薬であって、その内の少なくとも1種が、
(i)標識成分(a)に結合可能なリガンド、
(ii)標識成分(a)の結合パートナーに結合可能なリガンド、
(iii)測定対象の成分の少なくとも1種に結合可能なリガンド、及び
(iv)測定対象の成分の少なくとも1種の結合パートナーの少なくとも1種に結合可能なリガンドから成る群から選択されるリガンド又は固定リガンドである追加的免疫化学試薬と、
(c)本明細書に記載のアミノ酸配列の1種とその特異的結合パートナーとの間の免疫化学反応の1種以上の成分を検出及び/又は測定するプロトコルを実行するための指示書とを含有させ得る。
オーストラリアのB.ヒオディセンテリア(WA1株)のブタ隔離集団を用いてゲノムライブラリーを調製する。この株は十分に特徴付けされており、ブタの実験的チャレンジ後に病原性になることが分かっている。臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)法を用いてゲノムDNAライブラリーの調製に適した高品質の染色体DNAを調製する。B.ヒオディセンテリアを100mLの嫌気性トリプチケースソイブロス培地中で生育させ、細胞密度を109個(細胞)/mLとする。細胞を4000×gで10分間回収し、細胞ペレットを9.5mLのTEバッファー中で再懸濁させる。SDSを最終濃度が0.5%(w/v)となるまで添加し、100μgのプロテイナーゼKを用いて細胞を37℃で1時間溶解させる。NaClを最終濃度が0.7Mとなるまで添加し、1.5mLのCTAB/NaCl溶液(10%w/v CTAB、0.7M NaCl)を添加した後、溶液を65℃で20分間インキュベートする。ライセートを等体積のクロロホルム/イソアミルアルコールで抽出し、チューブを6000×gで10分間遠心分離して相分離を行う。水相を新しいチューブに移し、0.6体積のイソプロパノールを添加して高分子量DNAを沈殿させる。沈殿したDNAを鉤状ガラス棒を用いて回収し、1mLの70%(v/v)エタノールを含有するチューブに移す。該チューブを10000×gで遠心分離し、ペレット状DNAを4mLのTEバッファー中で一晩再溶解させる。再溶解DNA溶液を用いて1.05g/mLのCsClと0.5mg/mLの臭化エチジウムを含有する塩化セシウム勾配を調製する。該勾配を4mLのシール可能な遠心チューブに移し、70000×gで一晩、15℃で遠心分離する。分離したDNAを紫外光下で可視化し、高分子量DNAを15g針を用いて勾配から回収する。CsCl飽和イソプロパノールを用いた逐次抽出によって臭化エチジウムをDNAから除去する。精製した染色体DNAを2LのTEバッファーに対して透析し、イソプロパノールで沈殿させる。GeneMachines Hydroshear(ゲノミック・ソリューションズ、ミシガン州アンアーバー)を用いて再懸濁ゲノムDNAを剪断し、クレノウDNAポリメラーゼを用いて剪断DNAを埋めて、平滑末端断片を製造する。CloneSmartDNAリガーゼを用いて、100ngの平滑末端DNA断片を25ngのpSMART VCベクター(ルシジェン、ウィスコンシン州ミドルトン)に連結させる。次いで、連結したDNAを大腸菌エレクトロコンピテント細胞に電気穿孔する。小型挿入(2〜3kb)ライブラリー及び中型挿入(3〜10kb)ライブラリーを構築し、低コピー型のpSMART VCベクターとする。
ゲノムライブラリーを得た後、pSMART VCベクターを含有する個々の大腸菌クローンを選択する。プラスミドDNAを精製し、配列決定を行う。pSMART VCベクターに特異的な順方向プライマーと逆方向プライマーを用いて、精製プラスミドをpSMART VCベクターの自動化直接配列決定に付す。200ngのプラスミドDNA、2pmolのプライマー及び4μLのABI PRISMTM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix(PEアプライド・バイオシステム社、カリフォルニア州フォスターシティ)から成る体積10μLで各配列決定反応を行う。サイクリング条件は、96℃で2分間の変性工程、次いで96℃で10秒間の変性を25サイクル、及び60℃で4分間のプライマーアニーリングと伸長の組合せ工程とする。85mMの酢酸ナトリウム(pH5.2)及び3mMのEDTA(pH8)を含有する95%(v/v)エタノールで沈殿させることによって配列決定産物から残留ダイターミネーターを除去し、真空乾燥する。各プライマーを用いてプラスミドの配列決定を二重で行う。配列決定産物をABI 373A DNAシークエンサー(PEアプライド・バイオシステムズ)を用いて解析する。
種々の公有のバイオインフォマティクスツールを用いてB.ヒオディセンテリアの部分ゲノム配列を構築及びアノテートし、データ解析上の品質保証手続きの一部として該配列を解析及び再解析する。オープンリーディングフレーム(ORF)は、GeneMarkやGLIMMER、ORPHEUS、SELFID、GetORF等の種々のプログラムを用いて予測する。推定ORFは、BLASTやFASTA等のサーチを用いて既存の国際データベースとの相同性(DNA及びタンパク質)について調べる。PSI−BLASTやFASTA、MOTIFS、FINDPATTERNS、PHD、SIGNALP、PSORT等のプログラムを用いて、予測されたORFの全てを解析し、その細胞局在を確認する。InterproやProsite、ProDom、Pfam、Blocks等のデータベースを用いて、膜貫通ドメインやリーダーペプチド、公知の表面タンパク質に対する相同性、リポタンパク質サイン、外膜アンカーモチーフ、宿主細胞結合ドメイン等の表面関連タンパク質を予測する。系統発生や他の分子進化解析は同定された遺伝子及び他の種を用いて行い、機能の割り当てを補助する。両方の部分配列決定ゲノムのインシリコ解析によって、入手し得る配列データに存在する予測ORF全ての包括的リストが得られる。予測分子量や等電点、疎水性、細胞内局在等の説明的情報について各ORFを調べて、天然遺伝子産物のインビトロ特性を関連付けることができる。他の病原菌において表面局在化成分及び/又は病原性因子同様のタンパク質をコードする予測遺伝子は、潜在的なワクチン標的として選択する。
B.ヒオディセンテリアゲノムのショットガン配列決定によって、該ゲノムの94.6%(予測される3200kbの内3028.6kb)の配列が決定する。B.ヒオディセンテリア配列は294個のコンティグ(平均コンティグサイズは10.3kb)から成る。B.ヒオディセンテリアの場合、294個のコンティグから2593個のオープンリーディングフレーム(ORF)が予測される。予測ORFを核酸及びタンパク質データベースに存在する遺伝子と比較することによって、約70%のORFが公的データベースに含まれる遺伝子と相同性を有することが分かる。予測ORFの残りの30%は公知の同一性を有しない。
ワクチン候補として試験されるであろうORFの数を削減するため、外表面タンパク質に対して妥当な相同性(e-15未満のE値)を示すORF、分泌タンパク質、及び公的データベースに存在する可能な病原性因子を潜在的なワクチン候補として選択する。ゲノムショットガン配列決定によって得られる2593個のORFの内の多くはこの試験をパスするが、その内の33個の遺伝子の結果を本明細書に示す。表1−1、表1−2には、潜在的なワクチン標的として選択した33個の遺伝子を示すと共に、その遺伝子とSWISS−PROTデータベースから得た他の公知のアミノ酸配列との類似度を示す。注目されるのは、アミノ酸の%同一性が58%を超えないのに対し、アミノ酸の%類似性(%相同性)が71%未満のままであり、このことからこれらのORFは独特であることが分かる。
標的遺伝子コード領域の異なる領域にアニールする1種又は2種のプライマー対を設計し、PCR検出のために最適化する。Oligo Explorer 1.2を用いて個々のプライマーを設計し、融解温度が約55〜60℃と推定されるプライマーセットを選択する。また、これらのプライマーセットの選択は、200bpを超えるPCR産物を製造するためにも行われる。中程度ストリンジェンシーのプライマーアニーリング温度(50℃)を選択して分布解析PCRを行う。この中程度ストリンジェンシー条件によって、プライマー結合部位で生じる潜在的な少数のミスマッチ配列(株の差異に起因)がプライマー結合に影響を及ぼすことはないであろう。21個のB.ヒオディセンテリア標的遺伝子の分布解析は、B.ヒオディセンテリアの23株(非病原性であることが分かっている2株を含む)に対して行う。PCR解析は、Taq DNAポリメラーゼ(バイオテック・インターナショナル、メリーランド州サーモント)を用いて全量25μLにて行う。増幅混合物は、1×PCRバッファー(1.5mMのMgCl2含有)、1UのTaq DNAポリメラーゼ、0.2mMの各dNTP(アマシャム・ファルマシア・バイオテク、ニュージャージー州ピスカタウェイ)、0.5μMのプライマー対、及び1μLの精製染色体鋳型DNAから成る。サイクリング条件は、94℃で5分間の初期鋳型変性工程、次いで、94℃で30秒間の変性を35サイクル、50℃で15秒間のアニーリング、及び68℃で4分間のプライマー伸長とする。PCR産物は、1×TAEバッファー(40mMのTris−アセテート、1mMのEDTA)中1%(w/v)アガロースゲルにて電気泳動に付し、1μg/mLの臭化エチジウム溶液で染色し、UV光を用いて観察する。
pTrcHisプラスミド(インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド)を有する大腸菌JM109クローンをグリセロールストックから、100mg/Lのアンピシリンを追加したLuria−Bertani(LB)寒天プレート上にストリークし、37℃で16時間インキュベートする。100mg/Lのアンピシリンを追加した10mLのLBブロスに単一コロニーを接種し、振盪させながらブロス培地を37℃で12時間インキュベートする。一晩培養液の全量を5000×gで10分間遠心分離し、細胞に含まれるプラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン、ビクトリア州ドンカスター)を用いて抽出する。ペレット状細胞を250μLの細胞再懸濁バッファーP1で再懸濁させた後、250μLの細胞溶解バッファーP2を添加して溶解させる。溶解した細胞を350μLの中和バッファーN3で中和し、沈殿した細胞片を遠心分離(20000×g、10分間)によってペレットにする。上清をスピンカラムに移し、遠心分離を10000×gで1分間行う。フロースルーを廃棄した後、500μLの洗浄バッファーPEをカラムに添加し、上述のように遠心分離を行う。フロースルーを廃棄し、遠心分離を20000×gで3分間行ってカラムを乾燥する。100μLの溶出バッファーEBを用いてカラムからプラスミドDNAを溶出させる。Dynaquant DNA蛍光計(Hoefer、カリフォルニア州サンフランシスコ)を用いて精製プラスミドを定量し、TEバッファーで希釈してDNA濃度を100μg/mLに調整する。精製pTrcHisプラスミドは−20℃で保存する。
100mMのTris−HCl(pH7.5)、50mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mMのDTT及び100μg/mLのBSAに5Uの2種の制限酵素を含有する全量50μLにて2μgの精製pTrcHisプラスミドを37℃で1〜4時間消化する。用いる特定の制限酵素対はプライマーの配列及びORFの配列によって決まる(ORFを切断しないプライマーを用いるのが目的である)。制限ベクターの確認は、1μLの消化反応物を1×TAEバッファー中1%(w/v)アガロースゲルにて90Vで1時間電気泳動させることによって行う。電気泳動したDNAを1μg/mLの臭化エチジウムで染色し、紫外(UV)光を用いて観察する。
プライマー対の設計は、ゲノムDNAを開始点として用い、標的遺伝子のコード領域をできる限り増幅するように行う。全てのプライマー配列は、得られるアンプリコンの直線化pTrcHisベクターへの付着末端連結を可能とする末端制限酵素部位を含む。Amplify 1.2(ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン)を用いてプライマーを試験し、理論的アンプリコン配列をpTrcHisベクター配列の適切な位置に挿入する。キメラpTrcHis発現カセットの推定翻訳はVector NTIバージョン6(インフォーマックス)を用いて行い、遺伝子インサートが正しいリーディングフレーム内にあるかどうか確認する。また、表3には、遺伝子サイズ、タンパク質サイズ、天然タンパク質の予測分子量(単位:ダルトン)、及びタンパク質の予測pIを示す。注目されるのは、組換えタンパク質のヒスチジン融合によって天然タンパク質の予測分子量に約4kDaが加わることである。
ゲノムDNAを用い、Taq DNAポリメラーゼ(バイオテック・インターナショナル)及びPfu DNAポリメラーゼ(プロメガ、ウィスコンシン州マディソン)を用いた全量100μLにおけるPCRによって全ての標的遺伝子インサートを増幅する。増幅混合物は、1×PCRバッファー(1.5mMのMgCl2含有)、1UのTaq DNAポリメラーゼ、0.01UのPfu DNAポリメラーゼ、0.2mMの各dNTP(アマシャム・ファルマシア・バイオテク)、0.5μMの適切なプライマー対、及び1μLの精製染色体DNAから成る。染色体DNAは、ゲノム配列決定に用いたのと同じB.ヒオディセンテリア株から調製する。サイクリング条件は、94℃で5分間の初期鋳型変性工程、次いで、94℃で30秒間の変性を35サイクル、50℃で15秒間のアニーリング、及び68℃で4分間のプライマー伸長とする。PCR産物は、1×TAEバッファー中1%(w/v)アガロースゲルにて電気泳動に付し、1μg/mLの臭化エチジウム溶液で染色し、UV光を用いて観察する。正しいサイズのPCR産物の存在を確認した後、UltraClean PCR Clean−up Kit(Mo Bio Laboratories、カリフォルニア州カールズバッド)を用いてPCR反応物を精製する。PCR反応物(100μL)を500μLのSpinBindバッファーB1と混合し、その全量をスピンカラムに添加する。遠心分離を8000×gで1分間行った後、フロースルーを廃棄し、300μLのSpinCleanバッファーB2をカラムに添加する。上述のようにカラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄した後、カラムを20000×gで3分間乾燥させる。精製したベクターを100μLのTEバッファーを用いてカラムから溶出させる。
クローニングオリゴヌクレオチドプライマーによって確認される末端制限エンドヌクレアーゼ認識部位と適合する各制限酵素(1U)を用い、30μLの精製PCR産物を全量50μLにて消化する。制限反応は、100mMのTris−HCl(pH7.5)、50mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mMのDTT及び100μg/mLのBSAと1Uの各制限酵素を用い、37℃で1〜4時間行う。消化したインサートDNAはUltraClean PCR Clean−up Kit(上述参照)を用いて精製する。精製した消化インサートDNAを蛍光計によって定量し、TEバッファーで希釈してDNA濃度を20μg/mLに調整する。精製した制限インサートDNAは直ちに用いてベクター連結を行う。
連結反応は全て全量20μLにて行う。1UのT4 DNAリガーゼ(プロメガ)を含有する30mMのTris−HCl(pH7.8)、10mMのMgCl2、10mMのDTT及び1mMのATPにて100ngの直線化pTrcHisを20ngの制限インサートと共に16℃で16時間インキュベートする。インサートDNAを含まない同一の連結反応もベクター再環状化の負の対照として行う。適切な制限酵素を各反応に用いる。
コンピテント大腸菌JM109(プロメガ)細胞を−80℃保存から氷上で解凍した後、5μLの一晩連結反応物(25ngのpTrcHisベクター相当)を含有する氷冷1.5mLのマイクロチューブ内に50μLの該細胞を移す。ベンチ上で各チューブの底を優しく叩いて混合し、氷上で30分間放置する。次いで、チューブを42℃の水浴に45秒間入れて細胞に熱ショックを与えた後、チューブを2分間氷に戻す。形質転換細胞は、優しく混合しながら1mLのLBブロスに37℃で1時間回収する。回収した細胞を2500×gで5分間収集し、50μLの新しいLBブロスにて再懸濁させる。全量50μLの再懸濁細胞は、100mg/Lのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上に滅菌ガラス棒を用いて均一に塗布する。プレートを37℃で16時間インキュベートする。
100mg/Lのアンピシリンを含有する新しいLB寒天プレート上に各構築物の12個の単一形質転換体コロニーをストリークし、37℃で16時間インキュベートする。各形質転換イベント由来の単一コロニーを50μLのTEバッファーにて再懸濁させ、1分間煮沸する。2μLの煮沸した細胞をPCRの鋳型として用いる。増幅混合物は、1×PCRバッファー(1.5mMのMgCl2含有)、1UのTaq DNAポリメラーゼ、0.2mMの各dNTP、0.5μMのpTrcHis−Fプライマー(5’−CAATTTATCAGACAATCTGTGTG−3’:配列番号107)及び0.5μMのpTrcHis−Rプライマー(5’−TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG−3’:配列番号108)から成る。サイクリング条件は、94℃で5分間の初期鋳型変性工程、次いで、94℃で30秒間の変性を35サイクル、60℃で15秒間のアニーリング、及び72℃で1分間のプライマー伸長とする。PCR産物は、1×TAEバッファー中1%(w/v)アガロースゲルにて電気泳動に付し、1μg/mLの臭化エチジウム溶液で染色し、UV光を用いて観察する。各種インサートのpTrcHis発現ベクターへのクローニングによって種々のサイズの組換え構築物が産生する。
大腸菌JM109中の組換えpTrcHis構築物の5〜10個の単離コロニーを、100mg/Lのアンピシリン及び1mMのIPTGを含有する5mLチューブ内の3mLのLBブロスに接種し、振盪させながら37℃で16時間インキュベートする。遠心分離を5000×g、4℃で10分間行って細胞を回収する。上清を廃棄し、各ペレットを10μLのNi−NTA変性用溶解バッファー(100mMのNaH2PO4、10mMのTris−HCl、8Mの尿素、pH8.0)で再懸濁させる。チューブを1分間ボルテックスした後、細胞片を遠心分離(10000×g、10分間、4℃)によってペレットにする。上清を新しいチューブに移し、解析を行うまで−20℃で保存する。
タンパク質のSDS−PAGE解析は不連続Tris−グリシンバッファー系を用いて行う。30μLのタンパク質サンプルを10μLの4×サンプル処理バッファー(250mMのTris−HCl(pH6.0)、8%(w/v)のSDS、200mMのDTT、40%(v/v)のグリセロール及び0.04%(w/v)のブロモフェノールブルー)と混合する。サンプルを5分間煮沸した直後、10μLのサンプルをゲル中のウェルに添加する。ゲルは濃縮用ゲル(125mMのTris−HCl(pH6.8)、4%w/vのアクリルアミド、0.15%w/vのビスアクリルアミド及び0.1%w/vのSDS)と分離用ゲル(375mMのTris−HCl(pH8.8)、12%w/vのアクリルアミド、0.31%w/vのビスアクリルアミド及び0.1%w/vのSDS)から成る。0.1%(v/v)のTEMEDと0.05%(w/v)の新しく調製した硫酸アンモニウム溶液を添加してこれらのゲルを重合させ、ミニプロティアン二重スラブセル(バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス)に流し込む。サンプルを室温(RT)、150Vでブロモフェノールブルー色素がゲルの底部に到達するまで処理する。分子量の推定値を得るために予め染色した分子量標準物質をサンプルと並行して電気泳動させる。電気泳動後、直ちにゲルをクーマシーブリリアントブルーG250(バイオ・ラッド)を用いて染色するか、又はウェスタンブロッティング用ニトロセルロース膜に電気移動させる。
Towbinトランスファーバッファー系を用い、SDS−PAGEゲルから分離したタンパク質をニトロセルロース膜に電気泳動させる。電気泳動後、トランスファーバッファー(25mMのTris、192mMのグリシン、20%v/vのメタノール,pH8.3)中でゲルを15分間平衡化させる。ミニプロティアントランスブロット装置(バイオ・ラッド)を用いてゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜(プロトラン、Schleicher and Schuell BioScience社、ニューハンプシャー州キーン)に30V、4℃で一晩電気移動させる。分離タンパク質を含有する新しく移動したニトロセルロース膜を、5%(w/v)の脱脂粉乳を含有する10mLのトリス緩衝生理食塩水(TBS)によって室温で1時間ブロックする。膜を0.1%(v/v)Tween20含有TBS(TBST)で洗浄した後、10mLのマウス抗his抗体(TBSTで5000倍希釈)と共に室温で1時間インキュベートする。TBSTで3回、5分間洗浄した後、膜をTBSTで5000倍希釈した10mLのヤギ抗マウスIgG(全分子)−APと共にRTで1時間インキュベートする。アルカリホスファターゼ基質キット(バイオ・ラッド)を用いて膜を発色させる。膜を蒸留水で洗浄することによって発色反応を停止させる。次いで、膜を乾燥し、プレゼンテーション用にスキャンする。
正しいサイズのPCR産物を産生した各構築物の2種の形質転換体クローンを100mg/Lのアンピシリンを含有する10mLのLBブロスに接種し、振盪させながら37℃で12時間インキュベートする。一晩培養物全量を5000×gで10分間遠心分離し、細胞に含まれるプラスミドを上述のようにQIAprep Spin Miniprep Kitを用いて抽出する。精製したプラスミドは蛍光計で定量する。両方の精製プラスミドを、pTrcHis−Fプライマー及びpTrcHis−Rプライマーを用いるpTrcHis発現カセットの自動化直接配列決定に付す。配列決定反応の各々は、200ngのプラスミドDNA、2pmolのプライマー及び4μLのABI PRISMTMBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix(PEアプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ)から成る量10μLにて行う。サイクリング条件は、96℃で2分間の変性工程、次いで96℃で10秒間の変性の25サイクル、60℃で4分間のプライマーアニーリングと伸長の組合せ工程とする。残留ダイターミネーターは、85mMの酢酸ナトリウム(pH5.2)及び3mMのEDTA(pH8)を含有する95%(v/v)エタノールで沈殿させることによって配列決定産物から除去し、真空乾燥する。各プライマーを用いてプラスミドの配列決定を二重で行う。配列決定産物をABI 373A DNAシークエンサー(PEアプライド・バイオシステムズ)を用いて解析する。pTrcHisのヌクレオチド配列決定を行って、発現カセットが各構築物の正しいリーディングフレーム内にあることを確認する。
大腸菌JM109中の組換えpTrcHis構築物の単一コロニーを250mLのコニカルフラスコ内の100mg/Lのアンピシリンを含有する50mLのLBブロスに接種し、振盪させながら37℃で16時間インキュベートする。100mg/Lのアンピシリンを追加した1LのLBブロスを含む2Lコニカルフラスコに10mLの一晩培養物を接種し、37℃で、細胞の光学密度が600nmで0.5になるまで(約3〜4時間)インキュベートする。次いで、IPTGを最終濃度が1mMになるまで添加して培養物を誘導し、細胞を振盪させながら37℃に戻す。5時間の誘導後、培養物を250mLの遠心ボトルに移し、ボトルを5000×g、4℃で20分間遠心分離させる。上清を廃棄し、各ペレットを8mLのNi−NTA変性用溶解バッファー(100mMのNaH2PO4、10mMのTris−HCI、8Mの尿素、pH8.0)で再懸濁させる。再懸濁した細胞を−20℃で一晩保存する。
溶出したタンパク質をプールし、分子量カットオフ(MWCO)3500Daの水和透析チューブ(スペクトラム・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州ロサンゼルス)に移す。プールした溶出液のアリコート(200μL)を採取し、市販のプロテインアッセイ(バイオ・ラッド)を用いて定量する。タンパク質を2Lの蒸留水に対して4℃で撹拌しながら透析する。透析バッファーを12時間間隔で8回交換する。透析したタンパク質を透析チューブから50mL遠心チューブ(最大容量:40mL)に移し、該チューブを−80℃で一晩置く。チューブをMAXI凍結乾燥機(Heto−Holten、デンマーク、アレロッド)に入れ、凍結乾燥して乾固する。次いで、凍結乾燥したタンパク質をPBSで再水和して推定濃度を2mg/mLとし、−20℃で保存する。
続く透析、凍結乾燥、安定な組換え抗原は製造に成功した。
20μgの精製した組換えタンパク質を7cmのIEFウェルに添加し、10%(w/v)のSDS−PAGEゲルによって電気泳動し、ニトロセルロース膜へ電気移動させる。膜をTBS−脱脂乳(5%w/v)でブロックし、マルチスクリーン装置(バイオ・ラッド)に組み込む。ウェルを100μLの希釈ブタ血清(100倍)と共に室温で1時間インキュベートする。ブタ血清は、高健康状態のブタ(n=3)、実験的にチャレンジした臨床SDを示すブタ(n=5)、自然感染し血清転換したブタ(n=5)、及び自然感染から回復したブタ(n=4)から採取する。次いで、膜を該装置から取り出し、TBST(0.1%v/v)で3回洗浄した後、10mLのヤギ抗ブタIgG(全分子)−AP(5000倍)と共にRTで1時間インキュベートする。膜をTBSTで3回洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質キット(バイオ・ラッド)を用いて発色させる。十分な発色が起こったら膜を水道水で洗浄し、乾燥させ、プレゼンテーション用にスキャンする。
精製した組換えhisタグタンパク質の各々について、10匹のマウスを全身的又は経口的に免疫し、組換えタンパク質が免疫原性であるかどうか確認する。組換えタンパク質を30%(v/v)油中水型アジュバントで乳化し、10匹のマウス(Balb/cJ:5週齢、雄性)の四頭筋に筋肉内注射する。全てのマウスに100μgのタンパク質(全量100μL中)を投与する。第1のワクチン接種から3週間後、第1のワクチン接種と同じ第2の筋肉内ワクチン接種を全てのマウスに行う。第2のワクチン接種から2週間後にマウスを全て殺す。死後に心臓から血清を採取し、ウェスタンブロット解析によりB.ヒオディセンテリアの細胞抽出物に対する抗体について試験する。
20μgの精製した組換えタンパク質を7cmのIEFウェルに添加し、10%(w/v)のSDS−PAGEゲルによって電気泳動し、ニトロセルロース膜へ電気移動させる。膜をTBS−脱脂乳(5%w/v)でブロックし、マルチスクリーン装置(バイオ・ラッド)に組み込む。ウェルを100μLの希釈マウス血清(100倍)と共に室温で1時間インキュベートする。膜を該装置から取り出し、TBST(0.1%v/v)で3回洗浄した後、10mLのヤギ抗マウスIgG(全分子)−AP(5000倍)と共に室温で1時間インキュベートする。膜をTBSTで3回洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質キット(バイオ・ラッド)を用いて発色させる。十分な発色が起こったら膜を水道水で洗浄し、乾燥させ、プレゼンテーション用にスキャンする。
精製した組換えhisタグタンパク質の各々について、10匹の血清陰性ブタに対し、1mgの特定の抗原(ワクチン量1mL中)を筋肉内注射する。抗原を等体積の油中水型アジュバントで乳化する。ブタへのワクチン接種は3週齢時に行い、6週齢時に再度行う。10匹の血清陰性ブタから成る第2のグループを負の対照として用い、ワクチン接種を行わないままにする。全てのブタに対し、8週齢時に100mLの活性B.ヒオディセンテリア培養物(〜109個(細胞)/mL)でチャレンジし、実験時(チャレンジ後6週間まで)及び死後検査時にブタ赤痢の臨床徴候を観察する。
B.ヒオディセンテリアへの感染が分かっている養豚場のブタ、B.ヒオディセンテリアに感染していないことが分かっているブタ、及びB.ヒオディセンテリアへの感染が不明の養豚場のブタから血清を採取する。20μgの精製した組換えタンパク質を7cmのIEFウェルに添加し、10%(w/v)のSDS−PAGEゲルによって電気泳動し、ニトロセルロース膜へ電気移動させる。膜をTBS−脱脂乳(5%w/v)でブロックし、マルチスクリーン装置(バイオ・ラッド)に組み込む。ウェルを100μLの希釈ブタ血清(100倍)と共に室温で1時間インキュベートする。次いで、膜を該装置から取り出し、TBST(0.1%v/v)で3回洗浄した後、10mLのヤギ抗ブタIgG(全分子)−AP(5000倍)と共に室温で1時間インキュベートする。膜をTBSTで3回洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質キット(バイオ・ラッド)を用いて発色させる。十分な発色が起こったら膜を水道水で洗浄し、乾燥させ、プレゼンテーション用にスキャンする。得られた結果を正の対照及び負の対照と比較することによって、ブタがB.ヒオディセンテリアに感染しているかどうか確認することができる。
Claims (44)
- 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63及び65から成る群から選択される配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
- 発現ベクターである、請求項2に記載のプラスミド。
- 請求項2に記載のプラスミドを含む細胞。
- 請求項3に記載のプラスミドを含む細胞。
- 請求項3に記載のプラスミドを含む免疫原性組成物。
- 請求項3に記載の発現ベクターを含む、ブラキスピラ・ヒオディセンテリアの治療又は予防のためのワクチン組成物。
- 請求項4に記載の細胞を含む、ブラキスピラ・ヒオディセンテリアの治療又は予防のためのワクチン組成物。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドと少なくとも70%同一である配列を含むDNA分子。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドと少なくとも80%同一である、請求項9に記載のDNA分子。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドと少なくとも90%同一である、請求項9に記載のDNA分子。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
- 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64及び66から成る群から選択される配列を含むポリペプチド。
- 請求項15に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項16に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミド。
- 発現ベクターである、請求項17に記載のプラスミド。
- 請求項17に記載のプラスミドを含む細胞。
- 請求項19に記載の細胞を含む免疫原性組成物。
- 請求項15に記載のポリペプチドと少なくとも70%相同である配列を含むタンパク質。
- 請求項15に記載のポリペプチドと少なくとも80%相同である、請求項21に記載のタンパク質。
- 請求項15に記載のポリペプチドと少なくとも90%相同である、請求項22に記載のタンパク質。
- 請求項23に記載のタンパク質を含む免疫原性組成物。
- 請求項15に記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
- 請求項15に記載のポリペプチドを含む、ブラキスピラ・ヒオディセンテリアの治療又は予防のためのワクチン組成物。
- 請求項15に記載のポリペプチドと結合するモノクローナル抗体。
- 請求項27に記載のモノクローナル抗体を含む、動物におけるブラキスピラ・ヒオディセンテリアの存在を診断するためのキット。
- 請求項15に記載のポリペプチドを含む、動物におけるブラキスピラ・ヒオディセンテリアの存在を診断するためのキット。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含む、動物におけるブラキスピラ・ヒオディセンテリアの存在を診断するためのキット。
- 動物においてブラキスピラ・ヒオディセンテリアに対する免疫応答を生じさせる方法であって、請求項24に記載の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法。
- 動物においてブラキスピラ・ヒオディセンテリアに対する免疫応答を生じさせる方法であって、請求項25に記載の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法。
- 動物においてブラキスピラ・ヒオディセンテリアに対する免疫応答を生じさせる方法であって、請求項6に記載の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法。
- 動物においてブラキスピラ・ヒオディセンテリアに対する免疫応答を生じさせる方法であって、請求項20に記載の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法。
- ブラキスピラ・ヒオディセンテリアに起因する疾患の治療又は予防を前記治療を必要とする動物において行う方法であって、請求項7に記載のワクチン組成物の治療有効量を前記動物に投与することを含む方法。
- ブラキスピラ・ヒオディセンテリアに起因する疾患の治療又は予防を前記治療を必要とする動物において行う方法であって、請求項8に記載のワクチン組成物の治療有効量を前記動物に投与することを含む方法。
- ブラキスピラ・ヒオディセンテリアに起因する疾患の治療又は予防を前記治療を必要とする動物において行う方法であって、請求項26に記載のワクチン組成物の治療有効量を前記動物に投与することを含む方法。
- 動物においてブラキスピラ・ヒオディセンテリアに対する免疫応答を生じさせるための薬剤を調製するための請求項23に記載のタンパク質の使用。
- 動物においてブラキスピラ・ヒオディセンテリアに対する免疫応答を生じさせるための薬剤を調製するための請求項15に記載のタンパク質の使用。
- 動物においてブラキスピラ・ヒオディセンテリアに対する免疫応答を生じさせるための薬剤を調製するための請求項3に記載のプラスミドの使用。
- 動物においてブラキスピラ・ヒオディセンテリアに対する免疫応答を生じさせるための薬剤を調製するための請求項19に記載の細胞の使用。
- ブラキスピラ・ヒオディセンテリアに起因する疾患の治療又は予防を前記治療を必要とする動物において行うための薬剤を調製するための請求項3に記載の発現ベクターの使用。
- ブラキスピラ・ヒオディセンテリアに起因する疾患の治療又は予防を前記治療を必要とする動物において行うための薬剤を調製するための請求項4に記載の細胞の使用。
- ブラキスピラ・ヒオディセンテリアに起因する疾患の治療又は予防を前記治療を必要とする動物において行うための薬剤を調製するための請求項15に記載のポリペプチドの使用。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05502370A (ja) * | 1989-09-13 | 1993-04-28 | エムエル テクノロジー ヴェンチャーズ エル.ピー. | 分子量39kDaの赤痢病原体抗原およびそれに対する遺伝子暗号付与 |
JP2005532804A (ja) * | 2002-07-17 | 2005-11-04 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | ブラキスピラ・ヒオジセンテリアエワクチン |
JP2006500914A (ja) * | 2002-05-08 | 2006-01-12 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | ブタ赤痢(Brachyspirahyodysenteriae)ワクチン |
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US3654090A (en) | 1968-09-24 | 1972-04-04 | Organon | Method for the determination of antigens and antibodies |
NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
US4016043A (en) | 1975-09-04 | 1977-04-05 | Akzona Incorporated | Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies |
US4491632A (en) | 1979-10-22 | 1985-01-01 | The Massachusetts General Hospital | Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor |
US4444887A (en) | 1979-12-10 | 1984-04-24 | Sloan-Kettering Institute | Process for making human antibody producing B-lymphocytes |
US4342566A (en) | 1980-02-22 | 1982-08-03 | Scripps Clinic & Research Foundation | Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes |
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US4493890A (en) | 1981-03-23 | 1985-01-15 | Miles Laboratories, Inc. | Activated apoglucose oxidase and its use in specific binding assays |
US4451570A (en) | 1981-03-26 | 1984-05-29 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line |
US4399121A (en) | 1981-11-04 | 1983-08-16 | Miles Laboratories, Inc. | Iodothyronine immunogens and antibodies |
US4427783A (en) | 1981-12-14 | 1984-01-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunoassay of thymosin α1 |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
CA1319101C (en) | 1986-09-03 | 1993-06-15 | Marta Iris Sabara | Rotavirus nucleocapsid protein with or without binding peptides as immunologic carriers for macromolecules |
US6673776B1 (en) | 1989-03-21 | 2004-01-06 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
ZA918426B (en) | 1990-10-31 | 1992-12-30 | Akzo Nv | Chicken anemia virus vaccine and diagnostic |
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US5612487A (en) | 1991-08-26 | 1997-03-18 | Edible Vaccines, Inc. | Anti-viral vaccines expressed in plants |
US6034298A (en) | 1991-08-26 | 2000-03-07 | Prodigene, Inc. | Vaccines expressed in plants |
US5837832A (en) | 1993-06-25 | 1998-11-17 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes on biological chips |
US5712118A (en) | 1993-09-29 | 1998-01-27 | Research Foundation Of State University Of New York | Vaccine for branhamella catarrhalis |
US6682729B1 (en) | 1995-05-03 | 2004-01-27 | University Of Maryland, Baltimore | Method for introducing and expressing genes in animal cells, and live invasive bacterial vectors for use in the same |
US5877159A (en) | 1995-05-03 | 1999-03-02 | University Of Maryland At Baltimore | Method for introducing and expressing genes in animal cells and live invasive bacterial vectors for use in the same |
US6150170A (en) | 1998-05-03 | 2000-11-21 | University Of Maryland At Baltimore | Method for introducing and expressing genes in animal cells, and live invasive bacterial vectors for use in the same |
US5824538A (en) | 1995-09-06 | 1998-10-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Shigella vector for delivering DNA to a mammalian cell |
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CA2390716A1 (en) | 1999-09-24 | 2001-04-05 | Alan D. King | Process for enhancing electric field-mediated delivery of biological materials into cells |
AU2001240109A1 (en) | 2000-03-07 | 2001-09-17 | U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases | Dna vaccines against poxviruses |
WO2001068889A2 (en) | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Malone Robert W | Method for gene transfection and vaccination through skin using electropermeabilization |
AU2002953431A0 (en) * | 2002-12-19 | 2003-01-09 | Murdoch University | BmpB Novel Nucleotide and Amino Acid Sequences and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof |
JP2007534311A (ja) * | 2003-12-19 | 2007-11-29 | マードツク・ユニバーシテイ | Brachyspirapilosicoli72kDa外膜タンパク質及び診断及び治療のためのその使用 |
US8834891B2 (en) * | 2005-03-14 | 2014-09-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis |
CN101175856A (zh) * | 2005-05-12 | 2008-05-07 | 诺瓦提斯公司 | 猪痢疾短螺旋体的基因和蛋白质及其用于诊断和治疗的用途 |
US20100297178A1 (en) * | 2006-03-20 | 2010-11-25 | Murdoch University | Novel genes and proteins of brachyspira hyodysenteriae and use of same for diagnosis and therapy |
MX2010001381A (es) * | 2007-08-03 | 2010-09-14 | Spirogene Pty Ltd | Genes y proteinas de brachyspira hyodysenteriae y usos de los mismos. |
EP2363407A1 (en) * | 2008-02-28 | 2011-09-07 | Murdoch University | Novel sequences of Brachyspira, immunogenic compositions, methods for preparation and use thereof |
CA2719553A1 (en) * | 2008-03-27 | 2009-10-01 | Spirogene Pty Ltd | Novel sequences of brachyspira, immunogenic compositions, methods for preparation and use thereof |
JP2012508564A (ja) * | 2008-11-14 | 2012-04-12 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー | ブラキスピラ・ヒオディセンテリアのワクチン株 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05502370A (ja) * | 1989-09-13 | 1993-04-28 | エムエル テクノロジー ヴェンチャーズ エル.ピー. | 分子量39kDaの赤痢病原体抗原およびそれに対する遺伝子暗号付与 |
JP2006500914A (ja) * | 2002-05-08 | 2006-01-12 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | ブタ赤痢(Brachyspirahyodysenteriae)ワクチン |
JP2005532804A (ja) * | 2002-07-17 | 2005-11-04 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | ブラキスピラ・ヒオジセンテリアエワクチン |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6012055047; Veterinary Microbiology Vol.102, 2004, pp.97-109 * |
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