BRPI0721908A2 - Genes e proteínas de brachyspira hyodysenteriae e usos dos mesmos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENES E PROTEÍNAS DE BRACHYSPIRA HYODYSENTERIAE E USOS DOS MESMOS".

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a novos genes em Brachyspira hyody-

senteriae e a proteínas codificadas nos mesmos. Esta invenção refere-se adicionalmente ao uso destes novos genes e proteínas para diagnose de doença de B. hyodysenteriae, vacinas contra B. hyodysenteriae e para clas- sificação de compostos que matam B. hyodysenteriae ou bloqueiam os efei- 10 tos patogênicos de B. hyodysenteriae. Estas seqüências podem também ser úteis para tratamento de diagnóstico e terapêutico e/ou profilático de doen- ças em animais causadas por outras espécies de Brachyspira, incluindo B. suanatina, B. intermedia, B. aivinipulli, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. pilosicoii.

Antecedentes da Invenção

A disenteria suína é uma doença endêmica significante de por- cos na Austrália e ao redor do mundo. A disenteria suína é uma doença diar- réica mucohemorrágica contagiosa, caracterizada por inflamação extensiva e necrose da superfície epitelial do intestino grosso. Perdas econômicas devido 20 à disenteria suína resultam principalmente do retardo do crescimento, custos de medicação e mortalidade. O agente causativo de disenteria suína foi pri- meiro identificado como uma espiroqueta anaeróbica (Treponema hyodysen- teriae) em 1971, e foi recentemente redesignada ao gênero Brachyspira co- mo B. hyodysenteriae. Onde a disenteria suína é estabelecida em um chi- 25 queiro, o espectro da doença pode variar de ser brando, transiente ou não- aparente, para ser severo e mesmo fatal. As estratégias de medicação em chiqueiros individuais podem mascara os sinais clínicos e, em alguns chi- queiros, a doença pode ser não-observada, ou pode somente ser suspeita- da. Se ou não doença óbvia ocorre, a B. hyodysenteriae pode persistir em 30 porcos infectados, ou em outros hospedeiros reservatórios tais como roedores, ou no ambiente. Todas estas fontes apresentam potencial para transmissão da doença a rebanhos não-infectados. As aves domésticas comerciais podem também serem colonizadas por B. hyodysenteriae, embora não seja claro como comumente isto ocorre sob condições de campo.

A Colonização por B. hyodysenteriae induz uma forte resposta imunológica contra a espiroqueta, consequentemente evidência indireta de exposição à espiroqueta pode ser obtida pela medição da circulação de titu- lações de anticorpo no sangue de animais infectados. Estas titulações de anticorpo foram reportadas para serem mantidas em níveis baixos, mesmo em animais que se recuperaram de disenteria suína. Os testes sorológicos para detecção de anticorpos, portanto, têm potencial considerável para de- tecção de infecções subclínicas e porcos veículos recuperados que têm nú- meros não-detectáveis de espiroquetas em seus intestinos grossos. Estes testes seriam particularmente valiosos em uma facilidade para uso de forma de kit, tal como um ensaio imunosorvente ligado a enzima. Uma variedade de técnicas foi desenvolvida para demonstrar a presença de circulação de anticorpos contra B. hyodysenteriae, incluindo testes de anticorpo fluores- centes indiretos, testes de hemaglutinação, testes de aglutinação de microti- tulação, testes de fixação de complemento, e ELISA usando ou Iipopolissa- carídeo ou espiroquetas sonicadas totais como antígeno. Todos estes testes sofreram de problemas de especificidade, visto que espiroquetas intestinais não-patogênicas relacionadas podem induzir anticorpos reativos cruzados. Estes testes são úteis para detecção de rebanhos onde existe doença óbvia e alta circulação de titulações de anticorpo, mas eles são problemáticos para identificação de rebanhos subclinicamente infectados e porcos individuais infectados. Consequentemente, até aqui, ensaios não completamente sensí- veis e específicos são disponíveis para a detecção de anticorpos contra B. hyodysenteriae. A falta de testes diagnósticos adequados tem dificultado o controle de disenteria suína.

Um número de métodos é empregado para controlar disenteria suína, variando a partir do uso profilático de agentes antimicrobiais, para completar desestoque de rebanhos infectados e prevenção de re-entrada de porcos veículos infectados. Todas estas opções são custosas e, se elas são para serem totalmente eficazs, elas requerem o uso de testes diagnósticos sofisticados para monitorar progresso. Atualmente, detecção de disenteria suína em rebanhos com infecções subclínicas, e animais veículos saudáveis individuais, permanecem um problema maior e está dificultando a implemen- tação de medidas de controle efetivo. Uma diagnose definitiva de disenteria 5 suína tradicionalmente tem requerido o isolamento e identificação de B. hyodysenteriae das fezes ou mucosa de porcos doentes. Os problemas maiores envolvidos incluem o crescimento lento e requerimentos nutricionais fastidiosos destas bactérias anaeróbicas e confusão devido à presença de espiroquetas morfologicamente similares na flora normal do intestino do por- 10 co. Um aperfeiçoamento significante na diagnose dê porcos afetados indivi- duais foi alcançado com o desenvolvimento de ensaios de reação de cadeia de polimerase (PCR) para a detecção de espiroquetas das fezes. Infelizmen- te nas aplicações práticas, o limite de detecção de PCRs tornou incapaz de- tectar animais veículos com infecções subclínicas. Como uma conseqüência 15 destes problemas diagnósticos, existe uma necessidade clara de desenvol- ver uma ferramenta diagnostica a simples e eficaz capaz de detectar infec- ção de B. hyodysenteriae no rebanho e nível de porco individual.

Uma forte resposta imunológica é induzida contra a espiroqueta seguindo colonização com B. hyodysenteriae, e porcos recuperados de di- 20 senteria suína são protegidos de reinfecção. Apesar disto, tentativas de de- senvolver vacinas para controlar disenteria suína têm encontrado sucesso muito limitado, ou porque elas têm provido proteção inadequada na base do rebanho, ou elas têm sido muito custosas e difíceis de produzir para torná- las comercialmente viáveis. As vacinas bacterin proporcionam algum nível 25 de proteção, mas elas tendem a serem específicas de grupo de soro Iipopo- lissacarídeo, que então requerem o uso de bacterins multivalentes. Além disso, elas são difíceis e custosas de produzir em uma grande escala por causa dos requerimentos de crescimento anaeróbico fastidioso da espiro- queta.

Várias tentativas têm sido feitas para desenvolver vacinas vivas

atenuadas para disenteria suína. Esta aproximação tem a vantagem que cepas de vacinas atenuadas mostram colonização reduzida, e, consequen- temente, causam estímulo imune reduzido. Existe também relutância na par- te de produtores e veterinários em usar vacinas vivas para disenteria suína por causa da possibilidade de reversão à virulência, especialmente conforme muito pouco é conhecido sobre regulação genética e organização em B.

kyodysenteriae.

O uso de vacinas de subunidade recombinante é uma alternativa atrativa, visto que os produtos seriam bem definidos (essencial para propos- tas de registro), e relativamente fáceis de produzir em uma grande escala. Até aqui o primeiro uso reportado de uma proteína recombinante de B. 10 kyodysenteriae como uma vacina candidata (uma proteína flagelar de 38- quilodáltons) falhou em prevenir colonização em porcos. Esta falha está pro- vavelmente relacionada a especificamente a proteína recombinante particu- lar usada, bem como a outras emissões mais a jusante de sistemas de dis- tribuição e rotas, taxas de dose, escolha de adjuvantes, etc. (Gabe, JD, 15 Chang, RJ, Slomiany, R, Andrews, WH e McCaman, MT (1995) Isolation of extracytoplasmic proteínas from Serpuiina kyodysenteriae B204 e molecular cloning of the/ZaBI gene encoding a 38-kilodalton flagellar proteína. Infection and Immunity 63:142-148). A primeira proteína de B. kyodysenteriae recom- binante protetora parcialmente reportada usada para vacinação foi uma Iipo- 20 proteína de membrana externa de 29,7 kDa (Bhlp29.7, também referida co- mo BmpB e BIpA) que tinha homologia com as lipoproteínas de ligação de metionina de várias bactérias patogênicas. O uso da proteína his-etiquetada recombinante Bhlp29.7 para vacinação de porcos, seguido por desafio expe- rimental com B. kyodysenteriae, resultou em 17-40% de porcos vacinados 25 desenvolvendo doença comparado a 50-70% dos porcos de controle não- vacinados que desenvolveram doença. Desde que a incidência de doença para os porcos vacinados Bhlp29.7 foi significantemente (P=0.047) menos do que para os porcos de controle, Bhlp29.7 pareceu ter potencial como um componente de vacina de disenteria suína (La, T, Phillips, ND, Reichel, MP 30 and Hampson, DJ (2004). A proteção de porcos de disenteria suína por va- cinação com BmpB recombinante, uma lipoproteína de membrana externa de 29,7 kDa de Brachyspira kyodysenteriae. Veterinary Microbiology 102:97- 109). Um número de outras tentativas foi feito para identificar proteínas de envelope externa de B. kyodysenteriae que podem ser usadas como com- ponentes de vacina recombinante, mas novamente nenhuma vacina de su- cesso foi ainda produzida. Uma aproximação muito mais global é necessária 5 para a identificação de proteínas imunogênicas potencialmente úteis de B. hyodysenteriae é necessária.

Até aqui, somente um estudo usando DNA para vacinação foi reportado. Neste estudo, o gene de B. hyodysenteriae ftnA, que codifica uma ferritin putativa, foi clonado em um plasmídeo de E. coli e o DNA de plasmí- 10 deo usado para revestir contas de ouro para vacinação balística. Um modelo de murina para disenteria suína foi usado para determinar a natureza prote- tora de vacinação com DNA e/ou proteína recombinante. A vacinação com proteína recombinante induz uma boa resposta sistêmica contra ferritina; contudo, a vacinação com DNA induz somente uma resposta sistêmica de- 15 tectável. A vacinação com DNA seguida de um impulso com proteína re- combinante induz uma resposta sistêmica imune a ferritina somente após impulso com proteína. Contudo, nenhum dos regimes de vacinação testados foi capaz de proporcionar os camundongos com proteção contra colonização de B. hyodysenteriae e as lesões associadas. Interessantemente, a vacina- 20 ção dos camundongos com DNA somente resultou em exacerbação signifi- cante da doença (Davis, A.J., Smith, S.C. and Moore, R.J. (2005). The Bra- chyspira hyodysenteriae ftnA gene: DNA vaccination e real-time PCR quanti- fication of bactéria in a mouse model of disease. Current Microbiology 50: 285-291).

Breve Sumário da Invenção

É um objetivo desta invenção ter novos genes de B. hyodysente- riae e as proteínas codificadas por estes genes. É um objetivo adicional des- ta invenção que os novos genes e as proteínas codificadas por estes genes possam ser usados para propostas terapêuticas e diagnosticas. Pode-se 30 usar os genes e/ou as proteínas em uma vacina contra B. hyodysenteriae e para diagnose de infecções de B. hyodysenteriae.

É um objetivo desta invenção ter um novo gene B. hyodysenteri- ae tendo a seqüência de nucleotídeo contida em SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9,

11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, e 65. É também um objetivo desta invenção ter as seqüências de nucleotídeo que são idênticas a SEQ ID NOs: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51,

53, 55, 57, 59, 61, 63, e 65, onde a identidade de percentagem pode ser pe- lo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% (e todo inteiro de 100 a 70). Esta invenção também inclui uma vacina de DNA ou composição imunogê- nica de DNA contendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47,

49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, e 65 e seqüências que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70%o idênticas (e todo inteiro de 100 a 70) para es- tas seqüências. Esta invenção inclui adicionalmente um ensaio de diagnósti- co contendo DNA tendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47,

49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, e 65, e seqüências que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75%o e 70%) idênticas (e todo inteiro de 100 a 70) para estas seqüências.

É também um objetivo desta invenção ter plasmídeos contendo 20 DNA tendo a seqüência de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35,37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, e 65; vetores de expressão procarióticos e/ou eucarióticos contendo DNA tendo a seqüência de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 25 63, e 65; e uma célula contendo os plasmídeos que contêm DNA tendo a seqüência de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,

29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, e 65.

É um objetivo desta invenção ter novas proteínas de B. hyody- senteriae proteínas tendo a seqüência de aminoácido contida em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66. É outro objetivo desta in- venção ter proteínas que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas (e todo inteiro de 100 a 70) para as seqüências contidas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66. É também um objetivo desta invenção uma vacina ou composição imunogênica para conter as pro- 5 teínas tendo a seqüência de aminoácido contida em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66, ou seqüência de aminoácidos que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas (e todo inteiro de 100 a 70) para as seqüências contidas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 10 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66. É um outro aspecto desta invenção ter um kit diagnóstico contendo uma ou mais proteínas tendo uma seqüência contida em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66, ou que são 15 pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%o, 75%o e 70% homólogas às seqüências contidas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,

30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66.

É outro aspecto desta invenção ter seqüências de nucleotídeo que codificam as proteínas tendo a seqüência de aminoácido contida em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66, e codifica as se- qüências de aminoácidos que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70%) homólogas (e todo inteiro de 100 a 70) às seqüências contidas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66. A invenção tam- bém cobre plasmídeos, vetores de expressão eucarióticos e procarióticos, e vacinas de DNA que contêm DNA tendo uma seqüência que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido contida em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66, e codifica seqüências de aminoácido que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%o, 75%) e 70% homólogas (e todo in- teiro de 100 a 70) às seqüências contidas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52,

54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66. As células que contêm estes plasmídeos e veto- res de expressão estão incluídas nesta invenção.

Esta invenção inclui anticorpos monoclonais que se ligam a pro- teínas tendo uma seqüência de aminoácido contida em SEQ ID NOs: 2, 4, 6,

8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48,

50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66, ou se ligam a proteínas que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas (e todo inteiro de 100 to 70) às seqüências contidas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 10 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66. Kits de diagnóstico contendo os anticorpos monoclonais que se ligam às proteínas tendo uma seqüência de aminoácido contida em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66, ou se ligam às 15 proteínas que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólo- gas (e todo inteiro de 100 a 70) às seqüências contidas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66 estão incluídos nesta invenção. Estes kits de diagnósticos podem detector a presença de B. kyodysenteriae 20 em um animal. O animal é preferivelmente qualquer mamífero e pássaro; mais preferivelmente, galinha, ganso, pato, peru, periquito, cão, gato, hams- ter, gerbo, coelho, furão, cavalo, vaca, ovelha, porco, macaco, e ser huma- no.

A invenção também contempla o método de prevenir ou tratar 25 uma infecção de B. kyodysenteriae em um animal por administração a um animal de uma vacina de DNA contendo uma ou mais seqüências de nucleo- tídeos listadas em SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, e 65, ou seqüências que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% idên- 30 ticas (e todo inteiro de 100 a 70) a estas seqüências. Esta invenção também cobre um método de prevenir ou tratar uma infecção de B. hyodysenteriae em um animal por administração a um animal de uma vacina contendo uma ou mais proteínas tendo a seqüência de aminoácido contida em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66, ou seqüências que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas (e todo inteiro de 5 100 a 70) a estas seqüências. O animal é preferivelmente qualquer mamífe- ro e pássaro; mais preferivelmente, galinha, ganso, pato, peru, periquito, cão, gato, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, vaca, ovelha, porco, maca- co, e ser humano. A invenção também contempla o método de geração de uma resposta imune em um animal por administração a um animal de uma 10 composição imunogênica contendo uma ou mais das seqüências de nucleo- tídeo listadas em SEQ ID NOs: 1,3,5,7,9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25,27, 29,

31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, e 65, ou se- qüências que são pelo menos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% idênticas (e todo inteiro de 100 a 70) a estas seqüências. Esta invenção também co- 15 bre um método de geração de uma resposta imune em um animal por admi- nistração a um animal de uma composição imunogênica contendo uma ou mais proteínas tendo a seqüência de aminoácido contida em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66, ou seqüências que são pelo me- 20 nos 95%, 90%, 85%, 80%, 75% e 70% homólogas (e todo inteiro de 100 a 70) a estas seqüências. O animal é preferivelmente qualquer mamífero e pássaro; mais preferivelmente, galinha, ganso, pato, peru, periquito, cão, gato, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, vaca, ovelha, porco, macaco, e humano.

Sumário Detalhado da Invenção

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para se referirem a um ou mais do que um (isto é, a pelo menos um) do objetivo gramatical do arti- go. Por meio de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais do que um elemento.

O termo "aminoácido" é pretendido envolver todas as moléculas,

se naturais ou sintéticas, que incluem ambos uma funcionalidade de amino e uma funcionalidade de ácido e capaz de ser incluído em um polímero de a- minoácidos que ocorre naturalmente. Aminoácidos exemplares incluem ami- noácidos que ocorrem naturalmente; análogos, derivados e congêneres des- tes; análogos de aminoácido tendo cadeias laterais variantes;, e todos os estereoisômeros de qualquer de qualquer dos precedentes.

Um animal pode ser qualquer mamífero ou pássaro. Exemplos

de mamíferos incluem cão, gato, hamster, gerbo, coelho, furão, cavalo, va- ca, ovelha, porco, macaco, e ser humano. Exemplos de pássaros incluem galinha, ganso, pato, peru, e periquito.

O termo "resíduo conservado" refere-se a um aminoácido que é um membro de um grupo de aminoácidos tendo certas propriedades co- muns. O termo "substituição de aminoácido conservativo" refere-se a substi- tuição (conceitualmente ou de outro modo) de um aminoácido de um tal gru- po com um aminoácido diferente do mesmo grupo. Um modo funcional para definir propriedades comuns entre aminoácidos individuais para analisar as frequências normalizadas de mudanças de aminoácido entre proteínas cor- respondentes de organismos homólogos (Schulz, G. E. e R. H. Schinner., Principies of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo com tal análise, grupos de aminoácidos podem ser definidos onde aminoácidos dentro de um grupo trocam preferencialmente um com o outro, e, portanto, se asseme- Iham com o outro mais em seu impacto na estrutura de proteína total (S- chulz, G. E. e R. H. Schirmer, Principies of Protein Structure, Springer- Verlag). Exemplos de grupos de aminoácido definidos dessa maneira inclu- em: (i) um grupo positivamente carregado contendo Lys, Arg e His, (ii) um grupo negativamente carregado contendo Glu e Asp, (iii) um grupo aromáti- co contendo Phe, Tyr e Trp, (iv) um grupo de anel de nitrogênio contendo His e Trp, (v) um grupo não-polar alifático grande contendo Vai, Leu e De, (vi) um grupo levemente polar contendo Met e Cys, (vii) um grupo de resíduo pequeno contendo Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gin e Pro, (viii) um gru- po alifático contendo Vai, Leu, De, Met e Cys, e (ix) um grupo hidroxil pe- queno contendo Ser e Thr.

Uma "proteína de fusão" ou "polipeptídeo de fusão" se referem a uma proteína quimérica conforme este termo é conhecido na técnica e po- dem ser construídos usando-se métodos conhecidos na técnica. Em, muitos exemplos de proteínas de fusão, existem duas seqüências de polipeptídeo diferentes, e, em certos casos, podem ser mais. As seqüências de polinu- cleotídeo que codificam a proteína de fusão podem ser operavelmente Iiga- 5 das na estrutura de modo que a proteína de fusão pode ser transladada cor- retamente. Uma proteína de fusão pode incluir seqüências de polipeptídeo da mesma espécie ou de espécie diferente. Em várias concretizações, o po- lipeptídeo de fusão pode conter uma ou mais seqüências de aminoácido liga- das a um primeiro polipeptídeo. No caso onde mais do que uma seqüência de 10 aminoácido é fundida a um primeiro polipeptídeo, as seqüências de fusão po- dem ser cópias múltiplas da mesma seqüência, ou, alternativamente, podem ser seqüências de aminoácido diferentes. Os polipeptídeos de fusão podem ser fundidos ao N-terminal, ao C-terminal, ou aos N- e C-terminal do primeiro polipeptídeo.

Proteínas de fusão exemplares incluem polipeptídeos contendo

uma etiqueta glutationa S-transferase (GST-etiqueta), etiqueta de histidina (His-tag), um domínio de imunoglobulina ou um domínio de ligação de imu- noglobulina.

O termo "polipeptídeo isolado" refere-se a um polipeptídeo, em 20 certas concretizações preparado de DNA ou RNA recombinante, ou de ori- gem sintética ou de origem natural, ou alguma combinação destes, que (1) não está associado com proteínas que são normalmente encontradas na natureza, (2) é separado da célula em que ele normalmente ocorre, (3) está livre de outras proteínas da mesma fonte celular, (4) é expresso por uma 25 célula de uma espécie diferente, ou (5) não ocorre na natureza. É possível para um polipeptídeo isolado existir, mas não se qualificar como um polipep- tídeo purificado.

O termo "ácido nucleico isolado" e "polinucleotídeo isolado" refe- re-se a um polinucleotídeo se DNA genômico, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, iRNA, ou um polinucleotídeo obtido de uma organela celular (tal como mito- côndria e cloroplasto), ou se de origem sintética, que (1) não está associado com a célula em que o "ácido nucleico isolado" é encontrado na natureza, ou (2) é operavelmente ligado a um polinucleotídeo ao qual ele não é ligado na natureza. É possível para um polinucleotídeo isolado existir, mas não se qualificar como um polinucleotídeo purificado.

O termo "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" se referem a uma 5 forma polimérica de nucleotídeos, ou ribonucleotídeos ou deoxirribonucleotí- deos, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Os termos devem também ser compreendidos para incluir, como equivalentes, análogos de ou RNA ou DNA produzidos de análogos de nucleotídeo, e, conforme apli- cável a concretização sendo descrita, polinucleotídeos de trançado simples 10 (tal como de sentido e antisentido) e polinucleotídeos de trançado duplo.

O termo "ácido nucleico da invenção'1 e "polinucleotídeo da in- venção" se referem a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da in- venção. Um polinucleotídeo da invenção pode compreender todo, ou uma porção de uma seqüência de ácido nucleico objeto; uma seqüência de nu- 15 cleotídeo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de ácido nucleico objeto (e todo inteiro entre 60 e 100); uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob condições estringen- tes a uma seqüência de ácido nucleico objeto; seqüências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos que são funcionalmente equivalentes a polipep- 20 tídeos da invenção; seqüências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% homólo- gas ou idênticas com uma seqüência de aminoácido objeto (e todo inteiro entre 60 e 100); seqüências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos ten- do uma atividade de um polipeptídeo da invenção, e tendo pelo menos cerca 25 de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais homologia ou iden- tidade com uma seqüência de aminoácido objeto (e todo inteiro entre 60 e 100); seqüências de nucleotídeo que diferem por 1 a cerca de 2, 3, 5, 7, 10,

15, 20, 30, 50, 75 ou mais substituições de nucleotídeo, adições ou anula- ções, tais como variantes alélicas de uma seqüência de ácido nucleico obje- to; ácidos nucleicos derivados de e evolucionariamente relacionados a uma seqüência de ácido nucleico objetos; e complementos de e seqüências de nucleotídeo resultantes da degenerescência do código genético, para todos dos precedentes e outros ácidos nucleicos da invenção. Os ácidos nucleicos da invenção também incluem homólogos, por exemplo, ortólogos e paralo- gos de uma seqüência de ácido nucleico objeto e também variantes de uma seqüência de ácido nucleico objeto que foi otimizada por códon para expres- são em um organismo particular (por exemplo, célula hospedeira).

O termo "operavelmente ligado", quando descreve o relaciona- mento entre duas regiões de ácido nucleico, refere-se uma justaposição no qual as regiões estão em um relacionamento que permite que as mesmas funcionem em sua maneira pretendida. Por exemplo, uma seqüência de con- 10 trole "operavelmente ligada" a uma seqüência de codificação é ligada de tal maneira que a expressão da seqüência de codificação é alcançada sob con- dições compatíveis com as seqüências de controle, tais como quando as moléculas apropriadas (por exemplo, indutoras e polimerases) são ligadas à(s) sequência(s) de controle ou regulatória.

O termo "polipeptídeo", e os termos "proteína" e "peptídeo" que

são usados permutavelmente aqui, se referem a um polímero de aminoáci- dos. Polipeptídeos exemplares incluem produtos de gene, proteínas que o- correm naturalmente, homólogos, ortólogos, paralogos, fragmentos, e outros equivalentes, variantes e análogos do precedente.

Os termos "fragmento de polipeptídeo" ou "fragmento", quando

usados em referência a um polipeptídeo de referência, se referem a um poli- peptídeo em que resíduos de aminoácido são anulados conforme compara- dos ao próprio polipeptídeo de referência, mas onde a seqüência de amino- ácido remanescente é usualmente idêntica às posições correspondentes no 25 polipeptídeo de referência. Tais anulações podem ocorrer no amino-terminal ou carbóxi-terminal do polipeptídeo de referência, ou alternativamente am- bos. Os fragmentos tipicamente são pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, pelo menos 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos de comprimento, pelo menos 75 aminoácidos 30 de comprimento, ou pelo menos 100, 150, 200, 300, 500 ou mais aminoáci- dos de comprimento. Um fragmento pode reter uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de referência. Em certas concretizações, um frag- mento pode compreender um domínio tendo a atividade biológica desejada, e, opcionalmente, aminoácidos adicionais em um ou ambos os lados do do- mínio, cujos aminoácidos adicionais podem numerar de 5, 10,15, 20, 30, 40,

50, ou até 100 ou mais resíduos. Adicionalmente, fragmentos podem incluir um subfragmento de uma região específica, cujo subfragmento retém uma função da região da qual é derivado. Em outra concretização, um fragmento pode ter propriedades imunogênicas.

O termo "polipeptídeo da invenção" refere-se a um polipeptídeo contendo uma seqüência de aminoácido objeto, ou um equivalente ou frag- 10 mento deste. Os polipeptídeos da invenção incluem polipeptídeos contendo toda ou uma porção de uma seqüência de aminoácido objeto; uma seqüên- cia de aminoácido objeto com 1 a cerca de 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 ou mais substituições de aminoácido conservativas; uma seqüência de ami- noácido que é pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 15 99% homólogas a uma seqüência de aminoácido objeto (e todo inteiro entre 60 e 100); e fragmentos funcionais destes. Os polipeptídeos da invenção também incluem homólogos, por exemplo, ortólogos e paralogos de uma seqüência de aminoácido objeto.

É também possível modificar a estrutura dos polipeptídeos da 20 invenção para tais propostas como aumento da eficiência terapêutica ou pro- filática, ou estabilidade (por exemplo, vida útil ex vivo, resistência à degrada- ção proteolítica in vivo, etc.). Tais polipeptídeos modificados, quando desig- nados para reter pelo menos uma atividade da forma que ocorre naturalmen- te da proteína, são consideradas "equivalentes funcionais" dos polipeptídeos 25 descritos em mais detalhes aqui. Tais polipeptídeos modificados podem ser produzidos, por exemplo, por substituição de aminoácido, anulação, ou adi- ção, cujas substituições podem consistir no todo ou parte por substituições de aminoácido conservativas.

Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição de ami- noácido conservativa isolado, tal como substituição de uma Ieucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, não terá um efeito maior na atividade biológica da molécula re- sultante. Se uma mudança na seqüência de aminoácido de um polipeptídeo resulta em um homo Iog funcional pode ser prontamente determinado por avaliação da capacidade do polipeptídeo variante para produzir uma respos- ta similar àquela da proteína tipo selvagem. Os polipeptídeos em que mais 5 do que uma substituição tenha ocorrido pode ser prontamente testado da mesma maneira. O termo "purificado" refere-se a uma espécie objetiva que é a espécie predominante presente (Isto é, em uma base molar é mais a- bundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Uma "fração purificada" é uma composição na qual a espécie objetiva é pelo me- 10 nos cerca de 50 por cento (em uma base molar) de toda espécie presente. Em se fazendo a determinação da pureza ou uma espécie em solução ou dispersão, o solvente ou matriz em que a espécie é dissolvida ou dispersa é usualmente não incluída em tal determinação; ao invés, somente a espécie (incluindo a uma de interesse) dissolvida ou dispersa é levada em conside- 15 ração. Geralmente, uma composição purificada terá uma espécie que é mais do que cerca de 80% de todas as espécies presentes na composição, mais do que cerca de 85%, 90%, 95%, 99% ou mais de todas as espécies pre- sentes. As espécies objetivas podem ser purificadas a homogeneidade es- sencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição 20 por métodos de detecção convencionais) no qual a composição é essenci- almente uma espécie simples. Um técnico no assunto pode purificar um po- lipeptídeo da invenção usando técnicas padrão para purificação de proteína à Iuz dos ensinamentos aqui. A pureza de um polipeptídeo pode ser deter- minada por um número de métodos conhecidos àqueles técnicos no assun- 25 to, incluindo, por exemplo, análise de seqüência de aminoácido amino termi- nal, eletroforese de gel, análise de espectrometria de massa e os métodos descritos aqui.

Os termos "proteína recombinante" ou "polipeptídeo recombi- nante" se referem a um polipeptídeo que é produzido por técnicas de DNA recombinante. Um exemplo de tais técnicas inclui o caso quando DNA que codifica a proteína expressa é inserido em um vetor de expressão adequado que é, por sua vez, usado para transformar uma célula hospedeira para pro- duzir a proteína ou polipeptídeo codificado pelo DNA.

O termo "seqüência regulatória" é um termo geral usado através de todo o relatório para se referir a seqüências de polinucleotídeo, tal como sinais de iniciação, intensificadores, reguladores e promotores, que são ne- cessários ou desejáveis para afetar a expressão de seqüências de codifica- ção ou não-codificação a qual elas são operavelmente ligadas. Seqüências regulatórias exemplares são descritas em Goeddel; Gene Expression Tech- nology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990), e incluem, por exemplo, os promotores anteriores e posteriores de SV40, ade- novírus ou promotores anteriores imediatos de citomegalovirus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, o promoter T7 cuja expressão é direcionada por T7 RNA polimerase, o operador maior e regiões de promotor de fago lambda, as regiões de controle para proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerateoquinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida {por exemplo, Pho5), os promotores dos fato- res de união-α de leveduras, o promotor poli-hedron do sistema de baculoví- rus e outras seqüências conhecidas para controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e várias combinações destes. A natureza e uso de tais seqüências de controle podem diferir de- pendendo do organismo hospedeiro.

Nos procariotas, tais seqüências regulatórias geralmente inclu- em promotor, local de ligação ribossomal, e seqüências de terminação de transcrição. O termo "seqüência regulatória" é pretendido para incluir, no mínimo, componentes cuja presença pode influenciar expressão, e pode 25 também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por e- xemplo, seqüências condutoras e seqüências co-participantes de fusão. Em certas concretizações, a transcrição de uma seqüência de polinucleotídeo está sob o controle de uma seqüência promotora (ou outra seqüência regu- latória) que controla a expressão do polinucleotídeo em um tipo de célula em 30 que expressão é pretendida. Será também compreendido que o polinucleo- tídeo pode estar sob o controle de seqüências regulatórias que são as mes- mas ou diferentes daquelas seqüências que controlam expressão da forma que ocorre naturalmente do polinucleotídeo.

O termo "seqüência de homologia" refere-se à proporção de e- quiparações bases entre duas seqüências de ácido nucleico ou a proporção de equiparações de aminoácido entre duas seqüências de aminoácidos.

Quando a homologia de seqüência é expressa como uma percentagem, por exemplo, 50%, a percentagem denota a proporção de equiparações sobre o comprimento de seqüência de uma seqüência desejada que é comparada a alguma outra seqüência. Folgas (em qualquer das duas seqüências) são permitidas para maximizar equiparação; comprimentos de folga de 15 bases 10 ou menos são usualmente usados, 6 bases ou menos são usadas mais fre- quentemente, com 2 bases ou menos usadas ainda mais frequentemente. O termo "identidade de seqüência" significa que seqüências são idênticas (isto é, em uma base de nucleotídeo por nucleotídeo base para bases de ácidos nucleicos ou aminoácido por aminoácido para polipeptídeos) sobre uma ja- 15 nela de comparação. O termo "percentagem de identidade de seqüência" é calculada por comparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de posições nas quais os aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ocorrem em ambas as seqüências para produzir o número de posições equiparadas, dividindo-se o número de 20 posições equiparadas pelo número total de posições na janela de compara- ção, e multiplicando-se o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de seqüência. Métodos para calcular identidade de seqüência são conhecidos àqueles técnicos no assunto e descritos em detalhe adicio- nal abaixo.

O termo "solúvel", conforme usado aqui com referência a um

polipeptídeo da invenção ou outra proteína, significa que sob exposição na cultura de célula, pelo menos alguma porção do polipeptídeo ou proteína expressa permanece na fração citoplásmica da célula e não fraciona com o fragmento celular após Iysis e centrifugação do lisato. A solubilidade de um 30 polipeptídeo pode ser aumentada por uma variedade de métodos conheci- dos na técnica, incluindo fusão a uma seqüência heteróloga de aminoácido, anulação de resíduos de aminoácido, substituição de aminoácido (por e- xemplo, enriquecimento da seqüência com resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais hidrofílicas), e modificação química (por exemplo, adição de grupos hidrofílicos).

A solubilidade de polipeptídeos pode ser medida usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo, difusão de Iuz dinâ- mica para determinar estado de agregação, absorção de UV, centrifugação para separar agregado de material não-agregado, e eletroforese de SDS gel (por exemplo, a quantidade de proteína na fração solúvel é comparada à quantidade de proteína nas frações solúveis e insolúveis combinadas). Quando expressos em uma célula hospedeira, os polipeptídeos da invenção podem ser pelo menos cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais solúveis, por exemplo, pelo menos cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da quantidade total de proteína expressa na célula é encontrada na fração cito- plásmica. Em certas concretizações, uma cultura de um litro de células ex- pressando um polipeptídeo da invenção produzirá pelo menos cerca de 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 miligramas de mais de proteína solúvel. Em uma concretização exemplar, um polipeptídeo da invenção é pelo menos cerca de 10% solúvel e produzirá pelo menos cerca de 1 miligrama de prote- ína de um litro de cultura de célula.

O termo "hibridiza especificamente" refere-se à ligação de ácido nucleico detectável e específica. Os polinucleotídeos, oligonucleotídeos e ácido nucleicos da invenção hibridizam seletivamente a trançados de ácido nucleico sob condições de hibridização e de lavagem que minimizam quanti- 25 dades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucleicos não-específicos. As condições estringentes podem ser usadas para alcançar condições sele- tivas de hibridização conforme conhecidas na técnica e discutidas aqui. Ge- ralmente, a identidade de seqüência de ácido nucleico entre os polinucleotí- deos, oligonucleotídeos, e ácido nucleicos da invenção e uma seqüência de 30 ácido nucleico de interesse será pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais (e todo inteiro entre 30 e 100). Em certos exemplos, as condições de hibridização e de lavagem são reali- zadas sob condições estringentes de acordo com os procedimentos de hi- bridização e conforme descrito adicionalmente aqui.

Os termos "condições estringentes" ou "condições de hibridiza- ção estringentes" se referem às condições que promovem hibridização es- pecífica entre dois trançados de polinucleotídeo complementares de modo a formar um dúplex. As condições estringentes podem ser selecionadas para serem cerca de 5°C mais baixa do que o ponto de fusão térmico (Tm) para um dado polinucleotídeo dúplex a uma resistência iônica definida e pH. O comprimento dos trançados de polinucleotídeo complementares e seu con- teúdo de GC determinarão a Tm do dúplex, e, desse modo, as condições de hibridização necessárias para obtenção de uma especificidade desejada de hibridização. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica definida e pH) na qual 50% de uma seqüência de polinucleotídeo hibridiza a um trançado complementar perfeitamente equiparado. Em certos casos, pode ser desejá- vel aumentar a estringência das condições de hibridização para ser cerca de igual a Tm para um dúplex particular.

Uma variedade de técnicas de estimar a Tm são disponíveis. Tipicamente, pares base G-C em um dúplex são estimados para contribuir cerca de 3°C para a Tm, enquanto pares bases A-T são estimados para con- tribuir cerca de 2°C, até um máximo teórico de cerca de 80-100°C.

Contudo, modelos mais sofisticados de Tm são disponíveis em que interações de empilhamento G-C, efeitos de solvente, a temperatura de ensaio desejada, e similares, são levados em conta.

Por exemplo, sondas podem ser designadas para ter uma tem- 25 peratura de dissociação (Td) de aproximadamente 60°C, usando a fórmula: Td = (((3 x #GC) + (2 x #AT)) x 37) - 562)/#pb) - 5; onde #GC, #AT, e #pb são o número de pares bases guanina-citosina, o número de pares bases adenina-timina, e o número de pares bases totais, respectivamente, envolvi- dos na formação do dúplex.

A hibridização pode ser efetuada em 5x SSC, 4x SSC, 3x SSC,

2x SSC, 1x SSC ou 0,2x SSC por pelo menos cerca de 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, ou 24 horas. A temperatura da hibridização pode ser au- mentada para ajustar a estringência da reação, por exemplo, de cerca de 25°C (temperatura ambiente), a cerca de 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, ou 65°C. A reação de hibridização pode também incluir outro agente que afeta a es- tringência, por exemplo, hibridização conduzida na presença de 50% de 5 formamida aumenta a estringência de hibridização a uma temperatura defi- nida.

A reação de hibridização pode ser seguida por uma etapa de lavagem simples, ou duas ou mais etapas de lavagem, que podem estar nas mesmas ou uma salinidade e temperatura diferentes. Por exemplo, a tempe- 10 ratura da lavagem pode ser aumentada para ajustar a estringência de cerca de 25°C (temperatura ambiente), a cerca de 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, ou mais alta. A etapa de lavagem pode ser conduzida na presença de um detergente, por exemplo, 0,1 ou 0,2% de SDS. Por exemplo, a hibridização pode ser seguida por duas etapas de lavagem a 65°C cada por cerca de 20 15 minutos em 2x SSC, 0,1 % SDS, e, opcionalmente, duas etapas de lavagem adicionais a 65°C cada por cerca de 20 minutos em 0,2x SSC, 0,1% de SDS.

As condições de hibridização estringentes exemplares incluem hibridização durante a noite a 65°C em uma solução contendo 50% de for- 20 mamida, IOx Denhardt (0,2% de Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de albumina de soro bovino) e 200 μς/ηηΙ de DNA veículo desnaturado, por e- xemplo, DNA de esperma de salmão cisalhado, seguido por duas etapas de lavagem a 65°C cada por cerca de 20 minutos em 2x SSC, 0,1% de SDS, e duas etapas de lavagem a 65°C cada por cerca de 20 minutos em 0,2xSSC, 25 0,1% de SDS.

A hibridização pode consistir de hibridização de dois ácidos nu- cleicos na solução, ou um ácido nucleico na solução a um ácido nucleico fixado a um suporte sólido, por exemplo, um filtro. Quando um ácido nuclei- co está em um suporte sólido, uma etapa de pré-hibridização pode ser con- duzida antes da hibridização.

A pré-hibridização pode ser efetuada por pelo menos cerca de 1 hora, 3 horas ou 10 horas na mesma solução e na mesma temperatura co- mo a solução de hibridização (sem o trançado de polinucleotídeo comple- mentar).

AS condições de estringência apropriadas são conhecidas àque- les técnicos no assunto ou podem ser determinadas experimentalmente pelo 5 técnico no assunto. Ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Bio- logy, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-12.3.6; Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volume 20; Tijssen (1993) Labo- ratory Teehniques in Biochemistry e Molecular Biology — Hibridização Com 10 Acid nucleic Probes, for example, parte I capítulo 2 "Overview of principies of hybridization e the strategy of acid nucleic probe assays1', Elsevier, New York; and Tibanyenda, N. et al. Eur. J. Biochem. 139:19 (1984) and Ebel, S. et al. Biochem. 31:12083 (1992).

O termo "vetor" refere-se a um ácido nucleico capaz de transpor- 15 tar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado. Um tipo de vetor que pode ser usado de acordo com a invenção é um epissoma, isto é, um ácido nucleico capaz de replicação extra-cromossomal. Outros vetores incluem aqueles capazes de replicação autônoma e expressão de ácidos nucleicos ao qual eles são ligados. Os vetores capazes de direcionar a expressão de genes ao 20 qual eles são operativamente ligados são referidos aqui como "vetores de expressão". Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes são frequentemente na forma de "plasmídeos" que se referem a moléculas de DNA de trançado duplo circulares que, em sua for- ma de vetor não estão ligados ao cromossoma. No presente relatório, 25 "plasmídeo" e "vetor" são usados permutavelmente como o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Contudo, a invenção é pretendida para incluir tais outras formas de vetores de expressão que sen/em a fun- ções equivalentes e que tornam-se conhecidas na técnica subsequentemen- te aqui.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser usados como rea-

gentes diagnósticos para detectar a presença ou ausência das sequências- alvos de DNA ou RNA ao qual eles se ligam especificamente, tal como para determinar o nível de expressão de um ácido nucleico da invenção. Em um aspecto, a presente invenção contempla um método para detectar a presen- ça de um ácido nucleico da invenção ou uma porção deste em uma amostra, o método das etapas de: (a)proporcionar um oligonucleotídeo pelo menos 5 oito nucleotídeos de comprimento, o oligonucleotídeo sendo complementar a uma porção de um ácido nucleico da invenção; (b) contatar o oligonucleotí- deo com uma amostra contendo pelo menos um ácido nucleico sob condi- ções que permitem hibridização do oligonucleotídeo com um ácido nucleico da invenção ou uma porção deste; e (c) detectar hibridização do oiigonucleo- 10 tídeo a um ácido nucleico na amostra, detectando, desse modo, a presença de um ácido nucleico da invenção, ou uma porção deste na amostra. Em outro aspecto, a presente invenção contempla um método para detectar a presença de um ácido nucleico da invenção, ou uma porção deste em uma amostra, por (a) provisão de um par de oligonucleotídeos de trançado sim- 15 pies, cada um do qual é pelo menos oito nucleotídeos de comprimento, complementar às seqüências de um ácido nucleico da invenção, e no qual as seqüências as quais os oligonucleotídeos são complementares são pelo menos dez nucleotídeos à parte; e (b) contatar os oligonucleotídeos com uma amostra contendo pelo menos um ácido nucleico sob condições de hi- 20 bridização; (c) amplificar a seqüência de nucleotídeo entre os dois iniciado- res de oligonucleotídeo; e (d) detectar a presença da seqüência amplificada, detectando, desse modo, a presença de um ácido nucleico da invenção, ou uma porção deste na amostra.

Em outro aspecto da invenção, o polinucleotídeo da invenção é 25 provido em um vetor de expressão contendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção e operavelmente ligado a pelo menos uma seqüência regulatória. Deve ser compreendido que o desenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da cé- lula hospedeira a ser transformada e/ou o tipo de proteína desejado a ser 30 expresso. O número de cópia do vetor, a capacidade de controlar este nú- mero de cópia e a expressão de qualquer outra proteína codificada pelo ve- tor, tais como marcadores antibióticos devem ser considerados. Um vetor de expressão contendo o polinucleotídeo da invenção pode, em seguida, ser usado como um agente farmacêutico para tratar um animal infectado com B. hyodysenteriae ou como uma vacina (também um agente farmacêutico) para prevenir um animal de ser infectado com B.

hyodysenteriae, ou para reduzir os sintomas e curso da doença se o animal não se torna infectado. Uma maneira de usar um vetor de expressão como um agente farmacêutico é administrar uma vacina de ácido nucleico ao ani- mal em risco de ser infectado ou ao animal após ser infectado. A tecnologia de vacina de ácido nucleico é bem descrita na técnica. Algumas descrições 10 podem ser encontradas na Patente dos Estados Unidos 6.562.376 (Hooper et al.); Patente dos Estados Unidos 5.589.466 (Feigner, et al.); Patente dos Estados Unidos 6.673.776 (Feigner, et al); e Patente dos Estados Unidos 6.710.035 (Feigner, et al.). As vacinas de ácido nucleico podem ser injetadas no músculo ou intradermalmente, pode ser eletroporada no animal (ver, WO 15 01/23537, King et al.; e WO 01/68889, Malone et al.), via composições de lipídeo (ver Patente dos Estados Unidos 5.703.055, Feigner, et al.), ou ou- tros mecanismos conhecidos no campo técnico.

Vetores de expressão podem também serem transfectados na bactéria que pode ser administrada ao animal alvo para induzir uma respos- ta imune à proteína codificada pelos nucleotídeos desta invenção contidos no vetor de expressão. O vetor de expressão pode conter seqüências de expressão eucarióticas tal que os nucleotídeos desta invenção são transcri- tos e transladados no animal hospedeiro. Alternativamente, o vetor de ex- pressão pode ser transcrito na bactéria e, em seguida, transladado no ani- mal hospedeiro. A bactéria usada como um veículo do vetor de expressão deve ser atenuada, mas ainda invasiva. Pode-se usar Shigeila spp., Salmo- nella spp., Escherichia spp., e Aeromonas spp., justamente para denominar umas poucas que foram atenuadas, mas ainda invasivas. Exemplos destes métodos podem ser encontrados na Patente dos Estados Unidos 5.824.538 (Branstrom et al.); Patente dos Estados Unidos 5.877.159 (Powell, et al.); Patente dos Estados Unidos 6.150.170 (Powell, et al); Patente dos Estados Unidos 6.500.419 (Hone, et al.); e Patente dos Estados Unidos 6.682.729 (Powell, et al.).

Alternativamente, os polinucleotídeos desta invenção podem ser colocados em certos vírus que agem como um vetor. Os vetores virais po- dem ou expressar as proteínas desta invenção na superfície do vírus, ou 5 transportar polinucleotídeos desta invenção em uma célula de animal onde o polinucleotídeo é transcrito e transladado em uma proteína. O animal infec- tado com os vetores virais pode desenvolver uma resposta imune às proteí- nas codificadas pelos polinucleotídeos desta invenção. Desse modo, pode- se aliviar ou prevenir uma infecção por B. hyodysenteriae no animal que re- 10 cebeu os vetores virais. Exemplos de vetores virais podem ser encontrados na Patente dos Estados Unidos 5.283.191 (Morgan et al.); Patente dos Es- tados Unidos 5.554.525 (Sondermeijer et al.) e Patente dos Estados Unidos 5.712.118 (Murphy).

O polinucleotídeo da invenção pode ser usado para causar ex- pressão e sobre expressão de um polipeptídeo da invenção em células pro- pagandas na cultura, por exemplo, para produzir proteínas ou polipeptídeos, incluindo proteínas de fusão ou polipeptídeos.

Esta invenção pertence a uma célula hospedeira transfectada com um gene recombinante de modo a expressar um polipeptídeo da inven- ção. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucarióti- ca. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser expresso em células bacteriais, tais como E. coli, células de inseto (baculovírus), levedura, planta, ou células de mamífero. Naqueles exemplos quando a célula hospedeira é humana, ela pode ou não pode estar em um indivíduo vivo. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas àqueles técnicos no assunto. Adi- cionalmente, a célula hospedeira pode ser suplementada com moléculas de tRNA não tipicamente encontradas no hospedeiro de modo a otimizar ex- pressão do polipeptídeo. Alternativamente, a seqüência de nucleotídeo pode ser alterada para otimizar expressão na célula hospedeira, ainda a proteína produzida teria alta homologia à proteína originalmente codificada. Outros métodos adequados para maximização da expressão do polipeptídeo serão conhecidos àqueles técnicos no assunto. A presente invenção pertence adicionalmente a métodos de pro- dução dos polipeptídeos da invenção. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vetor de. expressão que codifica um polipeptídeo da invenção pode ser cultivada sob condições apropriadas para permitir que 5 expressão do polipeptídeo ocorra. O polipeptídeo pode ser secretado e iso- lado de uma mistura de células e meio contendo o polipeptídeo. Alternativa- mente, o polipeptídeo pode ser retido citoplasmicamente e as células coleta- das, Iisadas e a proteína isolada.

Uma cultura de célula inclui células hospedeiras, meio e outros 10 subprodutos. Meio adequado para cultura de célula são bem conhecidos na técnica. O polipeptídeo pode ser isolado do meio de cultura de célula, célu- las hospedeiras, ou ambos usando técnicas conhecidas na técnica para puri- ficação de proteínas, incluindo cromatografia de troca de íon, cromatografia de filtração de gel, ultrafiltração, eletroforese, e purificação com imunoafini- 15 dade com anticorpos específicos para epítopes particulares de um polipeptí- deo da invenção.

Desse modo, uma seqüência de nucleotídeo que codifica toda ou uma porção selecionada de polipeptídeo da invenção, pode ser usada para produzir uma forma recombinante da proteína via processos celulares 20 microbiais ou eucarióticos. A ligação da seqüência em um construto de poli- nucleotídeo, tal como um vetor de expressão, e transformação ou transfec- ção em hospedeiros, ou eucarióticos (levedura, aves, inseto ou mamífero) ou procarióticos (células bacteriais), são procedimentos padrão. Procedi- mentos similares, ou modificações destes, podem ser empregados para pre- 25 parar polipeptídeos recombinantes da invenção por meios microbiais ou tec- nologia de cultura de tecido.

Vetores adequados para a expressão de um polipeptídeo da in- venção incluem plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pTrcHis, plasmídeos derivados de pET, plasmídeos derivados de pBR322, plasmí- 30 deos derivados de pEMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos deri- vados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para expressão nas células procarióticas, tais como E coli. Os vários métodos empregados na prepara- ção dos plasmídeos e transformação de organismos hospedeiros são bem conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados para ambas as células procarióticas e eucarióticas, bem como procedimentos re- combinantes gerais, ver Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., 5 ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Capítulos 16 e 17.

As seqüências de codificação para um polipeptídeo de interesse podem ser incorporadas como uma parte de um gene de fusão incluindo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo diferente. A 10 presente invenção contempla um polinucleotídeo isolado contendo um ácido nucleico da invenção e pelo menos uma seqüência heteróloga que codifica um peptídeo heterólogo ligado na estrutura à seqüência de nucleotídeo do ácido nucleico da invenção de modo a codificar uma proteína de fusão con- tendo o polipeptídeo heterólogo. O polipeptídeo heterólogo pode ser fundido 15 a (a) o C-terminal do polipeptídeo da invenção, (b) o N-terminal do polipeptí- deo da invenção, ou (c) o C-terminal e o N-terminal do polipeptídeo da in- venção.

Em certos exemplos, a seqüência heteróloga que codifica um polipeptídeo permitindo a detecção, isolamento, solubilização e/ou estabili- 20 zação do polipeptídeo ao qual é fundido. Em ainda outras concretizações, a seqüência heteróloga que codifica um polipeptídeo tal como um poli-His eti- queta, myc, HA, GST, proteína A, proteína G, peptídeo de ligação de calmo- dulina, tioredoxina, proteína de ligação de maltose, poli arginina, poli-His- Asp, FLAG, uma porção de uma proteína de imunoglobulina, e um peptídeo 25 de transcitose.

Sistemas de expressão de fusão podem ser úteis quando é de- sejável produzir um fragmento imunogênico de um polipeptídeo da invenção. Por exemplo, a proteína VP6 capsid de rotavírus pode ser usada como uma proteína veículoa imunológica para porções de polipeptídeo, ou na forma 30 monomérica ou na forma de uma partícula viral. A seqüência de ácidos nu- cleicos correspondente à porção de um polipeptídeo da invenção ao qual anticorpos são para ser elevados pode ser incorporada em um construto de gene de fusão que inclui seqüências de codificação para uma proteína estru- tural de vacina posterior para produzir um conjunto de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão compreendendo uma porção da proteína como parte do vírion. O antígeno de superfície de Hepatite B pode também 5 ser utilizado neste papel também. Similarmente, construtos quiméricos que codificam proteínas de fusão contendo uma porção de um polipeptídeo da invenção e a proteína de poliovírus capsídeo pode ser criada para aumentar imunogenicidade (ver, por exemplo, Publicação EP NO: 0259149; e Evans et al. (1989) Nature 339:385; Huang Et al. (1988) /. Virol. 62:3855; e Schlienger 10 et al. (1992) /. Virol. 66:2).

As proteínas de fusão podem facilitar a expressão e/ou purifica- ção das proteínas. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser ge- rado como uma proteína de fusão glutationa-S-transferase (GST). Tal prote- ína de fusão GST pode ser usada para simplificar a purificação de um poli- peptídeo da invenção, tal como através do uso de matrizes derivatizadas de glutationa (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). Em outra concretização, um gene de fusão que codifica uma seqüência condutora de purificação, tal co- mo uma seqüência de local de clivagem poli-(His)/enteroquinase no N- terminal da porção desejada da proteína recombinante, pode permitir purifi- cação da proteína de fusão expressa por cromatografia de afinidade usando uma resina de metal de Ni2+. A seqüência condutora de purificação pode então ser subsequentemente removida por tratamento com enteroquinase para proporcionar a proteína purificada (por exemplo, ver Hochuli et al., (1987). Chromatography 411: 177; e Janknecht Qt al, PNAS USA 88:8972).

Técnicas para produção de genes de fusão são bem conheci- das. Essencialmente, a união de vários fragmentos de DNA que codificam seqüências diferentes de polipeptídeo é realizada de acordo com técnicas convencionais, empregando terminais de extremidade cega ou de extremi- 30 dade escalonada para ligação, digestão de enzima de restrição para propor- cionar terminais apropriados, enchimento de extremidades coesivas confor- me apropriado, tratamento de fosfatase alcalina para evitar união indesejá- vel, e ligação enzimática. Em outra concretização, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA. Al- ternativamente, amplificação de PCR de fragmentos de gene pode ser efe- tuada usando-se iniciadores de âncora que dão ocorrência a balanços com- 5 plementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem subse- quentemente ser fortalecidos para gerar uma seqüência de gene quimérica (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

Em outras concretizações, a invenção proporciona ácidos nucle- 10 icos da invenção imobilizados em uma superfície sólida, incluindo, placas, placas de microtitulação, lâminas, contas, partículas, esferas, filmes, trança- dos, precipitados, géis, folhas, tubos, recipientes, capilares, almofadas, fa- cas, etc. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser imobilizados em um chip como parte de uma série. A série pode conter um ou mais polinucleotí- 15 deos da invenção conforme descrito aqui. Em uma concretização, o chip contém um ou mais polinucleotídeos da invenção como parte de uma série de seqüências de polinucleotídeo a partir da mesma espécie patogênica como tal(is) polinucleotídeo(s).

Em uma forma preferida da invenção é provido polipeptídeos isolados de B. hyodysenteriae conforme aqui descrito, e também as seqüên- cias de polinucleotídeo que codificam estes polipeptídeos. Mais desejavel- mente os polipeptídeos de B. hyodysenteriae são providos na forma subs- tancialmente purificada.

Os polipeptídeos preferidos da invenção terão uma ou mais pro- 25 priedades biológicas (por exemplo, propriedades imunológicas in vivo ou in vitró) do polipeptídeo de comprimento total nativo. Os polipeptídeos não- funcionais estão também incluídos dentro do escopo da invenção porque eles podem ser úteis, por exemplo, como antagonistas dos polipeptídeos funcionais. As propriedades biológicas de análogos, fragmentos, ou deriva- 30 dos relativos a tipo selvagem podem ser determinadas, por exemplo, por meio de ensaios biológicos.

Polipeptídeos, incluindo análogos, fragmentos e derivados, po- dem ser preparados sinteticamente /por exemplo, usando-se as técnicas bem conhecidas de síntese de peptídeo de fase sólida ou de fase de solu- ção). Preferivelmente, as técnicas sintéticas de fase sólida são empregadas. Alternativamente, os polipeptídeos da invenção podem ser preparados u- 5 sando-se técnicas de engenharia genética bem conhecidas, conforme des- crito infra. Em ainda outra concretização, os polipeptídeos podem ser purifi- cados (por exemplo, por purificação de imunoafinidade) de um fluido biológi- co, tal como mas não limitado a plasma, fezes, soro, ou urina de animais, incluindo, mas não limitado a, porco, galinha, ganso, pato, peru, periquito, 10 ser humano, macaco, cão, gato, cavalo, hamster, gerbo, coelho, furão, cava-

lo, gado, e ovelha. Um animal pode ser qualquer mamífero ou pássaro.

Os análogos de polipeptídeo de B. hyodysenteriae incluem a- queles polipeptídeos tendo a seqüência de aminoácido, no qual um ou mais dos aminoácidos são substituídos com outro aminoácido cujas substituições não alteram substancialmente a atividade biológica da molécula.

De acordo com a invenção, os polipeptídeos da invenção produ- zidos recombinantemente ou por síntese química e fragmentos ou outros derivados ou análogos destes, incluindo proteínas de fusão, podem ser usa- dos como um imunogen para gerar anticorpos que reconhecem os polipeptí- deos.

Uma molécula é "antigênica" quando é capaz de se interar es- pecificamente com uma molécula de reconhecimento de antígeno do siste- ma imune, tal como uma imunoglobulina (anticorpo) ou receptor de antígeno de célula T. Uma seqüência de aminoácido antigênica contém pelo menos 25 cerca de 5, e preferivelmente pelo menos cerca de 10, aminoácidos. Uma porção antigenoica de uma molécula pode ser a porção que é imunodomi- nante para anticorpo ou reconhecimento de receptor de célula T, ou pode ser uma porção usada para gerar um anticorpo para a molécula por conju- gação da porção antigênica para uma molécula veículoa para imunização. 30 Uma molécula que é antigenoica não necessita ser imunogênica, isto é, ca- paz de induzir uma resposta imune sem um veículo.

Um "anticorpo" é qualquer imunoglobulina, incluindo anticorpos e fragmentos desta, que se liga a um epítopo específico. O termo envolve an- ticorpos policlonais, monoclonais, e quiméricos, o último mencionado descri- to em detalhe adicional nas Patentes dos Estados Unidos N— 4.816.397 e 4.816.567, bem como porções de ligação de antígeno de anticorpos, incluin- 5 do Fab, F(ab')2 e F(v) (incluindo anticorpos de cadeia simples). Consequen- temente, a frase "molécula de anticorpo" em suas várias formas gramaticais conforme usadas aqui contemplam ambas uma molécula de imunoglobulina intacta e uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imuno- globulina contendo o local de combinação de anticorpo. Um "local de combi- 10 nação de anticorpo" é aquela porção estrutural de uma molécula de anticor- po compreendida de regiões variáveis de cadeia pesada e leve e hipervariá- veis que se ligam especificamente a um antígeno.

Moléculas de anticorpo exemplares são moléculas de imunoglo- bulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e 15 aquelas porções de uma molécula de imunoglobulina que contém o parato- pe, incluindo aquelas porções conhecidas na técnica como Fab, Fab', F(ab')2 e F(v), cujas porções são preferidas para uso nos métodos terapêuti- cos aqui descritos.

As porções Fab e F(ab')2 de moléculas de anticorpo são prepa- 20 radas por reação proteolítica de papaína e pepsina, respectivamente, nas moléculas de anticorpos substancialmente intactas por métodos que são bem conhecidos. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N2 4.342.566 para Theofilopolous et al. As porções de molécula de anticorpo Fab1 são também bem conhecidas e são produzidas de porções F(ab')2, se- 25 guidas por redução com mercaptoetanol das ligações de disulfeto que ligam as duas porções de cadeia pesada, e seguido por alquilatação da proteína mercaptan resultante com um reagente tal como iodoacetamida. Um anti- corpo contendo moléculas de anticorpo intactas é preferido aqui.

A frase "anticorpo monoclonar1 em suas várias formas gramati- cais refere-se a um anticorpo tendo somente uma espécie de local de com- binação de anticorpo capaz de imunoreagir com um antígeno particular. Um anticorpo monoclonal desse modo tipicamente revela uma afinidade de liga- ção simples para qualquer antígeno com o qual ele imunoreage. Um anticor- po monoclonal pode, portanto, conter uma molécula de anticorpo tendo uma pluralidade de locais de combinação de anticorpo, cada um imunoespecífico para um antígeno diferente; por exemplo, um anticorpo monoclonal (quiméri- co) específico.

O termo "adjuvante" refere-se a um composto ou mistura que intensifica a resposta imune a um antígeno. Um adjuvante pode servir como um depósito de tecido que libera vagarosamente o antígeno e também como um ativador do sistema linfóide que intensifica não-especificamente a res- posta imune [Hood et al., in Immunology, p. 384, Second Ed., Benja- min/Cummings, Menlo Park, Califórnia (1984)]. Frequentemente, um desafio primário com um antígeno sozinho, na ausência de um adjuvante, falhará em induzir uma resposta imune humoral ou celular. Os adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, adjuvante de Freund completo, adjuvante de Freund incompleto, saponin, géis minerais tal como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície tais como lisolecitina, polióis plurônicos, po- liânions, peptídeos, óleo ou emulsões de hidrocarboneto, hemocianins de lapa de buraco de fechadura, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencial- mente úteis tais como BCG (bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Preferivelmente, o adjuvante é farmaceuticamente aceitável.

Vários procedimentos conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de anticorpos policlonais para os polipeptídeos da inven- ção. Para a produção de anticorpo, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com o polipeptídeo da invenção, incluindo, mas não 25 limitados a, coelhos, camundongos, ratos, ovelha, cabras, etc. Em uma con- cretização, um polipeptídeo da invenção pode ser conjugado a um veículo imunogênico, por exemplo, albumina de soro bovino (BSA) ou hemocianin de lapa de buraco de fechadura (KLH). Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie de hospe- 30 deiro, incluindo, mas não limitados a, Freund (completo e incompleto), géis minerais tal como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianins de LP de buraco de fechadura, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG {bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Para preparação de anticorpos monoclonais direcionados a um polipeptídeo da invenção, qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas de célula contínuas na cultura pode ser usada. Estas incluem, mas não estão limitadas a, técnica de hibridoma origi- nalmente desenvolvida por Kohler et al., (1975) Nature, 256:495-497, a téc- nica do trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana [Kozbor et al., (1983) Immunology Today, 4:72], e a técnica de EBV-hibridoma para produ- zir anticorpos monoclonais humanos [Cole et al., (1985) em Anticorpos mo- noclonais and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc.]. Linhas de célu- la de produção de anticorpo, imortais, podem ser criadas por técnicas outras do que fusão, tal como transformação direta de linfócitos B com DNA onco- gênico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nss 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; e 4.493.890.

Em uma concretização adicional da invenção, anticorpos mono- clonais podem ser produzidos em animais livres de germe utilizando tecno- Iogia recente. De acordo com a invenção, anticorpos de galinha e suínos podem ser usados e podem ser obtidos pelo uso de hibridomas de galinha ou de suíno ou por transformação de células B com vírus EBV in vitro. De fato, de acordo com a invenção, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" [Morrison et al., (1984). BacterioL, 159-870; Neuber- ger et al., (1984) Nature, 312:604-608; Takeda et al., (1985) Nature, 314:452-454] por união dos genes de uma molécula de anticorpo de camun- dongo específica para um polipeptídeo da invenção junto com genes de uma molécula de anticorpo de atividade biológica apropriada, podem ser usadas; tais anticorpos estão dentro do escopo desta invenção. Tais anticorpos qui- méricos são preferidos para uso na terapia de doenças ou distúrbios intesti- nais (descrito infra), visto que os anticorpos são muito menos provavelmente do que anticorpos xenogênicos para induzir uma resposta imune, em parti- cular uma resposta alérgica.

De acordo com a invenção, as técnicas descritas para a produ- ção de anticorpos de cadeia simples (Patente dos Estados Unidos 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples 5 específicos para um polipeptídeo da invenção. Uma concretização adicional da invenção utilize as técnicas descritas para a construção de bibliotecas de expressão Fab [Huse et al., (1989) Science, 246:1275-1281] para permitir identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especifici- dade desejada para um polipeptídeo da invenção.

Os fragmentos de anticorpo que contêm o idiotipo da molécula

de anticorpo podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não estão limitados a: o fragmento F(ab')2 que po- de ser produzido por digestão de pepsina da molécula de anticorpo; os frag- mentos Fab1 que podem ser gerados por redução das pontes de disulfeto do 15 fragmento F(ab')2, e os fragmentos Fab que podem ser gerados por trata- mento da molécula de anticorpo com papaína e um agente de redução.

Na produção de anticorpos, a classificação para o anticorpo de- sejado pode ser efetuada por técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, rádio-imunoenaio, ELISA, imunoensaios "intercalados", ensaios imunorra- 20 diométricos, reações de precipitina de difusão de gel, ensaios de imunodifu- são, inunoensaios in situ (usando etiquetas de ouro coloidal, enzima ou ra- dioisótopo, por exemplo), Western blots, reações de precipitação, ensaios de aglutinação (por exemplo, ensaios de aglutinação, ensaios de hemaglutina- ção), ensaios de fixação de complemento, ensaios de imunofluorescência, 25 ensaios de proteína A, ensaios de imunoeletroforese, etc. Em uma concreti- zação, a íigação de anticorpo é detectada por detecção de uma etiqueta no anticorpo primário. Em outra concretização, o anticorpo primário é detectado por detecção de ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticor- po primário. Em uma concretização adicional, o anticorpo secundário é eti- 30 quetado. Muitos meios são conhecidos na técnica para detecção de ligação em um imunoensaio e estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, para selecionar anticorpos que reconhecem um epítope específico de um polipeptídeo da invenção, Pode-se ensaiar hibridomas gerados para um produto que se liga a um fragmento de um polipeptídeo da invenção con- tendo tal epítopo.

A invenção também cobre métodos de diagnóstico e de prognós- tico para detectar a presença de B. kyodysenteriae usando um polipeptídeo da invenção e/ou anticorpos que se ligam ao polipeptídeo da invenção e kits úteis para diagnose e prognose de infecções de B. kyodysenteriae.

Métodos de diagnósticos e prognósticos serão geralmente con- duzidos usando-se uma amostra biológica obtida de um animal, tal como 10 galinha ou suíno. Uma "amostra" refere-se a um tecido de animal Ou fluido suspeito de conter uma espécie de Brachyspira, tal como B. kyodysenteriae, ou seus polinucleotídeos ou seus polipeptídeos. Exemplos de tais tecidos ou fluidos incluem, mas não estão limitados a, plasma, soro, material fecal, uri- na, pulmão, coração, músculo do esqueleto, estômago, intestinos, e consti- 15 tuintes de cultura de célula in vitro.

A invenção proporciona métodos para detecção da presença de um polipeptídeo da invenção em uma amostra, com as seguintes etapas: (a) contato de uma amostra suspeita de conter um polipeptídeo da invenção com um anticorpo (preferivelmente ligado a um suporte sólido) que se liga 20 especificamente ao polipeptídeo da invenção sob condições que permitem a formação de complexos de reação compreendendo o anticorpo e o polipep- tídeo da invenção; e (b) detecção da formação de complexos de reação compreendendo o anticorpo e polipeptídeo da invenção na amostra, no qual a detecção da formação de complexos de reação indica a presença do poli- 25 peptídeo da invenção na amostra.

Preferivelmente, o anticorpo usado neste método é derivado de um anticorpo monoclonal de afinidade purificada, e, mais preferivelmente um anticorpo monoclonal. Em adição, é preferível para as moléculas de anticor- po aqui usadas estarem na forma de porções Fab, Fab1, F(ab')2 ou F(v), ou todas moléculas de anticorpo.

Métodos particularmente preferidos para detecção de B. kyody- senteriae baseados no método acima incluem ensaios inunosorventes liga- dos a enzima, radioimunoensaios, ensaios imunoradiométricos e ensaios imunoenzimáticos, incluindo ensaios intercalados usando-se anticorpos mo- noclonais e/ou policlonais.

Três tais procedimentos que são especialmente úteis utilizam 5 qualquer polipeptídeo da invenção (ou um fragmento deste) etiquetado com uma etiqueta detectável, anticorpo Abi etiquetado com uma etiqueta detec- tável, ou anticorpo Ab2 etiquetado com uma etiqueta detectável. Os proce- dimentos podem ser resumidos pelas seguintes equações no qual o asteris- co indica que a partícula é etiquetada e "AA" suporta o polipeptídeo da in- 10 venção:

A. AA* + Abi = AA*Abi

B. AA + Ab*i=AAAbi*

C. AA + Abi + Ab2* = Abi AA Ab2*

Os procedimentos e sua aplicação são todos familiares ao técni- co no técnica e, consequentemente, podem ser utilizados dentro do escopo da presente invenção. O procedimento "competitivo", Procedimento A, é descrito nas Patentes dos Estados Unidos N— 3.654.090 e 3.850.752.

O procedimento B é representativa de técnicas de ensaio com- petitivo bem conhecidas. O procedimento C, o procedimento "intercalado", é 20 descrito nas Patentes dos Estados Unidos N— RE 31.006 e 4.016.043. Ainda outros procedimentos são conhecidos, tal como o "anticorpo duplo" ou pro- cedimento "DASP", e podem ser usados. Em cada exemplo, o polipeptídeo da invenção forma complexos com um ou mais anticorpo(s) ou co- participantes de ligação e um membro do complexo é etiquetado com uma 25 etiqueta detectável. O fato que um complexo tenha se formado e, se deseja- do, a quantidade deste, pode ser determinada por métodos conhecidos apli- cáveis à detecção de etiquetas.

Será visto a partir do acima que uma propriedade característica de Ab2 é que ele reagirá com Abi. Esta reação é porque Abi, ocorrido em uma espécie de mamífero, foi usado em outra espécie como um antígeno para elevar o anticorpo, Ab2. Por exemplo, Ab2 pode ser elevado em cabras usando anticorpos de coelho como antígenos. Ab2, portanto, seria anticorpo anticoelho ocorrido em cabras. Para proposta desta descrição e reivindica- ções, Abi será referido como um anticorpo primário, e Ab2 será referido co- mo anticorpo secundário ou anti-Abi.

As etiquetas mais comumente empregadas para estes estudos são elementos radioativos, enzimas, químicos que fluorescem quando ex- postos a Iuz ultravioleta, e outros. Exemplos de materiais fluorescentes ca- pazes de serem utilizados como etiquetas incluem fluoresceína, rodamina e auramina. Um material de detecção particular é anticorpo anticoelho prepa- rado em cabras e conjugados com fluoresceína através de um isotiocianato. Exemplos de isótopo preferidos incluem 3H, 14C, 32P, 35S, 36CIl51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I1131I, e 186Re. A etiqueta radioativa pode ser detectada por qualquer dos procedimentos de contagem atualmente disponíveis. Enquanto muitas enzimas podem ser usadas, exemplos de enzimas preferidas são peroxidase, B-glucuronidase, B-D-glucosidase, B-D-galactosidase, urease, glicose oxidase mais peroxidase e fosfatase alcalina. As enzimas são conju- gadas à particular selecionada por reação com moléculas em ponte tais co- mo carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldeído, e similares. Etiquetas de en- zima podem ser detectadas por qualquer das técnicas atualmente utilizadas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperomé- tricas ou gasométricas. As Patentes dos Estados Unidos N— 3.654.090; 3.850.752; e 4.016.043 são referidas por meio de exemplo para sua descri- ção de métodos e material de etiquetação alternados.

A invenção também proporciona um método de detector anticor- pos a um polipeptídeo da invenção em mostras biológicas, usando as se- 25 guintes etapas: (a) provisão de um polipeptídeo da invenção ou um fragmen- to deste; (b) incubação de uma amostra biológica com referido polipeptídeo da invenção sob condições que permitem a formação de um complexo de anticorpo-antígeno; e (c) determinação se um complexo de anticorpo- antígeno com o polipeptídeo da invenção é formado.

Em outra concretização da invenção, são providos métodos in

vitro para avaliar o nível de anticorpos a um polipeptídeo da invenção em uma amostra biológica usando as seguintes etapas: (a) detecção da forma- ção de complexos de reação em uma amostra biológica de acordo com o método notado acima; e (b) avaliação da quantidade de complexos de rea- ção formados, cuja quantidade de complexos de reação corresponde ao ní- vel de polipeptídeo da invenção na amostra biológica.

São providos adicionalmente métodos in vitro para monitoramen-

to de tratamento terapêutico de uma doença associada com B. hyodysente- riae em um hospedeiro animal por avaliação, conforme descrito acima, dos níveis de anticorpos a um polipeptídeo da invenção em uma série de amos- tras biológicas obtidas em pontos de tempo diferentes de um hospedeiro animal que suporta tal tratamento terapêutico.

A presente invenção proporciona adicionalmente métodos para detectar a presença ou ausência de B. hyodysenteriae em uma amostra bio- lógica por: (a) trazer a amostra biológica em contato com uma sonda de po- linucleotídeo ou iniciador de polinucleotídeo da invenção sob condições de 15 hibridização estáveis; e (b) detecção de qualquer dúplex formado entre a sonda ou iniciador e ácido nucleico na amostra.

De acordo com uma concretização da invenção, a detecção de

B. hyodysenteriae pode ser efetuada por amplificação diretamente de se- qüências de polinucleotídeo de amostra biológica, usando-se técnicas co- nhecidas e em seguida detectando a presença de polinucleotídeo das se- qüências da invenção.

Em uma forma da invenção, a seqüência de ácido nucleico alvo é amplificada por PCR e então detectada usando-se qualquer dos métodos específicos acima mencionados. Outras técnicas de diagnóstico úteis para 25 detecção da presença de seqüências de polinucleotídeo incluem, mas não estão limitadas a: 1) PCR específica-alelo; 2) análise de conformação de trançado duplo; 3) eletroforese de gel de gradiente de desnaturação; 4) en- saios de proteção de RNase 5) o uso de proteínas que reconhecem dese- quiparações de nucleotídeo, tal como a proteína E. coii mutS; 6) oligonucleo- 30 tídeos específicos de alelo; e 7) hibridização fluorescente in situ.

Em adição aos métodos acima, seqüências de polinucleotídeo podem ser detectadas usando-se tecnologia de sonda convencional. Quan- do sondas são usadas para detectar a presença das seqüências de polinu- cleotídeo desejadas, a amostra biológica a ser analisada, tal como sangue ou soro, pode ser tratada, se desejado, para extrair os ácidos nucleicos. As seqüências de polinucleotídeo de amostra podem ser preparadas em vários 5 modos para facilitar detecção da sequência-alvo; por exemplo, desnatura- ção, digestão de restrição, eletroforese ou manchamento de ponto. A região alvejada da seqüência de polinucleotídeo de amostra usualmente deve ser pelo menos parcialmente de trançado simples para formar híbridos com a sequência-alvo da sonda. Se a seqüência é naturalmente trançada simples, 10 desnaturação não será requerida. Contudo, se a seqüência é de trançado duplo, a seqüência necessitará provavelmente de ser desnaturada. A desna- turação pode ser efetuada por várias técnicas conhecidas.

As seqüências de polinucleotídeo de amostra e sondas são in- cubadas sob condições que promovem formação híbrida estável da sequên- cia-alvo na sonda com a seqüência de polinucleotídeo putativa desejada na amostra. Preferivelmente, condições de alta estringência são usadas de mo- do a prevenir positivos falsos.

A detecção, se houver, do híbrido resultante é usualmente efe- tuada pelo uso de sondas etiquetadas. Alternativamente, a sonda pode ser não-etiquetada, mas pode ser detectável por ligação específica com um Ii- gante que é etiquetado, ou diretamente ou indiretamente. Etiquetas adequa- das e métodos para etiquetação de sondas e Iigantes são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, etiquetas ratioativas que podem ser incor- poradas por métodos conhecidos (por exemplo, translação de corte, escor- vação aleatória ou quinação), biotina, grupos fluorescentes, grupos quimilu- minescentes (por exemplo, dioxetanos, dioxetanos particularmente dispara- dos), enzimas, anticorpos, e similares. Variações deste esquema básico são conhecidas na técnica, e incluem aquelas variações que facilitam separação dos híbridos a serem detectados de materiais estranhos e/ou que amplificam o sinal a partir da porção etiquetada.

É também contemplado dentro do escopo desta invenção que os ensaios de sonda de ácido nucleico desta invenção podem empregar um coquetel de sondas de ácido nucleico capazes de detectar as seqüências de polinucleotídeo desejadas desta invenção. Desse modo, em um exemplo para detectar a presença de seqüências de polinucleotídeo desta invenção em uma amostra de célula, mais do que uma sonda complementar a uma 5 seqüência de polinucleotídeo é empregada e, em particular, o número de sondas diferentes é alternativamente 2, 3, ou 5 seqüências de sonda de áci- do nucleico diferentes.

As seqüências de polinucleotídeo aqui descritas (preferivelmente na forma de sondas) podem também serem imobilicadas para um suporte de fase sólida para a detecção de espécies de Brachyspira, incluindo, mas não limitadas a, B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. aivinipuili, B. aalborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. pilosicoii. Alternativamente as seqüências de polinucleotídeo aqui descritas formarão parte de uma biblioteca de molécu- las de DNA que pode ser usada para detectar simultaneamente um número de genes diferentes de espécie Brachyspira, tal como B. hyodysenteriae. Em uma forma alternada adicional da invenção, seqüências de polinucleotídeo aqui descritas junto com outras seqüências de polinucleotídeo (tais como de outra bactéria ou vírus) podem ser imobilizadas em um suporte sólido de tal maneira a permitir identificação da presença de espécie Brachyspira, tal co- mo B. hyodysenteriae e/ou qualquer das outras seqüências de polinucleotí- deo ligadas no suporte sólido.

Técnicas para produção de bibliotecas imobilizadas de molécu- las de DNA foram descritas na técnica. Geralmente, muitos métodos da téc- nica anterior descrevem a síntese de bibliotecas de molécula de ácido nucle- 25 ico de trançado único, usando-se, por exemplo, técnicas de mascaramento para produzir várias permutações de seqüências nas várias posições discre- tas no substrato sólido. A Patente dos Estados Unidos N2 5.837.832 descre- ve um método aperfeiçoado para produção de séries de DNA imobilizadas para substratos de silicone baseados em tecnologia de intregração de esca- 30 Ia muito grande. Em particular, a Patente dos Estados Unidos Ne 5.837.832 descreve uma estratégia denominada "ladrilhos" para sintetizar conjuntos específicos de sondas em localizações espacialmente definidas em um substrato que pode ser usado para produzir as bibliotecas de DNA imobili- zadas da presente invenção. A Patente dos Estados Unidos No 5.837.832 também proporciona referências para técnicas anteriores que podem ser usadas. Desse modo, as sondas de seqüência de polinucleotídeo podem ser sintetizadas in situ na superfície do substrato.

Alternativamente, moléculas de trançado único podem ser sinte- tizadas para a do substrato sólido e cada seqüência preformada aplicada a uma posição discreta no substrato sólido. Por exemplo, seqüências de poli- nucleotídeo podem ser impressas diretamente no substrato usando-se dis- positivos robóticos equipados com ou pinos ou dispositivos piezelétricos.

As seqüências de biblioteca são tipicamente imobilizadas em ou em regiões discretas de um substrato sólido. O substrato pode ser poroso para permitir imobilização dentro do substrato ou substancialmente não- poroso, em cujo caso as seqüências de biblioteca são tipicamente imobiliza- 15 das na superfície do substrato. O substrato sólido pode ser produzido de qualquer material ao qual os polipeptídeos podem se ligar, ou diretamente ou indiretamente. Exemplos de substratos sólidos adequados incluem vidro plano, pastilhas de silício, mica, cerâmicas e polímeros orgânicos tais como plásticos, incluindo poliestireno e polimetacrilato. Pode também ser possível 20 usar membranas semipermeáveis tais como membranas de nitrocelulose ou de náilon, que são amplamente disponíveis. As membranas semipermeáveis podem ser montadas em uma superfície sólida mais robusta tal como vidro. As superfícies podem opcionalmente serem revestidas com uma camada de metal, tal como ouro, platina ou outro metal de transição.

Preferivelmente, o substrato sólido é geralmente um material

tendo uma superfície rígida ou semirrígida. Em concretizações preferidas, pelo menos uma superfície do substrato será substancialmente plana, embo- ra em algumas concretizações possa ser desejável separar fisicamente regi- ões de síntese de polímeros diferentes com, por exemplo, regiões elevadas 30 ou fossos gravurados. É também preferido que o substrato sólido seja ade- quado para a aplicação de alta densidade de seqüências de DNA em áreas discretas de tipicamente de 50 a 100 μιη, dando uma densidade de 10000 a 40000 pontos/cm2.

O substrato sólido é convenientemente dividido em seções. Isto pode ser alcançado por técnicas tais como fotogravura, ou pela aplicação de tintas hidrofóbicas, por exemplo, tintas baseadas em teflon (Cel-line, USA).

Posições discretas, em que cada membro diferente da biblioteca

está localizado podem ter qualquer forma conveniente, por exemplo, circular, retangular, elíptica, em forma de cunha, etc.

A fixação das seqüências de polinucleotídeo ao substrato pode ser por meio covalente ou não-covalente. As seqüências de polinucleotídeo 10 podem ser fixadas ao substrato via uma camada de moléculas a qual as se- qüências de biblioteca se ligam. Por exemplo, as seqüências de polinucleo- tídeo podem ser etiquetadas com biotin e o substrato revestido com avidina e/ou estreptavidina. Uma característica conveniente de uso de seqüências de polinucleotídeo biotinilatadas é que a eficiência de acoplamento ao subs- 15 trato sólido pode ser determinada facilmente. Desde que as seqüências de polinucleotídeo possam se ligar somente e pobremente a alguns substratos sólidos, é frequentemente necessário proporcionar uma interface química entre o substrato sólido (tal como no caso de vidro) e as seqüências de áci- do nucleico. Exemplos de interfaces químicas adequadas incluem hexaetile- 20 no glicol. Outro exemplo é o uso de vidro revestido com polilisina, a polilisina então sendo quimicamente modificada usando-se procedimentos padrão para introduzir um Iigante de afinidade. Outros métodos para fixação de mo- léculas às superfícies de substrato sólido pelo uso de agentes de acopla- mento são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, W098/49557.

A ligação de seqüências de polinucleotídeo complementares à

biblioteca de ácido nucleico imobilizada pode ser determinada por uma vari- edade de meios tais como mudanças nas características óticas da seqüên- cia de polinucleotídeo ligada (isto é, pelo uso de brometo de etídio), ou pelo uso de ácidos nucleicos etiquetados, tais como polipeptídeos etiquetados 30 com fluoróforos. Outras técnicas de detecção que não requerem o uso de etiquetas incluem técnicas óticas tais como opto acústicas, refIectometria, elipsometria e ressonância de plasmon de superfície (ver, W097/49989). Desse modo, a presente invenção proporciona um substrato só- lido tendo imobilizado no mesmo pelo menos um polinucleotídeo da presen- te invenção, preferivelmente duas ou mais seqüências de polinucleotídeo diferentes da presente invenção.

A presente invenção também pode ser usada como um profiláti-

co ou terapêutico, que podem ser utilizados para a proposta de estimular respostas humorais e mediadas por célula em animais, tais como galinhas e suínos, proporcionando, desse modo, proteção contra colonização com es- pécies Brachyspira, incluindo, mas não limitadas a, B. hyodysenteriae, B. 10 suanatina, B. intermedia, B. aivinipulii, B. aaiborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. pilosicoli. A infecção natural com uma espécie Brachyspira, tal como B. hyodysenteriae, induz circulação de titulações de anticorpo contra as proteí- nas aqui descritas. Portanto, as seqüências de aminoácido aqui descritas ou partes destas, têm o potencial de formar a base de um profilático ou terapêu- 15 tico sistemicamente ou oralmente administrado para proporcionar proteção contra espirocaetose intestinal.

Consequentemente, em uma concretização a presente invenção proporciona as seqüências de aminoácido aqui descritas ou fragmentos des- tas ou anticorpos que se ligam às seqüências de aminoácido ou às sequên- 20 cias de polinucleotídeo aqui descritas em uma quantidade terapeuticamente eficaz misturada com um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente, ou excipiente.

A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" é usada aqui para significar uma quantidade suficiente para reduzir por pelo menos cerca de 25 15%, preferivelmente por pelo menos 50%, mais preferivelmente por pelo menos 90%, e mais preferivelmente prevenir um déficit clinicamente signifi- cante na atividade, função e resposta do hospedeiro animal. Alternativamen- te, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para causar um a- perfeiçoamento em uma condição clinicamente significante no hospedeiro 30 animal. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades molecu- lares e composições que são fisiologicamente toleráveis e não produzem tipicamente uma reação alérgica ou similarmente adversa, tal como distúrbio gástrico e similar, quando administradas a um animal. 0 termo "veículo" re- fere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual o com- posto é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos esté- reis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, animal, de ori- 5 gem vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mi- neral, óleo de gergelim, e similares. Água ou soluções salinas e dextrose aquosa e soluções de glicerol são preferivelmente empregados como veícu- los, particularmente para soluções injetáveis. Veículos farmacêuticos ade- quados são descritos em Martin, Remington1S Pharmaceuticai Sciences, 10 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, (1990).

Em uma forma mais específica da invenção, são providas com- posições farmacêuticas compreendendo quantidades terapeuticamente efi- cazs das seqüências de aminoácido aqui descritas, ou um análogo destas, fragmento ou produto derivado deste, ou anticorpos juntos com diluentes farmaceuticamente aceitáveis, conservantes, solubilizadores, emulsificado- res, adjuvantes e/ou veículos. Tais composições incluem diluentes de vários teores de tampão (por exemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), pH e resistência iônica e aditivos tais como detergentes e agentes de solubilização (por e- xemplo, Tween 80, Polissorbato 80), anti-oxidantes (por exemplo, ácido as- córbico, metabisulfeto de sódio), conservantes (por exemplo, Thimersol, benzil álcool) e substâncias de massa Cpor exemplo, lactose, manitol). O ma- terial pode ser incorporado em preparações particuladas de compostos po- liméricos tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., ou em Iiposso- mas. O ácido hialurônico pode também ser usado. Tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa de limpeza in vivo das presentes proteínas e derivados. Ver, por exemplo, Mar- tin, Remington1S Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 que são aqui incorporadas por referência. As composições podem ser preparadas na forma líquida, ou po- dem estar em pó seco, tal como forma liofilizada.

Alternativamente, os polinucleotídeos da invenção podem ser otimizados para expressão em plantas (por exemplo, milho). A planta pode ser transformada com plasmídeos contendo os polinucleotídeos otimizados. Em seguida a planta é crescida, e as proteínas da invenção são expressas na planta, ou a versão otimizada de planta é expressa. A planta é mais tarde coletada, e a seção da planta contendo as proteínas da invenção é proces- 5 sada em alimento para o animal. Esta alimentação de animal concederá i- munidade contra B. hyodysenteriae quando comida pelo animal. Exemplos de técnica anterior detalhando estes métodos podem ser encontrados na Patente dos Estados Unidos 5.914.123 (Arntzen, et al.); Patente dos Esta- dos Unidos 6.034.298 (Lam, et al.); e Patente dos Estados Unidos 6.136.320 10 (Arntzen, et al.).

Será apreciado que composições farmacêuticas providas de a- cordo com a invenção podem ser administradas por qualquer meio conheci- do na técnica. Preferivelmente, as composições farmacêuticas para adminis- tração são administradas por injeção, oralmente, ou por via pulmonar ou na- 15 sal. As seqüências de aminoácido aqui descritas ou anticorpos derivados destas são mais preferivelmente distribuídas por vias intravenosa, intra- arterial, intraperitoneal, intramuscular, ou subcutânea de administração. Al- ternativamente, a seqüência de aminoácido aqui descrita ou anticorpos deri- vados da mesma, corretamente formulados, podem ser administrados por 20 administração nasal ou oral.

Também envolvido pela presente invenção é o uso de seqüên- cias de polinucleotídeo da invenção, bem como seqüências de antisentido e de ribozima de polinucleotídeo hibridizável a uma seqüência de polinucleotí- deo que codifica uma seqüência de aminoácido de acordo com a invenção, 25 para manufatura de um medicamento para modulação de uma doença asso- ciada a hyodysenteriae. Seqüências de polinucleotídeo que codificam cons- truções de antisentido ou ribozimas para uso em métodos terapêuticos são desejavelmente administradas diretamente como um construto de ácido nu- cleico não-revestido. O entendimento de construtos de ácido nucleico não- 30 revestidos por células bacteriais é aumentado por várias técnicas de trans- fecção conhecidas, por exemplo, aquelas incluindo o uso de agentes de transfecção. Exemplos destes agentes incluem agentes catiônicos (por e- xemplo, fosfato de cálcio e DEAE-dextrano) e lipofectantes. Tipicamente, construções de ácido nucleico são misturadas com o agente de transfecção para produzir uma composição.

Alternativamente, o construto de antissenso ou ribozimas pode 5 ser combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável ou diluente pa- ra produzir uma composição farmacêutica. Veículos adequados e diluentes incluem soluções salinas isotônicas, por exemplo, salina tamponada por fos- fato. A composição pode ser formulada para administração parenteral, in- tramuscular, intravenosa, subcutânea, intraocular, oral ou transdermal. As 10 vias de administração descritas são pretendidas somente como uma guia visto que um técnico no assunto será capaz de determinar prontamente a via ótima de administração e qualquer dosagem para qualquer animal particular e condição.

A invenção também inclui kits para classificação de animais sus- peitos de serem infectados com uma espécie Brachyspira, tal como B. kyodysenteriae, ou para confirmar que um animal é infectado com uma es- pécie Brachyspira, tal como B. kyodysenteriae. Em uma concretização adi- cional desta invenção, kits adequados para uso por um especialista pode ser preparado para determinar a presença ou ausência de espécies Brachyspi- ra, incluindo, mas não limitadas a, B. kyodysenteriae, B. suanatina, B. inter- media, B. aivinipulli, B. aaiborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. pilosicoii em animais infectados suspeitos ou para medir quantitativamente uma espécie Brachyspira, incluindo, mas não limitada a, infecção de B. kyodysenteriae, B. suanatina, B. intermedia, B. aivinipulli, B. aaiborgi e B. pilosicoii. De acordo com as técnicas de teste discutidas acima, tais kits podem conter pelo me- nos uma versão etiquetada de uma das seqüências de aminoácidos descri- tas aqui ou seu coparticipante de ligação, por exemplo, um anticorpo especí- fico, e direções dependendo do método selecionado, por exemplo, "competi- tivo", "intercalado", "DASP" e similares. Alternativamente, tais kits podem conter pelo menos uma seqüência de polinucleotídeo complementar a uma porção de uma das seqüências de polinucleotídeo descritas aqui junto com instruções para seu uso. Os kits podem também conter reagentes periféricos tais como tampões, estabilizadores, etc.

Consequentemente, um kit de teste para a demonstração da presença de espécies Brachyspira, incluindo, mas não limitadas a, B. kyody- senteriae, B. suanatina, B. intermedia, B. aivinipulli, B. aaiborgi, B. innocens, B. murdochii, e B. pilosicoli, pode conter os seguintes:

(a) uma quantidade predeterminada de pelo menos um com- ponente reativo imunoquimicamente etiquetado obtido por fixação direta ou indireta de uma das seqüências de aminoácidos aqui descritas ou um copar- ticipante de ligação específica, a uma etiqueta detectável;

(b) Outros reagentes; e

(c) direções para uso de referido kit.

Mais especificamente, o kit de teste de diagnóstico pode conter:

(a) uma quantidade conhecida de uma das seqüências de aminoácido aqui descritas conforme descrito acima (ou um co-participante

de ligação) geralmente ligado a uma fase sólida para formar um imunosor- vente, ou na alternativa, ligado a uma etiqueta adequada, ou existem uma multiplicidade de tais produtos finais, etc;

(b) se necessário, outros reagentes; e

(c) direções para uso de referido kit de teste.

Em uma variação adicional, o kit de teste pode conter:

(a) um componente etiquetado que foi obtido por acoplamento de uma das seqüências de aminoácido descritas aqui para uma etiqueta de- tectável;

(b) um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais dos quais

pelo menos um reagente é um Iigante ou um Iigante imobilizado, cujo Iigante

é selecionado a partir do grupo consistindo de:

(i) um Iigante capaz de se ligar com o componente etiquetado

(a);

(ii) um Iigante capaz de se ligar com um coparticipante de Iiga-

ção do componente etiquetado (a);

(iii) um Iigante capaz de se ligar com pelo menos um do(s) com- ponente(s) a ser(em) determinado(s); ou (iv) um Iigante capaz de se ligar com pelo menos um dos copar- ticipantes de ligação de pelo menos um do(s) componente(s) a ser(em) de- terminado(s); e

(d) direções para o desempenho de um protocolo para a de-

tecção e/ou

(e) determinação de um ou mais componentes de uma rea- ção imunoquímica entre uma das seqüências de aminoácido aqui descritas e um coparticipante de ligação específica.

Preparação de biblioteca qenômica Uma biblioteca genômica é preparada usando-se um isolado de

campo porcino da Austrália de B. hyodysenteriae (cepa WA1). Esta cepa foi bem caracterizada e mostrada para ser virulenta seguindo desafio experi- mental de porcos. O método de cetiltrimetilamônio brometo (CTAB) é usado para preparar DNA cromossomal de alta qualidade adequado para prepara- 15 ção de bibliotecas de DNA genômico. B. hyodysenteriae é crescido em 100 ml de cultura de caldo de soja tripticase anaeróbica para uma densidade de célula de 109 células/ml. As células são coletadas a 4.000 x g por 10 minu- tos, e a pelota de célula resuspensa em 9,5 ml de tampão de TE. SDS é adi- cionado a uma concentração final de 0,5 % (p/v), e as células Iisadas a 37°C 20 por 1 hora com 100 1xg de Proteinase K. NaCI é adicionado a uma concen- tração final de 0,7 M e 1,5 ml de solução de CTAB/NaCI (10% p/v de CTAB, 0,7 M NaCI) é adicionado antes da incubação da solução a 65°C por 20 mi- nutos. O Iisato é extraído com um volume igual de clorofórmio/isoamil álcool, e o tubo é centrifugo a 6.000 x g por 10 minutos para separar as fases. A 25 fase aquosa é transferida para um tubo fresco e 0,6 volumes de isopropanol são adicionados para precipitar o DNA de alto peso molecular. O DNA preci- pitado é coletado usando uma haste de vidro em gancho e transferido para um tubo contendo 1 ml de 70 % (v/v) de etanol. O tubo é centrifugado a

10.000 x g e o DNA pelotado redissolvido em 4 ml de tampão de TE durante a noite. Um gradiente de cloreto de césio contendo 1,05 g/ml CsCI e 0,5 mg/ml de brometo de etídio é preparado usando-se solução de DNA redis- solvida. O gradiente é transferido para 4 ml de tubos centrífugos vedáveis e centrifugados a 70.000 x g durante a noite a 15°C. O DNA separado é visua- lizado sob uma Iuz ultravioleta, e o DNA de alto peso molecular é retirado a partir do gradiente usando uma agulha de 15-g. O brometo de etídio é remo- vido a partir do DNA por extração seqüencial com isopropanol saturado com 5 CsCI-. O DNA cromossomal purificado é dialisado contra 2 litros de tampão de TE e precipitado com isopropanol. O DNA genômico resuspenso é cisa- Ihado usando-se um GeneMachines Hydroshear (Genomic Solutions, Ann Arbor, Ml), e o DNA cisalhado é preenchido usando-se Klenow DNA polime- rase para gerar fragmentos de feixe terminal. Cem ng dos fragmentos de 10 DNA de feixe terminal é ligado com 25 ng de pSMART VC vetor (Lucigen, Meddleton, Wl) usando CIoneSmart DNA ligase. O DNA ligado é então ele- troporado em células de E. coli eletrocompetentes. Uma biblioteca de inserto pequeno (2-3 kb) e biblioteca de inserto médio (3-10 kb) é construída na versão de cópia baixa do pSMART VC vetor.

Seauenciamento genômico

Após a biblioteca genômica ser obtida, clones individuais de E. coli contendo o vetor pSMART VC são captados. O DNA de plasmídeo é purificado e sequenciado. Os plasmídeos purificados são submetidos a se- quenciamento direto automático do vetor pSMART VC usando os iniciadores 20 de avanço e reverso específicos para o vetor pSMART VC. Cada reação de sequenciamento é realizada em um volume de 10 μΙ consistindo em 200 ng de DNA de plasmídeo, 2 pmol de iniciador, e 4 μΙ do ABI PRISM® BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). As condições de ciclização envolvem uma etapa de desna- 25 turação de 2 minutos a 96°C, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 96°C por 10 segundos, e um iniciador combinado de fortalecimento e etapa de extensão a 60°C por 4 minutos. Terminadores de matiz residual são removi- dos a partir dos produtos de sequenciamento por precipitação com 95% (v/v) de etanol contendo 85 mM de acetato de sódio (pH 5,2), 3mM de EDTA (pH 30 8), e secado a vácuo. Os plasmídeos são sequenciados em duplicata usan- do cada iniciador. Os produtos de sequenciamento são analisados usando um Sequenciador ABI 373A DNA (PE Applied Biosystems). Anotação

Seqüências de genoma parciais para B. kyodysenteriae são montadas e anotadas usando uma faixa de ferramentas de bioinformática de domínio público para analisar e reanalisar as seqüências como parte de pro- 5 cedimento de garantia de qualidade na análise de dados. Estruturas de leitu- ra abertas (ORFs) são prognosticadas usando uma variedade de programas incluindo GeneMark, GLIMMER, ORPHEUS, SELFID e GetORF. ORFs pu- tativas são examinadas para homologia (DNA e proteína) com bases de da- dos internacionais existentes usando pesquisas incluindo BLAST e FASTA. 10 Todas as ORFs prognosticadas são analisadas para determinar sua locali- zação celular usando programas incluindo PSI-BLAST, FASTA, MOTIFS, FINDPATTERNS, PHD, SIGNALP e PSORT. Bases de dados incluindo In- terpro, Prosite, ProDom, Pfam e Blocos são usados para prognosticar prote- ínas associadas a superfície tais como domínios de transmembrana, peptí- 15 deos condutores, homologias a proteínas de superfície conhecidas, assina- tura de lipoproteína, motivos de ancoramento de membrana externa e domí- nios de ligação de célula hospedeira. Análise filogenética e outras análises de evolução molecular são conduzidas com os genes identificados e com outras espécies para auxiliar na transferência da função. A análise in silico 20 de ambos genomas parcialmente sequenciados produz uma lista compreen- siva de todas as ORFs prognosticadas presentes nos dados de seqüência disponíveis. Cada ORF é interrogada para informação descritiva tal como peso molecular prognosticado, ponto isoelétrico, hidrofobicidade, e localiza- ção subcelular para capacitar correlação com as propriedades in vitro do 25 produto de gene nativo. Genes prognosticados que codificam proteínas simi- lares a componentes localizados de superfície e/ou fatores de virulência em outras bactérias patogênicas são selecionados com alvos de vacina potenci- ais.

Resultados de bioinformáticas O sequenciamento de espingarda do genoma de B. kyodysente-

riae resulta em 94,6% (3028,6 kb fora de um prognosticado 3200 kb) do ge- noma sendo sequenciado. A seqüência de B. kyodysenteriae é compreendi- da de 294 contigs com um tamanho de contig médio de 10,3 kb. Para B. kyodysenteriae, 2.593 estruturas de leitura aberta (ORFs) são prognostica- das de 294 contigs. A comparação das ORFs prognosticadas com genes presentes no ácido nucleico e bases de dados de proteína indica que apro- 5 ximadamente 70% das ORFs têm homologia com genes contidos nas bases de dados públicas. Os 30% remanescentes das ORFs prognosticadas não têm identidade conhecida.

Vacinas candidatas

Para ajudar a reduzir o número de ORFs que seria testado como uma vacina candidata, ORF's mostrando homologia razoável (valor-E menor do que e‘15) com proteínas de superfície externas, proteínas secretadas, e fatores de virulência possíveis presentes nas bases de dados públicas são selecionados como vacinas candidatas potenciais. Das 2.593 ORFs obtidas no sequenciamento de espingarda genômico, muitas passam este teste, mas os resultados de trinta e três genes são apresentados aqui. A Tabela 1 mostra trinta e três genes selecionados como alvos de vacina potenciais e sua similaridade com outras seqüências de aminoácido conhecidas obtidas da base de dados SWISS-PROT. É notado que a percentagem de identida- de de aminoácidos não ocorre acima de 58%, enquanto a percentagem de similaridade ou homologia de aminoácidos permanece menor do que 71%, indicando, desse modo, que estas ORFs são únicas.

Tabela 1

Gene Identidade de Proteína Identida-de Similaridade Número de Com Homologia Mais (aminoácidos) (aminoácidos) Acesso Alta NAV-H54 Proteína de superfície 106/223 (47%) 136/223 068157 variável (VspD) of Bra¬ (60%) chyspira hyodysenteriae NAV-H55 Proteína B flagelar de 58/213 (27%) 108/213 Q72SJ3 Leptospira interrogans (50%) NAV-H56 Antígeno maior similar à 288/1509 609/1509 P21249 Miosina (19%) (40%) Gene Identidade de Proteína Identida-de Similaridade Número de Com Homologia Mais (aminoácidos) (aminoácidos) Acesso Alta NAV-H57 Lítica mureína transgli- 97/318 (25%) 158/318 Q6F7W9 cosilato (possivelmente (41%) membrana externa liga¬ da) NAV-H58 Proteína de membrana 57/175 (32%) 90/175 (51%) P96127 externa de Treponema pallidum NAV-H59 Antígeno maior similar à 204/1012 432/1012 P21249 Miosina (20%) (42%) NAV-H60 Proteína de membrana 46/139 (33%) 68/139 (48%) COG2885 externa e peptideoglica- no relacionado NAV-H61 Lipoproteína putativa de 336/805 (41%) 483/805 Q73NT0 Treponema denticola (60%) NAV-H62 NIpA lipoproteína de 92/269 (34%) 151/269 Q303L3 Streptococcus suis (56%) NAV-H63 NIpA lipoproteína de 106/312 (33%) 167/312 Q303L3 Streptoeoecus suis (53%) NAV-H64 NIpA lipoproteína de 112/337 (33%) 198/337 Q303L3 Streptoeoecus suis (58%) NAV-H65 Proteína secretada pu¬ 50/127 (39%) 68/127 (53%) Q849M9 tativa de Streptomyees violaeeoruber NAV-H66 Toxina (YoeB) de Es- 42/85 (58%) 60/85 (76%) P69349 eheriehia coli NAV-H67 Proteína de membrana 80/350 (20%) 171/350 Q2Z054 externa (ToIC) (39%) NAV-H68 Proteína relacionada de 121/415 (29%) 204/415 Q3ZYX1 hemolisina provável de (49%) Gene Identidade de Proteína Identida-de Similaridade Número de Com Homologia Mais (aminoácidos) (aminoácidos) Acesso Alta Dehalococcoides sp. NAV-H69 Proteína de superfície 193/357 (54%) 256/357 Q4MWS0 externa de Bacillus ce- (71%) reus NAV-H70 Lipoproteína associada 146/417 (35%) 203/417 Q2SRL9 à membrana de Vibrio (48%) vulnificus NAV-H71 Proteína de camada de 72/201 (36%) 112/201 Q8TJE3 superfície de Methano- (49%) sarcina barkeri NAV-H72 Lítica mureína transgli- 51/141 (36%) 6/141 (53%) P44049 cosila to (possivelmente mem¬ brana externa ligada) NAV-H73 Toxina (YoeB) de Es- 42/84 (50%) 62/84 (73%) P69349 NAV-H74 Proteína de membrana 210/833 (25%) 339/833 COG4775 NAV-H22 Proteína de superfície 29% (133/454) 43% A- NAV-H23 Lipoproteína associada 43% (114/263) 60% A- NAV-H24 Lipoproteína de mem- 32% (46/142) 53% (76/142) ZP0030092 NAV-H30 antígeno de superfície 38% (83/216) 55% A- NAV-H32 proteína hemolítica (Hl- 35% (49/137) 56% (77/137) NP488469. NAV-H33 proteína hemolítica de 54% (64/117) 70% (83/117) A- NAV-H37 Proteína de mediação 36% (58/159) 63% NP800579. NAV-H40 lítica mureína transgli- 26% (120/449) 41% ZP0014610 NAV-H41 Antígeno de superfície 41% (84/201) 57% A- NAV-H43 Hemolisinas e proteínas 35% (150/425) 56% ZP0016271 Gene Identidade de Proteína Identida-de Similaridade Número de Com Homologia Mais (aminoácidos) (aminoácidos) Acesso Alta NAV-H44 Porina de membrana 20% (79/393) 41% YP001419.1 NAV-H45 Fator de virulência 32% (153/469) 49% NP952225. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H54 são encontra-

dos em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. O DNA e seqüências de ami- noácido de NAV-H55 são encontrados em SEQ ID NOs: 3 e 4, respectiva- mente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H56 são encontrados 5 em SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoáci- do de NAV-H57 são encontrados em SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H58 são encontrados em SEQ ID NOs: 9 e 10, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H59 são encontrados em SEQ ID NOs: 11 e 12, respectivamente. O 10 DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H60 são encontrados em SEQ ID NOs: 13 e 14, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H61 são encontrados em SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H62 são encontrados em SEQ ID NOs: 17 e 18, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de 15 NAV-H63 são encontrados em SEQ ID NOs: 19 e 20, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H64 são encontrados em SEQ ID NOs: 21 e 22, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H65 são encontrados em SEQ ID NOs: 23 e 24, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H66 são encontrados em SEQ ID 20 NOs: 25 e 26, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H67 são encontrados em SEQ ID NOs: 27 e 28, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H68 são encontrados em SEQ ID NOs: 29 e 30, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H69 são encontrados em SEQ ID NOs: 31 e 32, respectivamente. O 25 DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H70 são encontrados em SEQ ID NOs: 33 e 34, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H71 são encontrados em SEQ ID NOs: 35 e 36, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H72 são encontrados em SEQ ID NOs: 37 e 38, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H73 são encontrados em SEQ ID NOs: 39 e 40, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H74 são encontrados em SEQ ID NOs: 41 e 42, respectivamente.

O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H22 são encontra- dos em SEQ ID NOs: 43 e 44, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H23 são encontrados em SEQ ID NOs: 45 e 46, respec- tivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H24 são encontra- 10 dos em SEQ ID NOs: 47 e 48, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H30 são encontrados em SEQ ID NOs: 49 e 50, respec- tivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H32 são encontra- dos em SEQ ID NOs: 51 e 52, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H33 são encontrados em SEQ ID NOs: 53 e 54, respec- 15 tivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H37 são encontra- dos em SEQ ID NOs: 55 e 56, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H40 são encontrados em SEQ ID NOs: 57 e 58, respec- tivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H41 são encontra- dos em SEQ ID NOs: 59 e 60, respectivamente. O DNA e seqüências de 20 aminoácido de NAV-H43 são encontrados em SEQ ID NOs: 61 e 62, respec- tivamente. O DNA e seqüências de aminoácidos de NAV-H44 são encontra- dos em SEQ ID NOs: 63 e 64, respectivamente. O DNA e seqüências de aminoácido de NAV-H45 são encontrados em SEQ ID NOs: 65 e 66, respec- tivamente.

Para adicionalmente reduzir o número de ORFs que seriam tes-

tadas como uma vacina candidata, os produtos de gene prognosticados pela análise de silico a ser localizada no citoplasma ou membrana interna do es- pirochaete são abandonados. Como um resultado, vinte e um dos trinta e três genes apresentados na Tabela 1 são adicionalmente analisados. Estes 30 incluem NAV-H58, NAV-H60, NAV-H62, NAV-H64, NAV-H66, NAV-H67, NAV-H69, NAV-H71, NAV-H73, NAV-H22, NAV-H23, NAV-H24, NAV-H30, NAV-H32, NAV-H33, NAV-H37, NAV-H40, NAV-H41, NAV-H43, NAV-H44, e NAV-H45.

Análise de distribuição de gene usando reacão de cadeia de polimerase (P- CR)

Um ou dois pares de iniciador que fortalecem para regiões dife- rentes da região de codificação de gene-alvo são designados e otimizados para detecção de PCR. Iniciadores individuais são designados usando Oligo Explorer 1.2 e iniciador ajustado com temperaturas de fusão calculadas de aproximadamente 55-60°C são selecionados. Estes ajustes de iniciador são também selecionados para gerar produtos de PCR maiores do que 200 pb. Uma temperatura de fortalecimento de iniciador de estringência média de 50°C é selecionada para a PCR de análise de distribuição. As condições de média estringência permitiriam seqüências desequiparadas menores poten- ciais (por causa das diferenças de cepa) que ocorrem nos locais de ligação de iniciador para não afetar ligação de iniciador. As análises de distribuição dos vinte e um genes-alvos B. kyodysenteriae são realizadas nas 23 cepas de B. kyodysenteriae, incluindo duas cepas que foram mostradas serem avi- rulentas. A análise de PCR é realizada em um volume total de 25 μΙ usando Taq DNA polimerase (Biotech International, Thurmont, MD). A mistura de amplificação consiste em tampão 1x PCR (contendo 1,5 mM de MgCfe), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP (Amersham Pharmacia Bio- tech, Piscataway, NJ), 0,5 μΜ do par de iniciador, e 1 μΙ de DNA gabarito cromossomal purificado. As condições de ciclização envolvem uma etapa de desnaturação de gabarito inicial de 5 minutos a 94°C, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, fortalecimento a 50°C por 15 se- gundos, e extensão de iniciador a 68°C por 4 minutos. Os produtos de PCR são submetidos a eletroforese em 1% (p/v) de géis de agarose em Ix TAE tampão (40 mM Tris-acetato, 1 mM de EDTA), manchamento com a 1 μπη/ιτιΙ de solução de brometo de etídio e observação sobre Iuz UV.

Os iniciadores usados para dezoito genes (fora de vinte e um) são indicados na Tabela 2. Destes dezoito genes, três deles (NAV-H23, NAV-H41 e NAV-H71) estão presentes em 83% das cepas B. kyodysenteri- ae testadas; três delas (NAV-H24, NAV-H30 e NAV-H73) estão presentes em 87% das cepas testadas, sete delas (NAV-H22, NAV-H32, NAV-H33, NAV-H37, NAV-H43, NAV-H64 e NAV-H69) estão presentes em 91% das cepas testadas, e três delas (NAV-H40, NAV-H44, e NAV-H45) estão pre- sentes em 100% das cepas testadas. Os três genes remanescentes estão 5 presentes em menos do que 80% das cepas B. kyodysenteriae testadas. A pobre distribuição destes genes tornam-os menos úteis como uma subuni- dade de vacina. Por esta razão, análise adicional destes genes foi abando- nada.

Tabela 2

Gene Nome do Ini¬ Seqüência de Iniciador (5'-3') ciador NAV-H22 H22-F4 AAACGTTTATATTTTATTTTATC (SEQ ID NO: 67) H22-R1308 AAACTTCCAAGTGATACC (SEQ ID NO: 68) NAV-H23 H23-F4 AAATATAAACCTACAAGCAG (SEQ ID NO: 69) H23-R2366 AATATTTCAGTTAATCTAAAATC (SEQ ID NO: 70) NAV-H24 H24-F19 ACTTTAATCTTTGTATTAAI I I I G (SEQ ID NO: 71) H24-R729 TTGTTTTAATTTGATAATATCAG (SEQ ID NO: 72) NAV-H30 H30-F4 A A A A A AATT ATTTT ATT AAT ATTT AT ATT (SEQ ID NO: 73) H30-R969 TTCTCTTATAATCTTTACAGTTG (SEQ ID NO: 74) NAV-H32 H32-F4 CATATTTCTGGTGATTCTC (SEQ ID NO: 75) H32-R564 Illlll GAIAAATAAGTTTTTTATTTG (SEQ ID NO: 76) NAV-H 33 H33-F4 TTTAATACTCCTATATTATTAATTATTT (SEQ ID NO: 77) H33-R396 AAGGAGAATCACCAGAAA (SEQ ID NO: 78) NAV-H37 H37-F4 AATGATATTATTAAAGTGATAAA (SEQ ID NO: 79) H37-R825 AAAATCTAATATAACGGATT (SEQ ID NO: 80) NAV-H40 H40-F16 AAATATGCTTCCATTATAGG (SEQ ID NO: 81) H40-R1815 AC I I I I AGGAAGAAGTTTAAC (SEQ ID NO: 82) NAV-H41 H41-F19 TATAI I I ICATT AT AT ATTT ATT AG (SEQ ID NO: 83) H41-R1067 CTAGGCATAGATTTTCCA (SEQ ID NO: 84) NAV-H43 H43-F46 TTTGCCATGTCGGAAATTGCAG (SEQ ID NO: 85) H43-R1236 TATTCTAGCACCGTCCATATC (SEQ ID NO: 86) NAV-H44 H44-F43 GTATGTTTATATGCTCAGGATAC (SEQ ID NO: 87) H44-R2931 AACAGCAGCACTATCTTGTAA (SEQ ID NO: 88) H44-F80 CAGCAGCAACAAATAATACTACTG (SEQ ID NO: 89) H44-R929 TGAATATAAACACCTTCTCTCAAAG (SEQ ID NO: 90) NAV-H45 H45-F52 AAAATGTCATTGGTAACTACTGTAAG (SEQ ID NO: 91) H45-R1595 CTTGATAATCTGCCTTTAAACATAC (SEQ ID NO: 92) NAV-H 62 H62-F69 ATGTGAGGAAAAAACAGAAAG (SEQ ID NO: 93) H62-R866 TCATTACCAGAAAACCATACTC (SEQ ID NO: 94) NAV-H64 H64-F69 AGGAAATAAAGCTCCTGCTGCTTCAGC (SEQ ID NO: 95) H64-R253 GCATAGCAGCAACTTCAGAAGGTCCA (SEQ ID NO: 96) NAV-H66 H66-F114 CTTATTAATTGGTATAGGAAAACC (SEQ ID NO: 97) H66-R200 AAT CTATGTT CTT GATTT ATT AG CC (SEQ ID NO: 98) NAV-H69 H69-F546 AGAAGCTAC I I I IGGACCTTGGCCTGT (SEQ ID NO: 99) H69-R662 ACACAGTCAACACCAAGAGC (SEQ ID NO: 100) NAV-H71 H71-F568 AAACAGCAGACTAGCTGGTG (SEQ ID NO: 101) H71-R773 TGACCATTACTTACACCGGATACCCCA (SEQ ID NO: 102) H71-F37 TTAATGACTATATCGCTTTCATACACTTTC (SEQ ID NO: 103) H71-R1241 TCAATTCTTCCAGACATAAAATCAGTAAG (SEQ ID NO: 104) NAV-H73 H73-F37 TATATAGAGTGGGTATCAGAAG (SEQ ID NO: 105) H73-R254 TCATAATGGTATTTACAAGATG (SEQ ID NO: 106) Extração de plasmídeo pTrcHis

Clones de Escherichia coli JM109 abrigando o plasmídeo pTr- cHis (Invitrogen, Carlsbad, CA) são riscados de armazenagem de estoque de glicerol em placas agar Luria-Bertani (LB) suplementadas com 100 mg/1 5 ampicilina e incubados a 37°C por 16 horas. Uma colônia simples é usada para inocular 10 ml de caldo de LB suplementado com 100 mg/1 de ampicili- na, e a cultura de caldo é incubada a 37°C por 12 horas com sacudimento. A cultura durante a noite total é centrifugada a 5.000 x g por 10 minutos, e o plasmídeo contido nas células é extraído usando-se o QIAprep Spin Mini- prep Kit (Qiagen, Doncaster VIC). As células peletizadas são ressuspensas com 250 μΙ de tampão de ressuspensão de célula Pl e em seguida são Iisa- das com a adição de 250 μΙ de tampão de Iise de célula P2. As células Iisa- das são neutralizadas com 350 μΙ de tampão de neutralização N3, e o frag- 5 mento de célula precipitado é peletizado por centrifugação a 20.000 x g por 10 minutos. O sobrenadante é transferido para uma coluna de rotação e centrifugado a 10.000 x g por 1 minuto. Após descarte do fluxo, 500 μΙ de tampão de lavagem PE é aplicado à coluna e centrifugado como antes. O fluxo é descarregado, e a coluna é secada por centrifugação a 20.000 x g 10 por 3 minutos. O DNA de plasmídeo é eluído a partir da coluna com 100 μΙ de tampão de eluição EB. O plasmídeo purificado é quantificado usando-se um fluorômetro de DNA Dynaquant (Hoefer, San Francisco, CA), e a con- centração de DNA ajustada para 100 μg/ml por diluição com tampão de TE. O plasmídeo pTrcHis purificado é armazenado a -20°C.

Preparação de Vetor

Dois μg do plasmídeo pTrcHis purificado é digerido a 37°C por 1-4 horas em um volume total de 50 μΙ contendo 5 U de duas enzimas de restrição em 100 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 50 mM de NaCI, 10 mM de Mg- Cl2, 1 mM de DTT e 100 pg/ml de BSA. O par particular de enzimas de res- 20 trição usado depende da seqüência dos iniciadores e da seqüência da ORF; o objetivo sendo usar iniciadores que não cortariam as ORFs. O vetor restri- to é verificado por eletroforese de 1 μΙ da reação de digestão através de 1% (p/v) de gel de agarose em tampão IX TAE a 90V por 1 hora. O DNA eletro- forosado é manchado com 1 μg/ml de brometo de etídio e visto sobre Iuz 25 ultravioleta (UV). Vetor pTrcHis Iinearizado é purificado usando-se o Kit Ul- traClean PCR Clean-up(Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA). Brevemente, a reação de restrição (50 μΙ) é misturada com 250 μΙ de tampão SpinBind BI, e o volume total é adicionado a uma coluna de rotação. Após centrifugação a

8.000 x g por 1 minuto, o fluxo é descartado e 300 μΙ de tampão SpinCIean B2 é adicionado à coluna. A coluna é centrifugada como antes, e o fluxo é descartado antes de secagem da coluna a 20.000 x g por 3 minutos. O vetor purificado é eluído da coluna com 50 μΙ de tampão TE. O vetor linear purifi- cado é quantificado usando-se um fluorômetro, e a concentração de DNA é ajustada para 50 pg/ml por diluição com tampão de TE. O vetor restrito puri- ficado é armazenado a -20°C.

Desenho de iniciador para preparação de inserto Pares de iniciador são designados para amplificar muita da regi-

ão de codificação do gene-alvo quanto possível usando DNA genômico co- mo ponto de partida. Todos as seqüências de iniciadores incluem locais de enzima de restrição terminal para capacitar ligação terminal coesiva do am- plicon resultante no vetor pTrcHis linearizado. Os iniciadores são testados 10 usando-se Amplify 1.2 (University of Wisconsin, Madison, Wl) e a seqüência de amplicon teórica é inserida na posição apropriada na seqüência de vetor pTrcHis. A translação deduzida do cassete de expressão pTrcHis quimérico é realizada usando-se Vector NTI versão 6 (InforMax) para confirmar que os insertos de gene estariam na estrutura de leitura correta. A Tabela 3 também 15 proporciona o tamanho de gene, o tamanho da proteína, o peso molecular prognosticado da proteína nativa em daltons e o pi prognosticado da proteí- na. É notado que a fusão de histidina da proteína recombinante adiciona a- proximadamente 4 kDa ao peso molecular prognosticado da proteína nativa. Tabela 3

Gene Tamanho do Tamanho da MW prognosticado de pi prognosticado Gene Proteína (aa) proteína nativa (Da) NAV-H40 1815 605 97,733 9.4853 NAV-H41 1068 356 39,870 5.2168 NAV-H44 2940 980 113,722 5.1864 NAV-H62 1014 338 37642 4.3944 NAV-H64 1011 337 36468 4.4953 N AV-H 66 264 88 10629 9.3027 NAV-H69 1080 360 41525 5.7123 NAV-H73 258 86 10527 9.5920 Amplificação dos insertos de gene

Usando-se DNA genômico, todos os insertos de gene alvos são amplificados por PCR em um volume total de 100 μΙ usando-se Taq DNA polimerase (Biotech International) e Pfu DNA polimerase (Promega, Madi- son, Wl). A mistura de amplificação consiste de 1x de tampão de PCR (con- tendo 1,5 mM de MgCI2), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,01 U Pfu de DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP (Amersham Pharmacia Biotech), 0,5 μΜ 5 do par de iniciador apropriado e 1 μΙ de DNA cromossomal purificado. O DNA cromossomal é preparado das mesmas cepas de B. kyodysenteriae usadas para sequenciamento de genoma. As condições de ciclização envol- vem uma etapa de desnaturação de gabarito inicial de 5 minutos a 94°C, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, fortaleci- 10 mento a 50°C por 15 segundos, e extensão de iniciador a 68°C por 4 minu- tos. Os produtos de PCR são submetidos à eletroforese em 1% (p/v) de géis de agarose em Ix de tampão de TAE, são manchados com 1 μg/ml de solu- ção de brometo de etídio e são vistos sobre Iuz UV. Após verificação da pre- sença do produto de PCR de tamanho correto, a reação de PCR é purificada 15 usando o Kit UItraCIean PCR Clean-up (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA). A reação de PCR (100 μΙ) é misturada com 500 μΙ de tampão SpinBind BI, e o volume total é adicionado a uma coluna de rotação. Após centrifugação a

8.000 x g por 1 minuto, o fluxo é descartado, e 300 μΙ de tampão SpinCIean B2 é adicionado à coluna. A coluna é centrifugada como antes e o fluxo é descartado antes de secagem da coluna a 20.000 x g por 3 minutos. O vetor purificado é eluído a partir da coluna com 100 μΙ de tampão TE.

Digestão da enzima de restrição dos insertos de gene

Trinta μΙ do produto de PCR purificado são digeridos em um vo- lume total de 50 μΙ com 1 U de cada enzima de restrição compatível com o 25 local de reconhecimento de restrição terminal determinado pela clonagem de iniciador de oligonucleotídeo. A reação de restrição consiste em 100 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 50 mM de NaCI, 10 mM de MgCI2, 1 mM de DTT e 100 μg/ml de BSA com 1 U de cada enzima de restrição a 37°C por 1-4 horas. Os DNAs do inserto digerido são purificados usando o Kit UItraCIean PCR 30 Clean-up (ver acima). Os DNAs de inserto digeridos purificados são quantifi- cados usando-se o fluorômetro, e a concentração de DNA é ajustada para 20 ^g/ml por diluição com tampão de TE. Os DNAs de inserto restritos puri- ficados são usados imediatamente para ligação de vetor.

Ligação do insertos de gene no vetor pTrcHis

As reações de ligação são todas realizadas em um volume total de 20 μΙ. Cem ng de pTrcHis Iinearizado é incubado com 20 ng de inserto 5 restrito a 16°C por 16 horas em 30 mM de Tris-HCI (pH 7,8), 10 mM de Mg- Cl2, 10 mM de DTT e 1 mM de ATP contendo 1 U de T4 DNA Iigase (Prome- ga). Uma reação de ligação idêntica não contendo DNA de inserto é também incluída como um controle negativo de recircularização de vetor. A enzima de restrição apropriada é usada para cada reação.

Transformação de ligações de pTrcHis em células de E. coli

Células competentes de E. coli JM109 (Promega) são desconge- ladas de armazenagem de -80°C em gelo e em seguida 50 μΙ das células são transferidas em tubos de microfuga de 1,5 ml de água fria contendo 5 μΙ das reações de ligação durante a noite (equivalente a 25 ng de vetor pTr- 15 cHis). Os tubos são misturados por esvaziamento brandamente do fundo de cada tubo na bancada e deixados no gelo por 30 minutos. As células são em seguida aquecidas por choque por colocação dos tubos em um banho de água de 42°C por 45 segundos antes do retorno do tubo ao gelo por 2 minu- tos. As células transformadas são recuperadas em 1 ml de caldo de LB por 1 20 hora a 37°C com mistura branda. As células recuperadas são coletadas a 2.500 x g por 5 minutos, e as células são ressuspensas em 50 μΙ de caldo de LB fresco. O total de 50 μΙ de células ressuspensas são pulverizados cons- tantemente em uma placa Agar LB contendo 100 mg/1 ampicilina usando uma haste de vidro estéril. As placas são incubadas a 37°C por 16 horas.

Deteccão de construções de pTrcHis recombinantes em E. coli por PCR

Doze colônias transformantes simples para cada construção são riscadas em placas Agar LB frescas contendo 100 mg/l de ampicilina e incu- badas a 37°C por 16 horas. Uma colônia simples de cada evento de trans- formação é ressuspensa em 50 μΙ de tampão de TE e é fervida por 1 minuto. 30 Dois μΙ de células fervidas são usados como gabarito para PCR. A mistura de amplificação consiste de 1x de tampão de PCR (contendo 1,5 mM de MgCb), 1 U de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP, 0,5 μΜ do pTr- cHis-F iniciador (5'-CAATTTATCAGACAATCTGTGTG-31 SEQ ID NO: 107) e

0,5 μΜ do pTrcHis-R iniciador ^'-TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG-S1 SEQ ID NO: 108). As condições de ciclização envolvem uma etapa de des- naturação de gabarito inicial de 5 minutos a 94°C, seguido por 35 ciclos de 5 desnaturação a 94°C por 30 segundos, fortalecimento a 60°C por 15 segun- dos, e uma extensão de iniciador a 72°C por 1 minuto. Os produtos de PCR são submetidos à eletroforese em 1% (p/v) de géis de agarose em 1x de tampão TAE, são manchados com 1 pg/ml de solução de brometo de etídio e são vistos sobre Iuz UV. A clonagem dos vários insertos no vetor pTrcHis 10 de expressão produz construtos recombinantes de vários tamanhos. Expressão piloto de proteínas etiquetadas His recombinantes

Cinco a dez colônias isoladas de construção pTrcHis recombi- nante em E. coli JM109 são inoculadas em 3 ml de caldo de LB em um tubo de 5 ml contendo 100 mg/l de ampicilina e 1 mM de IPTG e incubadas a 15 37°C por 16 horas com sacudimento. As células são coletadas por centrifu- gação a 5.000 x g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante é descartado, e cada pélete é resuspensa com 10 μΙ de tampão Iise Ni-NTA desnaturante (100 mM de NaH2PO^ 10 mM de Tris-HCI, 8 M de uréia, pH 8,0). Após cen- trifugação do tubo por 1 minuto, o fragmento celular é pelotizado por centri- 20 fugação a 10.000 x g por 10 minutos a 4°C. O subrenadante é transferido para um novo tubo e armazenado a -20°C até análise.

Eletroforese de gel de sódio dodecil sulfato poliacrilamida (SDS-PAGE)

Análise de SDS-PAGE de proteína é realizada usando um sis- tema de tampão descontínuo Tris-glicina. Trinta μΙ de amostra de proteína 25 são misturados com 10 μ1 de 4x amostras de tampão de tratamento (250 mM de Tris-HCI (pH 6,0), 8% (p/v) de SDS, 200 mM de DTT, 40% (v/v) de glicerol e 0,04 % (p/v) de bromofenol azul). As amostras são fervidas por 5 minutos imediatamente antes de carregamento de 10 μΙ da amostra em po- ços no gel. O gel compreende um gel de empilhamento (125 mM de Tris-HCI 30 pH 6,8, 4% p/v de acilamida, 0,15% p/v de bis-acrilamida e 0,1 % de p/v de SDS) e um gel de separação (375 mM de Tris-HCI pH 8,8, 12% p/v de aci- lamida, 0,31% p/v de bis-acrilamida e 0,1% p/v de SDS). Estes géis são po- Iimerizados pela adição de 0,1 % de (v/v) TEMED e 0,05% (p/v) de solução de sulfato de amônia recentemente preparada e fundida em célula de placa dupla mini-Protean (Bio-Rad, Hercules, Califórnia). As amostras são opera- das a 150 V à temperatura ambiente (RT) até o corante bromofenol azul al- 5 cançar o fundo do gel. Padrões de peso molecular pré-manchados são ele- troforados em paralelo com as amostras de modo a permitir estimações de peso molecular. Após eletroforese, o gel é imediatamente manchado usan- do-se Coomassie Brilliant Blue G250 (Bio-Rad) ou é submetido a eletro- transferência em membrana de nitrocelulose para Western blotting.

Análise de Western blot

Transferência eletroforética de proteínas separadas de gel de SDS-PAGE para membrana de nitrocelulose é realizada usando-se o siste- ma de tampão de transferência Towbin. Após eletroforese, o gel é equilibra- do em tampão de transferência (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 20% v/v 15 de metanol, pH 8,3) por 15 minutos. As proteínas no gel são eletrotransferi- das para membrana de nitrocelulose (Protran, Schleicher e Schuell BioSci- ence, Inc., Keene, NH) usando-se o aparelho mini-Protean transblot (Bio- Rad) a 30 V durante a noite a 4°C. A membrana de nitrocelulose recente- mente transferida contendo as proteínas separadas é bloqueada com 10 ml 20 de salina tris-tamponada (TBS) contendo 5% (p/v) de leite em pó por 1 hora à temperatura ambiente. A membrana é lavada com TBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20 (TBST) e em seguida é incubada com 10 mL de anti-his- anticorpo de camundongo (diluído 5.000 vezes com TBST) por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem três vezes por 5 minutos com TBST, a 25 membrana é incubada com 10 mL de cabra anticamundongo IgG (molécula total)-AP diluída 5.000 vezes em TBST por 1 hora à TA. A membrana é de- senvolvida usando-se o Kit de Substrato de Fosfatase Alcalina (Bio-Rad). A reação de desenvolvimento é cessada por lavagem da membrana com água destilada. A membrana é então secada e escaneada para apresentação. Verificação de estrutura de leitura das construções pTrcHis recombinantes por análise de seqüência direta

Dois clones transformantes para cada construção que produzi- ram os produtos de PCR dimensionados corretos são inoculados em 10 ml de caldo de LB contendo 100 mg/l de ampicilina e incubados a 37°C por 12 horas com agitação. As culturas durante a noite totais são centrifugadas a

5.000 x g por 10 minutos, e o plasmídeo contido nas células são extraídos usando o Kit QIAprep Spin Miniprep como descrito anteriormente. O plasmí- deo purificado é quantificado usando-se um fluorômetro.

Ambos os plasmídeos purificados são submetidos a sequencia-

mento direto automático do cassete de expressão pTrcHis usando os inicia- dores pTrcHis-F e pTrcHis-R. Cada reação de sequenciamento é realizada em um volume de 10 μ1 consistindo em 200 ng de DNA de plasmídeo, 2 pmol de iniciador, e 4 μΙ do ABI PRISM® BigDye Terminator Cycle Sequen- 15 cing Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). As con- dições de ciclização envolvem uma etapa de desnaturação de 2 minutos a 96°C, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 96°C por 10 segundos, e um fortalecimento de iniciador combinado e etapa de extensão a 60°C por 4 mi- nutos. Os terminadores de corante residuais são removidos dos produtos de 20 sequencimento por precipitação com 95% (v/v) de etanol contendo 85 mM de acetato de sódio (pH 5,2), 3mM de EDTA (pH 8), e secado a vácuo. Os plasmídeos são sequenciados em duplicata usando cada iniciador. Os pro- dutos de sequenciamento são analisados usando-se um Sequenciador de DNA ABI 373A (PE Applied Biosystems). O sequenciamento de nucleotídeo 25 do pTrcHis é realizado para verificar que o cassete de expressão está na estrutura de leitura correta para cada construto.

Expressão e purificação de proteínas His-etiquetadas recombinantes

Uma colônia simples da construção pTrcHis recombinante em E coli JM109 é inoculada em 50 ml de caldo de LB em um fresco cônico de 250 ml contendo 100 mg/l de ampicilina e incubada a 37°C por 16 horas com sacudimento. Uma frasco cônico de 2 I contendo 1 I de caldo de LB suple- mentado com 100 mg/l de ampicilina é inoculado com 10 ml da cultura du- rante noite e incubado a 37°C até a densidade ótica das células a 600 nm ser 0,5 (aproximadamente 3-4 horas). A cultura é então induzida por adição de IPTG a uma concentração final de 1 mM, e as células são retornadas a 37°C com agitação. Após 5 horas de indução, a cultura é transferida para 5 garrafas centrífugas de 250 ml, e as garrafas são centrifugadas a 5.000 x g por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante é descartado, e cada pelota é resus- pensa com 8 ml de tampão Iise Ni-NTA desnaturante (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de uréia, pH 8,0). As células ressuspensas são ar- mazenadas a -20°C durante a noite.

A suspensão de célula é removida de armazenagem a -20°C e

descongelada em gelo. O Iisato de célula é então sonicado em gelo 3 vezes por 30 segundos com incubação de 1 minuto no gelo entre etapas de soni- cação. As células Iisadas são clareadas por centrifugação a 20.000 x g por 10 minutos a 4°C, e o sobrenadante é transferido para uma coluna de 15 ml 15 contendo um volume de leito de 0,5 ml de resina de Ni-NTA agarose (Qia- gen). A proteína His6-etiquetada recombinante é permitida se ligar a resina por 1 hora a 4°C com mistura terminal. A resina é então lavada com 30 ml de tampão de lavagem Ni-NTA desnaturante (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de ureia, pH 6,3) antes de eluição com 12 ml de tampão de 20 eluição Ni-NTA desnaturante (100 mM de NaH2PO4, 10 mM de Tris-HCI, 8 M de ureia, pH 4,5). Quatro frações de 3 ml do eluído são coletadas e armaze- nadas a 4°C. Trinta μΙ de cada eluído são tratados com 10 μΙ de 4x amostra de tampão de tratamento e fervido por 5 minutos. As amostras são submeti- das a SDS-PAGE e manchadas com Coomassie Brilliant Blue G250 (Bio- 25 Rad). O gel manchado é equilibrado em água destilada por 1 hora e secado entre duas chapas de celulose durante a noite à temperatura ambiente.

A expressão dos clones de E. coli recombinantes é realizada em escala média para gerar proteína recombinante suficiente para vacinação de camundongos (ver abaixo).

Diálise e liofilizacão da proteína His-etiquetada purificada recombinante

As proteínas eluídas são reunidas e transferidas em um tubo de diálise hidratado (Spectrum Laboratories, Inc., Los Angeles, CA) com um corte de peso molecular (MWCO) de 3.500 Da. Uma alíquota de 200 μΙ do eluído reunido é tomada e quantificada usando-se um Ensaio de Proteína comercial (Bio-Rad). As proteínas são dialisadas contra 2 I de água destilada a 4°C com agitação. O tampão de diálise é mudado 8 vezes em intervalos 5 de 12-horas. As proteínas dialisadas são transferidas a partir do tubo de diá- lise em tubos centrífugos de 50 ml (40 ml de volume máximo), e os tubos são colocados a -80°C durante a noite. Os tubos são colocados em um se- cador-congelador MAXI (Heto-Holten, Allerod, Denmark) e Iiofilizados para secagem. As proteínas Iiofilizadas são então re-hidratadas com PBS a uma 10 concentração calculada de mg/ml e armazenadas a -20°C. Em seguida a diáli- se e liofilização, antígeno recombinante estável é produzido com sucesso.

Oito dos dezoito são bem sucedidamente clonados no Sistema de Expressão de E. coli e a proteína recombinante pode ser estavelmente expressa a partir destes clones.

Sorologia usando proteína recombinante purificada

Vinte pg de proteína recombinante purificada são carregados em uma poço IEF de 7 cm, eletroforizada através de 10% de (p/v) de gel SDS- PAGE, e eletro-transferida para membrana de nitrocelulose. A membrana é bloqueada com leite escumado de TBS (5% p/v) e montada no aparelho de 20 multi-classificação (Bio-Rad). Os poços são incubados com 100 μΙ de soro de porco diluído (100 vezes) por 1 hora à temperatura ambiente. O soro de porco é obtido de porcos de estado de alta saúde (n=3), experimentalmente desafiados mostrando SD clínico (n=5), porcos de soroconversão natural- mente infectados (n=5), e porcos recuperados de infecção natural (n=4). A 25 membrana em seguida é removida do aparelho e lavada três vezes com TBST (0,1% v/v) antes de incubação com 10 ml de cabra antissuíno IgG (molécula total)-AP (5.000 vezes) por 1 hora à temperatura ambiente. A membrana é lavada três vezes com TBST antes do desenvolvimento de cor usando um Kit de Substrato de Fosfatase Alcalina (Bio-Rad). A membrana é 30 lavada com água de torneira quando desenvolvimento suficiente ocorreu, secada e escaneada para apresentação.

A reatividade do soro de porco obtido de animal de estado de saúde diferente é mostrada na tabela abaixo. Todas as proteínas são reco- nhecidas por 100% do painel de soro, desse modo, indicando que os genes são expressos in vivo e que eles são capazes de induzir uma resposta imu- ne sistêmica seguindo exposição a espirochaete.

Tabela 4. Distribuição de gene e reatividade sorológica das oito vacinas candidatas bem-sucedidamente expressas de B. kyodysenteriae. A distribui- ção de gene foi analisada por PCR usando um painel de 23 cepas diferen- tes. Sorologia foi realizada usando-se 19 amostras de soro de cinco catego- rias diferentes de doença.

Gene Distribuição (%) Sorologia (%) NAV-H40 100 100% NAV-H41 83 100% NAV-H44 100 100% NAV-H62 96 100% NAV-H64 91 100% NAV-H66 96 100% NAV-H69 91 100% NAV-H73 87 100% Vacinação de camundonaos usando-se as proteínas his-etiquetadas purifi- cadas recombinantes

Para cada uma das proteínas his-etiquetada purificadas recom- binantes, dez camundongos são sistemicamente e oralmente imunizados para determinar se a proteína recombinante seria imunogênica. A proteína 15 recombinante é emulsificada com 30% (v/v) de água em adjuvante de óleo e injetada intramuscularmente no músculo quadraceps frequentemente em camundongos (Balb/cJ: 5 semanas de idade machos). Todos os camundon- gos receberam 100 pg de proteína em um volume total de 100 μΙ. Três se- manas após a primeira vacinação, todos os camundongos receberam uma 20 segunda vacinação intramuscular idêntica à primeira vacinação. Todos os camundongos são mortos duas semanas após a segunda vacinação. Os soros são obtidos do coração em pós-morte e testados em análise de Wes- tern blot para anticorpos contra extratos celulares de B. kyodysenteriae. Análise de Western blot

Vinte pg de proteína recombinante purificada é carregado em um poço IEF de 7 cm, eletroforizada através de 10% (p/v) de gel de SDS- PAGE, e eletrotransferida para membrana de nitrocelulose. A membrana é 5 bloqueada com leite em espuma de TBS (5% w/v) e montada no aparelho de multi-classificação (Bio-Rad). As poços são incubadas com 100 μΙ de soro de camundongo diluído (100 vezes) por 1 hora à temperatura ambiente. A membrana é removida do aparelho e lavada três vezes com TBST (0,1% v/v) antes de incubação com 10 ml de cabra anti-camundongo IgG (molécula 10 total)-AP (5.000 vezes) por 1 hora à temperatura ambiente. A membrana é lavada três vezes com TBST antes de desenvolvimento de cor usando um Kit de Substrato de Fosfatase Alcalina (Bio-Rad). A membrana é lavada com água de torneira quando desenvolvimento suficiente ocorreu, secada e es- caneada para apresentação.

A análise de western blot mostra um aumento significante na

reatividade de anticorpo nos camundongos para os antígenos de vacina re- combinantes seguindo vacinação. Todos os camundongos reconhecem pro- teínas recombinantes que são similares em peso molecular àquelas proteí- nas recombinantes purificadas manchadas de coomassie azul. Estes expe- 20 rimentos proporcionam evidência que as proteínas recombinantes são imu- nogênicas quando usadas para vacinar camundongos e que o protocolo de vacinação empregado pode induzir circulação específica de titulações de anticorpo contra o antígeno. Os resultados indicam que as proteínas recom- binantes podem ser úteis em uma vacina eficaz para espécies de animal de 25 serem colonizadas por B. kyodysenteriae.

Vacinação de porcos usando as proteínas his-etiauetadas recombinantes purificadas

Para dada uma das proteínas his-etiquetadas purificadas re- combinantes, dez porcos soro-negativos são injetados intramuscularmente com 1 mg do antígeno particular em 1 ml de volume de vacina. O antígeno é emulsificado com um volume igual de um adjuvante de água em óleo. Os porcos são vacinados em três semanas de idade e novamente em seis se- manas de idade. Um segundo grupo frequentemente soro-negativo é usado como controles negativos e são deixados não-vacinados. Todos os porcos são desafiados com 100 ml de uma cultura ativa de B. kyodysenteriae (~109 células/ml) em oito semanas de idade, e os porcos são observados para si- 5 nais clínicos de disenteria suína durante o experimento (até seis semanas pós-desafio) e no exame post-morten.

Kit de diagnóstico

Soro é obtido de porcos em um chiqueiro com infecção conheci- da de B. kyodysenteriae, de porcos conhecidos para não terem sido infecta- dos com B. kyodysenteriae, e de porcos em chiqueiro com infecção não- conhecida com B. kyodysenteriae. Vinte μς de proteína purificada recombi- nante são carregados em um poço IEF de 7 cm, eletroforizada através de 10% (p/v) de gel de SDS-PAGE, e eletrotransferida para membrana de nitro- celulose. A membrana é bloqueada com leite em espuma de TBS (5% p/v) e montada no aparelho de multi-classificação (Bio-Rad). Os poços são incu- badas com 100 μΙ de soro de porco diluído (100 vezes) por 1 hora à tempe- ratura ambiente. A membrana em seguida é removida do aparelho e lavada três vezes com TBST (0,1% v/v) antes de incubação com 10 ml de cabra antissuíno IgG (molécula total)-AP (5.000 vezes) por 1 hora à temperatura ambiente. A membrana é lavada três vezes com TBST antes de desenvol- vimento de cor usando um Kit de Substrato de Fosfatase Alcalina (Bio-Rad). A membrana é lavada com água de torneira quando desenvolvimento sufici- ente ocorreu, secada e escaneada para apresentação. Pode-se determinar se os porcos infectados com B. hyodysenteriae por comparação dos resulta- dos para o controle positivo e negativo.

Enquanto esta invenção foi descrita com uma referência a con- cretizações específicas, será óbvio àqueles técnicos na técnica que varia- ções nestes métodos e composições podem ser usadas e que é pretendido que a invenção pode ser praticada de outro modo do que conforme especifi- 30 camente descrita aqui. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações envolvidas dentro do espírito e escopo da invenção conforme definida pelas reivindicações.

Claims (44)

1. Polinucleotídeo compreendendo a seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1,3,5,7,9, 11, 13, 15, 17 , 19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, e 65.

2. Plasmídeo, compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

3. Plasmídeo, de acordo com a reivindicação 2, no qual o referi- do plasmídeo é um vetor de expressão.

4. Célula contendo o plasmídeo como definido na reivindicação 2.

5. Célula contendo o plasmídeo como definido na reivindicação 3.

6. Composição imunogênica compreendendo o plasmídeo como definido na reivindicação 3.

7. Composição de vacina para o tratamento ou prevenção de Brachyspira kyodysenteriae compreendendo o vetor de expressão como de- finido na reivindicação 3.

8. Composição de vacina para o tratamento ou prevenção de Brachyspira kyodysenteriae compreendendo a célula como definido na rei- vindicação 4.

9. Molécula de DNA compreendendo uma seqüência que é pelo menos 70% idêntica ao polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

10. Plasmídeo, compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 9.

11. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação 9, no qual referida molécula de DNA é pelo menos 80% idêntica ao polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

12. Plasmídeo, compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 11.

13. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação 9, no qual referida molécula de DNA é pelo menos 90% idêntica ao polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1.

14. Plasmídeo, compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 13.

15. Polipeptídeo, compreendendo a seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 , 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, e 66.

16. Polinucleotídeo, compreendendo uma seqüência que codifi- ca o polipeptídeo como definido na reivindicação 15.

17. Plasmídeo, compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 16.

18. Plasmídeo, de acordo com a reivindicação 17, no qual referi- do plasmídeo é um vetor de expressão.

19.Célula contendo o plasmídeo como definido na reivindicação 17.

20. Composição imunogênica compreendendo a célula como definida na reivindicação 19.

21. Proteína compreendendo uma seqüência que é pelo menos 70% homóloga ao polipeptídeo como definido na reivindicação 15.

22. Proteína, de acordo com a reivindicação 21, no qual referida proteína é pelo menos 80% homóloga ao polipeptídeo como definido na rei- vindicação 15.

23. Proteína, de acordo com a reivindicação 22, no qual referida proteína é pelo menos 90% homóloga ao polipeptídeo como definido na rei- vindicação 15.

24. Composição imunogênica compreendendo a proteína como definida na reivindicação 23.

25. Composição imunogênica compreendendo o polipeptídeo como definido na reivindicação 15.

26. Composição de vacina para o tratamento ou prevenção de Brachyspira kyodysenteriae compreendendo o polipeptídeo como definido na reivindicação 15.

27. Anticorpo monoclonal que se liga ao polipeptídeo como defi- nido na reivindicação 15.

28. Kit para a diagnose de presença de Brachyspira kyodysente- riae em um animal, referido kit compreendendo o anticorpo monoclonal co- mo definido na reivindicação 27.

29. Kit para a diagnose de presença de Brachyspira kyodysente- riae em um animal, referido kit compreendendo os polipeptídeos como defi- nidos na reivindicação 15.

30. Kit para a diagnose de presença de Brachyspira kyodysente- riae em um animal, referido kit compreendendo os polinucleotídeos como definidos na reivindicação 1.

31. Método de geração de uma resposta imune a Brachyspira kyodysenteriae em um animal compreendendo administrar ao referido ani- mal a composição imunogênica como definida na reivindicação 24.

32. Método de geração de uma resposta imune a Brachyspira kyodysenteriae em um animal compreendendo administrar ao referido ani- mal a composição imunogênica como definida na reivindicação 25.

33. Método de geração de uma resposta imune a Brachyspira kyodysenteriae em um animal compreendendo administrar ao referido ani- mal a composição imunogênica como definida na reivindicação 6.

34. Método de geração de uma resposta imune a Brachyspira kyodysenteriae em um animal compreendendo administrar ao referido ani- mal a composição imunogênica como definida na reivindicação 20.

35. Método de tratar ou prevenir uma doença causada por Bra- chyspira kyodysenteriae em um animal em necessidade de referido trata- mento compreendendo administrar a referido animal uma quantidade tera- peuticamente eficaz da composição de vacina como definida na reivindica- ção 7.

36. Método de tratar ou prevenir uma doença causada por Bra- chyspirakyodysenteriae em um animal em necessidade de referido tratamen- to compreendendo administrar a referido animal uma quantidade terapeuti- camente eficaz da composição de vacina como definida na reivindicação 8.

37. Método de tratar ou prevenir uma doença causada por Bra- chyspira kyodysenteriae em um animal em necessidade de referido trata- mento compreendendo administrar a referido animal uma quantidade tera- peuticamente eficaz da composição de vacina como definida na reivindica- ção 26.

38. Uso da proteína como definida na reivindicação 23, para a preparação de um medicamento para geração de uma resposta imune a Brachyspira kyodysenteriae em um animal.

39. Uso da proteína como definida na reivindicação 15 para a preparação de um medicamento para geração de uma resposta imune a Brachyspira hyodysenteriae em um animal.

40. Uso do plasmídeo como definido na reivindicação 3 para a preparação de um medicamento para geração de uma resposta imune a Brachyspira hyodysenteriae em um animal.

41. Uso da célula como definida na reivindicação 19 para a pre- paração de um medicamento para geração de uma resposta imune a Bra- chyspira hyodysenteriae em um animal.

42. Uso do vetor de expressão como definido na reivindicação 3, para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença causada por Brachyspira hyodysenteriae em um animal em ne- cessidade de referido tratamento.

43. Uso da célula como definida na reivindicação 4, para a pre- paração de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença causada por Brachyspira hyodysenteriae em um animal em necessidade de referido tratamento.

44. Uso do polipeptídeo como definido na reivindicação 15, para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença causada por Braehyspira hyodysenteriae em um animal em necessi- dade de referido tratamento.