MX2011005135A - Cepas de vacuna de brachyspira hyodysenteriae. - Google Patents

Cepas de vacuna de brachyspira hyodysenteriae.

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Matthew I Bellgard
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Abstract

La presente invención se refiere a cepas de vacuna de Brachyspira hyodysenteriae. En particular, la presente invención se refiere a cepas de vacuna vivas aisladas de B. hyodysenteriae que carecen de uno o más factores de virulencia. La presente invención también se refiere a métodos para identificar y preparar cepas de vacuna, así como composiciones de vacuna contra enfermedades diarreicas y métodos y kits para diagnosticar las mismas.

Description

CEPAS DE VACUNA DE BRACHYSPIRA HYODYSENTERIAE Campo de la Invención La presente invención se refiere de manera general a cepas de vacuna de Brachyspira hyodysenteriae.
Antecedentes de la Invención Brachyspira hyodysenteriae es una espiroqueta intestinal anaeróbica que infecta una cantidad de mamíferos y especies aviar de animales y origina enfermedades diarreicas. Un ejemplo bien estudiado es la disentería de cerdo (SD), una enfermedad endémica significativa de cerdos en Australia y a nivel mundial, originada por infección de ß. hyodysenteriae en cerdos. SD es una enfermedad diarreica mucohemorrágica contagiosa, caracterizada por inflamación extensiva y necrosis de la superficie epitelial del intestino grueso. Las pérdidas económicas debido a SD resultan principalmente del retraso en crecimiento, costos de medicamento y mortalidad. Cuando SD se establece en un criadero de cerdos, el espectro de la enfermedad puede variar de ser leve, temporal o no aparente, a ser severo o incluso fatal.
Las estrategias de medicación en criaderos de cerdos individuales pueden cubrir los signos clínicos y en algunos criaderos de cerdos, SD puede no ser notado, o únicamente puede ser sospechado. Si ocurre o no SD obvia, puede persistir B. hyodysenteriae en cerdos infectados o en otros receptores de depósito tales como roedores, o en el ambiente. Todas estas fuentes poseen potencial para transmisión de B. hyodysenteriae a crías no infectadas.
Se emplean un número de métodos para controlar SD, que varían desde el uso profiláctico de agentes antimicrobianos, hasta la eliminación completa de crías infectadas y la prevención del nuevo ingreso de cerdos portadores infectados. Todas estas opciones son costosas y tardadas debido a que para que sean completamente efectivas requieren el uso de pruebas de diagnóstico sofisticadas para monitorear el progreso.
El "estándar de oro" para el control de enfermedades originadas por B. hyodysenteriae, puede ser el uso de una vacuna para proporcionar animales con inmunidad, evitando la colonización y/o enfermedad de B. hyodysenteriae. Históricamente, las vacunas más efectivas y eficaces han sido versiones atenuadas vivas de cepas virulentas de microorganismos. Estas vacunas activan todas las fases de las repuestas y proporcionan inmunidad durable, por ejemplo, no se requieren refuerzos.
Se han realizado intentos para desarrollar vacunas contra B. hyodysenteriae utilizando proteínas inmunogénicas y cepas atenuadas. Sin embargo, las células completas exterminadas de B. hyodysenteriae o las subunidades, administradas en forma intramuscular a animales en pruebas experimentales, tuvieron poco valor de protección. Además, aunque aparecieron antígenos de flagelas periplásmicas recombinantes clonados para conferir protección en un modelo de ratón de SD, la composición falla en proporcionar protección a los cerdos. No existen vacunas efectivas actualmente para la protección contra B. hyodysenteriae .
Breve Descripción de la Invención Los inventores de la presente invención han identificado un número de factores de virulencia B. hyodysenteriae. Estos factores pueden ser utilizados en el desarrollo de vacunas que comprenden cepas B. hyodysenteriae vivas.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una cepa de vacuna viva aislada de B. hyodysenteriae, en donde la cepa de vacuna de B. hyodysenteriae carece de uno o más factores de virulencia.
En algunas modalidades, los factores de virulencia son codificados por una o más secuencias de polinucleótido sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en las SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6.
Por consiguiente, en un segundo aspecto la presente invención proporciona una cepa de vacuna viva aislada de B. hyodysenteriae , en donde la cepa de vacuna de B. hyodysenteriae carece de uno o más factores de virulencia funcionales codificados por una o más secuencias de polinucleótidos sustancialmente similares a una o más secuencias de ácido nucleico ilustradas en las SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6.
En algunas modalidades, la cepa de vacuna viva aislada de B. hyodysenteriae, es una cepa virulenta atenuada, que comprende una modificación que atenúa un factor de virulencia, de modo que la cepa retiene sus propiedades inmunogénicas para ser protectoramente inmunogénica, pero ya no es virulenta.
Los expertos en la técnica podrán apreciar que la cepa virulenta atenuada de B. hyodysenteriae puede ser modificada en cualquier forma que de cómo resultado que la cepa se vuelva atenuada o avirulenta. Por ejemplo, la modificación puede interrumpir la función de los ácidos nucleicos asociados con la virulencia. En algunas modalidades, la modificación da como resultado la reducción o supresión de la expresión mARN de una o más secuencias de polinucleótidos sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO : 5 , o SEC ID NO: 6. o combinaciones de las mismas. En algunas modalidades, la modificación no afecta la expresión, si no que da como resultado la traducción de uno o más productos no funcionales, en donde los productos funcionales son codificados por una o más secuencias de polipéptido sustancialmente similares a una o más secuencias de aminoácido ilustradas en las SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 12.
En algunas modalidades, los factores de virulencia son codificados por secuencias de ácido nucleico que son transportados por plásmido. Por lo tanto, la modificación puede comprender curar la cepa B. hyodysenteriae de uno o más plásmidos que comprenden uno o más factores de virulencia.
En otras modalidades, la cepa de vacuna viva aislada de B. hyodysenteriae, es una cepa avirulenta que ocurre naturalmente, en donde la cepa carece de uno o más factores de virulencia codificados por una secuencia de polinucleótido sustancialmente similar a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en las SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una cepa de vacuna B. hyodysenteriae, en donde la cepa de vacuna es una cepa viva de B. hyodysenteriae con deficiencia de expresión de mARN de una o más secuencias de polinucleótidos sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6 o combinaciones de las mismas, o expresa uno o más productos no funcionales, en donde los productos no funcionales son codificados por una o más secuencias de pol i péptido sustancialmente similares a una o más de las secuencias de aminoácido ilustradas en las SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 12, en donde la cepa tiene propiedades inmunogénicas para ser protectoramente inmunogénicas.
En un cuarto aspecto de la presente invención proporciona un método para preparar una cepa de vacuna viva de B. hyodysenteriae que comprende: (a) seleccionar una cepa virulenta de B. hyodysenteriae; (b) producir una modificación en la cepa virulenta de B. hyodysenteriae para proporcionar una cepa B. hyodysenteriae virulenta atenuada viva; (c) aislar la cepa B. hyodysenteriae virulenta atenuada viva, que contiene la modificación; y (d) seleccionar la cepa ß. hyodysenteriae aislada, en donde la cepa B. hyodysenteriae seleccionada retiene sus propiedades inmunogénicas para ser protectoramente inmunogénicas.
En un quinto aspecto la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende en un vehículo farmacéuticamente aceptable, al menos una cepa de vacuna de B. hyodysenteriae de acuerdo con el primero, segundo y/o tercer aspectos de la presente invención.
En algunas modalidades, la composición de vacuna comprende adicionalmente un adyuvante.
En un sexto aspecto la presente invención proporciona un método para prevenir una enfermedad diarreica en un animal, en donde el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de al menos una cepa de vacuna de acuerdo con el primero, segundo, y/o tercer aspectos de la presente invención.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar la colonización de B. hyodysenteriae virulento en un animal, en donde el método comprende los pasos de: (a) obtener una muestra del animal; y (b) determinar la presencia o ausencia de una o más secuencias de polinucleótidos sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en las SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6 y/o la expresión de mARN correspondiente o productos de proteína codificados, en donde la presencia de los ácidos nucleicos o mARN correspondiente o productos de proteína, indican la presencia de la colonización de B. hyodysenteriae virulento en el animal.
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para clasificar compuestos con la capacidad de inhibir la virulencia de B. hyodysenteriae, en donde el método comprende: (a) transfectar una célula con una construcción de ADN que comprende una o más secuencias de polinucleótidos sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6; (b) contactar la célula transfectada con el compuesto candidato; (c) comparar el nivel de expresión de mARN de una o más de las moléculas de ácido nucleico o el nivel de proteína codificada por la expresión de mARN, en donde la proteína tiene una secuencia de polipéptido sustancialmente similar a una o más de las secuencias de aminoácido ilustradas en las SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 12, en la célula en la presencia y ausencia del compuesto candidato; y (d) interferir de modo que el compuesto candidato sea un inhibidor de virulencia B. hyodysenteriae si existe una expresión de mARN y/o proteína significativamente menor cuando está presente el compuesto candidato, en comparación a cuando el compuesto está ausente.
Quedará entendido que el método de clasificación de la presente invención puede comprender en forma alternativa una construcción de ADN que codifica un gen reportero enlazado en forma operativa a una secuencia de regulación de transcripción o promotor de una o más secuencias de polinucleótido sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en las SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6, en donde el compuesto candidato es un inhibidor de la virulencia 8. hyodysenteriae si existe un producto de gen reportero significativamente menor producido cuando el compuesto candidato está presente en comparación a cuando el compuesto está ausente.
En un noveno aspecto, la presente invención proporciona el uso de una cepa de vacuna de 8. hyodysenteriae en la fabricación de un medicamento utilizado para prevenir infección 8. hyodysenteriae, en donde el uso comprende al menos una cepa de vacuna de acuerdo con el primero, segundo y/o tercer aspectos de la presente invención.
En un décimo aspecto, la presente invención proporciona un equipo para vacunación de un animal contra infección 8. hyodysenteriae, en donde el equipo comprende: (a) una composición de vacuna que comprende, en un vehículo farmacéuticamente aceptable al menos una cepa de vacuna de acuerdo con el primero, segundo y/o tercer aspectos de la presente invención; y (b) instrucciones para vacunar un animal.
En un onceavo aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar una cepa de vacuna candidata de 8. hyodysenteriae, en donde el método comprende los pasos de: (a) obtener una muestra de 8. hyodysenteriae; y (b) determinar la presencia ,o ausencia de una o más moléculas de ácido nucleico codificadas por una secuencia de polipéptido tal como se ¡lustra en la SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6 y/o la expresión de los productos de proteínas mARN correspondientes, en donde la ausencia de los ácidos nucleicos o la expresión del mARN o proteína correspondiente, indican una cepa de vacuna de B. hyodysenteriae .
En un doceavo aspecto, la presente invención proporciona un equipo para diagnosticar la colonización de B. hyodysenteriae virulenta en un animal, en donde el equipo comprende uno o más cebadores PCR que tienen secuencias de polinucleótidos sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ¡lustradas en las SEC ID NOs:55-90.
Descripción Detallada de la Invención Figura 1: Cebadores de oligonucleótidos para la detección PCR de ORF 1 , 2, 6, 7 - 10.
Figura 2: Función putativa de los genes presentes en el plásmido B. hyodysenteriae.
Figura 3: Cebadores de oligonucleótido para la detección PCR de ORF 11-16.
Figura 4: Comparación del contenido de gen de plásmido de cepas virulentas y avirulentas de B. hyodysenteriae utilizando hibridación genómica comparativa a base de microformación y análisis PCR (* = análisis PCR). Los genes que están ausentes en diferentes cepas están sombreados. El cuadro indica los seis genes (ORF 11-16) asociados con la biosíntesis LPS que están presentes en las cepas virulentas pero ausentes en las cepas avirulentas (P = presente; A = ausente).
Figura 5: Porcentaje de cerdos positivos para infección B. hyodysenteriae y para síntomas de disentería de cerdo después de infección con una cepa ß. hyodysenteriae virulenta WA1 (Grupo A) o una cepa de campo no caracterizada de B. hyodysenteriae que no contiene los factores de virulencia codificados mediante ORFs 11-16 (Grupo B).
Figura 6: Niveles de anticuerpos para preparaciones de célula completa de B. hyodysenteriae medidas mediante ELISA antes y después de la exposición ya sea a la cepa B. hyodysenteriae virulenta WA1 (Grupo A), y a una cepa de campo no caracterizada de B. hyodysenteriae que no contenía los factores de virulencia codificados por ORFs 11-16 (Grupo B).
Descripción Detallada de la Invención Antes de describir la presente invención con detalle, quedará entendido que la presente invención no se limita a métodos ejemplificados de manera particular, y por supuesto, puede variar.
También quedará entendido que la terminología utilizada en la presente invención, es con el propósito de describir modalidades particulares de la presente invención únicamente, y no pretende estar limitada, la cual estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Todas las Publicaciones, patentes y solicitudes de patente aquí mencionadas ya sea sufra o ¡nfra, están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. Sin embargo, las Publicaciones aquí mencionadas son con el propósito de describir y detallar los protocolos, reactivos y vectores que son reportados en las Publicaciones y que se pueden utilizar en relación con la presente invención. Nada de lo que aquí se encuentra será construido como una admisión de que la presente invención no está titulada para anteceder dicha descripción en virtud de la invención anterior.
Además, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otra manera, técnicas biológicas inmunológicas y moleculares y farmacología dentro de las habilidades en la técnica. Dichas técnicas son conocidas para los expertos en el arte, y están explicadas completamente en la literatura. Ver por ejemplo, las Publicaciones de Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher y Wingfield "Protocolos Actuales en Ciencia de Proteína" (1999) Volumen I y II (John Wiley & Sons Inc.); Sambrook y asociados, "Clonación Molecular: Manual de Laboratorio" (1989), 2o Edición (Cold Spring Harbor Laboratory press) ; y Prescott, Harley y Klein "Microbiología (1999) , 4o Edición (WBC McGraw-Hill).
Se deberá observar que tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un, una" y "el, la" incluyen referencias pluralidades a menos que el contexto indique claramente de otra manera. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un gen" incluye una pluralidad de dichos genes, y una referencia a un "animal" es una referencia a uno o más animales, y así sucesivamente. A menos que se defina lo contrario, todos los términos, técnicos y científicos aquí utilizados tienen los mismos significados a los comúnmente comprendidos por un experto en la técnica a la cual pertenecen la presente invención. Aunque cualesquiera materiales y métodos similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser utilizados para la práctica o pruebas de la presente invención, a continuación se describen los materiales y métodos descritos.
En el aspecto más amplio de la presente invención, se proporciona una cepa de vacuna de B. hyodysenteriae. B. hyodysenteriae son bacterias anaeróbicas, gram-negativas, quimiotróficas que pertenecen a la clase Spirochaetae y están caracterizadas por su forma larga, delgada, helicoidal. Los animales infectados por B. hyodysenteriae desarrollan enfermedades diarreicas. Los animales porcinos infectados por B. hyodysenteriae , desarrollan disentería de cerdo caracterizada por inflamación extensiva y necrosis de la superficie epitelial del intestino grueso. Por consiguiente, aunque se contempla de manera particular que las vacunas, compuestos y métodos de la presente invención son adecuados para utilizarse en animales porcinos (cerdos y marranos), también aplican a otros mamíferos y especies aviar de animales, incluyendo humanos, animales de compañía tales como perros y gatos, y animales domésticos tales como pollos y gansos, caballos, ganado y ovejas o mamíferos de zoológico tales como primates no humanos, felinos, caninos y bovinos.
La cepa de vacuna de la presente invención, es una cepa viva de B. hyodysenteriae . El término "cepa", tal como se utiliza en la presente invención, describe variantes de una especie bacteriana que puede distinguirse por una o más características, tal como la variación de secuencia de ARN ribosomal, polimorfismo de ADN, tipificación serológica o producción de toxinas, de otras cepas dentro de dichas especies. En la presente invención, las cepas B. hyodysenteriae son distinguidas por su estado de virulencia, es decir, las cepas son clasificadas como virulentas o avirulentas. Los ejemplos de cepas B. hyodysenteriae virulentas incluyen WA1, B204, Vic2, BW1, NSW5, Q17, NSW15, mientras que los ejemplos de cepas avirulentas incluyen B78T, SA2206, VS1 , B234, R301, B6933, FM 88.90 y A1.
En algunas modalidades, la cepa de vacuna es una cepa virulenta atenuada. Los términos "virulento", "virulencia", o equivalentes gramáticos de los mismos, se utilizan en la presente invención para describir cepas de B. hyodysenteriae con la capacidad de originar los síntomas clínicos asociados con las enfermedades diarreicas.
Las características virulentas de una cepa virulenta, resultan de su producción de factores de virulencia. El término "factor de virulencia", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a productos que contribuyen a la virulencia de B. hyodysenteriae o la capacidad de que B. hyodysenteriae origine la enfermedad. Los factores de virulencia pueden ser proteínas o carbohidratos e incluyen coagulasas, colagenasas, hemolisinas y lipopolisacáridos. Por ejemplo, los productos asociados con biosíntesis de ramnosa también pueden ser factores de virulencia. El lipopolisacárido (LPS) consiste en tres distintos dominios estructurales: lípido A, el centro y el antígeno-O. Las funciones de lípido A como una membrana hidrofóbica anclan y forman el componente bioactivo de la molécula. La región del centro consiste en un oligosacárido complejo, el cual, tal como se compara con el antígeno-O, muestra únicamente variabilidad estructural limitada. El antígeno-O comprende la parte más variable del LPS y confiere especificidad de cero tipo de bacteria. Está compuesto de subunidades de azúcar de repetición de uno a ocho azúcares. Cada cadena-O puede contener hasta 50 de estas subunidades. La ramnosa es una porción importante en el antígeno específico-O de LPS que comprende la pared celular y en la cápsula de muchas bacterias patogénicas. La pared celular y la cápsula interactúan con el huésped durante la infección, y son vitales para supervivencia bacteriana. Una pérdida de la porción de carbohidratos en LPS conduce a cepas con una morfología de colonia rugosa. Normalmente, la virulencia de las cepas ásperas se reduce en gran medida y se incrementa su sensibilidad hacia antibióticos o componentes de suero.
Por consiguiente, en algunas modalidades, los factores de virulencia de la presente invención codifican productos que están asociadas con la biosíntesis de ramnosa.
En algunas modalidades, los factores de virulencia están codificados por una o más secuencias de polinucleótido sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en la SEC ID N0.1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 6 o variantes funcionales de las mismas. Los términos "ácido nucleico", "ácido polinucleico" o "polinucleótido" se refieren a la presente invención a ácido desoxiribonucleico y ácido ribonucleico en todas sus formas, por ejemplo, ADN de hebra doble y simple, cADN, mARN y similares.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "sustancialmente similar" se refiere a secuencias de nucleótido equivalentes a las ilustradas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 6, pero que difieren en una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótido, tal como variantes alélicas y también incluirán secuencias que difieren debido a la degeneración del código genético. Las equivalentes también incluirán secuencias de nucleótidos que son "sustancialmente homologas", es decir, al menos aproximadamente 85%, preferentemente al menos aproximadamente 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente 95%, de nucleótidos que coinciden con la longitud definida de las secuencias de nucleótido. Las secuencias que son sustancialmente similares pueden ser identificadas en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, bajo condiciones de rigurosidad alta, media o baja, tal como se define para dicho sistema en particular.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "codifica" en sus diversas formas gramaticales incluyen nucleótidos y/o aminoácidos que corresponden a otros nucleótidos o aminoácidos en el sentido de transcripción y/o traducción.
Una "molécula de ADN de hebra doble" se refiere a la forma polimérica de desoxiribonucleótidos (adenina, guanina, timina, o citosina) en su hélice normal, de hebra doble). Este término se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a cualesquiera formas terciarias particulares. Por lo tanto, su término incluye encontrar ADN de hebra doble, inter alia, en moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción), viruses, plásmidos y cromosomas. En ia descripción de la estructura de las moléculas de ADN de hebra doble particulares, se pueden describir secuencias en la presente invención de acuerdo con la convención normal de proporcionar únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (por ejemplo, la hebra que tiene un homólogo de secuencia con el mARN).
Una secuencia de ADN "corresponde" a una secuencia de aminoácido si la traducción de la secuencia de ADN de acuerdo con el código genético, produce la secuencia de aminoácido (por ejemplo, la secuencia de ADN "codifica" la secuencia de aminoácido). Una secuencia de ADN "corresponde" a otro ADN en secuencia, si las dos secuencias codifican la misma secuencia de aminoácido. Una secuencia de ADN es una secuencia de "variante funcional" de otra secuencia de ADN cuando al menos aproximadamente el 85%, preferentemente al menos aproximadamente el 90%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 95% de los nucleótidos que coinciden en la longitud definida de las secuencias de ADN, y es equivalente a la actividad correspondiente de las proteínas codificadas por las secuencias de ADN. Una longitud de secuencia de ADN que codifica una proteína puede ser referida como un "gen".
El término "atenuado" se utiliza en la presente invención para describir una cepa virulenta de B. hyodysenteriae que ha sido modificada de modo que ya no tenga la capacidad de originar una enfermedad (por ejemplo, la cepa modificada es avirulenta).
El término "viva" se utiliza en la presente invención para describir B. hyodysenteriae que tiene la capacidad de crecer y reproducirse. Por consiguiente, la cepa B. hyodysenteriae viva de la presente invención, debe tener la capacidad de colonizar el colon de un animal, pero no originar los síntomas clínicos asociados con las enfermedades diarreicas originadas por infección B. hyodysenteriae. Además, la cepa viva de la presente invención debe tener la capacidad de réplica limitada en el animal vacunado y de inducir una respuesta inmune protectora que es protectora contra cepas virulentas de B. hyodysenteriae .
Una cepa ß. hyodysenteriae virulenta tal como se describe en la presente invención, puede ser una cepa virulenta clínicamente conocida o una cepa que es identificada como conteniendo factores de virulencia. Por consiguiente, la presente invención también proporciona métodos para identificar cepas B. hyodysenteriae virulentas. Por ejemplo, un primer paso para identificar si una cepa B. hyodysenteriae es una cepa virulenta, es determinar la presencia o ausencia de factores de virulencia en la cepa. En algunas modalidades, estos factores de virulencia son codificados por una o más secuencias de polinucleótidos sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6 o equivalentes funcionales de las mismas. La presencia de un polinucleótido o gen que codifica estos factores de virulencia, puede determinarse mediante el análisis de cualesquiera factores asociados con, o que indican la transcripción y/o traducción del polinucleótido o gen incluyendo, pero sin limitarse a, niveles de expresión de ARN, y niveles de expresión de proteína, así como la presencia de la secuencia de ADN dentro del cromosoma o citoplasma. Las técnicas para identificar la presencia de un polinucleótido o gen o subproducto en una muestra son conocidas por los expertos en la técnica, y se describen en cualquier parte en la presente invención. En algunas modalidades, la presencia de uno o más factores de virulencia en la cepa desconocida indicarán que es una cepa virulenta.
Una vez obtenida, la cepa B. hyodysenteriae virulenta puede ser modificada a través de cualquier número de métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, pasajes de varias veces, atenuación sensible a temperatura, mutación, o similares, de modo que la cepa resultante sea atenuada, es decir, avirulenta, y no tenga la capacidad de originar enfermedad en un animal.
En algunas modalidades, la modificación a la cepa virulenta da como resultado la reducción o supresión de expresión de polinucleótidos o genes que codifican factores de virulencia o conducen a la expresión de factores de virulencia no funcionales.
Existe un número de técnicas conocidas en el arte para reducir o abolir la expresión de polinucleótido. Por ejemplo, se puede introducir una mutación en un sitio predeterminado, tal como la región promotora o dentro de la secuencia de codificación para producir una mutación de no sentido utilizando tecnología de ADN recombinante. Las técnicas de ADN recombinante comprenden clonar el gen de interés, la modificación de la secuencia de gen mediante mutagénesis dirigida al sitio, la digestión de enzima de restricción seguido de re-ligadura y el subsecuente reemplazo del gen tipo natural con el gen mutante.
Las técnicas de ADN recombinante estándar tal como clonación del gen del factor de virulencia en un plásmido, digestión de la secuencia de ADN con una enzima de restricción, seguido de tratamiento de endonucleasa, religadura y recombinación homologa en la cepa huésped, todos son conocidos en la técnica y se describen en la Publicación de ínter alia en Sambrook y asociados, "Clonación Molecular: Manual de Laboratorio" (1989), 2o Edición (Cold Spring Harbor Laboratory press). Las mutaciones dirigidas al sitio, por ejemplo, se pueden realizar por medio de mutagénesis dirigida al sitio in vitro, utilizando el equipo TRANSFORMER® vendido por Clontech. Las técnicas-PCR se describen ampliamente en la Publicación de Dieffenbach & Dreksler (1995) "Manual de Laboratorio de Cebador-A PCR" (Cold Spring Harbour Laboratory Press) y en cualquier parte en dicha Publicación.
En algunas modalidades, se puede introducir una mutación en un sitio predeterminado en el ADN cromosomal o extracromosomal (por ejemplo un plásmido) mediante una inserción, eliminación o una sustitución de un nucleótido por otro, tal como una mutación de punta, que conduce a un gen mutado que tiene expresión reducida o no tiene expresión. La mutación debe producir una cepa B. hyodysenteriae que tiene una capacidad reducida de originar enfermedades diarreicas, tal como disentería de cerdo. Preferentemente, la mutación es una mutación de eliminación, en donde la interrupción del gen es originada por la extirpación de ácidos nucleicos. Dicha mutación, por ejemplo, se puede realizar a través de la eliminación de una extensión contigua de pares base. Incluso eliminaciones muy pequeñas tales como tensiones de 10 pares base, pueden originar que el gen codifique una no proteína o una proteína no funcional. Incluso la eliminación de un par de base simple puede conducir a una no proteína o proteína no funcional, ya que como resultado de dicha mutación, los otros pares base ya no están en la estructura de lectura correcta o la transcripción ha sido medida o disminuida. Más preferentemente, se elimina una extensión más larga, por ejemplo 100 pares base. Incluso más preferentemente, se elimina todo el gen.
Las mutaciones elaboradas en forma bien definida y deliberada que implican la eliminación de fragmentos o todo el gen, o combinaciones de las mismas, tienen la ventaja, en comparación con mutaciones inducidas en forma clásica, de que no revertirán al tipo natural. Por lo tanto, en algunas modalidades de la presente invención, la cepa de vacuna comprende una cepa B. hyodysenteriae virulenta atenuada viva en la cual una mutación en un gen que codifica un factor de virulencia comprende una eliminación o una inserción para interrumpir la secuencia de polinucleótido que codifica el factor de virulencia de modo que no se produzca una proteína correspondiente o la proteína sea no funcional.
Un experto en la técnica también apreciará que habiendo identificado los factores de virulencia de B. hyodysenteriae , puede ser posible, utilizando no más de las técnicas aquí descritas, identificar cepas que ocurren naturalmente de B. hyodysenteriae que son avirulentas o comprenden una o más mutaciones pre-existentes en un polinucleótido o gen que codifica un factor de virulencia que se puede utilizar como cepas de vacunas vivas. Estas B. hyodysenteriae que ocurren naturalmente, una vez aisladas mediante técnicas estándar, si se refiere, pueden ser sometidas a mutagénesis adicional o técnicas de ADN o recombinante, para construir una cepa muíante doble o múltiple. Además, la cepa B. hyodysenteriae puede contener eliminaciones de genes completos que codifican factores de virulencia. En algunas modalidades, la cepa B. hyodysenteriae será una cepa avirulenta tipo natural, que tiene mutaciones de eliminación preexistentes en todos los genes de virulencia.
Las técnicas para identificar bacterias que tienen una o más mutaciones en genes que codifican factores de virulencia, son conocidas por los expertos en la técnica. Por consiguiente, las técnicas de rutina para la detección de cepas B. hyodysenteriae que han sido mutadas a través de las técnicas descritas anteriormente, incluyen manchado Northern y Western, PCR, ELISAs y ensayos de citotoxicidad tal como se describe en cualquier parte en la presente invención. Las cepas mutantes sin genes funcionales que codifican factores de virulencia, también pueden seleccionarse fácilmente tal como se describe en la presente invención.
Los genes que codifican los factores de virulencia de la presente invención pueden ser transmitidos por plásmido. Por consiguiente, en algunas modalidades, la modificación a una cepa B. hyodysenteriae virulenta comprende curar las cepas de uno o más plásmidos. El término "plásmido", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un ADN citoplásmico que se réplica independientemente del cromosoma bacteriano. Se ha desarrollado una variedad de métodos que implican agentes químicos y físicos para eliminar o "curar" plásmidos de una cepa bacteriana. La curación de una cepa bacteriana de un plásmido no implica la eliminación física de plásmido directamente, sino que más bien se refiere a interferir con la réplica y/o división del plásmido para incrementar el rango en el cual ocurren las divisiones libres de plásmido.
Los protocolos estándar para curar plásmidos tal como la exposición de un cultivo bacteriano a concentraciones subinhibidoras de algunos agentes químicos, por ejemplo, naranja de acridina, acriflavina, sulfato dodecilo de sodio o a una temperatura super óptima seguido de selección de derivados curados, todos conocidos en la técnica y descritos ínter alia en las Publicaciones de Sambrook y asociados, "Clonación Molecular: Manual de Laboratorio" (1989), 2o Edición (Cold Spring Harbor Laboratory press). Los plásmidos pueden ser curados a partir de una cepa, por ejemplo, mediante exposición del cultivo a bromuro de etidio. En un ejemplo, las células B. hyodysenteriae, pueden crecer a una fase media-log en cultivo de caldo de soya de tripticasa anaeróbica. Las células posteriormente se diluyen en serie, por ejemplo, en caldo de soya de tripticasa anaeróbica que contiene 30 pg/ml de bromuro de etidio, y se mantiene aproximadamente a una temperatura de 37°C bajo condiciones anaeróbicas con agitación durante aproximadamente 3 días. El cultivo viable de la dilución en serie más alta se diluye en serie en cultivo de caldo de soya tripticasa anaeróbica que contiene 30 pg/ml de bromuro de etidio y se mantiene a una temperatura de 37°C bajo las mismas condiciones durante 3 días. Este proceso se repite al menos otras nueve veces, y después del pasaje final de las células bacterianas se lavan para eliminar el bromuro de etidio y se revisten en un medio de agar, tal como placas de Agar Anaeróbico Fastidioso (LabM) para obtener colonias simples.
Las técnicas para identificar derivados curados son conocidas por los expertos en la técnica. Las técnicas de rutina para su detección, tal como manchado Northern y Western, ensayos ELISAs y de citotoxicidad son conocidos en la técnica.
En un ejemplo, se clasifican colonias simples con respecto a la pérdida de un plásmido mediante PCR. La ausencia de producto PCR para todos los factores de virulencia, en comparación con la presencia de todos los productos en la cepa B. hyodysenteriae tipo natural indica una curación de plásmido exitosa.
Los expertos en la técnica podrán apreciar que estas mismas técnicas pueden ser aplicadas para identificar cepas avirulentas que ocurren naturalmente de B. hyodysenteriae, que carecen de uno o más plásmidos que contienen genes de virulencia.
Los términos "reacción de cadena de polimerasa" o "PCR", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere de manera general a un método para la amplificación de una secuencia de nucleótido deseada in vitro. En general, el método PCR implica ciclos repetidos de síntesis de extensión de cebador en la presencia de reactivos PCR, utilizando dos cebadores de oligonucleótido con la capacidad de hibridar preferentemente a un ácido nucleico de plantilla. Normalmente, los cebadores utilizados en el método PCR serán complementarios a las secuencias de nucleótido dentro de la plantilla en ambos extremos o flanqueo de la secuencia de nucleótido que será amplificada, aunque se pueden utilizar cebadores complementarios a la secuencia de nucleótidos que será amplificada. En algunas modalidades, los cebadores PCR utilizados para identificar la presencia de genes que codifican factores de virulencia, son los establecidos en la figura 3.
También se puede utilizar PCR para determinar si está presente una secuencia específica, utilizando un cebador que enlazará en forma específica a la secuencia deseada, en donde la presencia de un producto de amplificación indica que se formó un complejo de enlace específico. Como alternativa, la muestra amplificada puede ser fraccionada mediante electroforesis, por ejemplo, electroforesis capilar o de gel, se transfiere a un soporte adecuado, por ejemplo nitrocelulosa, y posteriormente se sondea con un fragmento de la secuencia de plantilla.
Los "cebadores de oligonucleótidos", "sondas de oligonucleótido" o "cebadores PCR" son polidesoxinucleótidos de hebra doble o simple, cortos que son químicamente sintetizados a través de métodos conocidos (implican por ejemplo, química de triéster, fosforamidita, o fosfonato). Normalmente, son purificados posteriormente, por ejemplo, mediante electroforesis de gel de poliacrilamida. Los cebadores y sondas de la presente invención son moléculas de ADN que son lo suficientemente complementarias con regiones de residuos de ácido nucleico contiguos dentro del ácido nucleico del gen que codifica un factor de virulencia para hibridarlos, preferentemente bajo condiciones de alta rigurosidad. La definición de las condiciones de hibridación adecuadas está dentro de las habilidades en la técnica. Sin embargo, de manera breve, las "condiciones de rigurosidad" para hibridar o endurecer moléculas de ácido nucleico, son aquellas que (1) emplean una baja resistencia iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo, 0.015M NaCI/0.0015M de citrato de sodio/0.1% de sulfato dodecilo de sodio (SDS) a una temperatura de 50°C, o (2) se emplean durante la hibridación, un agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo, 50% (vol/vol) de formamida con 0.1% de albúmina de suero de bovino/0.1% de Ficoll/0.1% de polivinilpirrolidona/50 mM de amortiguador de fosfato de sodio con un pH 6.5 con 750 mM de NaCI, 75 mM de citrato de sodio a una temperatura de 42°C. Otro ejemplo es el uso de formamida al 50%, 5 X SSC (0.75M de NaCI, 0.075M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6.8), 0.1% de pirofosfato de sodio, 5 X de solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/mL), 0.1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a una temperatura de 42°C, con lavados a una temperatura de 42°C en 0.2 X SSC y 0.1% SDS.
Los cebadores y sondas de ejemplo incluyen oligonucleótidos que tienen al menos aproximadamente 15 residuos de ácido nucleico de longitud y que se seleccionan de cualesquiera de 15 o más residuos contiguos de ADN. Preferentemente, los cebadores y sondas de oligonucleótidos utilizados en algunas modalidades de la presente invención, tienen aproximadamente 20 residuos de ácido nucleico de longitud. En la presente invención, también contempla cebadores y sondas de oligonucleótido que tienen 150 residuos de ácido nucleico de longitud, o son más largos. Los expertos en la técnica considerarán que las condiciones de hibridación de ácido nucleico para lograr la hibridación de un cebador o sonda de una longitud particular a una molécula de ácido nucleico en la presente invención, podrán ser determinados fácilmente. Dichas manipulaciones para lograr condiciones de hibridación óptimas para sondas de diversas longitudes, son conocidas en la técnica. En algunas modalidades, los cebadores de oligonucleótido utilizados para identificar la presencia de genes que codifican factores de virulencia se establecen en la figura 3.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "reactivos de PCR" se refiere a los químicos, además de la secuencia de ácido nucleico de plantilla, necesarios para llevar a cabo el proceso de PCR. Estos químicos consisten generalmente en cinco clases de componentes: (i) un amortiguador acuoso, (ii) una sal de magnesio soluble en agua, (iii) al menos cuatro trifosfatos de desoxiribonucleótido (dNTPs), (iv) cebadores de oligonucleótido (normalmente dos cebadores por cada secuencia de plantilla, las secuencia que define en los extremos 5' de las dos hebras complementarias de la secuencia de plantilla de hebra doble), y (v) una polimerasa de polinucleótido, preferentemente una polimerasa de ADN, más preferentemente una polimerasa de ADN termoestable, es decir una polimerasa de ADN que puede tolerar temperaturas entre 90°C y 100°C durante un tiempo total de al menos 10 minutos, sin perder más de aproximadamente la mitad de su actividad. Un ejemplo de una polimerasa de polinucleótido adecuada, es Polimerasa de ADN HotStarTag (Qiagen).
Las cuatro dNTPs convencionales son trifosfato de timidina (dTTP), trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP), y trifosfato de desoxiguanosina (dGTP). Estos trifosfatos de desoxiribonucleótido convencionales pueden ser suplementados o reemplazados por dNTPs que contiene análogo base, que son los pares base Watson-Crick tipo las cuatro bases convencionales, por ejemplo trifosfato de desoxiuridina (dUTP).
Se puede incluir una etiqueta detectable en una reacción de amplificación. Los nucleótidos etiquetados con biotina se puede incorporar en ADN o ARN mediante técnicas como traducción de nick, medios químicos y enzimáticos y similares. Los cebadores y sondas biotinilados son detectados después de hibridación, utilizando medios de indicación tales como avidina/estreptavidina, agentes que etiquetan en forma fluorescente, enzimas, conjugados de oro coloidales y similares. Los ácidos nucleicos también pueden ser etiquetados con otros componentes fluorescentes, con derivados fluorescentes ¡nmunodetectables, con análogos de biotina y similares. Los ácidos nucleicos también pueden ser etiquetados por medio de adhesión a una proteína. Los ácidos nucleicos reticulados para proteína de enlace de hebra simple de histona fluorescente o radioactiva también pueden ser utilizados. Los expertos en la técnica reconocerán que existen otros métodos adecuados para detectar cebadores y sondas de oligonucleótidos, y otras etiquetas detectables que están disponibles para uso en la práctica de la presente invención. Además, los residuos fluorescentes pueden ser incorporados en oligonucleótidos durante síntesis química. Preferentemente, los cebadores y sondas de oligonucleótidos de la presente invención son etiquetados para hacerlos fácilmente detectables.
Las etiquetas detectables también pueden ser cualquier especie o porción que pueda ser detectada ya sea en forma visual o con la ayuda de un instrumento.
Las etiquetas adecuadas incluyen fluorocromos, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, Rojo de Texas, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluorexceina (6-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceina (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7\4,7-hexaclorofluoresceina (HEX), 5-carboxifluoresceina (5-FAM) o N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), etiquetas radioactivas, por ejemplo, 32P, 35S, 3H, así como otras. Otros grupos de compuestos fluorescentes son las naftilaminas, que tiene un grupo amino en la posición alfa o beta. Incluidos entre los compuestos de naftilamina se encuentran el sulfonato de naftaleno o sulfonato de 1 -dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8-naftaleno y 2-p-touidinil-6-naftaleno. Otras tintas incluyen 3-fenil-7-isocianatocoumarina, acridinas, tales como naranja de acridina de 9-isotiocianatoacridina, N-(p-(2-benzoaxazolil)fenil)male¡mida; benzoxadiazoles, estilbenos, pirenos, y similares. Más preferentemente, los compuestos fluorescentes se seleccionan del grupo que consiste en VIC, fluoresceína de carboxi (FAM), Lightcycler® 640, y Cy5.
La etiqueta puede ser un sistema de dos etapas, en donde el ADN amplificado se conjuga a biotina, haptenos o similares que tienen una parte de enlace de alta afinidad, por ejemplo, avidina, anticuerpos específicos, etc, en donde la parte de enlace es conjugada a una etiqueta detectable. La etiqueta puede ser conjugada a uno o ambos de los cebadores. Como alternativa, el conjunto de nucleótidos utilizados en la amplificación es etiquetado, para incorporar la etiqueta en el producto de amplificación.
La cepa de vacuna de la presente invención debe retener sus propiedades inmunogénicas y ser protectoramente inmunogénica. El término "propiedades inmunogénicas" tal como se utiliza a la presente invención, se refiere a la capacidad que tiene la cepa de vacuna para generar en un animal en desarrollo de una respuesta inmune humoral y/o celular a un antígeno. Para los propósitos de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune transmitida por moléculas de anticuerpo, en tanto que una "respuesta inmune celular" es una transmitida por T-linfocitos y/o otros glóbulos blancos.
Un aspecto importante de inmunidad celular implica una respuesta específica de antígeno mediante células-T citotóxicas ("CTLs"). CTLs tiene especificidad para antígenos de péptido que se presentan en asociación con proteínas codificadas por el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y se expresan en la superficie de las células. CTLs ayuda a inducir y promover la destrucción de microbios intracelulares, o la lisis de células infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de inmunidad celular implica una respuesta específica de antígeno a través de células-T auxiliares. Las células-T auxiliares actúan para ayudar a estimular la función, y se enfocan en la actividad de células efectoras no específicas contra células que despliegan antígenos de péptido en asociación con moléculas MHC en su superficie. Una "respuesta inmune celular" también se refiere a la producción de citocinas, quimiocinas y otras moléculas producidas mediante células-T activadas y/o otros glóbulos blancos, incluyendo los derivados de células T CD4+ y CD8 + .
Una composición o vacuna que provoca una respuesta inmune celular puede servir para sensibilizar a un sujeto a través de la presentación de un antígeno en asociación con moléculas MHC en la superficie celular. La respuesta inmune transmitida por células se dirige en, o cerca de células que presentan antígenos en su superficie. Además, los linfocitos-T específicos de antígenos pueden generarse para permitir la futura protección de un huésped inmunizado.
La capacidad de un inmunogen particular para estimular una respuesta inmunológica transmitida por células, puede determinarse a través de un número de ensayos, tal como mediante ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos de célula citotóxica CTL o mediante el ensayo de linfocitos-T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Dichos ensayos son conocidos en la técnica. Los métodos para medir la respuesta inmune transmitida por células incluyen medir las citocinas intracelulares o la secreción de citocinas mediante poblaciones de célula-T, o a través de la medición de células-T específicas de epítope.
Por lo tanto, el término "propiedades inmunogénicas", tal como se utiliza en la presente invención, puede ser uno que estimule la producción de anticuerpos o provoque la producción de CTLs. Por lo tanto, las propiedades inmunogénicas de la cepa de vacuna de la presente invención puede enunciar uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos mediante células B; y/o la activación de células-T supresoras dirigidas en forma específica a un antígeno, o antígenos presentes en la composición de vacuna de la presente invención. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la inefectividad y prevenir la colonización de las bacterias en el intestino, y/o transmitir el complemento-anticuerpo, o la citotoxicidad de célula dependiente de anticuerpo (ADCC) para proporcionar protección a un huésped inmunizado. Por consiguiente, las propiedades inmunogénicas de la cepa de vacuna son "protectoramente inmunogénicas".
En algunas modalidades, el método para preparar una cepa de vacuna no comprende únicamente los pasos de seleccionar una cepa virulenta y producir una modificación en la cepa virulenta, sino también los pasos de aislar y seleccionar la cepa B. hyodysenteriae virulenta atenuada viva que contiene la modificación. Los métodos para aislar y seleccionar cepas modificadas de B. hyodysenteriae, son conocidas en la técnica y se describen en la presente invención.
Una vez producida la cepa de vacuna de la presente invención, puede ser administrada a un animal para prevenir la disentería originada por colonización de B. hyodysenteriae. En algunas modalidades, a un animal se le administra una cantidad efectiva de al menos una cepa de vacuna de B. hyodysenteriae.
Las cepas de vacuna de la presente invención pueden administrarse en dosis y mediante técnicas conocidas para los expertos en las artes médicas o veterinarias, tomando en consideración factores tales como la edad, sexo, peso, especie y condición del animal receptor, y la ruta de administración. La ruta de administración puede ser percutánea, a través de administración a mucosas (por ejemplo, oral, nasal, basal, anal, vaginal) o mediante una ruta parenteral (¡ntradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa, o intraperitoneal). Las cepas de vacuna pueden ser administradas solas, o pueden administrarse junto con o administrarse en secuencias con otros tratamientos o terapias. Las formas de administración pueden incluir suspensiones, jarabes, o elíxires y preparaciones para administración parenteral, subcutánea, ¡ntradérmica, intramuscular, intravenosa (por ejemplo, administración inyectable tal como suspensiones o emulsiones estériles).
Las cepas de vacuna pueden administrarse como un rocío o mezclarse en alimentos y/o agua, o proporcionarse en mezcla en adiciones con un transportador, diluyente, adyuvante o excipiente adecuado tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las cepas de vacuna pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsificación, agentes de amortiguación de pH, adyuvantes, aditivos de aumento de gelatinización o viscosidad, conservadores, agentes de saborización, colores y similares, dependiendo de la ruta de administración y la preparación deseada. Se pueden consultar textos farmacéuticos estándar, tal como "Ciencias Farmacéuticas de Remington" (1990), Edición 18 (Mack Publishing Co.), para preparar preparaciones adecuadas sin experimentación indebida.
La cepa de vacuna de la presente invención también se puede utilizar en la preparación de una composición de vacuna. En algunas modalidades, dicha composición de vacuna comprende al menos una de las cepas de vacuna de 8. hyodysenteriae aquí descritas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención también proporciona en algunas modalidades, el uso de una cepa de vacuna de B. hyodysenteriae en la fabricación de un medicamento utilizado para prevenir infección de B. hyodysenteriae . Los transportadores farmacéuticos para preparación de composiciones farmacéuticas en medicamentos son conocidos en la técnica, tal como se establece en los libros de texto tales como "Agentes Farmacéuticas de Remington" (1990), Edición 18 (Mack Publishing Co.)- Los métodos para administrar condiciones de vacuna también son conocidos en la técnica y se describen anteriormente.
La presente invención también proporciona, en algunas modalidades, un método de vacunación contra infección B. hyodysenteriae mediante la administración de una cantidad efectiva de la composición de vacuna. Lógicamente, la presente invención también proporciona un método para conferir inmunidad a un animal, tal como un cerdo, contra infección B. hyodysenteriae administrando al animal una cantidad efectiva de la composición de vacuna descrita anteriormente.
Las composiciones tal como se describen en las modalidades de la presente invención, pueden ser parte de un equipo. Normalmente el equipo también puede incluir instrucciones de USO.
La presente invención también se refiere a un método para diagnosticar la colonización de B. hyodysenteriae virulenta en un animal. En algunas modalidades el método comprende obtener una muestra de un animal del que se sospecha tiene una infección de B. hyodysenteriae.
Una "muestra" se refiere a un tejido, fluidos biológicos u otros materiales de un animal que se sospecha contienen B. hyodysenteriae, o sus polinucleótidos o sus polipéptidos. Los ejemplos de dichos tejidos, fluidos o materiales se incluyen pero no se limitan a plasma, suero, materia fecal, orina, material de biopsia que incluye muestras de estómago de intestino. La muestra también debe incluir constituyentes de cultivo celular.
Si un animal es colonizado con una cepa virulenta de 8. hyodysenteriae puede determinarse evaluando la presencia o ausencia de polinucleótidos o genes que codifican los factores de virulencia tal como se describe. La presencia de un gen puede ser determinada mediante el análisis de cualesquiera factores asociados con, o que indican la transcripción y traducción de un gen que incluye pero no se limita a niveles de expresión de ARN y niveles de expresión de proteína, así como la presencia de un secuencia de ADN dentro del cromosoma o en forma extracromosomal.
Las técnicas para identificar la presencia de un gen o subproducto en una muestra, son conocidas para los expertos en la técnica. Las técnicas de rutina tales como manchado Nortern y Western, PCR, microformaciones y ELISAs son conocidas en la técnica y se describen en la presente invención. En una modalidad, la presencia de genes que codifican factores de virulencia dentro de una cepa, se pueden determinar mediante ELISA. Los protocolos en los cuales los ensayos ELISA pueden estar basados e incluyen, por ejemplo, ensayos de competición, ensayos de reacción directa y ensayos tipo emparedado. En ensayos ELISA, se pueden agregar muestras que incluyen, por ejemplo, fluidos y tejido biológico a depósitos recubiertos con péptido, por ejemplo, en una charola de microtitulación en donde se forma un complejo inmunológico si están presentes anticuerpos en la muestra. Se puede agregar un medio de generación de señal para detectar la formación del complejo. Se produce una señal detectable si están presentes anticuerpos específicos en la muestra.
Por ejemplo, las placas de microtitulación pueden ser recubiertas con péptidos B. hyodysenteriae que corresponden a factores de virulencia, por ejemplo, en un amortiguador de carbonato. Se permite que el recubrimiento ocurra durante la noche en una cámara humidificada en una temperatura de aproximadamente 4°C. Las placas pueden ser bloqueadas con PBS-BSA con mezclado y lavadas con PBST. Se agrega suero de cerdo diluido a las placas y se incuba. Las placas posteriormente pueden ser lavadas antes de agregarse, por ejemplo, IgG-HRP anti-cerdo de cabra. El substrato TMB K-Blue posteriormente puede agregarse y permitir que ocurra el desarrollo de color antes de detenerse con la adición de ácido sulfúrico. La densidad óptica de cada depósito puede ser leída posteriormente. La existencia de color en este ejemplo puede ser indicativo de que están presentes anticuerpos específicos de factores de virulencia B. hyodysenteriae en la muestra, y por lo tanto el animal está colonizado con una cepa virulenta de B. hyodysenteriae.
También se puede utilizar un dispositivo de punto de atención en la forma de una prueba mediante flujo, para diagnosticar si un animal están colonizado con una cepa virulenta de B. hyodysenteriae. En una prueba de flujo, se agrega una muestra biológica a una membrana de microcelulosa en la cual se inmovilizan anticuerpos para factores de virulencia, y cuando una muestra pasa a través de la membrana, los polipéptidos se enlazan a los anticuerpos inmovilizados para formar complejos inmune. Cuando una solución que incluye anticuerpos secundarios etiquetados pasa a través de la membrana, enlaza a los complejos inmune. En una prueba de tira, una vez que se agrega una muestra biológica, la muestra biológica pasa a través de una región que incluye anticuerpos etiquetados, y los polipéptidos enlazan a anticuerpos etiquetados para formar complejos inmune.
Cuando una muestra biológica pasa a través de una región que incluye un anticuerpo de fase sólida, los polipéptidos se enlazan a los complejos inmune. La cantidad de anticuerpos secundarios detectados en la región con anticuerpos inmovilizados, muestra la presencia o ausencia de factores de virulencia en la muestra.
En la presente invención también se refiere a un método para clasificar compuestos con la capacidad de modular la virulencia de una cepa B. hyodysenteriae. En algunas modalidades el método de clasificación, evalúa el potencial de los compuestos para modular la expresión o dirigir la actividad de factores de virulencia B. hyodysenteriae .
El término "compuestos" incluye preferentemente, pero no se limita a moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que enlazan a un polinucleótido y/o polipéptido que codifica un factor de virulencia, de modo que la actividad de expresión del factor de virulencia u objetivo del mismo, es inhibida o suprimida. Los compuestos potenciales pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido, tal como una proteína relacionada en forma cercana o un anticuerpo que enlaza al mismo sitio(s) en una molécula de enlace.
El término "compuestos" también incluye potencialmente moléculas pequeñas que enlazan a, y que ocupan el sitio de enlace de un polipéptido de factor de virulencia, evitando de esta forma el enlace a moléculas de enlace celulares, de modo que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas tipo péptido. Otros ejemplos de antagonistas de polipéptido potenciales incluyen anticuerpos o en algunos casos, oligonucleótidos o proteínas que están relacionadas en forma cercana con los ligandos, substratos, receptores, enzimas, etc, como puede ser el caso del polipéptido, por ejemplo, un fragmento de un ligando, substrato, receptor, enzima, etc; o moléculas pequeñas que enlazan al polipéptido de la presente invención, pero no provocan una respuesta, de modo que se evita la actividad del polipéptido. Otros compuestos potenciales incluyen moléculas antisentido, ver por ejemplo la Publicación de "Oligodesoxinucleótidos" como Inhibidores Antisentido de Expresión de Gen" (1988) CRC Press, para una descripción de estas moléculas.
En algunas modalidades, puede ser deseable inmovilizar cualesquiera de los polipéptidos que codifica factores de virulencia o sus moléculas o ligandos objetivo, para acomodar la automatización del ensayo. El enlace de un compuesto de prueba a una proteína que codifica un factor de virulencia (o fragmento, o variante del mismo) o interacción de dicha proteína con una molécula o ligando objetivo en la presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede lograr en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos.
Los ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de microtitulación , tubos de prueba y tubos de micro-centrifugación.
En algunas modalidades, se puede proporcionar una proteína de fusión que agregue un dominio que permita que una o ambas de las proteínas se enlacen a una matriz. Las técnicas para inmovilizar proteínas en matrices son conocidas en la técnica.
En algunas modalidades, el método comprende el uso de una construcción de ADN que codifica un gen reportero bajo el control de una secuencia reguladora de transcripción o un promotor de un gen codificado de una secuencia de polinucleótido ilustrada en SEC ID NO:1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5 o SEC ID NO: 6. Las células que contienen la construcción se contactan con un compuesto que será probado y la cantidad de señal producida por el gen reportero medida. Si la cantidad del producto de gen reportero producido es menor a la producida por células de control no expuestas al compuesto, el compuesto tiene la capacidad de inhibir la virulencia B. hyodysenteriae.
A continuación se describió la presente invención por medio de la referencia únicamente a los siguientes ejemplos no limitantes. Sin embargo deberá quedar entendido, que los ejemplos que se encuentran a continuación son únicamente con propósitos ilustrativos, y no deberán ser tomados en forma alguna como una restricción de la generalidad de la invención descrita anteriormente.
Ejemplo 1 Secuenciación de genoma Se secuenció con pistola de disparo un aislado de B. hyodysenteriae (cepa WA1) de un campo de porcino Australiano. Esta cepa ha sido bien caracterizada y ha mostrado ser virulenta después del estimulo experimental de los cerdos. Se creció la espiroqueta en cultivo de caldo de soya de tripticasa anaeróbico, y se extractaron 100 pg de ADN utilizando un método de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) para preparar ADN de alto peso molecular, de alta calidad adecuado para la preparación de bibliotecas de ADN genómico. El ADN genómico fue cortado utilizando un GeneMachines Hydroshear, y el ADN fragmentado fue procesado para clonarse para el protocolo recomendado por los proveedores del sistema del vector pSMART (Lucigen). Se construyó una biblioteca de injerto pequeño (2-3 kb) y una biblioteca de inserto medio (3-10 kb) en la versión de copia de bajo nivel del vector pSMART y se secuenciaron clones aleatorios utilizando el secuenciador de ADN AB 3730 para proporcionar al menos una cobertura 8x del genoma. Para cerrar en forma adicional la secuencia de genoma, se prepararon bibliotecas de pistola de disparo para Roche GS-FLX del ADN genómico con un tamaño de inserto promedio de 500 pb. Se secuenciaron clones aleatorios de esta biblioteca utilizando el secuenciador de ADN Roche GS-FLX. Finalmente, se utilizó un cebador que recorre entre secuencias contiguas no enlazadas, para terminar la secuencia de genoma.
Ejemplo 2 Anotación Todas las secuencias de genoma de B. hyodysenteriae fueron ensambladas y anotadas por la Instalación de Investigación de Genoma Australiana (Australian Genome Research Facility) (AGRF) en Queensland y en la Universidad de Murdoch a través de Centro de Genómicos Comparativos (Centre for Comparative Genomics) (CCG). Se utilizó un rango de herramientas de bioinformáticas de dominio para analizar y reanalizar las secuencias como parte de un procedimiento de aseguramiento de calidad en el análisis de datos. Se anticiparon cuadros de lectura abierta (ORFs) utilizando una variedad de programas que incluyen GeneMark, GLIMMER, ORPHEUS, SELFID y GetORF. Se revisaron ORFs putativos para homología (ADN y proteína) con base de datos internacionales existentes utilizando búsqueda que incluyen BLAST y FASTA. Se llevaron a cabo análisis filogenéticos y otros análisis de evolución molecular con los genes identificados y con otras especies, para ayudar en la asignación de la función. El análisis in silico del genoma secuenciado parcialmente, produjo una lista integral de todos los ORFs anticipados presentes en los datos de secuencia disponibles.
La combinación de datos de las diferentes plataformas de secuenciación para el genoma B. hyodysenteriae, da como resultado la identificación de una genoma de 3,000,694 pb y un plásmido extracromosomal circular de 35,940 pb. El genoma fue anticipado para codificar 2,551 ORFs y el plásmido codifica 32 ORFs. La comparación de los ORFs anticipados con genes presentes en las bases de datos de ácido nucleico y proteína indica que aproximadamente el 70% de los ORFs anticipados tuvo homología con genes contenidos en las bases de datos. El restante 30% de los ORFs no tienen identidad conocida. Las funciones putativas de los 32 genes anticipados presentes en el plásmidos se muestran en la figura 2. La mayoría de estos genes tienen funciones asociadas con la biosíntesis de envoltura celular, y en forma específica, la biosíntesis de lipopolisacárido (LPS).
Ejemplo 3 Análisis de Microensavo y Análisis de PCR Los GeneChips acostumbrados están diseñados y fabricados por Affymetrix, utilizando los ORFs anticipados del genoma B. hyodysenteriae y la secuencia de plásmido. De los 2,551 ORFs codificados en el genoma, 1718 están representados en el GeneChip, y 25 de los 32 ORFs codificados en el plásmido, están representados por el chip. Se utilizó un análisis de hibridación genómica comparativo a base de microformación (CGH), para comparar el contenido de gen de seis cepas B. hyodysenteriae altamente virulentas (cepas B204, BW1, Vic2, NSW5, NSW15 y Q17), y ocho cepas de baja virulencia (cepas B234, SA2206, VS1, A1, B78T, R301, B6933 y F 88.90) con el contenido de gen de la cepa B. hyodysenteriae WA1, también una cepa altamente virulenta. Las cepas virulentas han sido reportadas por originar diversos signos clínicos de SD en cerdos infectados en forma experimental y natural. Se han reportado cepas avirulentas para colonizar cerdos sin originar signos clínicos significativos de SD. Se extrajo ADN de alto peso molecular de células B. hyodysenteriae utilizando el equipo de Sangre y Tejido de DNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se digirió el ADN de alto peso molecular, purificado, con enzimas de restricción Rsa , y los fragmentos de restricción resultantes fueron etiquetados con una tinta de cianuro fluorescente (Cy3) utilizando el sistema de Etiquetación Genómica de Formación CGH BioPrime (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos del genoma etiquetado fueron hibridizados al GeneChip de B. hyodysenteriae bajo condiciones moderadamente estrictas (37°C) en el Horno de Hibridación 645 (Affymetrix) durante 16 horas. Los GeneChips fueron lavados y etiquetados utilizando el Equipo de Hibridación, Lavado y manchado de GeneChip (Affymetrix) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó la Fluidics Station 450 (Affymetrix) para llevar a cabo el lavado y manchado de los GeneChips. Finalmente, se escaneó el GeneChip hibridado utilizando el escáner 3000 (Affymetrix) y la imagen compuesta se analizó utilizando el Software Operación GeneChip (GCOS, Affymetrix).
Para los siete ORFs de plásmido no representados por el GeneChip, se diseñaron tres pares de cebador únicos para la amplificación PCR de cada ORF (tabla 1). El ADN de alto peso molecular de todas las cepas utilizadas en el análisis de microformación CGH se sometió a reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando la Polimerasa de ADN HotStarTag (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La temperatura de endurecimiento utilizada para cada cebador se ajustó a 5°C menos que la temperatura de endurecimiento óptimo para permitir un similar al de la hibridación de microformación. Los productos de amplificación fueron electroforesis a través de un gel de agarosa, manchada con bromuro de etidio y vistos a través de luz ultravioleta. La presencia de uno o más productos de un ORF, fue indicativa de la presencia de dicho ORF en el plásmido.
La comparación del contenido de gen de plásmido de las cepas virulentas y avirulentas se muestran en la figura 4. Estos resultados indican que todas las cepas analizadas poseen el plásmido, excepto las cepas avirulentas A1 y FM88.90. Para las cepas que poseen el plásmido, están presentes ORFs 1-10, 17-24 y 26-32 en todos los plásmidos. La distribución de ORF 25 fue variable entre las cepas y no se correlaciona con su virulencia. Los ORFs 11-16 estuvieron presentes en el plásmido de las cepas virulentas pero estuvieron ausentes en el plásmido de las cepas avirulentas. Estos resultados indican que ORFs 11-16 codifica los factores de virulencia.
Por consiguiente, las cepas sin los factores de virulencia funcional identificados pueden ser útiles como cepas de vacuna viva. Además, la detección de ORFs 11-16 en una cepa de virulencia desconocida puede proporcionar un medio útil para determinar si la cepa fue virulenta. En forma similar, la evaluación de la presencia de factores de virulencia identificados, se puede utilizar para diagnosticar si un sujeto está infectado o no con una cepa virulenta de B. hyodysenteriae.
Ejemplo 4 Eliminación de plásmido ("curación") Se crecieron células WA1 de la cepa B. hyodysenteriae para la fase media-log en cultivo de caldo de soya de tripticasa anaeróbica. Las células se diluyeron en serie en caldo de soya de tripticasa anaeróbica que contiene 30 pg/ml de bromuro de etidio y se mantuvieron a una temperatura de 37°C bajo condiciones anaeróbicas con agitación durante 3 días. El cultivo viable de la dilución en serie más alta se diluyó en serie en cultivo de caldo de soya de tripticasa anaeróbica que contiene 30 pg/ml de bromuro de etidio y se mantuvo a una temperatura de 37°C bajo las mismas condiciones durante tres días. Este proceso se repitió otras nueve veces y después del pasaje final se lavaron las espiroquetas para eliminar el bromuro de etidio, y se revistieron en placas de Agar Anaerobico Selectivo (LabM) para obtener colonias simples.
Ejemplo 5 Clasificación de clones con plásmidos curados Las colonias simples obtenidas a través del pasaje medio y líquido que contiene bromuro de etidio, se clasificaron mediante PCR para la pérdida de plásmido. Se diseñaron tres pares de cebador que dirigen los ORFs 11-16 para el proceso de clasificación (figura 3). Se escogieron células de 48 colonias en amortiguador Tris-EDTA y se agregaron como plantilla en reacciones PCR utilizando cada uno de los seis conjuntos de cebador. Las reacciones PCR se llevaron a cabo utilizando polimerasa de ADN HotStarTag (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ausencia de producto PCR para todos los conjuntos de cebador, en comparación con la presencia de todos los productos en la cepa B. hyodysenteriae WA1 tipo natural, indicaron una curación de plásmido exitosa.
Ejemplo 6 Infección experimental de cerdos con una cepa de campo de B. hyodysenteriae que no contiene factores de virulencia (ORFs 11-16) Se compraron treinta y seis cerdos macho castrados (Large White x Landrace x Duroc) de aproximadamente 18 kg de peso corporal en un criadero de cerdos comercial que está libre de disentería de cerdo. Los cerdos fueron pesados, se etiquetaron en la oreja, y se tomaron muestras fecales y se cultivaron para excluir la posible presencia de Brachyspira hyodysenteriae . Los cerdos fueron asignados en forma aleatoria a dos grupos: i) Grupo A: doce cerdos que fueron estimulados con cepa WA1 S. hyodysenteriae virulenta, es decir, una cepa que contenía los factores de virulencia identificados anteriormente en el Ejemplo 3 (ORFs 11-16); y ii) Grupo B: veinticuatro cerdos que fueron estimulados con una cepa de campo no caracterizada previamente de B. hyodysenteriae que no contenía los factores de virulencia identificados anteriormente en el Ejemplo 3 (ORFs 11-16), es decir una cepa anticipada para ser avirulenta.
Cada grupo fue alojado en un solo corral, en una habitación diferente a la de un alojamiento de animales de aislamiento. Se mantuvieron los protocolos de bioseguridad estrictos para evitar la transmisión de infección entre las habitaciones. Los cerdos fueron alimentados ad libidum en una dieta de cerdos criados en libertad que no contenía antibióticos.
Dos semanas después de la llegada, los cerdos del Grupo A se estimularon mediante un tubo estomacal con 100 mi de un caldo que contiene la cepa B. hyodysenteriae WA1 crecida para fase-log exponencial (~108/ml). En la misma forma, los cerdos del grupo B fueron estimulados con 100 mi de un caldo que contiene la cepa de campo no caracterizada de B. hyodysenteriae, crecida para fase-log exponencial (~108/ml). Para ambos grupos, se repitió el estímulo durante tres días consecutivos.
Después del estímulo, los cerdos fueron observados diariamente con respecto a signos clínicos consistentes con disentería de cerdo, particularmente la presencia de diarrea que contenía sangre y moco fresco. Los cerdos que desarrollaron signos clínicos de disentería de cerdo fueron eliminados. Se tomaron isopos de bacteriología de heces rectales de todos los cerdos dos veces a la semana, y los isopos fueron cultivados en forma anaeróbica en agar selectivo. El experimento terminó 4 semanas después del estímulo experimental. Se recolectó sangre de la vena yugular antes del primer día del estímulo, y post-mortem, o al final del experimento. El suero fue eliminado y utilizado para análisis serológicos en un ELISA.
Ejemplo 7 Cultivo de espiroqueta Se rayaron los isopos de bacteriología en placas de agar de Soya de Tripticasa que contiene 5% (v/v) de sangre de becerro desfibrinada, 400 pg/ml de espectinomicina y 25 pg/ml de cada uno de colistina y vancomicina. Estas placas fueron incubadas a una temperatura de 39°C en un ambiente aeróbico durante siete días. Las espiroquetas fueron identificadas como B. hyodysenteriae sobre la base de una fuerte hemólisis-beta y morfología microscópica. Se subcultivaron un subconjunto de aislados y se confirmaron como B. hyodysenteriae , utilizando PCR específico de la especie.
Once de los 12 cerdos (92%) en el Grupo A, arrojaron B. hyodysenteriae en sus heces durante el período experimental y desarrollaron signos de disentería de cerdo. En el grupo B, 13 de los 24 cerdos (54%), arrojaron B. hyodysenteriae y desarrollaron disentería de cerdo (ver figura 5). Estas diferencias en el patrón de arrojamiento y la enfermedad entre los dos grupos fue estadísticamente significativo (P=0.031; prueba exacta de Fisher). No hubo diferencia en el grado de patología de volumen encontrada en los intestinos gruesos de los cerdos con disentería en los dos grupos.
Por consiguiente, la cepa de campo no caracterizada de B. hyodysenteriae que no contenía los factores de virulencia identificados en el Ejemplo 3 (ORFs 11-16), colonizaron significativamente menos cerdos, y significativamente menos animales desarrollaron enfermedad después del estímulo, en comparación con la cepa con los factores de virulencia. Este hallazgo indica que ORFs 11-16 son importantes en facilitar la colonización y permitir el desarrollo de la enfermedad, soportando que la afirmación de que ORFs 11-16 codifica factores de virulencia. Estos resultados también demuestran la utilidad de ORFs 11-16 en determinar si la cepa de B. hyodysenteriae es virulenta o avirulenta.
Ejemplo 8 ELISA serolóqico Se recubrieron placas de microtitulación con 100 µ? por depósito de células completas de B. hyodysenteriae sonicadas y aclaradas (1 g/ml) en amortiguador de carbonato (pH 9.6). Las células fueron de la misma cepa utilizada en las infecciones respectivas. Se dejó que ocurriera el recubrimiento durante la noche a una temperatura de 4°C. Las placas fueron bloqueadas con 150 µ? de PBS-BSA (1% p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con mezclado y posteriormente se lavaron tres veces con 150 µ? de PBST (0.05% v/v). Los sueros de cerdo fueron diluidos 400 veces en 100 µ? de PBST-BSA (0.1% p/v) y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con mezclado. Las placas fueron lavadas (tal como se describió anteriormente) antes de agregar 100 µ? de IgG anti-cerdo de cabra (molécula completa)-HRP diluido 50,000 veces en PBST-BSA (0.1% p/v). Después de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron y se agregaron 100 µ? de substrato TMB. Se permitió que ocurriera el desarrollo de color durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de detenerse con la adición de 100 µ? de 500 mM de ácido sulfúrico. La densidad óptica de cada depósito se leyó en 450 nm.
Los cerdos de ambos grupos tuvieron un nivel de línea de base similar de anticuerpos para preparaciones de célula completa de B. hyodysenteriae , antes del estímulo experimental. En el grupo A, 8 de los 12 cerdos mostraron un incremento en los niveles de anticuerpo entre el tiempo de estímulo experimental y el final del experimento, aunque todo el grupo, el incremento en los niveles de anticuerpo no fue significativo. En el grupo B, 21 de 24 cerdos mostraron un incremento en niveles de anticuerpo, y fue significativo el incremento del grupo en niveles de anticuerpo (p<0.001) (ver figura 6).
Por consiguiente, la exposición a la cepa de campo de B. hyodysenteriae que no contiene los factores de virulencia, dio como resultado una respuesta inmune sistémica evidenciada por un incremento significativo en los niveles de anticuerpo postinfección B. hyodysenteriae. Estos resultados indican que una cepa B. hyodysenteriae que no comprende los ORFs 11-16 no tiene propiedades inmunogénicas y puede inducir a inmunidad protectora contra una infección de B. hyodysenteriae (por ejemplo, protectoramente inmunogénica), incluso aunque tenga capacidad reducida de colonizar cerdos y originar una enfermedad. Por lo tanto, estos resultados soportan la afirmación de que las cepas de B. hyodysenteriae sin ORF funcionales, pueden ser útiles como cepas de vacuna viva.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Una cepa de vacuna viva aislada de B. hyodysenteriae, en donde la cepa de vacuna de B. hyodysenteriae carece de uno o más factores de virulencia.
2. Una cepa tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque los factores de virulencia son codificados por una o más secuencias polinucleótido sustancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6.
3. Una cepa de vacuna viva aislada de B. hyodysenteriae , en donde la cepa de vacuna de B. hyodysenteriae carece de uno o más factores de virulencia funcionales codificados por una o más secuencias de polinucleótido substancialmente similares a una o más secuencias de ácido nucleico ilustradas en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6.
4. Una cepa tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizada porque la cepa de la vacuna viva aislada de B. hyodysenteriae es una cepa virulenta atenuada, que comprende una modificación que atenúa un factor de virulencia de modo que la cepa retenga sus propiedades inmunogénicas para ser protectoramente inmunogénica, pero ya no es virulenta.
5. Una cepa tal como se describe en la reivindicación 4, caracterizada porque la modificación da como resultado la reducción o supresión de la expresión mARN de una o más secuencias de polinucleotido substancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO. 4, SEC ID NO. 5, o SEC ID NO: 6, o combinaciones de las mismas.
6. Una cepa tal como se describe en la reivindicación 4, caracterizada porque la modificación da como resultado la traducción de uno o más productos no funcionales, en donde los productos funcionales son codificados por una o más secuencias de polipéptido substancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido en la SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 12.
7. Una cepa de vacuna tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 2 a la 6, caracterizada porque una o más secuencias de polinucleotido son transportadas en el plásmido.
8. La cepa de vacuna tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizada porque la modificación resulta de la curación del plásmido de B. hyodysenteriae.
9. Un método para preparar una cepa de vacuna viva de B. hyodysenteriae caracterizado porque comprende: (a) seleccionar una cepa virulenta de B. hyodysenteriae; (b) producir una modificación en la cepa virulenta de B. hyodysenteriae para proporcionar una cepa B. hyodysenteriae virulenta atenuada viva; (c) aislar la cepa B. hyodysenteriae virulenta atenuada viva que contiene la modificación; y (d) seleccionar la cepa B. hyodysenteriae aislada, en donde la cepa B. hyodysenteriae seleccionada retiene sus propiedades inmunogénicas para ser protectoramente inmunogénica.
10. Una composición de vacuna que comprende en un vehículo farmacéuticamente aceptable al menos una cepa de vacuna de B. hyodysenteriae tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8.
11. Una composición de vacuna tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizada porque la composición de vacuna comprende adicionalmente un adyuvante.
12. Un método para prevenir una enfermedad diarreica en un animal, en donde el método comprende administrar al animal una cantidad efectiva de al menos una cepa de vacuna de B. hyodysenteriae tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8 o una composición de vacuna tal como se describe en las reivindicaciones 10 ó 11.
13. Un método para diagnosticar una colonización de B. hyodysenteriae virulenta en un animal, en donde el método comprende los pasos de: (a) obtener una muestra del animal; y (b) determinar la presencia o ausencia de una o más secuencias de polinucleótido substancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6 y/o la expresión del mARN correspondiente o productos de proteína codificados, en donde la presencia de los ácidos nucleicos o mARN correspondiente o productos de proteína indican la presencia de colonización de B. hyodysenteriae virulenta en el animal.
14. Un equipo para diagnosticar la colonización de B. hyodysenteriae virulenta en un animal, en donde el equipo comprende uno o más cebadores PCR que tienen secuencias de polinucleótido substancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en las SEC ID NOs: 55-90.
15. Un método para clasificar compuestos con la capacidad de inhibir la virulencia de B. hyodysenteriae , en donde el método comprende: (a) transfectar una célula con una construcción de ADN que comprende una o más secuencias de polinucleótido substancialmente similares a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6; (b) contactar la célula transfectada con el compuesto candidato; (c) comparar el nivel de expresión de mRNA de una o más de las moléculas de ácido nucleico o el nivel de proteína codificada por la expresión de mARN, en donde la proteína tiene una secuencia de polipéptido substancialmente similar a la una o más secuencias de aminoácido ilustradas en las SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 12, en la célula en la presencia y ausencia del compuesto candidato; y (d) inferir que el compuesto candidato es un inhibidor de virulencia B. hyodysenteriae, si existe significativamente menos expresión de mARN y/o proteína, cuando el compuesto candidato está presente en comparación a cuando el compuesto candidato está ausente.
16. Un método para clasificar compuestos con la capacidad de inhibir la virulencia de B. hyodysenteriae, en donde el método comprende: (a) transfectar una célula con una construcción de ADN que codifica un gen reportero enlazado en forma operativa a una secuencia reguladora de transcripción o promotor de una o más secuencias de ADN substancialmente similar a una o más de las secuencias de ácido nucleico ilustradas en SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, o SEC ID NO: 6; (b) contactar la célula transfectada con el compuesto candidato; (c) comparar el nivel de expresión de gen reportero en la célula en la presencia y ausencia del compuesto candidato y (d) inferir que el compuesto candidato es un inhibidor de virulencia B. hyodysenteriae , si existe significativamente menos expresión de gen reportero cuando el compuesto candidato está presente en comparación a cuando el compuesto está ausente.
17. El uso de una cepa de vacuna de B. hyodysenteriae en la fabricación de un medicamento utilizado para prevenir infección de B. hyodysenteriae , en donde el uso comprende al menos una cepa de vacuna tal como se describe en la reivindicación 1.
18. Un equipo para la vacunación de un animal contra infección de B. hyodysenteriae , en donde el equipo comprende: (a) una composición de vacuna que comprende en un vehículo farmacéuticamente aceptable al menos una cepa de vacuna tal como se describe en la reivindicación 1 y (b) instrucciones para vacunar un animal.
19. Un método para identificar una cepa de vacuna candidata de ß. hyodysenteriae, en donde el método comprende los pasos de: (a) obtener una muestra de B. hyodysenteriae; y (b) determinar la presencia o ausencia de una o más moléculas de ácido nucleico codificadas con una secuencia de polipéptido tal como se ilustra en la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6 y/o la expresión de los productos de mARN o proteína correspondientes, en donde la ausencia de los ácidos nucleicos o expresión del mARN o proteína correspondiente, indica una cepa de vacuna de B. hyodysenteriae.
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