ES2248647T3 - Metodos y composiciones para la identificacion de cerdos geneticamente resistentes a enfermedades relacionadas con e. coli f18. - Google Patents

Metodos y composiciones para la identificacion de cerdos geneticamente resistentes a enfermedades relacionadas con e. coli f18.

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Abstract

Método para identificar un cerdo que es resistente a la colonización intestinal por E. coli F18 que es capaz de unirse al ECF18R en cerdos, comprendiendo dicho método las etapas siguientes: a. determinar si un polimorfismo genético, en el que una base nitrogenada en la posición 307 del gen alfa (1, 2) fucosiltransferasa 1 del cerdo es adenina, o un polimorfismo en asociación alélica con el polimorfismo FUT1 que presenta adenanina en la posición 307, está en una muestra biológica del cerdo; e b. inferir que el cerdo es resistente si el cerdo es homocigoto para el polimorfismo FUT1 o para un polimorfismo en desequilibrio de ligamiento con éste.

Description

Métodos y composiciones para la identificación de cerdos genéticamente resistentes a enfermedades relacionadas con E. Coli F18.
Se proporcionan composiciones y métodos no invasivos para la identificación de cerdos genéticamente resistentes a enfermedades asociadas a E. coli, en particular a las enfermedades intestinales asociadas a una cepa de bacterias E. coli que presentan las fimbrias F18. Se identificaron los polimorfismos de ADN del gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa (FUT1) del cerdo que diferencian los cerdos resistentes de los cerdos sensibles y proporcionan un método diagnóstico útil para los criadores de cerdos.
Uno de los problemas principales de la cría del cerdo es mantenerles libres de enfermedades. Los trastornos intestinales que aparecen después del destete representan un problema particular. El número de serotipos de cepas de Escherichia (E.) coli toxígenas causantes de la enfermedad del edema y la diarrea postdestete que aparecen en el cerdo es limitado. Son los microorganismos causantes de graves pérdidas económicas en especial entre los cochinillos de 4 a 12 semanas de edad en las granjas de cría de cerdos de todo el mundo. Los síntomas típicos de la enfermedad del edema son los signos neurológicos como ataxia, convulsiones y parálisis. En la exploración postmortem el edema está típicamente presente en localizaciones características como son los párpados y la frente, la pared gástrica y el mesocolon. Las enfermedades se deben a una variante de la toxina II de tipo Shiga y a las enterotoxinas LT, STa y STb, respectivamente, producidas por E. coli que colonizan la superficie del intestino delgado sin producir cambios morfológicos en los enterocitos (las células intestinales). Algunos tipos de cepas bacterianas de E. coli, como F18 F4 y K88, son los agentes patógenos mortales principales a este respecto. "La enfermedad del edema porcina es una enterotoxemia caracterizada por daño vascular generalizado. Esto último a causa de una toxina, la variante de la toxina II de tipo Shiga, producida por algunas cepas de E. Coli." ("Oedema disease of pigs is an enterotoxaemia characterized by generalized vascular damage. The latter is cause by a toxin. Shiga-like toxin-II variant produced by certain strains of E. coli") (Bertschinger et al., 1993). Las bacterias E. coli se distinguen por los tipos de sus pili. Los grupos de fimbrias adhesivas que están relacionados entre sí se denominan de forma similar, por ejemplo, K88 ó F18 (Vögeli et al., 1997).
No todos los cerdos sucumben a las infecciones por E. coli. La colonización depende de la adherencia de la bacteria a los enterocitos, que está mediada por las fimbrias bacterianas denominadas, por ejemplo, K88 o F18. Se ha demostrado que la sensibilidad a la adhesión, es decir, la expresión de los receptores en el cerdo para la unión de las fimbrias, está genéticamente controlada por el huésped y que se hereda como un rasgo dominante que, en el caso de la cepa F18, B es el alelo de la sensibilidad y b es el alelo de la resistencia (Vögeli et al., 1996; Meijerink et al., 1997). El locus genético para este receptor F18 de E. coli (ECF18R) se ha cartografiado en el cromosoma porcino 6 (SSC6), basado en su estrecha ligazón genética con el locus S y otros loci del grupo halotano (HAL) del cromosoma 6. El receptor para K88 de E. coli se encuentra en el cromosoma 13.
El mecanismo de la resistencia parece residir en que los bordes intestinales de los animales resistentes no se colonizan por E. coli, es decir, las bacterias no se adhieren a las paredes intestinales de los cerdos resistentes. Los receptores glucoproteicos de la membrana del borde en cepillo del intestino aparecen como responsables de las diferencias entre los fenotipos adhesivos y no adhesivos relacionados con algunas cepas de E. coli, y por tanto, el genotipo del cerdo huésped determina la resistencia. También se han estudiado las bacterias con fimbrias (WO 9413811).
Los métodos actuales de identificación de los cerdos que son resistentes a la enfermedad asociada a E. coli F18 consisten en 1) obtener muestras intestinales a partir de los cerdos en el matadero y realizar una prueba de adhesión microscópica, 2) estimular a los animales con E. coli virulento ("prueba de colonización"), o 3) determinar el tipo sanguíneo en el sistema A-0 (S). Los primeros dos métodos no son prácticos para identificar a los animales resistentes en las granjas de crianza y, aunque el método de tipado de sangre identifica a los animales resistentes, la prueba no puede determinar si los animales sensibles son homocigotos o heterocigoto para la sensibilidad. Es esencial conocer el genotipo de los animales con respecto a estos alelos (situaciones de un gen) para desarrollar un programa de crianza de éxito. El objetivo del programa de crianza consiste en producir cerdos que sean resistentes a las enfermedades asociadas a E. coli F18 que diezman las piaras después del destete.
En una publicación, los autores afirmaban que, en referencia a la enfermedad edematosa del cerdo, "Hay investigaciones en marcha para encontrar los marcadores genéticos adecuados." ("Searches are underway for appropriate genetic markers.") (Bertschinger et al., 1993, página 87) y, citando a Walters y Sellwood, 1982:
La cría de cerdos resistentes es un método atractivo para prevenir enfermedades para las cuales no se dispone de una profilaxis eficaz. La viabilidad de este abordaje dependerá de la prevalencia del gen o genes que codifican la resistencia en la población de cerdos, de los métodos mejorados para la detección de los cerdos resistentes, y ausencia de rasgos genéticos negativos que se seleccionen junto a esta resistencia.
Un locus "marcador" genético es un locus que codifica o no codifica, pero que está cercano al locus genético de interés, pero no es necesariamente el locus en sí mismo. Los fenotipos detectables incluyen rasgos continuos o discontinuos, como, por ejemplo, los polimorfismos de longitud del fragmento de restricción, los rasgos de producción, los rasgos de adhesión bacteriana, las reacciones calorimétricas o enzimáticas y la resistencia a antibióticos. El locus S controla la expresión de los antígenos de grupos sanguíneos A y 0. Los cerdos homocigotos recesivos en el locus S no expresan ninguno de ambos antígenos de grupo sanguíneos A o 0. En el hombre se presenta una situación similar, que se debe a mutaciones en el gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa que codifica el grupo sanguíneo humano H (Kelly et al., 1994; véase también WO 9628967). Recientemente, se ha secuenciado el gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa porcina (Cobney et al., 1996). Este gen es, muy probablemente, el gen presente en el locus S del cerdo.
Se ha obtenido el mapa genético del grupo sanguíneo H y del locus Se, situándose físicamente en el cromosoma humano 19q13.3. Esta región se ha conservado durante la evolución y contiene genes homólogos a los del grupo de genes HAL en los cerdos. El grupo sanguíneo H que codifica el gen es el denominado FUT1, mientras que el gen Se es equivalente al gen FUT2. El gen FUT1 determina la expresión del antígeno H en la línea celular eritroide, mientras que el gen FUT2 regula la expresión del antígeno H en los epitelios secretores y la saliva. Se ha demostrado la conservación del gen FUT1 en mamíferos inferiores como la rata y el conejo, así como la expresión del ARNm en el tejido del cerebro de conejo y en el colon de rata. En todas estas especies se han descrito dos tipos de genes de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa que son estructuralmente muy similares a los genes FUT1 y FUT2 humanos, pero en particular los genes homólogos FUT1 muestran un patrón de expresión específico de la especie. En el hombre, el gen FUT1 es responsable de la síntesis de los antígenos H en los precursores de los eritrocitos. No obstante, los eritrocitos absorben pasivamente los antígenos de tipo H desde el suero en los cerdos, como sucede con los antígenos de Lewis en el hombre. En los cerdos, todos los antígenos de tipo H están relacionados con los tejidos secretores exocrinos y se observa la expresión del gen FUT2 (Secretor) en los tejidos secretores de otras especies animales. Por lo tanto, los determinantes de la expresión del grupo sanguíneo A-0 porcino que dan una reacción cruzada con los anticuerpos contra los grupos sanguíneos H y A podrían estar influidos por el gen
FUT2.
Se dispone de más información sobre los grupos sanguíneos y las enfermedades por E. coli en el cerdo, como que las estructuras de carbohidratos de los antígenos de grupo sanguíneo median la adhesión de algunos microorganismos patógenos en los tejidos del huésped, por ejemplo, Helicobacter pylori se adhiere a los antígenos de grupo sanguíneo de Lewis^{b}, y las E. coli que causan infecciones de las vías urinarias se adhieren a la sustancia P del grupo sanguíneo. Los genes que codifican las glucosiltransferasas que son responsables de la formación de las estructuras de carbohidratos específicas del grupo sanguíneo representan, por tanto, los genes candidatos para el control de la colonización bacteriana por parte del huésped. La localización de estos genes se sitúa en la misma región cromosómica que el locus responsable de la adhesión o no adhesión de E. coli F18 positiva en el intestino delgado del cerdo. El cerdo no expresa los antígenos de grupo sanguíneo A y 0 hasta después del destete, que es el mismo momento en el que se hacen sensibles a la enfermedad causada por E. coli F18.
Se necesitan nuevos métodos de diagnóstico y tratamiento para las enfermedades intestinales relacionadas con E. coli en el cerdo. Se propuso la detección de una mutación genética como prueba diagnóstica en alguna afección del cerdo (hipertermia maligna) (Fujii et al., 1991; Patente US nº 5.358.649), pero no se han descrito marcadores polimórficos para el diagnóstico. Se han descrito vacunas para desarrollar resistencia frente a la colonización por E. coli (Patente US nº 5.552.144; WO 8604604), pero es improbable que sea un método preferido para prevenir la enfermedad por E. coli por las dificultades que tiene la administración de una vacuna de gérmenes vivos por vía oral al cerdo recién nacido y por las restricciones legales. Existen antibióticos para el tratamiento, pero no existe una profilaxis satisfactoria.
Sumario de la invención
Las composiciones y métodos no invasivos de la presente invención permiten la detección y eliminación de cerdos que son sensibles a las enfermedades asociadas a E. coli. Un método no invasivo que permite identificar a un cerdo que es resistente a la colonización intestinal por E. coli F18 comprende las etapas siguientes: determinación de la presencia de un polimorfismo genético asociado a la resistencia a la colonización en una muestra biológica procedente del cerdo; y presunción de que el cerdo es resistente si es homocigoto para el polimorfismo^{1}.
Más en particular, el método comprende determinar en una muestra biológica procedente del cerdo si la base nitrogenada que se encuentra en la posición 307 en el gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa del cerdo es sólo adenina o si tiene guanina; e identificar al cerdo como resistente si la única base nitrogenada de la posición 307 es adenina.
Para determinar la presencia de un polimorfismo en una muestra biológica, se analizan los polimorfismos de longitud del fragmento de restricción en un gel que los separa según su peso molecular. Las endonucleasas de restricción son enzimas que cortan de una forma reproducible las moléculas de ácido nucleico en lugares específicos, dando lugar a fragmentos de ácido nucleico de diferentes pesos moleculares, dependiendo de la localización de los cortes.
La invención también se refiere a un método para criar cerdos para que sean resistentes a las enfermedades asociadas a E. coli al seleccionar para la cría a los cerdos que tengan un polimorfismo genético en el gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa 1 que les identifique como animales resistentes a las enfermedades intestinales relacionadas con E. coli; y a la cría de los cerdos seleccionados.
\newpage
Un aspecto de la invención es una molécula de ADN que es polimórfica para el gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa 1 en el cerdo, en particular una secuencia de acuerdo a la mostrada en la Figura 1. Otros aspectos de la invención se refieren a moléculas que tienen secuencias de nucleótidos complementarias a la mostrada en la Figura 1.
Un aspecto de la invención se refiere a una molécula de ADN aislada con una sustitución de guanina por adenina en la posición 307. Esta molécula puede también unir una sustitución de guanina por adenina en la posición 857. Otras moléculas de ADN aisladas de la presente invención son aquellas que tienen una mutación en la posición del nucleótido 229 de la secuencia de la Figura 1, en la cual el codón CTT se cambia por TTT, que codifica el aminoácido fenilalanina en lugar de leucina. Una mutación en la posición del nucleótido 714 procede del cambio GAT \rightarrow GAC, pero no se acompaña de una sustitución del aminoácido en el producto codificado.
Los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN de la presente invención y que tienen actividad alfa (1,2) fucosiltransferasa también son otros aspectos de la invención.
Un método molecular para la detección de los receptores F18 de E. coli en el cerdo se utiliza para (a) aislar el ADN a partir de las células porcinas nucleadas; (b) amplificar el ADN una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando oligonucleótidos como cebadores que son complementarios a la secuencia de ADN del gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa 1 porcina; (c) realizar una digestión enzimática de restricción con al menos una enzima de restricción como, por ejemplo, CfoI; (d) separar los fragmentos resultantes mediante electroforesis en gel; (e) determinar los números y longitudes respectivas de los fragmentos que hay en el gel; y (f) determinar los números y longitudes de los fragmentos de F18, cuyos receptores están presentes en las células porcinas. El uso de fragmentos amplificados de mayor tamaño que se revela en el presente documento para el análisis del polimorfismo del tramo de restricción (RFLP), en lugar de fragmentos más pequeños, resulta menos caro debido a que las bandas de ADN se pueden analizar en geles de agarosa de una concentración relativamente baja. Además, para producir algunos de los fragmentos sólo se necesita una enzima de restricción para obtener un lugar de restricción constante adyacente al lugar diagnóstico variable.
Un kit para la detección de los polimorfismos asociados a los receptores F18 de E. coli usa oligonucleótidos en envases diferentes que son complementarios a la secuencia de ADN del gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa 1 porcino, que distingue entre los cerdos resistentes y los cerdos sensibles. La prueba se puede realizar en cerdos de cualquier edad.
Los polimorfismos también son útiles para desarrollar fármacos para el tratamiento de cerdos que tengan la enfermedad asociada a E. coli. Una forma mutada de la enzima alfa 1,2 fucosiltransferasa porcina podría interferir con la enzima normal, previniendo que produzca en el receptor intestinal para F18.
Breve descripción de los dibujos
En la Figura 1 se muestra la secuencia de nucleótidos (FUT1) (líneas inferiores) y la secuencia predicha de aminoácidos (líneas superiores) del polimorfismo de la enzima \alpha1 \rightarrow 2 fucosiltransferasa de la presente invención usando un código de una letra por aminoácido. La doble línea continua que aparece por debajo de las secuencias de aminoácidos (=) señala la posible región transmembrana; la línea de puntos que aparece por debajo de la secuencia de aminoácidos muestra tres posibles lugares de glucosilación unida a N (...).
100 Indica el punto en el que una adenina (A) sustituye a una guanina (G) en los cerdos resistentes.
* Indica el codón de terminación.
Las abreviaturas utilizadas para los residuos de aminoácidos son las siguientes: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; e Y, Tyr.
Descripción de la realización preferida
El análisis molecular de los polimorfismos de ADN asociados a la resistencia del cerdo frente a las enfermedades relacionadas con E. coli facilitó el desarrollo de los métodos diagnósticos que permiten seleccionar los cerdos resistentes para la cría. Los cerdos resistentes difieren de los cerdos sensibles en el locus del receptor F18 de E. coli identificado por los marcadores polimórficos de la presente invención.
La presente invención proporciona métodos no invasivos y composiciones que permiten distinguir con un alto nivel de sensibilidad y especificidad a los cerdos que son genéticamente sensibles a las enfermedades asociadas con la infección por E. coli F18 de los cerdos resistentes. Se identificó un polimorfismo de ADN en el gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa (FUT1) del cerdo que diferencia los cerdos resistentes de los cerdos sensibles. El polimorfismo surgió mediante una mutación (cambio) en una secuencia de nucleótidos que produce un nuevo alelo. Un alelo es una situación de un gen. En una población puede haber muchos alelos de un gen que difieren en las sustituciones de las bases nitrogenadas, presumiblemente provocada por mutaciones en una molécula ancestral del ADN. La existencia simultánea en una población de más de un alelo (en ocasiones, denominado como "variante") es lo que se conoce como polimorfismo genético. Los loci en los cuales puede existir más de un alelo pueden presentarse como componentes aparentemente estables de una población, son los locus polimórficos. Habitualmente, uno de los loci polimórficos es el que tiene una baja frecuencia en la población.
Tal como se puede determinar a partir de una muestra biológica, preferiblemente sangre, los cerdos resistentes tienen un polimorfismo en sus genomas en los que la única base detectada en la posición 307 (véase la Figura 1) en la secuencia de nucleótidos es adenina, mientras que la base en la misma posición de los cerdos homocigotos sensibles es guanina. El cerdo heterocigoto mostrará ambos tipos de ADN y será sensible. El polimorfismo es una variación de la secuencia del gen porcino (Cohney et al. en 1996).
El análisis de ligazón genética se realizó en familias de cerdos y se determinaron las asociaciones genéticas entre los polimorfismos de la FUT1 y la resistencia a la enfermedad en cerdos de distintos orígenes. De acuerdo a la presente invención, se han encontrado polimorfismos en el gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa 1 (FUT1). Se usó un polimorfismo que tiene una única sustitución en la base de nucleótidos en la posición 307 para establecer una estrecha ligazón entre el gen de la fucosiltransferasa y el sistema S, el locus ECF18R y otros loci del grupo de ligazón HAL.
La detección de una estrecha ligazón entre la mutación de la enzima FUT1 y el locus ECF18R permitió el desarrollo de una prueba molecular para identificar los cerdos resistentes a la adhesión de las fimbrias F18 de E. coli, los cerdos heterocigotos (portadores) y los cerdos sensibles homocigotos. Esta prueba diagnóstica identifica con una sensibilidad y especificidad altas a los cerdos que son sensibles a la enfermedad del edema y a la diarrea postdestete. La incidencia de los polimorfismos de la presente invención difiere en cada raza de cerdo. Vögeli et al. (1997) presentaron las frecuencias del alelo M307 en 5 razas de cerdo procedentes de piaras que no estaban relacionadas entre sí. La disponibilidad de la prueba diagnóstica para determinar el polimorfismo de la presente invención proporciona a los criadores la oportunidad de eliminar eficazmente el alelo sensible ECF18R de sus piaras de cerdos, con lo cual se elimina un requisito previo para la adhesión de las bacterias E. coli F18 que provocan enfermedad del edema y diarrea postdestete.
La presente invención también incluye las secuencias de nucleótidos que son variantes de una secuencia del gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa 1 que representan los distintos polimorfismos en el pb 307, así como los kits basados en el diagnóstico molecular para identificar los polimorfismos en el gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa.
Para obtener los genes candidatos para el locus del receptor F18 de E. coli (ECF18R) se aislaron 5 cósmidos y un clon genómico que contenían los genes de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa, FUT1 y FUT2 (Meijerink et al., 1997), a partir de una librería genómica porcina. La cartografía mediante hibridación in situ y fluorescencia situó a todos estos clones en la banda q11 del cromosoma porcino 6 (SSC6q11). El análisis de la secuencia de los cósmidos dio lugar a la identificación de (a) un marco de lectura abierto (ORF), con una longitud de 1098 pares de bases, que es idéntico en un 82,3% a la secuencia de la enzima FUT1 humana, y (b) un segundo ORF, de una longitud de 1023 pares de bases que es idéntica en un 85% a la secuencia de la enzima FUT2 humana. Por lo tanto, parece que los loci FUT1 y FUT2 son los equivalentes porcinos al grupo sanguíneo H y al locus Secretor. La secuenciación directa de los dos ORF en el cerdo tanto sensible como resistente a la adhesión y colonización por E. coli con fimbrias F18 (ECF18R) reveló dos polimorfismos en el par de bases 307 (M307) y en el par de bases 857 (M857) del ORF de la FUT1. Las posiciones del nucleótido se numeran a partir de ATG (que codifica la metionina). El análisis de estas mutaciones en 34 apareamientos de familias de cerdos Landrace con 221 descendientes demostró una estrecha ligazón entre el locus que controla la resistencia y la sensibilidad a la adhesión de E. coli F18 y la colonización en el intestino delgado (ECF18R) y con el locus del inhibidor S del grupo sanguíneo. Por lo tanto, la mutación M307 es un buen marcador para la selección mediante marcadores de los animales resistentes a la adhesión de E. coli F18. Se encontró otra mutación en la posición del nucleótido 229 que provocaba un polimorfismo en el que el codón que codifica la leucina (CTT) se cambió a TTT (que codifica la fenilalanina). Una mutación en la posición 714 (GAT \rightarrow GAC) (que codifica el ácido aspártico) no produjo ninguna sustitución de aminoácido. No se identificaron polimorfismos en la enzima FUT2 que diferenciasen los cerdos sensibles de los resistentes.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos proporcionan realizaciones de la invención.
Ejemplo 1 Un método para cerdos resistentes
Los polimorfismos de la presente invención se pueden identificar fácilmente usando métodos de PCR-RFLP. Una realización de las pruebas utilizó un fragmento de 160 pb de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa 1 porcina amplificada por PCR con los siguientes cebadores; 5'CCAACGCCTCCGATTCCTGT3' y 5'GTGCATGGCAGGCTG
GATGA3'. Las condiciones preferidas de la PCR para esta realización son 25 ciclos con los siguientes tiempos y temperaturas: 94ºC, 30 s; 60ºC, 45 s; 72ºC, 90 s. El ADN amplificado a partir de cerdos resistentes se digirió con la enzima de restricción Hgal, pero no con la enzima de restricción HinPI, mientras que el ADN amplificado a partir de cerdos sensibles homocigotos se digirió con la enzima de restricción HinPI. El ADN amplificado a partir de cerdos sensibles heterocigotos se sometió a una digestión parcial con ambas enzimas.
Como alternativa, se aisló el ADN a partir de células nucleadas porcinas siguiendo los procedimientos estándar. La secuenciación directa de las secuencias de FUT1 y FUT2 porcinas y sus regiones flanqueadoras en animales de genotipos ECF18R diferentes (Bb, bb) dio lugar a la identificación de dos transiciones G \rightarrow A en las posiciones 307 y 857 (denominadas M307 y M857, respectivamente) del ORF de FUT1. La transición M307 elimina un locus de transición para CfoI. La amplificación del ADN aislado a partir de células nucleadas porcinas se efectuó de acuerdo a los procedimientos estándar utilizando cebadores P6 y P11 (3 min a 95ºC, 30 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 56ºC y 30 s a 72ºC, seguido por una extensión final de 7 min a 72ºC) seguida por digestión de CfoI y separación en gel de agarosa al 3%, dando lugar a un polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP). Los animales M307^{AA} homocigotos mostraron 2 bandas, los animales M307^{GG} homocigotos mostraron fragmentos de 93-, 241- y 87 pb y los animales heterocigotos mostraron los cuatro fragmentos.
Ejemplo 2 Sensibilidad y especificidad de un método que utiliza alfa (1,2) fucosiltransferasa para la detección de cerdos resistentes a E. coli F18
Se realizó un estudio para determinar la asociación entre resistencia a la enfermedad y el polimorfismo en la posición 307 del gen FUT1. Se obtuvieron 183 cerdos destetados (con edades comprendidas entre los 2 y los 6 meses) procedentes de seis piaras de cría diferentes. Sólo una de estas piaras era conocida por contener animales resistentes antes de comenzar el estudio, y se sabe que esta piara tiene una alta incidencia de síndrome de estrés porcino. Las otras 5 piaras no tenían signos de síndrome de estrés porcino y la incidencia de resistencia a la enfermedad era desconocida. Se seleccionaron cerdos al azar de cada piara, se sacrificaron con procedimientos humanitarios y se extrajeron los bazos y se tomaron muestras del intestino delgado. El ADN se extrajo a partir del tejido esplénico y se analizó con el método de PCR-RFLP descrito en el Ejemplo 1. Las células intestinales se purificaron mediante raspado de la superficie mucosa intestinal, lisado de las células en solución hipotónica de EDTA y lavado mediante centrifugación. Los bordes en cepillo purificados de las células intestinales se incubaron con E. coli F18. La mezcla se examinó con microscopio de contraste de fases. Este método determinó si el cerdo era sensible (las muestras intestinales tenían bacterias adheridas) o resistentes (las muestras intestinales no tenían bacterias adheridas). El resultado del método de PCR-RFLP para el polimorfismo se correlacionó con el del método de determinación de la unión entre bacterias y células intestinales en 53 de 53 cerdos resistentes y en 128 de 130 cerdos sensibles. Se había predicho incorrectamente que dos cerdos que se determinaron sensibles usando el método de unión entre bacterias y células intestinales eran resistentes según el método de PCR-RFLP. Dos de las seis piaras examinadas contenían cerdos resistentes, mientras que sólo una piara tenía síndrome de estrés porcino, lo demostró que el método de PCR-RFLP puede identificar animales resistentes a la enfermedad entre animales que no tienen el síndrome de estrés porcino.
Ejemplo 3 Localización del gen de FUT1 en el cromosoma 6 (SSC6)
Los cósmidos ETHs1, -s2, -s3, -s4 y -s6 se identificaron después de una selección en la librería de cósmidos con una sonda de nucleótidos FUT1 obtenida a partir de ADN genómico porcino con cebadores P7 y P10 y se cartografiaron mediante FISH y DISC-PCR en la banda q11 del cromosoma 6.
Ejemplo 4 Identificación del ORF de FUT1 porcina
La hibridación de los productos de digestión de los cósmidos KspI, EcoRI y KspI/EcoRI con los fragmentos radiomarcados P6 y P11 y P7 y P10 de FUT1 porcina para el análisis de transferencia Southern reveló señales de autorradiografía idénticas para ETHs2, -s4 y -s6, mientras que se obtuvieron señales diferentes a partir de los cósmidos ETHs1 y -s3. A partir del cósmido ETHs2 KspI se aislaron los subclones de 940 pb y 6,2 kb de longitud, correspondientes a una longitud estimada de los fragmentos KspI hibridantes en la transferencia Southern. Los resultados de la secuencia de ambos subclones se combinaron para obtener una secuencia de 1501 pb que coincidió con los resultados de la secuenciación directa de los productos genómicos de la PCR. La secuencia de 1501 pb contiene un marco de lectura abierto (ORF) de 1098 pb correspondiente al ORF de FUT1 humana, con una identidad del 82,3% de los nucleótidos y del 80,8% de los aminoácidos. El ORF codifica un polipéptido.
Ejemplo 5 Identificación de la enzima FUT2 y un pseudogen FUT1 porcinos
El cósmido ETHs1 tiene un fragmento de ADN (2,7 kb) que se hibrida con las secuencias FUT1, mientras que el cósmido ETHs3 tiene dos (2,7 kb y 8,2 kb). La subclonación y secuenciación parcial de un fragmento EcoRI de 2,7 kb de los cósmidos ETHs1 y -s3 confirmaron que ambos fragmentos son idénticos. La secuencia es muy similar a la de la enzima FUT2 humana pero muestra varios cambios en las regiones terminales NH_{2}- y -COOH. Estos cambios provocan desplazamientos del marco de lectura que no son compatibles con un ORF conservado, por lo que se supone que la secuencia obtenida a partir del fragmento de 2,7 kb representa un pseudogen (FUT2P). Después de subclonar los productos de la digestión del cósmido ETHs3 BamHI se identificaron las secuencias de hibridación contenidas en el fragmento EcoRI de 8,2 kb. La secuencia de los subclones obtenidos representa un ORF de 1023 pb y es idéntico en un 85% a los nucleótidos y en un 83% al nivel de aminoácidos de la secuencia FUT2 humana. Se observaron muchas diferencias en las regiones terminales NH_{2}- y -COOH entre la secuencia FUT2 porcina y la secuencia FUT2P derivada a partir del fragmento de 2,7 kb. La secuencia de aminoácidos predicha se corresponde con la secuencia de aminoácidos determinada parcialmente de la enzima Secretora porcina (Thurin y Blaszcyk-Thurin, 1995). Las secuencias de FUT1, FUT2, y FUTP porcinas obtenidas se remitieron al GenBank y tienen los números de acceso U70883, U70881 y U70882, respectivamente. Los genes FUT1 y FUT2 tienen secuencias altamente homólogas, lo que se tiene que tener en consideración, por ejemplo, en el desarrollo de cebadores. Además, en estudios futuros se debe diferenciar la actividad de las enzimas FUT1 y FUT2.
Ejemplo 6 Identificación de las mutaciones M307 y M857 e identificación de la mutación M307
El ADN se aisló a partir de células nucleadas porcinas de acuerdo a los procedimientos estándar. La secuenciación directa de las secuencias FUT1 y FUT2 porcinas y sus regiones flanqueadoras en animales de diferentes genotipos ECF18R (Bb, bb) dio lugar a la identificación de dos transiciones G \rightarrow A en las posiciones 307 y 857 (denominadas M307 y M857, respectivamente) del ORF de FUT1. La transición M307 elimina un locus de restricción para la enzima CfoI. La amplificación del ADN aislado a partir de las células nucleadas porcinas se realizó de acuerdo a los procedimientos estándar con los cebadores P6 y P11 (3 min a 95ºC, 30 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 56ºC y 30 s a 72ºC, seguidos por una extensión final de 7 min a 72ºC) seguida por la digestión con CfoI y separación en un gel de agarosa al 3% dio lugar al polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP). Los animales homocigotos M307^{AA} mostraron 2 bandas (fragmentos de 93 y 328 pb), mientras que los animales homocigotos M307^{AA} mostraron fragmentos de 87, 93 y 241 pb y los animales heterocigotos mostraron los cuatro fragmentos.
Ejemplo 7 Identificación de la mutación M857
La mutación M857 es una transición que elimina un locus AciI. El cebador PBEST se diseñó para desemparejar dos loci AciI adicionales en las posiciones 866 y 872. La PCR con cebadores P7 y PBEST (3 min a 95ºC, 30 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 56ºC y 30 s a 72ºC, seguido por una extensión final de 7 min a 72ºC) seguido por la digestión con AciI permite el análisis con PCR-RFLP en un gel de agarosa al 3%. Los animales homocigotos M857^{AA} muestran un fragmento de 174 pb mientras que los productos de amplificación de los animales M857^{GG} muestran fragmentos de 136 y 38 pb.
Ejemplo 8 Cartografía genética del gen FUT1
En las familias de cerdos Landrace los episodios de recombinación entre M307 y los loci del grupo HAL (S, ECF18R, RYR1, GP1, PGD) revelaron fracciones de recombinación \theta<0,04 (Tabla 2). Las razones lod Z para las fracciones de recombinación global se encontraron entre 24,5 y 50,6, mostrando importantes datos de ligazón entre ambos loci. Estos datos permiten obtener la cartografía genética del gen FUT1 en el grupo HAL muy cerca de S y ECR18R, estando ambos influidos por FUT1. En las familias Landrace experimentales se encontró una asociación alélica entre ECF18R y RYR1. Se observó un exceso de genotipos RYR1^{TT} en la posición 1843 en RYR1 (genotipo sensible a halotano) entre los cerdos resistentes a la enfermedad del edema y diarrea postdestete (genotipo ECF18R^{bb}) (Tabla 3). Esta asociación alélica es el resultado del desequilibrio de ligazón, es decir, la desviación de las frecuencias del haplotipo observado con respecto a las frecuencias del haplotipo esperado bajo una agrupación independiente de los alelos. Por lo tanto, el desequilibrio de ligazón designa una asociación no aleatoria de los alelos que pertenecen a los loci ligados. Sin embargo, y debido a las bajas tasas de recombinación, no se pudo determinar que ningún orden de loci fuese significativamente mejor que los demás.
Ejemplo 9 Asociación de M307^{A} con ECF18R^{b} y de M307^{G} con ECF18R^{B}
En los cerdos de padres Landrace (SL) y Large White (LW), el alelo ECF18R^{b} (el alelo de resistencia al edema y a la diarrea postdestete) se asocia en un 100% de los casos con M307^{A} y el alelo ECF18R^{B} (el alelo de sensibilidad al edema y a la diarrea postdestete) se asocia en un 100% con M307^{G} (siendo A= adenina y G= guanina). En los cerdos SL el 88% (30/34) de S^{5} explicó todos los haplotipos ECF18R^{b} y M307^{A}, respectivamente. Los valores correspondientes para S^{5}-ECF18R^{b} y S^{5}-M307^{A} fueron del 82% (9/11) en los cerdos Large White. En las familias experimentales SL la ocurrencia del alelo M857^{A} en el locus FUT1 fue baja, e incluso ausente, entre los cerdos LW. Por lo tanto, no se observó una asociación significativa entre los alelos de M857 y los alelos de los genes flanqueantes. Se encontraron las transiciones G \rightarrow A en las posiciones FUT1 307 y FUT1 857 con frecuencias variables también en los cerdos Duroc, Hampshire y Pietrain, haciendo probable que estas transiciones también se produjeran en estas razas de cerdos.
Ejemplo 10 Distribución de los genotipos FUT1
La Tabla 4 muestra que la distribución de genotipos FUT1 en la posición 307 de los nucleótidos entre los tipos ECF18R era significativamente diferente con respecto al cociente esperado bajo la hipótesis de que ambos son independientes. De los 119 animales ECF18R^{b/b} resistentes a la enfermedad del edema y a la diarrea postdestete, se determinó que 118 tenían un genotipo M307^{A/A} en la prueba del ADN y un animal resistente tenía el genotipo M307^{A/G}. De los 131 cerdos sensibles, 130 eran M307^{A/G} o M307^{G/G} y se demostró que un animal, sensible a la adhesión de E. coli, era homocigoto M307^{A/A} con la prueba del ADN. Los datos procedentes de este ejemplo y del ejemplo 2, junto con estudios anteriores, sugirieron que el gen FUT1 es el gen presente en el locus S del cerdo y en el locus ECF18. Aunque 4 animales de este ejemplo y del ejemplo 2 contradicen esta hipótesis, es probable que el fenotipado de estos animales fuese incorrecto con respecto a la resistencia o sensibilidad de la enfermedad.
Ejemplo 11 Intercambio de aminoácidos en la alfa (1,2) fucosiltransferasa
Los cambios G \rightarrow en los pb +307 y pb +857 del gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa 1 da lugar a una sustitución predicha de aminoácidos de treonina (neutro-polar) en lugar de alanina (neutro-no polar) y glutamina (neutro-polar) en lugar de arginina (básico), respectivamente, lo que podría tener consecuencias funcionales en el producto codificado. El cambio C \rightarrow T en el pb 229 da lugar a una sustitución de aminoácidos de leucina (neutro-no polar) en lugar de fenilalanina (neutro-no polar).
TABLA 1 Secuencias de cebadores anterógrados-(F) e inversos-(R) y su posición relativa con respecto a los codones de inicio FUT1 y FUT2 del cerdo^{2}
Nombre del cebador Secuencia del cebador Posición
FUT1 P6 (R) 5'-CTTCAGCCAGGGCTCCTTTAAG-3' +489
FUT1 P7 (F) 5'-TTACCTCCAGCAGGCTATGGAC-3' +720
FUT1 P10 (R) 5'-TCCAGAGTGGAGACAAGTCTGC-3' +1082
FUT1 P11 (F) 5'-CTGCCTGAACGTCTATCAAGATC-3' +69
FUT1 P16 (F) 5'-AGAGTTTCCTCATGCCCACAGG-3' -90
FUT1 P18 (R) 5'-CTGCTACAGGACCACCAGCATC-3' +1203
FUT1 PBEST (R) 5'-ACCAGCAGCGCAAAGTCCCTGACGGGCACGGCCTC-3' +893
FUT2 P16 (R) 5'-CTCCCTGTGCCTTGGAAGTGAT-3' +1094
FUT2 P17 (F) 5'-AACTGCACTGCCAGCTTCATGC-3' -83
^{2}Los cebadores FUT1 P10 y FUT1 P11 derivan del gen FUT1 humano. 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Fracciones globales de recombinación (\theta), Razones lod (Z) y número de animales informativos (N) para M307 y Loci del grupo HAL en la población experimental de animales Landrace
Par de locus N \theta Z
S-ECF18R 183 0,01 50,6
M307-S 183 0,01 50,6
M307-ECF18R 216 0,01 57,1
M307-RYR1 198 0,02 47,2
M307-GP1 147 0,03 34,2
M307-PGD 147 0,04 24,5
TABLA 3 Frecuencias de haplotipos en los cuatro loci (S-FUT-1 (M307, M587)-ECF18R-RYR1) de la población experimental de animales Landrace (SL) y de los animales Large White (LW) seleccionados al azar
Raza Haplotipo^{3} en S, FUT1(M307, M857), Frecuencia^{4} (número)
ECF18R, RYR1
SL sAGbT 70 (28)
sAGbC 5 (2)
sGGBC 15 (6)
sGABC 10 (4)
LW sAGbC 56 (9)
sGGBC 31 (5)
sGGBC 13 (2)
^{3}S: locus supresor para los tipos de sangre A y 0 (S y s).
\begin{minipage}[t]{150mm} FUT1 (M307): cambio de adenina (A) a guanina (G) en el nucleótido 307 del gen de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa (FUT1). FUT1 (M857): cambio de adenina (A) a guanina (G) en el nucleótido 857 del gen FUT1. ECF18R: receptor F18 de E. coli. El alelo dominante sensible está indicado por B y el alelo resistente, por b. RYR1: receptor de rianodina del músculo esquelético. C (citosina) es el alelo dominante resistente y T (timina) es el alelo sensible de hipertermia maligna.\end{minipage}
^{4}Frecuencias de haplotipos en % y número absoluto de haplotipos entre paréntesis. 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Distribución de los genotipos, correlación tetracórica (R) y significación de la asociación (X^{2} y w x X^{2}) del FUT1 polimórfico asociado (M307) y loci ECF18R en la población experimental Landrace (SL) y cerdos Large White (LW) seleccionados al azar
FUT1/M307
Raza Locus Genotipo A/G A/A r X^{2} X^{2} x w^{5}
SL ECF18R^{6} b/b 1 113 0,98 213,1 42,6***
B/b 106 1
Genotipo A/G
(G/A) G/G A/A
LW ECF19R^{6} b/b 0 5 1,00 29,0 11,6***
B/b, B/B 24 0
^{5} \begin{minipage}[t]{150mm} Se aplicó un factor del peso de w = 0,2 (SL) y 0,4 (LW) para corregir la ausencia de precisión que se genera como consecuencia de la inclusión de animales relacionados en los datos, de acuerdo a Cotterman (1947). *** p<0,001.\end{minipage}
^{6} \begin{minipage}[t]{150mm} Los animales del genotipo b/b del locus ECF18R son resistentes y los del genotipo B/b y B/B son sensibles a la adhesión de las bacterias E. coli F18ab.\end{minipage}
Métodos 1. Cebadores
Se usaron cebadores derivados a partir del gen FUT1 humano para la amplificación de su homólogo porcino a partir del ADN genómico. A partir de las secuencias porcinas resultantes se diseñaron cebadores específicos que se usaron en una amplificación y reacciones de secuenciación posteriores (Tabla 1).
2. Selección de una librería genómica porcina
Las librerías genómicas porcinas se seleccionaron con una sonda de FUT1 porcina obtenida con cebadores P7 y p10 o con un ADNc de FUT1. Se seleccionó una librería genómica porcina, construida con SuperCos 1 (Stratagene, LaJolla, Cal., EE.UU.) con una sonda de FUT1 marcada con dATP \alpha^{32}P (Prime It II, Stratagene) obtenida a partir del ADN genómico porcino mediante cebadores P7 y P10. Después de la hibridación de los filtros de reproducción a 42º C durante 15 h (formamida al 50%, 6 x SSC, 5 x Denhardt, SDS al 0,5%, 0,1 mg/ml de esperma de salmón) y de lavar dos veces a 65º C durante 30 min (1 x SSC, SDS al 0,1%), se identificaron las colonias positivas después de la exposición (15 h, -80º C) a los rayos X.
3. Hibridación in situ de los cromosomas porcinos en metafase
Los clones de cósmidos ETHs1, ETHs2, ETHs3, ETHs4 y ETHs6 se sometieron a hibridación in situ con fluorescencia (FISH) (Solinas Toldo et al., 1993) o PCT cromosómica directa in situ (DISC PCR) en las metafases porcinas. Se determinaron las bandas Q en los cromosomas en metafase y se fotografiaron antes de la hibridación. Las sondas se marcaron mediante cebado aleatorio usando biotina-16-dUTP. La detección y amplificación de la señal se realizó usando avidina-FITC y anti-avidina biotinilada. Los cromosomas se contratiñeron con 4,6-diamidino-2-fenilindol y las posiciones relativas de los cósmidos se determinaron según describe Solinas Toldo, 1993.
4. Subclonación
Los productos de la digestión enzimática de las colonias genómicas positivas con la sonda se separaron en gel de agarosa, se transfirieron a una membrana de nailon y las bandas positivas de la sonda se subclonaron en plásmidos para el secuenciado de FUT1. La secuencia de FUT1 derivada a partir de este método se muestra en la Figura 1.
Los productos de la digestión KspI-, EcoRI- y KspI/EcoRI de todos los cósmidos se separaron en un gel de agarosa al 0,8% y se transfirieron a una membrana de nailon Hybond N (Meijerink et al., 1997). Esta transferencia se hibridó con los productos de la PCR de la enzima porcina FIT1 marcada con dATP \alpha^{32}P (cebadores P6-P11 y P7-P10). A partir de las señales autorradiográficas los cósmidos ETHs1, -s2 y -s3 se sometieron a una nueva subclonación en pBluescript SK- (Stratagene) y se determinaron las secuencias de FUT a partir de los subclones. Las secuencias de los dos marco de lectura abiertos (ORF) de tipo FUT (FUT1 y FUT2) obtenidos a partir de los cósmidos ETHs2 y -s3 se compararon en los animales ECF18R positivos (BB/Bb) y negativos (bb) mediante secuenciación directa de los productos de la PCR.
5. Reacción de polimerasa en cadena y secuenciación directa
Mediante un kit Ready Reaction Dye Terminator de Perkin Elmer (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT., U.S.A.) y 10 pmol de cebador se obtuvo la secuenciación del ciclo con un programa de temperaturas consistente en una desnaturalización inicial de 5 min a 95ºC, seguida por 25 ciclos de 30 s a 95ºC, 15 s a 50ºC y 4 min a 60ºC. Los cebadores usados para la amplificación y secuenciación de los genes porcinos de la enzima alfa (1,2) fucosiltransferasa se presentan tabulados en la Tabla 1. Se diseñaron otros cebadores, teniendo en cuenta la posibilidad de emparejamiento cruzado de los cebadores debido a la elevada similitud existente entre FUT1, FUT2 y el pseudogen FUT2. Las muestras se analizaron en un secuenciador 373A ABI (Applied Biosystems, Inc.) y el análisis de la secuencia se efectuó con el programa GCG (Devereux, 1984).
6. Producción de la descendencia informativa
Se analizaron los polimorfismos de un solo nucleótido en 221 cerdos Landrace producidos a partir de 4 cerdos macho y 16 cerdas paridoras, y en 29 cerdos Large White producidos a partir de 9 apareamientos entre cerdos no relacionados. Para producir un gran número de descendencia informativa para el análisis de ligazón entre los genes porcinos que codifican los receptores ECF18 y los loci polimórficos seleccionados sólo se produjeron apareamientos informativos con cerdos Landrace de tipo B/b x b/b.
7. Prueba de colonización
En un estudio de Bertschinger et al., 1993, también se analizó en una prueba de colonización la sensibilidad a ECF18 de los cerdos Landrace mencionados anteriormente. En esta nueva prueba se inoculó a los cerdos poco después del destete con bacterias de E. coli de la cepa 124/76 serotipo O139:K12(B):H1:F18 (Rippinger y cols, 1995). La siembra fecal de las bacterias se monitorizó diariamente. El alcance de la colonización se calculó como la media de las dos puntuaciones fecales más altas. Los cerdos que tenían una media de la puntuación fecal de 3,5, correspondiente a 6,7 log de unidades formadoras de colonias (CFU)/g o más se consideraron sensibles a la colonización. Este límite se basó en la ausencia de mortalidad por debajo de este valor y en las puntuaciones obtenidas a partir de camadas completamente resistentes.
8. Análisis de ligazón de los polimorfismos de nucleótidos
Los resultados de los polimorfismos de un solo nucleótido se compararon con los datos de tipado de ECF18R, que se identificaron en un método de adhesión in vitro descrito por Vögeli y cols. (1996) y con los datos de tipado de GPI-, PGD-, \alpha-1-B-glucoproteína (AIBG), receptor de rianodina (RYRI) y loci EAH y S según publicaron Vögeli et al. (1996). El análisis de ligazón pareado y los cálculos de las fracciones de recombinación se realizaron con el programa CRI-MAP versión 2,4 (Green et al., 1990). El análisis de ligazón de múltiples puntos se realizó con la inserción secuencial de los loci mencionados en el mapa. Las frecuencias de los haplotipos se calcularon a partir de los progenitores de los animales, en las familias de cerdos Landrace y en 8 progenitores Large White en los que se obtuvo el tipado haploide para ECF18R a partir de la información de la progenie. Las correlaciones tetracóricas de ECF18R y las mutaciones de FUT1 (FUT1/M307) (polimorfismos) se calcularon en todas las progenies Landrace y Large White.
9. Análisis de la transferencia Southern
El análisis de la transferencia Southern se realizó en los cósmidos ETHs1 (1 a 3), ETHs2 (4 a 6) y ETHs3 (7 a 9) después de la digestión con enzimas KspI (1, 4, 7), EcoRI (2, 5, 8) y KspI/EcoRI (3, 6, 9) y separación en gel de agarosa al 0,8%. La hibridación con un fragmento 5' de FUT1 marcado con \alpha^{32}PdATP (cebadores P6-P11) da lugar a la misma banda hibridante de 940 pb tanto en los productos de digestión de KspI (línea 4) como en los de KpsI/EcoRI (línea 6). Sin embargo, la hibridación con un fragmento 3' de FUT1 (cebadores P7-P10) (Tabla 1) muestra una banda KspI de 6,2 kb y una banda KspI/EcoRI de 1,1 kb. Ambos fragmentos 5' y 3' de FUT1 se hibridan con el mismo fragmento EcoRI de 4,6 kb en la línea 4. Esto que indica la presencia de un loci KspI en el gen FUT1 contenido en el cósmido ETHs2. La hibridación cruzada del fragmento 3' de FUT1 detecta bandas de 2,7 kb (líneas 2, 3, 8 y 9) y 8,2 kb (líneas 8 y 9), dando lugar a la identificación de un pseudogen FUT2 (ORF incompleto) y de las secuencias del gen FUT2, respectivamente.
10. Polimorfismos del fragmento de restricción
La detección de las mutaciones (A) M307 G a A y (B) M857 G a A en el gen FUT1 porcino se consiguió mediante el análisis del polimorfismo del tramo de restricción, utilizando varias enzimas de restricción. La digestión de los fragmentos de FUT1 utilizados con CfoI (A) y AciI (B) dio lugar al polimorfismo del fragmento de restricción. En la primera línea es un marcador de 100 bp.
(A) El genotipo M307^{A/A} genera los fragmentos de restricción de 328 y 93 pb mientras que el genotipo M307^{G/G} (línea 2) genera fragmentos de 93, 241 y 87 pb y los genotipos M307^{A/G} (línea 3) muestran los cuatro fragmentos.
(B) La digestión del genotipo M857^{A/A} (línea 2) genera ffragmentos de 174 pb, mientras que generan fragmentos de 136 y 38 pb en los genotipos M857^{A/G} (línea 4) y en los genotipos M857^{A/G} (línea 3) se generan los tres fragmentos.
11. Origen de los cerdos
Los datos de la población experimental Swiss Landrace procedían de dos pedigrees que se crearon en el Institute of Veterinary Bacteriology de la Universidad de Zurich. Todos los demás cerdos de las razas Large White, Swiss Landrace, Duroc, Hampshire y Pietrain procedían de distintas piaras de cerdos de Suiza. Otros cerdos se obtuvieron aleatoriamente de granjas del medio oeste de los EE.UU.
Documentos citados
Bertschinger et al. (1993) Veterinary Microbiology 35:79-89.
Cohney et al. (1996) Immunogenetics 44:76-79.
Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 1:387-395.
Fujii et al. (1991) Science 253:448-451.
Green et al. (1990) Documentación para CRI-MAP, Versión 2,4, St. Louis: Washington University School of Medicine.
Kelly et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 91:5843-5847.
Meijerink, E. et al. (1997), 25^{th} Int. Conf. on Animal Genetics, p. 44
Rippinger, et al (1995) Vet. Microbial. 45:281-295.
Solinas Toldo et al. (1993) Mamm. Genome 4:720-727.
Thurin y Blaszczyk-Thurin, (1995) J. Biol. Chem. 270(44):26577-26580.
Vögeli et al. (1996) Animal Genetics 27:321-328.
Vögeli et al. (1997) Schweiz. Arch. Tierheilk. 139:479-484.
Patente U.S. nº 5.358.649, Maclennon et al.
Patente U.S. nº 5.552.144, Valery et al.
WO 8604604 987P, Inventor: Peterson.
WO 9628967, Inventor: Koike, C.
WO 9413811, Inventores: Imberechts y Lintermans.
TW 266264, Inventores: Jeng y Liou.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Biotechnology Research and Development Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1815 North University Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Peoria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: IL
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 61604
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: U.S. Department of Agriculture
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 14^{th} & Independence Ave., N.W.
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: D.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 20250
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Swiss Federal Institute of Technology Zurich
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Ramistrasse 101, ETH-Zentrum
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Zurich
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Switzerland
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: CH-8092
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos y composiciones para la identificación de cerdos genéticamente resistentes a enfermedades relacionadas con E. coli F18
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/10318
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 mayo 1998
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAACGCCTC CGATTCCTGT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGCATGGCA GGTGGATGA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTCAGCCAG GGCTCCTTTA AG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTACCTCCAG CAGGCTATGG AC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCAGAGTGG AGACAAGTCT GC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCCTGAAC GTCTATCAAG ATC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAGTTTCCT CATGCCCACA GG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCTACAGG ACCACCAGCA TC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCAGCAGCG CAAAGTCCCT GACGGGCACG GCCTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCCTGTGC CTTGGAAGTG AT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACTGCACTG CCAGCTTCAT GC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1269 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9..1103
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 12:
1
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 365 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
4
5

Claims (3)

1. Método para identificar un cerdo que es resistente a la colonización intestinal por E. coli F18 que es capaz de unirse al ECF18R en cerdos, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
a.
determinar si un polimorfismo genético, en el que una base nitrogenada en la posición 307 del gen alfa (1, 2) fucosiltransferasa 1 del cerdo es adenina, o un polimorfismo en asociación alélica con el polimorfismo FUT1 que presenta adenanina en la posición 307, está en una muestra biológica del cerdo; e
b.
inferir que el cerdo es resistente si el cerdo es homocigoto para el polimorfismo FUT1 o para un polimorfismo en desequilibrio de ligamiento con éste.
2. Método para identificar un cerdo que es resistente a los trastornos intestinales causados por un microorganismo capaz de unirse al ECF18R en cerdos, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
a.
determinar en una muestra biológica procedente del cerdo si la única base nitrogenada en la posición 307 del gen alfa (1,2) fucosiltransferasa 1 del cerdo es adenina; e
b.
identificar el cerdo como resistente si la única base nitrogenada en la posición 307 es adenina
3. Método según la reivindicación 1, en el que E. coli es la cepa F18.
ES03001366T 1997-05-20 1998-05-20 Metodos y composiciones para la identificacion de cerdos geneticamente resistentes a enfermedades relacionadas con e. coli f18. Expired - Lifetime ES2248647T3 (es)

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US47181 1997-05-20

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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6355859B1 (en) * 1997-05-20 2002-03-12 Biotechnology Research And Development Corporation Interactions between genotype and diet in swine that prevent E. coli associated intestinal disease
RU2204609C2 (ru) * 1997-05-20 2003-05-20 Биотехнолоджи Резёрч Энд Девелопмент Корпорэйшен СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СВИНЕЙ, РЕЗИСТЕНТНЫХ К КИШЕЧНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С Е.Сoli, СПОСОБ РАЗВЕДЕНИЯ СВИНЕЙ, РЕЗИСТЕНТНЫХ К КИШЕЧНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С E.Coli, ВЫДЕЛЕННАЯ ДНК-МОЛЕКУЛА (ВАРИАНТЫ), МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ Е.Сoli F-18 У СВИНЕЙ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ Е.Сoli F-18
HU221664B1 (hu) * 1999-03-31 2002-12-28 MTA Állatorvostudományi Kutatóintézete Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs előállítására alkalmas eljárás
GB0118549D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Pig Improvement Uk Ltd Methods
US7785778B2 (en) 2002-11-25 2010-08-31 University Of Copenhagen Porcine polymorphisms and methods for detecting them
CA2512110A1 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Mmi Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for inferring bovine breed
CN104982387B (zh) * 2015-05-25 2018-01-23 广东温氏食品集团股份有限公司 一种muc13和fut1基因的分子标记辅助选择方法
PH12018500447B1 (en) * 2015-09-02 2022-11-11 Int N&H Denmark Aps Glycoside hydrolases and their use in preventing and/or treating a pathogenic infection in an animal
CN106480174B (zh) * 2016-09-14 2019-04-16 扬州大学 一种用于猪抗病育种的遗传分子标记方法和应用
CN108384865A (zh) * 2018-02-07 2018-08-10 扬州大学 Alpha菌毛基因在仔猪腹泻致病性大肠杆菌监测、鉴别中的应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK41885A (da) 1985-01-31 1986-11-13 Slagteriernes Forskningsinst 987p-fimbrie-producerende mikroorganisme, vaccine til immunisering af grise samt fremgangsmaade til fremstilling af vaccinen
AU665178B2 (en) 1990-12-21 1995-12-21 University Of Guelph Diagnosis for porcine malignant hyperthermia
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5552144A (en) 1992-01-22 1996-09-03 Microcarb, Inc. Immunogenic shiga-like toxin II variant mutants
WO1994013811A1 (en) 1992-12-04 1994-06-23 N.V. Innogenetics S.A. New polypeptides, nucleic acid sequences encoding them, and their use to prevent the adhesion of f107-fimbriated bacteria
US5625124A (en) * 1994-07-11 1997-04-29 Washington University Animal model for helicobacter pylori infection
WO1996028967A1 (en) 1995-03-17 1996-09-26 Chihiro Koike Transgenic non-primatal mammals wherein serotypes of higher primates have been expressed by foreign gene transfer and method of creating the same
US6355859B1 (en) * 1997-05-20 2002-03-12 Biotechnology Research And Development Corporation Interactions between genotype and diet in swine that prevent E. coli associated intestinal disease
RU2204609C2 (ru) * 1997-05-20 2003-05-20 Биотехнолоджи Резёрч Энд Девелопмент Корпорэйшен СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СВИНЕЙ, РЕЗИСТЕНТНЫХ К КИШЕЧНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С Е.Сoli, СПОСОБ РАЗВЕДЕНИЯ СВИНЕЙ, РЕЗИСТЕНТНЫХ К КИШЕЧНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С E.Coli, ВЫДЕЛЕННАЯ ДНК-МОЛЕКУЛА (ВАРИАНТЫ), МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ Е.Сoli F-18 У СВИНЕЙ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ Е.Сoli F-18
MXPA01009447A (es) * 1999-03-19 2003-08-19 Stonecraft Llc Composicion de cemento y polimero, y metodo para fabricar el mismo.

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