HU221664B1 - Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs előállítására alkalmas eljárás - Google Patents
Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs előállítására alkalmas eljárás Download PDFInfo
- Publication number
- HU221664B1 HU221664B1 HU9900836A HUP9900836A HU221664B1 HU 221664 B1 HU221664 B1 HU 221664B1 HU 9900836 A HU9900836 A HU 9900836A HU P9900836 A HUP9900836 A HU P9900836A HU 221664 B1 HU221664 B1 HU 221664B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- strain
- escherichia coli
- producing
- enterotoxin
- f18ac
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 18
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- 241000282887 Suidae Species 0.000 title abstract description 4
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims abstract description 10
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 26
- 231100000249 enterotoxic Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000002242 enterotoxic effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 3
- 241001076388 Fimbria Species 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 11
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 6
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 206010004016 Bacterial diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
A találmány tárgya élő, szájon át adható Escherichia coli vakcinakészítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésénekmegelőzésére, és a törzs előállítására alkalmas eljárás. A találmányszerinti törzsnek az a lényege, hogy az enterotoxin-mentes éseredetileg vad típusú Escherichia coli törzs egyidejűleg két adhéziósfimbriát (F4ac és F18ac) termel, míg a találmány szerinti eljárásnakaz a lényege, hogy az eredetileg enterotoxinok és F18ac fimbriáktermelésére képes vad, kórokozó enterotoxikus Escherichia coli törzsenterotoxin-termelő képességét a választott malacok vékonybelénekfalához való tapadását elősegítő F18ac-fimbria-- termelő képességmegtartásával genetikai úton szüntetik meg, majd az így módosítotttörzset egy további, felületi adhéziós fimbria (F4ac) termelésére isképessé teszik. ŕ
Description
A találmány tárgya élő, szájon át adható Escherichia coli vakcinatörzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére, és a törzs előállítására alkalmas eljárás.
A sertésnevelés egyik legsúlyosabb, mindennapos betegsége az úgynevezett enterotoxikus Escherichia 5 coli (ETEC) baktériumok okozta coli-hasmenés, mely előbb az újszülött- (szopós) korban szokott 5-15%-os elhullást okozni, majd a malacok választása után lép fel ismét, hasonló veszteségek elóidézőjeként. Az elhullások okozta kárnál jóval tetemesebb a gyógykezelésből, 10 fejlődésben való elmaradásból és egyéb követelményekből eredő veszteség. A bántalom kórfejlődésének lényege, hogy az ETEC baktériumok a malac bélcsatomájába jutva, felületi fehérje antigénjeik (fimbriáik) segítségével a vékonybél falához tapadnak, ott jelentős szám- 15 bán elszaporodnak és hőstabil, illetve hőlabilis toxinjaikat (STa, STb, LT enterotoxinokat) közvetlenül a bélhámsejteknek átadják. A toxinok hatására a bélhámsejtek folyadékfelszívó tevékenysége leáll, és ehelyett jelentős mennyiségű folyadékot választanak ki. Ennek 20 eredményeként klinikailag súlyos hasmenés jelentkezik. A kórkép kialakításának első lépése tehát a kórokozó ETEC baktériumoknak a bélfalhoz való tapadása (mely önmagában még betegséget nem idéz elő), melyet követ a toxinok hatása a bélhámsejtekre (ennek kö- 25 vetkezménye a hasmenés) (1).
Az újszülöttek coli-hasmenése elleni védekezésben az utóbbi 10-15 évben több vakcinát is előállítottak és forgalmaztak. Ezek a vakcinák az anyák (kocák) oltása (ún. parenterális vakcinázása) révén az anyatejben a 30 kórokozó ETEC-törzsek elleni specifikus ellenanyagok képzését váltják ki. Ezen ellenanyagok az újszülött és szopós malacokat megfelelő védelemben részesítik. Az anyatej ellenanyagai a bél üregében és a bél falán lévő kórokozókat szaporodásukban specifikusan gátolják. 35
A választott malacok coli-hasmenése elleni védekezésre a fentiekhez hasonló oltóanyagként alkalmazható hatékony vakcinát nem ismerünk. Ennek legfőbb oka, hogy a parenterálisan (emésztőcsatorna megkerülésével) beadott vakcinák túlnyomóan a keringő ellenanya- 40 gok képződését segítik, mely keringő ellenanyagok azonban a bél üregében és a bélfalon lévő enterotoxikus E. coli baktériumokat nem, vagy alig érik el. Ezért egyesek magukat az ellenanyagokat (például tyúktojás szikanyagában megtermelt specifikus ellenanya- 45 gokat) igyekeznek szájon keresztül (például takarmányba keverve) a malacok gyomor-bél csatornájába juttatni (3). A védekezésnek egy további lehetőségét jelentik a szájon keresztül felvehető vakcinák, amelyek az emésztőcsatornában fejtik ki az ETEC baktériumok elleni im- 50 munizáló hatásukat. Ilyen, a bélcsatoma immunizálására alkalmas korábbi vakcinák elölt mikroorganizmusokat tartalmaztak, amelyek folyamatos és jelentős mennyiségű jelenléte (takarmányban) bizonyos esetekben csökkentette a választási hasmenés okozta vesztesé- 55 geket, de kevésbé megbízható volta miatt, ma már az ilyen vakcinákat nem vagy alig alkalmazzák. A kudarcok egyik fő oka ez esetben az, hogy a hőkezelés az ETEC baktériumok virulenciája szempontjából fontos, hőérzékeny, fehéijetermészetű termékeit elpusztítja. 60
Ezek a hőlabilis enterotoxin, F4 (4) és F18 (5) fimbriák. így azok immunizáló hatása nem érvényesülhet. Következésképp, az ilyen - elsősorban a bélcsatoma immunizálására előállítandó - vakcinák élő mikroorganizmusokat kell hogy tartalmazzanak, melyek képesek a bélcsatomában megtelepedni, ott folyamatosan, a védelem szempontjából fontos antigéneket megfelelő mennyiségben termelni, és ellenük a bélcsatoma immunitását elősegíteni.
A kórokozók elleni helyi (nyálkahártyán érvényesülő) védelmet nyújtani képes élő mikroorganizmusok egyrészt ártalmatlan laboratóriumi törzsekbe való génbevitellel, másrészt a kórokozók bizonyos tulajdonságainak megváltoztatásával alakíthatók ki. Mi az utóbbi eljárást választottuk.
A találmány tárgya élő, szájon át adható Escherichia coli vakcinatörzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére, és a törzs előállítására alkalmas eljárás. A találmány szerinti törzsnek az á lényege, hogy az enterotoxin-mentes és eredetileg vad típusú Escherichia coli törzs egyidejűleg két adhéziós fimbriát (F4ac és F18ac) termel, míg a találmány szerinti eljárásnak az a lényege, hogy az eredetileg enterotoxinok és F18ac fimbriák termelésére képes vad, kórokozó enterotoxikus Escherichia coli törzs enterotoxin-termelő képességét a választott malacok vékonybelének falához való tapadását elősegítő F18ac-fimbria-termelő képesség megtartásával genetikai úton szűntetjük meg, majd az így módosított törzset egy további, felületi adhéziós fimbria (F4ac) termelésére is képessé tesszük.
Az eljárást a választási hasmenést előidézni képes ETEC-törzsek egyik jellegzetes képviselőjének (Ec2173 jelű törzsnek) példáján mutatjuk be.
Az Ec2173 (0147:F18ac, STa, STb) törzs a sertések választási hasmenésének súlyos esetéből Magyarországon izolált és általunk jellemzett (Nagy, B. és munkatársai, 1990, 1997) Escherichia (E.) coli törzs, mely idegen plazmidok felvételére természetes, (vagy ahhoz hasonló) körülmények között nem alkalmas. Ennek, az enterotoxinok (STa, STb) termeléséért felelős genetikai elemét (plazmidját) - a plazmid-inkompatibilitás elvének alkalmazásával - eltávolítottuk Mindezt úgy végeztük, hogy a toxinnegatív Ec2173 E. coli törzs (NBI/36) eredeti, bélbeni megtelepedését segítő felületi fimbriáit (F18ac) továbbra is termelje.
Előzetesen már ismert volt, hogy az EC2173 jelű enterotoxikus E. coli törzs STb enterotoxingénjét a törzsben egy plazmid hordozza. Emellett az STb toxingént (két majdnem egyenlő részre vágva) „elrontva” tartalmazó, valamint a toxingénbe inszertálva kanamicin (pTKm5-pMBl replikációs origo AmpR, KmR) markergént hordozó plazmidkonstrukciót juttattak be elektroporálással (8) a EC2173 jelű vad törzsbe - azon célból, hogy kettős homológ rekombináció (9) révén az „elrontott” STb toxingén lecserélje a virulenciaplazmid ép toxingénjét. A kísérleteket követő ellenőrző vizsgálatok során kiderült, hogy az STb toxingén - a pTKm5 bevitele ellenére működőképesen fennmaradt a törzsben. További - a plazmid-inkompatibilitás (10) elvét alkalmazó kísérletek során sikerült a transzformált EC2173 szárma2
HU 221 664 Bl zékokból először az endemikus virulenciaplazmidot és a pTKm5 plazmidkonstrukciót az alábbiak szerint eliminálni.
Az inkompatibilis (pFOL547-pMBl replikációs origo CmR, konjugativ plazmid) kiűző plazmidot konju- 5 gációval (11) juttatták be a pTKm5 hordozó transzformánsokba, majd néhány kiválasztott (transzkonjugáns) telep passzálása történt (10-12 órán növesztés 20 pg/ml klóramfenikol-tartalmú GTS/minimál/tápfolyadékban) azon célból, hogy Km- és Tc-érzékeny (vagyis pTKm5- 10 és pTc-mentes) telepeket (kiónokat) kapjanak A 10. passzálás után (20 pg/ml klóramfenikol-tartalmú GTS/minimál/agarra szélesztve replica platinggel) meghatározták az antibiotikumrezisztencia-mintázatot.
Ezután újbóli passzálás következett a pFOL547 plaz- 15 mid kiűzésének meggyorsítására. Egyes izolátumok esetében úgy tapasztalták, hogy EC2173 vad törzsre jellemző tetraciklin-rezisztencia a klóramfenikol-rezisztenciával együtt megszűnt. Ezen tetraciklin- és klóramfenikol-szenzitív izolátumokból tisztított összplazmid DNS 20 HindlII restrikciós enzimanalizise (12) során kapott eredmények alapján az endémikus virulenciaplazmid és a pFOL547 plazmid elvesztése következett be (a törzsek mind Te-, mind Cm-érzékenyek lettek).
A virulenciaplazmid elvesztésével létrehozott izo- 25 látumok tetraciklinre érzékennyé váltak - így a plazmid a rajta lévő tetraciklin-rezisztenciagén után a pTc nevet kapta. Az izolátumok STa toxingén specifikus printerrel végzett PCR (13) - valamint STb toxingén specifikus Southern hibridizációs (14) vizsgálatok alapján 30 STa és STb enterotoxingénekre hiányosnak bizonyultak, ugyanakkor az F18ac fimbriát [agglutinációs és immunfluorszcenciás vizsgálatok (7) alapján] továbbra is termelték, igy alkalmassá váltak további - vakcinatörzs előállítását célzó - kísérletekre. 35
A vakcinatörzs előállítása céljából egy további (az úgynevezett F4) fimbria termelését kódoló géncsoportot is a toxinnegatív (NBI/36) törzsbe vittünk, mivel az F4 fimbria termelése a választott malacok belében való megtapadás készségét ugyancsak fokozza. Az 40 F4 fimbriák bevitelére alkalmas pDB88-102 plazmidot Mooi, FM205 törzséből (15) Bakker állította elő, és e célból ő bocsátotta szabadon rendelkezésünkre (16). A pDB88-102 olyan plazmid, mely a K88ac fimbriák termelését szabályozó teljes génrendszert (ope- 45 ront) tartalmazza. A pDB88-102 plazmid bevitele az atoxikus NBI/36 törzsbe elektroporálással történt, ugyanez elvégezhető konjugációval vagy transzformációval is (10), (12).
A jelzett törzsek elektroporálását (elektrotranszfor- 50 málását) Bio-Rad Gene Pulser elektroporáló készülékkel D=2 mm-es küvettában 25 pF, 400 Ω, 2,5 kV elektroporálási paraméterekkel végeztük. A transzformáláskor 100 pl elektrokompetens baktériumsejthez (17) kb.
pg pDB88-102 plazmid DNS-t adtunk. Az elektro- 55 porálás után 1 órát 1,5 ml antibiotikumot nem tartalmazó LB-levesben 37 °C-on növesztettük, majd centrifugálás (7500 rpm, 3 min.) után az összes baktériumot 150 pg/ml ampicillint tartalmazó juhvéres agaira szélesztettük, és 37 °C-on 18 órán át inkubáltuk, majd az ampi- 60 cillinrezisztens telepeket 150 pg/ml ampicillintartalmú LB-levesben felszaporítottuk. A fent leírtak szerint a pDB88-102 plazmidot a EC2173-as törzs atoxikus származékaiba (például ΝΒΙ/36-ba) juttattuk be.
Az így módosított (NBI/36-9 jelű) E. coli törzsek az alábbi fenotípussal jellemezhetők: 0147:K+, NM, F4ac, F18ac, Hly+.
Egy ilyen törzs élő tenyészetének (például 1010 E. coli/adag) választás előtti és választás utáni szájon keresztüli alkalmazásával a malacok E. coli okozta választási hasmenése lényegesen visszaszorítható.
Irodalomjegyzék
1. Fairbrother JM.: Enteric colibacillosis. In: Leman
AD, Straw BE, Mengeling WL, D’Allaire S, Taylor
D, eds. Diseases of Swine, 7th edn, Ames, Iowa
State University Press, 1992 : 489-497.
2. Moon HW.: Protection against enteric colibacillosis in pigs suckling orally vaccinated dams: Evidence fór pili as protective antigens. Am. J. Vet. Rés. 1981:42,173-177.
3. Zuniga A, Yokohama H, Albicker-Rippinger P, Eggenberger E, Bertschinger HU.: Reduced intestinal colonisation with F18-positive enterotoxigenic Escherichia coli in weaned pigs fed chicken egg antibody against the fimbriae. FEMS Immunoi. Medical Microbiol. 1997: 18,153-161.
4. Orskov I, Orskov F.: Serology of Escherichia coli fimbriae. Prog. Allergy 1983: 33,80-105.
5. Rippinger P, Bertschinger HU, Imberechts H, Nagy B, Sorg I, Stamm M, Wild P, Witting W.: Designations F18ab, and F18ac fór the related fimbrial types F107, 2134P and 8813 of Escherichia coli isolated from porcine postweaning diarrhoea and from oedema disease. Vet. Microbiol. 1995:45, 281-295.
6. Nagy B, Casey TA, Moon HW.: Phenotype and genotype of Escherichia coli isolated from pigs with postweaning diarrhea in Hungary. J. Clin. Microbiol 1990 : 26,651-653.
7. Nagy B, Whipp, SC, Imberechts H, Bertschinger HU, Dean-Nytsrom EA, Casey TA, Salajka E.: Biological relationship between F18ab and F18ac fimbriae of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli from weaned pigs with oedema disease or diarrhoea. Microbial Pathogenesis 1997: 22,1-11.
8. Sambrook, Fritsch, Maniatis: Molecular cloning A Laboratory Manual 1989,1.75.
9. Freifelder: Microbial Genetics 1987,346-347. oldal
10. Freifelder: Microbial Genetics 1987, 253-268. oldal
11. Kondorost á., Kiss Gy., Forral T., Vincze É., Bánfalvi Zs.: Circular linkage map of Rhizobium meliloti citromosomé. Natúré 1977. 268 525-527.
12. Sambrook, Fritsch, Maniatis: Molecular cloning A Laboratory manual 1989,1.82-85.
13. Alexa P., Rychlik I., Nejezchleb A., Hamrik J.: Identification of enterotoxin-producing strains of Escherichia coli by PCR and biological methods. Vet. Med. (Praha) 1997. Apr; 42(4):97-100.
HU 221 664 Bl
14. Lee C. H., Moseley S. L., Moon H. W., Whipp S.
C., Gyles C. L., So M.: Characterization of the gene encoding heat-stable toxin II and preliminary molecular epidemiological studies of enterotoxigenic Escherichia coli heat-stable toxin Π producere. 5 Infect. Immun. 1983 42(1):264-268.
15. Mooi FR, Van Buuren M, Koopman G, Roosendaal E, DeGraf FK: K88ab gene of Escherichia coli encodes a fímbria-like protein distinct from the K88ab fímbrial adhesin. J. Bacteriol. 1984: 159, 10 482-487.
16. Bakker D.: Studies on the K88 fimbriae of enteropathogenic Escherichia coli. Akademisch Proefschrift, Drukkerij Elinkwijk BV, Utrecth 1991. 15
17. Maloy, Stewart, Taylor: Genetic analysis of pathogenic bacteria - A Laboratory Manual 1996, 490-492. oldal.
Claims (6)
1. Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcinatörzs sertések választási hasmenésének megelőzésére, azzal jellemezve, hogy enterotoxin-mentes és eredetileg 25 vad típusú Escherichia coli törzs egyidejűleg két adhéziós fímbriát (F4ac és F18ac) termel.
2. Az 1. igénypont szerinti törzs, azzal jellemezve, hogy az Ec2173 jelű enterotoxikus Escherichia coli törzs módosításával előállitott Escherichia coli törzsek (NB1/36-9) [letétbe helyezése: NCAIM Ρ (B)
001270 számon] az alábbi fenotípussal jellemezhetők:
0147 :K+, NM, F4ac, F18ac, Hly+.
3. Eljárás élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs előállítására sertések választási hasmenésének megelőzésére, azzal jellemezve, hogy az eredetileg enterotoxinok és F18ac fímbriák termelésére képes vad, kórokozó enterotoxikus Escherichia coli törzs enterotoxin-termelő képességét a választott malacok vékonybelének falához való tapadását elősegítő F18ac-fimbria-termelő képesség megtartásával genetikai úton szüntetjük meg, majd az így módosított törzset egy további, felületi adhéziós fimbria (F4ac) termelésére is képessé tesszük.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, αζζα/ jellemezve, hogy az Ec2173 jelű enterotoxikus Escherichia törzs enterotoxin-termelő (STa, STb) képességét kódoló plazmidjának (pTc) eltávolításával szüntetjük meg.
5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enterotoxinok termelését irányító plazmidot egy inkompatibilis plazmid (pFOL547) bevitelével űzzűk ki.
6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy az Ec2173 jelű enterotoxikus Escherichia törzs enterotoxin nem termelő származékába (NBI/36) a felületi adhéziós fímbriát (F4ac) kódoló plazmidot építünk be.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9900836A HU221664B1 (hu) | 1999-03-31 | 1999-03-31 | Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs előállítására alkalmas eljárás |
| US09/958,081 US7163820B1 (en) | 1999-03-31 | 2000-03-29 | Escherichia coli strain for an oral vaccine against post-weaning diarrhea in pigs |
| AU39823/00A AU3982300A (en) | 1999-03-31 | 2000-03-29 | A strain suitable for producing a live, orally applicable escherichia coli vaccine for the prevention of postweaning diarrhoea in pigs and the procedure suitable for producing that strain |
| PCT/HU2000/000026 WO2000058476A1 (en) | 1999-03-31 | 2000-03-29 | A strain suitable for producing a live, orally applicable escherichia coli vaccine for the prevention of postweaning diarrhoea in pigs and the procedure suitable for producing that strain |
| EP00919072A EP1173576A1 (en) | 1999-03-31 | 2000-03-29 | A strain suitable for producing a live, orally applicable escherichia coli vaccine for the prevention of postweaning diarrhoea in pigs, and the procedure suitable for producing that strain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9900836A HU221664B1 (hu) | 1999-03-31 | 1999-03-31 | Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs előállítására alkalmas eljárás |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9900836D0 HU9900836D0 (en) | 1999-05-28 |
| HUP9900836A2 HUP9900836A2 (hu) | 2002-07-29 |
| HU221664B1 true HU221664B1 (hu) | 2002-12-28 |
Family
ID=89997998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9900836A HU221664B1 (hu) | 1999-03-31 | 1999-03-31 | Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs előállítására alkalmas eljárás |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7163820B1 (hu) |
| EP (1) | EP1173576A1 (hu) |
| AU (1) | AU3982300A (hu) |
| HU (1) | HU221664B1 (hu) |
| WO (1) | WO2000058476A1 (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006506991A (ja) | 2002-11-25 | 2006-03-02 | デン・コンゲリエ・ヴェテリネー−オ・ランボホイスコレ | ブタ多型およびその検出のための方法 |
| US7927586B2 (en) * | 2008-07-08 | 2011-04-19 | South Dakota State University | Vaccine for porcine post-weaning diarrhea caused by enterotoxigenic Escherichia coli |
| CA2730328C (en) | 2008-09-03 | 2015-03-31 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Immunogenic escherichia coli heat stable enterotoxin |
| WO2010124085A2 (en) * | 2009-04-23 | 2010-10-28 | Cornell University | Compositions and methods for preventing and treating uterine disease |
| CN102851226A (zh) * | 2012-03-29 | 2013-01-02 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一株脂多糖合成缺陷的无毒福氏志贺氏菌及其构建方法 |
| CN104736695B (zh) | 2012-07-20 | 2017-05-24 | 普瑞特克微生物有限责任公司 | 非致病性f18大肠杆菌菌株及其用途 |
| EP2943220A2 (en) * | 2013-01-10 | 2015-11-18 | Velin-Pharma A/S | Vaccine |
| CA2993883A1 (en) * | 2015-07-31 | 2017-02-09 | Bayer Animal Health Gmbh | Enhanced immune response in porcine species |
| CN114752531B (zh) * | 2022-04-29 | 2023-05-26 | 扬州大学 | 一株同时表达f4和f18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株及其应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ199866A (en) * | 1981-03-09 | 1984-11-09 | Cetus Corp | Vaccine for prevention of gastroenteric disease:non-pathogenic strain genetically engineered to comprise genes for adhesin and/or toxoids |
| ES8705033A1 (es) * | 1984-12-04 | 1987-04-16 | Biotech Australia Pty Ltd | Un metodo para preparar una vacuna para uso en el tratamiento prevencion de diarrea porcina neonatol. |
| WO1994013811A1 (en) * | 1992-12-04 | 1994-06-23 | N.V. Innogenetics S.A. | New polypeptides, nucleic acid sequences encoding them, and their use to prevent the adhesion of f107-fimbriated bacteria |
| US5798260A (en) * | 1994-06-24 | 1998-08-25 | Children's Hospital And Medical Center | Escherichia coli O157:H7 epithelial adhesin |
| AU7580798A (en) * | 1997-05-20 | 1998-12-11 | Biotechnology Research And Development Corporation | Methods and composition to identify swine genetically resistant to f18 (e. coli)associated diseases |
| US6355859B1 (en) * | 1997-05-20 | 2002-03-12 | Biotechnology Research And Development Corporation | Interactions between genotype and diet in swine that prevent E. coli associated intestinal disease |
| EP1246848A1 (en) * | 1999-12-27 | 2002-10-09 | University Of Manitoba | GENETIC VACCINES FOR THE PRODUCTION OF CHICKEN EGG-YOLK ANTIBODIES AGAINST ENTEROTOXIGENIC i ESCHERICHIA COLI /i AND OTHER PATHOGENS |
-
1999
- 1999-03-31 HU HU9900836A patent/HU221664B1/hu not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-29 AU AU39823/00A patent/AU3982300A/en not_active Abandoned
- 2000-03-29 WO PCT/HU2000/000026 patent/WO2000058476A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-03-29 US US09/958,081 patent/US7163820B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-29 EP EP00919072A patent/EP1173576A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1173576A1 (en) | 2002-01-23 |
| US7163820B1 (en) | 2007-01-16 |
| AU3982300A (en) | 2000-10-16 |
| HU9900836D0 (en) | 1999-05-28 |
| HUP9900836A2 (hu) | 2002-07-29 |
| WO2000058476A1 (en) | 2000-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6399074B1 (en) | Live attenuated salmonella vaccines to control avian pathogens | |
| AU745003B2 (en) | Live attenuated vaccines | |
| EP0060129B1 (en) | Vaccines, a method for making vaccines and a method for stimulating antibody production | |
| Dorman et al. | Characterization of porin and ompR mutants of a virulent strain of Salmonella typhimurium: ompR mutants are attenuated in vivo | |
| US20050260223A1 (en) | Salmonella vaccine materials and methods | |
| Kwaga et al. | A carAB mutant of avian pathogenic Escherichia coli serogroup O2 is attenuated and effective as a live oral vaccine against colibacillosis in turkeys | |
| Clouthler et al. | Unique fimbriae‐like structures encoded by sefD of the SEF14 fimbrial gene cluster of Salmonella enteritidis | |
| Cárdenas et al. | Stability, immunogenicity and expression of foreign antigens in bacterial vaccine vectors | |
| AU2001256957A1 (en) | Salmonella vaccine materials and methods | |
| US4761372A (en) | Mutant enterotoxin of E. coli | |
| HU221664B1 (hu) | Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs előállítására alkalmas eljárás | |
| US5798260A (en) | Escherichia coli O157:H7 epithelial adhesin | |
| Wray et al. | Escherichia coli infections in farm animals | |
| WO2015066292A1 (en) | Attenuated pasteurella multocidavaccines & methods of making & use thereof | |
| US20050019335A1 (en) | Salmonella vaccine | |
| Dougan et al. | Molecular analysis of the virulence determinants of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from domestic animals: applications for vaccine development | |
| US5137721A (en) | Employing strains of E. coli expressing non-indigenous adhesins and toxoids of E. coli | |
| Viboud et al. | The structural gene encoding human enterotoxigenic Escherichia coli PCFO20 is homologous to that for porcine 987P | |
| Casey et al. | Characterization of bovine septicemic, bovine diarrheal, and human enteroinvasive Escherichia coli that hybridize with K88 and F41 accessory gene probes but do not express these adhesins | |
| Zhao | Virulence factors of Salmonella enterica serovar Enteritidis | |
| Bertin | Phenotypic expression of K88 adhesin alone or simultaneously with K99 and/or F41 adhesins in the bovine enterotoxigenic Escherichia coli strain B41 | |
| MXPA99011431A (en) | Live attenuated vaccines | |
| Doane | Subcloning of the fimbrial gene encoding for 987P for use as a diagnostic probe in swine diarrheal disease | |
| EP1640013A2 (en) | Inactivated Salmonella vaccines | |
| Russell | The products of two Escherichia coli type 1 pilus genes influence pilus number and length |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |