CN104736695B - 非致病性f18大肠杆菌菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613‑01的分离的大肠杆菌(E.coli)菌株。还提供了使用该菌株在动物中预防由F18致病性大肠杆菌感染引起的水肿病或腹泻的方法。

Description

非致病性F18大肠杆菌菌株及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2012年7月20日提交的美国临时申请61/674,179的权益，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本申请涉及非致病性F18大肠杆菌(E.Coli)菌株及其用途。

背景技术

水肿病和腹泻通常为饲养者所饲养动物中的常见疾病。例如，断奶仔猪的水肿病通常由编码2e型志贺毒素(Shiga toxin type 2e，Stx2e)的志贺毒素编码大肠杆菌(shigatoxin-encoding Escherichia coli，STEC)菌株引起(MacLeod等，1991，Vet Pathol 28：66-73)，而新生和断奶仔猪中的分泌性腹泻通常由编码热稳定(STa、STb、EAST1)和/或热不稳定(LT)肠毒素的产肠毒素大肠杆菌菌株(enterotoxigenic Esch erichia colistrain，ETEC)引起(Gyles和Fairbrother，2010，Escherichia coli.In：Pathogenesis ofbacterial infections in animals，ed.Gyles CL，Prescott JF，SongerG，Thoen CO，第四版，第267-308页。Blackwell Publishing，Ames，IA；Nagy等，1997，Microb Pathog 22：1-11)。一些致病性菌株表达Stx2e基因和肠毒素基因二者，因此能够在同一动物中引起水肿病的症状和腹泻的症状(STEC/ETEC)(Barth等，2007，Berl Munch TierarztlWochenschr120：307-316)。

对于与水肿病和/或腹泻病的症状相关的肠细菌感染，许多常规治疗性或预防性组合物和方法的相关缺陷是其较低的可靠性和效力。因此，需要用于水肿病和/或腹泻病的改进的治疗性或预防性组合物和方法。

发明内容

在一个非限制性的广泛方面中，提供了于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的分离的大肠杆菌菌株。

在另一个非限制性的广泛方面中，提供了用于在动物中预防致病性F18大肠杆菌(E.coli)肠道感染的方法，其包括向动物经肠递送有效量的于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的活大肠杆菌菌株。

在另一个非限制性的广泛方面中，提供了用于在动物中预防由致病性F18大肠杆菌(E.coli)感染引起的水肿病或腹泻病的方法，其包括向动物经肠递送有效量的于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的活大肠杆菌菌株。

在一个非限制性实施方案中，所述活大肠杆菌菌株为冻干形式。在另一个非限制性实施方案中，使活大肠杆菌菌株与可喂养用载体(feed acceptable carrier)联合，例如可将活大肠杆菌菌株稀释、掺入或混悬在可喂养用载体中。在另一个非限制性实施方能中，所述活大肠杆菌菌株为冷冻形式。

在结合附图阅读以下对本发明一些具体实施方案的描述之后，本发明的这些和其他方面和特征对于本领域的普通技术人员来说现将变得明显。

附图说明

下文参照附图提供本发明一些实施方案的详细描述，在附图中：

图1是举例说明根据可变剂量(示出为平均对数菌落形成单位(colony formingunit，CFU)的反对数)施用活的非致病性F18后，非致病性F18菌株的粪便排泄的非限制性图。

图2是举例说明F18-STEC致病性攻击菌株的粪便排泄的非限制性图：经组合的组合物处理的动物与对照动物的比较。

图3是举例说明F18-STEC致病性攻击菌株在不同肠节段中定殖的非限制性图：经组合的组合物处理的动物与对照动物的比较。

图4是举例说明血清样本中针对F18菌毛的IgM的免疫学检测的非限制性图：经组合的组合物处理的动物与对照动物的比较。

具体实施方式

通常，猪STEC和许多猪ETEC菌株表达F18决定簇。F18决定簇是促进细菌定殖于肠黏膜表面的茵毛(Fairbrother等.2006，Postweaning Escherichiacoli diarrhea andedema disease.In：Diseases 0f swine，ed.Straw B，Zimmermann JJ，D′Allaire S，Taylor DJ，第9版，第649-662页.Blackwell Publishing，Ames，IA)。认为F18菌毛介导表达F18的细菌细胞在肠细胞受体ECF18R受体上的黏附，该受体被小肠的肠细胞暴露在其顶细胞质膜上(等.1996，Anim Genet 27：321-328；Waddell等.1996，Infect Immun 64：1714-1719)。

一些猪STEC和STEC/ETEC菌株除F18菌毛之外可表达其他细胞黏附(cytoadhesive)茵毛或非茵毛黏附素，特别是F4或F5茵毛或“参与弥漫性黏附的黏附素”(adhesin involved in diffuse adherence，AIDA)(Barth等，2007，Berl MunchTierarztl Wochenschr 120：307-316；DebRoy等.2009，J Vet Diagn Invest 21：359-364；Fairbrother等，见上文；Niewerth等：2001，Clin Diagn Lab Immunol 8：143-149)。虽然AIDA黏附素常常发生在这两种病原体中，F4或F5茵毛在这些菌株中较为罕见。

在农场中，猪的断奶后腹泻(post-weaning diarrhea，PWD)和水肿病(edemadisease，ED)通常发生在断奶后第一个2周，PwD与致病性F4或F18产肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌株感染相关，而ED与产生致病性F18志贺毒素的大肠杆菌(STEC)菌株感染相关。对于这两种菌株，茵毛(即F4或F18)使得细菌能够黏附至其位于小肠绒毛上的特定受体，继之以细菌分裂并定殖于肠。

在PWD中，约30％至40％的猪表达F4受体并且在约70％至80％的猪中检测到F18受体。致病性菌株产生多种毒素(例如LT、STa和STb)的组合。受ETEC-F4感染的猪通表现出非常高的发病率，生长延迟，通常导致被感染动物死亡的水样和喷射性(projectile)腹泻。

对ED而言，在约70％至80％的猪中检测到了F18受体。与STEC相关的毒素是Stx2e，这是一种作用于血管内皮细胞的血管毒素，其导致水肿和随后的神经学体征，包括共济失调、横卧(decumbency)，对于PWD来说，最终通常导致被感染动物的死亡。

本文中使用的词语“F18大肠杆菌”或“F18菌株”是指表达F18决定簇(茵毛)的大肠杆菌菌株。

本文中使用的词语“F14大肠杆菌”或“F14菌株”是指表达F14决定簇(茵毛)的大肠杆菌菌株。

技术人员将认识到无需过多费力就可以操纵本文中所述非致病性F18菌株从而获得其突变体或其变体菌株(具有本文中所述菌株的所有识别特征的菌株)。产生突变体或变体的方法是本领域中常见且公知的。例如，美国专利No.7,371,558(其通过引用整体并入本文)公开了用于产生“其突变体或变体”的一些方法的概要。使用辐射或化学试剂产生突变体的具体方法在本领域中也有详细记载。参见例如Thomas D.Brock in Biotechnology：ATextbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass.，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.36，227(1992)。其突变体或变体菌株也可被鉴定为具有在高度严格条件下与本文中所述菌株的基因组杂交的基因组或其显著部分。技术人员将能够认识到基因组的一部分必须如何显著，从而考虑给定的菌株是否是“其突变体或变体”。因此，技术人员将合理预期可使用其这样的其变体或突变体来实施本发明而无需过多费力。

本文中使用的词语“有效量”是指引起组织、系统或动物的期望生物学应答的量。本文中描述的这样的有效量的活F18大肠杆菌菌株可以是例如但不限于足以预防肠细菌感染、使细菌排泄最小化、预防由肠细菌感染引起的疾病等的量。待使用的有效量可根据若干因素而变化。例如，所述若干因素可选自动物类型、动物初始重量、动物生长阶段、环境、与活菌株联合的可喂养用载体，即动物设施、生产的类型和管理、设施的卫生状况、断奶或孵化后动物的应激、使用的饲料和补充剂、动物的健康和伴随的疾病或治疗等。例如，有效量可以是但不限于在约5×10⁶CFU至约3×10¹⁰CFU范围内选择的任意量。本领域技术人员无需过多费力就能够确定合适的有效量。

本文中使用的术语“动物”是指适于根据本发明使用的任何幼年或成年动物。在一个非限制性实施方案中，术语“动物”是指猪(swine)。在一个非限制性实施方案中，术语“动物”是指猪(pig)。在一个非限制性实施方案中，猪是断奶前的猪。在另一个非限制性实施方案中，猪是断奶后的猪。本领域技术人员将无需过多费力就能够确定合适的动物。

本文中使用的术语“经肠递送”是指能够使菌株最终达到胃肠道、更优选肠的施用方式。在一个非限制性实施方案中，通过经口施用菌株来进行经肠递送。在另一个非限制性实施方案中，通过经直肠施用(例如通过栓剂)来进行经肠递送。本领域技术人员将无需过多费力就能够确定合适的施用方式。

本文中使用的词语“可喂养用载体”是指与本文中所述菌株相容并且可以给予动物而不会引起不良反应的任何载体、稀释剂或赋形剂。本领域中已知的合适的可喂养用载体包括但不限于水、盐水、葡萄糖、右旋糖、缓冲溶液等。这样的载体有利地对菌株无毒并且对动物无害。其还可以是生物可降解的。载体可以是固体或液体可喂养用载体。合适的固体可喂养用载体是非毒性可摄入载体。例如，该固体可喂养用载体可以是常见的固体饲料例如由谷物产品(例如大麦粉(barley meal)、玉米粉(maize meal)或小麦饲料(wheatfeed))、坚果和种子产品(例如脱壳花生饼或籽棉饼或提取的棉籽饼)与很少量例如羽毛粉、海藻粉(seaweed meal)、骨粉(bone meal)、细骨粉(bone flour)、白垩、盐、尿素和维生素组成的典型动物饮食的成分；或者其可以是无营养价值的惰性固体稀释剂或载体，例如高岭土、滑石、碳酸钙、漂白土、凹凸棒石黏土(attapulgus clay)、磨碎的牡蛎壳或磨碎的石灰石；或其可以是淀粉或乳糖。在另一个具体实施方案中，固体可喂养用载体可以是磨碎的玉米、大豆粉、乳清、动物脂肪等。合适的液体可喂养用载体是例如水并优选饮用水；乳例如全乳或脱脂乳；或培养基例如胰蛋白胨大豆肉汤(trypsone soy broth，TSB)。本领域技术人员将无需过多费力就能够确定合适的可喂养用载体。

权利要求的范围不应当受以下实施例所列出的优选实施方案的限制，但是应当在整体上给出与说明书相符的最广泛的解释。

实施例

实施例1

a)非致病性F18大肠杆菌菌株

对于大肠杆菌(EcL)，J.M.Fairbrother博士在1996年于OIE参考实验室(Facultéde medicine vétérinaire(FMV)，Université de Montréal(UdeM)，Saint-Hyacin，魁北克，加拿大)从猪粪便中分离出了大肠杆菌菌株，所述大肠杆菌菌株于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01。

使用API系统进行菌株的鉴定。原种(Master Seed)的API 20E编码是5004552。菌株的血清型显示为O141：K94：H-血清型。

通过茵落杂交和/或聚合酶链式反应(PCR)来确定菌株的毒力型。毒力型结果表现为菌株对F18和AIDA呈阳性，但是对以下毒素呈阴性：STa、STb、LT、EAST1、Stx1、Stx2、CNF、F4、F5、F6、F17、F41、P、AFA、Eae、Paa、Tsh、产气菌素基因。因此该菌株为非致病性大肠杆菌菌株。

菌株对以下抗微生物剂具有抗性：阿莫西林、氨苄西林、克林霉素、多西环素、红霉素、新霉素、青霉素、大观霉素、链霉素、磺胺氯哒嗪、磺胺地索辛、磺胺噻唑、泰妙菌素、替米考星、四环素(氯基和氧基)和泰乐菌素，而对以下抗微生物剂敏感：安普霉素、头孢噻呋、黏杆菌素、达氟沙星、恩诺沙星和庆大霉素。

b)非致病性F4大肠杆菌菌株

还可将非致病性F4大肠杆菌菌株与本文中所述的非致病性F18菌株组合使用。在一个非限制性实施方案中，非致病性F4大肠杆菌菌株是表达F4决定簇的任意非致病性菌株。在一个非限制性实施方案中，非致病性F4大肠杆菌菌株是重组菌株，例如pMK005菌株(Kehoe等，J Bacteriol.1983Sep；155(3)：1071-7)。在另一个非限制性实施方案中，非致病性F4大肠杆菌菌株是天然菌株，例如如美国7,981,411(其全部内容通过引用整体并入本文)所述在2005年1月21日保藏在加拿大国际保藏单位并且登记号为210105-01的菌株。

实施例2

在一个广泛的方面中，该研究的目的是评价不同经口剂量的本文中所述非致病性F18菌株对其粪便排泄和抗F18全身体液应答的影响。

下表1一般地概述了研究日程安排：

I-研究设计

a)动物

采集50只哺乳期仔猪的血样用于F18受体状态检测分析，并且标记仔猪的耳朵。所选择的年龄在17至20天之间的断奶猪(雄性和雌性)购自位于加拿大魁北克的Montérégie的当地农场。将动物运送到隔离设施中。所选农场表现为最近(小于6个月)无猪繁殖和呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)以及断奶后疾病事件。猪是健康的猪并且重量在4Kg至6Kg之间。总共使用对F18受体状态呈阳性的二十一(21)只猪，使用耳标号码将其随机分为三(3)个组，每组7只动物(三种不同的F18组合物剂量)。在断奶后第2天，采集粪便样本以使用PCR确定F4阳性菌株和F18阳性菌株定殖的存在。在断奶后第2天未发现对F4阳性或F18阳性细菌呈阳性的动物。

b)居住和喂养

将处理组容纳在独立房间中。在研究期间，动物随意获取水并每日喂养两次。动物饮食由如美国专利US 6,355,859(其全部内容通过引用整体并入本文)所述的高大豆粉构成。在研究期间不同时施用药物或接种疫苗。

c)菌株制备和施用

以相同方式制作两条生长曲线来评价非致病性F18菌株获得其最佳产率所需时间。工作种子(Working Seed，WS)用于制备生长曲线和用于制备F18组合物的培养物。使用1毫升的WS来接种500mL的无动物来源材料的胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth)。在搅拌下(180rpm)使培养物于37℃孵育约6.5小时。进行活菌计数来估计F18菌株培养物的产率并且使用PCR反应来证实测定期间使用了合适的菌株。基于这些结果，使用无动物来源材料的无菌TSB调整培养物以满足待测试剂量：组1，5×10⁸CFU/剂；组2，1×10⁹CFU/剂；以及组3，5×10⁹CFU/剂。

对每一种制剂制备九(9)种剂量的非致病性F18菌株组合物，比待处理的仔猪数目多2以补偿任何组合物损失。将六(6)mL的F18组合物经口施用于每只仔猪。在断奶后第5天使用食道导管施用F18组合物。II-观察和评价

a)总体健康状况

每日观察两次仔猪的总体健康状况：行为、脱水、食欲和一般身体状况。还评价运动性和毛发外观。

b)腹泻

每日对粪便黏稠度的评分如下：0，正常；1，糊状；2，存在液体，但是固体颗粒比液体更多；3，存在的液体多于固体颗粒；以及4，完全为液体。

c)所施用的非致病性F18菌株的排泄

在断奶后第2天和第5至19天，在Luria-Bertoni(LB)肉汤中富集后，通过PCR测试粪便(多重：LT、STa、STb和F4；F18、Stx2e和AIDA)以评价各组中施用的非致病性F18菌株的存在。认为对F18呈阳性的样本对施用的非致病性F18菌株呈阳性。在断奶后第5至8天、第10、12、14、16、18和19天，使用胰蛋白胨大豆琼脂II(Tryptic Soy Agar II，TSA II)-5％绵羊血在粪便样本上进行活茵计数来评价在施用之后所排泄的施用的非致病性F18菌株的水平。仅对具有典型大肠杆菌形态的溶血性茵落进行计数。

d)免疫评价

在断奶后第5、10、12、15和19天采集血样以通过ELISA根据施用的非致病性F18菌株的剂量评价最佳免疫应答。

III-尸检

a)尸检

在接种疫苗3天后(断奶后第8天)，对随机选择的2只动物进行第一次尸检，并且评价大体异常。因此在研究结束时，对断奶后第19天(接种疫苗后第14天)的所有剩余动物进行第二次尸检。

b)肠内容物黏稠度

对空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠中肠内容物黏稠度的评分如下：0，正常；1，糊状；2，存在液体，但是固体颗粒比液体更多；3，存在的液体多于固体颗粒或完全为液体。

c)疫苗菌株在回肠的定殖

在距离回盲肠连接处大约10cm处对2厘米的回肠部分进行取样。使用TSA II-5％绵羊血进行活细菌计数，其中仅对具有典型大肠杆菌形态的溶血性菌落进行计数。

IV-结果

贯穿整个研究，未在经处理动物和对照动物两者中观察到死亡率。根据PCR-RFLP方法，选择的所有猪对F18受体呈阳性。通常，仔猪在整个研究中健康状况良好。几乎没有动物表现为在施用非致病性F18菌株之前或者由于损伤而出现降低的运动性，因此与非致病性F18的施用不相关。

在该研究期间，得分为2或更高被认为是腹泻。在21只动物中，5只在施用F18后显示出暂时性轻微腹泻。1只动物(第3组中的第5只猪)有腹泻(得分为3)，持续2天(表2a、2b和2c)。

每天通过PCR测试粪便样本以检测所施用F18菌株的存在；第2组中的3只动物(1×10⁹CFU/剂)最迟在疫苗接种11天后对施用的F18菌株呈阳性，其中第3组(5×10⁹CFU/剂)中1只仔猪在疫苗接种10天后、1只在疫苗接种8天后以及3只在疫苗接种7天后呈阳性。对于第1组(5×10⁸CFU/剂)，1只仔猪在疫苗接种8天后对施用的非致病性F18菌株呈阳性，1只仔猪在疫苗接种7天后以及2只在疫苗接种6天后呈阳性(表2a、2b和2c)。

表2a施用5×10⁸CFU/剂的组的腹泻的得分、持续时间和严重程度

表2b施用1×10⁹CFU/剂的组的腹泻的得分、持续时间和严重程度

表2c施用5×10⁹CFU/剂的组的腹泻的得分、持续时间和严重程度

＊1粪便黏稠度得分如下：0，正常；1，糊状；2，存在液体，但是固体颗粒比液体更多；3，存在的液体多于固体颗粒；以及4，完全为液体；

＊2第5天：F18施用的菌株施用；

＊3腹泻持续时间(在疫苗接种后时段得分为2或更高的天数；第6至19天)；

＊4腹泻的严重程度(疫苗接种后时段累积的腹泻得分；第6至19天)；

＊5腹泻得分中值；

垂直粗线表示通过PCR检测到F18(疫苗菌株)的最后一天。

ND：未进行

E：空的

D：死亡的(经受尸检)

还通过在5至8天、第10、12、14、16、18和19天从粪便样本中细菌计数来评价施用非致病性F18菌株的粪便排泄。图1示出施用菌株后的排泄。较低剂量(5×10⁸CFU)排泄的细菌水平次于另外两者，从施用1×10⁹CFU剂量的第2组动物中观察到最高的排泄。

没有观察到内脏大体异常。对积聚液体的肠内容物黏稠性进行评价。

在该研究中，得分为2或更高被认为是在尸检日肠段中流体积聚。表3a、3b和3c示出第1组中的1只动物呈现出具有流体积聚(得分为2)的两个连续段。其他的动物未示出流体累积。

在该研究期间未观察到与施用非致病性F18菌株相关的不期望事件，这表明测试的剂量通常安全。

基于菌株排泄评价，PCR和细菌计数两者均表明1×10⁹CFU/剂为获得该菌株延长的粪便排泄的合适剂量。这两种测试均证实与其他测试的剂量相比，以1×10⁹CFU/剂施用的非致病性F18菌株排泄时间更长。

表3a施用5×10⁸CFU/剂的组的肠内容物黏稠度得分和流体在肠内积聚的程度和严重程度

表3b施用1×10⁹CFU/剂的组的肠内容物黏稠度得分和液体在肠内积聚的程度和严重程度

表3c施用5×10⁹CFU/剂的组的肠内容物黏稠度得分和液体在肠内积聚的程度和严重程度

＊1对空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠中肠内容物黏稠度的评分如下：0，正常；1，糊状；2，存在液体但是固体颗粒比液体更多；3，存在的液体多于固体颗粒或完全为液体；

＊2在肠中积聚流体的程度(评分为2或更高的肠段的数量)

＊3腹泻的严重程度(对肠段积累的黏稠性肠内容物评分)

＊4肠内容物黏稠度评分的中值

ND：未进行

实施例3

在一个广泛的方面中，该研究的目的是评价包含本文中所述非致病性F4和F18大肠杆菌菌株的组合的组合物的效力。

下表4一般地概述了研究日程安排：

天数	事件
		0	猪到达实验单位并分为2组
0至5	适应期
		1、12、14、16、18和19	粪便取样用于PCR
4、12、17和19	血样
		5	经口施用剂量或安慰剂
12、13和14	攻击
		12、14、16、18和19	粪便取样用于攻击菌株的活菌计数
19	最终尸检并且结束实验

I-研究设计

a)动物

采集50只哺乳期仔猪的血样用于F18受体检测分析，并且标记仔猪的耳朵。所选择的年龄在17至21天之间的断奶猪(雄性和雌性)购自位于加拿大魁北克的Montérégie地区的商业农场。将动物运送到隔离设施中。所选农场表现为最近(小于6个月)无猪繁殖和呼吸综合症(PRRS)以及断奶后疾病事件。猪是健康的猪并且重量在4Kg至6Kg之间。

总共使用二十(20)只猪，使用耳标号码将其随机分开。使用随机函数发生器(randomizer)软件来随机将20只动物分配为两(2)组，每组10只动物(对照组和施用组)。在断奶后第1天，采集粪便样本以使用PCR分析来确定来源于农场的致病性F4-ETEC阳性菌株和F18-ETEC/STEC阳性菌株定殖的存在。靶向的基因是STa、STb、LT、F4、Stx2和F18。在断奶后第1天未发现对F4-ETEC或F18-ETEC/STEC细菌呈阳性的动物。

b)居住和喂养

将处理组和对照组容纳在独立房间中。在研究期间，动物随意获取水和饲料。动物饮食由如US 6,355,859所述的高大豆粉构成。在研究期间不同时施用药物或接种疫苗。

c)菌株制备和施用

将再水化的组合的组合物稀释以获得每6mL剂量最低5×10⁸CFU/菌株。安慰剂由6mL的无菌水构成。使用具有橡皮管的注射器经口施用组合的组合物和安慰剂。

d)攻击菌株(F18-STEC EcL14724)制备和施用

该攻击菌株在2013年7月9日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号090713-01。

制备培养物以获得1×10¹¹CFU/仔猪的感染剂量。在施用10mL的1.2％碳酸钙(CaCO₃)后，使用食道导管向每只仔猪经口施用五(5)mL的攻击菌株。在连续三(3)天期间(即断奶后第12、13和14天)以每天1×10¹¹CFU/剂的浓度施用攻击菌株。

e)观察和评价

每日观察两次仔猪的总体健康状况：行为、食欲、一般身体状况、运动性并评价毛发外观。每天观察一次脱水和体温。通过PCR和活细菌计数(CFU)来评价攻击菌株的排泄。使用特定酶联免疫吸附测定(ELISA)分析血样。结果以相对于阳性对照的阳性百分比(PP％)来表示。

II-尸检

如下测定攻击菌株在回肠和盲肠的定殖。在距离回盲肠连接处大约10cm处对2厘米回肠部分以及盲肠的一部分进行取样。使用TSA II-5％绵羊血进行活细菌计数，其中在37℃孵育12至18小时后仅对具有典型大肠杆菌形态的溶血性茵落进行计数。

III-结果

a)一般信息

在所测试的50只仔猪中，30只对F18菌株黏附敏感并且随机选择20只动物用于试验。通常，在攻击前仔猪健康状况良好。

下表5示出排泄出的来自经处理动物和对照动物粪便的攻击菌株的PCR结果：

如在表5中所示，与接受安慰剂的猪相比，施用组合的组合物的猪排泄更低的攻击菌株。超过一半的安慰剂动物(56％)在最后一次攻击后第5天(研究结束)仍会排泄攻击菌株，然而早在最后一次攻击后第4天就未在用组合的组合物处理的动物中检测到攻击菌株。

图2示出来自经处理动物和对照动物粪便的排泄的攻击菌株的活细菌计数(CFU)/g。在断奶后14天(攻击后0天)从经处理动物和对照动物两者中均看出排泄的攻击菌株的浓度峰。在经处理的动物中，粪便中攻击菌株的浓度在攻击后第2天(断奶后第16天)开始降低，并且观察到在最后一次攻击后第4天和第5天其相较于安慰剂进一步降低。这些结果与PCR结果相一致。更确切地说，在最后一次攻击后第5天(研究结束)，施用组合的组合物使攻击菌株的排泄水平降低约2log。

b)攻击菌株定殖回肠和盲肠

对于肠组织段(回肠和盲肠)两者，观察到经处理动物和安慰剂动物之间肠道定殖的差异。图3表明施用组合的组合物显著降低攻击菌株定殖肠道。更确切地说，在最后一次攻击后第5天(研究结束)，施用组合的组合物使攻击菌株对回肠和盲肠的定殖降低约2log。

c)免疫应答评价

使用特定ELISA评价血清样本中针对F18菌毛的全身lgM的存在。施用后7天，经组合的组合物处理的动物就表现出特异性免疫应答(图4)。

基于导致的攻击菌株定殖的降低，排泄和特异性抗-F18抗体的刺激降低，该研究表明经经肠递送包含本文中所述非致病性F18菌株的组合物能够预防F18大肠杆菌肠道细菌感染。

实施例4

在一个更广泛的方面中，该研究的目的是评价本文中所述非致病性F18大肠杆菌菌株的效力。

I-研究设计

a)动物

在动物进入设施之前，在产仔猪单元对10窝哺乳仔猪，每窝10只，一共100只仔猪进行取样以用于分离DNA并通过RFLP-PCR方法筛选F18受体(RF18+)状态。通过按窝划分区组来将三十(30)只RF18+仔猪随机分配在各组之中(1∶1比例)，产生的划分区组大小n＝6。将仔猪分配至以下组之一：施用非致病性F18测试菌株的T1(n＝15)；以及施用安慰剂的T2(n＝15)。

将经处理组(T1)的动物混合在实验房间的畜圈中并且将安慰剂组(T2)的动物混合在另一个实验房间的畜圈中直至攻击阶段。在攻击日(即施用非致病性F18菌株或安慰剂后11天)，将T1组(n＝15)和T2组(n＝15)的动物在攻击前转移入位于攻击房间的2个单独畜圈中。特殊处理组的所有15只猪混合在相应畜圈中。除了在疫苗接种前不给予动物水之外，贯穿整个研究中动物随意获取水。每天用未加药的高大豆粉喂养动物两次(U.S.6,355,859)。

在断奶后第1天，采集粪便样本以使用PCR分析来确定来源于农场的致病性F4-ETEC阳性菌株和F18-ETEC/STEC阳性菌株定殖的存在。靶向的基因是STa、STb、LT、F4、Stx2和F18。未发现在断奶后第1天对F4-ETEC或F18-ETEC/STEC细菌呈阳性的动物。出于动物福利的原因，从研究中撤出T1组的三(3)只动物。并认为这些不良事件与非致病性F18菌株的施用不相关。

下表6一般地概述了所使用的动物：

下表7一般地概述了研究设计：

II-程序和评价

不能混合T1组和T2组动物，原因是受试产品(即活疫苗)的性质要求经处理动物与安慰剂对照分开圈养。由不参与动物阶段的人员制备非致病性F18菌株和安慰剂溶液。将代码“A”和“B”随机分配给非致病性F18菌株和安慰剂溶液。房间随机分配给处理组并标记为房间1和房间2。各个房间具有混合在单一畜圈中的所有的T1组或所有的T2组动物。参与动物阶段并进行实验室分析的人员不知道处理和房间分配。对于尸检阶段，使待尸检的动物的顺序随机分配并将动物再标记为A至AD。进行尸检的人员不知道猪标识和处理。负责的生物统计人员将随机码存放在密封的信封中。

a)非致病性F18菌株的制备和施用

将非致病性F18菌株培养于发酵罐中，然后将细菌冷冻并在-78℃保存于包含200标称剂量的10mL玻璃小瓶中。在使用前于室温下用水稀释冷冻细菌。

在断奶后1天(第0天)以约3×10⁸CFU/2mL剂的剂量施用一次。使用安装有橡皮管的注射器经口施用剂量。对照动物接受相同量的安慰剂溶液(水)。

b)攻击菌株(F18-STEC菌株EcL 14724)

将用于该测定的攻击菌株从先前用EcL 14724菌株(对Stx2、F18ab、AIDA和Paa呈阳性)攻击的仔猪(#381)中再分离。连续3天(研究的11、12和13天)将攻击菌株以1×10¹⁰CFU/猪经口施用一次。使用作为食管插管替代物的明胶胶囊施用各攻击剂量。在施用攻击菌株后，立即以明胶胶囊经口施用卡巴多司(刺激志贺毒素释放的抗生素)以引发志贺毒素的释放。

c)总体健康评价

在攻击时段之前每天观察一次猪的总体健康状况。在第一次攻击之后，每天两次监测动物的总体健康状况(包括抑郁、脱水、食欲)和与水肿病相关的任何临床症状：共济失调、面部或四肢水肿、突然死亡。

d)排放攻击菌株的评价

使用靶向编码F18菌毛的FedA主要蛋白的基因之最大几率数PCR(Most-Probable-Number PCR，MPN-PCR)方法对攻击菌株的粪便排放进行定量。

e)尸检

在第一次攻击后7天进行尸检。使用约2cm²部分的组织利用靶向编码F18菌毛的FedA主要蛋白的基因之最大几率数PCR(MPN-PCR)方法来定量攻击菌株对盲肠的定殖。

III结果

PCR分析表明施用非致病性F18菌株用于预防攻击F18志贺毒素基因的致病性菌株之排泄的效力。观察知最后一次攻击后4天，与安慰剂动物相比，经处理动物的粪便排出减小约2.5log(表8)。在最后一次攻击后4天，93％的安慰剂动物而仅42％的经处理动物排出大于1×10⁵CFU的攻击菌株/g粪便样本(表9)

下表8示出在最后一次攻击后4天排放的攻击菌株：

	排放中值(攻击菌株的CFU/g的粪便样本)
		安慰剂动物	7.8×106
经处理动物	5.2×104

下表9示出最后一次攻击后4天不同细菌载量下排放攻击菌株的猪的比例：

观察知在最后一次攻击后5天，与安慰剂动物相比，检测到经处理动物(施用非致病性F18菌株)的盲肠中攻击菌株减小约1log(表10)。在最后一次攻击后5天，大于约53％的安慰剂动物而仅8％的经处理动物排放大于1×10⁵CFU的攻击菌株/克的盲肠组织(表11)。在最后一次攻击后5天，相较于50％的经处理动物，大于80％安慰剂动物的被大于1×10⁴CFU的攻击菌株/克的盲肠定殖于盲肠(表11)。

下表10示出在最后一次攻击后5天攻击菌株在盲肠的定殖：

	盲肠定殖中值(攻击菌株的CFU/g的盲肠组织)
		安慰剂动物	3.4×105
经处理动物	1.5×104

下表11示出最后一次攻击后5天不同细菌载量下盲肠被攻击菌株定殖的猪的比例：

基于所导致的攻击菌株定殖的降低和排泄的降低，该研究表明经肠递送包含非致病性F18菌株的组合物能够预防F18大肠杆菌肠细菌感染导致的水肿。

以下条款对根据本发明的非限制性实施方案的实施例提供了进一步的描述。

条款：

条款1：分离的大肠杆菌菌株，其于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01。

条款2：根据条款1所述的分离的大肠杆菌菌株，其为冻干形式。

条款3：根据条款1所述的分离的大肠杆菌菌株，其为冷冻形式。

条款4：根据条款1所述的分离的大肠杆菌菌株，其中所述菌株与可喂养用载体联合。

条款5：组合物，其包含根据条款1至3中任一项所述的分离的大肠杆菌菌株和可喂养用载体。

条款6：根据条款5所述的组合物，其还包含表达F4茵毛的分离的活非致病性大肠杆菌。

条款7：根据条款6所述的组合物，其中所述表达F4菌毛的非致病性大肠杆菌是2005年1月21日保藏在加拿大国际保藏单位并且登记号为IDAC 210105-01的菌株。

条款8：用于在动物中预防F18非致病性大肠杆菌肠感染的方法，其包括向所述动物经肠递送有效量的于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的活大肠杆菌菌株。

条款9：根据条款8所述的方法，其中通过经口施用所述活大肠杆菌菌株来获得所述经肠递送。

条款10：根据条款8或9所述的方法，其中所述活大肠杆菌菌株为冻干形式。

条款11：根据条款8或9所述的方法，其中所述活大肠杆菌菌株为冷冻形式。

条款12：根据条款8或9所述的方法，其中所述活大肠杆菌菌株与可喂养用载体联合。

条款13：根据条款8至12中任一项所述的方法，其中所述有效量为至少5×10⁷CFU。

条款14：根据条款8至12中任一项所述的方法，其中所述动物是猪。

条款15：用于在动物中预防由F18致病性大肠杆菌感染引起的水肿病或腹泻的方法，其包括向所述动物经肠递送于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的活大肠杆菌菌株。

条款16：根据条款15所述的方法，其中通过经口施用所述活大肠杆菌菌株来获得所述经肠递送。

条款17：根据条款15或16所述的方法，其中所述活大肠杆菌菌株为冻干形式。

条款18：根据条款15或16所述的方法，其中所述活大肠杆菌菌株为冷冻形式。

条款19：根据条款15或16所述的方法，其中所述活大肠杆菌菌株与可喂养用载体联合。

条款20：根据条款15至19中任一项所述的方法，其中所述有效量为至少5×10⁷CFU。

条款21：根据条款15至20中任一项所述的方法，其中所述动物是猪。

条款22：于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的有效量的活大肠杆菌菌株用于在动物中预防F18致病性大肠杆菌肠感染的用途，所述菌株适于在所述动物中经肠递送。

条款23：于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的有效量的活大肠杆菌菌株在制备用于在动物中预防F18致病性大肠杆菌肠感染的组合物中的用途，所述组合物适于在所述动物中经肠递送。

条款24：有效量的于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的活大肠杆菌菌株用于在动物中预防由F18致病性大肠杆菌感染动物引起的水肿病或腹泻的用途，所述菌株适于在所述动物中经肠递送。

条款25：有效量的于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的活大肠杆菌菌株在制备用于在动物中预防由F18致病性大肠杆菌感染引起的水肿病或腹泻的组合物中的用途，所述组合物适于在所述动物中经肠递送。

条款26：根据条款22至25中任一项所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株适于经口施用。

条款27：根据条款22至26中任一项所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株为冻干形式。

条款28：根据条款22至26中任一项所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株为冷冻形式。

条款29：根据条款22至26中任一项所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株与可喂养用载体联合。

条款30：根据条款22至29中任一项所述的用途，其中所述有效量为至少约5×10⁷CFU。

条款31：根据条款22至30中任一项所述的用途，其中所述动物是猪

条款32：根据条款1至4中任一项所述的分离的大肠杆菌菌株，其用于在动物中预防F18致病性大肠杆菌肠感染，所述菌株适于在所述动物中经肠递送。

条款33：根据条款1至4中任一项所述的分离的大肠杆菌菌株，其用于制备用于在动物中预防F18致病性大肠杆菌肠感染的组合物，所述组合物适于在所述动物中经肠递送。

条款34：根据条款1至4中任一项所述的分离的大肠杆菌菌株，其用于在动物中预防由F18致病性大肠杆菌感染引起的水肿病或腹泻，所述菌株适于在所述动物中经肠递送。

条款35：根据条款1至4中任一项所述的分离的大肠杆菌菌株，其用于制备用于在动物中预防由F18致病性大肠杆菌感染引起的水肿病或腹泻的组合物，所述组合物适于在所述动物中经肠递送。

应注意为了方便读者，标题或副标题可贯穿本发明，其决不应限制本发明范围。此外，本文中提出并公开了某些理论；然而，只要根据本公开内容实施本发明而不考虑任何特定理论或操作方案，则无论它们正确还是错误，都绝不应限制本发明范围。

本领域技术人员应理解贯穿本说明书，没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。本领域技术人员应理解贯穿本说明书，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，其指内含性的或者开放式的并且不排除另外的、未记载的要素或方法步骤。

除非另外定义，否则本文中所用所有技术和科学术语具有与本发明相关领域普通技术人员通常理解的相同含义。在发生冲突的情况下，以包含定义的本文件为准。

虽然本文中所述研究使用了断奶的猪，但是本领域技术人员将易于理解被处理的猪可以作为替代地为“断奶前的猪”。

本文中所用的“大约”、“约”或“大致”应一般地意指在给定值或范围的20％以内，优选在10％以内，并且更优选在5％。本文中给出的数字数量一般是近似的；意指没有明确的陈述时可推断有术语“大约”、“约”和“大致”。

贯穿本说明书引用的所有参考通过引用整体并入本文。

权利要求的范围不应受实施例中所列出的优选实施方案的限制，而应给出与说明书整体相一致的最宽泛解释。

Claims (19)

1.分离的大肠杆菌(E.coli)菌株，其于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01。

2.权利要求1所述的分离的大肠杆菌菌株，其为冻干形式。

3.权利要求1所述的分离的大肠杆菌菌株，其为冷冻形式。

4.权利要求1所述的分离的大肠杆菌菌株，其中所述菌株与可喂养用载体联合。

5.组合物，其包含于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的分离的大肠杆菌菌株和可喂养用载体。

6.权利要求5所述的组合物，其还包含表达F4菌毛的分离的活非致病性大肠杆菌。

7.权利要求6所述的组合物，其中所述表达F4菌毛的非致病性大肠杆菌是于2005年1月21日保藏在加拿大国际保藏单位并且登记号为IDAC 210105-01的菌株。

8.有效量的于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的活大肠杆菌菌株在制备用于在动物中预防F18非致病性大肠杆菌肠感染的药物中的用途，其中所述药物配制成用于向所述动物经肠递送。

9.权利要求8所述的用途，其中通过经口施用所述活大肠杆菌菌株来获得所述经肠递送。

10.权利要求9所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株为冻干形式。

11.权利要求9所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株为冷冻形式。

12.权利要求9所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株与可喂养用载体联合。

13.根据权利要求9所述的用途，其中所述动物是猪。

14.有效量的于2013年6月20日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)并且登记号为200613-01的活大肠杆菌菌株在制备用于在动物中预防由F18致病性大肠杆菌感染引起的水肿病或腹泻的药物中的用途，其中所述药物配制成用于向所述动物经肠递送。

15.权利要求14所述的用途，其中通过经口施用所述活大肠杆菌菌株来获得所述经肠递送。

16.权利要求15所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株为冻干形式。

17.权利要求15所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株为冷冻形式。

18.权利要求15所述的用途，其中所述活大肠杆菌菌株与可喂养用载体联合。

19.根据权利要求15所述的用途，其中所述动物是猪。