CN107523529B - 一种利用大肠杆菌生产肠杆菌肽的工艺及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株大肠杆菌ZNYT2，所述大肠杆菌ZNYT2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年8月23日，保藏编号为：CGMCC NO.12902，分类命名：大肠埃希氏菌。本发明通过优选诱变菌株发酵、双效浓缩、脱色、层析分离、超滤、冻干等工艺，使肠杆菌肽纯品的生产能力大幅度提升，生产成本降低，对肠杆菌肽在畜牧行业领域的应用、推广成为可能。

Description

一种利用大肠杆菌生产肠杆菌肽的工艺及其应用
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种利用大肠杆菌生产肠杆菌肽的工艺及其应用。
背景技术
乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、玉米淀粉、玉米浆干粉、玉米浆等是常用的发酵工业用碳源。牛骨蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母膏、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、牛肉浸粉、大豆粕粉、大豆饼粉等是常用的发酵工业用氮源。碳源、氮源、无机盐和微量元素、生长因子是组成基础发酵生产培养基的成分。通过在基础发酵生产培养基中补充碳源、氮源，进行补料分批高密度发酵工艺优化，可以显著提高生物发酵效价，降低发酵原料成本，缩短发酵生产周期，具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。
近年来随着抗生素的大量使用，细菌耐药性不断形成，致使现有抗菌药物对细菌感染治疗的疗效低下或无效，形成的危害日益严重。如何克服细菌的耐药性是当前的研究重点和热点，科研工作者们正努力寻求新的抗菌策略，这迫切需要开发出新型的抗菌制剂。高效、低毒、不易形成耐药性的抗菌肽作为最有希望代替抗生素的新药制剂倍受国内外科研工作者的关注。
目前国内外对于肠杆菌肽的研究，除了申请人（中农颖泰集团）进入量产阶段外，大部分还是部分科学院校处于实验室初步研究阶段，有关其报道和文献几乎没有。申请人的技术团队经过几年专心研究，已经成功的从实验室研究阶段进入到了大批量生产阶段，肠杆菌肽的发酵生产、分离纯化技术目前在国内外处于领先水平。肠杆菌肽在临床上主要治疗畜禽由于大肠杆菌、沙门氏菌等引起的腹泻，随着肠杆菌肽的工业化生产的实现，逐步会减少、替代抗生素在治疗畜禽腹泻方面的应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的不足之处，提供一种利用大肠杆菌生产肠杆菌肽的工艺及其应用。
本发明的目的是以下述方式实现的：
一株大肠杆菌ZNYT2，所述大肠杆菌ZNYT2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年8月23日，保藏编号为：CGMCC NO. 12902，分类命名：大肠埃希氏菌。
一种利用如上述的大肠杆菌ZNYT2生产肠杆菌肽的工艺，包括以下步骤：
（1）菌种的分离：通过对户外采集样本的富集以及初筛、复筛，从初筛菌株中筛选出产生的抑菌物质能够很好的耐受高温和蛋白酶处理，而且菌株生长迅速，抑菌圈大且明显的菌株S49-2，命名为益生大肠杆菌ZNYT2；
（2）菌种的诱变：将分离得到的益生大肠杆菌ZNYT2原始菌株扩大培养后，配制成菌悬液后，先利用氦氖激光对菌悬液中的菌株进行诱变，经过培养和筛选，挑出生长快速、透明圈直径大的菌株，再利用紫外亚硝基胍进行复合诱变，经过培养和初筛，挑出生长快速、透明圈直径大的菌株，进行复筛，获得稳定高产菌株；
（3）菌种的扩大培养
将步骤（2）中得到的稳定高产大肠杆菌ZNYT2进行菌种活化、摇瓶培养和种子罐培养，获得种子发酵液；
（4）发酵罐中发酵培养
将步骤（3）中得到的种子发酵液接种于发酵罐中的发酵罐培养基上，进行发酵培养获得发酵液；
（5）对步骤（4）中得到的发酵液进行后处理，获得肠杆菌肽
a. 双效浓缩；利用双效分离器在真空条件下进行浓缩；
b. 醇沉：将双效浓缩后的发酵液的含醇量调至体积分数为65%-85%，于4℃下进行醇沉；
c. 离心：将醇沉后的发酵液进行离心分离，收集上清液；
d. 脱色：将离心后的上清液经过氧化铝渗漉柱进行脱色；
e. 醇回收：回收经过脱色后的发酵液中的乙醇至无醇味；
f. 盐析：向经过醇回收后的发酵液中加入硫酸铵，变加边搅拌，加完硫酸铵后继续搅拌1-2h，静置12-15h，离心，收集沉淀，多肽的盐析分离采用饱和硫酸铵溶液法；根据硫酸铵饱和度溶液表可知，1L发酵液加入767g硫酸铵固体；
g. 微滤：将收集到盐析沉淀进行复溶，溶剂为体积分数为20%的乙醇溶液，再将复溶后的溶液通过0.45μm微滤滤膜进行微滤，收集微滤液；
h. 柱层析分离：利用层析柱对微滤液进行柱层析分离，采用梯度洗脱法，收集洗脱液；
i. 超滤：将柱层析的洗脱液通过1000Da超滤膜进行超滤，收集截留液；
j. 冻干：对超滤后的截留液进行低温真空冷冻干燥，即得肠杆菌肽纯品。
所述步骤（5）中的h步骤中所用层析柱为BPG200/500层析柱。
所述步骤（5）中的h步骤中柱层析分离的具体步骤为：
（1）先用纯水冲洗柱子至基线平衡；Buffer A冲洗柱子2CV；
（2）加载样品，上样量为一倍的柱体积；
（3）Buffer A平衡柱子3CV；
（4）Buffer B 0-100%线性梯度洗脱，观察电导变化及谱图，收集目标物质峰；
（5）Buffer B 3CV冲洗柱子至基线及电导降到纯水电导为止，准备下一次上样；
缓冲液： BufferA：1M/L氯化钠；BufferB：纯水；
样品溶液的配制：肠杆菌肽用体积分数为20%乙醇溶液进行溶解，用药用级氯化钠调电导至55ms/cm。
根据上述的工艺生产得到的肠杆菌肽。
根据上述的工艺所制备的肠杆菌肽在饲料领域中的应用。
本发明以筛选产抗革兰氏阴性菌的抗菌肽菌株为目的，通过户外采样，菌株初筛，共筛选出具有抗菌活性菌株25株，经过多轮复筛得到一株具有较好抑菌活性的菌株，经过菌种鉴定确定为益生大肠杆菌ZNYT2。同时对该菌株产生的抑菌物质进行了一些性质评价和菌种诱变，极大的提高了菌株的产抗菌肽能力，使其能够满足工业生产的应用需求。
目前除本发明能够生产纯度达到95%以上的纯品外，国内外未有肠杆菌肽纯品（纯度达到95%以上的）生产。本发明通过优选诱变菌株发酵、双效浓缩、脱色、层析分离、超滤、冻干等工艺，使肠杆菌肽纯品的生产能力大幅度提升，生产成本降低，对肠杆菌肽在畜牧行业领域的应用、推广成为可能。
附图说明
图1是ZNYT2发酵液上清对大肠杆菌的抑菌效果，大肠杆菌1：K88（筛选指示菌）、2：CVCC1497、3：CVCC1499、4：CVCC1506、5：ATCC25922共5株大肠杆菌和6：鸡白痢沙门氏菌CVCC519。
图2是ZNYT2发酵液上清对沙门氏菌的抑菌效果，大肠杆菌1：K88（筛选指示菌）、2：CVCC1497、3：CVCC1499、4：CVCC1506、5：ATCC25922共5株大肠杆菌和6：鸡白痢沙门氏菌CVCC519。
图3是菌液未沸水浴、沸水浴、未高压灭菌和高压灭菌后的抑菌效果图，注释：1,1′,1′′为离心上清，2,2′,2′′为空白培养基，3为离心上清调，pH为中性。
图4是胃蛋白酶和胰蛋白酶混合酶不同处理时间下的抑菌效果图，XP是未经过胃蛋白酶处理上清； P是经过胃蛋白酶处理上清；XT是未经过胰蛋白酶处理上清； T是经过胰蛋白酶处理上清； A是空白培养基。
图5是ZNYT2产生的不同浓度的抑菌活性物质被嗜热菌蛋白酶处理后的抑菌效果图，注：C：代表未加蛋白酶处理样组S：代表加入蛋白酶处理组1/4、1/16：代表样本的不同稀释浓度。
图6是氦氖激光诱变实验结果，注：+代表氨苄青霉素阳性对照，—代表空白培养基阴性对照，编号1-20为部分筛选样本。
图7是紫外亚硝基胍复合诱变实验结果，注：+代表氨苄青霉素阳性对照，—代表空白培养基阴性对照，编号1-4为部分筛选样本。
图8是Butyl Sepharose HP精制纯化图谱（收集目的峰）。
图9是Butyl Sepharose HP 精制HPLC检测图谱。
具体实施方式
一株大肠杆菌ZNYT2，所述大肠杆菌ZNYT2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年8月23日，保藏编号为：CGMCC NO. 12902，分类命名：大肠埃希氏菌。
一种利用如上述的大肠杆菌ZNYT2生产肠杆菌肽的工艺，包括以下步骤：
（1）菌种的分离：通过对户外采集样本的富集以及初筛、复筛，从初筛菌株中筛选出产生的抑菌物质能够很好的耐受高温和蛋白酶处理，而且菌株生长迅速，抑菌圈大且明显的菌株S49-2，命名为益生大肠杆菌ZNYT2；
（2）菌种的诱变：将分离得到的益生大肠杆菌ZNYT2原始菌株扩大培养后，配制成菌悬液后，先利用氦氖激光对菌悬液中的菌株进行诱变，经过培养和筛选，挑出生长快速、透明圈直径大的菌株，再利用紫外亚硝基胍进行复合诱变，经过培养和初筛，挑出生长快速、透明圈直径大的菌株，进行复筛，获得稳定高产菌株；
（3）菌种的扩大培养
将步骤（2）中得到的稳定高产大肠杆菌ZNYT2进行菌种活化、摇瓶培养和种子罐培养，获得种子发酵液；
（4）发酵罐中发酵培养
将步骤（3）中得到的种子发酵液接种于发酵罐中的发酵罐培养基上，进行发酵培养获得发酵液；
（5）对步骤（4）中得到的发酵液进行后处理，获得肠杆菌肽
a. 双效浓缩；利用双效分离器在真空条件下进行浓缩；
b. 醇沉：将双效浓缩后的发酵液的含醇量调至体积分数为65%-85%，于4℃下进行醇沉；
c. 离心：将醇沉后的发酵液进行离心分离，收集上清液；
d. 脱色：将离心后的上清液经过氧化铝渗漉柱进行脱色；
e. 醇回收：回收经过脱色后的发酵液中的乙醇至无醇味；
f. 盐析：向经过醇回收后的发酵液中加入硫酸铵，变加边搅拌，加完硫酸铵后继续搅拌1-2h，静置12-15h，离心，收集沉淀，多肽的盐析分离采用饱和硫酸铵溶液法；根据硫酸铵饱和度溶液表可知，1L发酵液加入767g硫酸铵固体；
g. 微滤：将收集到盐析沉淀进行复溶，溶剂为体积分数为20%的乙醇溶液，再将复溶后的溶液通过0.45μm微滤滤膜进行微滤，收集微滤液；
h. 柱层析分离：利用层析柱对微滤液进行柱层析分离，采用梯度洗脱法，收集洗脱液；
i. 超滤：将柱层析的洗脱液通过1000Da超滤膜进行超滤，收集截留液；
j. 冻干：对超滤后的截留液进行低温真空冷冻干燥，即得肠杆菌肽纯品。
所述步骤（5）中的h步骤中所用层析柱为BPG200/500层析柱。
所述步骤（5）中的h步骤中柱层析分离的具体步骤为：
（1）先用纯水冲洗柱子至基线平衡；Buffer A冲洗柱子2CV；
（2）加载样品，上样量为一倍的柱体积；
（3）Buffer A平衡柱子3CV；
（4）Buffer B 0-100%线性梯度洗脱，观察电导变化及谱图，收集目标物质峰；
（5）Buffer B 3CV冲洗柱子至基线及电导降到纯水电导为止，准备下一次上样；
缓冲液： BufferA：1M/L氯化钠；BufferB：纯水；
样品溶液的配制：肠杆菌肽用体积分数为20%乙醇溶液进行溶解，用药用级氯化钠调电导至55ms/cm。
根据上述的工艺生产得到的肠杆菌肽。
根据上述的工艺所制备的肠杆菌肽在饲料领域中的应用。
1. 产抗菌肽菌株的筛选及性能评价
1.1实验材料：
1.1.1 菌种来源
北京市周边果园、菜园等土壤样本，水塘、河流等水体样本以及猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅等动物粪便样本。
1.1.2 菌株筛选培养基
初筛培养基：LB固体/液体培养基，NB固体/液体培养基，空白琼脂培养基。
复筛培养基：经过培养基优化后，易于抗菌肽产生的培养基为10g/L蔗糖、25g/L酵母粉、5g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、0.2g/L硫酸锰，调pH至6.5左右。
1.1.3 试剂及器材
三角瓶，培养皿，玻璃试管，移液枪，超净工作台，牛津杯，振荡器，离心机，冰箱，MaxQ6000恒温摇床培养箱（Thermo Scientific），诱导剂等。
1.2 实验步骤
1.2.1 菌株筛选
（1）将户外采集的土壤样本、粪便样本按1：10（m/v）质量体积比加入到0.85%的生理盐水中，4℃过夜放置，待菌体充分溶出；水体样本直接用于下一步处理。
（2）将样本溶出液与初筛培养基1：10比例混合后共培养24h，进行菌体富集。
（3）取富集后的菌液，梯度稀释后，用初筛培养基涂布培养24h。
（4）从涂布初筛培养平板中挑选出各种菌落形态不同的菌株，进一步进行纯化培养以及菌种编号保存。
（5）以大肠杆菌K88为指示菌，通过抑菌实验对筛选纯化出来的不同菌株进行复筛，筛选出具有一定革兰氏阴性菌抑菌活性的菌株。
（6）对复筛出具有一定抑菌活性的菌株用其它指示菌（沙门氏菌）进行进一步复筛，筛选出生长迅速，透明圈直径大的菌株，并对菌株进行菌种鉴定，保种备用。
1.2.2 菌种鉴定
（1）将复筛出来的菌株用LB固体培养基进行活化，获得单菌落。
（2）挑取单菌落到装有液体筛选培养基的试管中，37℃摇床培养12h，获得发酵液。
（3）取菌株发酵液，通过光学显微镜进行镜检确定无杂菌污染。
（4）将菌株发酵液（低温运输）交由第三方检测机构做菌种鉴定，确定菌株类别。
1.2.3 动物实验
1.2.3.1菌株S49-2动物毒性实验
试验选用1日龄AA肉鸡公雏280只，随机分为7个处理，每个处理10个重复，每个重复4只鸡，7-35d进行日粮添加试验。分别饲喂6个处理组：1）S49-2菌粉100g/T，菌含量为2×106cfu/g；2）S49-2菌粉200g/T，菌含量为2×107cfu/g；3）S49-2菌粉添加300g/T，菌含量为2×108cfu/g；4）阳性对照效霉素组；5）阳性对照恩拉鼎组；6）阴性对照基础日粮组。
试验于南口动物试验中心进行，采用三层镀锌鸡笼饲养（70 cm × 70 cm）。1日龄24 h光照，2-11日龄光照时间递减至20h，12-28日龄光照时间维持在18h，此后光照时间逐渐增加，至42d出栏时光照时间达到23h，自由采食和饮水。所有肉仔鸡在试验7 d时接种新城疫疫苗，14 d时接种传染性法氏囊疫苗。
1.2.3.2菌株S49-2动物攻毒-治疗实验
试验选用1日龄AA肉鸡公雏240只，随机分为8个处理，每个处理6个重复，每个重复5只鸡。试验第10-14d用大肠杆菌K88攻毒，灌服剂量为0.5 mL，浓度为3×108 CFU/mL，不攻毒组灌服同样剂量的0.75%生理盐水。第15~19d用S49-2或者卡那霉素拌料连续治疗5 d，其余时间正常饲喂，分组情况见下表1。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
试验于南口动物试验中心进行，采用三层镀锌鸡笼饲养（70 cm × 70 cm）。1日龄24 h光照，2-11日龄光照时间递减至20h，12-28日龄光照时间维持在18h，此后光照时间逐渐增加，至42d出栏时光照时间达到23h，自由采食和饮水。所有肉仔鸡在试验7 d时接种新城疫疫苗，14 d时接种传染性法氏囊疫苗。
1.4 实验结果
1.4.1菌株筛选实验结果
菌株筛选实验结果如表2-4所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE008
1.4.2动物实验结果
1.4.2.1菌株S49-2动物毒性实验结果
由表5可见动物生长性能试验结果，7-35d，七个处理组间的平均日增重（ADG）差异不显著、日采食量（ADFI）差异显著（P<0.05）、饲料转化率（FCR）差异不显著。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
1.4.2.2菌株S49-2动物攻毒-治疗实验结果
（1）生长性能
由表6可见，7-35d，八个处理组间的平均日增重（ADG）、日采食量（FI）、饲料转化率（FCR）差异不显著。
Figure DEST_PATH_IMAGE012
（2）临床症状
未见发病。
（3）肠道大肠杆菌计数
回肠样品稀释梯度太高，两次计数无有效数据。盲肠计数结果见表7，治疗前盲肠内容物大肠杆菌数为108级，比攻毒组低1个数量级；治疗后，大肠杆菌数为≤106级，略低于空白组，比阴性组低1个数量级。
Figure DEST_PATH_IMAGE014
1.5 小结
通过对户外采集样本的富集以及初筛、复筛，从789株初筛菌株中共获得具有一定抑菌活性的菌株25株，其中能够产生耐高温活性物质的菌株8株，耐胰蛋白酶活性物质的菌株4株，既耐高温又耐蛋白酶活性物质的菌株13株，但25株菌产生的抑菌物质用嗜热菌蛋白酶处理1h后均失去抑菌活性，这说明筛选出的25株菌产生的抑菌物质属于肽类物质，其中菌株S49-2产生的抑菌物质能够很好的耐受高温和蛋白酶处理，而且菌株生长迅速，抑菌圈大且明显，因此，最终选择菌株S49-2做为目标菌株进行菌株鉴定和菌株性能的进一步评价。
通过菌种鉴定，确定筛选出的能够产生抑菌活性物质的菌株S49-2为益生大肠杆菌ZNYT2，通过动物攻毒实验和相关文献资料证明该菌株安全无毒，且对动物生产性能具有一定程度的提高，因此可以用于进一步的性能研究。
2. 抑菌活性物质成分确定
2.1实验材料
2.1.1菌种来源
户外采样筛选获得的益生大肠杆菌ZNYT2菌株。
2.1.2发酵培养基
10g/L蔗糖、25g/L酵母粉、5g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、0.2g/L硫酸锰，调pH至6.5左右。
2.1.3试剂及器材
三角瓶，培养皿，玻璃试管，移液枪，超净工作台，牛津杯，振荡器，离心机，冰箱，MaxQ6000恒温摇床培养箱（Thermo Scientific），LB培养基，冰箱等、胃蛋白酶（sigma）、胰蛋白酶（sigma）、水浴锅、电炉子（带石棉网）。
2.2实验方法
2.2.1抑菌活性物的提取
（1）从-80℃冰箱内将菌株ZNYT2划线活化，挑取单菌落接种子液摇床培养12h，按2%接种量转接摇瓶（30ml/250ml），培养24h后取菌株发酵液4℃、9000rpm离心5min，收集上清；
（2）将收集到的上清液在65℃烘箱中烘干浓缩为原体积的1/10；
（3）浓缩后上清沸水浴10min后，4℃、9000rpm离心5min再次离心，收集上清；
（4）二次收集的上清液与正丁醇1:2（v:v）混合，通风厨中搅拌2-4h；
（5）静置分层后，上清用旋转蒸发仪蒸干；
（6）10ml左右去离子水重悬；
（7）离心，去除沉淀，保留上清。
2.2.2抑菌活性物质成分确定
2.2.2.1抑菌活性检测
取3.1（6）重悬后的抑菌活性成分，对实验室保存的大肠杆菌和沙门氏菌进行抑菌试验。发现对大肠杆菌K88、 CVCC1497、CVCC1499、CVCC1506、ATCC25922共5株大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌CVCC519有抑菌活性。
2.2.2.2热处理实验
取3.1（6）重悬后的抑菌活性成分，分别于100℃煮沸处理0min、30min、60min、90min、120min；121℃高压灭菌处理15 min、30min、60min、90min后，采用牛津杯法测定其抑菌活性。
2.2.2.3胃蛋白酶和胰蛋白酶处理实验
取3.1（6）重悬后的抑菌活性成分，分别加入0.35g/100ml胃蛋白酶调pH至3.0，37℃水浴处理30min，0.1g/100ml胰蛋白酶调pH至7.0，37℃水浴处理30min、60min、90min、120min后，将胃蛋白酶处理样本调至pH7.0后，采用牛津杯法做抑菌实验，比较酶处理前后对抑菌活性的影响。
2.2.2.4嗜热菌蛋白酶处理
取3.1（6）重悬后的抑菌活性成分，分别稀释不同倍数，加入嗜热菌蛋白酶，70℃处理30min、60min后，冷去到常温，采用牛津杯法做抑菌实验，比较酶处理前后对抑菌活性的影响。
2.3实验结果
2.3.1抑菌实验结果
用ZNYT2发酵液上清对实验室保存的大肠杆菌和沙门氏菌进行抑菌试验。见图1为不同培养基条件下的抑菌效果。通过抑菌实验发现ZNYT2发酵液上清对大肠杆菌1：K88（筛选指示菌）、2：CVCC1497、3：CVCC1499、4：CVCC1506、5：ATCC25922共5株大肠杆菌和6：鸡白痢沙门氏菌CVCC519有抑菌活性，其中+：氨苄青霉素阳性对照、-：空白培养基阴性对照。
2.3.2热处理实验结果
图2为菌液沸水浴和高压灭菌后抑菌效果图，从图中可以看出沸水浴120 min,高压灭菌90min均不会使抑菌效果失活，在不同时间点抑菌效果相当,说明ZNYT2产生的抑菌活性物质有较高的高温耐受性。
2.3.3胃蛋白酶和胰蛋白酶处理实验结果
从试验结果可以看出，ZNYT2产生的抑菌活性物质能够耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶，最长时间可达5.5h，且抑菌活力基本不减弱。
2.3.4嗜热菌蛋白酶处理实验结果
从试验结果可以看出，ZNYT2产生的不同浓度的抑菌活性物质被嗜热菌蛋白酶处理后，抑菌活力明显减弱甚至消失。
2.4小结
从实验结果可以看出，该菌株产生的抑菌活性物质对5株大肠杆菌和1株沙门氏菌具有较好的抑菌活性，同时该活性物质具有较好的热耐受性和胰蛋白酶耐受性。但是该活性物质经过嗜热菌蛋白酶处理不同时间后活性减弱直至消失，这说明该活性物质是一种耐热且耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白类物质，具体结构需要做进一步结果鉴定。
3. 产抗菌肽菌株的菌种诱变
3.1实验材料
3.1.1菌种来源
本实验所用的原始出发菌株ZNYT2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年8月23日，保藏编号为：CGMCC NO. 12902，分类命名：大肠埃希氏菌。
3.1.2主要培养基
斜面培养基：LB液体培养基：将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g NaCl溶于水并用水定容至1L，自然pH。
筛选培养基：10g/L蔗糖、25g/L酵母粉、5g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L硫酸镁、0.2g/L硫酸锰，调pH至6.5左右。
3.1.3试剂及器材
三角瓶，培养皿，玻璃试管，移液枪，超净工作台，诱变箱，磁力搅拌器，离心机，氦氖激光诱变器，亚硝基胍，MaxQ6000恒温摇床培养箱（Thermo Scientific），诱变剂：亚硝基胍（sigma公司生产），其它试剂均为国产分析纯。
3.2实验方法
3.2.1细菌培养及菌悬液制备
1）从-80℃冰箱取出冷冻保存的ZNYT2原始菌株，接种于LB斜面培养基上，37℃培养12小时。
2）从斜面上取菌落接种于LB液体培养基（每个250ml的锥形瓶装有30ml LB液体培养基）、37℃、220rpm振荡培养12小时至对数生长期。
3）菌悬液的制备：将菌体培养液装入30ml离心管中5000r/min离心3min，弃上清，将菌体用生理盐水洗涤两次，再用生理盐水将菌体制成菌悬液，并将浓度稀释至107-108cfu/mL备用。
3.2.2诱变处理
3.2.2.1氦氖激光诱变
1）取适量菌悬液置于已灭菌的小玻璃试管中用He-Ne激光照射，He-Ne 激光输出功率20mw,扩束光斑直径0.2cm，照射距离30cm，照射剂量分别为：15min、20min、25min、30min，对照组（CK）0min。
2）对诱变后的菌悬液进行中间培养9-10h后，用生理盐水进行系列梯度稀释，涂布于初筛培养基上进行初步检测。
3）对初筛培养基上长出的单菌落移接筛选液体培养基（每个250ml的锥形瓶装有30ml 筛选液体培养基）、37℃、220rpm振荡培养20小时至稳定期，在LB培养基平板上（加入相应指示菌）用管碟法对菌株进行筛选，将其中生长快速、透明圈直径大的菌株挑出保存，菌株命名为ZNYT2-1、ZNYT2-2、ZNYT2-3、、、、、、ZNYT2-n、并用于下一步诱变。
3.2.2.2紫外亚硝基胍复合诱变
1）对经过He-Ne激光诱变获得的高产菌株按照菌悬液制备方法制备相应的菌悬液，备用。
2）紫外诱变：取步骤1）中适量菌悬液于培养皿中（菌液厚度为2mm），置于诱变箱中磁力搅拌器上，照射条件：紫外灯20W 、20cm处，分别照射60s、90s、1200s、1500s、180s，计算致死率确定处理时间。
3）亚硝基胍（NTG）诱变：按100mgNTG:1mL丙酮的比例配置亚硝基胍溶液，以0.3g/L浓度、37℃、100r/min处理菌悬液，分别处理30min、40min、50min、60min，梯度稀释后平板计数，根据致死率确定处理时间。再将亚硝基胍按照不同浓度加入到菌悬液中（0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L），处理一定时间，根据菌落计数结果，计算致死率确定处理剂量。
4）复合诱变：以紫外诱变和亚硝基胍诱变的最佳诱变剂量对菌悬液进行复合诱变。
5）对复合诱变的菌液进行中间培养9-10h后，用生理盐水进行系列梯度稀释，涂布于筛选培养基上进行初步检测。
6）对筛选培养基上长出的单菌落移接筛选液体培养基（每个250ml的锥形瓶装有30ml LB液体培养基）、37℃、220rpm振荡培养20小时至稳定期，在LB培养基平板上（加入相应指示菌）用管碟法对菌株进行筛选，将其中生长快速、透明圈直径明显大的菌株挑出，进行复筛。
7）菌株复筛：将初筛出的菌株先移接斜面，再取一环菌接种于LB液体培养基（每个250ml的锥形瓶装有30ml LB液体培养基）、37℃、220rpm振荡培养15小时至对数期，再按5%接种量接入筛选培养基中，37℃、220rpm振荡培养32h，用高效液相色谱检测发酵液中抗菌活性物质的含量，确定经过三轮诱变后的稳定高产菌株。
3.2.3诱变菌种稳定性研究
3.2.3.1菌株传代培养
将实验室保存的复合诱变后菌株接种于筛选培养基中，37℃、220rpm振荡培养，每15h传代一次，连续传代10次，均按照5%的接种量进行接种。
3.2.3.2菌株形态学观察
在传代培养过程中，每一次传代前都对菌液和液体培养基中的菌体状态进行观察，记录菌株传代过程中的状态变化。
3.2.3.3抗菌活性物质含量测定
连续传代10次后的菌液作为种子液，按5%的接种量接种于发酵培养基中，在发酵罐中发酵培养24h后，用高效液相色谱检测发酵液中抗菌活性物质的含量。
3.3实验结果
3.3.1氦氖激光诱变实验结果
以大肠杆菌K88为指示菌，对氦氖激光诱变后获得的60个单菌落的抑菌能力进行初筛，最终获得生长迅速、抑菌圈大且明显的诱变菌株6株，分别命名为ZNYT2-1、ZNYT2-2、ZNYT2-3、ZNYT2-4、ZNYT2-5、ZNYT2-6，并应用于下一步诱变，部分筛选实验如图5如所示。
3.3.2紫外亚硝基胍复合诱变实验结果
对氦氖激光诱变后获得的6株菌进行第二轮复合诱变，共获得单菌落200个，以大肠杆菌K88为指示菌，对这些复合诱变后的单菌落的抑菌活性进行初筛，最终获得生长迅速、抑菌圈大且明显的诱变株3株，分别命名为ZNYT2-F1、ZNYT2-F2、ZNYT2-F3，并保存应用于下一步复筛，对其产生抗菌活性物质的能力进行评估。
通过液相的检测结果可以看出，ZNYT2-F1、ZNYT2-F2、ZNYT2-F3产生抗菌活性物质的能力明显高于原始菌株，其中ZNYT2-F2的生产能力最强，因此选用ZNYT2-F2做进一步应用研究，部分筛选如图6所示。
3.3.3诱变菌种稳定性研究结果
3.3.3.1菌株形态变化
菌株ZNYT2-F2在连续传代过程中，无论菌液状态还是菌体形态特征均未发生明显变化，保持良好的稳定性。
3.3.3.2菌株代谢状况
菌株ZNYT2-F2在连续传10代后的菌株，接种发酵罐发酵24h后，通过液相色谱对菌液中的二号抗菌肽含量进行检测，结果发现传代后的ZNYT2-F2菌株仍然保持二号抗菌肽的高产性能，可以满足生产过程中对菌株稳定性的要求，具体实验结果如下表8所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
3.4小结
益生大肠杆菌ZNYT2原始菌株经过He-Ne激光诱变、紫外-亚硝基胍复合诱变，三轮诱变后获得一株产抑菌活性物质含量1500-2000mg/L的高产菌株，较原始出发菌株（50-100mg/L）生产能力提高了10倍以上。
连续传代后，菌株的生产性能稳定，说明多重诱变可以提高益生大肠杆菌ZNYT2生产抑菌活性物质的性能，能够满足生产应用过程中对菌株生产性能稳定性的要求。
4. 菌种培养
4.1平板培养基的配制
4.1.1培养基配方
培养基配方如表9所示。
Figure 844860DEST_PATH_IMAGE017
配方中含有酵母浸粉、蛋白胨、NaCl和琼脂粉。其中酵母粉和蛋白胨为微生物主要提供氮源，NaCl提供无机盐，而琼脂粉起到凝固的作用。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。
由于益生大肠杆菌ZNYT2的菌种特性，需要将其pH调至中性或微碱性，以利于菌种的生长繁殖。
4.1.2原料和器材
原料和器材如表10所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE018
4.1.3操作步骤
①称量
按培养基配方比例依次准确地称取酵母浸粉、蛋白胨、NaCl、琼脂粉放入烧杯中。蛋白胨易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称量时防止交叉污染。
②溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，加入适量热水使其溶解。待完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
③pH值的调节
在未调pH前，先用酸度计测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用酸度计测其pH值，直至pH达7.5。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意防止pH值调节偏高，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。
④灭菌
将上述培养基以1.05kg/cm2，120～121℃，20min～25min高压蒸汽灭菌。
⑤倒平板
当灭菌后的培养基温度降到45～50℃左右时，在超净工作台内倒平板，把培养基倒入培养皿内。
⑥无菌检查
将制备好的空白平板放入37℃的温室中培养48h，检查有无杂菌出现。若无杂菌，放4℃冰箱备用。
4.2菌种活化
①准备：
1把镊子；
1个装有20ml无菌水的三角瓶；
若干支装有4.5ml无菌水的试管；
一个1ml移液器（若干相应的吸头，灭菌备用）；
若干无菌平板。
②操作步骤：
在超净工作台上，用消毒液擦拭甘油管表面。待甘油管内菌液彻底溶化后，用接种环粘取一环到平板上划线，使菌体分布均匀。用移液器取0.5ml（可适当减少）甘油管菌液至装4.5ml无菌水的试管中，吹吸数次，使之均匀，此稀释倍数为10-1，然后再取0.5ml到另一试管中，如此重复，至取0.5ml（可适当减少）最后稀释菌液划线平板上菌落数大概在50左右最好，稀释倍数分别为10-2，10-3，10-4…… 挑选适当的几个稀释倍数，用接种环分别粘取稀释菌液到平板上划线，37℃培养。挑选菌落数适中的几个平板，从中挑选菌落形态正常，菌落较大的单菌落，转接到平板上，37℃培养。
5. 一级摇瓶培养
5.1 一级摇瓶培养基配方
一级摇瓶培养基配方如表11所示。
Figure 496421DEST_PATH_IMAGE019
培养基的pH调至中性或微碱性，以利于菌种的生长繁殖。
5.2原料和器材
原料和器材如表12所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE020
5.3操作步骤
①称量
按培养基配方比例依次准确地称取酵母浸粉、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称量时防止交叉污染。
②溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，加入适量热水使其溶解。待完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
③pH值的调节
先用酸度计测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用酸度计测其pH值，使其pH值调至7.0～7.5。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意防止pH值调节偏高，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。
④分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在瓶口上，以免沾污棉塞或封口膜而引起污染。
⑤加塞
培养基分装完毕后，在三角烧瓶口上塞上棉塞或封口膜，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
⑥包扎
加塞或封口膜后，将全部试管用线绳捆扎好，再在棉塞或封口膜外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶封口后，外包牛皮纸，用线绳以活结形式扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
⑦灭菌
将上述培养基以1.05kg/cm2，120～121℃，20min～25min高压蒸汽灭菌。
5.4挑菌及菌种培养
①待平板生长20h左右时，挑取生长良好的单菌落，接入摇瓶种子培养基。
②待摇瓶种子长好后，转接到种子罐。
6. 种子罐培养
6.1种子罐培养基配方
种子罐培养基配方如表13所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE022
6.2种子罐培养条件
PH：灭菌前7.0～7.5，灭菌后6.5～7.0，培养过程中不控制；灭菌条件：120～121℃灭菌，保压20min～25min，预热到90℃后，开始直接进蒸汽灭菌。
种子量：1-3.0%；温度：35～37℃；风量：1：0.3～1：0.8；罐压：0.03～0.05Mpa；转速：40～100rpm；发酵液pH：灭菌前7.0～7.5，灭菌后6.5～7.0，培养过程中不控制，为自然pH。
6.3种子罐取样检测要求
种子罐取样检测要求如表14所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE024
当种子罐内的检测结果如表15所示时，种子罐培养结束。
Figure DEST_PATH_IMAGE025
7. 发酵罐培养
7.1 发酵罐培养基配方
发酵罐培养基配方如表16所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE027
7.2培养条件
pH：灭菌前7.0～7.5（灭菌前用NaOH溶液调节），灭菌后6.5～7.0，培养过程中7.0-7.5。
灭菌条件：120～121℃灭菌，保压25min～30min，预热到90℃后，开始直接进蒸气灭菌。
移种量：1.0%～3.0%；培养温度：35～37℃；风量：1︰0.3～1︰0.8，罐压：0.02～0.03Mpa；转速：70～100rpm；溶氧：0%～80%。
7.3发酵罐取样检测要求
发酵罐取样检测要求如表17所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE028
当发酵罐内的检测结果如表18所示时，发酵罐培养结束。
Figure DEST_PATH_IMAGE030
8. 双效浓缩
8.1开机前的准备工作
8.1.1打开分汽缸上的总蒸汽阀门，打开疏水阀，将冷凝水排净；
8.1.2检查设备是否清洗干净，如有结垢，要重新清洗；
8.1.3打开平衡槽物料阀门，将物料放至所需位置；
8.2开机
8.2.1打开机械密封处循环水进水阀、回水阀；
8.2.2依次启动进料泵、循环泵、出料泵，同时打开大回流阀，关闭出料阀；
8.2.3当大回流阀有物料流出时，启动真空泵、给水泵。启动真空泵，打开水环泵工作给水泵；通过玻璃视镜观察冷凝水水位情况。启动或停止冷凝水泵。
8.2.4二效分离器真空度达到-0.07 MPa时，打开杀菌器和热压泵的蒸汽阀。调热压泵工作压力0.4 MPa左右，杀菌器壳程真空度 -0.03～-0.05 MPa。
8.2.5调节冷却水排水温度至30～36ºC，调节进料量。
8.2.6让物料在平衡槽内进行大循环，严格按工艺要求调节进料量和杀菌温度。
8.2.7当大回流管物料浓度接近要求浓度时，开出料阀，同时关闭大回流阀，并根据出料浓度，可适当调整蒸汽压力和进料量的大小，使双效后浓度达到工艺要求：双效后溶液浓度达到相对密度为1.0-1.1（60℃）的清膏。
8.3清洗
当一个生产班次或一批发酵液处理完毕，需要停车，进行清洗。
8.3.1按《双效降膜蒸发器清洗操作规程》要求进行清洗；
8.3.2清洗注意事项
8.3.2.1各段清洗时应根据结垢程度和清洗过程中杀菌器的加热压力及温度情况而定；
8.3.2.2清洗时的操作与生产时操作基本相同，当碱液清洗时应把各效蒸发温度提高10～20ºC。酸液清洗时应把各效加热温度降低10～20ºC,当酸液温度达到40ºC（指一效蒸发温度）后应停止加热。
8.3.2.3清洗时的进液量可以调成最大。
8.4停机
8.4.1关闭蒸汽阀、冷却水阀，打开破空阀，破坏真空度；
8.4.2停水环真空泵、冷凝水泵、进料泵、循环泵、出料泵；
8.4.3关闭各泵机械密封处，循环水进回水阀门；
8.4.4关闭设备照明灯。
8.5 记录
及时、如实填写《双效操作记录》。
9. 醇沉
调整双效浓缩液的醇度，用药用级无水乙醇，把双效液的含醇量调至65%-85%，然后在4℃冷库存放12h～24h。
10. 离心
采用GQ75-J管式离心机处理发酵液，12000rpm，200lpH连续离心2次（具体操作见《GQ75-J管式离心机标准操作规程》），收集离心液。
11. 脱色
离心后的上清液经过氧化铝渗漉柱进行脱色。
12. 醇回收
通过QN-500球型浓缩器，回收渗漉液中的乙醇至无醇味；
13. 盐析（硫酸铵沉淀处理）
经过醇回收后的样品进行硫酸铵沉淀处理，加入硫酸铵后会观察到澄清发酵液变浑浊，继续加硫酸铵，边加边搅拌（具体加入量以饱和硫酸铵水溶解进行换算，1L发酵液加入767g硫酸铵固体），加完硫酸铵后搅拌1h，阴凉库静置12h，然后进行离心，除上清留沉淀。
14. 微滤
将收集到盐析沉淀物质进行复溶，使其达到完全溶解为标准。
按照《切向流微滤标准操作规程》，将Cenetrasette系统安装0.45μm微滤滤膜，连接配套蠕动泵，用0.5M NaOH及纯化水清洗微滤系统。清洁完毕，开始将离心上清液微滤，收集透过液，高效液相检测含量，过滤完毕，用纯化水和0.5M NaOH分别处理系统，处理完毕，用0.3M NaOH保存系统。
15. 柱层析分离
按照《Butyl SepHarose HP装柱标准操作规程》，装填BPG200/500层析柱。按照《Butyl SepHarose HP纯化标准操作规程》。
（1）先用纯水冲洗柱子至基线平衡；Buffer A冲洗柱子2CV；
（2）加载样品，上样量为一倍的柱体积；
（3）Buffer A平衡柱子3CV；
（4）Buffer B 0-100%线性梯度洗脱，观察电导变化及谱图，收集目标物质峰（B相增长到10%左右开始出目标物质峰）；
（5）Buffer B 3CV冲洗柱子至基线及电导降到纯水电导为止，准备下一次上样；
缓冲液： BufferA：1M/L氯化钠；BufferB：纯水；
样品溶液的配制：肠杆菌肽用体积分数为20%乙醇溶液进行溶解，用药用级氯化钠调电导至55ms/cm。
Butyl Sepharose HP纯化实验结果如表19所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE031
注：纯度是指主峰面积占总峰面积的百分比。
16. 超滤
按照《切向流超滤标准操作规程》，将Cenetrasette系统安装1000Da超滤滤膜，连接配套蠕动泵，用0.5M NaOH及纯化水清洗超滤系统。清洁完毕，将Butyl SepHarose HP洗脱液进行超滤。高效液相检测含量，符合质量要求的最终截留液，低温储存。过滤完毕，用纯化水和0.5M NaOH分别处理系统，处理完毕，用0.3M NaOH保存系统。
17. 冻干
超滤后的截留液经过低温真空冷冻干燥（低温真空冷冻干燥具体操作见《低温真空冷冻设备操作规程》）。
18. 检测、分装 , 即得肠杆菌肽原料。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一株大肠杆菌ZNYT2，其特征在于：所述大肠杆菌ZNYT2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年8月23日，保藏编号为：CGMCC NO. 12902，分类命名：大肠埃希氏菌。
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WO2014012172A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Prevtec Microbia Inc. Non-pathogenic f18 e. coli strain and use thereof

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２种肠道微生物抗菌肽的特性研究;王秋菊 等;《动物营养学报》;20101231;第22卷(第4期);第1054-1062页 *
土壤中产广谱抗菌肽菌株的筛选及鉴定;唐峰 等;《现代畜牧兽医》;20151231(第2期);第11-14页 *
抗菌肽研究进展;陈轶群 等;《中国畜牧杂志》;20091231;第45卷(第11期);第60-64页 *
肠杆菌肽的研究进展与应用;莫丹 等;《北方牧业》;20160505;第27-28页 *

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