CN114196580B - 一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法 - Google Patents
一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法。其中，所述的淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)菌株的保藏编号为：GDMCC No.61906。本发明获得的菌株在应用于中生菌素产业化生产时，可以使得中生菌素产业化发酵生产水平大幅度提高50％以上，最高达到18000μ/ml以上，由此可以获得中生菌素含量达到500000μ/g以上的大量全水溶的中生菌素母药干粉产品，极大地降低了中生菌素产业化生产成本，为生物农药中生菌素的市场需求奠定了基础，并且满足了绿色生态农业大范围大规模飞防用药等领域的扩展使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体涉及一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法。
背景技术
根据联合国粮农组织(FAO)的统计，全世界农林生产过程中；每年因病虫草害所造成的损失在三分之一以上。全世界每年大约发生300万起化学农药中毒事件。在发展中国家，全球每年因食用农药污染食品引起集体中毒事件大约1650起。因此，大力发展安全、低毒和无毒、低蓄积和无蓄积、不污染环境的生物农药已成为必然的趋势和全球共识。
中生菌素(化学名：1-N甙基链里定基-2-氨基L-赖氨酸-2脱氧古罗糖胺；分子式：C19H34O8N8；分子量：502.0)是一种新型农用抗生素类生物农药，其应用属于杀菌剂类别，用于防治农作物病害。它的产生菌是从海南岛的土壤中分离得到，命名为淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)，保藏号为CGMCC No.1026。作为一种农用抗生素生物农药，其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和丝状真菌具有强烈的抑制或杀灭作用。其通过抑制病原细菌蛋白质的肽键生成，最终导致细菌死亡；对真菌可抑制菌丝的生长、抑制孢子的萌发，起到防治真菌性病害的作用；对水稻白叶枯病，白菜软腐病，苹果轮纹病和苹果叶斑病等具有良好的防效作用；而对人畜类低毒安全，与环境相容友好。
因此，提高中生菌素产业化发酵水平，实现中生菌素产业化节能降耗的同时，扩大中生菌素原药产能，扩大绿色食品生产资料中生菌素的市场占有率，将为人类的食品健康事业添砖加瓦，具有良好的社会效益与经济效益。
中生菌素产业化发酵生产至今已有20年的时间，但实验室研究及产业化发酵生产过程中受到发酵生产过程中的中生菌素产生菌自身代谢产物，诸如葡萄糖效应、自身次级代谢产物中生菌素等诸多单因素和多因素的阻遏和反馈抑制调节，使得中生菌素发酵生产水平无法进一步提高，生物效价在8000μ/ml-12000μ/ml之间徘徊，使得中生菌素母药产品的含量无法进一步提高，限制了生物农药中生菌素母药及其制剂的市场供给需求及在大范围大区域综合应用的飞防等领域延伸扩展使用。
基于此，期望从中生菌素产生菌入手，筛选耐受自身次级代谢产物中生菌素及其其它自身代谢产物的中生菌素高产菌株并应用于产业化发酵生产，实现提高绿色生产资料中生菌素产业化发酵生产水平，获得大量全水溶的中生菌素高含量母药，满足快速发展的绿色生态农业的需求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法。本发明通过获得一种耐受中生菌素产生菌自身次级代谢产物中生菌素及其其它自身代谢产物的高产菌株的技术方法，并将使用该技术方法获得的中生菌素高产菌株应用于产业化生产，使得中生菌素产业化发酵生产水平大幅度提高50％以上，最高达到18000μ/ml以上，获得了中生菌素含量达到500000μ/g以上的大量全水溶的中生菌素母药干粉产品，极大地降低了中生菌素产业化生产成本，为生物农药中生菌素的市场需求奠定了基础并且满足了绿色生态农业大范围大规模飞防用药等领域的扩展使用。
为实现上述发明目的，本发明通过以下几个方面实现：
第一方面，本发明提出了一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株，所述淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)菌株的保藏编号为：GDMCCNo.61906。
第二方面，本发明提出了上述的菌株在生产中生菌素及其制品中的应用。
所述制品优选为含中生菌素的抗菌产品例如防治农作物病害产品。
第三方面，本发明提出了一种中生菌素的发酵方法，包括以下步骤：将上述的淡紫灰链霉菌海南变种菌株接种到培养基后进行发酵培养。
优选地，所述发酵满足以下条件的一种或多种：
发酵温度为26℃-35℃；
空气通气量0.5V/VM-1.5V/VM；
发酵罐搅拌转速50rpm-200rpm；
发酵培养周期为3天-10天；
所述发酵培养基配方包括：葡萄糖4.0％-15.0％，玉米淀粉1.0％-6.0％，玉米粉0.5％-7.5％，黄豆粉3.0％-12.0％，氯化钠0.2％-1.6％，氯化铵0.1％-1.8％，碳酸钙0.2％-1.6％，磷酸二氢钾0.01％-0.13％，硫酸镁0.01％-0.16％，pH6.0-7.0，所述％为质量体积百分比。
第四方面，本发明提出了一种采用上述的淡紫灰链霉菌海南变种菌株发酵得到的发酵液。
上述的发酵液在制备含中生菌素的抗菌产品例如防治农作物病害产品中的应用。
第五方面，本发明提出了一种制备中生菌素或含其的制品的方法，其包括以下步骤：发酵上述的菌株，获得含有中生菌素的发酵液。
优选地，所述方法包括通过提取发酵液，以制备获得中生菌素或含其的制品；
其中，所述提取包括如下步骤：将发酵液调节pH值至3.5-4.5的酸化液；随后，所述酸化液进行固液分离，获得二次透过液；再随后，所述二次透过液进行浓缩，获得浓缩液。
所述方法还包括制备中生菌素母药干粉的步骤：喷雾干燥所述浓缩液，获得中生菌素母药干粉。
优选地，所述固液分离包括：将酸化液进入0.15-0.20μm孔径的陶瓷膜进行固液分离，获得一次透过液，所述一次透过液再进入孔径0.03-0.05μm的陶瓷膜液固分离，获得二次透过液；
所述浓缩包括：将所述二次透过液经过分子量为400Da的纳滤膜浓缩，获得所述浓缩液。
第六方面，本发明提出了一种菌剂，由上述菌株和/或菌株的发酵液制得。
第七方面，本发明提出了一种菌剂的制备方法，其包括以下步骤：发酵上述菌株，获得发酵液。
在上述技术方案中，本案发明人从中生菌素产生菌的源头入手，理性选育耐受自身代谢产物的中生菌素高产菌株，并应用于中生菌素产业化发酵生产，最终提高中生菌素产业化发酵生产水平。
具体过程为：以淡紫灰链霉菌海南变种菌株(保藏号为CGMCC No.1026)的诱变菌种(UV-3)产业化发酵生产中生菌素，选取该产业化发酵生产发酵水平≥10000μ/ml的发酵罐批，以该发酵罐批发酵过程中次级代谢产物中生菌素生产快速增长累积阶段中末段的发酵液中的菌丝体作为筛选耐受自身代谢产物的目标出发菌株，通过累积递减紫外线-光复活复合诱变手段使目标出发菌株获得变异，以同一批中生菌素产业化发酵生产次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段末段的发酵液的滤液的浓缩液作为筛选耐自身代谢产物的中生菌素产生菌的底物因子来源，以含底物因子的浓缩液作为来源来配制梯度浓度培养基，进行理性选育耐受中生菌素产生菌自身代谢产物浓度较高的菌株。组合应用上述目标出发菌株、复合诱变手段、筛选底物因子进行挑选诱变变异耐受较高浓度的自身代谢产物的目标菌株单菌落培养，经过初筛、复筛、稳定性试验，得到中生菌素高产菌株。在大规模产业化发酵过程中该中生菌素高产菌株发酵水平高产性状稳定。
所述理性选育耐受自身代谢产物的中生菌素高产菌株的方法，是根据中生菌素产生菌在整个发酵生长生产过程中产生的中生菌素等自身代谢产物对中生菌素产生菌在产生中生菌素的过程中起到反馈抑制或阻遏的作用，造成中生菌素产业化发酵水平停滞、无法进一步提高发酵水平的问题，从选育中生菌素产生菌所用的目标出发菌株的选择、筛选底物因子的选择、诱变方法的选择以及针对性筛选选育培养基选择等方面入手，理性综合上述各种筛选因子进行设计并对中生菌素产生菌展开诱变、筛选、优化检出，以获得中生菌素高产菌株的方法。
所述中生菌素等自身代谢产物，是中生菌素产生菌在发酵生产过程中利用发酵培养基中的碳源、氮源、磷酸盐等无机盐类并将该碳源、氮源、磷酸盐等分解、转化成为中生菌素产生菌生长生产需要的ATP等能量以及氨基酸、寡肽、多肽、单糖、双糖、多糖，具有生物活性的酶类物质，以及其它中生菌素产生菌生长繁殖所必需的维生素、矿物质等以保证中生菌素产生菌正常生长繁殖，实现从繁殖生长期过渡到产抗生产期，完成该中生菌素产生菌在发酵过程中的菌体生长、增量繁殖的初级代谢过程，进而转入中生菌素生产累积的次级代谢过程；完成中生菌素产生菌菌体生长繁殖、中生菌素生产快速增长累积、中生菌素生产增长停滞、菌体生长衰亡甚至产抗生产下降的周期过程中产生的各种中生菌素产生菌自身代谢产物和中生菌素产生菌对培养基进行分解利用的分解产物。
所述理性选育耐受自身代谢产物的中生菌素高产菌株的目标出发菌株的选择，是根据中生菌素产生菌发酵生长与生产过程历经初级代谢时菌体生长繁殖、进而诱导转换进入次级代谢产生中生菌素产物的发酵生长、生产代谢周期过程中，以中生菌素产生菌生长、生产过程中历经菌体生长繁殖阶段、次级代谢产物中生菌素生产快速增长累积阶段、次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段、菌体生长衰亡阶段的不同阶段中的次级代谢产物中生菌素生产快速增长累积阶段中末段的菌丝体作为理性选育中生菌素高产菌株的目标出发菌株。
所述中生菌素产生菌生长、生产代谢过程中的次级代谢产物中生菌素生产快速增长累积阶段中末段(所述生产快速增长累积阶段中末段是指发酵液的目标次级代谢产物的生物效价或浓度从开始增加至增速达到最大值的后2/3时间段，所述最大值本领域技术人员可以根据通过实时测定确定获得或是通过绘制曲线后推导获得)的菌丝体，是中生菌素产生菌发酵生长生产过程中，中生菌素产生菌已经从初级代谢转换进入次级代谢且生长生产能力最旺盛的菌丝体，以在产业化规模生产中生菌素的自身发酵生长生产环境里生长的次级代谢产物中生菌素生产快速增长累积阶段中末段的菌丝体作为目标出发菌株进行筛选，筛选出来的菌株，更适应中生菌素产业化发酵自身生长与生产过程中的初级代谢产物与次级代谢产物；次级代谢产物中生菌素生产快速增长累积阶段的菌丝体的细胞壁的通透性比菌落孢子的细胞壁通透性更好，更易于接受紫外线-光复活的复合诱变，在理性选育的培养基上更容易筛选出来耐受自身代谢产物的目标菌株，选育出来的目标菌株适应产业化发酵生长与生产环境的能力更强。
所述理性选育耐受自身代谢产物的中生菌素高产菌株的筛选底物因子的选择，是根据中生菌素产生菌发酵生长与生产过程，历经初级代谢菌体生长繁殖、进而诱导转换进入次级代谢产生中生菌素产物的发酵生长生产代谢周期过程中，以中生菌素产生菌生长生产过程中次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段末段富含次级代谢产物中生菌素及中生菌素产生菌生长生产代谢过程中产生的其它各种代谢物质和培养基的分解物质的发酵液的滤液的浓缩液作为理性选育中生菌素高产菌株的筛选底物因子来源。
所述中生菌素发酵次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段末段(所述生产增长停滞阶段末段即发酵放罐的时间段)。中生菌素发酵到次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段末段，发酵液内富含次级代谢产物中生菌素及初级代谢和次级代谢产生的其它各种代谢产物以及培养基的分解物，这些物质起着阻遏或反馈抑制中生菌素的产生，此阶段中生菌素增长缓慢或不再增加；若继续发酵培养就会进入中生菌素生长生产代谢菌体生长衰亡阶段，菌体生长衰亡阶段发酵液内中生菌素自身代谢产物中的有些活性酶等物质甚至会分解已经形成的中生菌素成为其它小分子物质，造成中生菌素发酵水平不再增加，甚至会下跌，造成发酵时间的增加浪费，以及能耗的增加又不能达到提高中生菌素发酵水平的不经济的效果。
在抗生素自身产物耐受菌株选育上，传统方法基本上都是对自身次级代谢产物的反馈抑制，葡萄糖效应的解除、磷酸盐阻遏等的单一因子的耐受选育，所以效果显现较弱。
而与现有技术不同的是，本案所涉及的中生菌素产生菌在其生产代谢过程中的次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段末段的发酵液除富含中生菌素自身次级代谢产物中生菌素外还富含中生菌素生长生产发酵过程中的其它各种复杂的自身代谢产物。选用该次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段末段的发酵液滤液浓缩液作为筛选中生菌素自身代谢产物耐受菌株的筛选底物因子来源，不仅可以解除自身次级代谢产物中生菌素的反馈抑制，还可以解除中生菌素产生菌发酵过程中发酵培养基中分解代谢产生或剩余的各种碳源，如淀粉、多糖、双糖、葡萄糖、戊糖、丁糖、丙糖、α-酮戊二酸、草酰乙酸等；各种氮源，如β-氨基酸的β-赖氨酸等各种氨基酸、寡肽、短肽、多肽以及中生菌素前体物质、可转化为氨基糖苷类抗生素的基本结构单位的产生菌的细胞壁肽聚糖的N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、具有各种生物活性的细胞内、细胞外酶类如氧化还原酶、脱氢酶等的阻遏或反馈抑制。解除所述中生菌素产生菌发酵生产过程中自身产物中生菌素及其生长生产代谢产物的阻遏和反馈抑制，实现对各种阻遏或反馈抑制单因子或多因子以及多重协同因子的耐受，最终实现解除或部分解除该类各种阻遏或反馈抑制对中生菌素生产的影响，是提高中生菌素产业化发酵生产水平的根本所在。
所述理性选育耐受自身代谢产物的中生菌素高产菌株的诱变方法的选择，是采用累积递减紫外线-光复活复合诱变方法，其是将单纯的紫外线照射对中生菌素出发菌株产生的单因子物理诱变，变为出发菌株经紫外线照射产生诱变，再使用自然光日光灯对中生菌素产生菌产生的变异位点进行光复活修复作用的结合应用，成为紫外线-光复活双因子的复合诱变；更进一步地将这种紫外线-光复活的复合诱变进行多次的递减剂量进行累积递减诱变，达到因紫外线照射诱变结果形成的DNA单链或双链间的胸腺嘧啶二聚体的变异位点经过多次的形成二聚体→二聚体解聚→形成二聚体→二聚体解聚→形成二聚体，不再轻易发生回复修复的作用。
所述紫外线-光复活复合诱变方法，紫外线是选用对微生物菌株诱变最有效的区间波长
这一区间紫外线波长的杀菌和诱变作用最好。紫外线的生物学效应能引起DNA的生物损伤与胸腺嘧啶碱基对被二聚化，所以胸腺嘧啶二聚体的形成是紫外线改变DNA生物活性、造成菌体死亡或变异的主要途径，对引起菌体变异也起很大作用。当DNA进行自身复制时，双链先变成单链，然后各自再与附近的碱基形成互补链，然而由于两链间的胸腺嘧啶形成了二聚体，使DNA两条链交联，这样就阻碍了双链的分开和复制。同一链上的相邻胸腺嘧啶形成了二聚体，也会阻碍碱基的正常配对。在正常情况下，胸腺嘧啶与腺嘌呤配对，如果两个相邻的胸腺嘧啶形成了二聚体，就可能改变原来的配对情况，破坏了腺嘌呤的正常掺入，复制就在这一点上突然停止，或错误地进行。如果错误地进行复制，且在新形成的链上有一个改变了的碱基次序，则在随后的复制过程中，碱基次序已改变的DNA链仍照自身进行复制，产生了一个在二条链上碱基次序都是错误的分子因而引起突变；然而，紫外线损伤DNA遗传活性的作用，能被可见光日光灯恢复，这种现象是众所周知的光复活作用。由于被紫外线损伤的物质主要是二聚体，故在光复活酶作用下，二聚体就重新分解成为单体，使DNA恢复正常，所以菌株经紫外线诱变处理后，要避免可见光的照射。紫外线光复活作用，说明紫外线诱变是一个复杂的过程，紫外线的初始效应是诱发遗传物质处于各种类型的亚稳定，从亚稳定过渡到稳定的突变态需要一定的时间，故用时间上累积递减紫外线-光复活复合诱变方法，使用紫外线与可见白光日光灯多次反复处理菌丝体，使该菌丝体已经形成突变出错的各个位点不易回复恢复到初始正常的碱基序列，将能提高菌丝体的变异率和扩大变异幅度。
所述理性选育耐受自身代谢产物的中生菌素高产菌株的针对性筛选选育培养基的选择，是中生菌素产生菌耐受自身生长生产代谢产物的梯度浓度培养基，是将中生菌素产业化发酵过程中的次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段末段富含中生菌素及其自身代谢产物的发酵液的过滤液的浓缩液作为理性选育中生菌素高产菌株的筛选底物因子来源。将富含中生菌素发酵生长生产过程中产生的中生菌素及其其它初级代谢产物、次级代谢产物、培养基分解产物的浓缩液作为筛选培养基的一个主要组成成分，在筛选平皿的培养基上形成自身代谢产物浓度从低到高的渐进浓度升高，实现有针对性地快速地理性选育耐受自身代谢产物的目标高产菌株。受到累积递减紫外线-光复活复合诱变方法诱变产生变异的菌丝体在理性选育的筛选底物因子梯度培养基上能够较快速的表达显现出来，大大减少工作强度。
所述中生菌素产生菌耐受自身代谢产物的梯度浓度培养基，是在经过灭菌的直径90mm的双碟平皿底层铺上一层筛选培养基，给予倾斜放置，待该底层筛选培养基固化后将该培养皿放置水平，然后将富含中生菌素产生菌发酵生长生产过程中产生的中生菌素及其其它初级代谢产物、次级代谢产物、培养基分解物的发酵液的滤液的浓缩液的筛选培养基加入该培养皿，待其固化，由此形成含有中生菌素及其中生菌素产生菌自身代谢产物的各种物质的筛选底物因子浓度从低到高的渐进浓度升高的中生菌素产生菌理性选育的筛选培养基。
所述理性选育耐受自身代谢产物的中生菌素高产菌株的方法，是选取中生菌素产生菌发酵生产中生菌素的过程中次级代谢产物中生菌素生产快速增长累积阶段中末段的具有高活力产生中生菌素能力的菌丝体作为目标出发菌株；选取中生菌素产生菌发酵生产次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段末段的发酵液内的高单位的中生菌素、初级代谢及次级代谢过程中产生的大量的碳源、氮源、磷酸盐、前体物质、生物活性酶等作为耐受的筛选底物因子；以时间与剂量累计递减紫外线-光复活的复合诱变方法作为诱变因子；以中生菌素为代表的自身代谢产物浓度从低到高的渐进浓度升高的梯度浓度培养基的培养皿作为筛选检出已经实现诱变变异的目标菌株的检出工具筛选检出获得菌株。
采用上述的以同一中生菌素产业化发酵生产罐批的发酵生产过程中次级代谢产物中生菌素生产快速增长累积阶段中末段的菌丝体作为目标出发菌株、次级代谢产物中生菌素生产增长停滞阶段末段的发酵液的过滤液的浓缩液作为筛选底物因子来源、累积递减紫外线-光复活复合诱变作为诱变方法、筛选平皿的培养基上形成自身代谢产物浓度从低到高的渐进浓度升高的培养皿作为检出工具筛选培养基的组合筛选方法，进行耐自身代谢产物的中生菌素高产菌株的选育，筛选到一株中生菌素产生菌菌株，经过稳定性验证后应用于40m3发酵罐进行产业化发酵大生产，在与对照菌株产业化发酵相同发酵工艺与周期条件下，筛选到的菌株中生菌素发酵水平提高52.5％，发酵单位可以达到18050μ/ml，由此说明本案所获得的中生菌素产生菌菌株较之于现有技术而言发酵水平得到了极大的提高。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明获得的淡紫灰链霉菌菌株在应用于中生菌素产业化生产时，可以使得中生菌素产业化发酵生产水平大幅度提高50％以上，最高可达到18000μ/ml以上，由此可以获得中生菌素含量达到500000μ/g以上的大量全水溶的中生菌素母药干粉产品，极大地降低了中生菌素产业化生产成本，为生物农药中生菌素的市场需求奠定了基础并且满足了绿色生态农业大范围大规模飞防用药等领域的扩展使用。
生物材料保藏信息
本发明的淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)UV-11，已于2021年8月31日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)菌种室，广州市先烈中路100号大院59号楼。邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No.61906，培养物名称是UV-11，分类命名是Streptomyces sp.。
附图说明
图1为对照菌株UV-3的HPLC测试结果；
图2为本发明的UV-11菌株的HPLC测试结果；
图3示意了本发明的筛选培养基的结构。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
其中，涉及发酵的培养基配方及其发酵培养条件如下：
种子培养基配方(组分为质量体积百分比)：葡萄糖1.0％，玉米淀粉1.5％，玉米粉1.0％，黄豆粉2.0％，氯化钠0.3％，氯化铵0.3％，碳酸钙0.3％，调节至pH6.6。
发酵培养基配方(组分为质量体积百分比)：葡萄糖5.0％，玉米淀粉2.0％，玉米粉2.0％，黄豆粉4.0％，氯化钠0.6％，氯化铵0.8％，碳酸钙0.7％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.05％，调节至pH 6.6。
发酵培养条件为：发酵温度为26℃-35℃；空气通气量0.5V/VM-1.5V/VM；发酵罐搅拌转速50rpm-200rpm。
其中，涉及的斜面和平板培养基配方如下：
斜面和平板培养基(组分为质量体积百分比)：可溶性淀粉1.05％，蛋白胨0.06％，硫酸镁0.07％，硝酸钠0.25％，氯化钾0.05％，硫酸亚铁0.02％，磷酸二氢钾0.12％，琼脂2.05％，调整至pH 6.6。
实施例1淡紫灰链霉菌海南变种菌株(保藏号为CGMCC No.1026)的诱变菌种(UV-3)作为产业化生产菌株进行中生菌素产业化发酵生产
菌种UV-3是申请人以保藏号为CGMCC No.1026的淡紫灰链霉菌海南变种菌株经诱变获得的且已应用于产业化发酵生产中生菌素的淡紫灰链霉菌海南变种的诱变菌株。
将UV-3在40m3发酵罐内进行产业化发酵(按照前述的“发酵的培养基配方和发酵培养条件”，发酵培养周期5天)并收集发酵过程中不同阶段的发酵液。
上述产业化发酵液从发酵罐接种后的“0”小时开始按照无菌取样的要求取样收集发酵液样品，每隔12小时取样收集一次发酵液样品。无菌取样的具体方法为：中生菌素发酵罐取样口使用≥0.3Mpa的活蒸汽消毒灭菌30分钟，在火焰圈保护下，迅速关闭发酵罐取样口蒸汽阀门，开启发酵罐取样口出料阀门，发酵液从取样口流出；将带有棉塞已灭菌的玻璃三角瓶在火焰保护下，在取样口边迅速拔除棉塞(拔出的棉塞在火焰保护下)，瓶口对准取样口流出的发酵液迅速获取发酵液，迅速将三角瓶盖紧棉塞，关闭取样口出料阀门，开启蒸汽阀门消毒取样口10分钟，关闭蒸汽阀门。收集的发酵液样品在每次收集取样后立即放到4℃冰箱进行冷藏储存至该批产业化发酵至放罐为止。同时，在取样后、立即进行斜面、肉汤的无菌检验及进行显微镜镜检观察菌丝形态，只有斜面、肉汤无菌检验及显微镜观察没有受到其它杂菌感染的发酵液才可以作为样品使用测定发酵液样品的相关参数，其中生长快速增长累积阶段中末段以及生产增长停滞阶段末段的数值见表1。需要说明的是，生物效价增速v可采用以下公式计算，其中u1是指前一时刻t1的生物效价，u2是指后一时刻t2的生物效价，u1与u2的间隔时间可根据各实施方式的具体情况限定，在本实施方式中u1与u2间隔12小时：
表1.
需要说明的是，表1中涉及的测试方法采用以下方法进行测试：
1.1生物效价的测定
所述生物效价的测定方式采用的是《中国药典(2015年版)》的抗生素微生物检定法。采用的试剂和溶液为：磷酸盐缓冲液(pH7.8)；培养基I；枯草芽孢杆菌菌悬液(枯草芽孢杆菌编号为：CMCC63501)；容量瓶(100ml、50ml)。
1.2微生物代谢还原糖的测定
微生物代谢还原糖的测定采用斐林试剂比色法测定，斐林试剂的配制具体如下：
1.斐林试剂A液的配制：精确称取120克硫酸铜水合物(CuSO4·5H2O),分析纯，含量大于99.0％)，用2000ml蒸馏水完全溶解。
2.斐林试剂B液的配制：在敞口玻璃容器中装入2000ml蒸馏水。精确称取酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O，分析纯，含量大于99.0％)375克加入其中，充分搅拌，直至溶解。再精确称取氢氧化钠(分析纯)250克，分次慢慢加入上述溶液，边加边搅拌。
3.斐林试剂C液的配制：精确称取碘化钾(分析纯，含量大于98.0％)300克，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml。
4.斐林试剂的配制：将斐林试剂A、B、C液依次通过大漏斗盛装入10000ml棕色试剂瓶，并小心用力振摇均匀，即制备5000ml斐林试剂。
5.0.1mol/L硫代硫酸钠溶液的配制：称取26g硫代硫酸钠，加0.2g无水碳酸钠，溶于1000ml水中，缓缓煮沸10min，冷却。放置两周后过滤。过滤后根据GB/T601-2002进行标定。
6.1％淀粉指示剂的配制：称取1克淀粉加少量水配成淀粉溶液，加沸腾蒸馏水至100ml，沸腾2分钟即制备完毕。
操作程序
按微生物培养基的级别、培养时间综合判定总残糖浓度的预计范围。对于浓度超过10g/100ml的培养液滤液或培养基离心上清液，吸取1ml，加4ml蒸馏水稀释，混和均匀后，吸取其中1ml进行测定；对于总残糖浓度小于或等于10g/100ml，大于5g/100ml的滤液或上清液，吸取0.5ml进行测定，对于总糖浓度小于或等于5g/100ml的滤液或上清液，则吸取1ml测定。
准确吸取1ml滤液或上清夜置于150ml三角瓶中，直接加入20ml斐林试剂于电热板上均匀加热，沸腾后开始计时。计时二分钟，将三角瓶取下置于装有冷却水的手术盘中冷却。操作过程中，排气扇处于开启状态。
冷却完毕，精确加入2mol/L硫酸溶液15ml，迅速以0.0998mol/L Na2S2SO3溶液滴定至浅黄色，用滴定加入淀粉指示剂约1ml，继续滴定至蓝色消失。记下所消耗的硫代硫酸钠溶液的体积：V样。
空白实验：准确量取20ml斐林试剂置于150ml三角瓶中，不加待测液，加1ml蒸馏水代替样品。以后程序按总糖测定操作。空白瓶应与样品瓶同时加热煮沸，尽量减少偶然误差。滴定完毕，记下所消耗的硫代硫酸钠溶液的体积，记为V空。
ΔV＝V空-V样。按ΔV值查糖表，查出的糖值乘上稀释倍数，即为样品的总糖或还原糖浓度，单位：g/100ml。
1.3微生物代谢氨基氮测定
试剂配制
0.1％甲基红指示剂配制：准确称取0.1g甲基红于250ml烧杯中，加入75％酒精100ml，以干净玻璃棒充分搅拌，甲基红完全溶解。该试剂配制完毕，盛装约2/3滴瓶使用。
0.015mol/L硫酸溶液的配制：准确量取75ml蒸馏水于1000ml烧杯中。用100ml量筒准确量取2mol/L硫酸溶液，用斜置玻璃棒引流，慢慢加入烧杯中，边加边搅拌均匀。
0.02858mol/L氢氧化钠溶液的配制：取1.1432g氢氧化钠(分析纯)加蒸馏水溶解，定容于1000ml容量瓶中。进行标定。
18％中性甲醛溶液的配制：取37％-40％甲醛50ml与50ml蒸馏水混合均匀，制得18％甲醛溶液。
1％酚酞指示剂的配制：准确称取1g酚酞于250ml烧杯中，加入100ml75％酒精，以洁净玻璃棒充分搅拌，酚酞完全溶解。
操作程序
精确吸取培养液滤液或离心后上清液2ml加入200ml三角瓶中，加蒸馏水50ml。
加1％甲基红指示剂1滴，用0.015mol/L硫酸溶液滴定至微红。
用0.02858mol/L氢氧化钠溶液滴至橙黄色。
加入18％中性甲醛溶液2ml，轻摇均匀，静置10分钟
入1％酚酞指示剂2-8滴，用0.02858mol/L氢氧化钠溶液，滴定至微红色，记录本次0.02858mol/L标准氢氧化钠溶液的滴定毫升数。
1.4微生物菌浓测定
先将发酵液摇匀；
用电子称称量离心管的重量m1，向离心管倒入发酵液约10ml，再次称量离心管的重量m2；放离心机里，3000r/min离心15分钟；
将上清液倒出，称量剩余部份的重量m3；
结果：菌浓＝(m3-m1)/(m2-m1)×100％。
1.5微生物总磷检测
总磷检测采用的为仪器检测方法
总磷所使用的仪器为北京连华永兴科技发展有限公司制造的多参数水质测定仪(5B-3B(V11))所使用的试剂均为厂家生产。
实施例2目标出发菌株的制备
1.根据发酵液样品生物效价的测定结果，选择实施例1发酵至48小时(快速增长累积阶段中末段)收集的发酵液样品。
2.取出储存在4℃冰箱内的盛装未受到其它微生物污染的中生菌素发酵液样品的三角瓶，经过对三角瓶外表面进行紫外线照射消毒并经过75％酒精棉对三角瓶瓶体外壁全方位擦拭消毒后，移入无菌操作室超净工作台内，进行全程无菌操作；
3.在无菌室内，将上述中生菌素发酵液在常温下摇荡均匀，吸取100ml到内置20粒玻璃球的250ml的三角瓶内(该三角瓶及内容物已经经过灭菌消毒)，常温下至于220rpm的摇床上摇荡60min，使发酵液的菌丝体与发酵液的培养基充分剥离分散；
4.在无菌室内，无菌操作条件下，将上述经过充分震荡的使得菌丝体与培养基充分剥离分散的发酵液，以灭菌消毒后的无菌棉花为过滤介质的布氏漏斗进行常温下自然过滤，获得目标菌体出发菌株滤液置4℃冰箱保藏，同时传接进行无感染其它微生物试验(称为无菌试验)，只有无菌试验为阴性该菌株滤液才能作为出发菌株滤液。
实施例3耐受底物因子的制备
1.根据发酵液样品生物效价的测定结果，选择实施例1发酵至120小时(增长停滞阶段末段)收集的发酵液样品。
2.取出储存在4℃冰箱内的盛装未受到其它微生物污染的中生菌素发酵液样品的三角瓶，经过对该三角瓶外表面进行消毒并经过75％酒精棉对三角瓶瓶体外壁全方位擦拭消毒后，移入无菌操作室超净工作台内，进行全程无菌操作；
3.将上述中生菌素发酵液摇荡均匀，吸取500ml到内置50粒玻璃球的1000ml的三角瓶内(该三角瓶及内容物已经经过灭菌消毒)，置于220rpm的摇床上摇荡60min，使发酵液的菌丝体与发酵液的培养基充分剥离分散；
4.将上述经过充分震荡的使得菌丝体与培养基充分剥离分散的无菌发酵液，通过灭菌消毒的无菌棉花为过滤介质的布氏漏斗自然过滤，获取的滤液再经过无菌的细菌漏斗过滤，获得去除菌丝体的目标滤液400ml，置4℃冰箱保藏；
5.在无菌室内，以无菌操作方法，将上述获得的去除菌丝体的目标滤液400ml置于已经灭菌的旋转蒸发仪内，在温度＜45℃，真空度-0.098Mpa，冷却水温度5℃-7℃的条件下低温减压浓缩至剩余80ml，获得含中生菌素等自身代谢产物且无中生菌素菌丝体的目标滤液的无菌滤液浓缩液(该无菌滤液浓缩液即为含底物因子的浓缩液)，测定该浓缩液数据如下表2所示：
表2.
实施例4筛选培养基的制备
1.不含目标滤液的浓缩液的平板培养基制备：按照前述的“斜面和平板培养基配方”配制培养基，培养基经121℃、30分钟蒸汽湿热灭菌，冷却后在48℃-50℃水浴恒温保存待用。
2.含目标滤液的浓缩液的平板培养基制备：实施例3的目标滤液的浓缩液的使用量以中生菌素生物效价30000μ/ml视同3.0％计算；其它组分同前述的“斜面和平板培养基配方”。培养基经121℃、30分钟蒸汽湿热灭菌冷却后在48℃-50℃水浴恒温保存待用。
具体操作如下：
2.1.按照实施例3的目标滤液无菌浓缩液的中生菌素生物效价53286μ/ml，折算含量3％中生菌素所需的实施例3的目标滤液无菌浓缩液的体积为56.6ml，无菌操作量取该无菌浓缩液56.6ml备用。
2.2.目标滤液浓缩液平板培养基其它组分的配制：扣除目标滤液无菌浓缩液后的其它培养基组分共计配制成43.4ml。按照前述的“斜面和平板培养基配方”以培养基总体积100ml计算称量培养基。该43.3ml培养基经过121℃、30min蒸汽湿热消毒灭菌后冷却至48℃-50℃后，置于48℃-50℃水浴恒温保存待用。
2.3.将上述无菌操作量取的中生菌素生物效价53286μ/ml的目标滤液无菌浓缩液56.6ml，无菌操作加热至45℃，放置45℃水浴恒温保存待用，45℃保温时间越短越好不宜超过10分钟，这会减少浓缩液内的自身代谢产物的生物活性的失活。
2.4.将经过消毒灭菌在48℃-50℃水浴恒温保存的扣除目标滤液无菌浓缩液外的其它培养基组分共计43.4ml的培养基与在45℃水浴恒温保存的目标滤液的无菌浓缩液56.6ml迅速混合均匀，获得含3％中生菌素等自身代谢产物且无中生菌素菌体的平板培养基，该含3％中生菌素等自身代谢产物培养基混合均匀后，立即进行梯度浓度培养基的制备。
3.梯度浓度培养基的制备具体如下：
3.1.在无菌室无菌操作条件下，取48℃-50℃水浴恒温保存的平板培养基10ml，放置90mm培养皿中，将该培养皿一边迅速靠在一横条上倾斜放置，使得培养皿靠在横条高位的底面正好触及到培养基，形成上薄下厚的培养基的培养皿，放置待培养基凝固后放平培养皿，培养皿形成一个从一端到另一端逐渐变厚的培养基斜面，在培养皿背面标记从培养基最厚开始到最薄处的箭头标识，“↑”箭头头部处为培养基的最薄处；
3.2.在无菌室无菌操作条件下，将上述已经形成固态斜面的平板培养基的培养皿给予标记箭头处为最薄处后，给予水平放置；取刚刚配制好的含3％中生菌素等自身代谢产物培养基10ml，迅速放置于上述已经形成固态斜面的平板培养基的培养皿中，迅速摇匀铺展水平，放置待含中生菌素等自身代谢产物的培养基固化，获得含有中生菌素等自身代谢产物梯度浓度的培养基的培养皿，该培养皿中生菌素等自身代谢产物的含量按照箭头的方向逐渐增加，箭头“↑”头部处的中生菌素含量为3％，同理培养基中其它自身代谢产物的浓度在箭头“↑”头部处也最高；
3.3.在无菌室无菌操作条件下，按照上述方法同时制备6个含中生菌素等自身代谢产物梯度浓度的培养基的培养皿；培养皿底部箭头头部处的中生菌素含量为3％，同理培养基中其它自身产物的浓度在箭头“↑”头部处也最高。
由此最终形成的梯度浓度培养基，即为用于理性筛选的筛选培养基，所述筛选培养基结构参见图3。
如图3所示，箭头“↑”尾部所在侧为0mm，其中自身代谢产物梯度浓度沿箭头方向逐渐递增。图3中I显示的是制备时不含目标滤液的浓缩液的平板培养基，II显示的是制备时含目标滤液的浓缩液的平板培养基。
实施例5目标菌体滤液的复合诱变液制备
1.将实施例2获得的在4℃冰箱保藏的目标出发菌株菌体滤液取出，将实施例4已经制备好的含中生菌素等自身代谢产物梯度浓度培养基的培养皿一起置于具有红灯的无菌暗室内。
2.累积递减紫外线-光复活复合诱变：
2.1.在具有红灯的无菌暗室中，将装有30w日光灯和30w波长为
的紫外灯的诱变箱内的日光灯与紫外灯都同时开启预热稳定15分钟，关闭紫外灯与日光灯(该诱变箱外用红黑布罩罩着)；
2.2.吸取目标出发菌株菌体滤液10ml在90mm双碟无菌培养皿内，在具有红灯的无菌暗室中去掉培养皿上层的盖，放入装有30w日光灯和30w的紫外灯的诱变箱内的双灯下方20cm处的旋转盘上，缓缓旋转。
2.3.连续进行5次紫外线-光复活诱变：
2.3.1.先开启紫外灯照射30s，而后关闭紫外灯20s；开启日光灯照射20s；关闭日光灯20s；
2.3.2.再开启紫外灯照射25s，而后关闭紫外灯20s；开启日光灯照射20s；关闭日光灯20s；
2.3.3.再开启紫外灯照射20s，而后关闭紫外灯10s；开启日光灯照射10s；关闭日光灯10s；
2.3.4.再开启紫外灯照射15s，而后关闭紫外灯10s；开启日光灯照射10s；关闭日光灯10s；
2.3.5.再开启紫外灯照射10s，而后关闭紫外灯5s；开启日光灯照射5s；关闭日光灯5s；
2.4.经过5次紫外线-光复活的剂量累积递减复合诱变，获得目标出发菌株菌体滤液的复合诱变液。
实施例6理性筛选
1.将上述经过5次紫外线-光复活的剂量累积递减复合诱变获得的目标出发菌株菌体滤液的复合诱变液进行涂布、培养、筛选，具体包括如下步骤：
1.1.涂布：将事先准备好的6个含有中生菌素等自身代谢产物梯度浓度培养基的培养皿放置在红灯无菌暗室中，在无菌操作条件下，对5个培养皿都进行相同的操作：吸取1ml实施例5获得的目标出发菌株菌体滤液的复合诱变液均匀涂布在1个含有中生菌素等自身代谢产物梯度浓度的培养基的90mm的双碟培养皿上；对其中剩余的1个培养皿进行涂布剩余未经紫外线-光复活诱变的目标出发菌株菌体滤液，作为对照培养皿。
1.2.培养：在无菌暗室内，调节暗室温湿度恒定为：温度28.5℃-29.5℃、相对湿度55％-65％；将对照培养皿和5个进行了经过复合诱变的相同菌液涂布的培养皿都盖上盖子、盖子朝上，培养一天后，将整套培养皿倒置过来、盖子为底，培养7天-10天时间，避免培养基干燥。
1.3.挑选耐受高浓度自身代谢产物单菌落菌株：
1.3.1.在对照的培养皿上标记为箭头尾部处长有成片稀疏的菌落，随着朝箭头方向的延伸菌落稀疏，最高到22mm处只有一个菌落，菌落都是粉色，按照中生菌素梯度浓度测算，该22mm的菌落耐受中生菌素浓度约为7300μ/ml左右，该菌落标记为d22；
1.3.2.在试验的5个培养皿上标记为箭头尾部处都长有成片稀疏的菌落，随着朝箭头方向的延伸菌落几乎没有，但有3个培养皿最高分别在延伸到52mm、58mm、63mm分别各有一个菌落，按照中生菌素梯度浓度测算，该52mm、58mm、63mm的菌落耐受中生菌素浓度分别约为17000μ/ml、19000μ/ml、21000μ/ml左右；52mm、63mm的菌落小而密实，呈现扁馒头状布满孢子菌落，孢子呈现粉色状；58mm的菌落小而密实，呈现中间凸起较高的馒头状布满孢子的菌落，但孢子白色较多、粉色不明显；将该三个试验培养皿上52mm、58mm、63mm的菌落进行标记为n52、n58、n63。
1.3.3.挑选上述d22、n52、n58、n63的菌落进行传接斜面，在29℃培养7天，d22的斜面菌苔较厚呈现粉色，试管斜面背面呈现深粉色；n52、n63斜面菌苔厚呈现粉色，试管斜面背面呈现深粉色；n58斜面菌苔厚呈现灰白略有微微淡粉色，试管斜面背面呈现淡粉色。
1.3.4发酵试验：将筛选到的耐受中生菌素及自身代谢产物的耐受菌株n52，n58，n63与对照菌株d22及产业化生产使用的菌株UV-3一起进行5L发酵罐发酵试验(按照前述的“发酵的培养基配方和发酵培养条件”，发酵培养周期7天)，重复进行3次试验，考察中生菌素发酵水平，相关的结果数据如下表3所示：
表3.
由表3可以看出，n52、n58和n63获得的中生菌素效价都远高于起始菌株UV-3的11389μ/ml，可见本发明的筛选方法可以获得较多的高产菌株。将其中产量最高的n58进行保藏，即保藏编号为：GDMCC No.61906的淡紫灰链霉菌海南变种UV-11。
实施例7菌株保种以及稳定性验证
1.将上述实施例6中涉及的UV-3、d22、n52、n58、n63的5支斜面以无菌液体石蜡进行斜面液体石蜡封存后，置-80℃冰箱冷冻保藏3个月。
2.取出上述无菌液体石蜡封存冷冻保藏的UV-3、d22、n52、n58、n63的斜面菌株，进行平板单菌落分离并培养7天-10天观察单菌落生长情况，观察结果见下表4：
表4.
3.挑选单菌落分离平板内的特征单菌落，转接斜面置于温度28.5℃-29.5℃、相对湿度55％-65％无菌室内、培养7天-10天；进一步观察斜面菌苔形态：UV-3的斜面菌苔较厚呈现粉色，d22的斜面菌苔较厚呈现粉色，试管斜面背面呈现深粉色；n52斜面菌苔厚呈现粉色，试管斜面背面呈现深粉色；n58斜面菌苔厚呈现粉色，试管斜面背面呈现深粉色；n63斜面菌苔厚呈现粉色，试管斜面背面呈现深粉色；
4.发酵试验：上述经过-80℃冷冻保藏的液体石蜡斜面菌株，经过单菌落分离，再转接斜面的斜面菌株UV-3、d22、n52、n58以及n63一起进行5L发酵罐试验(按照前述的“发酵的培养基配方和发酵培养条件”，发酵培养周期7天)，重复进行3次试验。
考察中生菌素发酵水平，结果数据如下表5：
表5.
由表5可以看出，对中生菌素等自身代谢产物耐受较高剂量的3个菌株(即n52、n58以及n63)，其中生菌素发酵水平不仅较之于现有的菌株有所提升，并且与对照组(UV-3、d22)比较也都有较大幅度的提高，尤其是n58，其最高的提高幅度超过55％。
实施例8产业化发酵生产验证
将UV-3以及UV-11应用于40m3发酵罐进行产业化发酵生产验证(按照前述的“发酵的培养基配方和发酵培养条件”，发酵培养周期5天)，获得中生菌素放罐发酵液各项参数。UV-11的发酵液各项参数如下：
总糖：1.306g/100ml，还原糖：0.6359g/100ml，氨基氮：88.58mg/100ml，总磷10.25mg/L，菌浓27.2％，pH6.95，生物效价18050μ/ml。
而在相同发酵条件、发酵周期下，UV-3菌株罐批中的中生菌素发酵水平仅为11936μ/ml，而UV-11菌株罐批的中生菌素发酵单位达到18050μ/ml，也就是说，UV-11菌株产业化发酵水平比对照菌株UV-3提高52.5％。进一步通过高效液相色谱测定法测定UV-11发酵放罐液中发酵液各组分，结果参见图1和图2。其中，图1为对照菌株UV-3的HPLC测试结果；图2为UV-11菌株的HPLC测试结果。
结合图1和图2可以看出，UV-11发酵放罐液中的各组分的保留时间与对照菌株UV-3的保留时间在一个区间，具体数据如下表6所示。
表6.
需要说明的是，HPLC采用的条件如下：
机型：waters e2695
流动相：梯度洗脱条件如下表7所示：
表7.
流速：1.0mL/min。
柱温：30℃±2℃。
检测波长：200nm。
进样体积：10μL。
柱子：water SymmetryShieldTMRP18 5μm
实施例9包含中生菌素的制品的制备
1.发酵液酸化：将上述实施例8中获得的生物效价18050μ/ml的发酵液调节pH至3.5的酸化液；
2.酸化液固液分离：将发酵液酸化液打入0.20μm孔径的陶瓷膜进行固液分离，获得透过液，该透过液再打入孔径0.05μm的陶瓷膜液固分离，获得发酵液二次透过液；
3.发酵液二次透过液浓缩：二次透过液经过分子量为400Da的纳滤膜浓缩，获得浓缩液；
4.喷雾干燥：浓缩液直接进行喷雾干燥，获得中生菌素全水溶母药干粉，测定该母药干粉生物效价为510025μ/g。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围，故但凡依本发明的权利要求和说明书所做的变化或修饰，皆应属于本发明专利涵盖的范围之内。
Claims (15)
1.一种淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)菌株，其特征在于，所述淡紫灰链霉菌海南变种菌株的保藏编号为：GDMCC No.61906。
2.如权利要求1所述的淡紫灰链霉菌海南变种菌株在生产中生菌素及其制品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制品为含中生菌素的抗菌产品。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含中生菌素的抗菌产品为防治农作物病害产品。
5.一种中生菌素的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1所述的淡紫灰链霉菌海南变种菌株接种到培养基后进行发酵培养。
6.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵满足以下条件的一种或多种：
发酵温度为26℃-35℃；
空气通气量0.5V/VM-1.5V/VM；
发酵罐搅拌转速50rpm-200rpm；
发酵培养周期为3天-10天；
所述培养基配方包括：葡萄糖4.0％-15.0％，玉米淀粉1.0％-6.0％，玉米粉0.5％-7.5％，黄豆粉3.0％-12.0％，氯化钠0.2％-1.6％，氯化铵0.1％-1.8％，碳酸钙0.2％-1.6％，磷酸二氢钾0.01％-0.13％，硫酸镁0.01％-0.16％，pH 6.0-7.0，所述％为质量体积百分比。
7.一种采用如权利要求1所述的淡紫灰链霉菌海南变种菌株发酵得到的发酵液。
8.如权利要求7所述的发酵液在制备含中生菌素的抗菌产品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含中生菌素的抗菌产品为防治农作物病害产品。
10.一种制备中生菌素或含其的制品的方法，其特征在于，其包括以下步骤：发酵如权利要求1所述的淡紫灰链霉菌海南变种菌株，获得含有中生菌素的发酵液。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括通过提取发酵液，以制备获得中生菌素或含其的制品；
其中，所述提取包括如下步骤：将发酵液调节pH值至3.5-4.5的酸化液；随后，所述酸化液进行固液分离，获得二次透过液；再随后，所述二次透过液进行浓缩，获得浓缩液。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备中生菌素母药干粉的步骤：喷雾干燥所述浓缩液，获得中生菌素母药干粉。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述固液分离包括：将酸化液进入0.15-0.20μm孔径的陶瓷膜进行固液分离，获得一次透过液，所述一次透过液再进入孔径0.03-0.05μm的陶瓷膜液固分离，获得二次透过液；
所述浓缩包括：将所述二次透过液经过分子量为400Da的纳滤膜浓缩，获得所述浓缩液。
14.一种菌剂，其特征在于，其由如权利要求1所述的淡紫灰链霉菌海南变种菌株和/或所述的淡紫灰链霉菌海南变种菌株的发酵液制得。
15.一种菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：发酵如权利要求1所述的淡紫灰链霉菌海南变种菌株，获得发酵液。
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