CN112322611A - 一种筛选中生菌素高产菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种筛选中生菌素（Zhongshengmycin）高产菌株的方法，其解决了现有菌株中生菌素含量较低的技术问题。本发明的出发菌株为淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis new var.)，该方法包括出发菌株摇瓶培养萌发成菌丝体，将菌丝体经过ARTP诱变后，涂布于含有LiCl的培养基平板上并培养，将挑出的各单菌落菌块平板预筛，挑出抑菌圈直径较大的单菌落转接考核斜面，将考核斜面摇瓶考核，选出中生菌素含量高的菌株。本发明筛选中生菌素含量高的菌株，其发酵液对水稻白叶枯病、白菜软腐病、苹果轮纹病及苹果叶斑病等有良好的防效，该方法可以快速地筛选出中生菌素含量高的菌株。

Description

一种筛选中生菌素高产菌株的方法
技术领域
本发明属于微生物制药领域，具体涉及一种筛选中生菌素（Zhongshengmycin）高产菌株的方法。
背景技术
中生菌素（Zhongshengmycin）属于N-糖苷类农用抗生素，含有6个有效组分，各组分之间依次递增一个β-赖氨酸，对细菌、酵母菌和丝状真菌性病害有活性，主要用于防治水稻白叶枯病、白菜软腐病、苹果轮纹病及苹果叶斑病等有良好的防效，对人畜低毒，对环境不造成污染，是一种理想的抗细菌兼抗真菌的生物农药。目前，中生菌素已在全国部分省市应用推广，并取得了一定的经济效益。
其产生菌淡紫灰链霉菌海南变种（Streptomyces lavendulae var. hainanensis new var.），由中国农业科学院生物防治研究所在海南岛土壤中分离获得。由于该菌菌苔较薄，用刮铲难以刮取足量的孢子，摇瓶考核时只能用挖块的方式接种。该菌遗传稳定性较差，传代后斜面菌苔有时都会颜色变浅，孢子量下降，考核效价随传代次数不断下降。这种退化现象和目前生产效价较低，造成其生产成本偏高，推广难度较大。因此，需进一步对其菌种进行改良。
在微生物菌种改良过程中，诱变育种是主要方法之一。它利用物理或化学诱变剂处理微生物细胞群，促进其在非自然条件下随机突变频率大幅度提高，然后用简便快速高效的筛选方法，从中挑选符合育种要求的突变株（如高产株或有效组分比例高的菌株）。其中物理诱变即利用物理因素（如紫外线、X射线、γ射线、快中子等）对悬液进行一定剂量一定时间的照射，使细胞内的遗传物质（如DNA）复制系统出错，从而诱发变异。化学诱变—利用化学诱变剂[如亚硝酸、甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、亚硝基甲基脲、氮芥、乙烯亚胺、羟胺、氯化锂、秋水胆碱等]对悬液进行一定浓度一定时间的作用处理，使细胞内的遗传物质（如DNA）复制系统出错，从而诱发变异。
发明内容
为了解决现有技术中淡紫灰链霉菌海南变种（Streptomyces lavendulae var. hainanensis new var.）菌苔薄、传代后菌苔质量下降、中生菌素含量较低的问题，本发明提供一种筛选中生菌素（Zhongshengmycin）高产菌株的方法，其解决了现有菌株中生菌素含量较低的技术问题。本发明的出发菌株为淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var. hainanensis new var.)，本发明的方法包括出发菌株摇瓶培养萌发成菌丝体，将菌丝体经过ARTP诱变后，涂布于含有LiCl的培养基平板上并培养，将挑出的各单菌落菌块平板预筛，挑出抑菌圈直径较大的单菌落转接考核斜面，将考核斜面摇瓶考核，选出中生菌素含量高的菌株。本发明的筛选方法可以快速地筛选出中生菌素含量高的菌株。
更为具体的，本发明的筛选中生菌素高产菌株的方法，其主要步骤如下：
步骤1 将中生菌素出发菌株淡紫灰链霉菌海南变种（Streptomyces lavendulae var. hainanensis new var.）的孢子挖块接种于摇瓶活化培养基恒温振荡培养；
步骤2 在步骤1培养已萌发的菌悬液中加入甘油，振荡分散制成待诱变菌悬液；
步骤3 吸取步骤2制成的待诱变菌悬液滴入ARTP诱变育种仪的载片上，均匀涂开，经ARTP诱变，得到诱变液；
步骤4 用无菌生理盐水清洗步骤3得到的诱变液；
步骤5 在红光下，将步骤4所述的诱变液用生理盐水梯度稀释，分别涂布于含有LiCl的平板培养基上30℃恒温培养10-12天；
步骤6 挑选步骤5培养突变的单菌落，用无菌打孔器打下单菌块，放置在玻璃平板培养基上35-37℃恒温培养14-16h；培养基包含两层，上层是加入枯草芽孢杆菌（CMCC63501）的BPA培养基，下层是琼脂水培养基；
步骤7 挑选步骤6中抑菌圈直径较大的单菌块，接入斜面培养基中恒温培养；
步骤8 在步骤7培养好的斜面中，每菌株各抽取一支斜面接种到摇瓶种子培养基，恒温振荡培养；
步骤9 将步骤8培养的摇瓶种子以5-15%的接种量接种到摇瓶发酵培养基中继续恒温振荡培养；
步骤10 将各发酵瓶发酵液中生菌素含量进行检测，筛选含量高于出发菌株的菌株。
优选的，所述步骤1中的摇瓶活化培养基包括以下成份：可溶性淀粉（AR）0.8-1.3%、MgSO4·7H2O（AR）0.03-0.06%、KH2PO4（AR）0.05-0.15%、KCl（AR）0.03-0.06%、NaNO3（AR）0.1-0.5%、FeSO4·7H2O（AR）0.001%，其余是蒸馏水，所述的摇瓶活化培养基的消前pH6.8-7.0。
优选的，所述步骤1的培养参数为：温度28-32℃下培养3-7h。
优选的，所述步骤3中ARTP诱变参数为：照射功率120W，温度25-35℃，氦气流量8-12SLM，照射10-180秒。
优选的，所述步骤5中的含有LiCl的平板培养基包括以下成份：可溶性淀粉（AR）1.5-2.5%、牛肉膏（BR）0.1-0.2%、MgSO4·7H2O（AR）0.03-0.08%、KNO3（AR）0.05-0.15%、K2HPO4（AR）0.03-0.08%、NaCl（AR）0.03-0.07%、FeSO4·7H2O（AR）0.001% 、LiCl（AR）0.3%、琼脂2.0%，其余是蒸馏水，所述的平板培养基的消前pH7.0-7.2。
优选的，所述步骤7中的斜面培养基包括以下成份：可溶性淀粉（AR）0.8-1.3%、MgSO4·7H2O（AR）0.03-0.06%、KH2PO4（AR）0.05-0.15%、KCl（AR）0.03-0.06%、NaNO3（AR）0.1-0.5%、FeSO4·7H2O（AR）0.001%，其余是蒸馏水，所述斜面培养基的消前pH6.8-7.0。
优选的，所述步骤8中摇瓶种子培养基包括以下成份：葡萄糖（AR）1.0-2.0%、冷榨黄豆饼粉（IR）1.0-3.0%、玉米粉（FR）0.5-2.0%、玉米淀粉（FR）1.0-2.0%、NH4Cl（AR）0.3-0.6%、NaCl（AR）0.2-0.5%、MgSO4·7H2O（AR）0.01-0.05%、KH2PO4（AR）0.01-0.05%、轻质CaCO3（AR）0.03-0.05%、自来水配制，所述摇瓶种子培养基的消前pH6.5-7.5。
优选的，所述步骤9中摇瓶发酵培养基包括以下成份：葡萄糖（AR）1.0-2.0%、冷榨黄豆饼粉（IR）1.0-3.0%、玉米粉（FR）0.5-2.0%、玉米淀粉（FR）1.0-2.0%、NH4Cl（AR）0.3-0.6%、NaCl（AR）0.2-0.5%、MgSO4·7H2O（AR）0.01-0.05%、KH2PO4（AR）0.01-0.05%、轻质CaCO3（AR）0.03-0.05%、自来水配制，所述摇瓶种子培养基的消前pH6.5-7.5。
优选的，所述步骤8的摇床培养参数为28-32℃，转速250rpm，恒温培养20-30h。
优选的，所述步骤9的摇床培养参数为28-32℃，转速250rpm，恒温培养120-150h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明提供了一种中生菌素高产菌株的筛选方法，通过一系列的步骤进行筛选，得到中生菌素高产菌株斜面菌苔变厚且颜色加深，孢子量明显增多，其发酵液对枯草芽孢杆菌（CMCC63501）具有抑菌作用。本发明筛选中生菌素含量高的菌株，其发酵液对水稻白叶枯病、白菜软腐病、苹果轮纹病及苹果叶斑病等有良好的防效。本发明的筛选方法可以理性快速地筛选高产菌株，简单易行，LiCl对人毒性较小，所涉及的培养基原料成本低、来源广，具有十分重要的工农业应用潜力。
附图说明
下面结合附图进行进一步的说明：
图1为出发菌株1#斜面菌苔；
图2为出发菌株1#斜面传代2代的斜面菌苔；
图3为中生菌素高产菌株46#的斜面菌苔；
图4为出发菌株1#摇瓶振荡培养3h时萌发的菌丝图像；
图5 出发菌株1#与中生菌素高产菌株46#发酵液两者对枯草芽孢杆菌的抗菌活性实验对比；其中抑菌圈直径单位：mm。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：原始菌株菌悬液制备
步骤1 将中生菌素出发菌株淡紫灰链霉菌海南变种（Streptomyces lavendulae var. hainanensis new var.）的斜面（如图1）孢子挖块接种于摇瓶活化培养基30℃恒温250rpm振荡培养3h，形成已萌发的菌悬液（如图4）。其中，摇瓶活化培养基成份：可溶性淀粉（AR）1.0%、MgSO4·7H2O（AR）0.05%、KH2PO4（AR）0.1%、KCl（AR）0.05%、NaNO3（AR）0.2%、FeSO4·7H2O（AR）0.001%、蒸馏水配制，消前pH6.8-7.2，消后pH控制在6.8-7.0。
实施例2：中生菌素出发菌株的诱变
步骤2 吸取实施例1培养已萌发的菌悬液800μL，加入200μL 20%甘油，振荡分散制成待诱变菌悬液。
步骤3 吸取待诱变菌悬液15μL滴入ARTP诱变育种仪的载片上，均匀涂开，使用ARTP诱变育种仪经ARTP诱变（照射功率120W，25℃，氦气流量8-12SLM，照射70秒），得到诱变液。
步骤4 用无菌生理盐水洗下诱变液。
步骤5 红光下用生理盐水梯度稀释诱变液至10-4、10-5、10-6，涂布于含有LiCl培养基平板上30℃恒温培养12天。
含有LiCl培养基平板的培养基成份：可溶性淀粉（AR）2.0%、牛肉膏（BR）0.1%、MgSO4·7H2O（AR）0.05%、KNO3（AR）0.1%、K2HPO4（AR）0.05%、NaCl（AR）0.05%、FeSO4·7H2O（AR）0.001%、LiCl（AR）0.3%、琼脂2.0%、蒸馏水配制，消前pH7.0-7.2。
步骤6 挑选培养突变的单菌落，用无菌打孔器打下单菌块，放置在玻璃平板培养基上35℃恒温培养16h，单菌块周围出现抑菌圈。挑选抑菌圈直径较大的单菌块，小心接入斜面培养基中30℃恒温培养12天。玻璃平板培养基包含两层，上层是加入枯草芽孢杆菌（CMCC63501）的BPA培养基，下层是琼脂水培养基。
斜面培养基成份：可溶性淀粉（AR）1.0%、MgSO4·7H2O（AR）0.05%、KH2PO4（AR）0.1%、KCl（AR）0.05%、NaNO3（AR）0.2%、FeSO4·7H2O（AR）0.001%、琼脂2.0%、蒸馏水配制，消前pH6.8-7.2，消后pH控制在6.8-7.0。
步骤8 每菌株各抽取一支斜面接种到摇瓶种子培养基，30℃恒温250rpm振荡培养25h。
摇瓶种子培养基成份：葡萄糖（AR）1.5%、冷榨黄豆饼粉（IR）2.0%、玉米粉（FR）1.0%、玉米淀粉（FR）1.0%、NH4Cl（AR）0.3%、NaCl（AR）0.3%、MgSO4·7H2O（AR）0.01%、KH2PO4（AR）0.03%、轻质CaCO3（AR）0.03%、自来水配制，所述摇瓶培养基的消前pH6.5-7.5。
步骤9 将种子以10%的接种量移种到摇瓶发酵培养基中继续30℃恒温250rpm振荡培养136h。
摇瓶发酵培养基成份：葡萄糖（AR）1.5%、冷榨黄豆饼粉（IR）2.0%、玉米粉（FR）1.0%、玉米淀粉（FR）1.0%、NH4Cl（AR）0.3%、NaCl（AR）0.3%、MgSO4·7H2O（AR）0.01%、KH2PO4（AR）0.03%、轻质CaCO3（AR）0.03%、自来水配制，所述摇瓶培养基的消前pH6.5-7.5。
步骤10 将各发酵瓶发酵液中生菌素生物效价进行检测，筛选出含量高于出发菌株的菌株46#。
实施例3：斜面菌苔比较
出发菌株1#与高产菌株46#分别接种到斜面培养基上，30℃恒温培养，发现46#的菌苔变化一直比出发菌株1#快。培养12天后，1#菌苔（如图1）较薄，整体均匀的淡紫灰色，而46#菌苔（如图3）较1#厚一些，整体均匀，颜色为较1#更深的淡紫灰色。相比1#传代两代后斜面菌苔（如图2）变薄甚至半透明，均匀细腻，淡粉色。经过斜面孢子计数，1#与46#的试管孢子数分别为3.9╳109CFU和7.9╳109CFU，而1#传代两代后的试管孢子数已经下降到6.8╳108CFU。
实施例4：测定中生菌素高产菌株46#的发酵液对枯草芽孢杆菌（CMCC63501）的抑菌活性
1枯草芽孢杆菌菌悬液的制备：接种枯草芽孢杆菌（CMCC63501）于NA培养基（蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1L，消前pH7.0)中，30℃培养3天。将培养好的枯草芽孢杆菌斜面中加入玻璃珠（7-10个），然后加10mL无菌水洗下，倒入无菌的三角瓶中，充分振荡打匀，在65℃水浴中加热30min，杀死营养体，制成悬液。
2 双层平板的制备：在无菌平板中倒入10mL 80℃的琼脂水培养基(琼脂15g，蒸馏水1L，pH自然)，平放于水平工作台面上，待其完全冷却，即为底层培养基。取5mL 50℃水浴中保温的NA培养基（蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1L，消前pH7.0)，按3%的接种量加入枯草芽孢杆菌菌悬液，混合混匀后，倒入底层培养基上，晃动平板使培养基均匀铺开。
3 抑菌活性的检测：在双层平板中均匀放置4个牛津杯，其中1个牛津杯加入200μL出发菌株1#的摇瓶发酵液离心上清液作为对照（稀释40倍），其它3个牛津杯加入200μL中生菌素高产菌株46#的发酵液离心上清液（稀释50倍）。将平板置于30℃培养箱中培养16小时后用抑菌圈测量仪测量抑菌圈直径。图5显示，加入46#菌株发酵液离心上清液的牛津杯周围有明显的抑菌圈生成且抑菌圈直径更大，而1#出发菌株生物效价3677 U/mL，计算后46#菌株生物效价4411U/mL。说明46#菌株发酵液与出发菌株1#相比，对枯草芽孢杆菌（CMCC63501）的生物效价提高了49.0%。
表一 最小二剂量法生物测定数据
Figure 309704DEST_PATH_IMAGE001
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种筛选中生菌素高产菌株的方法，其特征在于，以出发菌株摇瓶培养萌发成菌丝体，将菌丝体经过ARTP诱变后，涂布于含有LiCl的培养基平板上并培养，将挑出的各单菌落菌块平板预筛，挑出抑菌圈直径较大的单菌落转接考核斜面，将考核斜面摇瓶考核，选出中生菌素含量高的菌株。
2.一种筛选中生菌素高产菌株的方法，其特征在于，其主要步骤如下：
步骤1 将中生菌素出发菌株淡紫灰链霉菌海南变种（Streptomyces lavendulae var. hainanensis new var.）的孢子挖块接种于摇瓶活化培养基恒温振荡培养；
步骤2 在步骤1培养已萌发的菌悬液中加入甘油，振荡分散制成待诱变菌悬液；
步骤3 吸取步骤2制成的待诱变菌悬液滴入ARTP诱变育种仪的载片上，均匀涂开，经ARTP诱变，得到诱变液；
步骤4 用无菌生理盐水清洗步骤3得到的诱变液；
步骤5 在红光下，将步骤4所述的诱变液用生理盐水梯度稀释，分别涂布于含有LiCl的平板培养基上， 30℃暗处恒温培养10-12天；
步骤6 挑选步骤5培养突变的单菌落，用无菌打孔器打下单菌块，放置在玻璃平板培养基上35-37℃恒温培养14-16h；培养基包含两层，上层是加入枯草芽孢杆菌（CMCC63501）的BPA培养基，下层是琼脂水培养基；
步骤7 挑选步骤6中抑菌圈直径较大的单菌块，接入斜面培养基中恒温培养；
步骤8 在步骤7培养好的斜面中，每菌株各抽取一支斜面接种到摇瓶种子培养基，恒温振荡培养；
步骤9 将步骤8培养的摇瓶种子以5-15%的接种量接种到摇瓶发酵培养基中继续恒温振荡培养；
步骤10 将各发酵瓶发酵液中生菌素含量进行检测，筛选含量高于出发菌株的菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的摇瓶活化培养基包括以下成份：可溶性淀粉（AR）0.8-1.3%、MgSO4·7H2O（AR）0.03-0.06%、KH2PO4（AR）0.05-0.15%、KCl（AR）0.03-0.06%、NaNO3（AR）0.1-0.5%、FeSO4·7H2O（AR）0.001%，其余是蒸馏水，所述的摇瓶活化培养基的消前pH6.8-7.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1的培养参数为：温度28-32℃下培养3-7h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3中ARTP诱变参数为：照射功率120W，温度25-35℃，氦气流量8-12SLM，照射10-180秒。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤5中的含有LiCl的平板培养基包括以下成份：可溶性淀粉（AR）1.5-2.5%、牛肉膏（BR）0.1-0.2%、MgSO4·7H2O（AR）0.03-0.08%、KNO3（AR）0.05-0.15%、K2HPO4（AR）0.03-0.08%、NaCl（AR）0.03-0.07%、FeSO4·7H2O（AR）0.001% 、LiCl（AR）0.3%、琼脂2.0%，其余是蒸馏水，所述的平板培养基的消前pH7.0-7.2。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤7中的斜面培养基包括以下成份：可溶性淀粉（AR）0.8-1.3%、MgSO4·7H2O（AR）0.03-0.06%、KH2PO4（AR）0.05-0.15%、KCl（AR）0.03-0.06%、NaNO3（AR）0.1-0.5%、FeSO4·7H2O（AR）0.001%，其余是蒸馏水，所述斜面培养基的消前pH6.8-7.0。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤8中摇瓶种子培养基包括以下成份：葡萄糖（AR）1.0-2.0%、冷榨黄豆饼粉（IR）1.0-3.0%、玉米粉（FR）0.5-2.0%、玉米淀粉（FR）1.0-2.0%、NH4Cl（AR）0.3-0.6%、NaCl（AR）0.2-0.5%、MgSO4·7H2O（AR）0.01-0.05%、KH2PO4（AR）0.01-0.05%、轻质CaCO3（AR）0.03-0.05%、自来水配制，所述摇瓶种子培养基的消前pH6.5-7.5。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤9中摇瓶发酵培养基包括以下成份：葡萄糖（AR）1.0-2.0%、冷榨黄豆饼粉（IR）1.0-3.0%、玉米粉（FR）0.5-2.0%、玉米淀粉（FR）1.0-2.0%、NH4Cl（AR）0.3-0.6%、NaCl（AR）0.2-0.5%、MgSO4·7H2O（AR）0.01-0.05%、KH2PO4（AR）0.01-0.05%、轻质CaCO3（AR）0.03-0.05%、自来水配制，所述摇瓶种子培养基的消前pH6.5-7.5。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤8的摇床培养参数为28-32℃，转速250rpm，恒温培养20-30h；所述步骤9的摇床培养参数为28-32℃，转速250rpm，恒温培养120-150h。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114045252A (zh) * 2021-11-18 2022-02-15 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法
CN114196580A (zh) * 2021-12-14 2022-03-18 福建凯立生物制品有限公司 一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法
CN114250183A (zh) * 2021-12-27 2022-03-29 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种筛选多抗霉素b和l复合组分高产菌株的方法
CN114276392A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种中生菌素f组分母药及其制备方法
CN114292774A (zh) * 2021-12-14 2022-04-08 福建凯立生物制品有限公司 一种菌丝体或菌体及其应用、及利用其选育菌株的方法
CN114317670A (zh) * 2021-12-14 2022-04-12 福建凯立生物制品有限公司 一种筛选培养基及其制备方法和应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1539957A (zh) * 2003-11-04 2004-10-27 中国农业科学院生物防治研究所 淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法
CN106967656A (zh) * 2017-05-31 2017-07-21 衡水学院 一种地衣芽孢杆菌及其应用
CN107513514A (zh) * 2017-10-20 2017-12-26 福建和泉生物科技有限公司 一种供生产用的链霉菌种液及其制备、保存、使用方法
CN108841733A (zh) * 2018-07-26 2018-11-20 福州工微生物科技有限公司 一株生产松刚霉素主份——灰黄霉素的菌株及方法
CN109609491A (zh) * 2018-12-27 2019-04-12 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种高效产春雷霉素的小金色链霉菌诱变和筛选方法
CN110499308A (zh) * 2019-09-23 2019-11-26 华东理工大学青岛创新研究院 基于artp复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法
CN111100859A (zh) * 2020-01-16 2020-05-05 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种筛选多氧霉素b组分高产菌株的方法
CN113621667A (zh) * 2021-09-14 2021-11-09 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种电磁耦合发酵淡紫链霉菌海南变种微生物生物电池
CN114196580A (zh) * 2021-12-14 2022-03-18 福建凯立生物制品有限公司 一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法
CN114317670A (zh) * 2021-12-14 2022-04-12 福建凯立生物制品有限公司 一种筛选培养基及其制备方法和应用
CN116287063A (zh) * 2023-01-29 2023-06-23 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种提高中生菌素发酵效价的生产工艺

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1539957A (zh) * 2003-11-04 2004-10-27 中国农业科学院生物防治研究所 淡紫灰链霉菌海南变种及由该菌种制备农用抗生素的方法
CN106967656A (zh) * 2017-05-31 2017-07-21 衡水学院 一种地衣芽孢杆菌及其应用
CN107513514A (zh) * 2017-10-20 2017-12-26 福建和泉生物科技有限公司 一种供生产用的链霉菌种液及其制备、保存、使用方法
CN108841733A (zh) * 2018-07-26 2018-11-20 福州工微生物科技有限公司 一株生产松刚霉素主份——灰黄霉素的菌株及方法
CN109609491A (zh) * 2018-12-27 2019-04-12 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种高效产春雷霉素的小金色链霉菌诱变和筛选方法
CN110499308A (zh) * 2019-09-23 2019-11-26 华东理工大学青岛创新研究院 基于artp复合诱变技术的高通量筛选庆大霉素高产菌株的方法
CN111100859A (zh) * 2020-01-16 2020-05-05 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种筛选多氧霉素b组分高产菌株的方法
CN113621667A (zh) * 2021-09-14 2021-11-09 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种电磁耦合发酵淡紫链霉菌海南变种微生物生物电池
CN114196580A (zh) * 2021-12-14 2022-03-18 福建凯立生物制品有限公司 一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法
CN114317670A (zh) * 2021-12-14 2022-04-12 福建凯立生物制品有限公司 一种筛选培养基及其制备方法和应用
CN116287063A (zh) * 2023-01-29 2023-06-23 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种提高中生菌素发酵效价的生产工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
姚亚丽等: "中生菌素在植物病害防治上的应用研究进展", 《衡阳师范学院学报》, no. 06, pages 99 - 104 *
赖滨霞: "中生菌素耐自生产物突变株的选育", 《海峡药学》, vol. 23, no. 8, pages 2 - 5 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114045252A (zh) * 2021-11-18 2022-02-15 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法
CN114045252B (zh) * 2021-11-18 2023-08-22 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法
CN114196580A (zh) * 2021-12-14 2022-03-18 福建凯立生物制品有限公司 一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法
CN114292774A (zh) * 2021-12-14 2022-04-08 福建凯立生物制品有限公司 一种菌丝体或菌体及其应用、及利用其选育菌株的方法
CN114317670A (zh) * 2021-12-14 2022-04-12 福建凯立生物制品有限公司 一种筛选培养基及其制备方法和应用
CN114196580B (zh) * 2021-12-14 2023-03-28 福建凯立生物制品有限公司 一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法
CN114250183A (zh) * 2021-12-27 2022-03-29 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种筛选多抗霉素b和l复合组分高产菌株的方法
CN114276392A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 陕西麦可罗生物科技有限公司 一种中生菌素f组分母药及其制备方法

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