CN111849807B - 一种刺糖多孢菌ds190375及其发酵产物、菌剂、发酵与筛选方法及应用 - Google Patents

一种刺糖多孢菌ds190375及其发酵产物、菌剂、发酵与筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种刺糖多孢菌DS190375及其发酵产物、菌剂、发酵与筛选方法及应用。本发明的刺糖多孢菌DS190375，其保藏编号为CGMCC No.18681。其发酵方法为先将该菌在高盐平板培养基中进行复壮筛选，然后再进行发酵。本发明还提供多杀菌素产量高的一类刺糖多孢菌的筛选方法，先筛选获得耐盐性高的刺糖多孢菌，再对获得的耐盐性高的刺糖多孢菌进行筛选，获得多杀菌素产量高的菌株。本发明的刺糖多孢菌DS190375耐高盐、多杀菌素产量高。发酵方法避免了因菌株性能退化所产生的多杀菌素产量不稳定的问题。

Description

一种刺糖多孢菌DS190375及其发酵产物、菌剂、发酵与筛选方 法及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种刺糖多孢菌DS190375及其发酵产物、菌剂、发酵与筛选方法及应用。
背景技术
多杀菌素(Spinosad)是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的一类大环内酯类生物活性物质，对大部分鳞翅目、双翅目农业害虫都具有高效杀灭效果，对其它农业害虫也有一定防治效果，关键是多杀菌素对人和环境都非常安全，并且可生物降解，是一种非常理想的“绿色农药”。
目前制约多杀菌素大规模产业化的关键性因素是其发酵工艺复杂，发酵单位低，生产成本高。因此提高多杀菌素的发酵单位，降低其生产成本，是当前的研究重点。近年来很多科研机构都成功的利用诱变筛选、原生质体融合、基因工程等手段提高了多杀菌素菌种的发酵单位，但是都没有成功产业化，其中一个重要原因是，多杀菌素的高产菌种，在生产过程中非常容易出现菌种衰退的现象，导致发酵生产水平很不稳定，阻碍了多杀菌素的成功产业化。因此对于多杀菌素的产业化来说，除了筛选出高产菌种之外，研究出一个可避免高产菌种易退化现象对生产工艺影响的方法，也是非常重要的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种可避免高产菌的退化现象对发酵生产多杀菌素稳定性影响的刺糖多孢菌。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
本发明的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375，其于2019年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101)，分类命名为刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa，保藏编号为CGMCC No.18681。
本发明的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375是将原始出发菌株经ARTP诱变后，涂布于高盐平板培养基进行耐高盐筛选，再经过多孔板发酵初筛和摇瓶发酵复筛，选育出的一株耐高盐的多杀菌素高产菌株DS190375。本发明中诱变筛选得到的该高产菌株的高产性状与耐高盐性状是相关联的，以该菌株用于生产时，可先用高盐平板培养基进行复壮筛选，再将菌种接种于高盐种子培养基中培养，该方法得到的种子可淘汰退化的菌丝，具有很好的生产稳定性，有效地解决了多杀菌素高产菌种容易退化，从而影响产量的问题。
进一步地，本发明提供所述刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375的发酵产物。
本发明提供一种菌剂，其含有上述刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375或上述发酵产物。
优选地，所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。
本发明还提供一种刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375的发酵方法，所述发酵方法是先将刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375在高盐平板培养基中进行复壮筛选，然后以高盐种子培养基培养复壮筛选出的菌株，以获得种子液用于发酵。
优选地，所述高盐平板培养基和所述高盐种子培养基中盐的含量为3.5％。
优选地，本发明的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375的发酵方法具体为：首先将刺糖多孢菌DS190375菌株涂布于高盐平板培养基进行平板复壮筛选，然后从长出单菌落的复壮平板上挑取单菌落接种于斜面培养基培养，再从成熟斜面上刮取孢子接种到高盐种子培养基培养，培养好的种子液接种到发酵培养基中进行发酵生产多杀菌素。
具体步骤包括：
(1)将刺糖多孢菌DS190375菌种用生理盐水梯度稀释后涂布于高盐平板培养基上，平板于28～30℃下培养10～15天。
(2)从高盐平板上选取外形饱满、产白色孢子的较大的单菌落接种于斜面培养基上，斜面于28～30℃下培养8～10天。
(3)从成熟斜面上刮取孢子接种于种子摇瓶内的高盐种子培养基中，种子摇瓶在28～30℃，200～220rpm条件下培养2～4天，得摇瓶种子液。
(4)将摇瓶种子液按0.1～1.5％的接种量接种于种子罐的高盐种子培养基中，种子罐在罐温28～30℃，搅拌转速100～200rpm，通气比0.5～1.5vvm条件下培养3～6天，得种子液(若有必要，可增加种子罐级数)。
(5)将种子液按5～15％的接种量接种于发酵罐的发酵培养基中，发酵罐在罐温28～30℃，搅拌转速60～600rpm，通气比0.5～1.5vvm条件下培养12～16天后结束发酵。
优选地，在步骤(5)所述的发酵过程中的第6～15天，以每天0.5～2％的速度流加补葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度在0.5～3.0％之间。
其中，高盐平板培养基配方：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，七水硫酸镁0.2％，氯化钠3.5％，琼脂2％。
斜面培养基配方：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，七水硫酸镁0.2％，琼脂2％。
高盐种子培养基配方：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1.5％，黄豆饼粉1％，磷酸氢二钾0.5％，七水硫酸镁0.2％，氯化钠3.5％。
发酵培养基配方：葡萄糖8％，菜籽油2％，黄豆饼粉1％，蛋白胨2％，棉籽饼粉3％，七水硫酸镁0.2％，碳酸钙0.4％。
本发明在发酵生产中用高盐平板培养基和高盐种子培养基淘汰退化的刺糖多孢菌DS190375菌丝，有效解决了菌种退化问题对生产稳定性的影响，保证了高产菌种在发酵生产中的稳定性。
本发明另提供一种高产多杀菌素的一类刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)的筛选方法，其包括：
(1)筛选获得耐盐性高的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)；
(2)对步骤(1)获得的耐盐性高的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)进行筛选，获得多杀菌素产量高的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)。
本发明中，在步骤(1)前还包括对作为出发菌的刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)进行耐盐性上限测试和诱变的步骤；步骤(1)筛选耐盐性高的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中所用的盐浓度高于获得的所述出发菌的耐盐性上限。
本发明中，步骤(2)中筛选多杀菌素产量高的刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)的方法具体为：
初筛：通过生物检测筛选出刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的发酵产物中多杀菌素产量高的菌株；
复筛：将初筛获得的所述菌株进行发酵培养，通过测定发酵液中多杀菌素的含量进行复筛。
优选，生物检测采用伊蚊幼虫作为实验对象，通过判断菌株发酵产物对其的杀灭效果，判断发酵产物中多杀菌素的含量。
本发明提供的利用ARTP诱变技术与高盐平板培养基筛选相结合筛选多杀菌素高产菌种的方法，可解决多杀菌素发酵生产中遇到的菌种退化对产量影响的问题。以该方法筛选获得的菌株，在生产前可先通过耐盐性对菌株进行复壮筛选，淘汰生产性能退化的菌株，从而保证发酵时多杀菌素的产量。
本发明的刺糖多孢菌DS190375的具体筛选方法，包括以下步骤：
1.将购自美国农业菌种保藏中心(NRRL)的出发菌种Saccharopolyspora spinosaNRRL 18395接种至斜面培养基，在28～30℃下培养8～10天，经过培养后获得成熟的斜面。本步骤中用到的斜面培养基配方为：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，七水硫酸镁0.2％，琼脂2％。
2.从成熟的斜面上刮取约1cm2的孢子接种到种子摇瓶，种子摇瓶在28～30℃，200～220rpm的摇床上培养2～3天至菌丝处于对数生长期，获得菌悬液。本步骤中用到的种子培养基配方为：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1.5％，黄豆饼粉1％，磷酸氢二钾0.5％，七水硫酸镁0.2％；
3.取步骤2中处于对数生长期的菌悬液进行离心和洗涤，弃去上清液，加入溶菌酶，在30℃水浴中振荡酶解，然后过滤，收集滤液，获得原生质体悬浮液；
4.取适量原生质体悬浮液涂布于无菌载片上，在ARTP诱变育种仪上进行诱变，诱变后，用生理盐水将载片上的原生质体洗脱下来，获得原生质体诱变库；
5.将原生质体诱变库经适当梯度稀释后，涂布于高盐平板筛选培养基上，28～30℃培养10～15天。本步骤用到的高盐平板培养基配方为：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，七水硫酸镁0.2％，氯化钠3.5％，琼脂2％；
6.高产菌株的发酵初筛：从高盐平板上选取外形饱满、产白色孢子较多、较大的单菌落，用已灭菌的竹签从单菌落接种于96孔板的发酵初筛培养基中，每孔装量500μl，在28～30℃振荡培养6天后，用2日龄埃及伊蚊幼虫对发酵液进行生测初筛。具体做法是，另取一块96孔板作为生测板，每孔加入500μl培养好的2日龄埃及伊蚊培养液，控制每孔中约5～8条埃及伊蚊幼虫，从发酵96孔板上各孔分别取20μl发酵液加入到生测96孔板上各孔中，一个小时后观察，选取埃及伊蚊幼虫全部死亡的菌株进行复筛。本步骤用到的多孔板发酵培养基配方：葡萄糖5％，酵母浸粉1％，蛋白胨3％，七水硫酸镁0.2％；
7.高产菌株的发酵复筛：从步骤6中挑选的埃及伊蚊幼虫全部死亡的菌株对应的单菌落接种至斜面培养基上，28～30℃培养8～10天，将斜面孢子接种到种子瓶培养基中，28～30℃，200～220rpm摇床培养2～3天至菌丝处于对数生长期，按5％～15％(v/v)的接种量转入发酵瓶培养基中进行发酵培养，28～30℃，200～220rpm摇床培养10～12天，采用HPLC法检测发酵液中多杀菌素的含量，从而筛选出发酵单位最高的3～5株高产菌株。本步骤用到的斜面培养基和种子培养基同步骤1和步骤2，本步骤用到的发酵培养基配方为：葡萄糖8％，菜籽油2％，黄豆饼粉1％，蛋白胨2％，棉籽饼粉3％，七水硫酸镁0.2％，碳酸钙0.4％；
高产菌株的稳定性考察：步骤7中复筛得到的3～5株高产菌株分别进行斜面传代，各传四代斜面，考察每个菌株各代斜面的发酵单位，选取各代发酵单位最稳定的一株菌株，即本发明的刺糖多孢菌DS190375，作为生产菌种保藏。本步骤中用到的斜面培养基、种子培养基和发酵培养基同步骤7。
本发明还提供了一种上述刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375，或上述发酵产物，或上述菌剂，或上述发酵方法，或上述筛选方法在生产多杀菌素中的应用。
本发明还提供了一种上述筛选方法在获得高产多杀菌素的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
(1)利用ARTP(常压室温等离子体)诱变技术对原始菌种进行诱变，与传统诱变方法相比，ARTP诱变技术能够有效造成DNA多样性损伤，所以突变率较高，并且较易获得遗传稳定性良好的突变株。
(2)巧妙设计的诱变筛选策略。本发明设计了一个诱变筛选策略，将耐高盐作为一个“筛子”来筛选经ARTP诱变后的菌种突变库，发现经耐高盐平板的“筛子”筛选后存活下来的突变株中，发酵单位提高的正突变率是较高的。因此，经过耐高盐这一道“筛子”的筛选后，再从存活下来的耐高盐突变株中筛选出高产的菌株的可能性大大提高了。
(3)利用多孔板发酵技术与多杀菌素的快速生测技术相结合，对耐高盐的突变菌株进行多孔板发酵初筛，比起传统的摇瓶发酵筛选，筛选通量大幅度提高，大大提高了菌种筛选的效率，有利于筛选出高产菌株。
(4)通过以上巧妙设计的筛选策略，筛选出来的高产菌株DS190375摇瓶发酵单位为2069μg/ml，同时该高产菌株还具有耐高盐的特性。
(5)利用DS190375菌株耐高盐的特性，在发酵生产中每次进行种子培养前，先用高盐平板培养基对保藏菌种进行一次复壮筛选，然后用高盐液体种子培养基进行种子培养，这样培养出来的种子液中已经淘汰了大部分退化的菌丝，因此，可以保证发酵罐发酵单位水平的稳定，从而解决了多杀菌素发酵生产中菌种容易退化，发酵单位不稳定的难题。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中所用到的各培养基的配方为：
斜面培养基配方、平板培养基配方：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，七水硫酸镁0.2％，琼脂2％；
种子培养基配方：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1.5％，黄豆饼粉1％，磷酸氢二钾0.5％，七水硫酸镁0.2％；
高盐平板培养基配方：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，七水硫酸镁0.2％，氯化钠3.5％，琼脂2％；
高盐种子培养基配方：葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨1.5％，黄豆饼粉1％，磷酸氢二钾0.5％，七水硫酸镁0.2％，氯化钠3.5％；
多孔板发酵初筛培养基配方：葡萄糖5％，酵母浸粉1％，蛋白胨3％，七水硫酸镁0.2％；
发酵培养基配方：葡萄糖8％，菜籽油2％，黄豆饼粉1％，蛋白胨2％，棉籽饼粉3％，七水硫酸镁0.2％，碳酸钙0.4％。
实施例1：出发菌种的耐盐性实验
以购自美国农业菌种保藏中心(NRRL)的Saccharopolyspora spinosa NRRL18395作为出发菌种。配制一批平板培养基，分别不加，加入0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％的氯化钠。将出发菌种分别涂布在平板上，每个氯化钠浓度的平板各涂布5个，涂布好的平板在29℃的培养箱中培养9天后，观察各组平板上菌落的生长情况，如表1所示：
表1 Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395在含盐平板上的生长情况
Figure BDA0002563882280000081
Figure BDA0002563882280000091
备注：+++表示有大量菌落，++表示菌落稀疏，+表示仅有个位数菌落生长，-表示无生长。
从上表1中可以看出，当培养基中NaCl的浓度达到2.0％时，菌落生长即受到明显抑制；当培养基中NaCl的浓度达到或超过3.0％时，均无菌落生长，所以Saccharopolysporaspinosa NRRL 18395菌种耐NaCl的极限为3.0％。因此可以选择3.5％的NaCl浓度来做耐盐性突变株的筛选。
实施例2：ARTP诱变筛选刺糖多孢菌高产菌株
(1)刺糖多孢菌的斜面培养：
以购自美国农业菌种保藏中心(NRRL)的Saccharopolyspora spinosa NRRL18395作为出发菌种，将出发菌种接种在斜面培养基上，斜面在29℃的培养箱中培养9天，获得成熟的斜面。
(2)刺糖多孢菌的摇瓶种子培养
从步骤(1)中培养成熟的斜面上，刮取斜面孢子，接种到种子摇瓶中的种子培养基中，每瓶接入大约1cm2斜面上的孢子，种子瓶在29℃，220rpm的摇床上培养3天，得摇瓶种子液。
(3)制备刺糖多孢菌原生质体悬浮液
取步骤(2)中培养好的摇瓶种子液，加入无菌离心管中，在离心机中以3000rpm的转速离心10min，弃去上清液，沉淀物用生理盐水洗涤两次，得到菌丝体。再往装菌丝体的离心管中加入溶菌酶溶液，在30℃的水浴中振荡酶解2h，然后用脱脂棉花过滤，收集滤液，加入终浓度为5％的甘油，得原生质体悬浮液。
(4)刺糖多孢菌原生质体的ARTP诱变
吸取20μl原生质体悬浮液滴在载片上并涂匀，用无菌镊子将载片置于ARTP诱变育种仪的操作室中，以高纯氦气为工作气体，进气量为10SLM，照射距离2mm，分别照射三组载片，照射时间分别为20s、30s、40s。诱变结束后，用无菌镊子将载片转移到无菌离心管中，加入2ml无菌生理盐水，振荡冲洗载片，把载片上附着的原生质体洗脱到生理盐水中，制成原生质体诱变库。
(5)原生质体诱变库在高盐平板培养基上的再生
将原生质体诱变库经梯度稀释，取10倍、100倍、1000倍、10000倍梯度的稀释液涂布在高盐平板培养基上，平板置于29℃的培养箱中培养13天，培养8天后每天注意观察，以每个平板上长出5～10个单菌落为合适。
(6)多孔板发酵初筛实验一
从高盐平板上选取外形饱满产白色孢子的较大的单菌落，用已灭菌的竹签从单菌落上沾取孢子接种于96孔板的发酵初筛培养基中，每孔装量500μl，用记号笔在单菌落平板背面做好编号，平板置于4℃冰箱保存。接种后的多孔板盖上盖子，置于29℃，220rpm的摇床上，振荡培养6天后进行生测。每块发酵96孔板对应一块生测96孔板，在生测96孔板的每孔中加入500μl培养好的2日龄埃及伊蚊培养液，控制每孔中约5～8条伊蚊幼虫，从发酵96孔板上各孔分别取20μl发酵液加入到生测96孔板上各孔中，伊蚊幼虫死亡越快，则说明发酵液中多杀菌素的产量越高，一个小时后观察，选取伊蚊幼虫全部死亡的菌株进行复筛。初筛共挑取480个单菌落进行多孔板发酵，发酵液经过生测鉴定，筛选出了有高产特征的27株菌株进入下一步复筛。
(7)摇瓶发酵复筛实验一
从步骤(6)中初筛出来的27株菌株的单菌落分别接种至斜面培养基上，29℃培养9天，从各斜面分别刮取约1cm2的孢子到种子瓶的种子培养基中，种子瓶在29℃，220rpm摇床上培养3天，再按10％(v/v)的接种量转入发酵瓶的发酵培养基中进行发酵培养，每个种子瓶接种三个平行发酵瓶，发酵瓶在29℃，220rpm摇床培养11天后放瓶，采用HPLC法检测发酵液中多杀菌素的含量，筛选出平均发酵单位最高的3株高产菌株分别为：DS190259，平均发酵单位2118μg/ml；DS190375，平均发酵单位2069μg/ml；DS190412，平均发酵单位1981μg/ml。
(8)诱变和初筛实验二
同样以NRRL 18395作为出发菌种，重复(1)～(6)的诱变筛选步骤，再次挑取480个单菌落进行多孔板发酵实验，发酵液经生测鉴定，筛选出了有高产特征的21株菌株进入下一步复筛。
(9)复筛实验二
从步骤(8)中初筛出来的21株菌株的单菌落分别接种至斜面培养基上，29℃培养9天，从各斜面分别刮取约1cm2的孢子到种子瓶的种子培养基中，种子瓶在29℃，220rpm摇床上培养3天，再按10％(v/v)的接种量转入发酵瓶的发酵培养基中进行发酵培养，每个种子瓶接种三个平行发酵瓶，发酵瓶在29℃，220rpm摇床培养11天后放瓶，采用HPLC法检测发酵液中多杀菌素的含量，筛选出平均发酵单位最高的3株高产菌株分别为：DS190521，平均发酵单位2081μg/ml；DS190728，平均发酵单位2035μg/ml；DS190833，平均发酵单位1977μg/ml。
(10)高产菌株的稳定性考察
将步骤(7)和步骤(9)中两次复筛分别得到的6株高产菌株分别进行斜面传代，各传四代斜面，考察每个菌株各代斜面的平均发酵单位，考察结果如表2所示：
表2 六株高产菌株的斜面传代稳定性考察
Figure BDA0002563882280000121
从以上表2中可以看出，DS190375、DS190728和DS190833这三株菌株的传代稳定性较好，其他三株菌株的生产能力衰退较快。其中又以DS190375的发酵单位较高和稳定性最好，因此将DS190375作为生产菌种保藏。另外从上表2中还可以看出诱变筛选出来的高产菌种，经过多次传代后，生产能力都会有不同程度的下降，所以在工业化生产的时候，为了生产的稳定，研究一种行之有效的菌种复壮措施是很有必要的。
实施例3：诱变菌株的高产性状与高耐盐性状的关联性实验
在生产实践中发现，多杀菌素的高产菌株在生产中很容易发生产量退化现象。通过表2可以看出，用本发明所述方法诱变筛选得到的高产菌株，经过多次传代后，生产能力也会有不同程度的下降，有些菌株稳定性较好，有些菌株退化较严重。总之，多杀菌素菌种在生产条件下的扩增过程中，高产性状容易退化是其自身特点，很难克服。为了研究本发明所述方法得到的诱变菌种的高产性状与耐盐性状的关系，设计了以下实验。
(1)高产菌株和退化菌株的耐盐性实验
将实施例2中诱变筛选出来的六株高产菌株的F5斜面孢子，分别涂布高盐平板培养基，每株菌涂布5个平板，涂布好的平板在29℃的培养箱中培养9天后，观察各组平板上菌落的生长情况，如表3所示：
表3 六株高产菌株F5分别在高盐(3.5％)平板上的生长情况
第1组平板 第2组平板 第3组平板 第4组平板 第5组平板
DS190259-F5 +++ ++ ++ ++ +
DS190375-F5 +++ +++ ++ +++ ++
DS190412-F5 + + - - ++
DS190521-F5 - + + - +
DS190728-F5 ++ + ++ ++ +
DS190833-F5 +++ + ++ ++ +
备注：+++表示有大量菌落，++表示菌落稀疏，+表示仅有个位数菌落生长，-表示无生长。
从表3中可以看出，高产性状稳定性较好的DS190375-F5，其耐盐性状也保持的比较好，而发酵单位下降较严重的DS190412-F5和DS190521-F5，其耐盐性状也退化明显，只能长出少量菌落。
(2)耐盐菌株与不耐盐菌株的产量对比实验
从DS190375-F5斜面上刮取孢子，加入到装有无菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶中，在摇床上振荡10分钟，然后用无菌滤纸过滤，得到单孢子菌悬液，用无菌生理盐水梯度稀释菌悬液，取合适稀释梯度的菌悬液涂布在平板培养基上，长好后作为母平板，每个母平板上的单菌落数控制在10～20个。用影印接种法从母平板上筛选出耐盐和不耐盐的单菌落菌株，具体做法是：用一小块无菌的丝绒布套在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章，然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒布的印章上，轻轻印一下，再把此印章在另一空白高盐平板培养基上轻轻印一下，高盐培养基平板长好后将长出的菌落与母平板上的菌落位置对应比较，两个平板上相同位置上都长出菌落的是未发生耐盐性退化的菌株；相同位置上母平板上长有菌落，高盐平板上未长出菌落，说明母平板上的该菌落已经发生了耐盐性退化，不再耐高盐了。用这种方法筛选出耐盐的单菌落96个，不耐盐的单菌落96个。然后用实施例2中第(6)步多孔板发酵初筛的方法，将两种单菌落分别接种发酵96孔板，发酵培养6天后，再用生测96孔板鉴定发酵液中多杀菌素产量的高低。实验结果显示，不耐盐的单菌落对应的生测96孔板，伊蚊幼虫全部死亡的孔位共有20个(20.8％)，耐盐的单菌落对应的生测96孔板，伊蚊幼虫全部死亡的孔位共有88个(91.7％)。这一实验结果说明，本发明所述方法诱变筛选出来的耐高盐高产菌种经过多次传代后，保留了耐盐性性状的菌株90％以上都保留了高产性状，而丢失了耐盐性性状的菌株仅有20％左右保留了高产性状。
通过本实施例的两个实验，可以看出，本发明所述方法诱变筛选出的耐高盐高产菌种，其高产性状与耐高盐性状的关联性较好。根据该特性，本发明设计了一个菌种复壮的方法，利用高盐平板培养基和高盐种子培养基对DS190375菌种进行菌种复壮筛选，淘汰掉已经失去耐盐性状和高产性状的退化菌株，因此可以有效的解决高产菌种在生产过程中的退化问题。
对比例1：多杀菌素的发酵小试(50L罐)不经高盐培养基复壮
(1)斜面培养
将本发明保藏的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375菌种接种于斜面培养基上，斜面在29℃下培养9天得到成熟的斜面。
(2)种子瓶培养
从成熟的斜面刮取约1cm2面积的孢子接种于种子摇瓶中的种子培养基(相比于本发明的高盐种子培养基，区别仅在于不添加氯化钠)中，种子瓶在29℃，220rpm的摇床上培养4天得到成熟的摇瓶种子液。
(3)15L种子罐培养
种子罐装量10L，种子罐培养基为种子培养基，从种子瓶按照1％(100ml)的接种量接种到种子罐，种子罐在罐温29℃，搅拌转速200rpm，通气量10L/min的条件下，培养72h得到成熟的种子液。
(4)50L发酵罐培养
发酵罐装量30L，从种子罐按照10％的接种量接种到发酵罐，发酵罐在罐温29℃，搅拌转速100～600rpm，通气量15～30L/min，溶氧≥30％的条件下培养，从第7天开始，每天补入1％左右的葡萄糖，维持发酵液中葡萄糖浓度在0.5～2.0％之间，发酵到第15天，结束发酵并放罐，放罐发酵液的发酵单位为3236μg/ml。
实施例4：菌种复壮的多杀菌素的发酵小试(50L罐)
(1)菌种复壮
将本发明保藏的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375菌种梯度稀释，涂布在高盐平板培养基上，平板在29℃下培养13天，从平板上挑选外形饱满产白色孢子的较大的单菌落接种于斜面培养基上，斜面在29℃下培养9天得到成熟的斜面。
(2)种子瓶培养
从成熟的斜面刮取约1cm2面积的孢子接种于种子摇瓶中的高盐种子培养基中，种子瓶在29℃，220rpm的摇床上培养4天得到成熟的摇瓶种子液。
(3)15L种子罐培养
种子罐装量10L，种子罐培养基为高盐种子培养基，从种子瓶按照1％(100ml)的接种量接种到种子罐，种子罐在罐温29℃，搅拌转速200rpm，通气量10L/min的条件下，培养72h得到成熟的种子液。
(4)50L发酵罐培养
发酵罐装量30L，从种子罐按照10％的接种量接种到发酵罐，发酵罐在罐温29℃，搅拌转速100～600rpm，通气量15～30L/min，溶氧≥30％的条件下培养，从第7天开始，每天补入1％左右的葡萄糖，维持发酵液中葡萄糖浓度在0.5～2.0％之间，发酵到第15天，因菌丝老化，发酵单位停止增长，结束发酵并放罐，放罐发酵液的发酵单位为4367μg/ml。
(5)菌种复壮的效果
通过与对比例1相比较，可以看出利用高盐平板培养基和高盐种子培养基对菌种进行复壮后，小试罐上发酵单位提高了30％以上，说明用本发明所述的方法淘汰退化菌种是行之有效的。
实施例5：菌种复壮的多杀菌素的发酵中试(5t罐)
(1)菌种复壮
将本发明保藏的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375菌种梯度稀释，涂布在高盐平板培养基上，平板在29℃下培养13天，从平板上挑选外形饱满产白色孢子的较大的单菌落接种于斜面培养基上，斜面在29℃下培养9天得到成熟的斜面。
(2)种子瓶培养
从成熟的斜面刮取约1cm2面积的孢子接种于种子摇瓶中的高盐种子培养基中，种子瓶在29℃，220rpm的摇床上培养4天得到成熟的摇瓶种子液。
(3)500L种子罐培养
种子罐装量300L，种子罐培养基为高盐种子培养基，从种子瓶按照0.2％(600ml)的接种量接种到种子罐，种子罐在罐温29℃，搅拌转速120rpm，通气量15m3/h的条件下，培养116h得到成熟的种子液。
(4)5t发酵罐培养
发酵罐装量3t，从种子罐按照10％的接种量接种到发酵罐，发酵罐在罐温29℃，搅拌转速80～300rpm，通气量100～200m3/h，溶氧≥30％的条件下培养，从第6天开始，每天补入1％左右的葡萄糖，维持发酵液中葡萄糖浓度在0.5～2.0％之间，发酵到第14天，发酵单位停止增长，结束发酵并放罐，放罐发酵液的发酵单位为4077μg/ml。
实施例6：菌种复壮的多杀菌素的发酵生产(20t罐)
(1)菌种复壮
将本发明保藏的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375菌种梯度稀释，涂布在高盐平板培养基上，平板在29℃下培养13天，从平板上挑选外形饱满产白色孢子的较大的单菌落接种于斜面培养基上，斜面在29℃下培养9天得到成熟的斜面。
(2)种子瓶培养
从成熟的斜面刮取约1cm2面积的孢子接种于种子摇瓶中的高盐种子培养基中，种子瓶在29℃，220rpm的摇床上培养4天得到成熟的摇瓶种子液。
(3)500L一级种子罐培养
种子罐装量300L，种子罐培养基为高盐种子培养基，从种子瓶按照0.2％(600ml)的接种量接种到种子罐，种子罐在罐温29℃，搅拌转速120rpm，通气量15m3/h的条件下，培养118h得到成熟的种子液。
(4)5t二级种子罐培养
二级种子罐装量1.5t，从一级种子罐按照10％的接种量接种到二级种子罐，二级种子罐在罐温29℃，搅拌转速80～300rpm，通气量100～200m3/h，溶氧≥30％的条件下培养，培养29h得到成熟的种子液。
(5)20t发酵罐培养
发酵罐装量15t，从二级种子罐按照10％的接种量接种到发酵罐，发酵罐在罐温29℃，搅拌转速60～200rpm，通气量450～900m3/h，溶氧≥30％的条件下培养，从第6天开始，每天补入1％左右的葡萄糖，维持发酵液中葡萄糖浓度在0.5～2.0％之间，发酵到第14天，发酵单位停止增长，结束发酵并放罐，放罐发酵液的发酵单位为3895μg/ml。
通过实施例5和实施例6可以看出，随着发酵规模的递增，发酵产量会有一定幅度的递降，这说明由于该菌种自身容易退化的特性，随着菌种扩增培养级数的增加，发酵产量降低是不可避免的。但从实施例4与对比例1对照可以看出，使用本发明所述方法诱变筛选得到的高产菌种，结合在生产中进行菌种复壮，可以大大地降低菌种退化的幅度，有效解决了菌种退化问题对生产稳定性的影响，保证了高产菌种在发酵生产中的稳定性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375，其特征在于，所述刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375的保藏编号为CGMCC No.18681。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)DS190375。
3.一种权利要求1所述的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375的发酵方法，其特征在于，先将刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375在高盐平板培养基中进行复壮筛选，然后以高盐种子培养基培养复壮筛选出的菌株，以获得种子液用于发酵，所述高盐平板培养基和所述高盐种子培养基中盐的含量为3.5％。
4.产多杀菌素的一类刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的筛选方法，其特征在于，包括：
(1)筛选获得耐盐性高的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)；
(2)对步骤(1)获得的耐盐性高的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)进行筛选，获得多杀菌素产量高的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)；
在步骤(1)前还包括对作为出发菌的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)进行耐盐性上限测试和诱变的步骤；步骤(1)筛选耐盐性高的刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)中所用的盐浓度高于获得的所述出发菌的耐盐性上限。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中筛选多杀菌素产量高的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的方法具体为：
初筛：通过生物检测筛选出刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的发酵产物中多杀菌素产量高的菌株；
复筛：将初筛获得的所述菌株进行发酵培养，通过测定发酵液中多杀菌素的含量进行复筛。
6.权利要求1所述的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)DS190375，或权利要求3所述的发酵方法，或权利要求4-5任一项所述的筛选方法在生产多杀菌素中的应用。
7.权利要求4-5任一项所述的筛选方法在获得产多杀菌素的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的应用。
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