CN108239606A - 黑酵母菌出芽短梗霉菌株及使用其生产琥珀酸的方法 - Google Patents

黑酵母菌出芽短梗霉菌株及使用其生产琥珀酸的方法 Download PDF

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Abstract

一种经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株及利用其生产琥珀酸的方法。黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株会利用碳源来生产琥珀酸。黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株可在弱酸以及有氧环境培养条件下，利用多种碳源产生大量的琥珀酸。

Description

黑酵母菌出芽短梗霉菌株及使用其生产琥珀酸的方法
【技术领域】
本发明是有关于一种黑酵母菌及使用其生产琥珀酸的方法，且特别是有关于一种黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株及使用其生产琥珀酸的方法。
【背景技术】
琥珀酸(succinic acid)，又名丁二酸，其是生产1,4-丁二醇、丁二醇、γ-丁内酯、马来酸和反丁烯二酸等化学品的重要原料。琥珀酸及其衍生物已被广泛应用于食品及化学工业。目前琥珀酸的生产除了来自于石化原料以外，也可藉由微生物法来生产琥珀酸。具体来说，可以藉由微生物对葡萄糖进行糖解后而产生琥珀酸。以微生物法来生产琥珀酸具有可利用废弃资源为原料、生产条件温和以及对环境友善等优点。
目前已知可用于生产琥珀酸的微生物主要包括琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinciproducens)以及产琥珀酸曼海姆菌(Mannheinia succinciproducens)，其皆为源自于自然环境的分离株。然而，上述三种菌株皆具有不耐酸、不耐氧以及只能利用葡萄糖作为碳源等缺点。因此，开发一种具有耐酸、耐氧特性且可利用多种碳源来生产琥珀酸的菌株，是目前研究人员亟欲解决的问题。
【发明内容】
本发明提供一种经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其具有耐氧、耐酸以及可利用多种碳源生产琥珀酸的特性。
本发明提供一种突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其具有耐氧、耐酸以及可利用多种碳源生产琥珀酸的特性。
本发明提供一种生产琥珀酸的方法，其利用黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株来代谢碳源以生产琥珀酸。
本发明提出一种经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其会利用碳源生产琥珀酸。
在本发明的一实施例中，上述的碳源例如是糖类、有机酸或其组合。
在本发明的一实施例中，上述的糖类例如是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、淀粉、木质素、半纤维素或纤维素。
在本发明的一实施例中，上述的有机酸例如是苹果酸、延胡索酸或乳酸。
在本发明的一实施例中，上述的经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株可在pH值为3至9的环境下生长。
在本发明的一实施例中，上述的经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株可在有氧的环境下生长。
本发明提出一种突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，寄存编号为CCTCC M 2016746。
在本发明的一实施例中，上述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株可利用碳源生产琥珀酸。
在本发明的一实施例中，上述的碳源例如是糖类、有机酸或其组合。
在本发明的一实施例中，上述的糖类例如是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、淀粉、木质素、半纤维素或纤维素。
在本发明的一实施例中，上述的有机酸例如是苹果酸、延胡索酸或乳酸。
在本发明的一实施例中，上述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株可衍生自上述经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株。
在本发明的一实施例中，上述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株可在pH值为3至9的环境下生长。
在本发明的一实施例中，上述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株可在有氧的环境下生长。
本发明提出一种生产琥珀酸的方法，其包括以下步骤。将上述的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株接种于包括碳源的第一培养基中。培养接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的第一培养基，以得到含有琥珀酸的所述第一培养基，其中黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株利用所述碳源生产琥珀酸。
在本发明的一实施例中，可于pH3至9、20℃至40℃、0rpm至500rpm以及有氧环境的条件下培养接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的第一培养基。其中，可以在通入气体或不通入气体的条件下培养接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的第一培养基。
在本发明的一实施例中，更包括于通入空气量为0.1vvm至2vvm的条件下培养接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的第一培养基。
在本发明的一实施例中，上述培养接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株的第一培养基可包括以下步骤。于通气条件下进行第一发酵培养，使得菌株达到生长对数期。于停止通气的条件下进行第二发酵培养。
在本发明的一实施例中，通气条件例如是通入空气量为0.1vvm至2vvm。
在本发明的一实施例中，可于pH3至9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的条件下进行第一发酵培养。
在本发明的一实施例中，可于于pH3至9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的条件下进行第二发酵培养。
在本发明的一实施例中，其中进行第一发酵培养的时间小于或等于24小时。
在本发明的一实施例中，上述的第一培养基可包括0.1％至6％的氮源以及1％至9％的碳源。
在本发明的一实施例中，上述的碳源例如是糖类、有机酸或其组合。
在本发明的一实施例中，上述的糖类例如是葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、淀粉、木质素、半纤维素或纤维素。
在本发明的一实施例中，上述的有机酸例如是苹果酸、延胡索酸或乳酸。
在本发明的一实施例中，上述的氮源例如是蛋白质、黄豆蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、亚硝酸盐、硝酸盐、铵盐、氨水、氨基酸或其组合。
在本发明的一实施例中，琥珀酸的含量例如是10克/升至50克/升。
在本发明的一实施例中，将黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株接种于包括碳源的第一培养基中可包括以下步骤。将黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株接种至第二培养基中。对接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的第二培养基进行种子培养，以得到种菌液。将种菌液接种至所述第一培养基中。
在本发明的一实施例中，上述的进行种子培养的方式例如是将接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的第二培养基于pH3至9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm下培养8至48小时。
在本发明的一实施例中，上述的第二培养基为营养液体(Nutrient Broth；NB)培养基、麦芽抽出物培养基(malt extract agar；MEA)或马铃薯葡萄糖培养基(potatodextrose agar；PDA)。
基于上述，与习知以不耐酸、不耐氧且仅可以葡萄糖作为碳源的菌株和使用其生产琥珀酸的方法相比较，在本发明所提出的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株以及生产琥珀酸的方法中，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株可在弱酸以及有氧环境培养条件下，利用多种碳源产生大量的琥珀酸。
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合所附图式作详细说明如下。
【附图说明】
图1A至图1D为黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的菌落型态图。
图1E至图1N为黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的显微构造图。
图2为依照本发明的一实施例的生产琥珀酸的流程步骤图。
图3为依照本发明的另一实施例的生产琥珀酸的流程步骤图。
图4为实施例1至实施例4的生长曲线图。
图5为实施例1至实施例4的培养时间对应琥珀酸产量的关系图。
图6为实验例5至实验例8的生长曲线图。
图7为实验例5至实验例8的培养时间对应琥珀酸产量的关系图。
图8为实验例5至实验例8的培养时间对应XYP培养基中的木糖含量的关系图。
图9为实验例9的培养时间对应OD600值、琥珀酸产量及木糖消耗量的关系图。
图10为实验例10的培养时间对应OD600值、琥珀酸产量及木糖消耗量的关系图。
【具体实施方式】
本发明的第一实施例提供一种黑酵母菌(black yeast)出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其是以pH值为3之平板培养基作为分离培养基，由土壤以及污泥样品中所筛选获得。所获得的出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株经培养后可利用碳源生产琥珀酸。
以下将详细说明本发明的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的筛选流程及鉴定结果。
[菌株的筛选]
本发明的出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株是分离自土壤以及污泥。具体来说，出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的筛选流程包括以下步骤。
首先，将土壤以及污泥样品涂布至pH值为3的营养液体(Nutrient Broth；NB)平板培养基(作为分离培养基)，以分离出多个耐酸性的第一分离株。
接着，将该些耐酸性的第一分离株分别于NB平板培养基上培养1-2天后，以无菌接种环刮取约1μL菌体，接种至5mL NB液体培养基中，于30℃以及100rpm的条件下培养1天，以得到种菌液。
然后，吸取50μL的种菌液，分别接种至葡萄糖培养基(含有3％葡萄糖、0.5％酵母萃取物以及0.5％消化蛋白，后文中简称为HG培养基)以及木糖培养基(含有3％木糖、0.5％酵母萃取物以及0.5％消化蛋白，后文中简称为XYP培养基)中，使得接种量为1％，并于30℃、100rpm以及有氧环境的条件下培养3天，以进行摇瓶发酵培养。而后，利用高效液相层析(high performance liquid chromatography；HPLC)法分析发酵液中琥珀酸的含量。藉此，筛选出多个以葡萄糖或木糖为碳源且在有氧环境下具有高琥珀酸产量(大于10克/升)的第二分离株。
之后，将该些第二分离株分别于NB平板培养基上培养1-2天后，以无菌接种环刮取约1μL菌体，接种至5mL NB液体培养基中，于30℃以及80rpm的条件下培养1天，以得到种菌液。
然后，吸取50μL的种菌液，分别接种于不同pH值(pH值分别为3、5以及7)的木糖液体培养基(XYP，5mL)中，于30℃、80rpm以及有氧环境的条件下培养3天，以进行摇瓶发酵培养。而后，利用高效液相层析法分析发酵液中琥珀酸的含量。藉此，筛选出在pH值为3的条件下(相对于pH值为5与pH值为7的条件下)具有最大琥珀酸产量的第三分离株。
[菌株的鉴定]
型态观察
图1A至图1D为黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的菌落型态图。图1E至图1N为黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的显微构造图。
将上述所筛选的第三分离株接种于麦芽抽出物培养基及马铃薯葡萄糖培养基中，经培养后进行型态观察。在25℃下于MEA培养7天后，菌落正面平滑且黏稠，其中心呈现粘液状。菌落中心呈现橄榄棕色至黑色，而菌落周围呈现黄白色至黄色(如图1A所示)。菌落背面中心呈现橄榄灰色至橄榄色，而菌落背面周围呈现黄白色至灰黄色(如图1B所示)。
在25℃下于PDA培养7天后，菌落正面平滑且黏稠。菌落的颜色呈现黄白色至棕黄色，部分呈现橄榄棕色(如图1C所示)。菌落背面呈现黄白色至灰黄色，部分呈现橄榄棕色(如图1D所示)。
在光学显微镜观察下，具有透明及褐色至黑褐色菌丝(如图1M所示，比例尺为10μm)。其中，褐色菌丝具横隔及厚壁，其直径为4.1μm至8.0μm。透明菌丝平滑且具横隔及薄壁，其直径为1.8μm至8.1μm。随着培养时间增长，菌丝会逐渐增厚变黑，可见黑褐色厚壁孢子(chlamydospore)产生，形状为球形至不规则(如图1N所示，比例尺为10μm)。产孢细胞(coindiogenous cell)未分化，位于透明菌丝中间或末端，具有小齿(dentile)(如图1E至图1N所示，比例尺为10μm)。具有透明及黑褐色分生孢子(conidia)，其中透明分生孢子外壁平滑，形状及大小变化大，常见侧生出芽生殖，大小为4.2μm-13.2μm×3.3μm-7.2μm(如图1I至图1J所示，比例尺为10μm)。黑褐色分生孢子具厚壁及具有0-2个横隔，其中无横隔分生孢子的大小为7.1μm-16.5μm×6.2μm-9.1μm。具有横隔分生孢子的大小为11.0μm-20.4μm×8.0μm-10.1μm(如图1K至图1L所示，比例尺为10μm)。
LSU D1/D2片段及rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段序列分析
首先，利用聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction；PCR)来扩增第三分离株的LSU D1/D2片段(具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列)及rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段(具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列)。所得的SEQ ID NO:1的序列总长为571bp，而所得的SEQ IDNO:2的序列总长为580bp。
将上述所扩增的第三分离株的LSU D1/D2片段及rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段与NCBI GenBank资料库进行比对。比对的结果显示，LSU D1/D2片段与Aureobasidiummelanogenum CBS 105.22T(FJ150926)的相似度为99.82％。rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段与Aureobasidium melanogenum CBS 105.22T(FJ150886)的相似度为98.34％。
依据上述对第三分离株的型态观察以及LSU D1/D2片段及rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段的序列分析结果，鉴定第三分离株为本发明的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株。
在本实施例中，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株包括下列生化性质：
(1)可利用糖类、有机酸或其组合作为碳源来生产琥珀酸。糖类例如是单糖、双糖或多糖。单糖例如是葡萄糖、木糖、果糖或半乳糖。双糖例如是蔗糖。多糖例如是淀粉、木质素、半纤维素或纤维素。有机酸例如是苹果酸、延胡索酸或乳酸。
(2)可在pH值为3至9的环境下生长。
(3)可在有氧的环境下生长。
本发明的第二实施例提供一种突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株。具体来说，此突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株衍生自上述第一实施例所述的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株。
以下将详细说明获得本发明的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株的详细步骤。
首先，提供上述第一实施例的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株以作为母株。接着，依序使用10％的甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate；EMS)以及能量为0.1焦耳的紫外光对潜力菌株进行化学诱变以及紫外线诱变，以诱导突变株产生。然后，对上述所获得的突变株于有氧环境下进行摇瓶振荡发酵培养，筛选琥珀酸高产株，以得到本发明的具有高琥珀酸产量的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株。
上述所获得的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株已于2016年12月13日寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，寄存编号为CCTCC M 2016746。
在本实施例中，突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株包括下列生化性质：
(1)可利用糖类、有机酸或其组合为碳源来生产琥珀酸。糖类例如是单糖、双糖或多糖。单糖例如是葡萄糖、木糖、果糖或半乳糖。双糖例如是蔗糖。多糖例如是淀粉或纤维素。有机酸例如是苹果酸、延胡索酸或乳酸。
(2)可在pH值为3至9的环境下生长。
(3)可在有氧的环境下生长。
图2为依照本发明之一实施例的一种生产琥珀酸的流程步骤图。
请参考图2，并提供生产琥珀酸步骤的详细叙述如下。
首先，执行步骤S100：将黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株接种于包括碳源的第一培养基中。在本实施例中，步骤S100可进一步包括子步骤S102、S104、S106。在本实施例中，执行子步骤S102：将黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株接种至第二培养基中。在本实施例中，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株包括上述第一实施例或第二实施例中的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株中的至少一者。第二培养基例如是NB液体培养基。
接着，执行子步骤S104：对接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株的第二培养基进行种子培养，以得到种菌液。具体来说，进行种子培养的方式例如是将接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的第二培养基于20℃至40℃以及0rpm至500rpm的条件下培养8小时至48小时，以得到种菌液。
然后，执行子步骤S106：将种菌液接种至第一培养基中。在本实施例中，按体积比计算，种菌液的接种量例如是0.1％至10％。第一培养基包括0.1％至6％的氮源以及1％至9％的碳源。碳源例如是糖类、有机酸或其组合。糖类例如是单糖、双糖或多糖。单糖例如是葡萄糖、木糖、果糖或半乳糖。双糖例如是蔗糖。多糖例如是淀粉、木质素、半纤维素或纤维素。有机酸例如是苹果酸、延胡索酸或乳酸。黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株可利用第一培养基中的碳源来生产琥珀酸。氮源例如是蛋白质、黄豆蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、亚硝酸盐、硝酸盐、铵盐、氨水、氨基酸或其组合。在本实施例中，第一培养基的氮源例如是0.1％至3％的消化蛋白以及0.1％至3％的酵母萃取物。第一培养基的pH值例如是3至9。在一较佳实施例中，第一培养基的pH值例如是3至6.5。
之后，执行步骤S110：培养接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株的第一培养基，以得到含有琥珀酸的所述第一培养基，其中黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株利用碳源生产琥珀酸。在本实施例中，例如是于20℃至40℃、0rpm至500rpm以及有氧环境下培养接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株的第一培养基。在进行培养过程中，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株会利用第一培养基中的碳源来产生琥珀酸。
除了在上述条件下进行培养外，更可在通空气的条件下进行培养。具体来说，例如是于通入空气量为0.1vvm至2vvm的条件下培养接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株的第一培养基。在上述通气量的范围内进行培养，有助于黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株产生高量的琥珀酸。至此，即完成了琥珀酸的生产。琥珀酸含量的例如是5克/升至50克/升。
在执行步骤S110之后，可进一步将含有琥珀酸的第一培养基进行纯化，以得到具有高纯度的琥珀酸。
图3为依照本发明的另一实施例的生产琥珀酸的流程步骤图。在此必须说明的是，下述实施例沿用前述实施例的部份流程步骤，并在执行步骤S100后进行后续的步骤。因此，下述实施例将沿用前述实施例的部分内容，并且省略了相同技术内容的说明。关于省略部分的说明可参考前述实施例，下述实施例不再重复赘述。
在执行步骤S100之后，执行步骤S120：培养接种有黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的第一培养基，以得到含有琥珀酸的所述第一培养基，其中黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株利用碳源生产琥珀酸。在本实施例中，执行步骤S120的方式例如是二阶段发酵法：首先，在通空气的条件下进行第一阶段发酵培养，以快速增加提高菌株密度；接着，在停止通气的条件下进行第二阶段发酵培养，以产生大量的琥珀酸。
步骤S120可进一步包括子步骤S122、S124。执行子步骤S122：于通气条件下进行第一发酵培养，使得菌株达到生长对数期，例如是生长对数期的前期或中期。具体来说，于通气条件例如是通入空气量为0.1vvm至2vvm的条件下进行第一发酵培养。在本实施例中，可于pH3至9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的条件下进行第一发酵培养。在一较佳实施例中，可于pH3至6.5、20℃至40℃以及50rpm至500rpm的条件下进行第一发酵培养。在进行第一发酵培养的过程中，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株会快速生长，以提高第一培养基中的菌株密度。在本实施例中，进行第一发酵培养的时间例如是小于或等于24小时。更具体来说，藉由进行第一发酵培养，使得菌株生长达到生长对数期的中期。
接着，执行子步骤124：于停止通入空气的条件下进行第二发酵培养。在本实施例中，例如是于pH3至9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的条件下进行第二发酵培养。在一较佳实施例中，可于pH3至6.5、20℃至40℃以及50rpm至200rpm的条件下进行第一发酵培养。在进行第二发酵培养过程中，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的生长会趋缓，且会大量利用碳源来产生琥珀酸。至此，即完成了琥珀酸的生产。琥珀酸含量的例如是10克/升至50克/升。在本实施例中，碳源例如是木糖。
在执行步骤S120之后，可进一步将含有琥珀酸的第一培养基进行纯化，以得到具有高纯度的琥珀酸。
以下将以实验例具体说明本发明，但实验例之参数与其数据结果仅是用来说明本发明的功效，而并非是用以限定本发明之范围。
实施例
[氮源含量及供氧对菌株生长与琥珀酸生产的影响]
实验例1
首先，将黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株接种于含有100mLNB培养基的250mL摇瓶中，于30℃、80rpm下培养1天，以得到种菌液。在本实验例中，是使用第一实施例中的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株。接着，按体积比将种菌液以1％的接种量接种至含50mL的高氮培养基(含有3％木糖、1％酵母萃取物以及1％消化蛋白)的250mL摇瓶中，于30℃、80rpm、弱酸(PH值小于5.8)下进行震荡培养3天，并于培养24小时、48小时及66小时后，取样分析OD600值及琥珀酸含量。在本实验例中，以震荡培养提供高氧环境。
实验例2
使用与实验例1类似的方法来培养黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株，其差别只在于以静置培养取代震荡培养。在本实验例中，以静置培养提供低氧环境。
实验例3
使用与实验例1类似的方法来培养黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株，其差别只在于以低氮培养基(含有3％木糖、0.1％酵母萃取物以及0.1％消化蛋白)取代高氮培养基。
实验例4
使用与实验例1类似的方法来培养黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株，其差别只在于以低氮培养基取代高氮培养基以及以静置培养取代震荡培养。
图4为实施例1至实施例4的生长曲线图。图5为实施例1至实施例4的培养时间对应琥珀酸产量的关系图。
请参照图4，无论是使用高氮培养基或低氮培养基来进行培养，菌株在高氧环境下(即震荡培养)生长较佳，且在震荡培养48小时后，菌株OD600值达最高。也就是说，在高氧环境下有助于黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株生长。
此外，请参照图5，无论是在高氧环境(震荡培养)或低氧环境(静置培养)下进行培养，菌株于高氮培养基中培养可生产较高量的琥珀酸。也就是说，高氮培养基有助于黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株生产琥珀酸。另外，当黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株于高氮培养基中进行震荡培养(即实施例1)48小时时，可产生最大量的琥珀酸。
[搅拌转速及通气量对菌株生长、琥珀酸生产及木糖消耗量的影响]
实验例5
首先，将黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株接种于含有100mLNB培养基的250mL摇瓶中，于30℃、80rpm下培养1天，以得到种菌液(OD600值＝0.8-0.9)。在本实验例中，是使用第一实施例中的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株。接着，按体积比将种菌液以1％的接种量接种至含3L的XYP培养基(含有3％木糖、1％酵母萃取物以及1％消化蛋白)的5L搅拌式发酵槽中，于30℃、300rpm、1vvm、弱酸(PH值小于5.8)下进行发酵培养，并于培养0、16、24、40、48及65小时后，取样分析OD600值、琥珀酸含量及XYP培养基中的木糖含量。
实验例6
使用与实验例5类似的方法来培养黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株，其差别只在于搅拌转速为100rpm。
实验例7
使用与实验例5类似的方法来培养黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株，其差别只在于搅拌转速为100rpm以及通气量为0.33vvm。
实验例8
使用与实验例5类似的方法来培养黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株，其差别只在于搅拌转速为50rpm以及通气量为0.33vvm。
图6为实验例5至实验例8的生长曲线图。图7为实验例5至实验例8的培养时间对应琥珀酸产量的关系图。图8为实验例5至实验例8的培养时间对应XYP培养基中的木糖含量的关系图。
请参照图6，在相同的通气量下，搅拌转速越高，菌株生长较佳。而在相同搅拌转速下，通气量越高，菌株生长较佳。也就是说，提高供氧可有助于黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株生长。此外，由图6的结果也可以看出，在搅拌转速300rpm及通气量1vvm的条件下，最有利黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株生长。
请参照图7，在实验例5中，在进行发酵培养24小时会有最高的琥珀酸含量，但在进行发酵培养24小时后，琥珀酸的含量会快速下降，也就是说，在进行发酵培养24小时后，琥珀酸会被快速消耗。而在实验例5至实验例8中，实验例6具有最高的琥珀酸产量，且在进行发酵培养65小时时，琥珀酸的含量达8克/升。此外，由图8的结果可知，在进行发酵培养16小时的过程中，实验例5至实验例8中的XYP培养基中的木糖含量仍保持高含量，也就是说，在进行发酵培养16小时的过程中，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株并不太使用木糖，而是利用其他碳源。而在进行发酵培养16小时后(即菌株生长减缓及琥珀酸开始明显产生时)，实验例5至实验例8中的XYP培养基中的木糖含量开始下降。也就是说，在进行发酵培养16小时后，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株才会大量利用木糖来生产琥珀酸。此外，实验例5中的菌株由于在高搅拌转速及高通气量下会生长快速(如图6所示)，也就是说，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株需要较多的碳源来提供生长所需的能量，因此黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株除了会使用XYP培养基中的木糖，也会消耗所产生的琥珀酸。
[二阶段发酵对菌株生长、琥珀酸生产及木糖消耗量的影响]
实验例9
首先，将黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株接种于含有100mLNB培养基的250mL摇瓶中，于30℃、80rpm下培养1天，以得到种菌液(OD600值＝0.8-0.9)。在本实验例中，是使用第一实施例中的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株。接着，按体积比将种菌液以1％的接种量接种至含3L的XYP培养基(含有3％木糖、1％酵母萃取物以及1％消化蛋白)的5L搅拌式发酵槽中。然后，于30℃、300rpm、1vvm、弱酸(pH值小于5.8)下发酵培养24小时(第一阶段)。之后，停止通气，并于30℃、300rpm以及弱酸(pH值小于5.8)的条件下进行发酵培养(第二阶段)。于不同培养时间点(0、16、24、40、48及65小时)取样分析OD600值、琥珀酸含量及XYP培养基中木糖的消耗量。
实验例10
使用与实验例5类似的方法来培养黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株，其差别只在于是使用第二实施例中的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株。
图9为实验例9的培养时间对应OD600值、琥珀酸产量及木糖消耗量的关系图。图10为实验例10的培养时间对应OD600值、琥珀酸产量及木糖消耗量的关系图。
请参照图9，在进行发酵培养24小时时(第一阶段)，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的密度达到最高。而后，由于在停止通气下进行发酵培养(第二阶段)，因此黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的生长速度开始趋缓。此外，由图9的结果也可看出，在进行第二阶段发酵培养过程中，XYP培养基中的木糖消耗量以及琥珀酸含量明显随培养时间增长而增加。也就是说，在进行第二阶段发酵培养过程中，由于黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的生长趋缓，因此黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株可减少利用木糖来提供生长时所需要的碳源，而可利用木糖来生产较高量的琥珀酸。在本实验例中，琥珀酸的产量可提高至13.9克/升。
请参照图10，在进行发酵培养24小时时(第一阶段)，突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的密度达到最高。而后，由于在停止通气下进行发酵培养(第二阶段)，因此突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的生长速度开始趋缓。此外，由图10的结果也可看出，在进行第二阶段发酵培养过程中，XYP培养基中的木糖消耗量以及琥珀酸含量明显随培养时间增长而增加。也就是说，在进行第二阶段发酵培养过程中，由于突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的生长趋缓，因此突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株可减少利用木糖来提供生长时所需要的碳源，而可利用木糖来生产较高量的琥珀酸。在本实验例中，琥珀酸的产量可提高至17.7克/升。
综上所述，与习知以不耐酸、不耐氧且仅可以葡萄糖作为碳源的菌株和使用其生产琥珀酸的方法相比较，在本发明所提出的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株以及生产琥珀酸的方法中，黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株可在弱酸以及有氧环境培养条件下，利用多种碳源产生大量的琥珀酸。
虽然本发明已以实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，故本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
<110> 胡育诚
长春人造树脂厂股份有限公司
长春石油化学股份有限公司
<120> 黑酵母菌出芽短梗霉菌株及使用其生产琥珀酸的方法
<160> 2
<210> 1
<211> 571
<212> DNA
<213> Aureobasidium melanogenum
<400> 1
aaaccaacag ggattgccct agtaacggcg agtgaagcgg caacagctca aatttgaaag 60
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<210> 2
<211> 580
<212> DNA
<213> Aureobasidium melanogenum
<400> 2
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Claims (31)

1.一种经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其特征在于，其会利用碳源生产琥珀酸。
2.如权利要求1所述的经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其中所述碳源为糖类、有机酸或其组合。
3.如权利要求2所述的经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其中所述糖类包括葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、淀粉、木质素、半纤维素、纤维素或其组合。
4.如权利要求2所述的经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其中所述有机酸包括苹果酸、延胡索酸、乳酸或其组合。
5.如权利要求1所述的经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其在pH值为3至9的环境下生长。
6.如权利要求1所述的经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其在有氧的环境下生长。
7.一种突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其寄存于中国典型培养物保藏中心，寄存编号为CCTCC M 2016746。
8.如权利要求7所述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其会利用碳源生产琥珀酸。
9.如权利要求8所述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其中所述碳源为糖类、有机酸或其组合。
10.如权利要求9所述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其中所述糖类包括葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、淀粉、木质素、半纤维素、纤维素或其组合。
11.如权利要求9所述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其中所述有机酸包括苹果酸、延胡索酸、乳酸或其组合。
12.如权利要求7所述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其衍生自权利要求1所述的经培养的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株。
13.如权利要求7所述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其在pH值为3至9的环境下生长。
14.如权利要求7所述的突变型黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株，其在有氧的环境下生长。
15.一种生产琥珀酸的方法，其特征在于，包括：
将如权利要求1至14中任一项所述的黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株接种于包括碳源的第一培养基中；以及
培养接种有所述黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的所述第一培养基，以得到含有琥珀酸的所述第一培养基，其中所述黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidiummelanogenum菌株利用所述碳源生产琥珀酸。
16.如权利要求15所述的生产琥珀酸的方法，于pH3至pH9、20℃至40℃、0rpm至500rpm以及有氧环境的条件下培养接种有所述黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的所述第一培养基。
17.如权利要求16所述的生产琥珀酸的方法，更包括于通入空气量为0.1vvm至2vvm的条件下培养接种有所述黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的所述第一培养基。
18.如权利要求15所述的生产琥珀酸的方法，其中培养接种有所述黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的所述第一培养基的步骤包括：
于通气条件下进行第一发酵培养，使得所述菌株达到生长对数期；以及
于停止通气的条件下进行第二发酵培养。
19.如权利要求18所述的生产琥珀酸的方法，所述通气条件为通入空气量为0.1vvm至2vvm。
20.如权利要求18所述的生产琥珀酸的方法，于pH3至pH9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的条件下进行所述第一发酵培养。
21.如权利要求18所述的生产琥珀酸的方法，于pH3至pH9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的条件下进行所述第二发酵培养。
22.如权利要求18所述的生产琥珀酸的方法，其中进行所述第一发酵培养的时间小于或等于24小时。
23.如权利要求15所述的生产琥珀酸的方法，其中所述第一培养基包括：
0.1％至6％的氮源；以及
0.1％至9％的所述碳源。
24.如权利要求15所述的生产琥珀酸的方法，其中所述碳源包括糖类、有机酸或其组合。
25.如权利要求24所述的生产琥珀酸的方法，其中所述糖类包括葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、半乳糖、淀粉、木质素、半纤维素、纤维素或其组合。
26.如权利要求24所述的生产琥珀酸的方法，其中所述有机酸包括苹果酸、延胡索酸、乳酸或其组合。
27.如权利要求23所述的生产琥珀酸的方法，其中所述氮源包括蛋白质、黄豆蛋白、消化蛋白、酵母萃取物、亚硝酸盐、硝酸盐、铵盐、氨水、氨基酸或其组合。
28.如权利要求15所述的生产琥珀酸的方法，其中琥珀酸的含量为5克/升至50克/升。
29.如权利要求15所述的生产琥珀酸的方法，其中将所述黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株接种于包括所述碳源的所述第一培养基中的步骤包括：
将所述黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株接种至第二培养基中；
对接种有所述黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的所述第二培养基进行种子培养，以得到种菌液；以及
将所述种菌液接种至所述第一培养基中。
30.如权利要求29所述的生产琥珀酸的方法，其中进行所述种子培养的方式包括将接种有所述黑酵母菌出芽短梗霉Aureobasidium melanogenum菌株的所述第二培养基于pH3至pH9、20℃至40℃以及0rpm至500rpm的条件下培养8小时至48小时。
31.如权利要求29所述的生产琥珀酸的方法，其中所述第二培养基为营养液体培养基、麦芽抽出物培养基或马铃薯葡萄糖培养基。
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