CN115093977A - 产富马酸的普鲁兰短梗霉菌株ep01及使用方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一株普鲁兰短梗霉菌株EP01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2022999，保藏日期为2022年6月30日。所述的普鲁兰短梗霉菌株EP01能在胞外积累大量富马酸，且纯度较高，可制成各种富马酸衍生物进行相关应用。同时，该菌株在培养过程中始终保持酵母状单细胞形态，不会因为溶解氧限制而影响发酵进程；且遗传背景相对清晰，易于通过基因编辑来实现代谢途径改造。基于此，本申请提供了普鲁兰短梗霉菌株EP01的基因经遗传改造后获得的富马酸高产基因工程菌株Y08。所述工程菌株Y08无副产物，产物中富马酸纯度达到99.4%；且在优化后的发酵培养基分批发酵的产物中富马酸的浓度可达70.45 g/L，显著提高了合成富马酸的能力，具有重要的产业化应用价值。

Description

产富马酸的普鲁兰短梗霉菌株EP01及使用方法

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及一株普鲁兰短梗霉菌株(Aureobasidium pullulansvar. aubasidani)及使用方法。

背景技术

富马酸是一种重要的基本化工原料和精细化工产品，广泛用于涂料、树脂、医药和增塑剂等领域。富马酸不但可以作为起始原料，合成琥珀酸和苹果酸等有机酸；还可以用于生产不饱和聚酯树脂和增塑剂等材料，从而广泛应用于工业生产。此外，富马酸可以作为酸味剂被添加到果汁饮料中；富马酸衍生药物被广泛应用于治疗多种皮肤病和神经疾病。因此，富马酸及其衍生物的需求日益增加。目前，富马酸的生产主要有石化合成法、酶催化法和微生物发酵法三种途径。其中，工业上主要通过石化合成法来获得富马酸。这种方法依赖于石油原料且催化毒性大，容易造成严重的环境污染。酶催化法采用的马来酸异构酶对热不稳定，因此也不能作为生产富马酸的成熟手段。与前两种方法相比，利用微生物发酵生产富马酸的方法具备反应条件温和易控制、原料来源丰富、绿色无污染等优势，因而得到了广泛的关注。

微生物发酵制备富马酸的方法，目前常用的菌种均为根霉属真菌(Rhizopusspp.)，包括米根霉、少根霉、无根根霉以及黑根霉。其中米根霉(Rhizopus oryzae)被认为是目前生产富马酸的优势菌株。Tsao教授等报道了利用米根霉发酵产富马酸的方法(ApplEnviron Microbiol， 1996，62：2926～2931)；通过对米根霉合成富马酸代谢途径分析发现，葡萄糖通过糖酵解过程生成丙酮酸，丙酮酸在经TCA和反TCA途径生成富马酸的同时，还可在乳酸脱氢酶(LDH) 的作用下生成乳酸，而乳酸途径的存在大大削弱了富马酸的积累能力。

为了解决这一问题，研究人员尝试通过菌株诱变手段筛选乳酸缺陷型菌株，但一直未能获得遗传稳定的低产乳酸米根霉菌株。这导致米根霉在常规培养一段时间后，乳酸在产物积累中渐渐起到主导作用，从而使得米根霉积累乳酸的能力逐步提高，进而严重影响了富马酸的合成。除此之外，根霉还具有以下不足：(1)在发酵过程中呈现出丝状形态，缠绕在发酵罐内部，从而造成严重的溶解氧限制，不利于富马酸的生产。(2)根霉的遗传背景不清晰，难以通过遗传改造的方式进行性能的提升。

发明内容

基于现有技术中微生物发酵制备富马酸的现状，本申请提供了一株普鲁兰短梗霉菌株 EP01(Aureobasidium pullulans var.aubasidani)。所述的普鲁兰短梗霉菌株EP01能在胞外积累大量富马酸，且纯度较高，可制成各种富马酸衍生物进行相关应用。此外，本申请还提供了普鲁兰短梗霉菌株EP01的基因经遗传改造后获得的富马酸高产基因工程菌株Y08，为微生物发酵生产富马酸提供新的路径。

本发明的技术方案：

一株产富马酸的普鲁兰短梗霉菌株(Aureobasidium pullulansvar.aubasidani)，所述普鲁兰短梗霉菌株命名为普鲁兰短梗霉EP01菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2022999，保藏日期为2022年6月30日，保藏地址为中国武汉武汉大学。发明人研究发现，普鲁兰短梗霉菌株EP01 能够在添加碳酸钙和高浓度葡萄糖的培养基中过量合成并分泌富马酸；同时，该菌株在培养过程中始终保持酵母状单细胞形态，不会因为溶解氧限制而影响发酵进程，克服了现有技术中米根霉菌容易造成溶解氧限制的问题。此外，普鲁兰短梗霉EP01菌株的遗传背景相对清晰，易于通过基因编辑来实现代谢途径改造。

一种包含如前所述的普鲁兰短梗霉EP01菌株的菌剂。

所述的普鲁兰短梗霉EP01菌株的活化方法，将菌株接种到YPD固体培养基中，在28℃的温度条件下培养1-2天。其中，所述YPD固体培养基的配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，琼脂20g/L。

如前所述的普鲁兰短梗霉EP01菌株的应用，将其用于发酵生产富马酸。

提高富马酸产量与纯度的普鲁兰短梗霉基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：(1) 利用Cre-loxP系统构建葡萄糖氧化酶GOX基因的敲除载体和PYC基因的表达载体。(2)采用前述敲除载体，通过电击转化敲除菌株中的葡萄糖氧化酶GOX基因，并过量表达PYC基因，即得到提高富马酸产量且富马酸纯度为99.4％的普鲁兰短梗霉基因工程菌株Y08。

采用前述方法构建的提高富马酸产量与纯度的普鲁兰短梗霉基因工程菌株Y08。经遗传改造后获得的高产富马酸的普鲁兰短梗霉基因工程菌株Y08，为微生物发酵生产富马酸提供了新的路径。

所述的普鲁兰短梗霉基因工程菌株Y08以葡萄糖为底物发酵生产富马酸的应用。具体为： (1)将普鲁兰短梗霉基因工程菌株Y08接入种子培养基中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞。(2)将菌体细胞接入到发酵培养基，发酵完成后，从发酵液中分离得到富马酸。其中，所述的发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L、CaCO₃ 80g/L、KH₂PO₄ 0.3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、ZnSO₄ 0.3g/L。

优选的是，所述应用中采用10升发酵罐分批发酵的方式进行富马酸的发酵生产；具体为：步骤(2)中，每隔12h取样测定生物量、富马酸浓度和剩余葡萄糖浓度，当葡萄糖全部消耗时产物中富马酸的浓度可达70.45g/L。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了可用于微生物发酵制备富马酸的普鲁兰短梗霉菌株EP01，与现有技术中的米根霉菌相比，培养过程中始终保持酵母状单细胞形态，且易于通过基因编辑来实现代谢途径改造，为富马酸的微生物发酵制备提供了新的路径。

(2)在普鲁兰短梗霉菌株EP01的基础上，本发明经遗传改造得到了普鲁兰短梗霉基因工程菌株Y08，所述工程菌株不但显著提高了合成富马酸的能力，且无副产物，产物中富马酸纯度达到99.4％。

(3)通过基因敲除确定了富马酸的过量积累途径为尿素循环，而非根霉中普遍的细胞质途径，为高产富马酸基因工程菌株的改造提供了理论支持。

(4)针对遗传改造后的普鲁兰短梗霉基因工程菌株Y08，本发明提供了在优化后的发酵培养基分批发酵的方法，产物中富马酸的浓度可达70.45g/L，生产强度大，转化率高。

附图说明

图1为实施例1中复筛步骤发酵上清液的HPLC分析与产物浓度测定结果；其中图1A为EP01菌株发酵上清液，图1B为葡萄糖酸标准品，图1C为富马酸标准品，图1D为EP01 菌株产物中葡萄糖酸与富马酸浓度。

图2为实施例2中基于ITS序列的系统发育分析。

图3为野生型菌株EP01与实施例3中的Δgox菌株摇瓶培养时胞外的葡萄糖酸与富马酸的浓度。

图4为实施例4中Δgox菌株摇瓶培养产物的纯度测定；其中图4A为HPLC分析结果，图4B为GC-MS分析结果。

图5为实施例5中不同基因的敲除对富马酸产量的影响。

图6为实施例6中不同培养时间对工程菌株Y08胞外富马酸浓度的影响。

图7为实施例7中Y08菌株10-L发酵罐分批发酵。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：产富马酸菌株的分离与筛选

(1)初筛：

使用灭菌的竹签刮取少量红树林海泥样品，接种到50mL液体YPD培养基中(添加25μg /ml氯霉素)，在28℃，180rpm条件振荡培养3d，此时观察到培养基变浑浊，说明有菌株生长。将上述培养后的菌液用无菌水稀释1000倍，吸取200μL菌液涂布于固体YPD培养基中，将平板放于28℃培养箱中倒置培养2d，观察到平板上出现单菌落，显微镜下观察呈酵母状。使用灭菌的竹签挑取单菌落转接到5mL液体YPD培养基中，28℃，180rpm振荡培养 16h,将筛选得到的菌株编号后使用甘油保种管保种，保藏于-80℃冰箱。

(2)复筛：

将初筛得到的菌株接种于50mL YPD液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养16h后取5mL转接至50mL产富马酸培养基(葡萄糖100g/L、(NH₄)₂SO₄ 1.0g/L、CaCO₃ 40g/L、 KH₂PO₄0.2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、ZnSO₄ 0.2g/L、KCl 0.2g/L)中，28℃和180rpm条件下振荡培养7d。取1mL上述的培养液，5000×g离心5min，取上清液通过HPLC分析测定富马酸浓度(图1)。其中，筛选到的最优菌株EP01的发酵上清液中，其胞外产物中含有 34.20g/L的葡萄糖酸和15.04g/L的富马酸，其中富马酸的纯度为30.54％(图1D)。

实施例2：菌种鉴定

使用PCR扩增的方法扩增菌株基因组ITS rDNA序列，将PCR产物送至青岛擎科生物公司进行测序，将测序结果在NCBI进行在线比对，使用MEGA6软件构建系统进化树。

提取菌株的基因组DNA，利用ITS序列通用引物，进行PCR扩增。引物如表2-1所示：

表1.ITS序列扩增通用PCR引物

PCR反应体系如下：

PCR扩增条件：

整个反应结束后，反应产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。在凝胶成像系统下将目的条带切回，按照上海生工SanPrep柱式试剂盒说明书进行DNA回收、纯化。回收DNA-20℃保存或用于转化链接。将回收产物与PMD19-T克隆载体进行连接，16℃连接过夜，获得目的菌株基因序列PMD19-T重组载体。

连接体系如下：

将连接产物全部转入已制备好的大肠杆菌感受态DH5α中，碎冰浴30min，42℃热激30s，置于冰上。加入650μl已经预热至37℃的LB培养基，37℃震荡培养1h。然后5000rpm离心3min，弃大部分上清，将剩余约150μL上清与沉淀吹打混匀，涂布于含有100mg/mL氨苄青霉素钠(Amp)的LB平板上，37℃正置培养1h后，再倒置培养12-16h。

挑取平板上长势良好的单菌落，37℃培养6h后，用特异引物ITS-F和ITS-R进行阳性克隆的筛选，将连接正确的菌液送至青岛擎科生物公司测序。最后，将目的菌株的cDNA序列进行Blast比对，并构建系统发育进化树，如图2所示。由此确定，菌株种属为普鲁兰短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans var.aubasidani)，将其命名为普鲁兰短梗霉EP01菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2022999，保藏日期为2022年6月30日。

实施例3：敲除葡萄糖氧化酶基因GOX获得没有副产物的富马酸积累菌株

原始普鲁兰短梗霉菌株EP01在摇瓶培养过程中同时积累葡萄糖酸和富马酸，而葡萄糖酸的存在严重阻碍了富马酸的分离纯化。由于葡萄糖氧化酶Gox是葡萄糖酸合成中的关键酶，因此发明人对该蛋白的编码基因进行敲除，以阻断葡萄糖酸的合成。

通过同源重组原理，利用Cre-loxP系统对Aureobasidium pullulansvar.aubasidani菌株进行基因编辑。构建GOX基因的敲除载体，通过电击转化获得GOX基因敲除菌株，并命名为Δgox菌株。测定原始菌株EP01与Δgox菌株积累的富马酸与葡萄糖酸浓度，如图3所示。说明，通过GOX基因的敲除获得了只积累富马酸而没有副产物的菌株。

实施例4：通过HPLC和GC-MS分析测定Δgox菌株产物中的富马酸纯度

将Δgox菌株摇瓶培养上清液用0.22μm水系滤膜过滤后进行HPLC分析。选用的高效液相色谱仪为Agilent1260高效液相色谱仪，色谱分析柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H。流动相为4mM的稀硫酸溶液，流速为0.5mL/min，柱温为50℃。检测器为紫外检测器，检测波长为210nm，进样量为20μL。

同时取1.0mLΔgox菌株摇瓶培养上清液至10mL玻璃瓶中，加入2.5mL 2％(v/v)硫酸/甲醇溶液。压盖密封混匀，80℃水浴1.5h，冷却后加入1.0-2.0mL正己烷萃取富马酸甲酯。吸取上层正己烷相，用0.22μm有机滤膜过滤除杂。将上述样品稀释至合适浓度取1.00 μL进样，采用的气相色谱仪为Agilent 7890A/5975C，色谱柱为Agilent HP-INNOWaxPolyethylene Glyco(30m×50μm×0.25μm)。初始温度为100℃，在10min内以15℃/min 的速率升温到240℃，运行时间为20min。每一个峰引入质谱进行分析，然后将质谱图在数据库中进行比对，得到与每一个峰最接近的分子结构。

HPLC和GC-MS检测结果如图4所示。通过上述HPLC分析和GC-MS分析计算可知，Δgox菌株产物中的富马酸纯度高达99.4％。

实施例5：富马酸过量合成途径的确定

富马酸除了作为TCA循环的中间产物之外，还参与细胞中许多代谢途径。真菌中主要有 5条途径参与了富马酸的生物合成，即TCA循环和乙醛酸循环、细胞质还原途径、氨基酸代谢途径、嘌呤核苷酸合成途径和尿素循环。为了探究实施例3得到的Δgox菌株主要通过哪条途径来积累富马酸，发明人Δgox菌株为出发菌株，分别敲除了上述途径中与富马酸合成相关的11个基因，各重组菌株的富马酸浓度变化如图5所示。

从图6可知，尿素循环中的精氨琥珀酸裂解酶ASL基因和氨甲酰磷酸合成酶CPS1、CPS2L、 CPS2S基因被敲除后，富马酸浓度显著下降，而其他几条途径中的基因敲除对富马酸的浓度变化没有影响。由此可知，Δgox菌株生产富马酸的机理是过量合成途径——即该菌株主要通过尿素循环积累富马酸。具体为：葡萄糖经糖酵解作用生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸，进而通过转氨基作用生成天冬氨酸。天冬氨酸作为精氨琥珀酸合成酶的底物进入尿素循环，被转化为精氨琥珀酸。精氨琥珀酸裂解为富马酸和精氨酸，其中，精氨酸继续参与尿素循环，而细胞质中积累的富马酸则被运输到细胞外。与根霉主要通过细胞质还原途径积累富马酸的过量合成途径不同，短梗霉菌株通过尿素循环过量合成富马酸。该发现为后续代谢途径改造提供理论指导，同时为富马酸的生物合成提供新的策略。

综上可知，本申请所述的短梗霉菌株发酵培养富马酸，提供了一种不同于霉菌的路径，对于理论研究和产业应用都具有重要的意义。

实施例6：过表达丙酮酸羧化酶PYC基因提高富马酸浓度

丙酮酸羧化酶PYC催化细胞质中的丙酮酸转化为草酰乙酸，而草酰乙酸不仅作为TCA 循环的补充物质，也是尿素循环中的重要氨基供体天冬氨酸的前体物质。因此，通过增强细胞质中的草酰乙酸供应，可以为尿素循环提供充足的氨基来源，进而促进富马酸的进一步积累。根据同源重组原理构建PYC基因的表达载体，通过电击转化获得过表达菌株，并命名为普鲁兰短梗霉工程菌株Y08。同时，将产富马酸培养基组成进行优化，得到最佳培养基组成为葡萄糖120g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L、CaCO₃ 80g/L、KH₂PO₄ 0.3g/L、MgSO₄·7H₂O0.3g/L、 ZnSO₄ 0.3g/L。将Y08菌株在优化后的产富马酸培养基中摇瓶培养168h时，葡萄糖消耗完毕，胞外富马酸浓度达到66.11g/L，结果如图6所示。

实施例7：Y08菌株的发酵罐分批发酵

使用10-L发酵罐(BIOQ-6005-6010B，上海汇和堂生物工程设备有限公司)进行分批发酵。将Y08菌株活化于YPD平板上，28℃培养48h后挑取多个菌落接种于800mL YPD液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养24h。取700mL种子液(细胞浓度为1.0×10⁸cells/mL) 接种到6.3L优化后的发酵培养基中，发酵罐培养。发酵温度为28℃，转速为400rpm，通气量为300L/h，每隔12h取样测定生物量、富马酸钙浓度和剩余葡萄糖浓度，当葡萄糖全部消耗完毕时，发酵168h时富马酸浓度达到70.45g/L(如图7所示)。与实施例6的摇瓶培养相比，发酵罐培养的产量更高。这是由于，由于发酵罐具备更优的通气和搅拌效果。由此可知，本申请所述的普鲁兰短梗霉基因工程菌株Y08，与原始的普鲁兰短梗霉EP01菌株相比，不但消除了副产物，将富马酸纯度的提升至99.4％，而且产量也达到野生菌株的4倍有余，得到了显著的提升。

综上可知，本发明提供了合成路径不同于现有技术、且易于基因编辑的普鲁兰短梗霉菌株EP01，并在理论研究的基础上对其进行遗传改造，不但显著提高了其合成富马酸的能力，而且富马酸纯度达到99.4％，这对于产业化应用具有重要的意义。

Claims (10)

1.一株产富马酸的普鲁兰短梗霉菌株，其特征在于：所述普鲁兰短梗霉菌株命名为普鲁兰短梗霉EP01菌株（Aureobasidium pullulans var. aubasidani），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2022999，保藏日期为2022年6月30日。

2.如权利要求1所述的产富马酸的普鲁兰短梗霉菌株的活化方法，其特征在于：将权利要求1所述的菌株接种到YPD固体培养基中，在28-30℃的温度条件下培养1-2天。

3.一种包含权利要求 1 所述的普鲁兰短梗霉菌株的菌剂。

4.如权利要求1所述的普鲁兰短梗霉菌株的应用，其特征在于：将所述的普鲁兰短梗霉菌株用于发酵生产富马酸。

5.提高富马酸产量的普鲁兰短梗霉基因工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤 ：

（1）利用Cre-loxP系统构建葡萄糖氧化酶GOX基因的敲除载体和PYC基因的表达载体；

（2）采用前述敲除载体，通过电击转化敲除菌株中的葡萄糖氧化酶GOX基因，并过量表达PYC基因，即得到提高富马酸产量的普鲁兰短梗霉基因工程菌株Y08。

6.采用权利要求 5所述的方法构建的提高富马酸产量的普鲁兰短梗霉基因工程菌株。

7.如权利要求6所述的普鲁兰短梗霉基因工程菌株以葡萄糖为底物发酵生产富马酸的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将权利要求6所述的普鲁兰短梗霉菌株接入种子培养基中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞；将菌体细胞接入到发酵培养基，发酵完成后，从发酵液中分离得到富马酸。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的发酵培养基组成为：葡萄糖120 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.0 g/L、CaCO₃ 80 g/L、KH₂PO₄ 0.3 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3 g/L、ZnSO₄ 0.3 g/L。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：采用分批发酵的方式进行富马酸的发酵生产。

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