CN116179380A - 一种高产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌wsmhp、构建方法及应用 - Google Patents

一种高产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌wsmhp、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌、构建方法及应用，所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP是将解脂耶氏酵母基因组中草酰乙酸转运蛋白编码基因Oac1p敲除，同时过表达丙酮酸脱羧酶编码基因Pyc2和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶编码基因Pck1。本发明提供的解脂耶罗酵母工程菌WSMHP与出发菌株解脂耶罗酵母出发菌株YW100‑1相比，以甘油为唯一碳源时，丙酮酸产量增加了39.0％，达到168.9g/L，为丙酮酸工业化生产提供了优良菌株。

Description

一种高产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP、构建方法及 应用
(一)技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种解脂耶氏酵母工程菌WSMHP、构建方法和应用。
(二)背景技术
丙酮酸作为微生物代谢途径中的中间体，也是重要的有机酸之一，在生物化工，制药，食品以及科学领域中具有广泛的作用。在医药工业，丙酮酸是一种重要的医药中间体，可用于合成左旋多巴，消炎镇痛药辛可芬，抗结核药异烟肼丙酮酸钙，噻咪唑药物等，此外，丙酮酸盐类(如丙酮酸钙，丙酮酸钾，丙酮酸肌酸盐等)广泛应用于减肥保健品药类。在食品行业，丙酮酸作为食品添加剂，具有天然的防腐和保鲜功效。在化工行业，丙酮酸乙酯作为皮肤美白剂，可以抑制皮肤中的黑色素的形成，具有很好的皮肤美白功效。此外，丙酮酸作为新一代的生物燃料的前体，国内外市场需求迅速增长，具有广阔的应用价值。
目前丙酮酸生产的方法主要有化学合成法，酶转化法，微生物发酵法三大类。化学合成法主要是以酒石酸为原料，化学合成丙酮酸，但该方法污染重，成本高，工业化生产受到了限制。酶转化法主要是利用微生物中的脱氢酶系，将乳酸转化为丙酮酸，但是该方法转化率低，成本高，目前还没有实现工业化生产。微生物发酵法主要是利用微生物，以葡萄糖或者甘油等廉价为碳源，通过微生物发酵，直接生产丙酮酸。目前微生物发酵法使用的菌株有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，大肠杆菌(Escherichia coli)，光滑球拟酵(Torulopsis glabrata)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。与化学合成法和酶转化法相比，具有污染小，转化率高，成本低等优点，也是目前工业化的主要方法。
前期我们发现了解脂耶氏酵母YW100-1具有非常好的丙酮酸生产能力，是由于通过增强甘油-3-磷酸途径和二羟基丙酮途径来强化甘油的分解代谢途径来加速甘油的分解，同时减弱甘油的合成途径。然而，有研究表明丙酮酸的合成过程中会随着ATP的产生，细胞体内高浓度的ATP水平会抑制糖酵解的速率，导致胞内丙酮酸积累量无法进一步提高。因此，如何提高丙酮酸产量成为迫切需要解决的问题。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种高产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP，及其构建方法与应用，本发明通过过量表达丙酮酸脱羧酶(由基因Pyc2编码)和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(由基因Pck1编码)，构建一个ATP消耗循环系统，同时敲除编码草酰乙酸转运蛋白基因Oac1p(YALI0E04048p)，阻止草酰乙酸进入线粒体参与三羧酸循环，从而实现丙酮酸在细胞内的大量积累，为丙酮酸的工业生产提供优良菌株。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种高产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP，所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP是将解脂耶氏酵母基因组中草酰乙酸转运蛋白编码基因Oac1p敲除，同时过表达丙酮酸脱羧酶编码基因Pyc2和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶编码基因Pck1构成的。
优选的，所述草酰乙酸转运蛋白编码基因Oac1p核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述丙酮酸脱羧酶编码基因Pyc2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶编码基因Pck1核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.9
ATGGCCGTTATTCTGGATAAGCAAAAGAAACAGCCACCCAAGCAAATCTCCACTCTCGGCGGATTTGTGGCGGGTGCTATCGCTGCCTGTGGAGCCGTCACAGTCACTAACCCGATCGAGTTGGTGAAGACCCGAATGCAGCTGCAGGGAGAGCTGGCTGCTCGAGGAGAGGCCAAGAAGGTCTACACAAGCCCCCTACAGGCTCTGGTGAAGATCTACAAGTCCGAGGGAATCAAGGGTCTCCAGTCCGGACTCTTCAGTGCATACGTCTATCAGATCGGTCTCAATGGTTGCCGACTGGGCTTGTATGAGCCCACCAGAAAGGTGATTGCCAACGTTTGCAACATTGATCTGAACAAAGAGAACCCCGTTGGTCTCAACGTGGCCTCTGGTGCCATCTCTGGTATCATGGGAGCCGTGGCCGGATCCCCCTTCTACCTGATCAAGACTCGACAGCAGTCTTACTCTCCTGCATTCAAGGTCGGAGCGCAGACCTACTACAAGTCCATCGGCGACGGATTCCGACAGATCTACGGAGCAGAGGGCTTCAAGGGTCTGTACCGAGGAGTTGACGCTGCTATTCTGAGAACTGGTGCTGGATCTTCTGTCCAGCTCCCCATCTATAACTGGGCCAAGGAGCTTCTGCTCAAGCACCACATCACCGATCCCGGAGCCTCCACCCATCTGGTTGCATCTGCCATGTCTGGTCTCGGAGTTGCTGTCGTCATGAACCCCTGGGACGTTCTCATGACCCGAATGTACAACCAGAAAGGCAACATGTACAAGAATCCCTTTGACTGTCTGATGAAGACCGTGTCCATCGAGGGACCGTTTGCTCTGTATAAGGGTTTCGGGGCCCATCTACTGCGAATTGCACCCCACACCATTTTGACCCTCATGTTCATGGAACAGACCATGAAGTGGGTCAAGTGGTTTGAGGGCGTTCCCTTTTAA
优选的，所述解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)YW100-1，已在专利申请(公开号：CN110499259A，公开日2019年11月26日)中公开。
优选的，所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP按如下步骤构建：
(1)将质粒pCRISPRyl的原有营养缺陷型标记基因Leu替换成潮霉素抗性基因HPH，得到CRISPR-HPH质粒；
(2)根据靶标基因Oac1p(NC_006071.1)设计gRNA序列，将20bp的gRNA序列当作引物的同源臂，以CRISPR-HPH为模板进行全质粒扩增，将gRNA序列插入到SCR1tRNA启动子表达位点，得到CRISPR-HPH-Oac1p gRNA质粒；所述gRNA序列如SEQ ID NO.8所示；
(3)以解脂耶氏酵母YW100-1基因组为模板，分别扩增Oac1p基因上游1kb碱基序列(简称5’oac1p)，启动子pEXP1片段和Oac1p基因下游1kb碱基序列(简称3’oac1p)；以酿酒酵母BY4741基因组作为模板，扩增来源于酿酒酵母BY4741的Pyc2和Pck1基因；以质粒JMP113作为模板扩增启动子Loxp-URA3-loxp-pTEF片段；通过重叠延伸PCR获得5'oac1p-Loxp-URA3-loxp-pTEF-5'Pyc2和3’Pyc2-pEXP1-Pck1-3’Oac1p两个大片段，同Pyc2基因以及CRISPR-HPH-Oac1p gRNA质粒一起电转导入解脂耶氏酵母(优选YW100-1)中，得到同源重组后的解脂耶氏酵母工程菌，记为解脂耶氏酵母工程菌W SMHP。
本发明还提供一种所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP在发酵甘油制备丙酮酸中的应用，所述发酵采用摇瓶发酵的方法为：将解脂耶氏酵母工程菌WSMHP接种于YPD培养基中，于30℃，200rpm培养24h，将培养液以初始菌体浓度OD600＝0.5接种于含50g/L甘油的YNG培养基中，于30℃，200rpm发酵培养至OD600为4.0-5.0(优选4.5)时，获得含丙酮酸的发酵液，分离纯化，获得丙酮酸；YPD液体培养基质量组成：10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，溶剂为去离子水，pH值自然；YNG培养基质量组成：6.7g/L YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的酵母基础氮源)，溶剂为去离子水，用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液调节pH到4.0。
所述发酵采用发酵罐发酵的方法为：将解脂耶氏酵母工程菌WSMHP接种至含60g/L甘油的发酵培养基中，在30-32℃、pH值4-4.5、溶氧量40-50％条件下进行发酵罐发酵，获得含丙酮酸的发酵液，分离纯化，获得丙酮酸；所述发酵培养基组成为：10g/L(NH4)2SO4、1.4g/L MgSO4·7H2O、2g/L KH2PO4、0.8g/L CaCl2、0.5g/L NaCl、1μg/L维生素B1，溶剂为去离子水，pH值自然。
优选的，发酵罐发酵时，甘油采用分批方式加入，首次加入60g/L，当甘油浓度低于20g/L时，分批补加甘油，每次补加40g/L，优选补加2-3次。
进一步，所述发酵罐发酵前，解脂耶氏酵母工程菌WSMHP先进行活化培养和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度10％的接种量接种至发酵培养基，所述活化培养和种子扩大培养为：解脂耶氏酵母工程菌WSMHP接种至YPD液体培养基中，30℃过夜培养，培养液以体积浓度6-7％的接种量转接至含2g/L甘油的种子培养基，30℃摇瓶培养18h，获得种子液；所述种子培养基：0.4g/L胰蛋白胨、酵母提取物0.2g/L、0.24g/L KH2PO4、1.7g/L K2HPO4·3H2O，溶剂为蒸馏水，pH值自然。YPD液体培养基质量组成：10g/L酵母提取物，2g/L葡萄糖，2g/L蛋白胨，溶剂为去离子水，pH值自然。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明提供的解脂耶罗酵母工程菌WSMHP与出发菌株解脂耶罗酵母出发菌株YW100-1相比，以甘油为唯一碳源时，丙酮酸产量增加了39.0％，达到168.9g/L，为丙酮酸工业化生产提供了优良菌株。
(四)附图说明
图1为摇瓶发酵解脂耶氏酵母工程菌WSMHP和出发菌YW100-1的丙酮酸产量和甘油残留量比较。
图2为20L发酵罐发酵培养解脂耶氏酵母工程菌WSMHP和出发菌YW100-1的丙酮酸产量比较。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下列实施例中的方法，如无特殊说明，均为公知方法。
YPD液体培养基质量组成：10g/L酵母提取物，2g/L葡萄糖，2g/L蛋白胨，溶剂为去离子水，pH值自然。
YPD固体培养基是在YPD液体培养基中加入2g/L琼脂。
YNG培养基质量组成：6.7g/L无氨基酵母氮源(YNB，含有硫酸铵、无氨基酸的酵母基础氮源)，溶剂为去离子水，用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液调节pH到4.0。
LB液体培养基质量组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，溶剂为蒸馏水，pH值自然。LB平板是在LB液体培养基中添加2g/L琼脂。
实施例1：高产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP的构建
1、CRISPR-HPH质粒的构建
潮霉素抗性基因(Hph)的扩增：通过设计表1中引物WSM2020067和WSM2020068，以pMS82为模板(购于Addgene；https://www.addgene.org/68110/)，扩增出Hph片段，大小约为1.8kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5
GACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAATCTCGAGTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGTTGAAAAGCTGTGGTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTA。
pCRISPRyl质粒骨架的扩增：通过设计表1中引物WSM2020065和WSM2020066，以pCRISPRyl质粒(购自addgene，https://www.addgene.org/70007/)为模板，扩增出pCRISPRyl质粒骨架片段，大小约为9424bp。
将上述获得的Hph片段和pCRISPRyl质粒骨架片段利用胶回收试剂盒(购自北京宝日医生物有限公司)回收后，采用一步克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，形成环状质粒。
克隆体系：2μL 5×CE MultiS缓冲液，3μL Hph片段，2μL pCRISPRly质粒骨架片段，1μL ExnaseTM MultiS酶，2μL蒸馏水。37℃反应半小时，置于冰上5分钟后取10μL加入到100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入1mL LB液体培养基，200rpm、37℃孵育1小时。离心收集菌液涂在含有100mg/mL氨苄霉素的LB平板上，37℃过夜培养待长出转化子后，用表1中引物YW202009+WSM2020069进行鉴定，PCR筛选出4个阳性单菌落。将阳性克隆接种至LB液体培养基，37℃培养8h，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明CRISPR-HPH质粒构建成功。
以上HPH基因，pCRISPRyl质粒骨架的PCR扩增条件均为98℃预变性3分钟；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用3分钟(30个循环)，72℃再次延伸10分钟。
表1 引物列表
Figure BDA0003788661820000051
2、CRISPR-HPH-Oac1p gRNA的构建
根据https://chopchop.cbu.uib.no/，设计Oac1p(NC_006071.1)基因的最佳gRNA序列，gRNA：TCACAGTCACTAACCCGATC(SEQ ID NO.8)。
设计表2中含有gRNA序列的引物WSM2020078和WSM2020079，以步骤1构建的CRISPR-HPH质粒为模板，进行全质粒扩增，将gRNA序列插入到SCR1tRNA启动子表达位点，得到CRISPR-HPH-Oac1p gRNA线性化质粒。PCR结束后，先用dpn1处理后，再用纯化试剂盒(
Figure BDA0003788661820000052
PCR Purification Kit购于诺唯赞生物科技有限公司纯化，不用跑电泳，直接转10μL入大肠杆菌DH5a感受态，加入1mL LB液体培养基，200rpm、37℃孵育1小时。离心收集菌液涂在含有100mg/mL氨苄霉素的LB平板上，37℃过夜培养待长出转化子后，挑取单菌落至LB液体培养基，37℃培养8h，利用大肠杆菌自我修复能力，获得阳性转化子，提取质粒送样测序，确定gRNA序列正确插入到位点中，最终获得CRISPR-HPH-Oac1p gRNA质粒。
表2 引物列表
Figure BDA0003788661820000061
3、解脂耶罗酵母工程菌WSMHP的构建
(1)基因片段扩增
5'Oac1p的扩增：通过表3中引物YW924+YW925，以解脂耶氏酵母YW100-1(公开号：CN110499259A)基因组为模板，扩增出5'Oac1p，大小约为1kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.6
AGAGTCGAACGCAGTTGCTCTTCCACAGGCTGCACACTCTCGATGGTCGCGATCCAGGGTTTCGGAATAAATAGAGTTATGCATTTCTCGGTGTTTTTTTCGGTTACTGGACACACTATATGTCGCTTCAAGTGTGGGGAAACGACGGCATTTTTGCGACTTCAGGAATTCAAACACTCAGAGCTACAGGAAGAGGTAGGAAAGCTGCATGCGTGGGGATAAAGAAAAGAACTACTTCCGGAGTTGATTCTCTACTACATAATTTACAGACTGATAATAATTAACTCATTTGTGTGTCACAGGAGGCCTTTTCCATAAGAAAGCTTGCATGTCACTTGACAGGGCTGAAAGTGCCAGACAGTGTACAGTACATCCTGTACGTACATACATTTTACAAGTAGAACTAACAACGGTCTTCCGGCTATACAAGGGAAAAAAAGGAACAATGAGCCATGTCAAAGAAATGGGGAAAAAACAAGCGGTGGATTAAAGGTTCTAAATGGAAAATTATAGGCTCCATCAGACAACCGGAACTAATAACAACCATTACCAATACGACCCCCGATATCGCATACCTCTGGCAAGCGGCATCGGCCCCCTTACTATGCCGTACCGCTATCTCCGGTTGCCGACATCGCCTATCATAACGCTGCAACCATAGTTAGAGCCTAAGAGTCACCCCCAGACAAAGTAAAGCTTGGGTGGTGAAAAATGATGCAAGTTGGCACGGACCTAAATTATCGAAACCCGAAGCGCTTCTTAGCATCTTATTCACTCGCACCCATCTTCCCGACGCATCACCCAAGGACTTGACACGTCTAGTTCACCTCTTCTAACGACACAGACCCTTCTTTCCGTTAACTCCGGTTCCGCTCACCAGATCAGGAAAGCAAGTCCGAAGTAATAAAACCTCGACGACTTCCACTTTCACGCTACACACTACACACACACC。
Loxp-Ura3-loxp-pTEF的扩增：通过表3中引物YW926+YW927，以JMP113质粒为模板，扩增出Loxp-URA3-loxp-pTEF，大小约为1.7kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1
GCCCATCGTCTAGAGTTGATGTACTAACTCAGATTTCACTACCTACCCTATCCCTGGTACGCACAAAGCACTTTGCTAGATAGAGTCGAGAATTACCCTGTTATCCCTAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTCTGAATTCCGAGAAACACAACAACATGCCCCATTGGACAGACCATGCGGATACACAGGTTGTGCAGTACCATACATACTCGATCAGACAGGTCGTCTGACCATCATACAAGCTGAACAGCGCTCCATACTTGCACGCTCTCTATATACACAGTTAAATTACATATCCATAGTCTAACCTCTAACAGTTAATCTTCTGGTAAGCCTCCCAGCCAGCCTTCTGGTATCGCTTGGCCTCCTCAATAGGATCTCGGTTCTGGCCGTACAGACCTCGGCCGACAATTATGATATCCGTTCCGGTAGACATGACATCCTCAACAGTTCGGTACTGCTGTCCGAGAGCGTCTCCCTTGTCGTCAAGACCCACCCCGGGGGTCAGAATAAGCCAGTCCTCAGAGTCGCCCTTAGGTCGGTTCTGGGCAATGAAGCCAACCACAAACTCGGGGTCGGATCGGGCAAGCTCAATGGTCTGCTTGGAGTACTCGCCAGTGGCCAGAGAGCCCTTGCAAGACAGCTCGGCCAGCATGAGCAGACCTCTGGCCAGCTTCTCGTTGGGAGAGGGGACTAGGAACTCCTTGTACTGGGAGTTCTCGTAGTCAGAGACGTCCTCCTTCTTCTGTTCAGAGACAGTTTCCTCGGCACCAGCTCGCAGGCCAGCAATGATTCCGGTTCCGGGTACACCGTGGGCGTTGGTGATATCGGACCACTCGGCGATTCGGTGACACCGGTACTGGTGCTTGACAGTGTTGCCAATATCTGCGAACTTTCTGTCCTCGAACAGGAAGAAACCGTGCTTAAGAGCAAGTTCCTTGAGGGGGAGCACAGTGCCGGCGTAGGTGAAGTCGTCAATGATGTCGATATGGGTCTTGATCATGCACACATAAGGTCCGACCTTATCGGCAAGCTCAATGAGCTCCTTGGTGGTGGTAACATCCAGAGAAGCACACAGGTTGGTTTTCTTGGCTGCCACGAGCTTGAGCACTCGAGCGGCAAAGGCGGACTTGTGGACGTTAGCTCGAGCTTCGTAGGAGGGCATTTTGGTGGTGAAGAGGAGACTGAAATAAATTTAGTCTGCAGAACTTTTTATCGGAACCTTATCTGGGGCAGTGAAGTATATGTTATGGTAATAGTTACGAGTTAGTTGAACTTATAGATAGACTGGACTATACGGCTATCGGTCCAAATTAGAAAGAACGTCAATGGCTCTCTGGGCGGAATTCGTATAACTTCGTATAGCAGGAGTTATCCGAAGCGATAATTACCCTGTTATCCCTAGAATCGATAGAGACCGGGTTGGCGGCGCATTTGTGTCCCAAAAAACAGCCCCAATTGCCCCAATTGACCCCAAATTGACCCAGTAGCGGACCCAACCCCGGCGAGAGCCCCCTTCACCCCACATATCAAACCTCCCCCGGTTCCCACACTTGCCGTTAAGGGCGTAGGGTACTGCAGTCTGGAATCTACGCTTGTTCAGACTTTGTACTAGTTTCTTTGTCTGGCCATCCGGGTAACCCATGCCGGACGCAAAATAGACTACTGAAAATTTTTTTGCTTTGTGGTTGGGACTTTAGCCAAGGGTATAAAAGACCACCGTCCCCGAATTACCTTTCCTCTTCTTTTCTCTCTCTCCTTGTCAACTCACACCCGAAG。
5'Pyc2的扩增：通过表3中引物YW928+YW1000，以酿酒酵母BY4741基因组(GCA_000766575.2)作为模板，扩增出5'Pyc2，大小约为0.6kb，核苷酸序列如SEQ ID NO.2中1-599bp所示。
Pyc2的扩增：通过表3中引物YW928+YW962，以酿酒酵母BY4741基因组作为模板，扩增出Pyc2，大小约为4.1kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2
ATGAGCAGTAGCAAGAAATTGGCCGGTCTTAGGGACAATTTCAGTTTGCTCGGCGAAAAGAATAAGATCTTGGTCGCCAATAGAGGTGAAATTCCGATTAGAATTTTTAGATCTGCTCATGAGCTGTCTATGAGAACCATCGCCATATACTCCCATGAGGACCGTCTTTCAATGCACAGGTTGAAGGCGGACGAAGCGTATGTTATCGGGGAGGAGGGCCAGTATACACCTGTGGGTGCTTACTTGGCAATGGACGAGATCATCGAAATTGCAAAGAAGCATAAGGTGGATTTCATCCATCCAGGTTATGGGTTCTTGTCTGAAAATTCGGAATTTGCCGACAAAGTAGTGAAGGCCGGTATCACTTGGATCGGCCCTCCAGCTGAAGTTATTGACTCTGTGGGTGACAAAGTCTCTGCCAGACACTTGGCAGCAAGAGCTAACGTTCCTACCGTTCCCGGTACTCCAGGACCTATCGAAACTGTGCAAGAGGCACTTGACTTCGTTAATGAATACGGCTACCCGGTGATCATTAAGGCCGCCTTTGGTGGTGGTGGTAGAGGTATGAGAGTCGTTAGAGAAGGTGACGACGTGGCAGATGCCTTTCAACGTGCTACCTCCGAAGCCCGTACTGCCTTCGGTAATGGTACCTGCTTTGTGGAAAGATTCTTGGACAAGCCAAAGCATATTGAAGTTCAATTGTTGGCTGATAACCACGGAAACGTGGTTCATCTTTTCGAAAGAGACTGTTCTGTGCAAAGAAGACACCAAAAAGTTGTCGAAGTCGCTCCAGCAAAGACTTTGCCCCGTGAAGTTCGTGACGCTATTTTGACAGATGCTGTTAAATTAGCTAAGGTATGTGGTTACAGAAACGCAGGTACCGCCGAATTCTTGGTTGACAACCAAAACAGACACTATTTCATTGAAATTAATCCAAGAATTCAAGTGGAGCATACCATCACTGAAGAAATCACCGGTATTGACATTGTTTCTGCCCAAATCCAGATTGCCGCAGGTGCCACTTTGACTCAACTAGGTCTATTACAGGATAAAATCACCACCCGTGGGTTTTCCATCCAATGTCGTATTACCACTGAAGATCCCTCTAAGAATTTCCAACCGGATACCGGTCGCCTGGAGGTCTATCGTTCTGCCGGTGGTAATGGTGTGAGATTGGACGGTGGTAACGCTTATGCAGGTGCTACTATCTCGCCTCACTACGACTCAATGCTGGTCAAATGTTCATGCTCTGGTTCTACTTATGAAATCGTCCGTAGGAAGATGATTCGTGCCCTGATCGAATTCAGAATCAGAGGTGTTAAGACCAACATTCCCTTCCTATTGACTCTTTTGACCAATCCAGTTTTTATTGAGGGTACATACTGGACGACTTTTATTGACGACACCCCACAACTGTTCCAAATGGTATCGTCACAAAACAGAGCGCAAAAACTGTTACACTATTTGGCAGACTTGGCAGTTAACGGTTCTTCTATTAAGGGTCAAATTGGCTTGCCAAAACTAAAATCAAATCCAAGTGTCCCCCATTTGCACGATGCTCAGGGCAATGTCATCAACGTTACAAAGTCTGCACCACCATCCGGATGGAGACAAGTGCTACTGGAAAAGGGACCATCTGAATTTGCCAAGCAAGTCAGACAGTTCAATGGTACTCTACTGATGGACACCACCTGGAGAGACGCTCATCAATCTCTACTTGCAACAAGAGTCAGAACCCACGATTTGGCTACAATCGCTCCAACAACCGCACATGCCCTTGCAGGTGCTTTCGCTTTAGAATGTTGGGGTGGTGCTACATTCGACGTTGCAATGAGATTCTTGCATGAGGATCCATGGGAACGTCTGAGAAAATTAAGATCTCTGGTGCCTAATATTCCATTCCAAATGTTATTACGTGGTGCCAACGGTGTGGCTTACTCTTCATTACCTGACAATGCTATTGACCATTTTGTCAAGCAAGCCAAGGATAATGGTGTTGATATATTTAGAGTTTTTGATGCCTTGAATGATTTAGAACAATTAAAAGTTGGTGTGAATGCTGTCAAGAAGGCCGGTGGTGTTGTCGAAGCTACTGTTTGTTACTCTGGTGACATGCTTCAGCCAGGTAAGAAATACAACTTAGACTACTACCTAGAAGTTGTTGAAAAAATAGTTCAAATGGGTACACATATCTTGGGTATTAAGGATATGGCAGGTACTATGAAACCGGCCGCTGCCAAATTATTAATTGGCTCCCTAAGAACCAGATATCCGGATTTACCAATTCATGTTCACAGTCATGACTCCGCAGGTACTGCTGTTGCGTCTATGACTGCATGTGCCCTAGCAGGTGCTGATGTTGTCGATGTAGCTATCAATTCAATGTCGGGCTTAACTTCCCAACCATCAATTAATGCACTGTTGGCTTCATTAGAAGGTAACATTGATACTGGGATTAACGTTGAGCATGTTCGTGAATTAGATGCATACTGGGCCGAAATGAGACTGTTGTATTCTTGTTTCGAGGCCGACTTGAAGGGACCAGATCCAGAAGTTTACCAACATGAAATCCCAGGTGGTCAATTGACTAACTTGTTATTCCAAGCTCAACAACTGGGTCTTGGTGAACAATGGGCTGAAACTAAAAGAGCTTACAGAGAAGCCAATTACCTACTGGGAGATATTGTTAAAGTTACCCCAACTTCTAAGGTTGTCGGTGATTTAGCTCAATTCATGGTTTCTAACAAACTGACTTCCGACGATATTAGACGTTTAGCTAATTCTTTGGACTTTCCTGACTCTGTTATGGACTTTTTTGAAGGTTTAATTGGTCAACCATACGGTGGGTTCCCAGAACCATTAAGATCTGATGTATTGAGAAACAAGAGAAGAAAGTTGACGTGCCGTCCAGGTTTAGAATTAGAACCATTTGATCTCGAAAAAATTAGAGAAGACTTGCAGAACAGATTCGGTGATATTGATGAATGCGATGTTGCTTCTTACAATATGTATCCAAGGGTCTATGAAGATTTCCAAAAGATCAGAGAAACATACGGTGATTTATCAGTTCTACCAACCAAAAATTTCCTAGCACCAGCAGAACCTGATGAAGAAATCGAAGTCACCATCGAACAAGGTAAGACTTTGATTATCAAATTGCAAGCTGTTGGTGACTTAAATAAGAAAACTGGGCAAAGAGAAGTGTATTTTGAATTGAACGGTGAATTAAGAAAGATCAGAGTTGCAGACAAGTCACAAAACATACAATCTGTTGCTAAACCAAAGGCTGATGTCCACGATACTCACCAAATCGGTGCACCAATGGCTGGTGTTATCATAGAAGTTAAAGTACATAAAGGGTCTTTGGTGAAAAAGGGCGAATCGATTGCTGTTTTGAGTGCCATGAAAATGGAAATGGTTGTCTCTTCACCAGCAGATGGTCAAGTTAAAGACGTTTTCATTAAGGATGGTGAAAGTGTTGACGCATCAGATTTGTTGGTTGTCCTAGAAGAAGAAACCCTACCCCCATCCCAAAAAAAGTAATTTTTACTCGTTAATTATATTTTATGACATCTGAAAATACTAGCTGTACTATATATGGCGTATATTTTATCTAGTTATGTTCCCATGTATATTTAAATGCCAAATAGAAAGTAATCAAACACTTTCGATGAAATACGTGCTAACTGTGTTTCTTCCTTAATGCTTTCACTTACCATGTCTCCATTCTCCATTTTCTTCTTGAGTGAAAATGTGAGTTTATAACGCTCAAGTACGTTAACTACTCTATTTAATATCGTACGGGATTTTTGATCGACTGTAGGTTTTCTTCTTAGACCATTCCAGCGCCCGGGTATTTAACCAAACGCTACGGATGCACAATAACTTACAATAAGCTCATCATTAGTCTTGAATTGCATCCAAAGTTCACCAATATTTTGCTGCGGACTTGGCGCAAACGAATTATTTATATAACAATAAACATGGTCCATTTTCAGCCGTCTCTT。
3'Pyc2的扩增：通过表3中引物YW936+YW962，以酿酒酵母BY4741基因组作为模板，扩增出3'Pyc2，大小约为0.5kb，核苷酸序列如SEQ ID NO.2中3600-4100bp所示。
启动子pEXP1的扩增：通过表3中引物YW963+YW964，以解脂耶氏酵母YW100-1基因组为模板，扩增出pEXP1，大小约为1kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3
GGAGTTTGGCGCCCGTTTTTTCGAGCCCCACACGTTTCGGTGAGTATGAGCGGCGGCAGATTCGAGCGTTTCCGGTTTCCGCGGCTGGACGAGAGCCCATGATGGGGGCTCCCACCACCAGCAATCAGGGCCCTGATTACACACCCACCTGTAATGTCATGCTGTTCATCGTGGTTAATGCTGCTGTGTGCTGTGTGTGTGTGTTGTTTGGCGCTCATTGTTGCGTTATGCAGCGTACACCACAATATTGGAAGCTTATTAGCCTTTCTATTTTTTCGTTTGCAAGGCTTAACAACATTGCTGTGGAGAGGGATGGGGATATGGAGGCCGCTGGAGGGAGTCGGAGAGGCGTTTTGGAGCGGCTTGGCCTGGCGCCCAGCTCGCGAAACGCACCTAGGACCCTTTGGCACGCCGAAATGTGCCACTTTTCAGTCTAGTAACGCCTTACCTACGTCATTCCATGCATGCATGTTTGCGCCTTTTTTCCCTTGCCCTTGATCGCCACACAGTACAGTGCACTGTACAGTGGAGGTTTTGGGGGGGTCTTAGATGGGAGCTAAAAGCGGCCTAGCGGTACACTAGTGGGATTGTATGGAGTGGCATGGAGCCTAGGTGGAGCCTGACAGGACGCACGACCGGCTAGCCCGTGACAGACGATGGGTGGCTCCTGTTGTCCACCGCGTACAAATGTTTGGGCCAAAGTCTTGTCAGCCTTGCTTGCGAACCTAATTCCCAATTTTGTCACTTCGCACCCCCATTGATCGAGCCCTAACCCCTGCCCATCAGGCAATCCAATTAAGCTCGCATTGTCTGCCTTGTTTAGTTTGGCTCCTGCCCGTTTCGGCGTCCACTTGCACAAACACAAACAAGCATTATATATAAGGCTCGTCTCTCCCTCCCAACCACACTCACTTTTTTGCCCGTCTTCCCTTGCTAACACAAAAGTCAAGAACACAAACAACCACCCCAACCCCCTTACACACAAGACATATCTACAG。
Pck1的扩增：通过表3中引物YW65+YW933，以酿酒酵母BY4741基因组作为模板，扩增出Pck1，大小约为2.1kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4
ATGTCCCCTTCTAAAATGAATGCTACAGTAGGATCTACTTCCGAAGTTGAACAAAAAATCAGACAAGAATTGGCTCTTAGTGACGAAGTCACCACCATCAGACGCAATGCTCCAGCTGCCGTTTTGTATGAAGATGGTCTAAAAGAAAATAAAACTGTCATTTCATCAAGCGGTGCATTGATCGCTTATTCCGGTGTTAAAACCGGAAGATCTCCAAAGGACAAACGTATTGTTGAAGAACCTACCTCGAAAGACGAAATTTGGTGGGGTCCGGTCAATAAACCATGTTCTGAAAGAACATGGTCTATCAACCGTGAAAGAGCTGCAGATTACTTGAGAACAAGAGACCACATTTATATTGTCGATGCATTTGCAGGATGGGATCCAAAATACAGAATCAAAGTCCGCGTTGTTTGTGCCAGGGCTTACCACGCTTTATTCATGACAAATATGCTTATTAGACCTACAGAAGAAGAATTAGCCCATTTTGGAGAACCTGATTTTACTGTCTGGAACGCTGGTCAGTTCCCAGCCAATTTACACACCCAGGATATGTCTTCAAAGAGTACTATAGAAATTAACTTCAAAGCAATGGAAATGATCATTTTAGGTACCGAATACGCCGGTGAAATGAAAAAAGGTATTTTCACAGTTATGTTTTACTTGATGCCTGTGCACCATAACGTTTTAACTTTGCACTCTTCCGCCAACCAGGGTATTCAAAACGGTGACGTTACTTTATTCTTTGGCCTAAGTGGTACCGGGAAAACCACTTTATCCGCAGACCCACATAGATTGTTGATCGGCGATGATGAACATTGTTGGTCCGACCATGGTGTCTTCAATATCGAAGGTGGTTGTTACGCCAAGTGTATTAATTTATCTGCCGAAAAGGAGCCTGAAATTTTCGACGCTATCAAGTTTGGTTCTGTATTAGAAAACGTTATCTATGACGAGAAGTCGCATGTAGTCGACTATGACGACTCTTCTATTACTGAAAATACTAGATGTGCCTACCCAATTGACTACATTCCAAGTGCCAAGATTCCATGTTTGGCGGACTCTCATCCAAAGAACATTATCCTGCTAACTTGTGATGCTTCGGGTGTTTTACCACCAGTATCTAAATTGACTCCTGAACAAGTCATGTACCATTTCATCTCTGGTTACACTTCTAAAATGGCTGGTACTGAGCAAGGTGTCACTGAACCTGAACCAACATTTTCATCTTGTTTCGGACAACCCTTCCTAGCCTTGCACCCTATTAGATACGCAACCATGTTAGCTACAAAGATGTCTCAACATAAAGCTAATGCGTACTTAATCAACACCGGCTGGACTGGTTCTTCCTACGTATCTGGTGGTAAACGTTGCCCATTGAAGTACACAAGGGCCATTCTGGATTCTATTCATGATGGTTCGTTAGCCAATGAAACGTACGAAACTTTACCGATTTTCAATCTTCAAGTACCTACCAAGGTTAACGGTGTTCCAGCTGAGCTTTTGAATCCTGCTAAAAACTGGTCTCAAGGTGAATCCAAATACAGAGGTGCAGTTACCAACTTGGCCAACTTGTTTGTTCAAAATTTCAAGATTTATCAAGACAGAGCCACACCAGATGTATTAGCCGCTGGTCCTCAATTCGAGTAAACGAAACATGTTCGTTCGATATGTTCAATCCAAAAAAAAAAAAAAGAATTAGAATTATTTCGACATCATAAATGTTCGTAATATATTATTTTGTCAATTTTTTCTCTTCCCATTTCAGCTTTTTTTTAATAACTGAAACTGGATCAACAAGCACATGTTTTTCTAATTAATCTTTCAAACATATTTATGTATATACATAAGGAAAATTCAAAAATCCGATGCAATTAACAGAATTCTTCTTCATAGTTCTCTTCATCCATTCTTTCGTAGAATAAGACGTATACCTCATCGCTAGACATTTCTGTTTTGCCGGCTTCAAAGTTGTTGCGATCCTTGCGATGTTGCTGTATATAATCGTCATCAAATGTAACCCAAACTTGTCTATTCAGTCCAATTTCATGGCTCTTTTCTTTGTTCACAACAGAAGTATAGTGTCCATTGATAAGGTTACCGGAATGATTCACCGTTC。
3'Oac1p的扩增：通过表3中引物YW934+YW935，以解脂耶氏酵母YW100-1基因组为模板，扩增出3'Oac1p，大小约为1kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。
SEQ ID NO.7
GGTTTGAGGGCGTTCCCTTTTAAATAGACTACAACTATGTATAGTAGAATAGACAATTAGAATATACTTACCATACGACGAGGTATGGAAGGGGGCTTATGACGCTGTTGTTGCACAGCATCTCTAGGAGAACCTGTTATCTTACATTCATGCACTGATATGAAGGCATGCATATTAAAGACTATCCAATGTCAGAACAATCATTATATACACTACAAGTAGACACTACTGCACTGAACATGTTATCATCACTTCTTCCAACCATAAGTAGCACTCAGTCTAGACTGGAGATGCTCCTCTGCGGTGATGACCTTTCCTTCGTTAGCTCCTCGGCCAGTTACAGAGGCAATCTTTGCACTGGGGACAGGTTCAAGTCTTACTTCTTCCTCGGGATGACAGAAGAAGACACACGAATATCGGTCCGTTCCCTCGGCCTGAAGCTTGGCTGGAAACTTGACTCTGTGAATTGTGCTCTTGAGAATACCAGCTGTCCAGTAGCTGAGCAGATCTCCAATGTTGACAACCACAGGTGGGGCCATACCAGGCTCCTTGGGTCCAACGTATGGGACAGGCTCCCACTTCTTAGATACGGGGGACAAAATCTCGAGTCCTTCCTCTCCCTCTCGTTGGAAAAGCAGAGTCAAAGATCCGTAGTCTGTGTGTGCTCCTGCCCGGATTTCGTCTTCGGGATCGGCCTTCTTCTGACCAGGATAGTAAAGCAATCTGAAGATTGATCCAGATGGGTAATCACGTCTGTGTCGGTCGGCAAACCAGTTTGATCCTCCTGAAGATTCGTCAATCTTGAGACCCATGGCTAGCAGTTTGAGAATTCTTTGTGAGAGGTTGTAAAGCTTGGTCTGCATGTTTGCAATGATGTCGGCATTCTCGGGTTTCTGGAAGAACTCGGGCATAGGTTGAATTGGCTTCTCGTTGATGTACTTGCCAAAGTTGAAGCCCTCCTTGGGGTCACCCTTCTTTTGGGTAGCGGGATCAAGGGTCTCGACGTTGATAGCGTTGTAACCT。
(2)融合片段
融合PCR构建5'oac1p-Loxp-Ura3-loxp-pTEF-5'Pyc2和3'Pyc2-pEXP1-Pck1-3'Oac1p片段。以5'oac1p-Loxp-Ura3-loxp-pTEF-5'Pyc2片段为例，具体操作如下：
融合PCR采用2轮PCR扩增。第一轮：扩增体系为25μL：2X PrimeSTARMax DNA聚合酶(购自北京宝日医生物有限公司)12.5μL，按照1:3:1摩尔比混合的5'oac1p，Loxp-Ura3-loxp-pTEF和5'Pyc2片段，补加蒸馏水至25μL，95℃预变性3分钟，98℃变性10秒，58℃退火15秒，72℃延伸2分钟(15个循环)，72℃再次延伸10分钟。第二轮：扩增体系为50μL：2XPrimeSTARMax DNA聚合酶25μL，2μL第一步扩增得到的PCR产物，1μL YW924+1μLYW1000以及补加蒸馏水至50μL，95℃预变性3分钟，98℃变性10秒，56℃退火15秒，72℃延伸2分钟(30个循环)，72℃再次延伸10分钟。
(3)解脂耶氏酵母YW100-1(△ku70)感受态的制备：
通过网站(http://chopchop.cbu.uib.no/)选定Ku70 gRNA序列为ATATCGCCGCAAGATTACAC(SEQ ID NO.10)。以CRISPR-Hph质粒为模板，设计表3的引物WSM2020070和WSM2020071，按照实施例1中的方法，得到CRISPR-Hph-Ku70 gRNA质粒。将CRISPR-Hph-Ku70 gRNA转化至解脂耶氏酵母YW100-1感受态细胞中，涂布于含有100mg/mL潮霉素抗性的YPD固体平板上，30℃恒温培养箱中培养72小时，挑选出阳性转化子进行培养。
挑取上一步制备的阳性转化子单菌落至5mL YPD试管中，30℃，200rpm摇床内培养过夜。转接至含有50mL YPD培养基的摇瓶中，控制初始OD600为0.2，置于30℃，200rpm摇床中培养4-5小时，生长至OD600为0.8～1。将上述菌液转移至50mL无菌离心管中，5000rpm离心10分钟，弃去上清。加入6ml 1M山梨醇水溶液、1ml 1.5M LiAc水溶液、1ml pH＝7的1M Tris-HCl、270μl 1M二硫苏糖醇水溶液和1.73ml ddH2O，冰浴一小时。将上述反应液5000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。将上述菌体用5mL 1M山梨醇水溶液重悬，再5000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。重复上述操作步骤两次。用50μL 1M山梨醇水溶液重悬上述菌体，获得解脂耶氏酵母YW100-1(△ku70)感受态细胞，分装至1.5mL无菌离心管中，每管50μL感受态细胞。
(4)工程菌的构建
将5'oac1p-Loxp-Ura3-loxp-pTEF-5'Pyc2，Pyc2和3'Pyc2-pEXP1-Pck1-3'Oac1p按照100ng/kb的添加量同500ng CRISPR-HPH-Oac1p gRNA质粒通过电转的方法转化到解脂耶氏酵母YW100-1(△ku70)感受态中，涂布含100mg/mL潮霉素的YND固体培养基中，30℃倒置培养2-3天，转化子用引物YW968+YW937进行PCR鉴定，并将PCR产物测序，得到阳性转化子，命名为解脂耶氏酵母工程菌(Yarrowia lipolytica)WSMHP。
表3 引物列表
Figure BDA0003788661820000121
实施例2：解脂耶氏酵母工程菌WSMHP和解脂耶氏酵母YW100-1的摇瓶发酵的比较
将解脂耶氏酵母工程菌WSMHP和出发菌解脂耶氏酵母YW100-1，分别接种于YPD液体培养基中，在250mL三角瓶中于30℃，200rpm培养24h，培养液以初始菌体浓度OD600＝0.5分别接种于含50g/L甘油的YNG培养基中，每种菌株做三组平行分析，于30℃，200rpm发酵培养16h至OD600为4.5时，取10mL发酵液，6000rpm离心5min，收集上清液，用高效液相色谱法测定丙酮酸和甘油的浓度，结果见图1。
高效液相色谱测定条件：Waters 1525Agilent Hi-Plex H色谱柱(7.7mm*300mm，8μm)，流动相：5mM硫酸水溶液；流速：0.6ml/min；进样温度：28℃；进样量：10μl。
图1所示，YW100-1在YNG培养基中发酵16h，丙酮酸的产量约为5.95g/L，甘油残留量约为7.4g/L。工程菌WSMHP的丙酮酸的产量约为7.85g/L，甘油残留量约为5.4g/L。由此可知，工程菌WSMHP发酵生产丙酮酸产量明显高于YW100-1出发菌。
实施例3：解脂耶氏酵母工程菌WSMHP和出发菌株解脂耶氏酵母YW100-1在20L发酵罐发酵产丙酮酸的比较
种子培养基：0.4g/L胰蛋白胨、酵母提取物0.2g/L、0.24g/L KH2PO4、1.7g/LK2HPO4·3H2O，溶剂为蒸馏水，pH值自然。
发酵培养基组成：10g/L(NH4)2SO4、1.4g/L MgSO4·7H2O、2g/L KH2PO4、0.8g/LCaCl2、0.5g/L NaCl、1μg/L维生素B1，溶剂为蒸馏水，pH值自然。
分别接种解脂耶氏酵母工程菌WSMHP和出发菌株解脂耶氏酵母YW100-1于YPD液体培养基中，30℃过夜培养，随后200ml培养液转接到3L含2g/L甘油的种子培养基中，30℃摇瓶培养18h，种子液以体积浓度10％接种量接种于装有12L含60g/L甘油的发酵培养基的20L发酵罐中，发酵培养1h。整个发酵培养过程中，用20％NaOH流加调节pH值至4.0，溶氧量保持在40％左右，发酵温度控制为30℃。对于出发菌株解脂耶氏酵母YW100-1，根据发酵罐中的甘油残留浓度低于20g/L时，分别补加甘油两次，每次一次性补加40g/L，共加入甘油1680g。对于工程菌WSMHP，根据发酵罐中的甘油残留浓度低于20g/L时，分别补加甘油三次，每次40g/L，共加入甘油2160g。
两株菌的甘油发酵产丙酮酸的过程如图2所示。出发菌株发酵120h，丙酮酸产量达到最大值121.2g/L，丙酮酸/甘油转化率约为0.865g/g。工程菌WSMHP发酵120h，丙酮酸产量达到最大值168.9g/L，丙酮酸/甘油转化率达到0.93g/g。与出发菌相比，工程菌WSMHP的发酵丙酮酸产量提高了39.0％，并且明显高于已报道的最高产量的其他基因工程菌。由此可见，解脂耶氏酵母工程菌WSMHP可以为丙酮酸工业化生产提供了优良菌株。

Claims (8)

1.一种高产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP，其特征在于，所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP是将解脂耶氏酵母基因组中草酰乙酸转运蛋白编码基因Oac1p敲除，同时过表达丙酮酸脱羧酶编码基因Pyc2和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶编码基因Pck1构成的。
2.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP，其特征在于，所述草酰乙酸转运蛋白编码基因Oac1p核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述丙酮酸脱羧酶编码基因Pyc2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶编码基因Pck1核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
3.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP，其特征在于，所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP按如下步骤构建：
(1)将质粒pCRISPRyl的原有营养缺陷型标记基因Leu替换成潮霉素抗性基因HPH，得到CRISPR-HPH质粒；
(2)根据靶标基因Oac1p设计gRNA序列，将20bp的gRNA序列当作引物的同源臂，以CRISPR-HPH为模板进行全质粒扩增，将gRNA序列插入到SCR1tRNA启动子表达位点，得到CRISPR-HPH-Oac1p gRNA质粒；所述gRNA序列如SEQ ID NO.8所示；
(3)以解脂耶氏酵母基因组为模板，分别扩增Oac1p基因上游1kb碱基序列，启动子pEXP1片段和Oac1p基因下游1kb碱基序列；以酿酒酵母BY4741基因组作为模板，扩增来源于酿酒酵母BY4741的Pyc2和Pck1基因；以质粒JMP113作为模板扩增启动子Loxp-URA3-loxp-pTEF片段；通过重叠延伸PCR获得5'oac1p-Loxp-URA3-loxp-pTEF-5'Pyc2和3’Pyc2-pEXP1-Pck1-3’Oac1p两个大片段，同Pyc2基因以及CRISPR-HPH-Oac1p gRNA质粒一起电转导入解脂耶氏酵母中，得到同源重组后的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP。
4.一种权利要求1所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP在发酵甘油制备丙酮酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵采用摇瓶发酵的方法为：将解脂耶氏酵母工程菌WSMHP接种于YPD培养基中，于30℃，200rpm培养24h，将培养液以初始菌体浓度OD600＝0.5接种于含50g/L甘油的YNG培养基中，于30℃，200rpm发酵培养至OD600为4.0-5.0时，获得含丙酮酸的发酵液，分离纯化，获得丙酮酸；YPD液体培养基质量组成：10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，溶剂为去离子水，pH值自然；YNG培养基质量组成：6.7g/L YNB，溶剂为去离子水，用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液调节pH到4.0。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵采用发酵罐发酵的方法为：将解脂耶氏酵母工程菌WSMHP接种至含60g/L甘油的发酵培养基中，在30-32℃、pH值4-4.5、溶氧量40-50％条件下进行发酵罐发酵，获得含丙酮酸的发酵液，分离纯化，获得丙酮酸；所述发酵培养基组成为：10g/L(NH4)2SO4、1.4g/L MgSO4·7H2O、2g/L KH2PO4、0.8g/L CaCl2、0.5g/LNaCl、1μg/L维生素B1，溶剂为去离子水，pH值自然。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵罐发酵时，甘油采用分批方式加入，首次加入60g/L，当甘油浓度浓度低于20g/L时，分批补加甘油，每次补加40g/L。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵罐发酵前，解脂耶氏酵母工程菌WSMHP先进行活化培养和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度10％的接种量接种至发酵培养基，所述活化培养和种子扩大培养为：解脂耶氏酵母工程菌WSMHP接种至YPD液体培养基中，30℃过夜培养，培养液以体积浓度6-7％的接种量转接至含2g/L甘油的种子培养基，30℃摇瓶培养18h，获得种子液；所述种子培养基：0.4g/L胰蛋白胨、酵母提取物0.2g/L、0.24g/L KH2PO4、1.7g/L K2HPO4·3H2O，溶剂为蒸馏水，pH值自然；YPD液体培养基质量组成：10g/L酵母提取物，2g/L葡萄糖，2g/L蛋白胨，溶剂为去离子水，pH值自然。
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