CN114410494B - 一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114410494B
CN114410494B CN202111674112.1A CN202111674112A CN114410494B CN 114410494 B CN114410494 B CN 114410494B CN 202111674112 A CN202111674112 A CN 202111674112A CN 114410494 B CN114410494 B CN 114410494B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
pumri
saccharomyces cerevisiae
ldh
opc4cl2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111674112.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114410494A (zh
Inventor
周萍萍
岳春磊
张雨晨
笪心怡
李言
方馨
周秀琪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN202111674112.1A priority Critical patent/CN114410494B/zh
Publication of CN114410494A publication Critical patent/CN114410494A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114410494B publication Critical patent/CN114410494B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01028—D-Lactate dehydrogenase (1.1.1.28)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0114—Rosmarinate synthase (2.3.1.140)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01051—Prephenate dehydratase (4.2.1.51)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，所述酿酒酵母工程菌，其以酿酒酵母芳香族氨基酸途径为基础，在已有整合了前体咖啡酸的合成所需的三个外源基因的前提上，继续整合了OD‑LDHY52A基因、OPc4CL2基因和OMoRAS基因，通过对细胞内限制前体合成的步骤的调控，能够获得稳定高产的酿酒酵母工程菌，实现葡萄糖到迷迭香酸的一步合成，无需添加其它外源前体物质；此外，通过敲除酿酒酵母苯丙氨酸合成所需要的PHA2基因，能够使得酿酒酵母工程菌在发酵中减少副产物的积累，以提高酿酒酵母重组菌株前体物质供应；通过将OPc4CL2基因的GAL10启动子替换为DDI2启动子，能够提高咖啡酰辅酶A合成酶和迷迭香酸合成酶对前体丹参素和咖啡酸的利用效率。

Description

一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，属于合成生物学技术领域。
背景技术
迷迭香酸(Rosmarinic acid)是一种重要的天然酚酸类化合物，具有较强的抗氧化、抗癌、抗炎等多种生理学活性，在制药、食品和化妆品等领域具有广泛的应用价值。目前，市场上的迷迭香酸主要是从唇形花科和紫草科等植物中提取。由于植物生长周期长，且提取工艺复杂，提取的产品纯度低，并不能满足人们对其日益增长的需求。随着近些年合成生物学的飞速发展，代谢改造微生物合成迷迭香酸潜力巨大。
目前，虽然已实现前体物质丹参素和对香豆酸在微生物细胞中的高效异源合成，产量分别高达7g/L(Metab Eng,2013,19:79-87)和12.5g/L(Nat Commun,2019,10(1):4976)，但关于迷迭香酸异源合成的研究报道还比较少。有文献报道，通过将迷迭香酸合成途径模块化组装到三株大肠杆菌中，并通过混菌培养，实现了大肠杆菌从葡萄糖到迷迭香酸的全合成，产量达到172mg/L(Metab Eng,2019,54:1-11)。但在该研究体系中，各途径模块以多个游离质粒形式存在，共培养体系稳定性差，在培养过程中需要添加多种抗生素，因此不具备生产经济性。此外，大肠杆菌属于非食品安全性菌株，自身能够产生内毒素，也不利于迷迭香酸的生产。而酿酒酵母作为生物安全菌株，其遗传背景清晰且高密度发酵技术成熟，是天然产物合成的理想底盘细胞。目前仅有一篇文献报道在酿酒酵母中实现了迷迭香酸的从头合成，但产量比较低，只有5.93mg/L(ACS Synth Biol,2020,9:1978-1988)。该研究是利用多个游离质粒表达迷迭香酸合成途径中所需要的基因，因此也存在质粒易丢失，菌株不稳定等问题，此外该途径还涉及P450酶，该酶活性低，也是限制迷迭香酸合成的一个主要因素。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，通过迷迭香酸途径中基因的染色体整合，以及途径中关键限速节点的改造，大幅度提高了酿酒酵母迷迭香酸的产量。
为解决上述技术问题，本发明是采用下述技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌在基因组中整合了OD-LDHY52A基因、OPc4CL2基因和OMoRAS基因。
其中，所述OD-LDHY52A基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述OPc4CL2基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述OMoRAS基因的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
其中，所述OD-LDHY52A基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述OPc4CL2基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述OMoRAS基因对应的氨基酸序列如SEQ IDNO：6所示。
其中，所述OPc4CL2基因的GAL10启动子被替换为DDI2启动子，所述DDI2启动子的基因序列如SEQ ID NO：7所示。
其中，还包括敲除了PHA2基因的酿酒酵母工程菌。
第二方面，本发明还提供一种所述的生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
重组载体pUMRI-△PDC5-D-LDHY52A和pUMRI-15-OPc4CL2-OMoRAS质粒的获得；
将重组载体pUMRI-△PDC5-D-LDHY52A导入酿酒酵母YCA113-8B中，得到YCA-SSA-5B菌株；
将酿酒酵母YCA-SSA-5B中的URA3和KanMX基因丢失，得到YCA-SSA-5B(-)菌株；
将pUMRI-15-OPc4CL2-OMoRAS质粒导入YCA-SSA-5B(-)中，得到YRA113-5B菌株。
其中，所述构建方法包括如下步骤：
重组载体pUMRI-△PDC5-D-LDHY52A和pUMRI-15-OPc4CL2-OMoRAS质粒的获得；
将重组载体pUMRI-△PDC5-D-LDHY52A导入酿酒酵母YCA113-8B中，得到YCA-SSA-5B菌株；
将酿酒酵母YCA-SSA-5B中的URA3和KanMX基因丢失，并敲除PHA2基因，得到YCA-SSA-9B(-)菌株；
将pUMRI-15-OPc4CL2-OMoRAS质粒导入YCA-SSA-9B(-)中，得到YRA113-9B菌株。
其中，所述构建方法包括如下步骤：
重组载体pUMRI-△PDC5-D-LDHY52A和pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒的获得；
将重组载体pUMRI-△PDC5-D-LDHY52A导入酿酒酵母YCA113-8B中，得到YCA-SSA-5B菌株；
将酿酒酵母YCA-SSA-5B中的URA3和KanMX基因丢失，并敲除PHA2基因，得到YCA-SSA-9B(-)菌株；
将pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒导入YCA-SSA-9B(-)中，得到YRA113-10B菌株。
第三方面，本发明还提供一种所述的生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌在迷迭香酸生产中的应用。
第四方面，本发明还提供一种迷迭香酸的生产方法，所述生产方法包括将所述的酿酒酵母工程菌进行发酵培养即得。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
1、本发明一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌，其以酿酒酵母芳香族氨基酸途径为基础，在已有整合了前体咖啡酸的合成所需的三个外源基因：酪氨酸解氨酶基因(ORgTAL)、4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶(OHpaB)基因和NADPH-黄素氧化还原酶(HpaC)基因的前提上，继续整合了迷迭香酸所需的三个外源基因：乳酸脱氢酶基因(OD-LDHY52A)、咖啡酰辅酶A合成酶基因(OPc4CL)、迷迭香酸合成酶基因(OMoRAS)，并对细胞内限制前体合成的步骤进行了调控，从而获得的稳定高产的酿酒酵母工程菌，实现了葡萄糖到迷迭香酸的一步合成，无需添加其它外源前体物质，为迷迭香酸的绿色生产提供了参考，为工业化发酵生产提供基础。
2、本发明提供一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，通过迷迭香酸途径中基因的染色体整合，以及途径中关键限速节点的改造，大幅度提高了酿酒酵母迷迭香酸的产量，为迷迭香酸的绿色生物合成以及工业化应用奠定了基础。
3、本发明提供一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌，通过敲除酿酒酵母苯丙氨酸合成所需要的PHA2基因，即将酿酒酵母YRA113-5B中的PHA2基因敲除，能够使得酿酒酵母工程菌在生产中减少副产物的积累，提高酿酒酵母重组菌株前体物质供应。
4、本发明通过将OPc4CL2基因的GAL10启动子替换为DDI2启动子，能够提高咖啡酰辅酶A合成酶和迷迭香酸合成酶对前体丹参素和咖啡酸的利用效率，减少副产物的产生。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基因组中整合的pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A，pUMRI-15-OPc4CL2-OMoRAS和pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS基因的质粒图谱；
图2是本发明实施例构建的从头生物合成迷迭香酸的途径示意图，其中，△符号表示基因敲除；
其中，EMP:Embden-Meyerhof-Parnas pathway；PPP:pentose phosphatepathway；PEP:phosphoenolpyruvate；E4P:4-erythritol phosphate；DAHP:3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate；CHA:Chorismate；PPA:Prephenate；PPY:phenylpyruvate；PAC:phenylacetaldehyde；L-TRP:tryptophan；L-PHA:phenylalanine；L-TYR:tyrosine；4-HPP:4-hydroxyphenylpyruvate；4-HPPA:4-hydroxy-phenylacetaldehyde；4-HPL:4-dihydroxy-phenyllactate；3,4-HPL:3,4-dihydroxyphenyllactic acid；p-CA:p-coumaric acid；CA:caffeic acid；CA-CoA:caffeoyl-CoA；RA:rosmarinic acid；
图3是本发明实施例提供的YRA113-5B和YRA113-9B菌株发酵产物的液相色谱图；其中，A为YRA113-5B菌株发酵产物的液相色谱图，B为YRA113-9B菌株发酵产物的液相色谱图；
图4是本发明实施例提供的YRA113-10B菌株在单氰胺诱导下，研究不同诱导浓度和诱导时间对迷迭香酸生产的影响；其中，A为不同浓度单氰胺诱导下，YRA113-10B菌株产迷迭香酸的情况；B为不同诱导时间下，YRA113-10B菌株产迷迭香酸的情况。
具体实施方式
下面将对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例所用培养基、储存液：
Luria-Bertani(LB)培养基：购于上海生物工程有限公司，115℃灭菌21min。
Yeast Extract Peptone Dextrose(YPD)培养基：10g/L酵母浸出粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，固体YPD培养基添加1.5-2％的琼脂粉，115℃灭菌21min。
卡那霉素储存液(50mg/mL)：取0.5g卡那霉素溶于10mL ddH2O中，过滤除菌，于-20℃保存，使用时稀释1000倍使终浓度为50μg/mL。
遗传霉素(G418)储存液(20mg/mL)：取0.2g G418溶于10mL ddH2O中，过滤除菌，于-20℃保存，使用时稀释100倍使终浓度为200μg/mL。
5-氟乳清酸(FOA)储存液(100mg/mL)：取0.1g 5-FOA溶于1mL二甲基亚砜中，使用时直接取1mL母液加到100mL SD固体培养基中，用于制作SD-FOA平板。
10×YNB储存液：称取1.7％YNB和5％(NH4)2SO4溶于ddH2O中，用0.22μm无菌针式过滤器过滤除菌，于4℃冰箱保存，使用时稀释10倍。
10×氨基酸混合储存液：按以下配方称取各种氨基酸混合并溶于ddH2O中，浓度为：L-腺嘌呤硫酸盐200mg/L，L-精氨酸200mg/L，L-组氨酸200mg/L，L-异亮氨酸300mg/L，L-亮氨酸1000mg/L，L-赖氨酸300mg/L，L-蛋氨酸200mg/L，L-苯丙氨酸500mg/L，L-苏氨酸2000mg/L，L-色氨酸200mg/L，L-酪氨酸300mg/L，L-尿嘧啶200mg/L，L-缬氨酸1500mg/L(注：配制上述氨基酸母液时，根据营养筛选的不同，缺失相应的氨基酸)。用0.22μm无菌针式过滤器过滤除菌，于4℃冰箱存放。使用时稀释10倍。
Synthetic Defined(SD)培养基：2％葡萄糖，10％(V/V)的10×YNB母液，10％(V/V)的10×氨基酸混合母液。配置100mL SD培养基具体流程如下：取2g葡萄糖溶于80mL水中，115℃高压灭菌21min中，待培养基冷却到60℃以下，加入10mL的10×YNB母液和10mL的10×氨基酸混合母液。固体SD培养基添加1.5-2％的琼脂粉。其中，SD-URA-表示缺尿嘧啶的SD培养基。
实施例所用试剂：
本发明中，高保真酶DNA聚合酶(Prime STARTM HS DNA polymeras)、DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购于大连宝生物公司(Takara，大连)；DNA marker(1kb DNA ladder)购于Thermo Scientific；核酸电泳相关试剂和酵母基因组抽提试剂盒购买与上海生物工程有限公司；细菌质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒购于杭州Axygen公司；无氨基酵母氮碱(Yeast nitrogen base without amino acids，YNB)购于上海生物工程有限公司用于合成培养基的制备；PCR引物合成及测序服务由上海生物工程有限公司提供。
实施例所用常规的技术方法：
1、大肠杆菌化转步骤：
(1)将大肠杆菌感受态从-80℃冰箱取出，冰上融化。
(2)加入10μL重组质粒，冰上放置20min。
(3)42℃热击90s，立即冰浴5min。
(4)加入1mL LB混匀，37摇床复苏50min。
(5)12000rpm离心1min，去上清，留100μL重悬，涂含有相应抗性的LB平板，37℃培养过夜。
2、酿酒酵母醋酸锂转化法：
(1)挑取单克隆接种到5mL YPD试管，30℃，220rpm培养过夜，取1mL的接种量转接到含有50mL YPD的250mL三角瓶中，30℃，220rpm培养5h左右，OD600约为2。
(2)将菌液转移到50mL灭过菌的离心管中，5000×g，离心5min后去上清。
(3)加30mL灭菌水洗涤菌体，5000×g离心5min后去上清。
(4)加800μL灭菌水重悬菌体，混匀后按每管100μL分装于1.5mL EP管，12000×g离心1min后去上清，备用。
(5)在上述1.5mL EP管的菌体中依次加入240μL PEG MW 3350(50％w/v)，36μL的1.0M醋酸锂，30μL灭菌水，50μL的单链DNA(Single-strandedcarrier DNA，2.0mg/mL)，线性化质粒片段4μL，剩余加灭菌水至总体积360μL，重悬菌体，充分混匀。
(6)将1.5mLEP管放置42℃水浴锅中热击40min。
(7)热击结束后，12000×g离心1min，去上清。
(8)加入1mL YPD培养基，混匀细胞后放置于30℃，220rpm摇床复苏1.5-2h。
(9)复苏后的细胞，12000×g离心1min，去上清培养基，再用1mL灭菌纯净水水洗沉淀，12000×g离心1min，去上清，最后加入1mL灭菌纯净水重选细胞，取15μL涂到相应的G418平板，于30℃培养箱培养3天。
3、酿酒酵母培养方法：
从琼脂平板上挑取单个克隆，接种到5mL新鲜的YPD试管中，于30℃、220rpm的恒温摇床中过夜培养15h左右。然后转接到含有50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，使摇瓶中的初始OD600为0.05，放置30℃，220rpm的恒温摇床中培养72h。
实施例1迷迭香酸合成所需的重组质粒构建
本领域技术人员在研究本发明实施例所用试剂后，可知本发明实施例中，利用引物UPPDC5-F(AAAGCTGGAGCTGGCCTTGTGTTCTTCTTGTTATTGTATTGTG)/UPPDC5-R(CTTACATCTTATTTAGAATAGGCCTTTATGGCCAAGGAAATAAAGCAAATAAC)和DNPDC5-F(GTTATTTGCTTTATTTCCTTGGCCATAAAGGCCTATTCTAAATAAGATGTAAGGCC)/DNPDC5-R(TAATAGCGAAGAGGCCTACAGCTAATTAACATAAAACTCATG)，分别从酿酒酵母BY4741的基因组上扩增出497bp的UpPDC5同源臂(ChrⅫ:410219到410720)和500bp的DnPDC5同源臂(ChrIV:412414到412987)，以上述两个片段为模板，UPPDC5-F/DNPDC5-R为引物，采用融合PCR技术扩增出HAPDC5同源臂片段。
PCR反应体系如下：
融合PCR反应体系如下：
PCR程序如下：
利用引物PUMRI-PDC5-F(AATACAATAACAAGAAGAACACAAGGCCAGCTCCAGCT)/PUMRI-PDC5-R(TGAGTTTTATGTTAATTAGCTGTAGGCCTCTTCGCTATTA)以PUMRI-11为模板(GenBank:KM216413.1)扩增出质粒骨架大片段。以该大片段和同源臂片段互为引物，互为模板，采用融合PCR技术扩增出质粒PUMRI-△PDC5。
以密码子优化后合成的基因OD-LDH为模板，用两对引物OD-LDH-F(BamH I)/OD-LDHY52A-R(GTGTAGTCCTTTTGTTGagcAACGTCAGCACCGTCGAAAC)和OD-LDH(Y52A)-F(TCGACGGTGCTGACGTTgctCAACAAAAGGACTACA CTGC)/OD-LDH-R(Sal I)为引物，通过融合PCR扩增得到突变基因OD-LDHY52A。将突变基因用BamH I和Sal I双酶切，得到的片段与同样BamH I和Sal I双酶切的pUMRI-△PDC5质粒连接做转化，构建得到pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A质粒。
基因片段或质粒酶切体系如下：
组成成分 体积(uL)
Quick cut BamH I 0.5
Quick cut Sa lI 0.5
10×Quick cut Buffer 2
基因片段 17
37℃，酶切2h。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，切下带有基因片段的凝胶，并用胶回收试剂盒纯化回收。
连接体系如下：
22℃，酶接50min，连接产物转化至大肠杆菌感受态中，放置于37℃培养箱培养过夜得到的阳性克隆用于质粒抽提。
设计并合成密码子优化的基因OPc4CL2，然后用EcoR I和Sac I进行双酶切，得到的片段与EcoR I和Sac I双酶切的pUMRI-15质粒(由浙江大学化学工程与生物工程于洪巍教授馈赠，Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(20):8419-8428)，按照上述连接转化方法进行连接转化，构建得到pUMRI-15-OPc4CL2质粒。设计并合成密码子优化的基因OMoRAS，然后用BamH I和Sal I进行双酶切，达到的片段与BamH I和Xho I双酶切的pUMRI-15-OPc4CL2的质粒按照上述连接方法进行连接转化，分别构建得到pUMRI-15-OPc4CL2-OMoRAS质粒。
用两对引物PDDI2-F(EcoRI)(GCGGAATTCGATTGATTCTTTTGAAGAGAAGCA)/PGAL1-DDI2-R(AGTGCGGCGCGAGGCACATTCAAAGGTTAAACTCGCTTAGA)和PDDI2-GAL1-F(TAGTCTAAGCGAGTTTAACCTTTGAATGTGCCTCGCGCCGCACT)/PGAL1-R(Sma I)(TCCCCCGGGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGT)为引物，以BY4741基因组为模板，通过两轮PCR，构建双向启动子PGAL1-PDDI2，并用EcoRI和Sma I进行双酶切，与同样双酶切的PUMRI-15进行连接转化，得到PUMRI-30质粒。将OPc4CL2用EcoR I和Sac I进行双酶切，得到的片段与EcoR I和Sac I双酶切的pUMRI-30质粒按照上述连接转化方式进行连接转化，构建得到pUMRI-30-OPc4CL2质粒。OMoRAS用Sma I和Sal I进行双酶切，达到的片段与Sma I和Xho I双酶切的pUMRI-30-OPc4CL2的质粒按照上述连接方法进行连接转化，分别构建得到pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒。
本发明实施例提供的基因组中整合的pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A，pUMRI-15-OPc4CL2-OMoRAS和pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS基因的质粒图谱，请参见图1。
实施例2迷迭香酸生产菌株的构建
将重组载体pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A用Sfi I酶切方式进行载体线性化。酶切体系：质粒43.5μL，10×Quick Cut Buffer 5μL，Quick cut Sfi I酶1.5μL，总体系50μL。酶切条件：放置50℃酶切2-3小时。将线性化的质粒pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A导入酿酒酵母YCA113-8B中，利用含G418抗性的YPD平板筛选得到阳性重组酵母，命名为YCA-SSA-5B。
由于pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A含有loxp-URA3-KanMX-loxp片段，KanMX在酵母中编码遗传霉素G418抗性，其中URA3编码乳清苷-5-磷酸脱氢酶(orotidine 5-phosphatedecarboxylase)，该酶在酵母RNA嘧啶核苷酸的合成过程中，催化其中的一个关键的反应。当在培养基中加入5-氟乳清酸(5-FOA)时，正常原养型酵母细胞的乳清苷5-磷酸脱羧酶可以将5-FOA转化为致死细胞的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)。将酿酒酵母菌株在YPD液体培养基中传代培养，URA3和KanMX两端的loxp正向重复片段间能发生同源重组，URA3和KanMX基因在这过程中会自然丢失，因此可以在SD-FOA平板上筛选出抗性丢失的克隆。然后将挑选出来的克隆分别点在不含G418抗性YPD以及含有G418抗性的YPD平板上进行再验证，去掉筛选抗性的菌株YCA-SSA-5B(-)用于下一轮基因的整合。
将pUMRI-15-OPc4CL2-OMoRAS质粒用Sfi I进行线性化，导入到YCA-SSA-5B(-)菌株中，得到迷迭香酸所产菌株YRA113-5B。
实施例3敲除PHA2基因提高迷迭香酸的合成效率
首先，利用引物对gPHA2-F(Esp3 I)(ATCGCGTCTCTGCGCAAGATTATTCAGTGGTACCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA)/tRNA-R(Esp3 I)(ATCGCGTCTCAAGCTTTGCGCAAGCCCGGA ATCG)以M3-T为模板(ACS synthetic biology,2021,DOI:10.1021/acssynbio.1c00378)扩增出gRNA序列片段。然后又以TYPE3-M为模板(ACS synthetic biology,2021,DOI:10.1021/acssynbio.1c00378)，利用Goldengate分子克隆发进行PCR反应，构建TYPE3-M-gPHA2。具体反应体系(10uL)为下表所示：
组成成分 体积(uL)
10mM ATP 1uL
20mM DTT 0.5uL
Tango buffer 1uL
Esp3I 0.5uL
T4连接酶 1uL
gRNA 3.5uL
模板 2.5uL
PCR程序为如下所示：
将10uL反应产物直接转化到BL21大肠杆菌细胞感受态中。扩增TYPE3-M-gPHA2质粒。
然后，利用HAPHA2-F(TTTTAACCAATTGGAGAACGACACTAGTATAGATTATTCAGTGGTACCGTTGAAAATTCCACCAATGGA)/HAPHA2-R(TTAAGTAACATTCAACCTGG)为引物，以BY4741酵母基因组为模板扩增出HAPHA2同源臂敲除序列。将构建的质粒和敲除同源臂共转化到YCA-SSA-5B(-)菌株中，敲除YCA-SSA-5B(-)中得PHA2基因，并利用SD-URA-平板筛选得到阳性重组酵母，命名为YCA-SSA-9B(-)。按照实施例2，将pUMRI-15-OPc4CL2-OMoRAS质粒用Sfi I进行线性化，导入到YCA-SSA-9B(-)菌株中，得到迷迭香酸所产菌株YRA113-9B。YRA113-9B与YRA113-5B区别在于，YRA113-9B是在YRA113-5B得基础上敲除了PHA2基因。
实施例4迷迭香酸产量分析与检测
本发明实施例构建的从头生物合成迷迭香酸的途径示意图，请参见图2，其中，△符号表示基因敲除，从图2中可知，本发明提供一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌，通过对细胞内限制前体合成的步骤的调控，能够实现葡萄糖到迷迭香酸的一步合成，无需添加其它外源前体物质，通过敲除酿酒酵母苯丙氨酸合成所需要的PHA2基因，即将酿酒酵母YRA113-5B中的PHA2基因敲除，能够使得酿酒酵母工程菌在生产中减少副产物的积累，提高酿酒酵母重组菌株前体物质供应。
具体地，将工程菌株YRA113-9B按照酿酒酵母培养方法在YPD摇瓶中培养72h。并按照以下步骤进行样品处理和产量分析：
(1)取600μL发酵液至1.5mL EP管，再加入600μL甲醇，超声10min混匀，常温下12000×g离心1min。
(2)取100μL上清至新1.5mLEP管中，加入900μL(1：1)甲醇水稀释10倍。
(3)用0.22μm的水系针式滤头过滤获得样品用于迷迭香酸测定。
迷迭香酸的定量分析：样品采用Agilent 1200高效液相色谱仪进行分析。色谱条件为：流动相A泵为0.1％甲酸水溶液，B泵为100％乙腈，梯度洗脱方式如下：
采用QS-C18Plus色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1mL/min、柱温35℃、进样量20μL，检测波长为320nm，梯度洗脱条件如下：
时间/min A泵 B泵
0 90 10
30 50 50
在YRA113-5B和YRA113-9B发酵液中成功检测到了迷迭香酸的积累，液相色谱图如3所示，其中，A为YRA113-5B菌株发酵产物的液相色谱图，B为YRA113-9B菌株发酵产物的液相色谱图，具体地，YRA113-5B菌株发酵产生的迷迭香酸产量为3.3mg/L，YRA113-9B菌株发酵产生的迷迭香酸产量121mg/L，由此可知，通过敲除酿酒酵母YRA113-5B中的PHA2基因，也可以提高酿酒酵母工程菌的迷迭香酸产量。
实施例5利用DDI2启动子调控OPc4CL2基因的表达
在实施例4的YRA113-9B样品分析中，酿酒酵母生物合成迷迭香酸的发酵液中含有多种迷迭香酸类似物。在迷迭香酸合成途径中，OPc4CL2可以作用于咖啡酸和其前体对香豆酸等结构类似物生成相应的辅酶A。本发明人用丹氰胺诱导的启动子表达了OPc4CL2基因。
将Sfi I的线性化PUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒按照实施例2的方式转化到YCA-SSA-9B(-)菌株中，所获得的酿酒酵母菌株命名为YRA113-10B。在YRA113-10B摇瓶发酵培养中，分别在一开始添加浓度为0，250μM，500μM，1mM，2.5mM，5mM的丹氰胺诱导OPc4CL2转录表达。并按照实施例4分析迷迭香酸产量，结果如图4A所示，在添加1mM单氰胺时，迷迭香酸产量最高，达到了201mg/L。进一步对单氰胺的诱导时间进行了优化，结果如图4B所示，0h添加1mM单氰胺时，迷迭香酸的产量最优，随着培养时间的延长，添加相同量的单氰胺反而使迷迭香酸的产量下降了。因此在迷迭香酸的生物合成中，选择0h添加1mM单氰胺进行诱导。
由此可知，本发明通过将OPc4CL2基因的GAL10启动子替换为DDI2启动子，能够提高咖啡酰辅酶A合成酶和迷迭香酸合成酶对前体丹参素和咖啡酸的利用效率，减少副产物的产生。
综上可知，本发明一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌，其以酿酒酵母芳香族氨基酸途径为基础，在已有整合了前体咖啡酸的合成所需的三个外源基因前提上，继续整合了迷迭香酸所需的乳酸脱氢酶基因(OD-LDHY52A)、咖啡酰辅酶A合成酶基因(OPc4CL)、迷迭香酸合成酶基因(OMoRAS)，通过对细胞内限制前体合成的步骤进行调控，能够获得的稳定高产的酿酒酵母工程菌，实现葡萄糖到迷迭香酸的一步合成，无需添加其它外源前体物质，为迷迭香酸的绿色生产提供了参考，为工业化发酵生产提供基础。
通过迷迭香酸途径中基因的染色体整合，以及途径中关键限速节点的改造，大幅度提高了酿酒酵母迷迭香酸的产量，为迷迭香酸的绿色生物合成以及工业化应用奠定了基础。通过敲除酿酒酵母苯丙氨酸合成所需要的PHA2基因，即将酿酒酵母YRA113-5B中的PHA2基因敲除，能够使得酿酒酵母工程菌在生产中减少副产物的积累，提高酿酒酵母重组菌株前体物质供应。通过将OPc4CL2基因的GAL10启动子替换为DDI2启动子，能够提高咖啡酰辅酶A合成酶和迷迭香酸合成酶对前体丹参素和咖啡酸的利用效率，减少副产物的产生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaagatca tcgcttacgc tgttagagac gacgaaagac cattcttcga cacttggatg 60
aaggaaaacc cagacgttga agttaagttg gttccagaat tgttgactga agacaacgtt 120
gacttggcta agggtttcga cggtgctgac gttgctcaac aaaaggacta cactgctgaa 180
gttttgaaca agttggctga cgaaggtgtt aagaacatct ctttgagaaa cgttggtgtt 240
gacaacttgg acgttccaac tgttaaggct agaggtttga acatctctaa cgttccagct 300
tactctccaa acgctatcgc tgaattgtct gttactcaat tgatgcaatt gttgagacaa 360
actccaatgt tcaacaagaa gttggctaag caagacttca gatgggctcc agacatcgct 420
aaggaattga acactatgac tgttggtgtt atcggtactg gtagaatcgg tagagctgct 480
atcgacatct tcaagggttt cggtgctaag gttatcggtt acgacgttta cagaaacgct 540
gaattggaaa aggaaggtat gtacgttgac actttggacg aattgtacgc tcaagctgac 600
gttatcactt tgcacgttcc agctttgaag gacaactacc acatgttgaa cgctgacgct 660
ttctctaaga tgaaggacgg tgcttacatc ttgaacttcg ctagaggtac tttgatcgac 720
tctgaagact tgatcaaggc tttggactct ggtaaggttg ctggtgctgc tttggacact 780
tacgaatacg aaactaagat cttcaacaag gacttggaag gtcaaactat cgacgacaag 840
gttttcatga acttgttcaa cagagacaac gttttgatca ctccacacac tgctttctac 900
actgaaactg ctgttcacaa catggttcac gtttctatga actctaacaa gcaattcatc 960
gaaactggta aggctgacac tcaagttaag ttcgactaa 999
<210> 2
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggtgact gtgttgctcc aaaggaagac ttgatcttca gatcgaagtt gccagacatc 60
tacatcccaa agcacttgcc attgcacact tactgtttcg aaaacatctc taaggttggt 120
gacaagtctt gtttgatcaa cggtgctact ggtgaaactt tcacttactc tcaagttgaa 180
ttgttgtcta gaaaggttgc ttctggtttg aacaagttgg gtatccaaca aggtgacact 240
atcatgttgt tgttgccaaa ctctccagaa tacttcttcg ctttcttggg tgcttcttac 300
agaggtgcta tctctactat ggctaaccca ttcttcactt ctgctgaagt tatcaagcaa 360
ttgaaggctt ctttggctaa gttgatcatc actcaagctt gttacgttga caaggttaag 420
gactacgctg ctgaaaagaa catccaaatc atctgtatcg acgacgctcc acaagactgt 480
ttgcacttct ctaagttgat ggaagctgac gaatctgaaa tgccagaagt tgttatcgac 540
tctgacgacg ttgttgcttt gccatactct tctggtacta ctggtttgcc aaagggtgtt 600
atgttgactc acaagggttt ggttacttct gttgctcaac aagttgacgg tgacaaccca 660
aacttgtaca tgcactctga agacgttatg atctgtatct tgccattgtt ccacatctac 720
tctttgaacg ctgttttgtg ttgtggtttg agagctggtg ttactatctt gatcatgcaa 780
aagttcgaca tcgttccatt cttggaattg atccaaaagt acaaggttac tatcggtcca 840
ttcgttccac caatcgtttt ggctatcgct aagtctccag ttgttgacaa gtacgacttg 900
tcttctgtta gaactgttat gtctggtgct gctccattgg gtaaggaatt ggaagacgct 960
gttagagcta agttcccaaa cgctaagttg ggtcaaggtt acggtatgac tgaagctggt 1020
ccagttttgg ctatgtgttt ggctttcgct aaggaaccat acgaaatcaa gtctggtgct 1080
tgtggtactg ttgttagaaa cgctgaaatg aagatcgttg acccagaaac taacgcttct 1140
ttgccaagaa accaaagagg tgaaatctgt atcagaggtg accaaatcat gaagggttac 1200
ttgaacgacc cagaatctac tagaactact atcgacgaag aaggttggtt gcacactggt 1260
gacatcggtt tcatcgacga cgacgacgaa ttgttcatcg ttgacagatt gaaggaaatc 1320
atcaagtaca agggtttcca agttgctcca gctgaattgg aagctttgtt gttgactcac 1380
ccaactatct ctgacgctgc tgttgttcca atgatcgacg aaaaggctgg tgaagttcca 1440
gttgctttcg ttgttagaac taacggtttc actactactg aagaagaaat caagcaattc 1500
gtttctaagc aagttgtttt ctacaagaga atcttcagag ttttcttcgt tgacgctatc 1560
ccaaagtctc catctggtaa gatcctcaga aaggacttga gagctaagat cgcttctggt 1620
gacttgccaa agtaa 1635
<210> 3
<211> 1284
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgagaatcg acatcaagga ctctactatg gttaagccag ctgctgaaac tccaggtggt 60
tctgtttggt tgactaactt ggacttgttg tctccagcta actaccacac tttgtctgtt 120
cacttctacc accacgacgg ttctgaaaac ttcttcgacg ctgctgcttt gaaggaagct 180
ttgtctagag ctttggttga cttctaccca tacgctggta gattgaagtt gaaggacaac 240
agattggaaa tcgactgtaa cggtgaaggt gttttgttgg ttgaagctga atctgacggt 300
gctttggctg aattgggtga attcgctcca agaccagact tgaacttgat cccacaagtt 360
gactacgcta agggtatctc tacttaccca ttgatgttgt tccaattgac tagattcaag 420
tgtggtggtg ttggtttggg tgttgctaac gaacaccact tgtctgacgg tgttgctgct 480
ttgcacttca tcaacacttg ggctcacttg gctagaggtg ttccagctcc atctccacca 540
ccagttttcg acagaagatc tttgtctgct agaaacccac caaagccaca attctctcac 600
gctgaatacc aaccaccacc aactttgcca actccattga ctgacactgc tatcgcttac 660
tctaagttga aggttactag agaccaattg ggtgctttga aggctaagtg tttggctggt 720
gacccatctg gtaagccaag atctactttc gaagttttgg ctggtcacat ctggagatgt 780
gtttgtgctg ctagaggttt gccagaagac caagaaacta agttgcacat cccattcgac 840
ggtagagcta agttgagatt gccaccaggt tacttcggta acgctatctt cttcgctact 900
ccagttgcta cttgtggtga aatcgaatct aactctttgg ctcacgctgt taagagagtt 960
ggtgacgcta tcgctagatt ggacgaagac tacttgagat cttctatcga cttcttggaa 1020
ttgcaagaag acatctctaa gttggctcaa ggtgctcact ctttcagatg tccaaacttg 1080
tgggttatct cttgggttag attgccagtt tacgaaccag acttcggttg gggtaaggct 1140
gtttacatgg gtccatgggc tgctccattc gaaggtaagt cttacttgtt gccaaaccca 1200
gacaacgacg gttctttgtt cgttgctatc actttgcaca ctcaacacat ggaaagattc 1260
gaaaagttgt tctacgaaat ctaa 1284
<210> 4
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Ile Ile Ala Tyr Ala Val Arg Asp Asp Glu Arg Pro Phe Phe
1 5 10 15
Asp Thr Trp Met Lys Glu Asn Pro Asp Val Glu Val Lys Leu Val Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Thr Glu Asp Asn Val Asp Leu Ala Lys Gly Phe Asp Gly
35 40 45
Ala Asp Val Ala Gln Gln Lys Asp Tyr Thr Ala Glu Val Leu Asn Lys
50 55 60
Leu Ala Asp Glu Gly Val Lys Asn Ile Ser Leu Arg Asn Val Gly Val
65 70 75 80
Asp Asn Leu Asp Val Pro Thr Val Lys Ala Arg Gly Leu Asn Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Ala Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr
100 105 110
Gln Leu Met Gln Leu Leu Arg Gln Thr Pro Met Phe Asn Lys Lys Leu
115 120 125
Ala Lys Gln Asp Phe Arg Trp Ala Pro Asp Ile Ala Lys Glu Leu Asn
130 135 140
Thr Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala
145 150 155 160
Ile Asp Ile Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Gly Tyr Asp Val
165 170 175
Tyr Arg Asn Ala Glu Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala
195 200 205
Leu Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asn Ala Asp Ala Phe Ser Lys Met
210 215 220
Lys Asp Gly Ala Tyr Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Ile Asp
225 230 235 240
Ser Glu Asp Leu Ile Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala
245 250 255
Ala Leu Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Thr Lys Ile Phe Asn Lys Asp Leu
260 265 270
Glu Gly Gln Thr Ile Asp Asp Lys Val Phe Met Asn Leu Phe Asn Arg
275 280 285
Asp Asn Val Leu Ile Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Glu Thr Ala
290 295 300
Val His Asn Met Val His Val Ser Met Asn Ser Asn Lys Gln Phe Ile
305 310 315 320
Glu Thr Gly Lys Ala Asp Thr Gln Val Lys Phe Asp
325 330
<210> 5
<211> 544
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gly Asp Cys Val Ala Pro Lys Glu Asp Leu Ile Phe Arg Ser Lys
1 5 10 15
Leu Pro Asp Ile Tyr Ile Pro Lys His Leu Pro Leu His Thr Tyr Cys
20 25 30
Phe Glu Asn Ile Ser Lys Val Gly Asp Lys Ser Cys Leu Ile Asn Gly
35 40 45
Ala Thr Gly Glu Thr Phe Thr Tyr Ser Gln Val Glu Leu Leu Ser Arg
50 55 60
Lys Val Ala Ser Gly Leu Asn Lys Leu Gly Ile Gln Gln Gly Asp Thr
65 70 75 80
Ile Met Leu Leu Leu Pro Asn Ser Pro Glu Tyr Phe Phe Ala Phe Leu
85 90 95
Gly Ala Ser Tyr Arg Gly Ala Ile Ser Thr Met Ala Asn Pro Phe Phe
100 105 110
Thr Ser Ala Glu Val Ile Lys Gln Leu Lys Ala Ser Leu Ala Lys Leu
115 120 125
Ile Ile Thr Gln Ala Cys Tyr Val Asp Lys Val Lys Asp Tyr Ala Ala
130 135 140
Glu Lys Asn Ile Gln Ile Ile Cys Ile Asp Asp Ala Pro Gln Asp Cys
145 150 155 160
Leu His Phe Ser Lys Leu Met Glu Ala Asp Glu Ser Glu Met Pro Glu
165 170 175
Val Val Ile Asp Ser Asp Asp Val Val Ala Leu Pro Tyr Ser Ser Gly
180 185 190
Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Leu Thr His Lys Gly Leu Val
195 200 205
Thr Ser Val Ala Gln Gln Val Asp Gly Asp Asn Pro Asn Leu Tyr Met
210 215 220
His Ser Glu Asp Val Met Ile Cys Ile Leu Pro Leu Phe His Ile Tyr
225 230 235 240
Ser Leu Asn Ala Val Leu Cys Cys Gly Leu Arg Ala Gly Val Thr Ile
245 250 255
Leu Ile Met Gln Lys Phe Asp Ile Val Pro Phe Leu Glu Leu Ile Gln
260 265 270
Lys Tyr Lys Val Thr Ile Gly Pro Phe Val Pro Pro Ile Val Leu Ala
275 280 285
Ile Ala Lys Ser Pro Val Val Asp Lys Tyr Asp Leu Ser Ser Val Arg
290 295 300
Thr Val Met Ser Gly Ala Ala Pro Leu Gly Lys Glu Leu Glu Asp Ala
305 310 315 320
Val Arg Ala Lys Phe Pro Asn Ala Lys Leu Gly Gln Gly Tyr Gly Met
325 330 335
Thr Glu Ala Gly Pro Val Leu Ala Met Cys Leu Ala Phe Ala Lys Glu
340 345 350
Pro Tyr Glu Ile Lys Ser Gly Ala Cys Gly Thr Val Val Arg Asn Ala
355 360 365
Glu Met Lys Ile Val Asp Pro Glu Thr Asn Ala Ser Leu Pro Arg Asn
370 375 380
Gln Arg Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly Asp Gln Ile Met Lys Gly Tyr
385 390 395 400
Leu Asn Asp Pro Glu Ser Thr Arg Thr Thr Ile Asp Glu Glu Gly Trp
405 410 415
Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Phe Ile Asp Asp Asp Asp Glu Leu Phe
420 425 430
Ile Val Asp Arg Leu Lys Glu Ile Ile Lys Tyr Lys Gly Phe Gln Val
435 440 445
Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ala Leu Leu Leu Thr His Pro Thr Ile Ser
450 455 460
Asp Ala Ala Val Val Pro Met Ile Asp Glu Lys Ala Gly Glu Val Pro
465 470 475 480
Val Ala Phe Val Val Arg Thr Asn Gly Phe Thr Thr Thr Glu Glu Glu
485 490 495
Ile Lys Gln Phe Val Ser Lys Gln Val Val Phe Tyr Lys Arg Ile Phe
500 505 510
Arg Val Phe Phe Val Asp Ala Ile Pro Lys Ser Pro Ser Gly Lys Ile
515 520 525
Leu Arg Lys Asp Leu Arg Ala Lys Ile Ala Ser Gly Asp Leu Pro Lys
530 535 540
<210> 6
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Arg Ile Asp Ile Lys Asp Ser Thr Met Val Lys Pro Ala Ala Glu
1 5 10 15
Thr Pro Gly Gly Ser Val Trp Leu Thr Asn Leu Asp Leu Leu Ser Pro
20 25 30
Ala Asn Tyr His Thr Leu Ser Val His Phe Tyr His His Asp Gly Ser
35 40 45
Glu Asn Phe Phe Asp Ala Ala Ala Leu Lys Glu Ala Leu Ser Arg Ala
50 55 60
Leu Val Asp Phe Tyr Pro Tyr Ala Gly Arg Leu Lys Leu Lys Asp Asn
65 70 75 80
Arg Leu Glu Ile Asp Cys Asn Gly Glu Gly Val Leu Leu Val Glu Ala
85 90 95
Glu Ser Asp Gly Ala Leu Ala Glu Leu Gly Glu Phe Ala Pro Arg Pro
100 105 110
Asp Leu Asn Leu Ile Pro Gln Val Asp Tyr Ala Lys Gly Ile Ser Thr
115 120 125
Tyr Pro Leu Met Leu Phe Gln Leu Thr Arg Phe Lys Cys Gly Gly Val
130 135 140
Gly Leu Gly Val Ala Asn Glu His His Leu Ser Asp Gly Val Ala Ala
145 150 155 160
Leu His Phe Ile Asn Thr Trp Ala His Leu Ala Arg Gly Val Pro Ala
165 170 175
Pro Ser Pro Pro Pro Val Phe Asp Arg Arg Ser Leu Ser Ala Arg Asn
180 185 190
Pro Pro Lys Pro Gln Phe Ser His Ala Glu Tyr Gln Pro Pro Pro Thr
195 200 205
Leu Pro Thr Pro Leu Thr Asp Thr Ala Ile Ala Tyr Ser Lys Leu Lys
210 215 220
Val Thr Arg Asp Gln Leu Gly Ala Leu Lys Ala Lys Cys Leu Ala Gly
225 230 235 240
Asp Pro Ser Gly Lys Pro Arg Ser Thr Phe Glu Val Leu Ala Gly His
245 250 255
Ile Trp Arg Cys Val Cys Ala Ala Arg Gly Leu Pro Glu Asp Gln Glu
260 265 270
Thr Lys Leu His Ile Pro Phe Asp Gly Arg Ala Lys Leu Arg Leu Pro
275 280 285
Pro Gly Tyr Phe Gly Asn Ala Ile Phe Phe Ala Thr Pro Val Ala Thr
290 295 300
Cys Gly Glu Ile Glu Ser Asn Ser Leu Ala His Ala Val Lys Arg Val
305 310 315 320
Gly Asp Ala Ile Ala Arg Leu Asp Glu Asp Tyr Leu Arg Ser Ser Ile
325 330 335
Asp Phe Leu Glu Leu Gln Glu Asp Ile Ser Lys Leu Ala Gln Gly Ala
340 345 350
His Ser Phe Arg Cys Pro Asn Leu Trp Val Ile Ser Trp Val Arg Leu
355 360 365
Pro Val Tyr Glu Pro Asp Phe Gly Trp Gly Lys Ala Val Tyr Met Gly
370 375 380
Pro Trp Ala Ala Pro Phe Glu Gly Lys Ser Tyr Leu Leu Pro Asn Pro
385 390 395 400
Asp Asn Asp Gly Ser Leu Phe Val Ala Ile Thr Leu His Thr Gln His
405 410 415
Met Glu Arg Phe Glu Lys Leu Phe Tyr Glu Ile
420 425
<210> 7
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcaaaggtt aaactcgctt agactatgtc tataatataa aaaaaaaata gctctattcc 60
gtttctttta ttctatttga tatttccatc acactttcat cttaatcacg gatgtatact 120
gataataggg ttgactgcgc ctgtacggat tacagtgccc tcttcaattg gaaaatccaa 180
gctttcaaga tgggtaactg ttattcaaag gatcctctaa gataaaacac agatcgacag 240
atccgagagt tggcttctgt gccttgggct caaattcctt tcccacctca tgcaaattga 300
tttttctgac tccaaaaaaa gacagagccc tgcgatagtt cccgaatgtt gtaacatcaa 360
agccaagcac tcctttatag aagtcgcatg aacgttgaat actagcagct ggtgaaacta 420
cagggtctaa actaactagt atccatatct ttttgagagc attgaaagta tacggagtac 480
aagctgggtt agaaggaatt tttatcttaa cagcaatgaa aatcaacttt ctagactgaa 540
tccctcaaga aaattgcaaa agactaactg atactggttt aaaagagaaa gatgtcaaat 600
atgcggagtt ataccatcaa acaactttgg acggccccga aacaaatgtc cgcaaaaaag 660
atcttattaa agtgcatgga cactatcatt tctataatac aaaatactcc accgcacaat 720
agtttgtcgg gaagtcatca atcaatcttg tacgagcttt acaaataact ttttaggatc 780
ggtcccctca taaaattata tataaatggg ttagtttcct tcttcttctg ttaacatgaa 840
gttgcttcgt actgtttttt gccttgcttc tcttcaaaag aatcaatc 888

Claims (4)

1.一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌在基因组中整合了OD-LDHY52A基因、OPc4CL2基因和OMoRAS基因，并敲除了PHA2基因；
所述OD-LDHY52A基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述OPc4CL2基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述OMoRAS基因的碱基序列如SEQ ID NO：3所示；
所述OD-LDHY52A基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述OPc4CL2基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述OMoRAS基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述OPc4CL2基因的GAL10启动子被替换为DDI2启动子，所述DDI2启动子的基因序列如SEQ ID NO：7所示；
所述构建方法包括如下步骤：
重组载体pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A和pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒的获得；
将重组载体pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A导入酿酒酵母YCA113-8B中，得到YCA-SSA-5B菌株；将酿酒酵母YCA-SSA-5B中的URA3和KanMX基因丢失，并敲除PHA2基因，得到YCA-SSA-9B(-)菌株；
将pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒导入YCA-SSA-9B(-)中，得到YRA113-10B菌株；
所述重组载体pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A的构建步骤包括：
利用引物UPPDC5-F：AAAGCTGGAGCTGGCCTTGTGTTCTTCTTGTTATTGTATTGTG、UPPDC5-R：
CTTACATCTTATTTAGAATAGGCCTTTATGGCCAAGGAAATAAAGCAAATAAC和DNPDC5-F：GTTATTTGCTTTATTTCCTTGGCCATAAAGGCCTATTCTAAATAAGATGTAAGGCC、DNPDC5-R：TAATAGCGAAGAGGCCTACAGCTAATTAACATAAAACTCATG，分别从酿酒酵母BY4741的基因组上扩增出497bp的UpPDC5同源臂和500bp的DnPDC5同源臂，所述497bp的UpPDC5同源臂位置为ChrⅫ:410219到410720；所述500bp的DnPDC5同源臂位置为ChrIV:412414到412987；以上述两个片段为模板，UPPDC5-F/DNPDC5-R为引物，采用融合PCR技术扩增出HAPDC5同源臂片段；
利用引物PUMRI-PDC5-F：AATACAATAACAAGAAGAACACAAGGCCAGCTCCAGCT、PUMRI-PDC5-R：TGAGTTTTATGTTAATTAGCTGTAGGCCTCTTCGCTATTA，以PUMRI-11为模板扩增出质粒骨架大片段；以该大片段和同源臂片段互为引物，互为模板，采用融合PCR技术扩增出质粒PUMRI-△PDC5；所述PUMRI-11的序列为GenBank:KM216413.1；
以密码子优化后合成的基因OD-LDH为模板，用带有BamH I识别位点的识别序列引物OD-LDH-F、OD-LDHY52A-R：GTGTAGTCCTTTTGTTGagcAACGTCAGCACCGTCGAAAC和带有Sal I识别位点的识别序列引物OD-LDHY52A-F：TCGACGGTGCTGACGTTgctCAACAAAAGGACTACACTGC、OD-LDH-R，通过融合PCR扩增得到突变基因OD-LDHY52A；将突变基因用BamH I和SalI双酶切，得到的片段与同样BamH I和SalI双酶切的pUMRI-△PDC5质粒连接做转化，构建得到pUMRI-△PDC5-OD-LDHY52A质粒；
所述的pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒构建方法包括：
用带有EcoRI识别位点的识别序列引物PDDI2-F：GCGGAATTCGATTGATTCTTTTGAAGAGAAGCA、PGAL1-DDI2-R：AGTGCGGCGCGAGGCACATTCAAAGGTTAAACTCGCTTAGA和带有Sma I识别位点的识别序列引物PDDI2-GAL1-F：TAGTCTAAGCGAGTTTAACCTTTGAATGTGCCTCGCGCCGCACT、PGAL1-R：TCCCCCGGGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGT，以BY4741基因组为模板，通过两轮PCR，构建双向启动子PGAL1-PDDI2，并用EcoRI和Sma I进行双酶切，与同样双酶切的PUMRI-15进行连接转化，得到PUMRI-30质粒；将OPc4CL2用EcoR I和Sac I进行双酶切，得到的片段与EcoR I和SacI双酶切的pUMRI-30质粒按照进行连接转化，构建得到pUMRI-30-OPc4CL2质粒；
OMoRAS用Sma I和Sal I进行双酶切，得到的片段与Sma I和Xho I双酶切的pUMRI-30-OPc4CL2的质粒进行连接转化，分别构建得到pUMRI-30-OPc4CL2-OMoRAS质粒。
2.一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，采用权利要求1所述方法构建而成。
3.根据权利要求2所述的生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌在迷迭香酸生产中的应用。
4.一种迷迭香酸的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括将权利要求2所述的酿酒酵母工程菌进行发酵培养。
CN202111674112.1A 2021-12-31 2021-12-31 一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用 Active CN114410494B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111674112.1A CN114410494B (zh) 2021-12-31 2021-12-31 一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111674112.1A CN114410494B (zh) 2021-12-31 2021-12-31 一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114410494A CN114410494A (zh) 2022-04-29
CN114410494B true CN114410494B (zh) 2024-04-16

Family

ID=81271721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111674112.1A Active CN114410494B (zh) 2021-12-31 2021-12-31 一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114410494B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108546722A (zh) * 2018-04-24 2018-09-18 上海中医药大学 一种利用丹参功能基因从头生物合成迷迭香酸的方法
CN111849794A (zh) * 2020-06-29 2020-10-30 扬州大学 一种酿酒酵母重组菌及其构建方法和应用
CN111876447A (zh) * 2019-06-25 2020-11-03 陕西鸿道生物分析科学技术研究院有限公司 一种生产迷迭香酸的菌株及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108546722A (zh) * 2018-04-24 2018-09-18 上海中医药大学 一种利用丹参功能基因从头生物合成迷迭香酸的方法
CN111876447A (zh) * 2019-06-25 2020-11-03 陕西鸿道生物分析科学技术研究院有限公司 一种生产迷迭香酸的菌株及方法
CN111849794A (zh) * 2020-06-29 2020-10-30 扬州大学 一种酿酒酵母重组菌及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Engineered synthesis of rosmarinic acid in Escherichia coli resulting production of a new intermediate, caffeoyl-phenyllactate;Jingjie Jiang等;Biotechnol Lett.;第38卷(第1期);摘要，第82页右栏第1段，第86页左栏第3段 *
Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Rosmarinic Acid Production;Mahsa Babaei等;ACS Synth Biol.;第9卷(第8期);摘要，第1982页第1985页左栏最后一段至右栏第一段，图2及注释 *
Utilization of a Strongly Inducible DDI2 Promoter to Control Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae;Aiyang Lin等;Front Microbiol.;第9卷;第2页左栏最后一段，第10页左栏第2段、右栏第2段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114410494A (zh) 2022-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111849794B (zh) 一种酿酒酵母重组菌及其构建方法和应用
CN110468092B (zh) 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN108699547B (zh) 一种高产cAMP的酵母菌株及其应用
CN110373370B (zh) 一种耦合atp再生系统的催化体系及其在生产谷胱甘肽过程中的应用
CN113755354A (zh) 利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途
CN115851810A (zh) 酿酒酵母从头合成柚皮素工程菌株及其构建方法与应用
WO2022174597A1 (zh) 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
CN107287144B (zh) 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
CN111057672B (zh) 重组菌株及其应用
CN111235136B (zh) 异柠檬酸裂合酶突变体及其在制备芳香族氨基酸中的应用
CN110305855B (zh) 天麻GeCPR基因及其应用
KR102473375B1 (ko) 재조합 미생물, 그 제조방법 및 보효소 q10의 생산에 있어서 그의 사용
CN114410494B (zh) 一种生产迷迭香酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
CN111154665A (zh) 一株重组解脂耶罗维亚酵母及其构建方法和应用
CN115058374B (zh) 一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用
CN115960812A (zh) 一种高产l-岩藻糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN112961815B (zh) 一种高产四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
CN110499259B (zh) 一种解酯耶氏酵母yw100-1及其应用
CN108424859B (zh) 生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用
CN112266892B (zh) AroG的突变体及其在产氨基酸基因工程菌中的应用
CA3068459A1 (en) Microorganism with stabilized copy number of functional dna sequence and associated methods
CN114525291B (zh) 一种羰基还原酶及利用该酶制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法
CN115125180B (zh) 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用
CN116179380A (zh) 一种高产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌wsmhp、构建方法及应用
CN116479032A (zh) 一种长寿酶的生物制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant