CN115058374B

CN115058374B - 一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN115058374B
Application number: CN202210569427.8A
Authority: CN
Inventors: 马媛媛; 宋浩; 户东升
Original assignee: Tianjin University; Frontier Technology Research Institute of Tianjin University Co Ltd
Current assignee: Tianjin University; Frontier Technology Research Institute of Tianjin University Co Ltd
Priority date: 2022-05-24
Filing date: 2022-05-24
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2042-05-24
Also published as: CN115058374A

Abstract

本发明公开了一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用，在运动发酵单胞菌中建立乙偶姻生产途径。丙酮酸在乙酰乳酸合成酶ALS、α‑乙酰乳酸脱羧酶ALDC的催化下生成乙偶姻。通过将上述酶构建至运动发酵单胞菌中，能够简洁快速的实现乙偶姻的生物合成。而且运动发酵单胞菌属于安全微生物，对发酵设备无特殊要求，具有广泛应用前景。

Description

一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程领域，更确切的说，本发明涉及异源生物合成乙偶姻的代谢途径，即一种能产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用。

背景技术

乙偶姻(acetoin)又名甲基乙酰甲醇，是一种重要的香精香料物质，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后会有令人愉悦的奶香气。国家标准 GB2760-1986规定为可以使用的食品香料，美国食品香料和FEMA安全号为 2008，国内外常将其用作各种食品的香味增强剂以及配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精^[1]。作为美国能源部30种优先开发利用的平台化合物之一，乙偶姻广泛应用于食品、烟草、化妆品、植物、医药和化工领域^[2]。乙偶姻的制备可以通过从含乙偶姻的植物中提取以及化学合成法和酶转化法^[3]。由于能源和环境的恶化以及化学合成的乙偶姻作为食品添加剂存在健康隐患，因此化学合成法不能满足人们的需求；而酶催化法和植物提取仍然无法克服成本高昂的缺点，因此也不能应用于工业化生产。

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是一种天然生产乙醇的兼性厌氧革兰氏阴性菌，由Barker和Hmer从变质的苹果酒中分离出来。具有生长速度快，糖利用率高，高酒精耐受性，适应广泛的pH范围(pH3.5-7.5)。作为GRAS微生物，其优良的菌株特性和代谢途径，以及通过对它遗传元件的研究和遗传操作的开发，使其在生物合成上有着广泛的应用，除了生产乙醇外，还用于生产其他高附加值产品，例如异丁醇、2,3-丁二醇、果聚糖、甘油、乙烯、丁二酸和琥珀酸等^[4-5]。

参考文献：

[1]Xiao Z,Lu JR.Generation of acetoin and its derivatives in foods.JAgric Food Chem.2014,16；62(28):6487-97.

[2]Gao C,Zhang L J,Xie Y J,etal.Production of(3S)-acetion fromdiacetyl by using stereoselective NADPH-dependent carbonyl reductase andglucose dehydrogenase[J].Bioresour Technol,2013,137:111-115

[3]Ji X J,Xia Z F,Fu N H,et al.Cofactor engineering throughheterologous expression of an NADH oxidase and its impact on metabolic fluxredistribution in Klebsiella pneumonia[J].Biotechnology for biofuels,2013,6(1):7.

[4]Yang S,Mohagheghi A,Franden MA,Chou YC,Chen X,Dowe N,Himmel ME,Zhang M.Metabolic engineering of Zymomonas mobilis for 2,3-butanediolproduction from lignocellulosic biomass sugars.Biotechnol Biofuels.2016Sep 2；9(1):189.

[5]Liu Y,Ghosh IN,Martien J,Zhang Y,Amador-Noguez D,Landick R.Regulated redirection of central carbon flux enhances anaerobic production ofbioproducts in Zymomonas mobilis[J].Metab Eng.2020Sep；61:261-274.

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用，解决现有技术中乙偶姻生产存在健康隐患，以及成本高昂不能应用于工业化生产的问题。

本发明的技术方案概述如下：

一种能够生产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌，含有编码乙酰乳酸合成酶ALS 和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC的表达载体；宿主菌为运动发酵单胞菌。

所述乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC来自于枯草芽孢杆菌，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述表达载体为pEZ15Asp、pHW20a或pZA22。

所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，将异源的乙酰乳酸合成酶ALS和α- 乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因连接在表达载体上，转入运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌；或者将乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶 ALDC基因乙构建至运动发酵单胞菌基因组上，获得利用alsSD途径生产乙偶姻的基因工程菌株。

另一种构建方法为：构建分别由启动子P_tet、P_pdc、P_tuf、P_zwf、P_eda、P_eno、P_clcd、 P_ppc和P_xsea调控由乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC组成的alssD操纵子的单操纵子表达盒；或乙酰乳酸合成酶由启动子P_tet、P_pdc、P_tuf、P_zwf、P_eda、 P_eno、P_clcd调控，α-乙酰乳酸脱羧酶由P_gap启动子调控的双启动子表达盒，将构建的表达盒转化至运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌。

作为优选，在上述获得重组运动发酵单胞菌中敲除生产菌株中的竞争代谢途径乙醇脱氢酶基因adhB、乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl、葡萄糖-果糖氧化还原酶基因gfo、柠檬酸裂合酶cl和过氧化氢酶cat，获得工程菌株。

所述的重组运动发酵单胞菌在生产乙偶姻中的应用。

一种重组运动发酵单胞菌生产乙偶姻的方法，包括以下步骤：

(1)制备权利要求1所述重组运动发酵单胞菌；

(2)发酵培养所述重组运动发酵单胞菌，发酵液中得到乙偶姻。

所述发酵培养是指按照初始接种密度为OD₆₀₀＝0.15将工程菌接种于发酵培养基，培养温度为30℃，并在150rpm的摇床速度下以及20g/L－100g/L葡萄糖浓度下的条件下发酵。

有益效果：本发明选择来源于细菌的外源酶，选用改造过的细菌作为宿主细胞，最终实现了乙偶姻的生产。本发明在运动发酵单胞菌中建立乙偶姻生产途径：丙酮酸在乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC的催化下生成乙偶姻 (图1)。通过将编码上述酶的基因构建至运动发酵单胞菌中，能够简洁快速的实现乙偶姻的生物合成。而且运动发酵单胞菌属于安全微生物，对发酵设备无特殊要求，具有广泛应用前景。本发明选择了催化效率较高的酶在运动发酵单胞菌 CP4中表达，人工设计了新的乙偶姻的合成途径，获得重组菌株，优化发酵条件，实现乙偶姻在重组菌株中的生产，为乙偶姻的生物合成提供了新思路。

附图说明

图1乙偶姻合成代谢图；

图2质粒pP_tetsc电泳鉴定和pP_tetsc质粒图谱；A：1泳道：Marker III；2泳道：使用引物对pEZ-F/pEZ-R对菌株进行PCR鉴定；B：pE-P_tet-alssD质粒图谱；

图3重组菌株CP4(pP_tetsc)乙偶姻发酵；A在0rpm、150rpm条件下的乙偶姻发酵产量；B在12％、20％装液量条件下的乙偶姻发酵产量；*代表p<0.05，具有极显著统计学差异；

图4单启动子调控alsSD操纵子表达菌株的乙偶姻发酵产量；**代表p<0.01，具有极显著统计学差异；

图5双启动子重组菌株发酵评价；A双操纵子过表达菌株发酵乙偶姻产量； B单双启动子过表达菌株产量对比，浅灰色为单操纵子过表达菌株的乙偶姻产量，深灰色为对应双操纵子过表达菌株的乙偶姻产量；**代表p<0.01，具有极显著统计学差异；

图6在副产物基因缺失菌株中的生长曲线和乙偶姻产量；A：各工程菌株生长曲线；B：工程菌株的乙偶姻产量，**代表p<0.01，具有显著统计学差异；

具体实施方式

乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶基因：alsS和alsD基因组成alsSD操纵子

大肠杆菌DH5α感受态(博迈德公司)

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

表达载体为：pEZ15Asp(pE)

下面通过实施例来详细阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。

实施例1构建诱导型启动子调控乙偶姻合成alssD操纵子的重组质粒

枯草芽孢杆菌的alsS基因和alsD基因分别编码乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶，这两个酶能够催化丙酮酸转化为乙偶姻。由北京擎科新业生物技术有限公司对alssD核酸序列进行密码子优化，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，并将优化后的合成基因连接至载体pUC57，得到质粒pUC57-alssD。

用引物alssD-SLF(SEQ ID NO.2)和alssD-SLR(SEQ ID NO.3)，以质粒 puc57-alssD为模板，使用高保真酶FastPfu DNA Polymerase酶扩增 alssD表达盒片段。以Ptet片段为模板，使用引物对alsSD-SRF(SEQ ID NO.4) /alsSD-SRR(SEQ ID NO.5)扩增P_tet启动子片段(SEQ ID NO.6)。在200μL的PCR管中配制50μL反应体系：10μL 的FastPfu Buffer，1μL 的上游引物alssD-SLF，1μL 的上游引物alssD-SRR，1μL的dNTP Mix，1μL的 />FastPfu DNA Polymerase，和32μL无菌水。PCR反应热循环程序为 95℃预变性2min，95℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸3min，终延伸5min。使用NEB公司的EcoR I-HF和Pst I-HF限制性内切酶双切pE质粒，电泳后用天根公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标载体片段。使用即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程公司)将片段和载体连接，在冰盒上按照表1连接体系添加各组分：

表1

将装有目的片段和线性化质粒的混合物在50℃下反应20min，反应结束后，将离心管置于冰上待转化。取5μl反应后的溶液转化至DH5α感受态细胞，复苏1h后，涂布在含有100μg/mL壮观霉素的LB平板上，在37℃的培养箱中培养12-16h。挑取平板上的转化子进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系，包括：25 μL的2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)，2μL的上游引物pEZ-F(SEQ ID NO.7)， 2μL的上游引物pEZ-R(SEQ ID NO.8)和补无菌水至50μL。PCR反应热循环程序为95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min。配置1％琼脂糖凝胶(1％琼脂，1.5‰EB，TAE缓冲液)。取5–10μLPCR产物点样，130V电泳25min(图 2A)。说明已经成功将P_tet-alssD表达盒整合到pE质粒上，选择正确的转化子转命名为DH5α(pP_tetsc)，送至北京擎科生物科技有限公司测序(图2B)。

实施例2构建含诱导型alssD途径的重组运动发酵单胞菌

取CP4甘油菌活化，当生长至OD₆₀₀＝2.5–2.6按约1/25的体积比转接于40ml RM培养基中，30℃静置培养至OD₆₀₀＝0.3–0.4。将40ml菌液转移至在4℃遇冷的50ml离心管中，冰浴10min，在4℃下1500g(3555rpm/min)离心10min，倒掉上清，将离心管倒置在灭菌的吸水纸上去除管壁上残留的液体。细胞沉淀先用20ml冰浴的无菌水洗涤1次，在4℃下1500g(3555rpm/min)离心10min，倒掉上清。用20ml冰浴的10％甘油重悬细胞沉淀两次，离心操作同上。用400 μl冰冷的10％甘油重悬细胞，然后按100μl/管分装到遇冷的1.5ml EP管中，用于转化。

取5μl pP_tetsc质粒(约150ng)与50μl运动发酵单胞菌CP4感受态细胞混匀，转移到4℃(也可以是0–4℃中的任意温度)预冷的电极杯中，冰浴5min，电压1800V，用eppendorf公司的电转仪进行转化，电击5ms，电击后立即向电击杯中加入500μL提前在30℃预热的RM培养基。将混合物转移到1.5mL离心管中，在30℃下静置复苏10h。在含有100μg/mL的RM平板上涂200μL(也可以是在100μL–200μL中任一数值)复苏菌液，30℃倒置培养直至转化子出现。使用引物PEZ-F如序列表中SEQ ID NO.7、引物PEZ-R如序列表中SEQ IDNO.8，按照实施例1中的菌落PCR鉴定方法鉴定转化子，从而获得生产乙偶姻的基因工程菌CP4(pP_tetsc)。

RM培养基为20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，2g/L磷酸二氢钾，余量为水。

RM固体培养基为20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，2g/L磷酸二氢钾，18g/L 琼脂，余量为水。

实施例3重组运动发酵单胞菌CP4(pP_tetsc)的发酵条件优化

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取菌株CP4(pE)和实施例2得到的重组菌株CP4(pP_tetsc)的甘油菌60 μl置于3ml含100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

②将新鲜的种子液浓缩至OD₆₀₀＝20，取225μl浓缩的菌液接种至30ml新鲜 RM培养基(100μg/mL壮观霉素)中；取375μl浓缩的菌液接种至50ml新鲜RM 培养基(100μg/mL壮观霉素)中，初始OD₆₀₀控制在0.15。在发酵起始(0h) 加入四环素诱导剂终浓度为1μg/mL。转速设计为0rpm或150rpm，培养温度为 30℃。

③测定色谱条件：使用带保护柱的Aminex HPX-87H分离柱，流动相为4mM 硫酸，流速为0.6ml/min，柱温40℃，RID光学单元温度40℃，VWD检测波长为280nm，样品处理时间为25min。

菌株CP4(pE)和CP4(pP_tetsc)在静置条件下的乙偶姻产量较低分别为0.32 g/L和0.36g/L，而对应的副产物乙醇产量分别达到7.8g/L和6.2g/L。说明在厌氧条件下主要的副产物是乙醇，不利于乙偶姻的生产。在150rpm条件下 CP4(pP_tetsc)乙偶姻产量显著提升至2.99g/L，比对照菌株CP4(pE)提高了20％，对应的乙醇产量下降至2.2g/L(图3A)。

选择在12％和20％的装液体积下进行发酵优化。菌株CP4(pP_tetsc)在12％的装液量下的乙偶姻产量最高，约为3.26g/L(图3B)，比20％装液量的乙偶姻产量提高了9％，比野生型对照菌株CP4(pE)提高了25％。引入的异源基因alsS和 alsD编码的酶能够催化丙酮酸转化为乙偶姻，并且在有氧条件下更有利于乙偶姻的生产。目前最适的发酵条件为150rpm下12％的装液量。

实施例4组成型启动子调控alssD操纵子表达盒的构建

以CP4基因组为模板，按照实施例1中扩增表达盒的PCR反应体系使用高保真酶扩增启动子P_pdc、P_tuf、P_zwf、P_eda、P_eno、P_clcd、P_ppc和P_xsea片段。引物Ppdcals-LF (SEQ ID NO.9)和Ppdcals-LF(SEQ ID NO.10)用于扩增P_pdc启动子，该启动子的DNA序列见序列表的SEQ IDNO.11；引物Ptufals-LF(SEQ ID NO.12)和 Ppdcals-LF(SEQ ID NO.13)用于扩增P_tuf启动子，该启动子的DNA序列见序列表的SEQ ID NO.14；引物Penoals-LF(SEQ ID NO.15)和Penoals-LF(SEQ ID NO.16)用于扩增P_eno启动子，该启动子的DNA序列见序列表的SEQ IDNO.17；引物Pedaals-LF(SEQ ID NO.18)和Pedaals-LF(SEQ ID NO.19)扩增P_eda启动子，该启动子的DNA序列见序列表的SEQ ID NO.20；引物Pzwfals-LF(SEQ ID NO.21)和Pzwfals-LR(SEQ ID NO.22)扩增P_zwf启动子，该启动子的DNA序列见序列表的SEQ IDNO.23；引物Pclcdals-LF(SEQ ID NO.24)和Pclcdals-LF (SEQ ID NO.25)扩增P_clcd启动子，该启动子的DNA序列见序列表的SEQ ID NO.26；引物Pppcals-LF(SEQ ID NO.27)和Pppcals-LR(SEQ ID NO.28)扩增P_ppc启动子，该启动子的DNA序列见序列表的SEQ IDNO.29；引物Pxseaals-LF (SEQ ID NO.30)和Pxseaals-LF(SEQ ID NO.31)扩增Pxsea启动子，该启动子的DNA序列见序列表的SEQ ID NO.32。

以pP_tetsc为出发质粒，使用Bsa I限制性内切酶酶切该质粒，将酶切产物上样1％浓度的琼脂糖凝胶、电泳后用天根公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒对线性化载体进行回收。将上述获得启动子片段和pP_tetsc质粒通过即用型无缝克隆试剂盒 (生工生物工程公司)进行连接，在冰盒上按照表2连接体系将各组分混合：

表2

在冰浴的离心管中配制上述连接体系，50℃反应40min，然后冰上放置2min。取5μl反应后的溶液转化至DH5α感受态细胞，复苏1h后，涂布在含有100 μg/mL壮观霉素的LB平板上，在37℃的培养箱中放置12–16h。挑取平板上的转化子，按照实施例1中转化子鉴定的PCR反应体系和反应程序进行菌落PCR 鉴定。挑选菌裂解鉴定正确的转化子送至北京擎科生物科技有限公司测序，将测序正确的过表达质粒命名为pP_pdcsc、pP_enosc、pP_tufsc、pP_edasc、pP_clcdsc、pP_zwfsc、 pP_ppcsc和pP_xseasc。

实施例5构建含有alssD乙偶姻合成途径的重组运动发酵单胞菌

按照实施例2中的方法制备CP4感受态细胞，并使用天根公司质粒小提中量试剂盒提取实施例4中构建的质粒pP_pdcsc、pP_enosc、pP_tufsc、pP_edasc、pP_clcdsc、 pP_zwfsc、pP_ppcsc和pP_xseasc。取5μl质粒(约150ng)分别加入到50μl运动发酵单胞菌CP4感受态细胞中，轻轻混匀。按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。挑取平板上的转化子，按照实施例1中的鉴定方法进行菌落PCR鉴定。获得含有上述工程质粒的重组菌株CP4(pP_xseasc)、 CP4(pP_ppcsc)、CP4(pP_clcdsc)、CP4(pP_zwfsc)、CP4(pP_edasc)、CP4(pP_enosc)、CP4(pPtufsc)、 CP4(pP_pdcsc)。

实施例6组成型启动子调控alssD操纵子过表达菌株发酵生产乙偶姻

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取菌株CP4(pE)和实施例5得到的重组菌株甘油200μl置于3ml含 100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

②将新鲜的种子液浓缩至OD₆₀₀＝20，取225μl浓缩的菌液接种至30ml新鲜 RM培养基(100μg/mL壮观霉素)中，初始OD₆₀₀控制在0.15。在发酵起始(0h) 加入四环素诱导剂终浓度为1μg/mL。转速设计为0rpm或150rpm，培养温度为 30℃。

③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。

过表达菌株CP4(pP_xseasc)、CP4(pP_ppcsc)、CP4(pP_clcdsc)、CP4(pP_zwfsc)、 CP4(pP_edasc)、CP4(pP_enosc)、CP4(pP_tufsc)、CP4(pP_pdcsc)的乙偶姻产量分别为2.85g/L、 3.14g/L、3.22g/L、3.15g/L、3.13g/L、3.24g/L、3.18g/L和3g/L，与对照菌株CP4 (pEZ)的2.54g/L相比分别提高了12.2％、23.6％、26.8％、24％、23.3％、27.6％、 25.2％和18.1％(图2-6)，说明将启动子Ptet更换为组成型启动子后也能够有效的进行乙偶姻的生产。其中获得产量最高的菌株是CP4(pP_tufsc)，产量最高为 3.24g/L。

实施例7双启动子调控alssD途径表达盒的构建

选用P_gap启动子调控alsD基因的表达，进一步研究增强alsD基因表达对产量的影响。根据实施例6中的发酵结果，选择了七个乙偶姻产量较高的重组菌发酵比较，以筛选高效发酵的重组菌。优化后的表达盒由单启动子改变为双启动子调控alssD操纵子中的alsS和alsD基因的表达，其中alsS基因分别由实施例6 中的P_tet、P_pdc、P_tuf、P_zwf、P_eda、P_eno和P_clcd启动子调控，而alsD基因则选用强启动子P_gap调控。分别以pP_pdcsc、pP_enosc、pP_tufsc、pP_edasc、pP_clcdsc、pP_zwfsc和 pP_tetsc为出发质粒，使用Xba I限制性内切酶切这七个质粒。以质粒CP4基因组为模板，用引物pEZpgap-F(SEQ ID NO.33)和pEZpgap-R(SEQ ID NO.34)按照实施例1中扩增表达盒的PCR反应体系使用高保真酶扩增P_gap启动子片段，该启动子的DNA序列见序列表的SEQ ID NO.35，然后使用胶回收试剂盒(天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)纯化扩增的P_gap启动子片段和线性化的质粒。使用即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程公司)按照实施例4中的方法将P_gap启动子的DNA片段分别和连接至上述线性化载体片段混合，50℃温浴20min转化DH5α感受态细胞。将P_gap启动子分别构建到上述质粒的XbaI酶切位点处，替换原有的核糖体结合位点(Ribosomebinding site，RBS)的DNA片段。在转化的平板上挑取单克隆、进行菌落PCR验证，鉴定成功的转化子送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。测序正确的质粒分别命名为：pP_pdcsP_gapc、pP_enosP_gapc、 pP_tufsP_gapc、pP_edasP_gapc、pP_clcdsP_gapc、pP_zwfsP_gapc和ppP_tetsP_gapc)。

实施例8构建含有双启动子调控alssD途径的重组运动发酵单胞菌

按照实施例2中的方法制备CP4感受态细胞，并使用天根公司质粒小提中量试剂盒提取实施例7中构建的质粒pP_clcdsP_gapc、pP_zwfsP_gapc、pP_edasP_gapc、 pP_enosP_gapc、pP_tufsP_gapc、pP_pdcsP_gapc和pP_tetsP_gapc。取5μl质粒(约150ng)分别加入到50μl运动发酵单胞菌CP4感受态细胞，轻轻混匀。按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。挑取平板上的转化子，按照实施例1中的转化子鉴定方法进行菌落PCR鉴定。从而获得含有重组菌株CP4(pP_clcdsP_gapc)、CP4(pP_zwfsP_gapc)、CP4(pP_edasP_gapc)、CP4(pP_enosP_gapc)、 CP4(pP_tufsP_gapc)、CP4(pP_pdcsP_gapc)和CP4(pP_tetsP_gapc)。

实施例9双启动子调控alssD途径重组菌株发酵生产乙偶姻

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取菌株CP4(pE)和实施例8得到的重组菌株甘油菌60μl置于3ml含有 100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

②将新鲜的种子液浓缩至OD₆₀₀＝20，取225μl浓缩的菌液转接至30mL含有100μg/mL壮观霉素的液体RM培养基中。初始OD₆₀₀控制在0.15。转速为 150rpm，培养温度为30℃。

③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。

菌株CP4(pP_clcdsP_gapc)、CP4(pP_zwfsP_gapc)、CP4(pP_edasP_gapc)、CP4(pP_tufsP_gapc)、 CP4(pP_tetsP_gapc)、CP4(pP_pdcsP_gapc)和CP4(pP_enosP_gapc)的乙偶姻产量产量达 5.1g/L–6.2g/L(图5)这些重组菌中，过表达菌株CP4(pP_zwfsP_gapc)乙偶姻产量最高为6.2g/L。因此后续的实验以双操纵子过表达质粒pP_zwfsP_gapc(该质粒简称 pDZP)为基础进行发酵研究。

实施例10敲除副产物重组菌的构建

运动发酵单胞菌通过途径1合成乙偶姻时以丙酮酸作为前体，而在生长代谢过程中丙酮酸也作为其它化合物(乙醇、乙酰辅酶A、乳酸、苹果酸、甲酸等) 的前体被利用。这些代谢途径均能够消耗前体物丙酮酸，导致流向目标产物的碳流减少，本研究利用动发酵单胞菌自身RecA的同源重组系统和IF-CRISPR基因编辑技术敲除副产物基因，抑制副产物的合成，使更多的丙酮酸用于目的产物乙偶姻的合成。敲除编码乳酸脱氢酶的基因ldhA以抑制乳酸的合成，敲除编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因gfo抑制山梨醇的合成，敲除编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因pfl抑制甲酸的合成，敲除编码柠檬酸裂合酶的基因cl抑制乙酸的合成，敲除编码乙醇脱氢酶的基因adhB抑制乙醇的合成，敲除编码过氧化氢酶的基因cat抑制乙醇的合成。

利用运动发酵单胞菌内源的IF型CRISPR系统敲除ldhA基因。LdhA基因的N32设计在5'-CCC-3'PAM(protospacer adjacent motifs,PAM)之后的32个碱基。合成单链的ldhAN32-F和ldhAN32-R如序列表中SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37。将这含有这两个DNA片段的溶液等体积混合，在PCR仪器中95℃反应 5min，然后冷却至室温，即可获得带有粘性末端的N32双链DNA片段。以pEH 为出发质粒，使用Bsa I限制性内切酶单切该质粒产生粘性末端，将上述获得带有粘性末端的N32双链DNA片段通过T4 DNA连接酶(Thermo Scientific)连接至该质粒，获得质粒pEH-ldhA。

以CP4基因组为模板，使用引物UF-ldhA-F(SEQ ID NO.38)和UF-ldhA-R (SEQ IDNO.39)扩增ldhA基因ORF框的上游片段作为左同源臂，使用引物DF-ldhA-F(SEQ ID NO.40)和DF-ldhA-R(SEQ ID NO.41)扩增ldhA基因ORF 框的下游片段作为右同源臂。以上述构建的pEH质粒为出发质粒，使用限制性内切酶EcoR I和Xba I酶切该质粒，使用即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程公司)将上下游同源臂片段连接至载体pEH-ldhA，获得打靶质粒pET-ldhA。

按照上述构建步骤分别构建adhB、gfo、cat、pfl和cl基因的打靶质粒，获得质粒pET-adhB、pET-gfo、pET-cat、pET-pfl和pET-cl。取5μlpET-ldhA、pET-adhB、 pET-gfo、pET-cat、pET-pfl和pET-cl质粒(约150ng)分别与50μlCP4感受态细胞混匀，按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h。取 200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。挑取平板上的转化子进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系，包括：25 μL的2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)，2μL的上游引物，2μL的下游引物和补无菌水至50μL。鉴定ldhA基因的使用的上游引物为ldhA-F(SEQ ID NO.42)，下游引物为ldhA-R(SEQ ID NO.43)；鉴定gfo基因的上游引物为gfo-F(SEQ ID NO.44)，下游引物为gfo-R(SEQ ID NO.45)；鉴定adhB基因的上游引物为adhB-F (SEQ ID NO.46)，下游引物为adhB-R(SEQ ID NO.47)；鉴定cl基因的上游引物为cl-F(SEQ ID NO.48)，下游引物为cl-R(SEQ ID NO.49)；鉴定cat基因的上游引物为cat-F(SEQ ID NO.50)，下游引物为cat-R(SEQ ID NO.51)；鉴定pfl 基因的上游引物为pfl-F(SEQ ID NO.52)，下游引物为pfl-R(SEQ ID NO.53)；PCR 反应热循环程序为95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min。经PCR鉴定获得阳性克隆，获得单基因缺失菌株分别命名为工程菌株CP4ΔldhA、 CP4ΔadhB、CP4Δpfl、CP4Δcl、CP4Δgfo和CP4Δcat。

将ldhA基因的打靶质粒pET-ldhA转化至CP4ΔadhB感受态中，按照实施例 2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。挑取平板上的转化子，按照实施例10中所述的单基因缺失菌株鉴定方法进行菌落PCR鉴定。经PCR鉴定获得阳性克隆，获得adhB和ldhA基因共同缺失的菌株命名为工程菌株Δ2(ΔadhBΔldhA)。

按照上述方法将打靶质粒pET-gfo转化至Δ2感受态中，获得adhB、ldhA和 gfo基因同时缺失的菌株命名为工程菌株Δ3(ΔadhBΔldhAΔgfo)。按照上述方法将打靶质粒pET-cl转化至Δ3感受态中，获得adhB、ldhA、gfo和cl基因共同缺失的菌株命名为工程菌株Δ4(ΔadhBΔldhAΔgfoΔcl)。按照上述方法将打靶质粒 pET-pfl转化至Δ4感受态中，获得adhB、ldhA、gfo、cl和pfl基因共同缺失的菌株命名为工程菌株Δ5(ΔadhBΔldhAΔgfoΔclΔpfl)。按照上述方法将打靶质粒 pET-cat转化至Δ5感受态中，获得adhB、ldhA、gfo、cl、pfl和cat基因共同缺失的菌株命名为工程菌株Δ6(ΔadhBΔldhAΔgfoΔclΔpflΔcat)。

实施例11构建含有pDZP质粒的基因缺失菌株

将实验实施例10中构建的多基因缺失菌株Δ2、Δ3、Δ4、Δ5和Δ6按照实施例2中的方法制备感受态细胞。提取的实施例9中获得的质粒pDZP，取1–5μl (约150ng-500ng)质粒分别与50μl多基因缺失菌株Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、和Δ6 感受态细胞混匀，按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏 10h。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。挑取平板上的转化子进行菌落PCR鉴定，挑取平板上的转化子进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系，包括：25μL的2×Rapid Taq MasterMix (Vazyme)，2μL的上游引物pEZ-als-F(SEQ ID NO.54)，2μL的下游引物pEZ-R 和补无菌水至50μL。PCR反应热循环程序为95℃变性30s，50℃退火30s，72℃ 延伸2min。经PCR鉴定成功的单克隆，分别命名为Δ2(pDZP)、Δ3(pDZP)、 Δ4(pDZP)、Δ5(pDZP)和Δ6(pDZP)。

实施例12副产物基因缺失的乙偶姻合成重组菌发酵生产乙偶姻

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取CP4(pE)、Δ2(pDZP)、Δ3(pDZP)、Δ4(pDZP)、Δ5(pDZP)和Δ6 (pDZP)甘油菌60μl置于3ml含有100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。

重组菌株Δ2(pDZP)、Δ3(pDZP)、Δ3(pDZP)、Δ4(pDZP)、Δ5(pDZP) 和Δ6(pDZP)的乙偶姻产量分别为6.5g/L–7.8g/L。Δ4(pDZP)菌株的产量最高为7.8g/L，相比对照菌株CP4(pDZP)提高了43％，这说明适当抑制副产物的生产，可以在减少副产物合成的同时，提高乙偶姻的产量。

实施例13菌株Δ4(pDZP)批次发酵条件优化

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取Δ4(pDZP)甘油菌60μl置于3ml含有100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

②将新鲜的种子液浓缩至OD₆₀₀＝20，取225μl浓缩的菌液接种至含有终浓度为100μg/mL壮观霉素的30mlRM培养基中，初始OD₆₀₀控制在0.15。在150rpm 转速下，分别对温度(27℃、30℃、33℃和37℃)、pH(5.5、6、7和8)和装液量 (12％、20％、32％和40％)进行发酵优化。

③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。

通过对检测Δ4(pDZP)的乙偶姻产量，探究了不同温度、pH、装液体积条件下Δ4(pDZP)菌株的乙偶姻产量差异。在pH6，装液量为12％，温度为27–37℃ 反应条件下，乙偶姻产量为4.58g/L–7.8％g/L。以温度为30℃，装液量为12％， pH为5–8的反应条件下，乙偶姻产量为5.26g/L–7.8g/L。以温度为30℃，pH梯度设计为6，装液量为12％–40％的反应条件下，乙偶姻产量为5.06g/L–7.8g/L。

实施例14重组菌株Δ4(pDZP)补料发酵生产乙偶姻

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

(1)取Δ4(pDPzwf)甘油菌200μl置于3ml含有100μg/mL壮观霉素的 RM培养基中活化，然后进行预培养。

(2)将上述菌株按初始OD₆₀₀＝0.15接种至30ml新鲜的RM培养基中含有壮观霉素(100μg/mL)培养基的250ml锥形瓶中，30℃、150rpm培养。在发酵30–45h时，补加1.5mL浓度为200g/L的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/L 的KH₂PO₄和1ml浓度为600g/L的葡萄糖溶液，补加后发酵液中总的葡萄糖浓度为40g/L。发酵80–95h时进行第二次补料，补加1.5ml浓度为200g/L的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/L的KH₂PO₄和1ml浓度为600g/L的葡萄糖溶液，补加后发酵液中总的葡萄糖浓度为60g/L。当发酵130–145h时进行第三次补料，补加1.5ml浓度为200g/L的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/L的KH₂PO₄和1ml 浓度为600g/L的葡萄糖溶液，补加后发酵液中总的葡萄糖浓度为80g/L。当发酵 180–195h时进行第四次补料，补加1.5ml浓度为200g/L的酵母粉溶液，300μl 浓度为200g/L的KH₂PO₄和1ml浓度为600g/L的葡萄糖溶液，补加后发酵液中总的葡萄糖浓度为100g/L。分别向锥形瓶中补加1、2、3和4次葡萄糖后，对应发酵液中的葡萄糖总浓度分别为40g/L、60g/L、80g/L和100g/L，分析比较葡萄糖对乙偶姻生产的影响。

菌株Δ4(pPDZP)在30–45h进行第一次补料后葡萄糖总浓度为40g/L，发酵至96h–120h时产量为13.4–15.6g/L。在80–95h进行第二次补料，发酵至144-168h 时产量为23.8–25.4g/L；在130–145h进行第三次补料，发酵至192–116h时产量为30.9–32.7g/L；在180–195h进行第四次补，发酵至230–254h产量为40–42.7g/L。

从以上结果可见，构建的重组菌株Δ4(pP_zwfsP_gapc)在优化后的发酵条件下进行四次连续补料发酵时乙偶姻产量最高，此结果说明了将alssD途径引入运动发酵单胞菌后，利用代谢工程对宿主细胞和乙偶姻合成途径进行优化有利于乙偶姻的生产。

本发明的实施方式并不局限于上述的具体实施例。如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护范围的情况下，做出其他变化或变型，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用

<160> 54

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2481

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgaccaaag ctaccaaaga acagaaatcc ctggttaaaa accgtggtgc tgaactggtt 60

gttgattgcc tggttgaaca gggcgttact catgtgttcg gcatcccggg tgctaaaatc 120

gatgctgttt tcgatgctct gcaggataaa ggtccggaaa tcatcgttgc tcgtcatgaa 180

cagaacgctg ctttcatggc tcaggctgtt ggtcgtctga ccggtaaacc gggtgttgtt 240

ctggttacct ccggtccggg tgcttccaac ctggctaccg gtctgctgac cgctaacacc 300

gaaggtgatc cggttgttgc tctggctggt aacgttatcc gtgctgatcg tctgaaacgt 360

acccatcagt ccctggataa cgctgctctg ttccagccga tcaccaaata ttccgttgaa 420

gttcaggatg ttaaaaacat cccggaagct gttaccaacg ctttccgtat cgcttccgct 480

ggtcaggccg gtgcagcgtt cgtttccttc ccacaggatg ttgttaacga agttaccaac 540

accaaaaacg ttcgtgctgt tgctgctccg aaactgggtc cggctgctga tgatgctatc 600

tccgctgcta tcgctaaaat ccagaccgct aaactgccgg ttgttctggt tggtatgaaa 660

ggtggtcgtc cggaagctat caaagctgtt cgtaaactgc tgaaaaaagt tcagctgccg 720

ttcgttgaaa cctatcaggc tgctggtacc ctgtcccgtg atctggagga ccagtacttc 780

ggacgtatcg gtctgttccg taaccagccg ggtgatctgc tgctggaaca ggctgatgtt 840

gttctgacca tcggttatga tccgatcgaa tatgatccga aattctggaa catcaacggt 900

gatcgtacca tcatccatct ggatgaaatc atcgctgata tcgatcatgc ttatcagccg 960

gatctggaac tgatcggtga tatcccgtcc accatcaacc atatcgaaca tgatgctgtt 1020

aaagttgaat tcgctgaacg tgaacagaaa atcctgtccg atctgaaaca gtatatgcat 1080

gaaggtgaac aggttccggc tgattggaaa tccgatcgtg ctcatccgct ggaaatcgtt 1140

aaagaactgc gtaacgctgt tgatgatcat gttaccgtta cctgcgatat cggttcccat 1200

gctatctgga tgtcccgtta tttccgttcc tatgaaccgc tgaccctgat gatctccaac 1260

ggtatgcaga ccctgggtgt tgctctgccg tgggctatcg gtgcttccct ggttaaaccg 1320

ggtgaaaaag ttgtttccgt ttccggtgat ggtggtttcc tgttctccgc tatggaactg 1380

gaaaccgctg ttcgtctgaa agctccgatc gttcatatcg tttggaacga ttccacctat 1440

gatatggttg ctttccagca gctgaaaaaa tataaccgta cctccgctgt tgatttcggt 1500

aacatcgata tcgttaaata tgctgaatcc ttcggtgcta ccggtctgcg tgttgaatcc 1560

ccggatcagc tggctgatgt tctgcgtcag ggtatgaacg ctgaaggtcc ggttatcatc 1620

gatgttccgg ttgattattc cgataacatc aacctggctt ccgataaact gccgaaagaa 1680

ttcggtgaac tgatgaaaac caaagctctg taaatgaaac gtgaatccaa catccaggtt 1740

ctgtcccgtg gtcagaaaga tcagccggtt tcccagatat accaggtaag caccatgacc 1800

tccctgctgg atggtgttta tgatggtgat ttcgaactgt ccgaaatccc gaaatatggt 1860

gatttcggta tcggtacctt caacaaactg gatggtgaac tgatcggttt cgatggtgaa 1920

ttctatcgtc tgcgttccga tggtaccgct accccggttc agaacggtga tcgttccccg 1980

ttctgctcct tcaccttctt caccccggat atgacccata aaatcgatgc taaaatgacc 2040

cgtgaagatt tcgaaaaaga aatcaactcc atgctgccgt cccgtaacct gttctatgct 2100

atccgtatcg atggtctgtt caaaaaagtt cagacccgta ccgttgaact gcaggaaaaa 2160

ccgtatgttc cgatggttga agctgttaaa acccagccga tcttcaactt cgataacgtt 2220

cgtggtacca tcgttggttt cctgaccccg gcttatgcta acggtatcgc tgtttccggt 2280

tatcatctgc atttcatcga tgaaggtcgt aactccggtg gtcatgtttt cgattatgtt 2340

ctggaagatt gcaccgttac catctcccag aaaatgaaca tgaacctgcg tctgccgaac 2400

accgctgatt tcttcaacgc taacctggac aatccggact tcgctaaaga tatagaaacc 2460

accgaaggtt ccccggaata a 2481

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

accagctcac cgtctgaatt cttaagaccc actttcacat t 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

agaggagaaa ggatctccca tgaccaaagc taccaaagaa c 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gtgagccagt gtgacctgca gttattccgg ggaaccttcg g 41

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gtgagccagt gtgacctgca gttattccgg ggaaccttcg g 41

<210> 6

<211> 736

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ttaagaccca ctttcacatt taagttgttt ttctaatccg catatgatca attcaaggcc 60

gaataagaag gctggctctg caccttggtg atcaaataat tcgatagctt gtcgtaataa 120

tggcggcata ctatcagtag taggtgtttc cctttcttct ttagcgactt gatgctcttg 180

atcttccaat acgcaaccta aagtaaaatg ccccacagcg ctgagtgcat ataatgcatt 240

ctctagtgaa aaaccttgtt ggcataaaaa ggctaattga ttttcgagag tttcatactg 300

tttttctgta ggccgtgtac ctaaatgtac ttttgctcca tcgcgatgac ttagtaaagc 360

acatctaaaa cttttagcgt tattacgtaa aaaatcttgc cagctttccc cttctaaagg 420

gcaaaagtga gtatggtgcc tatctaacat ctcaatggct aaggcgtcga gcaaagcccg 480

cttatttttt acatgccaat acaatgtagg ctgctctaca cctagcttct gggcgagttt 540

acgggttgtt aaaccttcga ttccgacctc attaagcagc tctaatgcgc tgttaatcac 600

tttactttta tctaatctgg acatcattaa ttcctaattt ttgttgacac tctatcgttg 660

atagagttat tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtattcaaat gatctaaaga 720

ggagaaagga tctccc 736

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

aattcgttga atcctgcctc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tcagtgccaa catagtaagc c 21

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

aggcaggtca ccagctcacc gtctgaatta aagtcacacg gttccttatt 50

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ggatttctgt tctttggtag ctttggtcat tgcttactcc atatattcaa aac 53

<210> 11

<211> 947

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

aaagtcacac ggttccttat ttcttttcta tccaaactct ttgcaatagt ctgtaacaag 60

atgacggcga cgatatcgga tcttcgtctc ttttgggtcg cgaaaaaata ttaactttaa 120

tcgaaaaaaa ttgagtctgt ttttactcgg gacaagaccg ccttttttta tccaaagaat 180

atccctttca tcttctttcg aaagcgaaaa ataaatactg aaaacaacgg ttttgaccac 240

aagattcacg ggctatcctt caaaagaaga agcccttttt tatcctctct tagggcgtgg 300

ttaagggttg gcttgggctt aacaaatttt gtttatgcac aactttgggt tgacttggcg 360

acaataaaat atcaccagag gggcagaccg gttacggaaa cgtttccgct ttgatagctc 420

agacggaggg aaaggctttg tcagtgttgc ggtataatat ctgtaacagc tcattgataa 480

agccggtcgc tcgcctcggg cagttttgga ttgatcctgc cctgtcttgt ttggaattga 540

tgaggccgtt catgacaaca gccggaaaaa ttttaaaaca ggcgtcttcg gctgctttag 600

gtctcggcta cgtttctaca tctggttctg attcccggtt tacctttttc aaggtgtccc 660

gttccttttt cccctttttg gaggttggtt atgtcctata atcacttaat ccagaaacgg 720

gcgtttagct ttgtccatca tggttgttta tcgctcatga tcgcggcatg ttctgatatt 780

tttcctctaa aaaagataaa aagtcttttc gcttcggcag aagaggttca tcatgaacaa 840

aaattcggca tttttaaaaa tgcctatagc taaatccgga acgacacttt agaggtttct 900

gggtcatcct gattcagaca tagtgttttg aatatatgga gtaagca 947

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

aggcaggtca ccagctcacc gtctgaatta aagtcacacg gttccttatt 50

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ggatttctgt tctttggtag ctttggtcat tagttacctc tttttgttac cg 53

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列()

ttaaatactg gcataaaccg aaaaatgtcg ttatgagcgc gccggagaag cgcggcgcgc 60

tcaatacaat agtgataaaa gcggtaacaa aaagaggtaa cta 103

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

aggcaggtca ccagctcacc gtctgaattt gtctatactc cagttactca atac 54

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ggatttctgt tctttggtag ctttggtcat atcgaaacct ttcttaaaat ct 52

<210> 17

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

tgtctatact ccagttactc aatacgtaac aataatcagt ttatcctaac tatagaatcg 60

catgagaagc gataacgttt caccataagc aatatattca ttgcaacagt ggaattgcct 120

tatgcgtcaa ggaaggatag atcattgacg gactgagttc aaaaagagac tcgtctaaaa 180

gattttaaga aaggtttcga t 201

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

aggcaggtca ccagctcacc gtctgaattg gtcgaatgca ttccttt 47

<210> 19

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ggatttctgt tctttggtag ctttggtcat taaaattatc tcgcataatc aac 53

<210> 20

<211> 293

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

ggtcgaatgc attcctttcg ttacagatat attccgctat aaaactatag aatataagtt 60

atgttccatt cgcagaatag atatagatca gcctctatgg atatgctata tatcgcccat 120

tccatttaag aataataata aaccatcatg ctgtttattt aatattttta ttacagtgaa 180

ttgaagaaat attttcttga taaaaattat taaaaatcta tcaccgacga tccgtctcta 240

tttcaagata gataataatt tgtttaacct gttgattatg cgagataatt tta 293

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

aggcaggtca ccagctcacc gtctgaattt taaacttgct ttggctga 48

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

ggatttctgt tctttggtag ctttggtcat tattctcgtc cttaaaacag ag 52

<210> 23

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

ttaaacttgc tttggctgaa tccttttgtc ttttttagat aagtcttaac caattatact 60

ttttgtttac aacgatggta taaagcgggc ggacaggcta aaaacaggct aaaaggattc 120

ggcctctgtt ttaaggacga gaata 145

<210> 24

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

taaggcaggt caccagctca ccgtctgaat tcaaacttct gctataacca ataag 55

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

tggtagcttt ggtcattttc agtccgtcct ttt 33

<210> 26

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

aacttctgct ataaccaata agctttccct ttgcgagccg cattaacata ttccgttttt 60

ggattcggaa tatctgccgc atcagaggaa agaggaaaag gacggactga aa 112

<210> 27

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

caggtcacca gctcaccgtc tgaattcgag accgaggtct catggcgtct atgagagca 59

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

tttggtagct ttggtcataa accatccctt tgcctag 37

<210> 29

<211> 610

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

tggcgtctat gagagcatgg cttttagaaa gacggatatc accgattata ccagttttac 60

catcatcccc gccgcgagta taaatgcgat tcagaaagac catgtcttac tttatgagtg 120

aaaaagagat tgtggtatag aaactaattt taatcgctct gataaattct attgcagcga 180

tgatagcgaa gctgtcttct tgaaaagaag aataattaat aataatcaat atcaatgcat 240

attttattgt ttataaagta aaatttttta ctttttctac ttattgcgtt tctaaccatt 300

aaataatctt aatatatttt tatcgggaag ctgaaatttt ttaagcatag ccagaatgtc 360

gattcagaat ctgtccctaa atttcaaagt aaatagaatt gattctttct tattcaatat 420

ttcaaatgac tttttgatta ttttataacc aaaaaataaa taattattat acaatatagt 480

aattcttaca aaaaaagcct ttaagagata atttaggata cttctaatcg aaaagactaa 540

ccattttttt gaggcataag gccagaagat gggttgtctc tcttcggtaa gctaggcaaa 600

gggatggttt 610

<210> 30

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

tgttcgcggc cgccggttcc gataagcagg acgttcatga ccaaagctac caaagaa 57

<210> 31

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

taaggcaggt caccagctca ccgtctgaat tcggcatgtt cgcggccgcc ggtt 54

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

ggcatgttcg cggccgccgg ttccgataag caggacgttc 40

<210> 33

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

gtgaactgat gaaaaccaaa gctctgtaat ctagatgtcg atgccgagtt gga 53

<210> 34

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

gaacctggat gttggattca cgtttcatgt ttattctcct aacttattaa g 51

<210> 35

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

tgtcgatgcc gagttggact ttgttcgatc aacaacccga atcctatcgt aatgatgttt 60

tgcccgatca gcctcaatcg acaattttac gcgtttcgat cgaagcaggg acgacaattg 120

gctgggaacg gtatactgga ataaatggtc ttcgttatgg tattgatgtt tttggtgcat 180

cggccccggc gaatgatcta tatgctcatt tcggcttgac cgcagtcggc atcacgaaca 240

aggtgttggc cgcgatcgcc ggtaagtcgg cacgttaaaa aatagctatg gaatataata 300

gctacttaat aagttaggag aataaac 327

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

gaaatattcg gttgccgaat atgcagtagg gatgtt 36

<210> 37

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

gaacaacatc cctactgcat attcggcaac cgaata 36

<210> 38

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

ttattgggaa gaacgcatt 19

<210> 39

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

ggttaattgt cgcttgtcta agacaccctc ttgaaaagtt 40

<210> 40

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

aacttttcaa gagggtgtct tagacaagcg acaattaacc 40

<210> 41

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

gaggtcagtc gacaaatctg 20

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

tcactatggt ggtctgaccg gt 22

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

cgtggagatc ggtatgacat acc 23

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

aggtgcatta ttgggacata 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

tataccagaa gagaaaagcg c 21

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

atgcagcgtt tgagacaatt gat 23

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

gagcgccgca gaaatagaag tc 22

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

tgctccacag cttattcatt tctg 24

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

ctggatgatg gcgcattata aac 23

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

tagaagagcg gtcagagcgt ca 22

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

catcataacg gattaagccg ct 22

<210> 52

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 52

gcattaaagc ggtcgcatc 19

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 53

cggacggcct gtcacaataa 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 54

aacgctgaag gtccggttat 20

Claims

1.一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌，其特征在于，含有编码乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC的表达载体；宿主菌为运动发酵单胞菌；所述乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC来自于枯草芽孢杆菌，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌，其特征在于，所述表达载体为pEZ15Asp、pHW20a或pZA22。

3.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，将异源的权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因连接在表达载体上，转入运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌；或者将乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因构建至运动发酵单胞菌基因组上，获得利用alsSD途径生产乙偶姻的基因工程菌株。

4.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，构建分别由启动子P_tet、P_pdc、P_tuf、P_zwf、P_eda、P_eno、P_clcd、P_ppc和P_xsea调控由乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC组成的alssD操纵子的单操纵子表达盒；或乙酰乳酸合成酶由启动子P_tet、P_pdc、P_tuf、P_zwf、P_eda、P_eno、P_clcd调控，α-乙酰乳酸脱羧酶由P_gap启动子调控的双启动子表达盒，将构建的表达盒转化至运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌。

5.根据权利要求3或4所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，在获得重组运动发酵单胞菌中敲除生产菌株中的竞争代谢途径乙醇脱氢酶基因adhB、乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl、葡萄糖-果糖氧化还原酶基因gfo、柠檬酸裂合酶cl和过氧化氢酶cat，获得工程菌株。

6.根据权利要求1-2任意一项所述的重组运动发酵单胞菌在生产乙偶姻中的应用。

7.一种重组运动发酵单胞菌生产乙偶姻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备权利要求1所述重组运动发酵单胞菌；

（2）发酵培养所述重组运动发酵单胞菌，发酵液中得到乙偶姻。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养是指按照初始接种密度为OD₆₀₀=0.15将工程菌接种于发酵培养基，培养温度为30℃，并在150rpm的摇床速度下以及20g/L－100g/L葡萄糖浓度下的条件下发酵。