EA016303B1

EA016303B1 - Метаболическая инженерия сбраживающих арабинозу дрожжевых клеток

Info

Publication number: EA016303B1
Application number: EA200900512A
Authority: EA
Inventors: Антониус Ерун Адриан Марис Ван; Якобус Томас Пронк; Хендрик Вутер Висселинк; Йоханнес Питер Ван Дейкен; Аарон Адриан Винклер; Йоханнес Хендрик Винде Де
Original assignee: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2012-04-30
Also published as: WO2008041840A1; EP2069476A1; US9303253B2; US20100086965A1; JP5553433B2; EP2069476B1; EA200900512A1; CA2664646A1; JP2014094011A; JP5846456B2; MX2009003501A; CA2664646C; AU2007302867A1; AU2007302867B2; US20120208231A1; JP2010505411A

Abstract

Изобретение касается эукариотических клеток, экспрессирующих нуклеотидные последовательности, кодирующие ферменты araA, araB и araD, причем экспрессия этих нуклеотидных последовательностей придает клеткам способность к утилизации L-арабинозы и/или к превращению L-арабинозы в L-рибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения типа этанола. Необязательно эукариотические клетки также обладают способностью к превращению ксилозы в этанол.

Description

Изобретение касается эукариотических клеток, обладающих способностью к утилизации Ьарабинозы и/или к превращению Ь-арабинозы в Ь-рибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения, а также способа получения продукта брожения, в котором используются эти клетки.

Уровень техники

Топливный этанол получил признание как ценная альтернатива ископаемому топливу. Экономически оправданная продукция этанола из гемицеллюлозной фракции растительной биомассы требует одновременного сбраживания и пентоз, и гексоз со сравнимой скоростью и с высоким выходом. Дрожжи, в частности 8асс11агошусе8 крр., являются наиболее подходящими кандидатами для этого процесса, так как они могут расти на гексозах и быстро сбраживать их как аэробным, так и анаэробным путем. Кроме того, они намного более устойчивы к токсической среде гидролизатов лигноцеллюлозы, чем (генетически модифицированные) бактерии.

В ЕР 1499708 описан способ получения штаммов 8. ссгсуыас. способных вырабатывать этанол из Ь-арабинозы. Эти штаммы были модифицированы введением гена агаА (Ь-арабинозоизомеразы) из Васб1ик 8иЬ!1118 и генов агаВ (Ь-рибулокиназы) и агаЭ (Ь-рибулозо-5-Р-4-эпимеразы) из ЕксйепсШа сой. Кроме того, эти штаммы либо несут дополнительные мутации в своем геноме, либо суперэкспрессируют ген ТАЬ1 (трансальдолазы). Однако у этих штаммов есть и некоторые недостатки. Они сбраживают арабинозу в условиях ограничения кислорода. Кроме того, они обладают низкой скоростью продукции этанола в 0,05 г-г^-1-ч^-1 (Вескег апб Во1е8, 2003). Более того, эти штаммы не способны утилизировать Ь-арабинозу в анаэробных условиях. Наконец, эти штаммы 8. сегеу181ае имеют фон дикого типа, поэтому они не могут использоваться для одновременного сбраживания нескольких сахаров С5.

В \νϋ 03/062430 и \νϋ 06/009434 раскрыты дрожжевые штаммы, способные превращать ксилозу в этанол. Эти дрожжевые штаммы обладают способностью к прямой изомеризации ксилозы в ксилулозу.

Тем не менее, существует потребность в альтернативных штаммах для продукции этанола, которые бы работали лучше и были бы более сильными и устойчивыми к сравнительно жестким условиям продукции.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - плазмидные карты ρΡ\ν231 и ρΡ\ν243;

фиг. 2 - особенности роста при культивировании в качалочных колбах штамма В\УВ219 (θ) и ΙΜ80001 в синтетической среде, содержащей 0,5% глюкозы (А) и 0,1% галактозы + 2% Ь-арабинозы (B) . Культуры выращивали 72 ч в синтетической среде с галактозой (А), а затем переносили в синтетическую среду с галактозой и арабинозой (В). Рост определяли по измерению ОЭ₆₆₀;

фиг. 3 - скорость роста при серийных пересевах культур 8. сегеу181ае ΙΜ80001 в качалочных колбах, содержащих синтетическую среду с 2% Ь-арабинозы. Каждая точка представляет скорость роста по измерению ОЭ₆₆₀ во время экспоненциальной фазы роста. Темными и светлыми кружочками представлены значения из двух параллельных опытов по серийному пересеву;

фиг. 4 - скорость роста при анаэробной 8ВВ-ферментации 8. сегеу181ае ΙΜ80001 в синтетической среде с 2% Ь-арабинозы. Каждая точка представляет скорость роста по измерению профиля СО₂ (сплошная линия) во время экспоненциальной фазы роста;

фиг. 5 - потребление сахара и образование продукта при анаэробной периодической ферментации штамма ΙΜ80002. Ферментация проводилась в 1 л синтетической среды с добавлением: 20 г-л^-1 арабинозы (А); 20 г-л^-1 глюкозы и 20 г-л^-1 арабинозы (В); 30 г-л^-1 глюкозы, 15 г-л^-1 ксилозы и 15 г-л^-1 арабинозы (C) . Потребление сахара и образование продукта при анаэробной периодической ферментации смеси штаммов ΙΜ80002 и Ρ\νΒ218. Ферментация проводилась в 1 л синтетической среды с добавлением 30 г-л'¹ глюкозы, 15 г-л'¹ ксилозы и 15 г-л'¹ арабинозы (ϋ). Обозначения: глюкоза ксилоза арабиноза этанол по данным кумулятивной продукции СО₂ этанол по данным НРЬС кумулятивная продукция СО₂ (А); ксилитол )-;

фиг. 6 - потребление сахара и образование продукта при анаэробной периодической ферментации клеток штамма ΙΜ80002, прошедших отбор на анаэробный рост на ксилозе. Ферментация проводилась в 1 л синтетической среды с добавлением 20 г-л'¹ ксилозы и 20 г-л'¹ арабинозы. Обозначения: ксилоза арабиноза этанол по данным НРЬС С·^)’ кумулятивная продукция СО₂ ксилитол ;

фиг. 7 - потребление сахара и образование продукта при анаэробной периодической ферментации штамма ΙΜ80003. Ферментация проводилась в 1 л синтетической среды с добавлением 30 г-л^-1 глюкозы, 15 г-л'¹ ксилозы и 15 г-л'¹ арабинозы. Обозначения: глюкоза ксилоза арабиноза этанол по данным кумулятивной продукции СО₂ этанол по данным НРЬС кумулятивная продукция СО₂(Δ).

Описание изобретения Эукариотические клетки

В первом аспекте изобретение касается эукариотических клеток, способных экспрессировать сле

- 1 016303 дующие нуклеотидные последовательности, причем экспрессия этих нуклеотидных последовательностей придает клеткам способность к утилизации Ь-арабинозы и/или к превращению Ь-арабинозы в Ьрибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения типа этанола:

(a) нуклеотидная последовательность, кодирующая арабинозоизомеразу (агаА), причем данная нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из (ί) нуклеотидных последовательностей, кодирующих агаА, причем агаА включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 55% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 1, (ίί) нуклеотидных последовательностей, включающих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична нуклеотидной последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 2, (ίίί) нуклеотидных последовательностей, у которых комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (ί) или (ίί), (ίν) нуклеотидных последовательностей, у которых последовательность отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода;

(b) нуклеотидная последовательность, кодирующая Ь-рибулокиназу (агаВ), причем данная нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из (ί) нуклеотидных последовательностей, кодирующих агаВ, причем агаВ включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 3, (ίί) нуклеотидных последовательностей, включающих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична нуклеотидной последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 4, (ίίί) нуклеотидных последовательностей, у которых комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (ί) или (ίί), (ίν) нуклеотидных последовательностей, у которых последовательность отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода;

(c) нуклеотидная последовательность, кодирующая Ь-рибулозо-5-Р-4-эпимеразу (агаБ), причем данная нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из (ί) нуклеотидных последовательностей, кодирующих агаБ, причем агаБ включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 5, (ίί) нуклеотидных последовательностей, включающих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична нуклеотидной последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 6, (ίίί) нуклеотидных последовательностей, у которых комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (ί) или (ίί), (ίν) нуклеотидных последовательностей, у которых последовательность отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода.

Предпочтительное воплощение касается эукариотических клеток, способных экспрессировать следующие нуклеотидные последовательности, причем экспрессия этих нуклеотидных последовательностей придает клеткам способность к утилизации Ь-арабинозы и/или к превращению Ь-арабинозы в Ьрибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения типа этанола:

(a) нуклеотидная последовательность, кодирующая арабинозоизомеразу (агаА), причем данная нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из (ί) нуклеотидных последовательностей, включающих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2, (ίί) нуклеотидных последовательностей, у которых комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (ί), (ίίί) нуклеотидных последовательностей, у которых последовательность отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίί) вследствие вырожденности генетического кода;

(b) нуклеотидная последовательность, кодирующая Ь-рибулокиназу (агаВ), причем данная нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из (ί) нуклеотидных последовательностей, кодирующих агаВ, причем агаВ включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 3, (ίί) нуклеотидных последовательностей, включающих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4, (ίίί) нуклеотидных последовательностей, у которых комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (ί) или (ίί), (ίν) нуклеотидных последовательностей, у которых последовательность отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода;

(c) нуклеотидная последовательность, кодирующая Ь-рибулозо-5-Р-4-эпимеразу (агаБ), причем данная нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из (ί) нуклеотидных последовательностей, кодирующих агаБ, причем агаБ включает аминокислотную

- 2 016303 последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0: 5, (ίί) нуклеотидных последовательностей, включающих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0: 6, (ίίί) нуклеотидных последовательностей, у которых комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (ί) или (ίί), (ίν) нуклеотидных последовательностей, у которых последовательность отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода.

Идентичность и сходство последовательностей

Идентичность последовательностей в настоящем изобретении определяется как родство между двумя или несколькими аминокислотными последовательностями (полипептидов или белков) или двумя или несколькими нуклеотидными последовательностями (полинуклеотидами), которое устанавливается путем сравнения этих последовательностей. Обычно идентичность или сходство последовательностей определяется по всей длине подвергаемых сравнению последовательностей. В этой области идентичность также обозначает степень родственности между аминокислотными или нуклеотидными последовательностями в зависимости от обстоятельств, которая определяется по совпадению между отрезками таких последовательностей. Сходство между двумя аминокислотными последовательностями определяется путем сравнения аминокислотной последовательности и её консервативных замен аминокислот одного полипептида с последовательностью второго полипептида. Идентичность и сходство можно легко рассчитать различными способами, известными специалистам в этой области.

Предпочтительные способы определения идентичности призваны давать наибольшее совпадение между исследуемыми последовательностями. Методы определения идентичности и сходства систематизированы в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные методы компьютерных программ для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают, например, Бек1Ей, БЙА8ТР, 1’ЕА8Т\ и ЕА8ТА (Айксйи1 8.Е. е1 а1., 1. Мо1. Бю1. 215: 403-410 (1990), в свободном доступе из ΝΟΒΙ и других источников (БЬЛ8Т Мапиа1, А11ясНи1 8. е1 а1., NСБI ΝΕΜ ΝΙΗ БеШекба, ΜΌ 20894). Наиболее предпочтительным алгоритмом является ЕМБ088 (1Шр:/А\'\у\у.еЫ.ас.ик/етЬокк/аНдп). Предпочтительные параметры для сравнения аминокислотных последовательностей с помощью ЕМБ088: открытый пробел 10,0, перекрывание пробела 0,5, матрица Б1окит 62. Предпочтительные параметры для сравнения нуклеотидных последовательностей с помощью ЕМБ088: открытый пробел 10,0, перекрывание пробела 0,5, матрица ΌΝΑ £и11 тайтх (матрица идентичности ДНК).

Необязательно при определении степени сходства аминокислот специалисты могут учитывать и консервативные замены аминокислот, как это должно быть им ясно. Консервативные замены аминокислот означают взаимозаменяемость остатков со сходными боковыми цепями. Например, в группу аминокислот с алифатическими боковыми цепями входят глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; в группу аминокислот с гидроксилом на алифатических боковых цепях входят серин и треонин; в группу аминокислот с содержащими амид боковыми цепями входят аспарагин и глутамин; в группу аминокислот с ароматическими боковыми цепями входят фенилаланин, тирозин и триптофан; в группу аминокислот с основными боковыми цепями входят лизин, аргинин и гистидин; а в группу аминокислот с содержащими серу боковыми цепями входят цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных замен аминокислот являются валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Замещенными вариантами аминокислотных последовательностей, приведенных в настоящем изобретении, являются варианты, у которых по меньшей мере один остаток в приведенной последовательности был удален, а на его место вставлен другой остаток. Предпочтительно замена аминокислот является консервативной. Предпочтительными консервативными заменами для каждой из встречающихся в природе аминокислот являются следующие: А1а на 8ег; Агд на Ьук; Акп на О1п или Нй; Акр на О1и; Сук на 8ег или А1а; О1п на Акп; О1и на Акр; О1у на Рго; Ηίκ на Акп или О1п; 11е на Ьеи или Уа1; Ьеи на 11е или Уа1; Ьук на Агд; О1п на О1и; Ме1 на Ьеи или 11е; РНе на Ме1, Ьеи или Туг; 8ег на ТНг; ТНг на 8ег; Тгр на Туг; Туг на Тгр или РНе; и Уа1 на 11е или Ьеи.

Гибридизация отрезков нуклеиновых кислот

Нуклеотидные последовательности, кодирующие ферменты, экспрессируемые в клетках изобретения, также могут характеризоваться по их способности к гибридизации с нуклеотидными последовательностями 8ЕО ГО Ν0.Α 2, 4, 6, 8, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 соответственно, при умеренных или предпочтительно строгих условиях гибридизации. Строгие условия гибридизации определяются в настоящем изобретении как условия, способствующие гибридизации отрезка нуклеиновой кислоты по меньшей мере из 25, предпочтительно 50 нуклеотидов, 75 или 100 и наиболее предпочтительно 200 или больше нуклеотидов при температуре около 65°С в растворе, содержащем 1М соль, предпочтительно в растворе 6х88С или любом ином растворе со сравнимой ионной силой, с отмывкой при 65°С в растворе, содержащем 0,1М соль или меньше, предпочтительно в растворе 0,2х88С или любом ином растворе со сравнимой ионной силой. Предпочтительно гибридизация выполняется в течение ночи, т. е. в течение как ми

- 3 016303 нимум 10 ч, а отмывка проводится в течение как минимум 1 ч, по меньшей мере с двумя заменами отмывочного раствора. Эти условия обычно способствуют специфической гибридизации последовательностей, степень идентичности которых составляет 90% или больше.

Умеренные условия определяются в настоящем изобретении как условия, способствующие гибридизации отрезка нуклеиновой кислоты по меньшей мере из 50 нуклеотидов, предпочтительно из 200 или больше нуклеотидов при температуре около 45°С в растворе, содержащем 1М соль, предпочтительно растворе 6х88С или любом ином растворе со сравнимой ионной силой, с отмывкой при комнатной температуре в растворе, содержащем 1М соль, предпочтительно растворе 6х88С или любом ином растворе со сравнимой ионной силой. Предпочтительно гибридизация выполняется в течение ночи, т.е. в течение как минимум 10 ч, а отмывка проводится в течение как минимум 1 ч, по меньшей мере с двумя заменами отмывочного раствора. Эти условия обычно способствуют специфической гибридизации последовательностей, степень идентичности которых составляет до 50%. Специалисты в этой области смогут модифицировать эти условия гибридизации так, чтобы специфически идентифицировать последовательности, идентичность которых составляет от 50 до 90%.

АгаА.

Предпочтительно нуклеотидные последовательности, кодирующие арабинозоизомеразу (агаА), экспрессируемую в клетках изобретения, выбираются из группы, состоящей из (a) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид агаА, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 1;

(b) нуклеотидных последовательностей, имеющих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 2;

(c) нуклеотидных последовательностей, у которых комплементарная нить гибридизируется с последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты по (а) или (Ь);

(6) нуклеотидных последовательностей, у которых последовательность отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (с) вследствие вырожденности генетического кода.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая агаА, может кодировать либо прокариотический, либо эукариотический фермент агаА, т.е. фермент, аминокислотная последовательность которого идентична той агаА, которая в природе встречается в прокариотическом или эукариотическом организме. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что способность определенной агаА придавать клеткам эукариотического хозяина способность к утилизации арабинозы и/или к превращению арабинозы в Ьрибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения типа этанола при совместной экспрессии с агаВ и агаЭ не слишком зависит от того, имеет ли агаА прокариотическое или эукариотическое происхождение. Скорее это зависит от родства аминокислотной последовательности агаА с последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 1.

АгаВ.

Предпочтительно нуклеотидные последовательности, кодирующие Ь-рибулокиназу (агаВ), экспрессируемую в клетках изобретения, выбираются из группы, состоящей из (a) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид агаВ, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 3;

(b) нуклеотидных последовательностей, имеющих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 4;

Нуклеотидная последовательность, кодирующая агаВ, может кодировать либо прокариотический, либо эукариотический фермент агаВ, т.е. фермент, аминокислотная последовательность которого идентична той агаВ, которая в природе встречается в прокариотическом или эукариотическом организме. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что способность определенной агаВ придавать клеткам эукариотического хозяина способность к утилизации арабинозы и/или к превращению арабинозы в Ьрибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения при совместной экспрессии с агаА и агаЭ не слишком зависит от того, имеет ли агаВ прокариотическое или эукариотическое происхождение. Скорее это зависит от родства аминокислотной последовательности агаВ с последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 3.

АгаЭ.

Предпочтительно нуклеотидные последовательности, кодирующие Ь-рибулозо-5-Р-4-эпимеразу (агаЭ), экспрессируемую в клетках изобретения, выбираются из группы, состоящей из

- 4 016303 (a) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид атаБ, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО 1Б N0: 5;

(b) нуклеотидных последовательностей, имеющих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности 81А) 1Б N0: 6;

(б) нуклеотидных последовательностей, у которых последовательность отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (с) вследствие вырожденности генетического кода.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая атаБ, может кодировать либо прокариотический, либо эукариотический фермент атаБ, т.е. фермент, аминокислотная последовательность которого идентична той атаБ, которая в природе встречается в прокариотическом или эукариотическом организме. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что способность определенной атаБ придавать клеткам эукариотического хозяина способность к утилизации арабинозы и/или к превращению арабинозы в Ьрибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения при совместной экспрессии с агаА и агаВ не слишком зависит от того, имеет ли атаБ прокариотическое или эукариотическое происхождение. Скорее это зависит от родства аминокислотной последовательности атаБ с последовательностью 8Е0 1Б N0: 5.

Вне ожидания, индекс употребительности кодонов показал, что экспрессия генов агаА, агаВ и атаБ из Ьас1оЬасШик р1ап1атиш более благоприятна в дрожжевых клетках, чем экспрессия прокариотических генов агаА, агаВ апб атаБ, описанных в ЕР 1499708.

Следует отметить, что Ь. р1ап1атиш относится к организмам, которые в общем считаются безопасными (СВА8), то есть признанным безопасными органами надзора за пищевыми продуктами. Поэтому предпочтительные нуклеотидные последовательности кодируют такие агаА, агаВ или атаБ соответственно, у которых аминокислотные последовательности родственны последовательностям 8Е0 1Б N0: 1, 3 или 5 соответственно, как определено выше. Предпочтительные нуклеотидные последовательности кодируют грибковые агаА, агаВ или атаБ соответственно (например, из Вак1бюшусе1е), более предпочтительно агаА, агаВ или атаБ соответственно, из анаэробных грибков, например анаэробных грибков, принадлежащих к семействам №осаШшак11х, Саесошусек, Рношусек, 0тршошусек или Вишшошусек. В качестве альтернативы предпочтительные нуклеотидные последовательности кодируют бактериальные агаА, агаВ или атаБ соответственно, предпочтительно из грамположительных бактерий, более предпочтительно из рода Ьас1оЬасШик, наиболее предпочтительно из вида Ьас1оЬасй1ик р1ап1атиш. Предпочтительно одна, две или три из нуклеотидных последовательностей агаА, агаВ и атаБ происходят из рода Ьас1оЬасб1ик, наиболее предпочтительно из вида Ьас1оЬасШик р1ап!атиш. Бактериальная агаА, экспрессируемая в клетках изобретения, не является ферментом агаА из ВасШик киЫШк, который раскрыт в ЕР 1499708 и приведен в 8Е0 1Б N0: 9. Нуклеотидная последовательность, кодирующая 8Е0 1Б N0: 9, представлена в 8ЕС 1Б N0: 10. Бактериальные агаВ и атаБ, экспрессируемые в клетках изобретения, не являются ферментами из ЕксйепсЫа сой (Е. сой), которые раскрыты в ЕР 1499708 и приведены в 8Е0 1Б N0: 11 и 8ЕС 1Б N0: 13. Нуклеотидная последовательность, кодирующая 8Е0 1Б N0: 11, представлена в 8Е0 1Б N0: 12. Нуклеотидная последовательность, кодирующая 8Е0 1Б N0: 13, представлена в 8Е0 1Б N0: 14.

Для повышения вероятности того, что (бактериальные) ферменты агаА, агаВ и атаБ соответственно, будут экспрессироваться в активной форме в эукариотических клетках хозяина по изобретению, к примеру дрожжевых клетках, соответствующая кодирующая нуклеотидная последовательность может быть подвергнута оптимизации по употребительности кодонов к выбранным эукариотическим клеткам хозяина. Приспособленность нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты агаА, агаВ и атаБ (или другие ферменты изобретения, см. ниже), к употребительности кодонов у выбранных клеток хозяина может быть выражена в виде индекса адаптации кодонов (СА1). Индекс адаптации кодонов в настоящем изобретении определяется как мера относительной приспособленности употребления кодонов гена к употребительности кодонов у генов с высоким уровнем экспрессии. Относительная приспособленность (ν) каждого кодона представляет собой отношение употребительности данного кодона к употребительности наиболее распространенного кодона для одной и той же аминокислоты. Индекс СА1 определяется как геометрическое среднее этих значений относительной приспособленности. При этом исключаются несинонимические кодоны и кодоны терминации (зависящие от генетического кода). Значения СА1 колеблются от 0 до 1, причем более высокие значения означают большую долю наиболее распространенных кодонов (см. 8йатр апб Ь1, 1987, ШсШс Асйбк Векеагсй 15: 1281-1295; а также Никеп е1 а1., 2003, N1.1с1ею Асйбк Век. 31(8):2242-51). Адаптированная нуклеотидная последовательность предпочтительно имеет значение СА1 не менее 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7.

В предпочтительном воплощении экспрессия нуклеотидных последовательностей, кодирующих агаА, агаВ и атаБ, как определено выше, придает клеткам способность к утилизации Ь-арабинозы и/или к превращению её в Ь-рибулозу и/или ксилулозо-5-фосфат. Не ограничивая себя какой-либо теорией, отметим, что Ь-арабиноза сначала превращается в Ь-рибулозу, которая затем превращается в ксилулозо-5

- 5 016303 фосфат, который является основным продуктом, поступающим в пентозофосфатный путь. В контексте изобретения утилизация Ь-арабинозы предпочтительно означает то, что измеренная при 660 нм (ΘΌ₆₆₀) оптическая плотность трансформированных клеток, культивируемых в аэробных или анаэробных условиях в присутствии по меньшей мере 0,5% Ь-арабинозы в течение по меньшей мере 20 дней, повышается примерно от 0,5 до 1,0 или больше. Более предпочтительно ΘΌ₆₆₀ повышается от 0,5 до 1,5 или больше. Более предпочтительно клетки культивируют в присутствии по меньшей мере 1%, по меньшей мере 1,5%, по меньшей мере 2% Ь-арабинозы. Наиболее предпочтительно клетки культивируют в присутствии приблизительно 2% Ь-арабинозы.

В контексте изобретения клетки обладают способностью к превращению Ь-арабинозы в Ьрибулозу, если в клетках, культивируемых в аэробных или анаэробных условиях в присутствии Ьарабинозы (при тех же предпочтительных концентрациях, что и в предыдущем абзаце) в течение по меньшей мере 20 дней, обнаруживается заметное количество Ь-рибулозы при помощи соответствующего метода. Предпочтительным методом определения Ь-рибулозы является метод НРЬС.

В контексте изобретения клетки обладают способностью к превращению Ь-арабинозы в ксилулозо-5-фосфат, если в клетках, культивируемых в аэробных или анаэробных условиях в присутствии Ьарабинозы (при тех же предпочтительных концентрациях, что и в предыдущем абзаце) в течение по меньшей мере 20 дней, обнаруживается повышение ксилулозо-5-фосфата по меньшей мере на 2% при помощи соответствующего метода. Предпочтительным методом определения ксилулозо-5-фосфата является метод НРЬС, описанный в ΖαϊάίναΓ 1. е1 а1. (2002), Αρρί. МюгоЫо1. Вю1ес1шоЬ 59: 436-442). Этот метод вкратце описан в экспериментальной части. Наиболее предпочтительно повышение составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25% или больше.

В другом предпочтительном воплощении изобретения экспрессия нуклеотидных последовательностей, кодирующих агаА, агаВ и атаЭ, как определено выше, придает клеткам способность к превращению Ь-арабинозы в желательный продукт брожения при культивировании в аэробных или анаэробных условиях в присутствии Ь-арабинозы (при тех же предпочтительных концентрациях, что и в предыдущем абзаце) в течение по меньшей мере от 1 месяца до 1 года. Более предпочтительно клетки обладают способностью к превращению Ь-арабинозы в желательный продукт брожения, если при культивировании в условиях, приведенных в предыдущем предложении, обнаруживается заметное количество желательного продукта брожения при помощи соответствующего метода. Более предпочтительно методом определения является метод НРЬС. Еще более предпочтительно продуктом брожения является этанол.

Клетки для трансформирования нуклеотидными последовательностями, кодирующими ферменты агаА, агаВ и атаЭ соответственно, как описано выше, предпочтительно представляют собой клетки хозяина, обладающие способностью к активному или пассивному транспорту ксилозы внутрь клетки и изомеризации ксилозы внутри клетки. Предпочтительно клетки обладают способностью к активному гликолизу. Клетки могут дополнительно содержать эндогенный пентозофосфатный путь и могут содержать эндогенную ксилулозокиназную активность с тем, чтобы ксилулоза, образовавшаяся при изомеризации ксилозы, могла подвергаться метаболическому превращению в пируват. Клетки предпочтительно дополнительно содержат ферменты для превращения пирувата в желательный продукт брожения, такой как этанол, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, аминокислоты, 1,3пропандиол, этилен, глицерин, бутанол, β-лактамовый антибиотик или цефалоспорин. Клеткам можно придать способность к вырабатыванию бутанола путем введения одного или нескольких генов бутанолового пути, как изложено в \УО 2007/041269.

Предпочтительными клетками, естественно, являются клетки, обладающие способностью к спиртовому брожению, предпочтительно анаэробному спиртовому брожению. Клетки-хозяин также предпочтительно обладают высокой устойчивостью к этанолу, высокой устойчивостью к низким значениям рН (т. е. способностью к росту при рН ниже 5, 4, 3 или 2,5) и к органическим кислотам типа молочной, уксусной или муравьиной кислоты и к таким продуктам деградации сахаров, как фурфураль и гидроксиметилфурфураль, а также высокой устойчивостью к повышенным температурам. Любые из этих характеристик или активностей клеток-хозяев могут присутствовать в клетках-хозяин естественным образом либо могут быть введены или модифицированы посредством генетической селекции или генетической модификации. Подходящими клетками-хозяин являются эукариотические микроорганизмы, такие, к примеру, как грибки, однако в качестве клеток-хозяин больше всего подходят дрожжи или нитчатые грибы.

Дрожжи в настоящем изобретении определяются как эукариотические микроорганизмы и включают все виды подотдела ЕитусоДиа (А1ехорои1оз С.1., 1962, Ιη: 1и1гойис1огу Мусо1оду, Ιοίιη \УПеу & §ои8, 1пс., Ыете Уотк), преимущественно растущие в виде одноклеточных форм. Дрожжи могут расти либо почкованием из одноклеточного таллома, либо путем деления организма. Предпочтительные в качестве клеток-хозяин дрожжи принадлежат к одному из родов Бассйатотусез, К1иууетотусе8, Саий1йа, РюЫа, ЗсЫхозассйаготусез. Наи8еии1а, К1оескега, Бскетаииютусез или Уаггсшла. Предпочтительно дрожжи обладают способностью к анаэробному брожению, более предпочтительно к анаэробному спиртовому брожению.

Нитчатые грибы в настоящем изобретении определяются как эукариотические микроорганизмы и

- 6 016303 включают все нитчатые формы подотдела ЕитусоДпа. Эти грибы характеризуются вегетативным мицелием, состоящим из хитина, целлюлозы и других сложных полисахаридов. Нитчатые грибы настоящего изобретения в морфологическом, физиологическом и генетическом отношении отличаются от дрожжей. Вегетативный рост нитчатых грибов происходит путем удлинения гиф, а углеродный катаболизм у большинства нитчатых грибов является облигатно аэробным. Предпочтительные в качестве клетокхозяин нитчатые грибы принадлежат к одному из родов АкретдШш, Тпсйобетта, Нитюо1а, Асгетошит, Еикапит или РешсШшт.

На протяжении ряда лет высказывались предложения о введении различных организмов для продукции биологического этанола из сахаров сельскохозяйственных культур. Однако на практике во всех основных биологических способах получения этанола продолжали использовать дрожжи из рода 8ассйатотусек в качестве продуцента этанола. Это обусловлено многими привлекательными для промышленных процессов характеристиками видов 8ассйатотусе5, как то: высокой устойчивостью к кислоте и этанолу и высокой осмотической устойчивостью, способностью к анаэробному росту и, конечно, высокой производительностью спиртового брожения. Предпочтительными в качестве клеток-хозяин видами дрожжей являются 8. сетеущ1ае, 8. ЬШбеп, 8. ЬатпеШ, 8. ех1дии8, 8. иуатит, 8. Шайайсш, К. 1ас!щ, К. татапш, К. ГгащШ.

В предпочтительном воплощении клетками-хозяин являются такие клетки, которые были трансформированы конструкцией из нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидные последовательности, кодирующие ферменты агаА, агаВ и атаЭ, как описано выше. В одном более предпочтительном воплощении клетки-хозяин трансформированы совместно тремя конструкциями из нуклеиновой кислоты, причем каждая конструкция включает нуклеотидную последовательность, кодирующую агаА, агаВ или атаЭ. Конструкции из нуклеиновой кислоты, включающие кодирующие последовательности агаА, агаВ и/или атаЭ, обладают способностью к экспрессии ферментов агаА, агаВ и/или атаЭ в клетках-хозяин. Для этой цели конструкции можно сконструировать так, как описано, например, в \УО 03/0624430. Клетки-хозяин могут содержать одиночные копии, но предпочтительно содержат множественные копии каждой конструкции из нуклеиновой кислоты. Конструкция из нуклеиновой кислоты может находиться в виде эписомы и при этом содержать последовательность для автономной репликации типа последовательности АК8. Подходящие эписомные конструкции, например, могут быть основаны на дрожжевых плазмидах 2μ или рКЭ1 (Е1еет е! а1., 1991, Вю!есйпо1оду 9: 968-975). Предпочтительно, однако, каждая конструкция из нуклеиновой кислоты в одной или нескольких копиях встраивается в геном клетки-хозяин. Встраивание в геном клетки-хозяин может происходить случайным образом при неправильной рекомбинации, но предпочтительно конструкция встраивается в геном клетки-хозяин при гомологической рекомбинации, как это хорошо известно в области молекулярной биологии грибов (например, см. \УО 90/14423, ЕР-А0481008, ЕР-А-0635574 и И8 6265186).

Соответственно, в более предпочтительном воплощении клетки изобретения содержат конструкцию из нуклеиновой кислоты, включающую кодирующие последовательности агаА, агаВ и/или атаЭ, и обладают способностью к экспрессии ферментов агаА, агаВ и/или атаЭ. В еще более предпочтительном воплощении каждая из кодирующих последовательностей агаА, агаВ и/или атаЭ функционально связана с промотором, вызывающим экспрессию соответствующей нуклеотидной последовательности в клетках, достаточную для придания клеткам способности к утилизации Ь-арабинозы и/или к превращению Ьарабинозы в Ь-рибулозу и/или ксилулозо-5-фосфат. Предпочтительно клетки представляют собой дрожжевые клетки. Соответственно, в следующем аспекте изобретение также охватывает конструкции из нуклеиновой кислоты, как изложено выше. Предпочтительно конструкция из нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую агаА, агаВ и/или атаЭ. Нуклеотидные последовательности, кодирующие агаА, агаВ или атаЭ, уже определены выше.

Еще более предпочтительно экспрессия соответствующих нуклеотидных последовательностей в клетках придает клеткам способность к превращению Ь-арабинозы в желательный продукт брожения, как описано ниже. В еще более предпочтительном воплощении продуктом брожения является этанол. Еще более предпочтительно клетки представляют собой дрожжевые клетки.

В настоящем изобретении термин функционально связан обозначает соединение полинуклеотидных элементов (или кодирующих последовательностей или нуклеотидных последовательностей) в функциональной взаимосвязи. Последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана, если она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Функционально связанные означает то, что связанные последовательности нуклеиновых кислот, как правило, являются смежными, а если нужно соединить кодирующие области двух белков, то смежными и в одной рамке считывания.

В настоящем изобретении термин промотор обозначает фрагмент нуклеиновой кислоты, который функционирует, контролируя транскрипцию одного или нескольких генов, и располагается перед сайтом инициации транскрипции гена относительно направления транскрипции, а в структурном отношении отличается наличием места связывания ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и иных последовательностей ДНК, в том числе мест связывания факторов транскрипции, мест свя

- 7 016303 зывания белков-репрессоров и белков-активаторов и иных последовательностей нуклеотидов, известных в этой области, которые, действуя прямо или косвенно, регулируют степень транскрипции из промотора. Конститутивный промотор есть такой промотор, который активен в большей части экологических и онтогенетических ситуаций. Индуцибельный промотор есть такой промотор, который активен при экологической или онтогенетической регуляции.

Промотор, который может использоваться для осуществления экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих агаА, агаВ и/или атаЭ, может быть чужим для нуклеотидных последовательностей, кодирующих экспрессируемые ферменты, т.е. этот промотор гетерологичен той нуклеотидной последовательности (кодирующей последовательности), с которой он функционально связан. Хотя предпочтительно промотор гетерологичен той кодирующей последовательности, с которой он функционально связан, но так же предпочтительно он может быть гомологичным, т.е. эндогенным для клеток-хозяин. Предпочтительно гетерологичный (относительно данной нуклеотидной последовательности) промотор способен обеспечить более высокий стационарный уровень транскрипта, содержащего кодирующую последовательность (или способен продуцировать больше молекул транскрипта, т.е. молекул мРНК за единицу времени), чем промотор, нативный для кодирующей последовательности, предпочтительно в таких условиях, когда источником углерода служит арабиноза, либо арабиноза и глюкоза, либо ксилоза и арабиноза, либо ксилоза, арабиноза и глюкоза, более предпочтительно в качестве основного источника углерода (т.е. более 50% доступного источника углерода составляет арабиноза, либо арабиноза и глюкоза, либо ксилоза и арабиноза, либо ксилоза, арабиноза и глюкоза), наиболее предпочтительно в качестве единственного источника углерода. Подходящие в этом плане промоторы охватывают как конститутивные, так и индуцибельные природные промоторы, а также искусственно созданные промоторы. Предпочтительный промотор для использования в настоящем изобретении, кроме того, должен быть нечувствительным к репрессии катаболитами (глюкозой) и/или предпочтительно не требовать арабинозы и/или ксилозы для индукции.

Промоторы, обладающие этими характеристиками, широко доступны и известны специалистам. Подходящие примеры таких промоторов включают, например, промоторы из гликолитических генов, к примеру промоторы фосфофруктокиназы (РРК), триозофосфатизомеразы (ΤΡΙ), глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы (ΟΡΌ, ΤΌΗ3 или ΟΑΡΌΗ), пируваткиназы (ΡΥΚ), фосфоглицераткиназы (РОК) из дрожжей или нитчатых грибов; более подробно о таких промоторах у дрожжей можно узнать в \νϋ 93/03159. Другими полезными промоторами являются промоторы генов, кодирующих рибосомные белки, промотор гена лактазы (ЬАС4), промоторы алкогольдегидрогеназы (ΑΌΗ1, ΑΌΗ4 и др.), промотор енолазы (ΕΝΟ), промотор глюкозо-6-фосфатизомеразы (ΡΟΙ1, ΗηιιΓ с1 а1., 2000) или промотор переносчика гексоз (глюкозы) (НХТ7) либо глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ΤΌΗ3). Последовательность промотора ΡΟΙ1 приведена в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 51. Последовательность промотора НХТ7 приведена в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 52. Последовательность промотора ΤΌΗ3 приведена в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 49. Другие промоторы и конститутивные, и индуцибельные, а также энхансеры или вышележащие активирующие последовательности, должны быть известны специалистам в этой области. Промоторы, используемые в клетках-хозяин по изобретению, могут быть подвергнуты модификации, если нужно, чтобы изменить их контролирующие характеристики.

Предпочтительными клетками по изобретению являются эукариотические клетки, трансформированные генами агаА, агаВ и атаЭ из Ь. р1ап1агиш. Более предпочтительно эукариотические клетки представляют собой дрожжевые клетки, еще более предпочтительно клетки штамма 8. есгсуыас. трансформированные генами агаА, агаВ и атаЭ из Ь. р1ап1атиш. Наиболее предпочтительно они представляют собой клетки СВ8 120327 или СВ8 120328, депонированные в Институте СВ8 (Нидерланды) 27 сентября 2006 г.

Термин гомологичные, когда он используется для обозначения взаимосвязи между данной молекулой (рекомбинантной) нуклеиновой кислоты или полипептида и данным организмом или клетками хозяина, подразумевает то, что в природе эта молекула нуклеиновой кислоты или полипептида вырабатывается клетками или организмами хозяина того же самого вида, предпочтительно той же самой разновидности или штамма. Если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, гомологична клеткам-хозяин, то она, как правило, должна быть функционально связана с последовательностью другого промотора или, если применимо, последовательностью другого сигнала секреции и/или терминатора, чем в своем естественном окружении. Когда он используется для обозначения родственности двух последовательностей нуклеиновых кислот, термин гомологичные означает, что одна последовательность однонитчатой нуклеиновой кислоты может гибридизироваться с комплементарной последовательностью однонитчатой нуклеиновой кислоты. Степень гибридизации может зависеть от ряда факторов, включая степень идентичности между последовательностями и такие условия гибридизации, как температура и концентрация соли, как это изложено выше. Предпочтительно участок идентичности составляет более 5 п.о., более предпочтительно участок идентичности составляет более 10 п.о.

Термин гетерологичные, когда он применяется в отношении нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) или белка, означает то, что нуклеиновая кислота или белок не встречается естественным образом в составе того организма, клетки, генома либо последовательности ДНК или РНК, в которых они находят

- 8 016303 ся, или же они находятся в таких клетках или таком месте в геноме или последовательности ДНК или РНК, которые отличаются от тех, в которых они встречаются в природе. Гетерологичные нуклеиновые кислоты или белки не являются эндогенными для тех клеток, в которые они введены, а были получены из других клеток либо синтетическим или рекомбинантным способом. Обычно, хотя и не обязательно, такие нуклеиновые кислоты кодируют белки, которые в норме не вырабатываются теми клетками, в которых происходит транскрипция или экспрессия. Аналогичным образом экзогенная РНК кодирует белки, которые в норме не экспрессируются в тех клетках, в которых находится эта экзогенная РНК. Гетерологичные нуклеиновые кислоты или белки также могут именоваться чужеродными нуклеиновыми кислотами или белками. Любая нуклеиновая кислота или белок, которую специалист в этой области признает гетерологичной или чужеродной тем клеткам, в которых она подвергается экспрессии, в настоящем изобретении охватывается термином гетерологичная нуклеиновая кислота или белок. Термин гетерологичные также применим к неестественным комбинациям нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей, т.е. таким комбинациям, в которых по меньшей мере две из комбинируемых последовательностей являются чужеродными относительно друг друга.

Предпочтительные эукариотические клетки, обладающие способностью к утилизации и/или превращению Ь-арабинозы и ксилозы

В более предпочтительном воплощении клетки изобретения, экспрессирующие агаА, агаВ и атаЭ, обладают способностью к утилизации Ь-арабинозы и/или к превращению её в Ь-рибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения, как определено выше, и кроме того, они проявляют способность к утилизации ксилозы и/или к превращению ксилозы в ксилулозу. Превращение ксилозы в ксилулозу предпочтительно представляет собой одностадийный процесс изомеризации (прямой изомеризации ксилозы в ксилулозу). Таким образом, клетки этого типа способны утилизировать и Ьарабинозу, и ксилозу. Утилизация ксилозы предпочтительно означает то же самое, что и утилизация Ь-арабинозы, как определено выше.

Применяются такие же обозначения ферментов, как в \УО 06/009434, в отношении ксилозоизомеразы (ЕС 5.3.1.5), ксилулозокиназы (ЕС 2.7.1.17), рибулозо-5-фосфат-эпимеразы (5.1.3.1), рибулозо-5фосфат-изомеразы (ЕС 5.3.1.6), транскетолазы (ЕС 2.2.1.1), трансальдолазы (ЕС 2.2.1.2) и альдозоредуктазы (ЕС 1.1.1.21).

В предпочтительном воплощении эукариотические клетки по изобретению, экспрессирующие агаА, агаВ и атаЭ, как определено выше, обладают способностью к изомеризации ксилозы в ксилулозу, как описано, например, в \УО 03/0624430 или в \УО 06/009434. Способность к изомеризации ксилозы в ксилулозу придается клеткам-хозяин при трансформации их конструкцией из нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу. Способность трансформированных клеток к изомеризации ксилозы в ксилулозу представляет собой прямую изомеризацию ксилозы в ксилулозу. Это значит, что ксилоза подвергается изомеризации в ксилулозу при одной единственной реакции, катализируемой ксилозоизомеразой в отличие от двухстадийного превращения ксилозы в ксилулозу через промежуточный продукт ксилитол, которое катализируется ксилозоредуктазой и ксилитолдегидрогеназой соответственно.

Нуклеотидная последовательность кодирует такую ксилозоизомеразу, которая предпочтительно экспрессируется в активной форме в трансформированных клетках-хозяин. Так, экспрессия нуклеотидной последовательности в клетках-хозяин дает ксилозоизомеразу с удельной активностью по меньшей мере 10 ед. ксилозоизомеразной активности на 1 мг белка при 30°С, предпочтительно по меньшей мере 20, 25, 30, 50, 100, 200, 300 или 500 ед. на 1 мг белка при 30°С. Удельная активность ксилозоизомеразы, экспрессируемой в трансформированных клетках-хозяин, определяется как количество единиц ксилозоизомеразной активности на 1 мг белка бесклеточного лизата клеток хозяина, например бесклеточного лизата дрожжевых клеток. Определение ксилозоизомеразной активности уже было описано ранее.

Предпочтительно экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу в клетках-хозяин, дает ксилозоизомеразу со значением К_м для ксилозы менее 50, 40, 30 или 25 мМ, более предпочтительно значение К_м для ксилозы составляет около 20 мМ или меньше.

Предпочтительная нуклеотидная последовательность, кодирующая ксилозоизомеразу, может быть выбрана из группы, состоящей из (е) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0: 7 или 8ЕО ГО N0: 15;

(1) нуклеотидных последовательностей, включающих нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО N0: 8 или ЛЬ) ГО N0: 16;

(д) нуклеотидных последовательностей, у которых комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (а) или (Ь);

(к) нуклеотидных последовательностей, у которых последовательность отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (с) вследствие вырожденности генетического кода.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая ксилозоизомеразу, может кодировать либо прока

- 9 016303 риотическую, либо эукариотическую ксилозоизомеразу, т.е ксилозоизомеразу, у которой аминокислотная последовательность идентична последовательности ксилозоизомеразы, встречающейся в природе у прокариотического либо эукариотического организма. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что способность конкретной ксилозоизомеразы придавать эукариотическим клеткам-хозяин способность к изомеризации ксилозы в ксилулозу не слишком зависит от того, имеет ли изомераза прокариотическое или эукариотическое происхождение. Скорее это зависит от родственности аминокислотной последовательности изомеразы к последовательности Рпошусек (8ЕО ΙΌ N0: 7). Неожиданно эукариотическая изомераза Рпошусек оказалась более родственной прокариотическим изомеразам, чем другим известным эукариотическим изомеразам. Поэтому предпочтительная нуклеотидная последовательность кодирует такую ксилозоизомеразу, аминокислотная последовательность которой родственна последовательности Рпошусек, как определено выше. Предпочтительная нуклеотидная последовательность кодирует грибковую ксилозоизомеразу (например, из Ва816юшусе!е), более предпочтительно ксилозоизомеразу из анаэробного грибка, например ксилозоизомеразу из анаэробного грибка, принадлежащего к семейству №осаШшайгх, Саесошусек, Рпошусек, Огршошусек или Витшошусек. В качестве альтернативы предпочтительная нуклеотидная последовательность кодирует бактериальную ксилозоизомеразу предпочтительно из грамотрицательных бактерий, более предпочтительно ксилозоизомеразу из класса Вас1его1бе5 или из рода Вас1егсн6е5. наиболее предпочтительно из В. 111е1аю1ао1шсгоп (8Е0 ΙΌ N0: 15).

Для повышения вероятности того, что ксилозоизомераза будет экспрессироваться в активной форме в эукариотических клетках-хозяин, к примеру дрожжевых клетках, нуклеотидная последовательность, кодирующая ксилозоизомеразу, может быть подвергнута оптимизации по употребительности кодонов к данным эукариотическим клеткам-хозяин, как определено выше.

Клетки-хозяин для трансформирования нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу, как описано выше, предпочтительно представляют собой клетки-хозяин, обладающие способностью к активному или пассивному транспорту ксилозы внутрь клетки. Предпочтительно клеткихозяин содержат систему активного гликолиза. Клетки-хозяин могут дополнительно содержать эндогенный пентозофосфатный путь и могут содержать эндогенную ксилулозокиназную активность с тем, чтобы ксилулоза, образовавшаяся при изомеризации ксилозы, могла подвергаться метаболическому превращению в пируват. Клетки предпочтительно дополнительно содержат ферменты для превращения пирувата в желательный продукт брожения, такой как этанол, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, аминокислоты, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, бутанол, β-лактамовый антибиотик или цефалоспорин. Предпочтительными клетками-хозяин являются клетки, от природы обладающие способностью к спиртовому брожению, предпочтительно анаэробному спиртовому брожению. Клетки-хозяин также предпочтительно обладают высокой устойчивостью к этанолу, высокой устойчивостью к низким значениям рН (т.е. способностью к росту при рН ниже 5, 4, 3 или 2,5) и к органическим кислотам типа молочной, уксусной или муравьиной кислоты, и к таким продуктам деградации сахаров, как фурфураль и гидроксиметилфурфураль, а также высокой устойчивостью к повышенным температурам. Любые из этих характеристик или активностей клеток-хозяин могут присутствовать в них естественным образом либо могут быть введены или модифицированы посредством генетической модификации. Подходящими клетками являются эукариотические микроорганизмы, такие, к примеру, как грибки, однако, в качестве клеток-хозяин больше всего подходят дрожжи или нитчатые грибы. Предпочтительные дрожжи и нитчатые грибы уже были определены ранее.

В настоящем изобретении выражение клетки-хозяин означает то же самое, что клетки.

Клетки изобретения предпочтительно трансформируют конструкцией из нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу. Предпочтительно используется та же самая конструкция, которая используется для нуклеотидных последовательностей, кодирующих агаА, агаВ или агаЭ.

В следующем предпочтительном воплощении изобретения клетки по изобретению, экспрессирующие агаА, агаВ и агаЭ и проявляющие способность к прямой изомеризации ксилозы в ксилулозу, как определено выше, дополнительно содержат генетическую модификацию, повышающую мощность пентозофосфатного пути, как описано в \У0 06/009434. В частности, генетическая модификация вызывает повышение мощности неокислительной части пентозофосфатного пути. Генетическая модификация, вызывающая повышение мощности неокислительной части пентозофосфатного пути, в настоящем изобретении означает такую модификацию, которая повышает мощность по меньшей мере в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 или 20 раз по сравнению с мощностью у такого штамма, который генетически идентичен во всем, кроме генетической модификации, вызывающей повышение мощности. Мощность неокислительной части пентозофосфатного пути может быть измерена путем культивирования модифицированных клеток на ксилозе как на единственном источнике углерода, определения удельной скорости потребления ксилозы и вычитания удельной скорости образования ксилитола из удельной скорости потребления ксилозы, если при этом образуется ксилитол. Однако мощность неокислительной части пентозофосфатного пути пропорциональна скорости роста на ксилозе как на единственном источнике углерода, предпочтительно скорости анаэробного роста на ксилозе как на единственном источнике углерода. Существует линейная зави

- 10 016303 симость между скоростью роста на ксилозе как на единственном источнике углерода (Цтах) и мощностью неокислительной части пентозофосфатного пути. Удельная скорость потребления ксилозы (О_?,) равняется скорости роста (μ), деленной на выход биомассы на сахаре (Υ_Χ8), поскольку выход биомассы на сахаре является постоянным (при данном наборе условий: анаэробности, среде роста, рН, генетическом фоне штамма и т.п.), т.е. Ο_?,=μ/Υ,._:?,). Поэтому повышение мощности неокислительной части пентозофосфатного пути можно вывести из повышения максимальной скорости роста при этих условиях. В предпочтительном воплощении клетки содержат генетическую модификацию, повышающую мощность пентозофосфатного пути, и имеют удельную скорость потребления ксилозы как минимум 346 мг ксилозы/г биомассы/ч.

Генетические модификации, повышающие мощность пентозофосфатного пути, могут быть введены в клетки-хозяин различными способами. Они включают, например, повышение стационарного уровня активности ксилулозокиназы и/или одного или нескольких ферментов неокислительной части пентозофосфатного пути и/или снижение стационарного уровня активности неспецифической альдозоредуктазы. Эти изменения стационарных уровней активности могут осуществляться путем селекции мутантов (спонтанных или индуцированных с помощью химических веществ или радиации) и/или по технологии рекомбинантной ДНК, например, путем суперэкспрессии или инактивации, соответственно, генов, кодирующих ферменты, или факторов, регулирующих эти гены.

В более предпочтительных клетках-хозяин генетическая модификация включает суперэкспрессию по меньшей мере одного фермента (неокислительной части) пентозофосфатного пути. Предпочтительно фермент выбирается из группы, состоящей из ферментов рибулозо-5-фосфат-изомеразы, рибулозо-5фофат-эпимеразы, транскетолазы и трансальдолазы, как описано в ОТО 06/009434.

Суперэкспрессии могут подвергаться различные комбинации ферментов (неокислительной части) пентозофосфатного пути. Например, суперэкспрессии могут подвергаться такие ферменты, как минимум, ферменты рибулозо-5-фосфат-изомераза и рибулозо-5-фосфат-эпимераза; или, как минимум, ферменты рибулозо-5-фосфат-изомераза и транскетолаза; или, как минимум, ферменты рибулозо-5-фосфатизомераза и трансальдолаза; или, как минимум, ферменты рибулозо-5-фосфат-эпимераза и транскетолаза; или, как минимум, ферменты рибулозо-5-фосфат-эпимераза и трансальдолаза; или, как минимум, ферменты транскетолаза и трансальдолаза; или, как минимум, ферменты рибулозо-5-фосфат-эпимераза, транскетолаза и трансальдолаза; или, как минимум, ферменты рибулозо-5-фосфат-изомераза, транскетолаза и трансальдолаза; или, как минимум, ферменты рибулозо-5-фосфат-изомераза, рибулозо-5-фосфатэпимераза и трансальдолаза; или, как минимум, ферменты рибулозо-5-фосфат-изомераза, рибулозо-5фосфат-эпимераза и транскетолаза. В одном воплощении изобретения суперэкспрессии в клетках-хозяин подвергается каждый из ферментов: рибулозо-5-фосфат-изомераза, рибулозо-5-фосфат-эпимераза, транскетолаза и трансальдолаза. Более предпочтительными являются такие клетки-хозяин, у которых генетическая модификация включает, по меньшей мере, суперэкспрессию двух ферментов - транскетолазы и трансальдолазы, так как такие клетки-хозяин уже обладают способностью к анаэробному росту на ксилозе. В самом деле, оказалось, что в этих условиях клетки-хозяин, суперэкспрессирующие только транскетолазу и трансальдолазу, уже обладают такой же скоростью анаэробного роста на ксилозе, как и клетки-хозяин, суперэкспрессирующие все четыре фермента, т.е. рибулозо-5-фосфат-изомеразу, рибулозо-5-фосфат-эпимеразу, транскетолазу и трансальдолазу. Более того, клетки-хозяин, суперэкспрессирующие два фермента - рибулозо-5-фосфат-изомеразу и рибулозо-5-фосфат-эпимеразу, предпочтительней, чем клетки-хозяин, суперэкспрессирующие только изомеразу или только эпимеразу, так как суперэкспрессия только одного из этих ферментов может вызвать метаболические нарушения.

Существуют различные доступные способы суперэкспрессирования ферментов в клетках изобретения. В частности, фермент может быть подвергнут суперэкспрессии путем повышения числа копий гена, кодирующего этот фермент в клетках-хозяин, например, посредством встраивания дополнительных копий гена в геном клеток-хозяин, экспрессирования гена из множественных копий эписомного экспрессионного вектора или введения эписомного экспрессионного вектора, содержащего множественные копии гена.

В качестве альтернативы суперэкспрессия ферментов в клетках-хозяин по изобретению может осуществляться при помощи промотора, являющегося чужеродным по отношению к последовательности, кодирующей суперэкспрессируемый фермент, т.е. промотора, гетерологичного для той кодирующей последовательности, с которой он функционально связан. Подходящие для этой цели промоторы уже были определены выше.

Кодирующая последовательность, используемая для суперэкспрессии ферментов, предпочтительно является гомологичной для клеток хозяина по изобретению. Однако равным образом можно использовать и кодирующие последовательности, гетерологичные для клеток-хозяин по изобретению, как указано в ОТО 06/009434.

Нуклеотидная последовательность, используемая для суперэкспрессии рибулозо-5-фосфатизомеразы в клетках-хозяин по изобретению, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с рибулозо-5-фосфат-изомеразной активностью, при этом предпочтительно

- 11 016303 полипептид имеет такую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 17, или же нуклеотидная последовательность способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 18 при умеренных условиях, предпочтительно при строгих условиях.

Нуклеотидная последовательность, используемая для суперэкспрессии рибулозо-5-фосфатэпимеразы в клетках-хозяин по изобретению, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с рибулозо-5-фосфат-эпимеразной активностью, при этом предпочтительно полипептид имеет такую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 19, или же нуклеотидная последовательность способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 20 при умеренных условиях, предпочтительно при строгих условиях.

Нуклеотидная последовательность, используемая для суперэкспрессии транскетолазы в клеткаххозяин по изобретению, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с транскетолазной активностью, при этом предпочтительно полипептид имеет такую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 21, или же нуклеотидная последовательность способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 22 при умеренных условиях, предпочтительно при строгих условиях.

Нуклеотидная последовательность, используемая для суперэкспрессии трансальдолазы в клеткаххозяин по изобретению, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с трансальдолазной активностью, при этом предпочтительно полипептид имеет такую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 23, или же нуклеотидная последовательность способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 24 при умеренных условиях, предпочтительно при строгих условиях.

Суперэкспрессия фермента, когда это относится к продукции фермента в генетически модифицированных клетках-хозяин, означает то, что фермент вырабатывается при более высоком уровне энзиматической активности по сравнению с немодифицированными клетками-хозяин в идентичных условиях. Обычно это значит, что энзиматически активный белок (или белки в случае ферментов из нескольких субъединиц) вырабатывается в большем количестве или же на более высоком стационарном уровне по сравнению с немодифицированными клетками-хозяин в идентичных условиях. Аналогичным образом это обычно значит, что мРНК, кодирующая энзиматически активный белок, вырабатывается в большем количестве или опять же на более высоком стационарном уровне по сравнению с немодифицированными клетками-хозяин в идентичных условиях. Суперэкспрессия фермента при этом предпочтительно определяется измерением уровня удельной активности фермента в клетках-хозяин при помощи соответствующих методов определения, как описано в настоящем изобретении. С другой стороны, суперэкспрессия фермента может определяться косвенным образом путем количественного определения удельного стационарного уровня белка фермента, например, с помощью антител, специфичных к этому ферменту, либо путем количественного определения удельного стационарного уровня мРНК, кодирующей этот фермент. Последнее может особенно подойти для ферментов пентозофосфатного пути, для которых энзиматические методы трудно достижимы, так как субстраты для ферментов не являются коммерчески доступными. Предпочтительно подлежащий суперэкспрессии в клетках-хозяин по изобретению фермент суперэкспрессируется по меньшей мере в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 или 20 раз по сравнению со штаммом, который генетически идентичен во всем, кроме генетической модификации, вызывающей суперэкспрессию. Следует иметь в виду, что эти уровни суперэкспрессии могут относиться к стационарному уровню активности фермента, стационарному уровню белка фермента, а также к стационарному уровню транскрипта, кодирующего этот фермент.

В следующем предпочтительном воплощении клетки-хозяин по изобретению, экспрессирующие агаА, агаВ и агаЭ и проявляющие способность к прямой изомеризации ксилозы в ксилулозу, а также необязательно содержащие генетическую модификацию, повышающую мощность пентозофосфатного пути, как определено выше, дополнительно содержат генетическую модификацию, повышающую удельную активность ксилулозокиназы. Предпочтительно генетическая модификация вызывает суперэкспрессию ксилулозокиназы, например, посредством суперэкспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилулозокиназу. Ген, кодирующий ксилулозокиназу, может быть эндогенным для клетокхозяин или же ксилулозокиназа может быть гетерологична клеткам-хозяин. Нуклеотидная последовательность, используемая для суперэкспрессии ксилулозокиназы в клетках-хозяин по изобретению, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с ксилулозокиназной активностью, при этом предпочтительно полипептид имеет такую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 25, или же нуклеотидная последовательность способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 26 при умеренных условиях, предпочтительно при строгих условиях.

Особенно предпочтительной ксилулозокиназой является ксилулозокиназа, которая родственна ксилулозокиназе ху1В из Р1гошуее8, как указано в XV0 03/0624430. Более предпочтительно нуклеотидная последовательность, используемая при суперэкспрессии ксилулозокиназы в клетках-хозяин по изобрете

- 12 016303 нию, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с ксилулозокиназной активностью, при этом предпочтительно полипептид имеет такую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 или 95% идентична 8ЕЦ ГО N0. 27, или же нуклеотидная последовательность способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью 8Е0 ГО N0. 28 при умеренных условиях, предпочтительно при строгих условиях.

В клетках-хозяин по изобретению генетическую модификацию, повышающую удельную активность ксилулозокиназы, можно комбинировать с любой из модификаций, повышающих мощность пентозофосфатного пути, как описано выше, но такое комбинирование не является существенным для изобретения. Так, изобретение определенно охватывает клетки-хозяин по изобретению, содержащие генетическую модификацию, повышающую удельную активность ксилулозокиназы, наряду с экспрессией ферментов агаА, агаВ и атаЭ, как определено в настоящем изобретении. Различные доступные способы осуществления и анализа суперэкспрессии ксилулозокиназы в клетках-хозяин по изобретению являются такими же, как описано выше для ферментов пентозофосфатного пути. Предпочтительно подлежащая суперэкспрессии в клетках-хозяин по изобретению ксилулозокиназа суперэкспрессируется по меньшей мере в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 или 20 раз по сравнению со штаммом, который генетически идентичен во всем, кроме генетической модификации, вызывающей суперэкспрессию. Следует иметь в виду, что эти уровни суперэкспрессии могут относиться к стационарному уровню активности фермента, стационарному уровню белка фермента, а также к стационарному уровню транскрипта, кодирующего этот фермент.

В следующем предпочтительном воплощении клетки-хозяин по изобретению, экспрессирующие агаА, агаВ и атаЭ и проявляющие способность к прямой изомеризации ксилозы в ксилулозу, а также необязательно содержащие генетическую модификацию, повышающую мощность пентозофосфатного пути, и/или дополнительно содержащие генетическую модификацию, повышающую удельную активность ксилулозокиназы, как определено выше, дополнительно содержат генетическую модификацию, уменьшающую активность неспецифической альдозоредуктазы в клетках-хозяин. Предпочтительно активность неспецифической альдозоредуктазы уменьшается в клетках-хозяин при одной или нескольких генетических модификациях, снижающих экспрессию или инактивирующих ген, кодирующий неспецифическую альдозоредуктазу, как описано в А0 06/009434. Предпочтительно генетическая модификация снижает или инактивирует экспрессию каждой эндогенной копии гена, кодирующего неспецифическую альдозоредуктазу в клетках-хозяин. Клетки-хозяин могут содержать множественные копии генов, кодирующих вследствие ди-, поли- или анеуплоидности, и/или клетки-хозяин могут содержать несколько различных ферментов с активностью альдозоредуктазы, отличающихся по аминокислотной последовательности, при этом все они кодируются разными генами. И в таких случаях предпочтительно снижается или инактивируется экспрессия каждого гена, кодирующего неспецифическую альдозоредуктазу. Предпочтительно ген инактивируется при помощи делеции по крайней мере части гена или разрушения гена, при этом термин ген также охватывает и некодирующую последовательность впереди или позади от той кодирующей последовательности, (частичная) делеция или инактивация которой приводит к снижению экспрессии неспецифической альдозоредуктазной активности в клетках-хозяина. Нуклеотидная последовательность, кодирующая альдозоредуктазу, активность которой подлежит уменьшению в клеткаххозяин по изобретению, представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с альдозоредуктазной активностью, при этом предпочтительно полипептид имеет такую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентична 8ЕЦ ГО N0: 29, или же нуклеотидная последовательность способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью 8ЕС ГО N0: 30 при умеренных условиях, предпочтительно при строгих условиях.

В клетках-хозяин по изобретению экспрессию ферментов агаА, агаВ и атаЭ, как определено выше, можно комбинировать с генетической модификацией, снижающей активность неспецифической альдозоредуктазы. Генетическую модификацию, вызывающую снижение активности неспецифической альдозоредуктазы, можно комбинировать с любой из модификаций, повышающих мощность пентозофосфатного пути, и/или с любой из модификаций, повышающих удельную активность ксилулозокиназы в клетках-хозяин, как описано выше, но такое комбинирование не является существенным для изобретения. Так, изобретение определенно охватывает клетки-хозяин, экспрессирующие агаА, агаВ и атаЭ, содержащие дополнительную генетическую модификацию, вызывающую снижение неспецифической альдозоредуктазной активности.

В предпочтительном воплощении клетки-хозяин представляют собой клетки СВ8 120327, депонированные в Институте СВ8 (Нидерланды) 27 сентября 2006 г.

В следующем предпочтительном воплощении изобретение касается модифицированных клетокхозяин, дополнительно адаптированных к утилизации Ь-арабинозы (утилизации Ь-арабинозы и/или превращению её в Ь-рибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения) и необязательно ксилозы путем селекции мутантов, спонтанных или индуцированных (например, с помощью радиации или химических веществ), в отношении роста на Ь-арабинозе и необязательно ксилозе как единственном источнике углерода, более предпочтительно в анаэробных условиях. Селекция мутантов может осуществляться методом серийного пересева культур, например, как описано в Киурег с1 а1. (2004, ЕЕМ8 Уеак! Кек. 4: 655-664), и/или методом культивирования при селекционном давлении в хемостате,

- 13 016303 как описано в примере 4 в \У0 06/009434. Процесс селекции может продолжаться столько, сколько нужно. Предпочтительно этот процесс селекции длится от 1 недели до 1 года. Но при необходимости он может продолжаться и дольше. Во время процесса селекции клетки предпочтительно культивируют в присутствии примерно 20 г/л Ь-арабинозы и/или примерно 20 г/л ксилозы. Полученные по окончании этого процесса селекции клетки должны быть улучшенными в отношении их способности к утилизации Ьарабинозы и/или ксилозы и/или к превращению Ь-арабинозы в Ь-рибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения типа этанола. При этом улучшенные клетки может означать то, что полученные клетки способны утилизировать Ь-арабинозу и/или ксилозу более эффективным образом, чем клетки, из которых они происходят. Например, полученные клетки должны лучше расти: повышение удельной скорости роста по меньшей мере на 2%, чем клеток, из которых они происходят, в одинаковых условиях. Предпочтительно повышение составляет по меньшей мере 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25% или больше. Удельная скорость роста может быть рассчитана из 0И₆₆₀, как это известно специалистам. Таким образом, по значениям 0И₆₆₀ можно вычислить удельную скорость роста. В этом плане улучшенные клетки может также означать и то, что полученные клетки должны превращать Ь-арабинозу в Ь-рибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или желательный продукт брожения типа этанола более эффективным образом, чем клетки, из которых они происходят. Например, полученные клетки должны вырабатывать большее количество Ь-рибулозы, и/или ксилулозо-5-фосфата, и/или желательного продукта брожения типа этанола: повышение по меньшей мере одного из этих соединений по меньшей мере на 2%, чем клетки, из которых они происходят, в одинаковых условиях. Предпочтительно повышение составляет по меньшей мере 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25% или больше. В этом плане улучшенные клетки может также означать и то, что полученные клетки должны превращать ксилозу в ксилулозу и/или желательный продукт брожения типа этанола более эффективным образом, чем клетки, из которых они происходят. Например, полученные клетки должны вырабатывать большее количество ксилулозы и/или желательного продукта брожения типа этанола: повышение по меньшей мере одного из этих соединений по меньшей мере на 2%, чем клетки, из которых они происходят, в одинаковых условиях. Предпочтительно повышение составляет по меньшей мере 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25% или больше.

У предпочтительных клеток-хозяин по изобретению по меньшей мере одна из генетических модификаций, описанных выше, включая модификации, полученные путем селекции мутантов, придает клеткам-хозяин способность к росту на Ь-арабинозе и необязательно ксилозе в качестве источника углерода, предпочтительно единственного источника углерода, предпочтительно в анаэробных условиях. Предпочтительно модифицированные клетки-хозяин практически не вырабатывают ксилитол, например ксилитол образуется на уровне ниже предела обнаружения или же составляет, к примеру, менее 5, 2, 1, 0,5, или 0,3% потребленного углерода в молях.

Предпочтительно модифицированные клетки-хозяин обладают способностью к росту на Ьарабинозе и необязательно ксилозе в качестве единственного источника углерода со скоростью по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 или 0,3 ч^-1 в аэробных условиях либо, если это применимо, со скоростью по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,12, 0,15 или 0,2 ч^-1 в анаэробных условиях. Предпочтительно модифицированные клетки-хозяин обладают способностью к росту на смеси глюкозы и Ь-арабинозы и необязательно ксилозы (в соотношении 1:1 по весу) в качестве единственного источника углерода со скоростью по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 или 0,3 ч^-1 в аэробных условиях либо, если это применимо, со скоростью по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,03, 0,05, ОД, 0,12, 0,15 или 0,2 ч^-1 в анаэробных условиях.

Предпочтительно у модифицированных клеток-хозяин удельная скорость потребления Ь-арабинозы и необязательно ксилозы составляет по меньшей мере 346, 350, 400, 500, 600, 650, 700, 750, 800, 900 или 1000 мг/г клеток/ч. Предпочтительно у модифицированных клеток-хозяин выход продукта брожения (типа этанола) на Ь-арабинозе и необязательно ксилозе составляет по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95 или 98% от выхода продукта брожения (типа этанола) на глюкозе у клетокхозяин. Более предпочтительно у модифицированных клеток хозяина выход продукта брожения (типа этанола) на Ь-арабинозе и необязательно ксилозе равен выходу продукта брожения (типа этанола) на глюкозе у клеток-хозяин. Аналогичным образом, у модифицированных клеток-хозяин выход биомассы на Ь-арабинозе и необязательно ксилозе предпочтительно составляет по меньшей мере 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95 или 98% от выхода биомассы на глюкозе у клеток-хозяин. Более предпочтительно у модифицированных клеток-хозяин выход биомассы на Ь-арабинозе и необязательно ксилозе равен выходу биомассы на глюкозе у клеток-хозяин. Следует иметь в виду, что при сравнении выхода на глюкозе и на Ьарабинозе и необязательно ксилозе сравнивают оба значения в аэробных условиях либо оба значения в анаэробных условиях.

В более предпочтительном воплощении клетки-хозяин представляют собой клетки СВ8 120328, депонированные в Институте СВ8 (Нидерланды) 27 сентября 2006 г., или клетки СВ8 121879, депонированные в Институте СВ8 (Нидерланды) 20 сентября 2007 г.

В предпочтительном воплощении клетки экспрессируют один или несколько ферментов, придающих клеткам способность к вырабатыванию по меньшей мере одного продукта брожения, выбранного из группы, состоящей из этанола, молочной кислоты, 3-гидроксипропионовой кислоты, акриловой кислоты,

- 14 016303 уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, аминокислот, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, бутанола, β-лактамовых антибиотиков и цефалоспоринов. В более предпочтительном воплощении клетки-хозяин по изобретению представляют собой клеткихозяин для получения этанола. В другом предпочтительном воплощении изобретение касается трансформированных клеток-хозяин для получения других продуктов брожения, чем этанол. Такие неэтаноловые продукты брожения в принципе включают любые валовые или тонкие химические соединения, вырабатываемые такими эукариотическими микроорганизмами, как дрожжи или нитчатые грибы. К таким продуктам брожения относятся, например, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, аминокислоты, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, бутанол, β-лактамовые антибиотики и цефалоспорины. Предпочтительными клетками-хозяин по изобретению для получения неэтаноловых продуктов брожения являются клетки, содержащие генетическую модификацию, вызывающую снижение активности алкогольдегидрогеназы.

Способ.

В следующем аспекте изобретение касается процессов брожения, при которых клетки-хозяин по изобретению используются для сбраживания источника углерода, включающего источник Ь-арабинозы и необязательно источник ксилозы. Предпочтительно источником Ь-арабинозы и источником ксилозы является Ь-арабиноза и ксилоза. Кроме того, источник углерода в среде брожения также может включать и источник глюкозы. Источником Ь-арабинозы, ксилозы или глюкозы может быть сама Ь-арабиноза, ксилоза или глюкоза либо какой-нибудь углеводный олиго- или полимер, содержащий звенья Ь-арабинозы, ксилозы или глюкозы, такой, к примеру, как лигноцеллюлоза, ксиланы, целлюлоза, крахмал, арабинан и др. Для высвобождения мономеров ксилозы или глюкозы из таких углеводов в среду брожения могут быть добавлены соответствующие карбогидразы (как ксиланазы, глюканазы, амилазы и т.п.) или же они могут вырабатываться модифицированными клетками-хозяин. В последнем случае модифицированные клетки-хозяин могут подвергаться генетической инженерии, чтобы они вырабатывали и выделяли такие карбогидразы. Дополнительное преимущество использования олиго- или полимерных источников глюкозы состоит в том, что оно позволяет поддерживать низкую концентрацию глюкозы во время брожения, например, используя лимитирующее скорость количество карбогидразы. В свою очередь это должно предотвратить репрессию систем, необходимых для метаболизма и транспорта таких неглюкозных сахаров, как ксилоза. В предпочтительном способе модифицированные клетки-хозяин сбраживают как Ьарабинозу (необязательно ксилозу), так и глюкозу, предпочтительно одновременно, причем в этом случае предпочтительно используются модифицированные клетки-хозяин, не чувствительные к репрессии глюкозой, чтобы предотвратить диауксический рост. Наряду с источником Ь-арабинозы, необязательно ксилозы (и глюкозы) как источника углерода, среда брожения должна дополнительно содержать надлежащие ингредиенты, необходимые для роста модифицированных клеток-хозяин. Составы сред брожения для выращивания таких микроорганизмов, как дрожжи или нитчатые грибы, хорошо известны в этой области.

В предпочтительном способе предусматривается способ получения продукта брожения, выбранного из группы, состоящей из этанола, молочной кислоты, 3-гидроксипропионовой кислоты, акриловой кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, аминокислот, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, бутанола, β-лактамовых антибиотиков и цефалоспоринов, при этом способ включает стадии:

(a) сбраживания среды, содержащей источник Ь-арабинозы и необязательно ксилозы, с помощью модифицированных клеток-хозяин, как определено в настоящем изобретении, при этом клетки-хозяин сбраживают Ь-арабинозу и необязательно ксилозу до этого продукта брожения, и необязательно (b) извлечения продукта брожения.

Процесс брожения является способом получения продуктов брожения, таких, например, как этанол, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, аминокислоты, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, бутанол, β-лактамовые антибиотики типа пенициллина С или пенициллина V и их ферментативные производные и/или цефалоспорины. Процесс брожения может быть аэробным или анаэробным процессом. Анаэробный процесс брожения определяется в настоящем изобретении как такой процесс брожения, который протекает в отсутствие кислорода или в котором кислород практически не расходуется, предпочтительно расходуется менее 5, 2,5 или 1 ммоль/л/ч, более предпочтительно расходуется 0 ммоль/л/ч (т. е. потребление кислорода не обнаруживается), и при этом и донорами электронов, и акцепторами электронов служат органические молекулы. В отсутствие кислорода вырабатываемый при гликолизе и образовании биомассы ΝΑΌΗ не может подвергаться окислению посредством окислительного фосфорилирования. Чтобы решить эту проблему, многие микроорганизмы в качестве акцептора электронов и водорода используют пируват или одно из его производных и при этом регенерируют ΝΑΌ⁺. Так, в предпочтительном способе анаэробного брожения в качестве акцептора электронов (и водорода) используется пируват, который восстанавливается до таких продуктов брожения, как этанол, молочная кислота,

- 15 016303

3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, аминокислоты, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, бутанол, β-лактамовые антибиотики и цефалоспорины. В предпочтительном воплощении процесс брожения является анаэробным. Анаэробный способ является выгодным, так как он дешевле, чем аэробные способы: требуется меньше специального оборудования. Кроме того, анаэробные способы должны давать больший выход продукта, чем аэробные способы. В аэробных условиях обычно бывает больший выход биомассы, чем в анаэробных условиях. Вследствие этого в аэробных условиях ожидаемый выход продукта обычно бывает ниже, чем в анаэробных условиях. Согласно авторам изобретения способ изобретения является первым анаэробным процессом брожения с использованием среды, содержащей источник Ьарабинозы, который был разработан до сих пор.

В другом предпочтительном воплощении процесс брожения протекает в условиях ограничения кислорода. Более предпочтительно процесс брожения является аэробным и протекает в условиях ограничения кислорода. Процесс брожения с ограничением кислорода - это такой процесс, в котором потребление кислорода ограничено переносом кислорода из газа в жидкость. Степень ограничения кислорода определяется количеством и составом поступающего потока газа, а также фактическими свойствами перемешивания и массообмена используемого ферментационного оборудования. Предпочтительно в процессе с ограничением кислорода скорость потребления кислорода составляет по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6 и еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч.

Процесс брожения предпочтительно протекает при температуре, оптимальной для модифицированных клеток. Так, для большинства дрожжевых и грибковых клеток процесс брожения проводится при температуре менее 42°С, предпочтительно менее 38°С. Для клеток-хозяин из дрожжей или нитчатых грибов процесс брожения предпочтительно проводится при температуре менее 35, 33, 30 или 28°С и более 20, 22 или 25°С.

Предпочтительным способом является способ получения этанола, при этом способ включает стадии: (а) сбраживания среды, содержащей источник Ь-арабинозы и необязательно ксилозы, с помощью модифицированных клеток-хозяин, как определено в настоящем изобретении, при этом клетки-хозяин сбраживают Ь-арабинозу и необязательно ксилозу до этанола, и необязательно (Ь) извлечения этанола. Среда брожения также может включать источник глюкозы, которая тоже сбраживается до этанола. В предпочтительном воплощении процесс брожения для получения этанола является анаэробным. Анаэробность уже была определена выше. В другом предпочтительном воплощении процесс брожения для получения этанола является аэробным. В следующем предпочтительном воплощении процесс брожения для получения этанола протекает в условиях ограничения кислорода, более предпочтительно он является аэробным и протекает в условиях ограничения кислорода. Условиях ограничения кислорода уже были определены выше.

В способе объемная продукция этанола предпочтительно составляет по меньшей мере 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 или 10,0 г этанола на л/ч. Выход этанола на Ь-арабинозе и необязательно ксилозе и/или глюкозе в способе предпочтительно составляет по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98%. Выход этанола при этом определяется как процент от теоретически максимального выхода, который для глюкозы, Ь-арабинозы и необязательно ксилозы составляет 0,51 г этанола на 1 г глюкозы или ксилозы. В другом предпочтительном воплощении изобретение касается способа получения продукта брожения, выбранного из группы, состоящей из молочной кислоты, 3-гидроксипропионовой кислоты, акриловой кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, аминокислот, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, бутанола, β-лактамовых антибиотиков и цефалоспоринов. Способ предпочтительно включает стадии: (а) сбраживания среды, содержащей источник Ь-арабинозы и необязательно ксилозы, с помощью модифицированных клеток-хозяин, как определено выше в настоящем изобретении, при этом клетки-хозяин сбраживают Ь-арабинозу и необязательно ксилозу до продукта брожения, и необязательно (Ь) извлечения продукта брожения. В предпочтительном способе среда также содержит источник глюкозы.

В способе брожения по изобретению, ведущем к получению этанола, можно отметить некоторые преимущества в сравнении с известными способами спиртового брожения:

возможны анаэробные процессы, также возможны условия ограничения кислорода, можно получить больший выход этанола и большую скорость продукции этанола, используемый штамм способен утилизировать Ь-арабинозу и необязательно ксилозу.

В качестве альтернативы способам брожения, описанным выше, предлагается и другой способ брожения в качестве дополнительного аспекта изобретения, в котором используются по меньшей мере две разновидности клеток для сбраживания источника углерода, содержащего по меньшей мере два источника углерода, выбранные из группы, состоящей из источника Ь-арабинозы, источника ксилозы и источника глюкозы. В этом способе брожения по меньшей мере две разновидности клеток означают то, что этот способ предпочтительно является способом совместного брожения. В одном предпочтительном воплощении используются две разновидности клеток: одна представляет собой клетки изобретения, как

- 16 016303 определено выше, обладающие способностью к утилизации Ь-арабинозы и/или к превращению её в Ьрибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения типа этанола и необязательно способностью к утилизации ксилозы, а другая, к примеру, представляет собой штамм, обладающий способностью к утилизации ксилозы и/или к превращению её в желательный продукт брожения типа этанола, как описано в ОТО 03/062430 и/или ОТО 06/009434. Клетки, обладающие способностью к утилизации ксилозы, предпочтительно представляют собой штамм, проявляющий способность к прямой изомеризации ксилозы в ксилулозу (в одну стадию), как определено выше. Эти два разных штамма предпочтительно культивируют в присутствии источника Ь-арабинозы, источника ксилозы и необязательно источника глюкозы. Три разновидности клеток или больше можно культивировать совместно и/или использовать три или больше источников углерода при условии, что по крайней мере одна разновидность клеток способна утилизировать хотя бы один из имеющихся источников углерода и/или превращать его в желательный продукт брожения типа этанола. Выражение утилизировать хотя бы один источник углерода имеет то же самое значение, что и выражение утилизировать Ь-арабинозу. Выражение превращать его (т.е. источник углерода) в желательный продукт брожения имеет то же самое значение, что и выражение превращать Ь-арабинозу в желательный продукт брожения.

В предпочтительном воплощении изобретение касается способа получения продукта брожения, выбранного из группы, состоящей из этанола, молочной кислоты, 3-гидроксипропионовой кислоты, акриловой кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, аминокислот, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, бутанола, β-лактамовых антибиотиков и цефалоспоринов, при этом способ включает стадии:

(a) сбраживания среды, содержащей, по меньшей мере, источник Ь-арабинозы и источник ксилозы, с помощью клеток по изобретению, как определено ранее в настоящем изобретении, и клеток, обладающих способностью к утилизации ксилозы и/или проявляющих способность к прямой изомеризации ксилозы в ксилулозу, при этом каждые клетки сбраживают Ь-арабинозу и/или ксилозу до этого продукта брожения, и необязательно (b) извлечения продукта брожения.

Все предпочтительные воплощения способов брожения, описанные выше, также являются предпочтительными воплощениями этих дополнительных способов брожения: идентичность продукта брожения, идентичность источника Ь-арабинозы и источника ксилозы, условия брожения (аэробные или анаэробные условия, условия ограничения кислорода, температура, при которой проводится процесс, продукция этанола, выход этанола).

Генетические модификации

Для суперэкспрессии ферментов в клетках-хозяин по изобретению, как описано выше, а также для дополнительной генетической модификации клеток-хозяин, предпочтительно дрожжей, клетки подвергают трансформации различными нуклеиновыми конструкциями по изобретению методами, хорошо известными в этой области. Такие методы известны, например, из стандартных пособий, таких как 8атЬгоок апб 1нкке1 (2001) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (3гб οάίΐίοη). Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогаЮгу. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк или Р. АикиЬе1 е1 а1., ебк., Сштеп! Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сгееп РиЬккЫпд апб ОТ Неу 1п1егкс1епсе, Ые\у Υо^к (1987). Методы трансформации и генетической модификации грибковых клеток-хозяин известны, например, из ЕР-А-0635574, ОТО 98/46772, ОТО 99/60102 и ОТО 00/37671.

Промоторы для нуклеиновых конструкций, предназначенных для суперэкспрессии ферментов в клетках-хозяин по изобретению, уже были описаны выше. В нуклеиновых конструкциях для суперэкспрессии 3'-конец нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, предпочтительно функционально связан с последовательностью терминатора транскрипции. Предпочтительно последовательность терминатора работает в выбранных клетках-хозяин, таких, к примеру, как выбранный вид дрожжей. В любом случае выбор терминатора не является критическим, например, он может происходить из дрожжевого гена, хотя иногда хорошо работают и терминаторы из недрожжевых эукариотических генов. Последовательность терминатора транскрипции предпочтительно дополнительно содержит сигнал полиаденилирования. Предпочтительными последовательностями терминаторов являются терминатор алкогольдегидрогеназы (АЭН1) и терминатор РС11. Более предпочтительно терминаторы АЭН1 и РС11 оба происходят из 8. сегеуЫае (8ЕЦ ГО ЫО: 50 и 8ЕЦ ГО ЫО: 53 соответственно).

Необязательно в нуклеиновой конструкции может находиться селекционный маркер. В настоящем изобретении термин маркер относится к гену, кодирующему признак или фенотип, позволяющий проводить селекцию или скрининг клеток-хозяин, содержащих маркер. Геном-маркером может являться ген устойчивости к антибиотику, при этом соответствующий антибиотик может использоваться для отбора трансформированных клеток из не прошедших трансформацию клеток. Однако предпочтительно используются не маркеры устойчивости к антибиотикам, а другие, к примеру, маркеры ауксотрофности (ИКА3, ТКР1, ЬЕИ2). В предпочтительном воплощении клетки-хозяин, трансформированные нуклеиновыми конструкциями, лишены генов-маркеров. Методы конструирования микробных клеток-хозяин, лишенных рекомбинантных генов-маркеров, раскрыты в ЕР-А-0635574 на основе применения двунаправленных маркеров. В качестве альтернативы в нуклеиновые конструкции по изобретению может быть введен

- 17 016303 такой селекционный маркер, как зеленый флуоресцентный белок, 1ас2, люцифераза, хлорамфениколацетилтрансфераза, β-глюкуронидаза, что позволит проводить скрининг трансформированных клеток.

Необязательные дополнительные элементы, которые могут находиться в нуклеиновых конструкциях по изобретению, включают, без ограничения, одну или несколько последовательностей лидеров, энхансеров, факторов интеграции и/или генов-репортеров, последовательностей интронов, центромеров, теломеров и/или последовательностей прикрепления к матриксу (МАК). Нуклеиновые конструкции по изобретению могут дополнительно содержать последовательность для автономной репликации, как последовательность АК8. Подходящие эписомные нуклеиновые конструкции могут основываться, к примеру, на дрожжевых плазмидах 2μ или рКЭ1 (Е1еег е! а1., 1991, Бю!есйио1оду 9: 968-975). С другой стороны, нуклеиновая конструкция может содержать последовательности для встраивания предпочтительно путем гомологической рекомбинации. При этом такие последовательности могут быть гомологичны намеченному для встраивания сайту в геноме клеток-хозяин. Нуклеиновые конструкции по изобретению могут быть получены каким-нибудь известным способом, что обычно включает такие методы, как разрезание (рестрикция) и соединение (лигирование) нуклеиновых кислот/последовательностей, за которыми отсылаем к стандартным пособиям, таким как 8атЬгоок апб Кикке1 (2001) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (3гб ебйюп), Со1б 8рттд НагЬог ЬаЬогаЮгу, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк.

Методы инактивации и разрушения генов у дрожжей или грибов хорошо известны в этой области (например, см. Ешсйат, 1989, МюгоЬю1 Кет. 53(1): 148-70; и ЕР-А-0635574).

В настоящем документе и его формуле изобретения глагол включать и его формы спряжения применяются в неограничительном смысле, означая то, что включаются следующие за ним предметы, но не исключаются предметы, не отмеченные специально. Кроме того, указание элемента в единственном числе не исключает возможности того, что присутствует больше, чем один элемент, если только по контексту не требуется четко, чтобы был один и только один такой элемент. Так что единственное число обычно означает по меньшей мере одно.

Примеры

Конструирование плазмид и штаммов Штаммы

Утилизирующий Ь-арабинозу штамм 8ассНаготусек се^еν^κ^ае, описанный в данной работе, основан на штамме К^Б220, который сам является производным К^Б217. Штамм К^Б217 представляет собой СЕХРК, у которого подвергнуты суперэкспрессии 4 гена, кодирующие ферменты пентозофосфатного пути: ТАЬ1, ТКЬ1, КРЕ1, ΚΚΙ1 (Киурег е! а1., 2005а). Кроме того, был удален ген, кодирующий альдозоредуктазу (6КЕ3). Штамм К^Б217 также содержит две плазмиды: плазмиду в одной копии с маркером ЬЕИ2 для суперэкспрессии ксилулокиназы (ХК81) и эписомную плазмиду в нескольких копиях с маркером иКА3 для экспрессии ксилозоизомеразы Ху1А. Штамм К^Б217 подвергали процедуре селекции для улучшения роста на ксилозе, которая описана в Киурег е! а1. (2005Ь). Процедура привела к получению двух чистых штаммов, К^Б218 (Киурег е! а1., 2005Ь) и К^Б219. Различие между К^Б218 и К^Б219 состоит в том, что после процедуры селекции К^Б218 был получен при посеве и пересеве штрихом на минеральной среде с глюкозой в качестве источника углерода, тогда как для К^Б219 использовалась ксилоза.

Штамм К^Б219 культивировали неизбирательно на среде УР с глюкозой (УРО) в качестве источника углерода, что способствует потере обеих плазмид. После посева на УРО одиночные колонии тестировали на потерю плазмид, проверяя их на ауксотрофность по урацилу и лейцину. Штамм, потерявший обе плазмиды, подвергали трансформации с помощью р8Н47, содержащей рекомбиназу сге, чтобы удалить кассету КапМХ (6и1бепег е! а1., 1996), которая все еще находилась там после встраивания суперэкспрессирующей конструкции КК11. Колонии с плазмидой ресуспендировали в среде с дрожжевым пептоном (УР) (10 г/л дрожжевого экстракта и 20 г/л пептона, оба фирмы БЭ Эйсо. Бельгия) с 1% галактозы и инкубировали 1 ч при 30°С. Около 200 клеток высеивали на УРО. Образовавшиеся колонии проверяли на потерю маркера КапМХ (устойчивости к 6418) и р8Н47 (ИКА3). Штамм, потерявший и маркер КапМХ, и плазмиду р8Н47, назвали К^Б220. Для получения штамма, тестируемого в этом патенте, К^Б220 подвергали трансформации с помощью рК^231 и рК^243 (табл. 2), получая штамм 1М80001.

Во время конструирования штаммы содержали на комплексной среде УР: 10 г· л^-1 дрожжевого экстракта (ΈΩ Пйсо), 20 г·л^-1 пептона (ΈΩ Ойсо), либо на синтетической среде (МУ) (Уетбиуи е! а1., 1992) с добавлением глюкозы (2%) в качестве источника углерода (УРО или МУЭ) и 1,5% агара в случае чашек. После трансформации плазмидами штаммы высевали на МУЭ. Трансформацию дрожжей проводили согласно 61е!х апб ХУообк (2002). Плазмиды подвергали амплификации в штамме ЕксйепсШа со11 ХЬ-1 Ь1ие (8!та!адепе, Ьа 1о11а, СА, И8А). Трансформацию проводили согласно 1поие е! а1. (1990). Клетки Е. со11 культивировали на чашках со средой ЬБ (Ьшта-Бейаш) или в жидкой среде ТВ (ТегпПс Бто!й) для выделения плазмид (8атЬгоок е! а1., 1989).

Плазмиды

Для того чтобы расти на Ь-арабинозе, дрожжи должны экспрессировать три разных гена: Ьарабинозоизомеразы (АгаА), Ь-рибулокиназы (АгаБ) и Ь-рибулозо-5-Р-4-эпимеразы (АтаЭ) (Бескег апб

- 18 016303

Во1е§, 2003). В настоящей работе было решено экспрессировать АгаА, АгаВ и АгаЭ из молочнокислой бактерии Ьас!оЬасШи8 р1ап!агат в 8. еегеуыае. Поскольку конечной целью является утилизация Ьарабинозы в сочетании с другими сахарами типа Ό-ксилозы, то гены, кодирующие бактериальный Ьарабинозный путь, комбинировали на одной и той же плазмиде с генами, кодирующими утилизацию Όксилозы.

Для того чтобы достичь высокого уровня экспрессии, гены агаА и агаЭ из Ь. р1ап!агит лигировали в плазмиду рАКХ002, т.е. плазмиду 2μ, несущую Ху1А.

Кассету АгаА конструировали путем амплификации укороченного варианта промотора ΤΌΗ3 с помощью олигонуклеотидов 8реI-5'Ρΐбй3 и 5'Α^аΑ-Ρΐбй3 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 49), гена АгаА с помощью Ρ(6Ιι5'АгаА и Τабй-3'Α^аΑ и терминатора АОИ1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:50) с помощью 3'Α^аΑ-Τабй1 и 3'Τабй1-8реI. Все три фрагмента экстрагировали из геля и смешивали примерно в эквимолярных количествах. На этой смеси проводили ПЦР с помощью олигонуклеотидов 8реI-5'Ρΐбй3 и 3'Τабй1-8реI. Полученную кассету Ρϊ6Ι3-АгаА-^пш очищали в геле, расщепляли по 5'- и 3'-сайтам 8реф а затем лигировали в рАКХ002, расщепленную с помощью ΝΙκΙ, получая плазмиду μΡν230.

Конструкцию АгаА получали прежде всего путем амплификации укороченного варианта промотора НХТ7 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 52) с помощью олигонуклеотидов 8;·ι1Ι-5'ΡΙι.χΐ7 и 5'Α^а^-Ρйxΐ, гена АгаЭ с помощью ΡΙχΙ-5'АгаЭ и Τрд^-3'Α^а^ и области терминатора ΟΡΙ1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 53) с помощью олигонуклеотидов 3^30^)731 и 3'Τрд^-8а1I. Полученные фрагменты экстрагировали из геля и смешивали примерно в эквимолярных количествах, после чего проводили ПЦР с помощью олигонуклеотидов 8η1Ι-5'ΡΙιχΐ7 и 3'Τ|^ί1-8η1Ι. Полученную кассету Ρ_ΗXτ7-Α^аΟ-Τ_ΡΟI1 очищали в геле, расщепляли по 5'- и 3'-сайтам 8реЕ а затем лигировали в рК^230, расщепленную с помощью ΧΙοΙ, получая плазмиду μΒν231 (фиг. 1).

Поскольку слишком высокая экспрессия Ь-рибулокиназы вредна для роста (Вескег апб Во1е§, 2003), ген АгаВ комбинировали с геном ХК81, кодирующим ксилулокиназу, на встраивающейся плазмиде. Для этого р415Α^ΗXК8 (Киурег е! а1., 2005а) сначала превращали в рК^229, расщепляя р415АОИХК8 и рВ8305 с помощью ΡνυΙ и лигируя содержащий АОИХК8 ΡνиI-фрагмент из р415АОИХК8 на остов вектора из рВ8305, получая μΡν229.

Кассету, содержащую ген АгаВ из Ь. р1ап!агит между промотором ΡΟΙ1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 51) и терминатором АЭШ (8ЕЦ Ш ΝΟ: 50), получали путем амплификации промотора ΡΟΙ1 с помощью олигонуклеотидов 8<^Ι-5'Ρ|^ί1 и 5'Α^аВ-Ρрд^1, гена АгаВ с помощью олигонуклеотидов Ρрд^-5'Α^аВ и Τабй-3'Α^аВ и терминатора АЭШ с помощью олигонуклеотидов 3'Α^аВ-ΤабйI и 3'ΤабЫ-8асI. Все три фрагмента экстрагировали из геля и смешивали примерно в эквимолярных количествах. На этой смеси проводили ПЦР с помощью олигонуклеотидов 8асI-5'Ρрд^1 и 3'Τабй1-8асI. Полученную кассету Ρ_ΡΟI1-Α^аВ-Τ_Α^Η1 очищали в геле, расщепляли по 5'- и 3'-сайтам 8асф а затем лигировали в рК^229, расщепленную с помощью 8аб, получая плазмиду рК^243 (фиг. 1).

Штамм К^В220 трансформировали плазмидами μΒν231 и μΒν243 (табл. 2), получая штамм ΙΜ80001.

Рестрикционные эндонуклеазы (Νο\ν Епд1апб В 1о1аЬз, Веνе^1у, МА, США и Восйе, Ва§е1, Швейцария) и ДНК-лигазу (Восйе) использовали в соответствии с инструкциями изготовителей. Выделение плазмид из Е. сой осуществляли с помощью набора 01аргер §рш т1шргер кй (Р1адеп, Иббеп, Германия). Фрагменты ДНК разделяли на 1% агарозном (81дта, 8ΐ. Ьошк, МО, США) геле в 1xΤВΕ (8атЬгоок е! а1., 1989). Выделение фрагментов из геля проводили с помощью набора О|ас.|шск де1 ехЧасбоп кй (Ошадеп). Амплификацию (элементов из) кассет АгаА, АгаВ и АгаЭ осуществляли с помощью ДНК-полимеразы УеШ|< (Νο\ν Епд1апб Вю1аЬ§) в соответствии с инструкцией изготовителя. Матрицей служила хромосомная ДНК 8. сеге^'Ыае ί.ΈΝ.ΡΙ<113-7Ό для промоторов и терминаторов или Ьас!оЬасШи8 р1ап!агит Ό8Μ20205 для генов Ага. Полимеразные цепные реакции (ПЦР) проводили на термоциклизаторе Вютейа ТСтабхеп! ^е^осу^ет (Вютейа, Оойшдеп, Германия) при следующих параметрах: 30 циклов отжига по 1 мин при 55, 60 или 65°С, наращивание от 1 до 3 мин при 75°С в зависимости от ожидаемого размера фрагмента и денатурирование 1 мин при 94°С.

Культивирование и среды

Культивирование в качалочных колбах проводили при 30°С в синтетической среде (Уетбиуп е! а1., 1992). Среду доводили до рН 6,0 с помощью 2М КΟΗ перед стерилизацией. Для получения твердой синтетической среды добавляли 1,5% агара.

Готовили предварительные культуры, инокулируя 100 мл среды, содержащей соответствующий сахар в колбе на 500 мл, порцией замороженной культуры. После инкубации при 30°С на круговой качалке (200 об/мин) эти культуры использовали для инокуляции культур в качалочных колбах или в ферментере. В синтетическую среду для анаэробного культивирования добавляли 0,01 г· л^-1 эргостерина и 0,42 г· л^-1Ътееп 80, растворенного в этаноле (Апбтеакеп апб 8йет, 1953; Апбтеакеп апб 8йет, 1954). Анаэробное периодическое культивирование проводили при 30°С в лабораторных ферментерах на 2 л (Аррйкоп, 8сй1ебат, Нидерланды) с рабочим объемом в 1 л. Значения рН в культурах поддерживали при рН 5,0 автоматическим добавлением 2М КΟΗ. Культуры перемешивали при 800 об/мин и пропускали 0,5 л^мин^-1газообразного азота (<10 ррт кислорода). Чтобы свести к минимуму диффузию кислорода, ферментеры

- 19 016303 были оснащены трубками из Шгргепе (Со1е Ра1тег 1п81гитеп1 Сотрапу, Уетоп НШк, США). Растворенный кислород регистрировали с помощью кислородного электрода (Аррккепк, 8сЫебат, Нидерланды). Условия ограничения кислорода достигались в той же экспериментальной обстановке подачей воздуха в свободное пространство приблизительно 0,05 л-мин^-1.

Определение сухого веса

Образцы культур (10,0 мл) фильтровали через предварительно взвешенные нитроцеллюлозные фильтры (размер пор 0,45 мкм; Ое1таи ЬаЬога1огу, Апп АгЬог, США). После удаления среды фильтры промывали деминерализованной водой и высушивали в микроволновой печи (Вокск, 81икдаг1, Германия) в течение 20 мин при 360 ^, а затем взвешивали. Двойные пробы отличались менее чем на 1%.

Анализ газов

Выделяемый газ охлаждали в газоохладителе (2°С) и сушили с помощью сушилки Регтариге типа ΜΌ-110-48Ρ-4 (Регтариге, Тотк Кбуег, США). Концентрации О₂ и СО₂ определяли с помощью анализатора N6А 2000 (Кокетоип! Апа1уйса1, ОпуШе, США). Скорость выделения газа и удельные скорости потребления кислорода и образования углекислого газа определяли, как описано ранее (Уаи Игк е1 а1., 1988; \Уеик1кшк е1 а1., 1994). При вычислении этих приведенных к биомассе показателей учитывали изменения объема, вызванные взятием образцов культур.

Анализ метаболитов

Глюкозу, ксилозу, арабинозу, ксилитол, органические кислоты, глицерин и этанол определяли методом НРЬС на установке для НРЬС \Уа1егк АШапсе 2690 (^а!егк, ΜΠίοπΡ США), снабженной колонкой НРХ 87Н (ВюВаб, Негси1ек, США), детектором показателя преломления \Уа1егк 2410 и УФ-детектором \Уа1егк 2487. Колонку элюировали при 60°С с помощью 0,5 г-л^-1 серной кислоты со скоростью потока 0,6 мл-мин^-1.

Определение ксилулозо-5-фосфата (2а1б1уаг 1. е1 а1., Арр1. М1сгоЫо1. Вю1ескпо1. (2002), 59: 436-442).

Для анализа таких внутриклеточных метаболитов, как ксилулозо-5-фосфат, из реактора отбирали 5 мл среды в двух пробах, до истощения глюкозы (через 22 и 26 ч культивирования) и после истощения глюкозы (через 42, 79 и 131 ч культивирования). Методики остановки метаболизма, твердофазной экстракции метаболитов и анализа были описаны подробно в 8тйк Н.Р. е1 а1., Апа1. Вюскет., 261: 36-42 (1998). Однако метод ионообменной хроматографии высокого давления в сочетании с импульсным амперометрическим детектированием, используемый для анализа клеточных экстрактов, был слегка модифицирован. Используемые растворы: элюент А - 75 мМ №ОН, элюент В - 500 мМ №1Ас. Чтобы предотвратить загрязнение растворов элюентов карбонатом, вместо гранул №1ОН использовали 50% раствор №1ОН с низкой концентрацией карбоната (Вакег Апа1укеб, ИеуеШег, Нидерланды). Элюенты дегазировали гелием (Не) в течение 30 мин, а затем хранили в атмосфере Не. Градиентный насос программировали на создание следующих градиентов: 100% А и 0% В (0 мин), линейное уменьшение А до 70% и линейное возрастание В до 30% (0-30 мин), линейное уменьшение А до 30% и линейное возрастание В до 70% (3070 мин), линейное уменьшение А до 0% и линейное возрастание В до 100% (70-75 мин), 0% А и 100% В (75-85 мин), линейное возрастание А до 100% и линейное уменьшение В до 0% (85-95 мин). Подвижную фазу пропускали со скоростью потока 1 мл/мин. Другие условия были согласно 8ткк е1 а1. (1998).

Выход углерода

Выход углерода рассчитывали как количество углерода в образовавшихся продуктах, деленное на общее количество израсходованного углерода сахаров, исходя из содержания углерода в биомассе в 48%. Для поправки на испарение этанола во время ферментации количество образовавшегося этанола принимали равным измеренной кумулятивной продукции СО₂ за вычетом продукции, обусловленной синтезом биомассы (5,85 ммоль СО₂ на г биомассы (Уегбиуп е1 а1., 1990)), и СО₂, связанного с образованием ацетата.

Селекция на рост на Ь-арабинозе

Штамм ΙΜ80001 (СВ8 120327, депонированный в СВ8 от 27/09/06), содержащий гены, кодирующие метаболические пути ксилозы (Ху1А апб ХК81) и арабинозы (АгаА, АгаВ, АгаЭ), конструировали по методике, описанной выше. Штамм ΙΜ80001, хотя он и способен расти на ксилозе (данные не приводятся), по-видимому, не способен расти на твердой синтетической среде с добавлением 2% Ь-арабинозы. Мутантов ΙΜ80001, способных утилизировать Ь-арабинозу в качестве источника углерода для роста, отбирали методом серийного пересева в качалочных колбах и периодического культивирования в ферментерах (8ВВ).

Для экспериментов по серийному пересеву качалочные колбы на 500 мл, содержащие 100 мл синтетической среды, содержащей 0,5% галактозы, инокулировали штаммом ΙΜ80001 или контрольным штаммом В\УВ219. Через 72 ч при оптической плотности 3,0 при 660 нм эти культуры использовали для инокуляции новых качалочных колб, содержащих 0,1% галактозы и 2% арабинозы. На основании определения методом НРЬС с Ό-рибулозой в качестве калибровочного стандарта было установлено, что уже при первом культивировании штамма ΙΜ80001 на среде, содержащей смесь галактозы и арабинозы, часть арабинозы превращалась в рибулозу и впоследствии выделялась в супернатант. Эти анализы выполнялись на установке для НРЬС \Уа1егк АШапсе 2690 (^а!егк, Μ Шок, США), снабженной колонкой

- 20 016303

ΒίοΚηά НРХ 87Н (ВюВаб, Негси1е8, США), детектором показателя преломления ^а1ег8 2410 и УФдетектором ^а1ег8 2487. Колонку элюировали при 60°С с помощью 0,5 г-л^-1 серной кислоты со скоростью потока 0,6 мл-мин^-1. В отличие от контрольного штамма ΚνΒ219 в культуре штамма ΙΜ80001 значение ΟΌ₆₆₀ возрастало после истощения галактозы. Когда примерно после 850 ч у штамма ΙΜ80001 был отмечен рост на арабинозе (фиг. 2), эту культуру пересеяли при ΟΌ₆₆₀ = 1,7 в качалочную колбу, содержащую 2% арабинозы. Затем культуры при ΟΌ₆₆₀ = 2-3 опять последовательно пересеивали в свежую среду, содержащую 2% арабинозы. Утилизация арабинозы подтвердилась при измерении время от времени концентрации арабинозы методом НРЬС (данные не приводятся). Скорость роста этих культур возросла от 0 до 0,15 ч^-1 примерно за 3600 ч (фиг. 3).

Периодическую ферментацию в условиях ограничения кислорода запускали путем инокуляции 1 л синтетической среды с добавлением 2% арабинозы с помощью 100 мл из качалочной колбы культуры выращенных на арабинозе клеток ΙΜ80001 с максимальной скоростью роста на 2% Ь-арабинозе приблизительно в 0,12 ч^-1. Когда отмечался рост на арабинозе, культуру подвергали анаэробным условиям путем пропускания газообразного азота. Последовательные циклы анаэробного периодического культивирования запускали, заменяя вручную или автоматически 90% культуры синтетической средой с 20 г-л^-1арабинозы. Для каждого цикла во время 8ВВ-ферментации оценивали экспоненциальную скорость роста из профиля СО₂ (фиг. 4). За 13 циклов экспоненциальная скорость роста возрастала с 0,025 до 0,08 ч^-1. Через 20 циклов брали образец и делали высев на твердую синтетическую среду с добавлением 2% Ьарабинозы и инкубировали при 30°С в течение нескольких дней. Отдельные колонии дважды пересеивали штрихом на твердую синтетическую среду с 2% Ь-арабинозы. Наконец, одиночной колонией инокулировали качалочную колбу, содержащую синтетическую среду с 2% Ь-арабинозы, и инкубировали 5 дней при 30°С. Эту культуру обозначили как штамм ΙΜ80002 (СВ8 120328, депонирован в Центральном Бюро плесневых культур (СВ8) от 27/09/06)). Отбирали образцы культур, добавляли 30% глицерина и хранили образцы при -80°С.

Ферментация смешанных культур

Гидролизаты биомассы, желательное сырье для промышленной биотехнологии, содержат сложные смеси, состоящие из различных сахаров, среди которых глюкоза, ксилоза и арабиноза обычно составляют значительную часть. Для осуществления спиртового брожения не только глюкозы и арабинозы, но также и ксилозы проводили анаэробную порционную ферментацию смешанной культуры сбраживающего арабинозу штамма ΙΜ80002 и сбраживающего ксилозу штамма ΚνΒ218. Анаэробный ферментер периодического действия, содержащий 800 мл синтетической среды с добавлением 30 г-л^-1 Ό-глюкозы, 15 г-л^-1 Ό-ксилозы и 15 г-л^-1 Ь-арабинозы, инокулировали с помощью 100 мл предварительной культуры штамма ΙΜ80002. Через 10 ч добавляли 100 мл инокулята ΚνΒ218. В отличие от сбраживания смеси сахаров одним только штаммом ΙΜ80002 после истощения глюкозы происходила утилизация и ксилозы, и арабинозы (фиг. 5Ό). Смешанная культура полностью утилизировала все сахара, и за 80 ч образовалось 564,0±6,3 ммоль-л^-1 этанола (рассчитывали по продукции СО₂) с высоким общим выходом в 0,42 г-г^-1сахара. Ксилитол образовывался лишь в небольшом количестве, до концентрации в 4,7 ммоль-л^-1.

Характеристика штамма ΣΜ80002

Определяли рост и образование продуктов у штамма ΙΜ80002 при анаэробной периодической ферментации на синтетической среде либо с Ь-арабинозой в качестве единственного источника углерода, либо со смесью глюкозы, ксилозы и Ь-арабинозы. Предварительные культуры для этих анаэробных ферментации готовили в качалочных колбах, содержащих 100 мл синтетической среды с 2% Ь-арабинозы, инокулируя их замороженными при -80°С образцами штамма ΙΜ80002 и инкубируя 48 ч при 30°С.

Из фиг. 5А видно, что штамм ΙΜ80002 способен сбраживать 20 г-л^-1 Ь-арабинозы до этанола при анаэробной периодической ферментации примерно за 70 ч. Удельная скорость роста в анаэробных условиях с Ь-арабинозой в качестве единственного источника углерода составила 0,05±0,001 ч^-1. С учетом испарения этанола во время периодической ферментации выход этанола из 20 г-л^-1 Ь-арабинозы составил 0,43±0,003 г-г^-1. Без поправки на испарение выход этанола составил 0,35±0,01 г-г^-1 арабинозы. При анаэробном росте на арабинозе не наблюдалось образования арабинитола.

На фиг. 5В представлено спиртовое брожение смеси из 20 г-л^-1 глюкозы и 20 г-л^-1 Ь-арабинозы штаммом ΙΜ80002. Утилизация Ь-арабинозы начиналась после истощения глюкозы. За 70 ч и глюкоза, и Ь-арабиноза были полностью израсходованы. Выход этанола из общего количества сахаров составил 0,42±0,003 г-г^-1.

На фиг. 5С представлен профиль брожения смеси из 30 г-л^-1 глюкозы, 15 г-л^-1 Ό-ксилозы и 15 г-л^-1Ь-арабинозы штаммом ΙΜ80002. Утилизация арабинозы начиналась после истощения глюкозы. За 80 ч и глюкоза, и арабиноза были полностью израсходованы. Из 100 мМ ксилозы только 20 мМ было израсходовано штаммом ΙΜ80002. Кроме того, наблюдалось образование 20 мМ ксилитола. Очевидно, штамм ΙΜ80002 превращал ксилозу в ксилитол. Поэтому выход этанола из общего количества сахаров был ниже, чем при описанных выше условиях брожения: 0,38±0,001 г-г^-1. Выход этанола из общего количества глюкозы и арабинозы был близок к другим условиям брожения: 0,43±0,001 г-г^-1.

В табл. 1 представлены скорости потребления арабинозы и скорости образования этанола, наблю

- 21 016303 давшиеся при анаэробной периодической ферментации штамма ΙΜ80002. Скорость потребления арабинозы составляла 0,23-0,75 г-ч^-1-г^-1 сухого веса биомассы. Скорость образования этанола из арабинозы составляла 0,08-0,31 г-ч^-1-г^-1 сухого веса биомассы.

Изначально сконструированный штамм ΙΜ80001 обладал способностью к сбраживанию ксилозы (данные не приводятся). В противоположность нашим ожиданиям, отобранный штамм ΙΜ80002 оказался неспособным сбраживать ксилозу до этанола (фиг. 5 С). Чтобы восстановить способность к сбраживанию ксилозы, одну колонию штамма ΙΜ80002 переносили на твердую синтетическую среду с 2% И-ксилозы и инкубировали в анаэробной банке при 30°С в течение 25 дней. После этого одну колонию переносили опять на твердую синтетическую среду с 2% арабинозы. После 4 дней инкубации при 30°С одну колонию переносили в качалочную колбу, содержащую синтетическую среду с 2% арабинозы. После инкубации при 30°С в течение 6 дней отбирали образцы, добавляли 30% глицерина и хранили при -80°С. Таким замороженным образцом инокулировали качалочную колбу, содержащую 100 мл синтетической среды с 2% арабинозой, и использовали в качестве предварительной культуры для анаэробной периодической ферментации в синтетической среде с 20 г-л^-1 Ό-ксилозы и 20 г· л^-1 Ь-арабинозы. На фиг. 6 представлен профиль брожения этой ферментации. Ксилоза и арабиноза утилизировались одновременно. Арабиноза закончилась через 70 ч, а ксилоза была полностью израсходована за 120 ч. Образовалось как минимум 250 мМ этанола из общего количества сахаров без учета испарения этанола. Принимая конечный сухой вес биомассы в 3,2 г-л^-1 (принимая выход биомассы равным 0,08 г-г^-1 сахара), конечная концентрация этанола по оценке из кумулятивной продукции СО₂ (355 ммоль-л^-1) составила примерно 330 ммоль-л^-1, что соответствует выходу этанола в 0,41 г-г^-1 сахара пентоз. Наряду с этанолом, глицерином и органическими кислотами образовалось небольшое количество ксилитола (приблизительно 5 мМ).

Селекция штамма ΣΜ80003

Изначально сконструированный штамм ΙΜ80001 обладал способностью к сбраживанию ксилозы (данные не приводятся). В противоположность нашим ожиданиям отобранный штамм ΙΜ80002 оказался неспособным сбраживать ксилозу до этанола (фиг. 5 С). Чтобы восстановить способность к сбраживанию ксилозы, одну колонию штамма ΙΜ80002 переносили на твердую синтетическую среду с 2% И-ксилозы и инкубировали в анаэробной банке при 30°С в течение 25 дней. После этого одну колонию переносили опять на твердую синтетическую среду с 2% арабинозы. После 4 дней инкубации при 30°С одну колонию переносили в качалочную колбу, содержащую синтетическую среду с 2% арабинозы. После инкубации при 30°С в течение 6 дней отбирали образцы, добавляли 30% глицерина и хранили при -80°С.

Порции из этих замороженных образцов размазывали на твердую синтетическую среду с 2% Ьарабинозы и инкубировали при 30°С в течение нескольких дней. Отдельные колонии дважды пересеивали штрихом на твердую синтетическую среду с Ь-арабинозой. Наконец, одиночной колонией инокулировали качалочную колбу, содержащую синтетическую среду с 2% арабинозы, и инкубировали в течение 4 дней при 30°С. Эту культуру обозначили как штамм ΙΜ80003 (СВ8 121879, депонирован в СВ8 от 20/09/07). Отбирали образцы культуры, добавляли 30% глицерина и хранили образцы при -80°С.

Характеристика штамма ΣΜ80003

Определяли рост и образование продуктов у штамма ΙΜ80003 при анаэробной периодической ферментации на синтетической среде со смесью 30 г-л^-1 глюкозы, 15 г-л^-1 Ό-ксилозы и 15 г-л^-1 Ь-арабинозы. Предварительную культуру для этой анаэробной ферментации готовили в качалочных колбах, содержащих 100 мл синтетической среды с 2% Ь-арабинозы, инокулируя их замороженными при -80°С образцами штамма ΙΜ80003 и инкубируя 48 ч при 30°С.

На фиг. 7 представлен профиль брожения смеси из 30 г-л^-1 глюкозы, 15 г-л^-1 Ό-ксилозы и 15 г-л^-1 Ьарабинозы штаммом ΙΜ80003. Утилизация арабинозы начиналась после истощения глюкозы. За 70 ч глюкоза, ксилоза и арабиноза были полностью израсходованы. Ксилоза и арабиноза утилизировались одновременно. Образовалось по меньшей мере 406 мМ этанола. Конечная концентрация этанола, рассчитанная по кумулятивной продукции СО2, составила 572 ммоль-л^-1, что соответствует выходу этанола в 0,46 г-г^-1 общего количества сахаров. В отличие от сбраживания смеси глюкозы, ксилозы и арабинозы штаммом ΙΜ80002 (фиг. 5С) или смешанной культурой штаммов ΙΜ80002 и В\УВ218 (фиг. 5Ό), штамм ΙΜ80003 не вырабатывал заметного количества ксилитола.

- 22 016303

Таблица 1

Штаммы 8. сегеу181ае

Штамм	Характеристики	Ссылка
ΚΨΒ217	МАТА игаЗ-521еи2-112 1охР-Р_ТР1::(-266,-1)ТАЫ %геЗ::кркМХ ривРтп-ТКЫ рИСРтргКРЕ! Кап1охР-Р_тп:: (-?,-1)ΆΚΙ1 {р415АОНХК8, РАКХ002}	Киурег еГ а1., 2005а
ЮУВ218	МАТА игаЗ-52 1еи2-112 1охР-Р_ТР1::(-266, -1)ТАЬ1 &-еЗ::ЪркМХ ρϋΟΡτΡΐ-ТКЫ рИСРт-КРЕ! Кап1охР-Р_ТР!::(-?,-1)ККП {р415АЕ)НХК31, рАКХ002}	Киурег е1 а1.₅ 2005Ь
ΚΨΒ219	МАТА игаЗ-52 1еи2-1121охР-Р_т::(-266,-1)ТАЬ1 %геЗ::кр1гМХ рИСРт-ТКЕ! _РиСР_ТР1-КРЕ1 ΚαηΙοχΡ-ΡτΡί:: (- ?, -1)ККП {р415 ΑΌΗΧΚ81, рАКХ002}	настоящая работа
КДУВ220	МАТА игаЗ-521еи2-1121охР-Р_т::(-266,-1)ТШ %геЗ::кркМХ рЦСтРтп-ТКЫ ривР_т-РРЕ1 1юР-Ртр1::(-?,-1)Ш1	настоящая работа
ΙΜ80001	МАТА игаЗ-521еи2-1121охР-Р_т::(-266,-1)ТАЫ §геЗ::кркМХ рИС,Р„1-ТКЫ _РиСР_ТР1-КРЕ1 1охР-Р_тр1::(-?,-1)ККП {рКА^г231, РК\¥243}	настоящая работа
ΙΜ80002	МАТА игаЗ-521еи2-1121охР-Р_ТР1::(-266,-1)ТАЫ §геЗ::кркМХ риОРт-ТКЫ ρϋΟΡτρι-ΚΡΕΙ 1охР-Р_т::(-?,-1)Ш1 {рЮУ231, РК\А243} прошел селекцию на анаэробный рост на Ьарабинозе	настоящая работа

Таблица 2

Плазмиды

Плазмида	Характеристики	Ссылка
рК8305	встраивание, БЕШ	С1е(/ апб 8и§шо, 1988
рАКХ002	2ц, ЦПАЗ, Р_Трц-Р1готусез ху1А	Киурег е1 а1., 2003
р415АОНХК81	ΟΕΝ, ЬЕи2, Рдвш-З.сег.ХКЗ!	Киурег е! а1., 2005а
ΡΚ.Ψ229	встраивание, ЬЕШ, Рдьнι-8.«*г.Х.К.81	настоящая работа
рБЖ230	рАКХ002 с Ртонз-АгаА	настоящая работа
рК.5У231	рАКХ002 с Ртрнз-ЛгаА и Рнхл-АгаО	настоящая работа
рКЛУ243	ЬЕШ, встраивание, Рдвн1-8.с.ХК81- Тс’гс, Ррсп-Ь.р1ап1агитАгаВ-Тлоп1	настоящая работа

Таблица 3

Олигонуклеотиды

Олигонуклеотид	Нуклеотидная последовательность
Экспрессионная кассета АгаА
8ре1-5Т1б113 8ΕφΙΟΝΟ:31	5 '0 АСТАОТСОАОТТГАТС АТТАТС А АТАСТОСЗ'
5'АгаА-Р1бЬ 8Е<2 Ш N0:32	5'СТСАТААТСАССТАСТОАТААСАТТТТОТТТОТТТАТОТОТО ТТТАТТСЗ'
Р1с111-5'АгаА 8ΕΟΙϋΝΟ:33	5'ОААТАААСАСАСАТАААСАААСААААТОТТАТСАСТАССТО АТТАТОАСЗ'

- 23 016303

Олигонуклеотид	Нуклеотидная последовательность
Табй-З'АтаА δΕφ ГО N0:34	5'ААТСАТАААТСАТААОАААТТСССТТАСТТТААОААТОССТТ АОТСАТЗ'
З'АгаА-ТабМ 8ЕС) ГО N0:35	5'АТаАСТААО6САТТСТТАААОТААаСОААТТТСТТАТСАТТТ АТОАТТЗ'
3'Табй1-8ре1 8ΕΟΙϋΝΟ:36	5 'САСТАСТСТСОАОТСТСОААОААСОАТТАС ААСА6ОЗ'
Экснрессионная кассета АгаВ
8ас1-5'₽рдй 8ΕΟΙϋΝΟ:37	5 'СОАОСТСОТСООТОТ АТТООАТТ АТАООААОЗ'
5'АгаВ-Рр§11 8Ε(2ΙϋΝΟ:38	5ТТОО6СТ0ТТТСААСТАААТТСАТТТТТАСОСТСОТАТСТТО АТТСТАЗ'
Рр81-5'АгаВ 8ΕφΠ3ΝΟ:39	5'ТАОААТСААОАТАССАОССТАААААТСтААТТТАОТТОАААС АОСССААЗ'
Табй-З'АгаВ 8Еф ГО N0:40	З'ААТСАТАААТСАТАаСАААТТСОСТСТААТАТТТСАТТССТТ ОСССАОЗ’
3'АгаВ-Табй1 8Ε<2ΙΠΝΟ:41	5'СТСООСААОСААТСАААТАТТАСАОСОААТТТСТТАТОАТТТ АТОАТТЗ'
ЗТабй1-8ас1 8Ε0ΙΏΝΟ:42	5’ТОАОСТСОТОТСгОААОААСОАТТАСААСАООЗ'
Экспрессионная кассета АгаО
8аП-5'Р11х17 8Ер ГО N0:43	5 ’АСОСОТСОАСТСОТАООА АС ААТТТСССЗ'
5’АгаП-Рйх1 8Е0 ГО N0:44	5'СТТСТТСТТТТААТССТТСТАОСАТТТТТТСАТТААААТТААА ААААСТТЗ'
Рйх(-5'АгаО 8Е0 ГО N0:45	5'ААОТТТТТТТААТТТТААТСААААААТОСТАОАА6САТТААА АСААОААОЗ'
ТрдйЗ'АгаО 8ЕРГОКО:46	5'0СгТАТАТАТТТААСгА6С0АТТТСгТТТАСТТ0ССгААСТСгСАТС АТССЗ'
3'АгаО-Тр§1 8Е0 ГО N0:47	5'ООАТСАТССАСгТТСОСААСгТАААСАААТСОСТСТТАААТАТ А ТАССЗ'
З'ТрдЕЗаП 8Е0 ГО N0:48	5'СОСАОТСОАССТТТТАААСАОТТСтАТОАОААССЗ'

Таблица 4 Максимальные удельные скорости потребления глюкозы и арабинозы и скорости образования этанола при анаэробной ферментации штамма 8. сегеуыае ΙΜ80002 ц^: удельная скорость потребления глюкозы ц_ага: удельная скорость потребления арабинозы

Ч_е1й,_д|_1|: удельная скорость образования этанола при росте на глюкозе с|_е1||,._|Г,,: удельная скорость образования этанола при росте на арабинозе

Источник углерода	ΓΉ Т сухого веса	Чатя? Г‘4 ¹ сухого веса	ЧеЙ1,§1и9 Г‘Ч ’Г ¹сухого веса	Чш.эга» ΓΉ *Г ¹сухого веса
20 г-л^-1 арабинозы	-	0,75 ± 0,04	-	0,31 ±0,02
20 г-л^-1 глюкозы, 20 г-л ¹ арабинозы	2,08 ± 0,09	0,41 ±0,01	0,69 ± 0,00	0,19 ± 0,00
30 г-л^-1 глюкозы, 15 г-л^-1 ксилозы, 15 г-л^-1 арабинозы	1,84 ±0,04	0,23 ± 0,01	0,64 ± 0,03	0,08 ± 0,01

Библиография

Апбгеакеп А.А., 8бег Т.Т (1954) АпаегоЫс ηυΐΓίΐίοη оГ 8ассйаготусек сегеуыае. ΙΙ. ипка1нга1еб Га11у ас1б гес.|шгетеп1 Гог дгоМй ίη а бейпеб тебшт. ί. Се11. Рйукю1. 43:271-281.

Апбгеакеп А.А., 8Пег Т.1. (1953) АпаегоЫс пи!г111оп оГ 8ассйаготусек сегеуыае. Ι. Егдок1его1 гес.|тгетеп1 Гог дгоМй ш а бейпеб тебшт. ί. Се11. Рйукю1. 41:23-36.

Вескег ί.. Во1ек Е. (2003) А тобШеб 8ассйаготусек сегеуыае к1гат 1йа1 сопкитек Ь-агаЬтоке апб ргобисек е1йапо1. Арр1. Епуйоп. МюгоЬюк 69:4144-4150.

С1е1х Κ.Ό., 8 ид то А. (1988) №\у уеай-ЕксйепсЫа сой кйий1е уес1огк сопк1гис1еб \\йй ш уйго тШадетхеб уеак1 депек 1аскшд κίχ-Ьаке ран гек(г1с(1оп кйек. Сепе 74:527-534.

С1е1х КТО. апб Аообк Я.А. (2002) ТгапкГогтабоп оГ уеак1 Ьу Шйтт асе1а1е/ктд1е-к1гапбеб сатег ОНА/ро1уе1йу1епе д1усо1 те1йоб. Ме1йобк Епхуто1. 350:87-96.

Си1бепег и., Неск 8., Е1е1бег Т., Вешйаиег 1., Недетагт ТН. (1996) А пе\у еГПаегИ депе бгкгирбоп сак

- 24 016303 ке11е Гог гереа!еб ике ίη Ьиббшд уеакЕ ШсЮс Ас1бк Кек. 1996 Ли1 1; 24(13):2519-24.

НаиГ к, 21шшегшапп Р.К., Ми11ег 8. (2000) 81ши11апеоик депонис оуегехргеккюп оГ кеуеп д1усо1уйс епхушек ίη 111е уеак! 8ассйагошусек сегетМае. Епхуте М1сгоЬ. ТесЬпо1. 2000 ίιιη1; 26(9-10):688-698.

1поие Н., №у1иа Н., Окауаша Н. (1990) Н1дй еГДшепсу йапкГогшайоп оГ ЕксйейсЫа со11 ινίΐΐι р1акш1бк. Сепе 96:23-28.

Киурег М., Найод М.М.Р., Тойкепк М.к, А1шеппд М.1.Н., \Утк1ег А.А., Уап Эукеп 1.Р., Ргопк кТ. (2005а) Ме!аЬо11с епдшееппд оГ а ху1оке-1кошегаке-ехргекктд 8ассйагошусек сегеуыае к(га1п Гог гар1б апаегоЫс ху1оке ГегшепЮюп. РЕМ8 Уеак1 Кекеагсй 5:399-409.

Киурег М., Тойкепк М.к, Э|бепс11 РА., \Утк1ег А.А., Уап Эукеп 1.Р., Ргопк кТ. (2005Ь) Еуо1ийопагу епдшееппд оГ ийхеб-кидаг ий11/айоп Ьу а ху1оке-Гегшепйпд 8ассйагошусек сегеуыае кйаш. РЕМ8 Уеак1 Кекеагсй 5:925-934.

8ашЬгоок К., Рг11ксЬ Е.Р. апб Машабк I. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб ебп. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ.

Уап Игк Н., Мак Р.К., 8сйеГГегк ^.А., Уап Эукеп !Р. (1988) Ме!аЬойс гекропкек оГ 8ассйагошусек сегеуыае СВ 8 8066 апб Сапб1ба и1111к СВ8 621 ироп йапкйюп Ггош д1исоке 11шй:айоп Ю д1исоке ехсекк. Υеакΐ 4:283-291.

Уегбиуп С., Рок!ша Е., 8сйеГГегк ^.А., Уап Эукеп !Р. (1990) Рйукю1оду оГ 8ассйагошусек сегеуй1ае ш апаегоЫс д1исоке-Ншйеб сйешок1а! сиЙигек. ί. Сеп. МюгоЬю1. 136:395-403.

Уегбиуп С., РокЕиа Е., 8сйейегк ^.А., Уап Эукеп !Р. (1992) ЕГГес! оГ Ьепхою ас1б оп ше!аЬойс Г1ихек ш уеайк: а сопбпиоик-сиНиге к!ибу оп И1е геди1айоп оГ гекр1га11оп апб а1сойойс ГепиеШаРоп. Υеакΐ 8:501517.

\Уеик11и.пк К.А., Уйкег ^., Ргопк !Т., 8сйеГГегк ЭД'.А., Уап Эукеп кР. (1994) ЕПссй оГ охудеп ИшгГаНоп оп кидаг ше!аЬоНкш ш уеайк - а сопбпиоик-сиНиге к!ибу оГ 111е К1иууег еГГес!. М1сгоЬю1оду 140:703715.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Эукариотическая клетка, способная экспрессировать нижеследующие нуклеотидные последовательности, причем экспрессия этих нуклеотидных последовательностей придает клеткам способность к утилизации Ь-арабинозы и/или к превращению Ь-арабинозы в Ь-рибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую арабинозоизомеразу (агаА), причем данная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из

ί) нуклеотидной последовательности, кодирующей агаА, причем агаА включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 55% идентична аминокислотной последовательности 8ЕГ) ΙΌ N0: 1, ίί) нуклеотидной последовательности, включающей нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 2, ίίί) нуклеотидной последовательности, у которой комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (ί) или (й), ίν) нуклеотидной последовательности, которая отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода;

(b) нуклеотидной последовательности, кодирующей Ь-рибулокиназу (агаВ), причем данная нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из

ί) нуклеотидной последовательности, кодирующей агаВ, причем агаВ включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20% идентична аминокислотной последовательности 8ЕГ) ΙΌ N0: 3, ίί) нуклеотидной последовательности, включающей нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 4, ίίί) нуклеотидной последовательности, у которой комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (ί) или (й), ίν) нуклеотидной последовательности, которая отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую Ь-рибулозо-5-Р-4-эпимеразу (агаЭ), причем данная нуклеотидная последовательность выбирается из группы, состоящей из

ί) нуклеотидной последовательности, кодирующей агаЭ, причем агаЭ включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности 8ЕГ) ΙΌ N0: 5,

й) нуклеотидной последовательности, включающей нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕЭ ΙΌ N0: 6, ίίί) нуклеотидной последовательности, у которой комплементарная нить гибридизируется с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность (ί) или (й),

- 25 016303 ίν) нуклеотидной последовательности, которая отличается от последовательности молекулы нуклеиновой кислоты (ίίί) вследствие вырожденности генетического кода.
2. Клетка по п.1, в которой одна, две или три из нуклеотидных последовательностей агаА, агаВ и агаБ происходят из рода бактерий ЬасФЬасШик, наиболее предпочтительно из вида ЬасЮЬасШик р1ап!агиш.
3. Клетка по п.1 или 2, представляющая собой дрожжевые клетки, предпочтительно принадлежащие к одному из родов 8ассйагошусек, К1иуνе^ошусек, Сапб1ба, Р1сй1а, 8сй1/окассйагошусек, Напкепи1а, К1оескега, 8с11\\'апшошусек или Уагго\\за.
4. Клетка по п.3, представляющая собой дрожжевые клетки, принадлежащие к одному из видов 8. се1^1к1ае, 8. Ьи1беп, 8. ЬагпеШ, 8. ех1диик, 8. ^агиш, 8. б1ак1а(1сик, К. 1ас11к, К. шатапик или К. Ггащйк.
5. Клетка по любому из пп.1-4, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие агаА, агаВ и/или агаБ, функционально связаны с промотором, вызывающим экспрессию соответствующей нуклеотидной последовательности в клетках, достаточную для придания клеткам способности к утилизации Ь-арабинозы и/или к превращению Ь-арабинозы в Ь-рибулозу, и/или ксилулозо-5-фосфат, и/или в желательный продукт брожения.
6. Клетка по любому из пп.1-5, обладающая способностью к прямой изомеризации ксилозы в ксилулозу.
7. Клетка по п.6, содержащая генетическую модификацию, повышающую мощность пентозофосфатного пути.
8. Клетка по п.6 или 7, в которой генетическая модификация заключается в суперэкспрессии по меньшей мере одного гена неокислительной части пентозофосфатного пути.
9. Клетка по п.8, в которой указанный ген выбран из группы, состоящей из генов, кодирующих рибулозо-5-фосфат-изомеразу, рибулозо-5-фофат-эпимеразу, транскетолазу и трансальдолазу.
10. Клетка по п.8, в которой генетическая модификация заключается в суперэкспрессии генов, кодирующих транскетолазу и трансальдолазу.
11. Клетка по любому из пп.8-10, дополнительно содержащая генетическую модификацию, повышающую удельную активность ксилулозокиназы.
12. Клетка по п.11, в которой генетическая модификация заключается в суперэкспрессии гена, кодирующего ксилулозокиназу.
13. Клетка по любому из пп.8-12, в которой подвергаемый суперэкспрессии ген является эндогенным для этих клеток.
14. Клетка по любому из пп.5-13, содержащая генетическую модификацию, снижающую активность неспецифической альдозоредуктазы в клетках.
15. Клетка по п.14, в которой генетическая модификация уменьшает экспрессию или инактивирует ген, кодирующий неспецифическую альдозоредуктазу.
16. Клетка по п.15, в которой ген инактивируется при помощи делеции по крайней мере части гена или разрушения гена.
17. Клетка по п.14 или 15, в которой снижается или инактивируется экспрессия в клетках каждого гена, кодирующего неспецифическую альдозоредуктазу.
18. Клетка по любому из предыдущих пунктов, в которой продукт брожения выбирается из группы, состоящей из этанола, молочной кислоты, 3-гидроксипропионовой кислоты, акриловой кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, аминокислот, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, бутанола, β-лактамовых антибиотиков и цефалоспоринов.
19. Конструкция из нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую агаА, нуклеотидную последовательность, кодирующую агаВ, и нуклеотидную последовательность, кодирующую агаБ, которые определены в п.1 или 2.
20. Способ получения продукта брожения, выбранного из группы, состоящей из этанола, молочной кислоты, 3-гидроксипропионовой кислоты, акриловой кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, аминокислот, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, бутанола, β-лактамовых антибиотиков и цефалоспоринов, включающий:

(a) сбраживание среды, содержащей источник Ь-арабинозы и необязательно ксилозы, с помощью модифицированных клеток по любому из пп.1-18, при этом клетки сбраживают Ь-арабинозу и необязательно ксилозу до нужного продукта брожения; и при необходимости (b) извлечение продукта брожения.
21. Способ получения продукта брожения, выбранного из группы, состоящей из этанола, молочной кислоты, 3-гидроксипропионовой кислоты, акриловой кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, аминокислот, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, бутанола, β-лактамовых антибиотиков и цефалоспоринов, включающий:

(а) сбраживание среды, содержащей, по меньшей мере, источник Ь-арабинозы и источник ксилозы, с помощью клеток по любому из пп.1-18 и клеток, обладающих способностью к утилизации ксилозы и/или проявляющих способность к прямой изомеризации ксилозы в ксилулозу, при этом каждые клетки

- 26 016303 сбраживают Ь-арабинозу и/или ксилозу до нужного продукта брожения; и при необходимости (Ь) извлечение продукта брожения.
22. Способ по п.20 или 21, в котором среда дополнительно содержит источник глюкозы.
23. Способ по любому из пп.20-22, в котором продуктом брожения является этанол.
24. Способ по п.23, в котором объемная продукция этанола составляет по меньшей мере 0,5 г этанола на л/ч.
25. Способ по п.23 или 24, в котором выход этанола составляет по меньшей мере 30%.
26. Способ по любому из пп.20-25, который является анаэробным.
27. Способ по любому из пп.20-25, который является аэробным и предпочтительно выполняется в условиях ограничения кислорода.