EA019482B1 - Клетка, ферментирующая сахар-пентозу - Google Patents

Abstract

Это изобретение относится к клетке, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, где аминокислотная последовательность этой ксилозоизомеразы имеет по меньшей мере приблизительно 70% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3 и где эта нуклеотидная последовательность является гетерологичной для этого хозяина. Клетка этого изобретения может быть использована в способе получения продукта ферментации, такого как этанол. Такой способ может предусматривать ферментацию среды, содержащей источник ксилозы, клеткой этого изобретения так, что эта клетка ферментирует ксилозу в продукт ферментации.

Description

Данное изобретение относится к клетке, которая способна изомеризовать ксилозу в ксилулозу. Это изобретение относится также к способу, в котором такие клетки применимы для продуцирования продукта ферментации, такого как этанол.

Сведения о предшествующем уровне техники

Крупномасштабное потребление традиционных ископаемых топлив (топлив на основе нефти) в последние десятилетия способствовало высоким уровням загрязнения. Это вместе с пониманием того, что мировой запас ископаемых топлив является неограниченным, и растущим осознанием опасности для окружающей среды стимулировало новые инициативы для исследования возможности альтернативных топлив, таких как этанол, который является сгорающим без образования частиц топливным источником, который высвобождает меньше СО₂, чем неэтилированный бензин при расчете на 1 л.

Хотя получаемый из биомассы этанол может производиться ферментацией гексозных сахаров, полученных из многочисленных различных источников, субстраты, обычно используемые для производства промышленного масштаба топливного спирта, такие как сахар сахарного тростника и кукурузный крахмал, являются дорогими, и, следовательно, производство топливного этанола потребует применения исходных (сырьевых) материалов более низкой стоимости.

В настоящее время только лигноцеллюлозный исходный (сырьевой) материал доступен в достаточных количествах для замены сельскохозяйственных культур, используемых в настоящее время для производства этанола. В большинстве лигноцеллюлозных материалов вторым наиболее часто встречающимся сахаром после глюкозы является ксилоза. Таким образом, для экономически осуществимого процесса получения топлива как гексозные, так и пентозные сахара должны ферментироваться с образованием этанола. Дрожжи Зассйагошусек есгсуыас являются надежными и хорошо адаптированными для производства этанола, но они неспособны продуцировать этанол с использованием ксилозы в качестве источника углерода. Кроме того, неизвестны природно встречающиеся организмы, которые могут ферментировать ксилозу в этанол как с высоким выходом этанола, так и с высокой продуктивностью этанола.

Таким образом, существует потребность в организме, обладающем этими свойствами, для обеспечения возможности коммерчески-жизненного получения этанола из лигноцеллюлозных исходных материалов.

Сущность изобретения

Согласно этому изобретению обеспечена клетка, которая способна к ферментации, такой как спиртовая ферментация, и использованию ксилозы в качестве источника углерода. Такая клетка содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, причем аминокислотная последовательность ксилозоизомеразы имеет по меньшей мере приблизительно 70% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в ЗЕЦ ΙΌ N0: 3, причем эта нуклеотидная последовательность является гетерологичной относительно этого хозяина. Такая клетка продуцирует более высокое количество этанола при использовании ксилозы в качестве источника углерода в сравнении с мицелиальным грибом дикого типа.

Это изобретение обеспечивает также способ получения продукта ферментации, который предусматривает ферментацию среды, содержащей источник ксилозы, клеткой этого изобретения, так что эта клетка ферментирует ксилозу в этот продукт ферментации;

способ получения продукта ферментации, который предусматривает ферментацию среды, содержащей, по меньшей мере, источник ксилозы и источник Ь-арабинозы, клеткой, которая определена этим изобретением, которая также способна использовать Ь-арабинозу, так что эта клетка ферментирует ксилозу и Ь-арабинозу в этот продукт ферментации; и способ получения продукта ферментации, который предусматривает ферментацию среды, содержащей, по меньшей мере, источник ксилозы и источник Ь-арабинозы, клеткой этого изобретения и клеткой, способной использовать Ь-арабинозу, посредством чего каждая клетка ферментирует ксилозу и/или арабинозу в продукт ферментации.

Это изобретение обеспечивает также применение клетки этого изобретения в способе (процессе) получения продукта ферментации.

Перечень фигур

Фиг. 1 представляет карту плазмиды рУ1§1Т4-ХК81-ху1А (Ваип СрО), кодирующей ксилозоизомеразу из Вас1его1бс5 ишГогшЬ АТСС 8492, для экспрессии в Зассйагошусек сегеуЫае. СрО обозначает оптимизированные пары кодонов.

Фиг. 2 представляет физическую карту плазмиды рР\Т080, последовательность которой приведена в 8ЕО ΙΌ N0: 4.

Фиг. 3 представляет физическую карту СКЕЗ-локуса дикого типа (панель а) и однокопийную интеграцию Р\Т080 в этот СКЕЗ-локус (панель Ь, показывающая, где связываются праймеры, и панель с, показывающая, где связывается КК11-зонд).

Фиг. 4 представляет авторадиограмму, показывающую правильную интеграцию одной копии плазмиды рР\\'Т080 в СЕКРК113-70;

- 1 019482

Панель а: Хст1-расщепление препаратов хромосомной ДНК, гибридизованных с ЯКП-зондом. Дорожка 1: СЕКРК113-7Э; дорожка 2: ΒΙΕ104Ε1; дорожка 3: ΒΙΕ104Ρ1.

Панель Ь: Рей-расщепление препаратов хромосомной ДНК, гибридизованных с ЯКП-зондом. Дорожка 1: СЕЫ.РК113-7П; дорожка 2: ΒΙΕ104Ε1; дорожка 3: ΒΙΕ104Ρ1.

ДСЯЕ3::РРР обозначает замену кодирующего района СЯЕ3-гена кассетой, содержащей гены ТАЬ1, ТКЬ1, ЯКИ и ЯРЕ1, под контролем сильных конститутивных промоторов, Δ6ЯΕ3:[ТΡI1ρ-ТА^1-А^ΗIρТКЬ1 -РОПр-ЯРЕ1-ЕКО1р-ЯКП].

Фиг. 5 представляет физическую карту СЯЕ3-локуса, где кодирующий район СЯЕ3-гена заменен интеграцией РРР-генов ТАЬ1, ТКЕ1, ЯКП и ЯРЕ1. Панель а показывает, где связываются праймеры 8ЕО ΙΌ N0: 5, а панель 6 показывает, где связывается ЯКП-зонд.

Фиг. 6 представляет физическую карту плазмиды рΥI#§IТ4.

Фиг. 7 представляет физическую карту плазмиды рР\УТ007.

Фиг. 8 представляет физическую карту плазмиды рР\УТ042.

Фиг. 9 представляет физическую карту 8ГГ4-локуса (панель а) и однокопийную интеграцию Р\УТ080 в этом 8!Т4-локусе (панель Ь, показывающая, где связываются праймеры).

Фиг. 10 представляет кривую роста ΒIΕ104Ρ1Υ9 на 2% ксилозе в качестве единственного источника углерода, после нескольких предварительных культивирований, и референс-штамма без одной копии рР\УТ042. интегрированной в этот геном. События, указанные в этом графике под номерами (1): перенос на ΥΝΒ 1% глюкоза + 1% ксилоза; (2): перенос на ΥΝΒ 0,1% глюкоза + 2% ксилоза; (3) перенос на ΥΝΒ 2% ксилоза; (4) перенос на ΥΝΒ 2% ксилоза (только ΒIΕ104Ρ1Υ9).

Фиг. 11 представляет кривую роста референс-штамма ΒIΕ104Ρ1 и метаболизирующего ксилозу штамма, ΒIΕ104Ρ1Υ9.

Фиг. 12 представляет потребление ксилозы и глюкозы и продуцирование этанола во времени штаммов ΒIΕ104Ρ1, предварительно культивированного на глюкозе (панель а), ΒIΕ104Ρ1Υ9, предварительно культивированного на глюкозе (панель Ь), и ΒIΕ104Ρ1Υ9, предварительно культивированного на ксилозе (панель с).

Фиг. 13 представляет физическую карту плазмиды рР\УТ018.

Фиг. 14 представляет физическую карту плазмиды рР\УТ006.

Фиг. 15 представляет авторадиограмму блота по Саузерну. Хромосомную ДНК штамма СЕКРК113-7Э дикого типа (дорожка 1) и ΒΕ104Α2 (дорожка 2) расщепляли как ЕсоЯЕ так и ΗίηάΙΙΙ. Этот блот гибридизовали со специфическим 8ГГ2-зондом.

Фиг. 16 представляет физические карты 5>!Т2-локуса (панель а) и после введения ага-генов интеграцией плазмиды рР\УТ018, с последующей внутримолекулярной рекомбинацией, приводящей к потере вектора и последовательностей селектируемых маркеров (панель Ь). Показана гибридизация этого зонда.

Фиг. 17 показывает графическое представление кривых роста штамма ΒIΕ104Α2Ρ1Υ9 на различных средах. Панель а: штамм ΒIΕ104Α2Ρ1Υ9, выращиваемый на галактозе, с последующими событиями, указанными в этом графике номерами, (1) перенос на 1% арабиноза + 1% ксилоза и (2) перенос на 2% ксилоза + 0,2% арабиноза. Панель Ь: штамм ΒIΕ104Α2Ρ1Υ9, выращиваемый на глюкозе, с последующим (1) переносом на 1% арабиноза + 1% ксилоза и (2) перенос на 2% ксилоза + 0,2% арабиноза.

Краткое описание списка последовательностей

8Е0 ΙΌ N0: 1 представляет последовательность глюкозоизомеразы дикого типа из Βη^Γοίώζδ цш1огт15 АТСС 8492. СепЬапк ассеееюп ηο. ΑΑΥΗ02000036.

8Е0 ΙΌ N0: 2 представляет оптимизированную в отношении кодонов последовательность, произведенную из 5>Е0 ΙΌ N0: 1.

8Е0 ΙΌ N0: 3 представляет аминокислотную последовательность ксилозоизомеразы из Βасΐе^ο^άе8 иш1огт18 АТСС 8492.

8Е0 ΙΌ N0: 4 представляет последовательность плазмиды рР\УТ080.

8Е0 ΙΌ N0: 5 представляет последовательность прямого праймера.

8Е0 ΙΌ N0: 6 представляет последовательность обратного праймера.

8Е0 ΙΌ N0: 7 представляет последовательность прямого мультифункционального праймера для диагностической ПЦР.

8Е0 ΙΌ N0: 8 представляет последовательность обратного мультифункционального праймера для диагностической ПЦР.

8Е0 ΙΌ N0: 9 представляет последовательность ЯКП-зонда прямого праймера.

5>Е0 ΙΌ N0: 10 представляет последовательность ЯШ-зонда обратного праймера.

8Е0 ΙΌ N0: 11 представляет последовательность капМХ-кассеты прямого праймера.

8Е0 ΙΌ N0: 12 представляет последовательность капМХ-кассеты обратного праймера.

8Е0 ΙΌ N0: 13 представляет последовательность прямого праймера.

5>Е0 ΙΌ N0: 14 представляет последовательность обратного праймера.

8Е0 ΙΌ N0: 15 представляет последовательность прямого мультифункционального праймера для диагностической ПЦР.

- 2 019482

8ЕО ΙΌ N0: 16 представляет последовательность обратного мультифункционального праймера для диагностической ПЦР.

8Е0 ΙΌ N0: 17 представляет последовательность плазмиды рРАТ018.

8Е0 ΙΌ N0: 18 представляет последовательность рРАТ018 с интеграцией прямого праймера. 8Е0 ΙΌ N0: 19 представляет последовательность рРАТ018 с интеграцией обратного праймера. 8Е0 ΙΌ N0: 20 представляет последовательность 81Т2-зонда прямого праймера.

8Е0 ΙΌ N0: 21 представляет последовательность 8!Т2-зонда обратного праймера.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Во всем этом описании и в сопутствующей формуле изобретения слова содержат и включают в себя и вариации, такие как содержит, содержащий, включает в себя и включающий в себя должны интерпретироваться как включающие в себя. То есть эти слова должны выражать возможное включение других элементов или целых чисел, не указанных конкретно, если это позволяет контекст.

Это изобретение относится к клетке, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, причем аминокислотная последовательность этой ксилозоизомеразы имеет по меньшей мере приблизительно 70% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0: 3, причем эта нуклеотидная последовательность является гетерологичной относительно этого хозяина.

Присутствие нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу, придает клетке способность изомеризации ксилозы в ксилулозу.

Ксилозоизомераза (ЕС 5.3.1.5) определяется здесь как фермент, который катализирует прямую изомеризацию Ό-ксилозы в Ό-ксилулозу и/или наоборот. Этот фермент известен также как Όксилозокетоизомераза. Эта ксилозоизомераза может быть также способна катализировать превращение между Ό-глюкозой и Ό-фруктозой (и, соответственно, может, следовательно, называться глюкозоизомеразой). Описанная здесь ксилозоизомераза может требовать присутствия бивалентного катиона, такого как магний, марганец или кобальт, в качестве кофактора.

Таким образом, клетка этого изобретения способна изомеризовать ксилозу в ксилулозу. Способность изомеризации ксилозы в ксилулозу придается клетке-хозяину трансформацией этой клеткихозяина конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую определенную ксилозоизомеразу. Клетка этого изобретения изомеризует ксилозу в ксилулозу прямой изомеризацией ксилозы в ксилулозу. Понятно, что это означает, что ксилоза изомеризуется в ксилулозу в единственной реакции, катализируемой ксилозоизомеразой, в отличие от двухстадийного превращения ксилозы в ксилулозу через промежуточный продукт ксилит при катализе ксилозоредуктазой и ксилитдегидрогеназой соответственно.

Одна единица (Е) ксилозоизомеразной активности может быть определена здесь как количество фермента, продуцирующего 1 нмоль ксилулозы в минуту, в условиях, описанных Киурег с1 а1. (2003, ЕЕМ8 УеаМ Кез. 4: 69-78).

Клетка этого изобретения определяется со ссылкой на ксилозоизомеразу, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3 или последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 70% идентичность относительно этой последовательности. Подобным образом, клетка этого изобретения может быть определена со ссылкой на ксилозоизомеразу, если имеется нуклеотидная последовательность, которая кодирует такую аминокислотную последовательность.

8Е0 ΙΌ N0: 3 представляет аминокислотную последовательность ксилозоизомеразы из Вас1его1бе5 ιιηίίοπηίδ АТСС 8492. Клетка этого изобретения содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 3, или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 70% идентичность последовательности с ней.

Предпочтительно клетка по данному изобретению является клеткой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, имеющую последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 75, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 85, по меньшей мере приблизительно 90, по меньшей мере приблизительно 92, по меньшей мере приблизительно 93, по меньшей мере приблизительно 94, по меньшей мере приблизительно 95, по меньшей мере приблизительно 96, по меньшей мере приблизительно 97, по меньшей мере приблизительно 98 или по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 92, по меньшей мере 93, по меньшей мере 94, по меньшей мере 95, по меньшей мере 96, по меньшей мере 97, по меньшей мере 98 или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:3. Однако клетка по этому изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, имеющую последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 55, по меньшей мере приблизительно 60 или по меньшей мере приблизительно 70% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕО ΙΌ N0: 3.

Идентичность последовательности (или сходство последовательности) определяется здесь как род

- 3 019482 ство между двумя или более аминокислотными (полипептидными или белковыми) последовательностями, определяемое сравнением этих последовательностей. Обычно идентичности или сходства сравнивают на протяжении полной длины сравниваемых последовательностей. Однако последовательности могут сравниваться на протяжении более коротких окон сравнения. В данной области идентичность означает также степень родства между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот, например, в случаях, когда определяют соответствие между тяжами таких последовательностей.

Предпочтительные способы для определения идентичности разработаны для получения наибольшего соответствия между испытываемыми последовательностями. Способы определения идентичности и сходства заложены в публично доступных компьютерных программах. Предпочтительные способы на основе компьютерных программ для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают в себя, например, ВсЧЕй. ВЬА8ТР, ΒΕΆ8ΤΝ и РА8ТА (А11ксйи1, 8.Р. с1 а1., 1. Мо1. Вю1. 215:403-410 (1990), публично доступны из ΝΟΒΙ и других источников (ВЬА8Т Мапиа1, А11ксйи1, 8., с1 а1., ΝΟΒΙ ΝΡΜ ΝΙΗ ВеЛекба, ΜΌ 20894). Предпочтительными параметрами для сравнения аминокислотных последовательностей с использованием ВЬА8ТР являются открывание бреши 11,0, удлинение бреши 1, матрикс В1окит 62. Предпочтительными параметрами для последовательностей нуклеиновых кислот с использованием ВЬА8ТР являются открывание бреши 11,0, удлинение бреши 1, полная матрица ДНК (матрица идентичности ДНК).

Необязательно, в определении степени сходства аминокислот квалифицированный в данной области специалист может также учитывать так называемые консервативные аминокислотные замены, как это будет понятно квалифицированному в данной области специалисту.

Консервативными аминокислотными заменами называют способность взаимозаменяемости остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группой аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, являются глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группой аминокислот, имеющих алифатические гидроксильные боковые цепи, являются серин и треонин; группой аминокислот, имеющих амидсодержащие боковые цепи, являются аспарагин и глутамин; группой аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, являются фенилаланин, тирозин и триптофан; группой аминокислот, имеющих основные боковые цепи, являются лизин, аргинин и гистидин; и группой аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, являются цистеин и метионин.

Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются валин-лейцинизолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Вариантами с заменами описанной здесь аминокислотной последовательности являются такие варианты, в которых по меньшей мере один остаток в описанных последовательностях был удален и на его месте был инсертирован другой аминокислотный остаток. Предпочтительно аминокислотная замена является консервативной. Предпочтительными консервативными заменами для каждой из природно встречающихся аминокислот являются следующие: А1а^кег; Агд^1ук; Акп ^д1п или Ык; Акр^-д1и; Сук^кег или а1а; С1п^акп; С1ц^акр; С1у^рго; Ηίκ^-акп или д1п; 11е^1еи или уа1; Ьеи^йе или уа1; Ьук^агд; д1п или д1и; Ме1^1еи или Не; Рйе ^ше1, 1еи или 1уг; 8ег^1йг; Тйг^кег; Тгр^1уг; Туг^йр или рйе; и Уа1^11е или 1еи.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент, который катализирует превращение ксилозы в ксилулозу в соответствии с данным изобретением, может быть также определена по ее способности гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, кодирующими этот фермент, имеющими последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3, или последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 70% идентичность последовательности с ней, при умеренных или предпочтительно строгих условиях гибридизации.

Формально, такие нуклеотидные последовательности гибридизуются с обратным комплементом нуклеотидных последовательностей, которые кодируют фермент, имеющий последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3, или последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 70% идентичность последовательности с ней, например последовательности, которые гибридизуются с обратным комплементом 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 или 2.

Строгие условия гибридизации определяются здесь как условия, которые позволяют последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере из приблизительно 25, предпочтительно приблизительно 50, 75 или 100 нуклеотидов и наиболее предпочтительно приблизительно 200 или более нуклеотидов гибридизоваться при температуре приблизительно 65°С в растворе, содержащем приблизительно 1М соль, предпочтительно 6 х 88С (хлорид натрия, цитрат натрия), или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу, и промывании при 65°С в растворе, содержащем приблизительно 0,1М соль или менее, предпочтительно 0,2 х 88С, или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию выполняют на протяжении ночи, т.е. по меньшей мере в течение 10 ч, и предпочтительно промывание выполняют в течение по меньшей мере 1 ч, по меньшей мере с двумя сменами промывочного раствора. Эти условия обычно делают возможной специфическую гибридизацию последовательностей, имеющих приблизительно 90% или большую идентичность последовательности.

- 4 019482

Умеренные условия определяются здесь как условия, которые позволяют последовательностям нуклеиновых кислот по меньшей мере из 50 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 200 или более нуклеотидов гибридизоваться при температуре приблизительно 45°С в растворе, содержащем приблизительно 1М соль, предпочтительно 6 х 88С (хлорид натрия, цитрат натрия), или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу, и промывании при комнатной температуре в растворе, содержащем приблизительно 1М соль, предпочтительно 6 х 88С, или любом другом растворе, имеющем сравнимую ионную силу. Предпочтительно гибридизацию выполняют на протяжении ночи, т.е. по меньшей мере в течение 10 ч, и предпочтительно промывание выполняют в течение по меньшей мере 1 ч, по меньшей мере с двумя сменами промывочного раствора. Эти условия обычно делают возможной специфическую гибридизацию последовательностей, имеющих приблизительно 50% идентичность последовательности. Квалифицированный в данной области специалист будет способен модифицировать эти условия гибридизации для специфической идентификации последовательностей, варьирующихся в идентичности между 50 и 90%.

Для увеличения вероятности того, что этот введенный фермент экспрессируется в активной форме в клетке этого изобретения, соответствующая кодирующая нуклеотидная последовательность может быть адаптирована для оптимизации частоты использования кодонов относительно частоты использования кодонов выбранной дрожжевой клетки. В данной области известны несколько способов оптимизации использования кодонов. Предпочтительным способом для оптимизации частоты использования кодонов этих нуклеотидных последовательностей относительно частоты использования кодонов нуклеотидных последовательностей дрожжей является способ оптимизации пар кодонов, описанный в \УО 2006/077258 и/или \УО 2008/000632. \УО 2008/000632 направлен на оптимизацию пар кодонов. Оптимизация пар кодонов является способом, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, модифицируют в отношении их использования кодонов, в частности пар кодонов, которые используются для получения улучшенного продуцирования кодируемого полипептида. Пары кодонов определяются как набор из двух последовательных триплетов (кодонов) в кодирующей последовательности.

В качестве простого измерения экспрессии генов и эффективности трансляции здесь используют индекс адаптации кодонов (СА1), как описано в Хийиа Х1а, Еуо1и!юпату ВюшГоттайск 2007: 353-58. Этот индекс использует ссылочный набор высокоэкспрессируемых генов из одного вида для оценивания относительных показателей каждого кодона, и балл для гена рассчитывают из частоты использования всех кодонов в этом гене. Этот индекс оценивает степень, с которой отбор был эффективен в формировании распределения частоты использования кодонов. В этом отношении полезно оценивать адаптацию вирусных генов к их хозяевам для предсказания уровня экспрессии гена и для выполнения сравнений частоты использования кодонов в различных организмах. Этот индекс может также давать приближенное указание вероятного успеха экспрессии гетерологичных генов. В генах с оптимизированными парами кодонов по этому изобретению этот СА1 равен 0,6 или более, 0,7 или более, 0,8 или более, 0,85 или более, 0,87 или более, 0,90 или более, 0,95 или более или 1,0.

В клетке этого изобретения ксилозоизомераза является обычно гетерологичной относительно этой клетки. То есть эта ксилозоизомераза имеет последовательность, которая не встречается природно в рассматриваемой в виде части этого организма клетки, последовательности геномной ДНК или РНК, в которой она присутствует. То есть эта ксилозоизомераза является экзогенной относительно этой клетки и природно не встречается в этой клетке. Таким образом, нуклеотидная последовательность, кодирующая ксилозоизомеразу, обычно экспрессируется или способна экспрессироваться в активной форме в трансформированной клетке-хозяине.

Таким образом, клетка этого изобретения является клеткой, которая содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, т.е. была трансформирована конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, как определено выше. Эта конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая кодирующую ксилозоизомеразу последовательность, предпочтительно способна к экспрессии этой ксилозоизомеразы в клетке-хозяине.

Способы экспрессии гетерологичной последовательности ксилозоизомеразы в клетке хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам.

Таким образом, клетка этого изобретения является рекомбинантной клеткой. То есть клетка этого изобретения содержит нуклеотидную последовательность или генетически модифицирована нуклеотидной последовательностью, которая природно не встречается в рассматриваемой клетке.

Способы рекомбинантной экспрессии ксилозоизомеразы в клетке, а также дополнительные генетические модификации клетки этого изобретения хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. Обычно такие способы включают в себя трансформацию клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей релевантную последовательность. Такие способы известны, например, из стандартных учебников, таких как 8атЬтоок апб Ян55с1 (2001) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (3тб ебйюп), Со1б 8рттд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Рге55. или Е. Лн5нЬе1 е! а1., еХ. Сиггеп! рго!осо1§ ш то1еси1аг Ь1о1оду, Сгееп РиЫЫнпд апб \УПеу 1п1ег8С1епсе, №\ν Уотк (1987). Способы трансформации и генетической модификации грибных клеток-хозяев известны, например, из ЕР-А

- 5 019482

0635574, νθ 98/46772, νθ 99/60102, νθ 00/37671, νΘ90/14423, ЕР-А-0481008, ЕР-А-0635574 И8 6265186.

Наиболее эписомные или 2 μ-плазмиды являются относительно нестабильными, теряющимися приблизительно в 10^-2 или более клетках после каждой генерации. Даже в условиях селективного роста только 60-95% этих клеток удерживают эту эписомную плазмиду. Копийность большинства эписомных плазмид находится в диапазоне 10-40 на клетку οίτ⁺ хозяев. Однако эти плазмиды не распределяются равномерно среди этих клеток, и существует высокая дисперсия (рассеяние) в числе копий на клетку в популяциях. Штаммы, трансформированные интегративными (включающимися в геном) плазмидами, являются чрезвычайно стабильными даже в отсутствие давления отбора. Однако потеря плазмид может происходить при частоте приблизительно 1·10^-3-10^-4 посредством гомологичной рекомбинации между тандемно повторяющимися ДНК, приводя к выпетливанию последовательности вектора. Предпочтительно конструкция вектора в случае стабильной интеграции является, следовательно, такой, что после потери генов селектируемых маркеров (которая происходит также внутримолекулярной, гомологичной рекомбинацией), это выпетливание интегрированной конструкции является уже невозможным. Таким образом, эти гены предпочтительно стабильно интегрируются. Стабильная интеграция определяется здесь как интеграция в геном, в которой выпетливание этой интегрированной конструкции уже не является возможным. Предпочтительно селективные маркеры отсутствуют.

Обычно этой конструкцией нуклеиновой кислоты может быть плазмида, например низкокопийная плазмида или высококопийная плазмида. Клетка по данному изобретению может содержать единственную копию или множественные копии нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу, например, посредством множественных копий нуклеотидной конструкции или посредством конструкции, которая имеет множественные копии последовательности ксилозоизомеразы.

Эта конструкция нуклеиновой кислоты может сохраняться эписомно и, следовательно, содержать последовательность для автономной репликации, такую как последовательность аутосомной последовательности репликации. Подходящая конструкция эписомной нуклеиновой кислоты может быть, например, основана на плазмиде 2μ дрожжей или плазмиде ρΚΌ1 (С1еет с1 а1., 1991 , Вю1ес1шо1оду 9: 968-975), или плазмидах АМА (Йетто е1 а1., 1995, Сигг СепеТ 29:482-489). Альтернативно, каждая конструкция нуклеиновой кислоты может быть интегрирована в одной или нескольких копиях в геном этой клетки. Интеграция в геном клетки может происходить случайным образом негомологичной рекомбинацией, но предпочтительно эта конструкция нуклеиновой кислоты может быть интегрирована в геном этой клетки гомологичной рекомбинацией, как хорошо известно в данной области (см., например, νθ 90/14423, ЕРА-0481008, ЕР-А-0635574 и И8 6265186).

Обычно кодирующая ксилозоизомеразу последовательность будет функционально связана с одной или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот, способными обеспечивать транскрипцию и/или трансляцию или способствовать транскрипции и/или трансляции последовательности ксилозоизомеразы.

Термин функционально связанные относится к непосредственному соседству, в котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предполагаемым для них образом. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью и указанный промотор или энхансер влияет на транскрипцию этой кодирующей последовательности.

В данном контексте термин промотор относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует, регулируя транскрипцию одного или нескольких генов, расположенных справа, относительно направления транскрипции, от сайта инициации транскрипции этого гена, и структурно идентифицируется присутствием сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и любыми другими ДНК-последовательностями, известными квалифицированным в данной области специалистам. Конститутивным промотором является промотор, который активен при регуляции окружающей средой и развитием.

Промотор, который может быть использован для достижения экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент согласно данному изобретению, может быть неприродным относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей подлежащий экспрессии фермент, т.е. промотором, который является гетерологичным относительно нуклеотидной последовательности (кодирующей последовательности), с которой он функционально связан. Однако этот промотор может быть гомологичным, т.е. эндогенным, относительно этой клетки-хозяина.

Подходящие промоторы в этом контексте включают в себя как конститутивные, так и индуцируемые природные промоторы, а также сконструированные промоторы, которые хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту. Подходящими промоторами в эукариотических клетках могут быть САЬ7, САЬ10 или САЬ1, СУС1, ΗΙ83, АОН1, РСЬ, РН05, САРЭН, АОС1, ТКР1, ИКА3, ЬЕи2, ΕΝ01, ТР11 и АОХ1. Другие подходящие промоторы включают в себя РЭС’1. СРЭ1. РСК1, ТЕЕ1 и ΤΌΗ3.

В клетке этого изобретения 3'-конец нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу, предпочтительно функционально связан с последовательностью терминации транскрипции.

- 6 019482

Предпочтительно последовательность терминатора является функциональной в выбранной клеткехозяине, такой как, например, клетка выбранного вида дрожжей. В любом случае выбор терминатора не является критическим; он может, например, происходить из любого гена дрожжей, хотя могут иногда работать терминаторы из недрожжевого, эукариотического гена. Обычно нуклеотидная последовательность, кодирующая ксилозоизомеразу, содержит терминатор. Предпочтительно такие терминаторы объединены с мутациями, которые предотвращают опосредованное нонсенс-мутацией расщепление мРНК в клетке-хозяине этого изобретения (см., например, 8Ыг1еу е1 а1., 2002, ОеиеНсз 161:1465-1482).

Кроме того, последовательность терминации транскрипции содержит предпочтительно сигнал полиаденилирования.

Необязательно, в конструкции нуклеиновой кислоты, подходящей для применения в этом изобретении, может присутствовать селектируемый маркер. В данном контексте термин маркер относится к гену, кодирующему признак или фенотип, который позволяет проводить отбор или скрининг на клеткухозяина, содержащую этот маркер. Этот маркерный ген может быть геном устойчивости к антибиотику, посредством чего может быть использован соответствующий антибиотик для отбора трансформированных клеток среди клеток, которые не являются трансформированными. Примеры подходящих маркеров устойчивости к антибиотикам включают в себя дигидрофолатредуктазу, гигромицин-Вфосфотрансферазу, З'-О-фосфотрансферазу II (устойчивость к канамицину, неомицину и 0418). Однако, хотя эти маркеры устойчивости к антибиотикам могут быть наиболее подходящими для трансформации полиплоидных клеток-хозяев, предпочтительно используют не маркеры устойчивости к антибиотикам, такие как ауксотрофные маркеры (ИКАЗ, ТКР1, ЬЕи2) или ген ТР18.ротЬе (описанный Ки88е11 Р.К., 1985, Оеие 40: 125-130). В одном предпочтительном варианте осуществления клетки-хозяева, трансформированные этими конструкциями нуклеиновых кислот, не содержат маркерного гена. Способы конструирования рекомбинантных микробных клеток-хозяев, не имеющих маркерных генов, описаны в ЕР-А0635574 и основаны на использовании бинаправленных маркеров, таких как ген атй8 (ацетамидазы) А. П1йн1ап8 или гены дрожжей ИКАЗ и ЬУ82. Альтернативно, скринируемый маркер, такой как зеленый флуоресцентный белок, 1асЬ, люцифераза, хлорамфеникол-ацетилтрансфераза, β-глюкуронидаза, может быть включен в конструкции нуклеиновых кислот этого изобретения, что позволяет проводить скрининг на трансформированные клетки.

Необязательные дополнительные элементы, которые могут присутствовать в конструкциях нуклеиновых кислот, подходящих для применения в этом изобретении, включают в себя, но не ограничиваются ими, одну или несколько лидерных последовательностей, один или несколько энхансеров, факторов интеграции и/или репортерных генов, последовательности интронов, центромеры, теломеры и/или последовательности прикрепления к матриксу (МАК). Кроме того, конструкции нуклеиновых кислот данного изобретения могут содержать автономно реплицирующуюся последовательность, такую как последовательность АК8.

Предпочтительно ксилозоизомераза экспрессируется в цитозоле. Цитозольная экспрессия может достигаться делецией или модификацией митохондриального или пероксисомного нацеливающего сигнала.

Клеткой этого изобретения может быть любая подходящая клетка, такая как прокариотическая клетка, такая как бактерия, или эукариотическая клетка, например клетка дрожжей или мицелиального гриба.

Дрожжи определяются здесь как эукариотические микроорганизмы и включают в себя все виды подраздела Еитусойиа (А1ехорои1о8, С.Р, 1962, Ιη: 1и1гойис1огу Мусо1оду 1о1т ^йеу & 8опз, 1пс., кет Уогк), которые растут преимущественно в одноклеточной форме.

Дрожжи могут расти посредством почкования одноклеточного таллома или могут расти посредством деления этого организма. Предпочтительные дрожжи в качестве клетки этого изобретения могут принадлежать к родам Зассйаготусез, Ииууеготусез, СаиШйа, РюНа, ЗсЫ/озассйаготусез, Наи8еии1а, К1оескега, Зсктаишотусез или Уагго\\1а. Предпочтительно эти дрожжи являются дрожжами, способными к анаэробной ферментации, более предпочтительно дрожжами, способными к анаэробной спиртовой ферментации.

Мицелиальные грибы определяются здесь как эукариотические микроорганизмы, которые включают в себя все мицелиальные формы подраздела ЕитусоДиа. Эти грибы характеризуются вегетативным мицелием, состоящим из хитина, целлюлозы и других комплексных полисахаридов.

Мицелиальные грибы, подходящие для применения в качестве клетки данного изобретения, морфологически, физиологически и генетически отличаются от дрожжей. Могут быть преимущественно использованы мицелиальные грибные клетки, так как большинство грибов не требуют стерильных условий для размножения и являются нечувствительными к бактериофаговым инфекциям. Вегетативный рост мицелиальных грибов происходит посредством удлинения гифов, и катаболизм углерода большинства мицелиальных грибов является облигатно аэробным. Предпочтительные мицелиальные грибы в качестве клетки-хозяина этого изобретения могут принадлежать к роду АзрегдШиз, Тпсйойегта, Нит1со1а, Асгетотигга, Ризагшт или РетсШшт. Более предпочтительно мицелиальной грибной клеткой может быть клетка АхрегщНщ шдег, АзрегдШив огу/ае, РешсШшт сйгузодеиит или К1пхори8 огу/ае.

- 7 019482

На протяжении многих лет делались предложения о введении различных организмов для получения биоэтанола из сахаров сельскохозяйственных культур. Однако на практике все основные крупномасштабные процессы производства этанола продолжали использовать дрожжи рода 8ассйаготусе§ в качестве продуцента этанола. Это обусловлено многими привлекательными признаками видов 8ассйаготусе§ для промышленных процессов, т.е. высокой кислотоустойчивостью, устойчивостью к этанолу и осмотолерантностью, способностью к анаэробному росту и, конечно, их высокой способностью к ферментации с образованием спирта. Предпочтительные виды дрожжей в качестве клеток-хозяев включают в себя 8. сегемыае. 8. Ьи14егг 8. ЬагиеШ, 8. ех1дии8, 8. иуагит, 8. Файайсик, К. 1ас1к, К. татаиик или К. ГгадШз.

Клетка этого изобретения может быть способна превращать биомассу растений, целлюлозы, гемицеллюлозы, пектины, рамнозу, галактозу, фукозу, мальтозу, мальтодекстрины, рибозу, рибулозу или крахмал, производные крахмала, сахарозу, лактозу и глицерин, например, в ферментируемые сахара. Таким образом, клетка этого изобретения может экспрессировать один или несколько ферментов, таких как целлюлаза (эндоцеллюлаза или экзоцеллюлаза), гемицеллюлаза (эндо- или экзоксиланаза или арабиназа), необходимых для превращения целлюлозы в глюкозные мономеры и гемицеллюлозы в ксилозные или арабинозные мономеры, пектиназа, способная превращать пектины в глюкуроновую кислоту и галактуроновую кислоту, или амилаза для превращения крахмала в глюкозные мономеры.

Клеткой этого изобретения является предпочтительно клетка, способная к активному или пассивному транспорту ксилозы в эту клетку.

Предпочтительно клетка этого изобретения способна к активному гликолизу; и/или обнаруживает поток через пентозофосфатный путь; и/или проявляет ксилулозокиназную активность, так что ксилулоза, изомеризованная из ксилозы, может метаболизироваться в пируват.

Кроме того, эта клетка предпочтительно содержит ферментативные активности, требуемые для превращения пирувата в желаемый продукт ферментации, такой как этанол, бутанол, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, фумаровая кислота, яблочная кислота, итаконовая кислота, аминокислота, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, β-лактамный антибиотик или цефалоспорин.

Предпочтительной клеткой этого изобретения является клетка, которая природно способна к спиртовому брожению, предпочтительно анаэробному спиртовому брожению. Клетка этого изобретения предпочтительно имеет высокую устойчивость к этанолу, высокую устойчивость к низкому рН (т.е. способна к росту при рН менее приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2,5) и к органическим кислотам, таким как молочная кислота, уксусная кислота или муравьиная кислота, и/или продуктам деградации сахаров, таким как фурфураль и гидроксиметилфурфураль, и/или высокую устойчивость к повышенным температурам.

Любая из приведенных выше характеристик или активностей клетки этого изобретения могут присутствовать природно в этой клетке или могут быть введены или модифицированы генетической модификацией.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая ксилозоизомеразу, обычно экспрессируется или способна экспрессироваться в активной форме в трансформированной клетке-хозяине. Таким образом, экспрессия этой нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине продуцирует активную ксилозоизомеразу, обычно с удельной активностью по меньшей мере приблизительно 10 Е ксилозоизомеразной активности на 1 мг белка при приблизительно 30°С, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 200, по меньшей мере приблизительно 300, по меньшей мере приблизительно 500, по меньшей мере приблизительно 750 или по меньшей мере приблизительно 1000 Е на 1 мг при приблизительно 30°С. Удельная активность ксилозоизомеразы, экспрессируемой в трансформированной клетке-хозяине, определяется как количество единиц ксилозоизомеразной активности на 1 мг белка бесклеточного лизата клетки-хозяина, например не содержащего дрожжевых клеток лизата. Определение ксилозоизомеразной активности, количества белка и приготовление не содержащего клеток лизата описаны здесь. Предпочтительно экспрессия нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилозоизомеразу, в клетке-хозяине продуцирует ксилозоизомеразу с К_т для ксилозы, которая меньше чем 50, 40, 30 или 25 мМ, более предпочтительно К_т для ксилозы равна приблизительно 20 мМ или менее.

Клетка этого изобретения может содержать одну или несколько генетических модификаций, которые увеличивают поток через пентозофосфатный путь. В частности, эта генетическая модификация (эти генетические модификации) могут приводить к увеличенному потоку через неокислительный участок пентозофосфатного пути. Генетическая модификация, которая вызывает увеличенный поток неокислительного участка пентозофосфатного пути, обозначает здесь модификацию, которая увеличивает этот поток по меньшей мере приблизительно в 1,1, приблизительно в 1,2, приблизительно в 1,5, приблизительно в 2, приблизительно в 5, приблизительно в 10 или приблизительно в 20 раз относительно потока в штамме, который является генетически идентичным, за исключением генетической модификации, вызы

- 8 019482 вающей увеличенный поток в клетку. Этот поток неокислительного участка пентозофосфатного пути в клетку может быть измерен по росту модифицированного хозяина на ксилозе в качестве единственного источника углерода определением удельной скорости потребления ксилозы и вычитанием этой удельной скорости продуцирования ксилита из удельной скорости потребления ксилозы, если ксилит образуется. Однако этот поток неокислительного участка пентозофосфатного пути пропорционален скорости роста на ксилозе в качестве единственного источника углерода, предпочтительно скорости анаэробного роста на ксилозе в качестве единственного источника углерода. Имеется линейная связь между скоростью роста на ксилозе в качестве единственного источника углерода (μ^) и потоком неокислительного участка пентозофосфатного пути. Удельная скорость потребления ксилозы (0₅) равна скорости роста (μ), деленной на выход биомассы на сахаре (Υ_Χ8), так как выход биомассы на сахаре является постоянным (при конкретном наборе условий: анаэробные условия, среда роста, рН, генетическая среда конкретного штамма и т.д.; т.е. О₅ = μ/Υ_Χ8). Таким образом, увеличенный поток неокислительного участка пентозофосфатного пути может быть выведен из увеличения максимальной скорости роста при этих условиях при отсутствии транспорта (поглощение является лимитирующим).

Одна или несколько генетических модификаций, которые увеличивают поток через пентозофосфатный путь, могут быть введены в клетку-хозяин различными путями. Они включают в себя, например, достижение более высоких стационарных уровней активности ксилозоизомеразы и/или одного или нескольких ферментов неокислительного участка пентозофосфатного пути и/или уменьшенного стационарного уровня активности неспецифической альдозоредуктазы. Эти изменения в стационарных уровнях активности могут выполняться отбором мутантов (спонтанных или индуцированных химикалиями или облучением) и/или технологией рекомбинантных ДНК, например посредством сверхэкспрессии или инактивации, соответственно, генов, кодирующих ферменты или факторы регуляции этих генов.

В предпочтительной клетке-хозяине эта генетическая модификация включает в себя сверхэкспрессию по меньшей мере одного фермента пентозофосфатного пути (неокислительного участка). Предпочтительно этот фермент выбран из группы, состоящей из таких ферментов, как риболозо-5фосфатизомераза, рибулозо-5-фосфатэпимераза, транскетолаза и трансальдолаза. Различные комбинации ферментов пентозофосфатного пути (неокислительного участка) могут быть сверхэкспрессируемыми. Например, ферментами, которые являются сверхэкспрессируемыми, могут быть, по меньшей мере, ферменты рибулозо-5-фосфатизомераза и рибулозо-5-фосфатэпимераза; или, по меньшей мере, ферменты рибулозо-5-фосфатизомераза и транскетолаза; или, по меньшей мере, ферменты рибулозо-5фосфатизомераза и трансальдолаза; или, по меньшей мере, ферменты рибулозо-5-фосфатэпимераза и транскетолаза; или, по меньшей мере, ферменты рибулозо-5-фосфатэпимераза и трансальдолаза; или, по меньшей мере, ферменты транскетолаза и трансальдолаза; или, по меньшей мере, ферменты рибулозо-5фосфатэпимераза, транскетолаза и трансальдолаза; или, по меньшей мере, ферменты рибулозо-5фосфатизомераза, транскетолаза и трансальдолаза; или, по меньшей мере, ферменты рибулозо-5фосфатизомераза, рибулозо-5-фосфатэпимераза и трансальдолаза; или, по меньшей мере, ферменты рибулозо-5-фосфатизомераза, рибулозо-5-фосфатэпимераза и транскетолаза. В одном варианте осуществления каждый из этих ферментов: рибулозо-5-фосфатизомераза, рибулозо-5-фосфатэпимераза, транскетолаза и трансальдолаза сверхэкспрессируются в этой клетке-хозяине. Более предпочтительной является клетка-хозяин, в которой эта генетическая модификация включает в себя, по меньшей мере, сверхэкспрессию обоих ферментов транскетолаза и трансальдолаза, так как такая клетка-хозяин уже способна к анаэробному росту на ксилозе. Действительно, при некоторых условиях клетки-хозяева, сверхэкспрессирующие только транскетолазу и трансальдолазу уже имеют ту же самую скорость анаэробного роста на ксилозе, что и клетки-хозяева, которые сверхэкспрессируют все эти четыре фермента, т.е. рибулозо-5фосфатизомеразу, рибулозо-5-фосфатэпимеразу, транскетолазу и трансальдолазу. Кроме того, клеткихозяева, сверхэкспрессирующие оба фермента, рибулозо-5-фосфатизомеразу и рибулозо-5фосфатэпимеразу, являются предпочтительными в сравнении с клетками-хозяевами, сверхэкспрессирующими только изомеразу или только эпимеразу, так как сверхэкспрессия только одного из этих ферментов может приводить к метаболическим дисбалансам.

Фермент рибулозо-5-фосфатэпимераза (ЕС 5.1.3.1) определяется здесь как фермент, который катализирует эпимеризацию Э-ксилозо-5-фосфата в Э-рибулозо-5-фосфат и У1се уегаа. Этот фермент известен также как фосфорибулозоэпимераза; эритрозо-4-фосфатизомераза; фосфокетопентозо-3эпимераза; ксилулозофосфат-3-эпимераза; фосфокетопентозоэпимераза; рибулозо-5-фосфат-3-эпимераза; Э-рибулозофосфат-3-эпимераза; Э-рибулозо-5-фосфатэпимераза; Э-рибулозо-5-Р-3-эпимераза; Όксилулозо-5-фосфат-3-эпимераза; пенто-5-фосфат-3-эпимераза или Э-рибулозо-5-фосфат-3-эпимераза. Рибулозо-5-фосфатэпимераза может быть дополнительно определена по ее аминокислотной последовательности. Подобным образом, рибулозо-5-фосфатэпимераза может быть определена по нуклеотидной последовательности, кодирующей этот фермент, а также по нуклеотидной последовательности, гибридизующейся с нуклеотидной референс-последовательностью, кодирующей рибулозо-5-фосфатэпимеразу.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая рибулозо-5-фосфатэпимеразу, обозначена здесь как КРЕ1.

- 9 019482

Фермент рибулозо-5-фосфатизомераза (ЕС 5.3.1.6) определяется здесь как фермент, который катализирует прямую изомеризацию Б-рибозо-5-фосфата в Б-рибулозо-5-фосфат и У1се усгяа. Этот фермент известен так же, как фосфопентозизомераза; фосфорибоизомераза; рибозофосфатизомериза; 5фосфорибозоизомераза; Б-рибозо-5-фосфатизомераза; Б-рибозо-5-фосфаткетолизомераза или Ό-рибозо5-фосфат-альдозо-кетозо-изомераза. Рибулозо-5-фосфатизомераза может быть определена по ее аминокислотной последовательности. Подобным образом, рибулозо-5-фосфатизомераза может быть определена по нуклеотидной последовательности, кодирующей этот фермент, а также по нуклеотидной последовательности, гибридизующейся с нуклеотидной референс-последовательностью, кодирующей рибулозо5-фосфатизомеразу.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая рибулозо-5-фосфатизомеразу, обозначена здесь как ΚΡΙ1.

Фермент транскетолаза (ЕС 2.2.1.1) определяется здесь как фермент, который катализирует реакцию Б-рибозо-5-фосфат + Б-ксилулозо-5-фосфат θ седогептулозо-7-фосфат + Б-глицеральдегид-3фосафт и У1се уегяа. Этот фермент известен также, как гликольальдегидтрансфераза или седогептулозо-7фосфат:Б-глицеральдегид-3-фосфатгликольальдегидтрансфераза. Транскетолаза может быть дополнительно определена по ее аминокислотной последовательности. Подобным образом, транскетолаза может быть определена по нуклеотидной последовательности, кодирующей этот фермент, а также по нуклеотидной последовательности, гибридизующейся с нуклеотидной референс-последовательностью, кодирующей транскетолазу. Нуклеотидная последовательность, кодирующая транскетолазу, обозначена здесь как ТКЬ1.

Фермент трансальдолаза (ЕС 2.2.1.2) определяется здесь как фермент, катализирующий реакцию: седогептулозо-7-фосфат + Б-глицеральдегид-3-фосфат θ Б-эритрозо-4-фосфат + Б-фруктозо-6-фосфат и У1се уегка. Этот фермент известен так же, как дигидроацетонтрансфераза; дигидроксиацетонсинтаза; формальдегидтранскетолаза или седогептулозо-7-фосфат:Б-глицеральдегид-3 -фосфатглицеронтрансфераза. Трансальдолаза может быть дополнительно определена по ее аминокислотной последовательности. Подобным образом, трансальдолаза может быть определена по нуклеотидной последовательности, кодирующей этот фермент, а также по нуклеотидной последовательности, гибридизующейся с нуклеотидной референс-последовательностью, кодирующей трансальдолазу. Нуклеотидная последовательность, кодирующая трансальдолазу, обозначена здесь как ТАЬ1.

Различные способы известны квалифицированным в данной области специалистам для экспрессии и сверхэкспрессии ферментов в клетке этого изобретения. В частности, фермент может быть сверхэкспрессирован увеличением числа копий гена, кодирующего этот фермент, в клетке-хозяине, например, интеграцией дополнительных копий этого гена в геноме этой клетки-хозяина, экспрессией этого гена из эписомного мультикопийного экспрессирующего вектора введением эписомного экспрессирующего вектора, который содержит множественные копии этого гена.

Альтернативно, сверхэкспрессия ферментов в клетках-хозяевах этого изобретения может быть достигнута с использованием промотора, который не является природным относительно последовательности, кодирующей фермент, который должен быть сверхэкспрессирован, т.е. промотора, который является гетерологичным относительно кодирующей последовательности, с которой он функционально связан. Хотя этот промотор предпочтительно является гетерологичным относительно последовательности, с которой он функционально связан, предпочтительно этот промотор является гомологичным, т.е. эндогенным для клетки-хозяина. Предпочтительно гетерологичный промотор способен продуцировать более высокий уровень стационарного состояния транскрипта, содержащего кодирующую последовательность (или способен продуцировать больше молекул транскрипта, т.е. молекул мРНК, на единицу времени), чем промотор, который является природным относительно этой кодирующей последовательности, предпочтительно при условиях, в которых ксилоза или ксилоза и глюкоза являются доступными в качестве источников углерода, более предпочтительно в качестве основных источников углерода (т.е. более 50% доступного источника углерода состоят из ксилозы или ксилозы и глюкозы), наиболее предпочтительно в качестве единственных источников углерода. Подходящие промоторы в этом контексте включают в себя как конститутивные, так и индуцируемые природные промоторы, а также сконструированные генной инженерией промоторы. Предпочтительный промотор для применения в данном изобретении будет, кроме того, нечувствительным к катаболитной репрессии (глюкозой) и/или предпочтительно не будет требовать ксилозы для индукции. Промоторы, имеющие эти характеристики, широко доступны и известны квалифицированному в данной области специалисту. Подходящие примеры таких промоторов включают в себя, например, промоторы из гликолитических генов, такие как промоторы фосфофруктокиназы (РЕК), триозофосфатизомеразы (ΤΡΙ), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ΟΡΌ, ΤΌΗ3 или САРБН), пируваткиназы (РУК), фосфоглицераткиназы (РСК) из дрожжей или мицелиальных грибов; больше деталей относительно таких промоторов из дрожжей можно найти в (νΟ 93/03159). Другими применимыми промоторами являются промоторы кодирующих рибосомные белки генов, промотор гена лактазы (ЬАС4), промоторы алкогольдегидрогеназы (ΑΌΗΙ, ΑΌΗ4 и т.п.) и промотор энолазы (ΕΝΟ). Другие промоторы, как конститутивные, так и индуцируемые, и энхансеры или находящиеся слева акти

- 10 019482 вирующие последовательности будут известны квалифицированным в данной области специалистам. Промоторы, используемые в клетках-хозяевах этого изобретения, могут быть модифицированы, если желательно, для воздействия на их регуляторные характеристики.

Кодирующая последовательность, используемая для сверхэкспрессии вышеупомянутых ферментов, может быть предпочтительно гомологичной в отношении клетки-хозяина этого изобретения. Однако могут быть также использованы кодирующие последовательности, которые являются гетерологичными относительно клетки-хозяина этого изобретения.

Сверхэкспрессия фермента при ссылке на получение этого фермента в генетически модифицированной клетке-хозяине, означает, что этот фермент продуцируется при более высоком уровне удельной ферментативной активности в сравнении с немодифицированной клеткой-хозяином при идентичных условиях. Обычно это означает, что ферментативно активный белок (или белки в случае мультисубъединичных ферментов) продуцируется в больших количествах или скорее при более высоком уровне стационарного состояния в сравнении с немодифицированной клеткой-хозяином при идентичных условиях. Таким образом, сверхэкспрессию фермента предпочтительно определяют измерением уровня удельной активности в клетке-хозяине с использованием подходящих анализов ферментов, описанных здесь. Альтернативно, сверхэкспрессия фермента может быть определена косвенно количественным определением конкретного стационарного уровня мРНК, кодирующей этот фермент. Последнее может быть особенно подходящим для ферментов пентозофосфатного пути, для которых ферментативные анализы не являются легко осуществимыми, так как субстраты для этих ферментов не являются коммерчески доступными. Предпочтительно в клетке-хозяине этого изобретения фермент, подлежащий сверхэкспрессии, сверхэкспрессируется по меньшей мере приблизительно в 1,1, приблизительно в 1,2, приблизительно в 1,5, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 5, приблизительно в 10 или приблизительно в 20 раз в сравнении со штаммом, который является генетически идентичным, за исключением генетической модификации, вызываемой этой сверхэкспрессией. Должно быть понятно, что эти уровни сверхэкспрессии могут применяться к стационарному уровню белка фермента, а также к стационарному уровню транскрипта, кодирующего этот фермент.

Клетка этого изобретения может содержать одну или несколько генетических модификаций, которые увеличивают удельную активность ксилулозокиназы. Предпочтительно эта генетическая модификация или эти генетические модификации вызывают сверхэкспрессию ксилулозокиназы, например, посредством сверхэкспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей ксилулозокиназу. Ген, кодирующий ксилулозокиназу, может быть эндогенным относительно клетки-хозяина или может быть ксилулозокиназой, которая является гетерологичной относительно этой клетки-хозяина. Нуклеотидной последовательностью, используемой для сверхэкспрессии ксилулозокиназы в клетке-хозяине этого изобретения, является нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с ксилулозокиназной активностью.

Фермент ксилулозокиназа (ЕС 2.7.1.17) определяется здесь как фермент, который катализирует реакцию АТФ + Ό-ксилулоза = АДФ + Ό-ксилулозо-З-фосфаат. Этот фермент известен также как фосфорилирующая ксилулокиназа, Ό-ксилулокиназа или АТФ:Э-ксилулозо-5-фосфотрансфераза. Ксилулозокиназа этого изобретения может быть дополнительно определена по ее аминокислотной последовательности. Подобным образом, ксилулозокиназа может быть определена по нуклеотидной последовательности, кодирующей этот фермент, а также по нуклеотидной последовательности, гибридизующейся с нуклеотидной референс-последовательностью, кодирующей ксилулозокиназу.

В клетке этого изобретения, генетическая модификация или генетические модификации, которые увеличивают удельную активность ксилулозокиназы, могут быть объединены с любой из модификаций, увеличивающих поток пентозофосфатного пути, как описано выше. Однако это не является существенным.

Таким образом, клетка-хозяин этого изобретения может содержать только одну генетическую модификацию или модификации, которые увеличивают удельную активность ксилулозокиназы. Различные способы, доступные в данной области для достижения и анализа сверхэкспрессии ксилулозокиназы в клетках-хозяевах этого изобретения, являются такими же, что и описанные выше для ферментов пентозофосфатного пути. Предпочтительно в клетках-хозяевах этого изобретения, ксилулозокиназа, которая должна сверхэкспрессироваться, сверхэкспрессируется по меньшей мере приблизительно в 1,1, приблизительно в 1,2, приблизительно в 1,5, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 5, приблизительно в 10 или приблизительно в 20 раз в сравнении со штаммом, который является генетически идентичным, за исключением генетической модификации, вызываемой этой сверхэкспрессией. Должно быть понятно, что эти уровни сверхэкспрессии могут применяться к уровню стационарного состояния белка фермента, а также к уровню стационарного состояния транскрипта, кодирующего этот фермент.

Клетка этого изобретения может содержать одну или несколько генетических модификаций, которые уменьшают неспецифическую альдозоредуктазную активность в клетке-хозяине. Предпочтительно неспецифическая альдозоредуктазная активность уменьшается в клетке-хозяине одной или несколькими генетическими модификациями, которые уменьшают экспрессию гена, кодирующего неспецифическую альдозоредуктазу, или инактивируют ген, кодирующий неспецифическую альдозоредуктазу. Предпочти

- 11 019482 тельно эти генетические модификации уменьшают или инактивируют экспрессию каждой эндогенной копии гена, кодирующего неспецифическую альдозоредуктазу в клетке-хозяине. Клетки-хозяева могут содержать множественные копии генов, кодирующих неспецифические альдозоредуктазы, как результат ди-, поли- или анэуплоидии, и/или клетка-хозяин может содержать несколько различных (изо)ферментов с альдозоредуктазной активностью, которые отличаются в аминокислотной последовательности и каждый из которых кодируется отличающимся геном. В таких случаях предпочтительно также, что экспрессия каждого гена, который кодирует неспецифическую альдолазоредуктазу, является уменьшенной или инактивированной. Предпочтительно этот ген инактивируется делецией по меньшей мере части этого гена или разрушением этого гена, вследствие чего в этом контексте термин ген включает в себя также любую некодирующую последовательность слева или справа от кодирующей последовательности, (частичная) делеция или инактивация которой приводит к уменьшению экспрессии неспецифической альдозоредуктазной активности в клетке-хозяине.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая альдозоредуктазу, активность которой должна быть уменьшена в клетке-хозяине этого изобретения, является нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид с альдозоредуктазной активностью.

В клетках-хозяевах этого изобретения генетическая модификация, которая уменьшает неспецифическую альдозоредуктазную активность в клетке-хозяине, может быть объединена с любой из модификаций, увеличивающих поток пентозофосфатного пути, и/или с любой из модификаций, увеличивающих удельную активность ксилулозокиназы в клетках-хозяевах, как описано выше. Однако это не является существенным.

Таким образом, клетка-хозяин этого изобретения, содержащая только одну генетическую модификацию или модификации, которые уменьшают неспецифическую альдозоредуктазную активность в клетке-хозяине, особо включена в это изобретение.

Фермент альдозоредуктаза (ЕС 1.1.1.21) определяется здесь как фермент, который способен восстанавливать ксилозу или ксилулозу в ксилит. В контексте этого изобретения альдозоредуктаза может быть любой неспецифической альдозоредуктазой, которая является природной (эндогенной) относительно клетки-хозяина этого изобретения и которая способна восстанавливать ксилозу или ксилулозу в ксилит. Неспецифические альдозоредуктазы катализируют реакцию альдоза + ΝΛΌ(Ρ)Η + Н⁺ θ альдит + ΝΑΏ(Ρ)⁺.

Этот фермент имеет широкую специфичность и известен также как альдозоредуктаза; полиолдегидрогеназа (ΝΑΌΡ*); альдит^АЭР-оксидоредуктаза; альдит^АВР⁺-1-оксидоредуктаза; ΝΑΌΡΗальдопентозоредуктаза или ΝΑΏΡΗ-альдозоредуктаза.

Конкретный пример такой неспецифической альдозоредуктазы, которая является эндогенной относительно 8. сетеу151ае и которая кодируется геном ОЯЕ3, описан в (ТгаГГ с1 а1., 2001, Αρρί. Εηνίτοη. ΜίοτοЫо1. 67: 5668-74). Таким образом, альдозоредуктаза этого изобретения может быть дополнительно определена по ее аминокислотной последовательности. Подобным образом, альдозоредуктаза может быть определена по нуклеотидной последовательности, кодирующей этот фермент, а также по нуклеотидной последовательности, гибридизующейся с нуклеотидной референс-последовательностью, кодирующей альдозоредуктазу.

Клетка этого изобретения может быть адаптирована к использованию ксилозы отбором мутантов, спонтанных или индуцированных (например, облучением или химикалиями), для роста на ксилозе, предпочтительно на ксилозе в качестве единственного источника углерода и более предпочтительно при анаэробных условиях. Отбор мутантов может выполняться способами, включающими в себя пассирование культур, как, например, описано Киурег е1 а1. (2004, ΕΕΜ8 Уеае1 Кее. 4: 655-664), или культивированием при селективном давлении в культуре в хемостате. В предпочтительной клетке-хозяине этого изобретения по меньшей мере одна из генетических модификаций, описанных выше, в том числе модификаций, полученных отбором мутантов, придает этой клетке-хозяину способность расти на ксилозе в качестве источника углерода, предпочтительно в качестве единственного источника углерода и предпочтительно при анаэробных условиях. Предпочтительно эта модифицированная клетка-хозяин, по существу, не продуцирует ксилит, например, продуцируемый ксилит находится ниже предела детектирования или, например, составляет менее приблизительно 5, приблизительно 2, приблизительно 1, приблизительно 0,5 или приблизительно 0,3% потребленного углерода в расчете на моль.

Клетка этого изобретения может иметь способность роста на ксилозе в качестве единственного источника углерода при скорости приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,25 или приблизительно 0,3 ч^-1 при аэробных условиях или, если возможно, при скорости по меньшей мере приблизительно 0,03, приблизительно 0,05, приблизительно 0,07, приблизительно 0,08, приблизительно 0,09, приблизительно 0,1, приблизительно 0,12, приблизительно 0,15 или приблизительно 0,2 ч^-1 при анаэробных условиях. Предпочтительно эта модифицированная клетка-хозяин имеет способность роста на смеси глюкозы и ксилозы (в массовом соотношении 1:1) в качестве единственного источника углерода при скорости по меньшей мере приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,25 или приблизительно 0,3 ч^-1 при аэробных условиях или, если возможно, при скорости по меньшей мере приблизительно 0,03, приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, прибли

- 12 019482 зительно 0,12, приблизительно 0,15 или приблизительно 0,2 ч^-1 при анаэробных условиях.

Клетка этого изобретения может иметь удельную скорость потребления ксилозы по меньшей мере приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 346, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 750 или приблизительно 1000 мг ксилозы/г клеток/ч. Клетка этого изобретения может иметь выход продукта ферментации (такого как этанол) на ксилозе, который равен меньшей мере приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 98 или приблизительно 99% выхода продукта ферментации клетки-хозяина (такого как этанол) на глюкозе. Более предпочтительно выход продукта ферментации (такого как этанол) клетки этого изобретения на ксилозе может быть равен выходу продукта ферментации этой клетки (такому как этанол) на глюкозе. Подобным образом, выход биомассы клеток на ксилозе может быть равен по меньшей мере приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 55, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 85, приблизительно 90, приблизительно 95, приблизительно 98 или приблизительно 99% выхода биомассы клеток на глюкозе. Более предпочтительно выход биомассы клеток на ксилозе может быть равен выходу биомассы клеток на глюкозе. Понятно, что в сравнении выходов на глюкозе и ксилозе оба выхода сравниваются при аэробных условиях или оба при анаэробных условиях.

Клетка этого изобретения может быть способна использовать арабинозу. Таким образом, клетка этого изобретения способна превращать Ь-арабинозу в Ь-рибулозу и/или ксилулозо-5-фосфат и/или желаемый продукт ферментации, например один из вышеупомянутых продуктов.

Организмы, например штаммы 8. еегеуыае. способные продуцировать этанол из Ь-арабинозы, могут быть получены модификацией клетки введением генов агаА (Ь-арабинозоизомеразы), агаВ (Ьрибулокиназы) и атаЭ (Ь-рибулозо-5-Р4-эпимеразы) из подходящего источника. Такие гены могут вводиться в клетку этого изобретения, чтобы она была способна использовать арабинозу. Такой подход описан в АО 2003/095627.

Клеткой этого изобретения может быть клетка, подходящая для получения этанола. Однако клетка этого изобретения может быть подходящей для получения продуктов ферментации, других чем этанол. Такие неэтанольные продукты ферментации включают в себя в принципе любое неочищенное или очищенное химическое соединение, которое может продуцироваться эукариотическим микроорганизмом, таким как дрожжи или мицелиальный гриб.

Такими продуктами ферментации может быть, например, бутанол, молочная кислота, 3гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, итаконовая кислота, аминокислота, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, β-лактамный антибиотик или цефалоспорин. Предпочтительной модифицированной клеткойхозяином этого изобретения для получения неэтанольных продуктов ферментации является клеткахозяин, которая содержит генетическую модификацию, которая приводит к уменьшенной алкогольдегидрогеназной активности.

В следующем аспекте это изобретение относится к способам ферментации, в которых модифицированные клетки-хозяева этого изобретения используются для ферментации источника углерода, содержащего источник ксилозы, такой как ксилоза. Кроме источника ксилозы этот источник углерода в данной ферментационной среде может также содержать источник глюкозы. Этим источником ксилозы или глюкозы может быть ксилоза или глюкоза как таковые или может быть любой углеводный олиго- или полимер, содержащий ксилозные или глюкозные звенья, такой как, например, лигноцеллюлоза, ксиланы, целлюлоза, крахмал и т.п. Для высвобождения ксилозных или глюкозных звеньев из таких углеводов, подходящие карбогидразы (такие как ксиланазы, глюканазы, амилазы и т.п.) могут быть добавлены к ферментационной среде или могут быть продуцированы модифицированной клеткой хозяином. В последнем случае модифицированная клетка-хозяин может быть генетически сконструирована для продуцирования и экскреции таких карбогидраз. Дополнительным преимуществом использования олиго- или полимерных источников глюкозы является то, что они позволяют поддерживать низкую (более низкую) концентрацию свободной глюкозы во время ферментации, например, с использованием ограничивающих скорость количеств карбогидраз. Это, в свою очередь, будет предотвращать репрессию систем, требуемых для метаболизма и транспорта сахаров иных чем глюкоза, таких как ксилоза.

В предпочтительном способе ферменты модифицированной клетки ферментируют как ксилозу, так и глюкозу, предпочтительно одновременно, и в этом случае предпочтительно используется модифицированная клетка-хозяин, которая является нечувствительной к глюкозной репрессии для предотвращения диауксического роста. Кроме источника ксилозы (и глюкозы) в качестве источника углерода, ферментационная среда будет дополнительно содержать подходящий ингредиент, требуемый для роста этой модифицированной клетки-хозяина. Композиции ферментационных сред для роста микроорганизмов, таких как дрожжи, хорошо известны в данной области. Этот способ ферментации является способом получения продукта ферментации, такого как, например, этанол, бутанол, молочная кислота, 3гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, итаконовая кислота, аминокислота, 1,3-пропандиол, этилен,

- 13 019482 глицерин, β-лактамный антибиотик, такой как пенициллин С или пенициллин V и их производные, и цефалоспорин.

Этот способ (процесс) ферментации может быть аэробным или анаэробным способом. Анаэробный способ ферментации определяется здесь как способ ферментации, проводимый в отсутствие кислорода, или способ, в котором кислород, по существу, не потребляется, предпочтительно менее приблизительно 5, приблизительно 2,5 или приблизительно 1 ммоль/л/ч, более предпочтительно 0 ммоль/л/ч (т.е. потребление кислорода является недетектируемым), и в котором органические молекулы служат в качестве как доноров электронов, так и акцепторов электронов. В отсутствие кислорода ΝΑΌΗ, продуцируемый в гликолизе и образовании биомассы, не может окисляться окислительным фосфорилированием. Для решения этой проблемы многие микроорганизмы используют пируват или одно из его производных в качестве акцептора электрона и водорода с регенированием посредством этого ΝΑΌ⁺.

Таким образом, в предпочтительном анаэробном способе ферментации пируват используется в качестве акцептора электрона и водорода и является уменьшенным относительно продуктов ферментации, таких как этанол, бутанол, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, итаконовая кислота, аминокислота, 1,3-пропандиол, этилен, глицерин, β-лактамный антибиотик и цефалоспорин.

Этот способ ферментации предпочтительно выполняют при температуре, которая является оптимальной для модифицированной клетки-хозяина. Таким образом, для большинства дрожжей или грибных клеток-хозяев, этот способ ферментации предпочтительно проводят при температуре, которая является более низкой чем приблизительно 42°С, предпочтительно меньшей чем 38°С. Для дрожжей или мицелиальных грибных клеток-хозяев этот способ ферментации предпочтительно выполняют при температуре, которая является более низкой чем приблизительно 35, приблизительно 33, приблизительно 30 или приблизительно 28°С и при температуре, которая является более высокой чем приблизительно 20, приблизительно 22 или приблизительно 25°С.

Предпочтительным способом является способ получения этанола, который предусматривает стадии: (а) ферментации среды, содержащей источник ксилозы, модифицированной клеткой-хозяином, определенной выше, посредством чего эта клетка-хозяин ферментирует ксилозу в этанол; и, необязательно, (Ь) извлечение этого этанола. Ферментационная среда может также содержать источник глюкозы, который также ферментируется в этанол. В этом способе волюметрическая продуктивность этанола равна предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,5, приблизительно 1,0, приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 5,0 или приблизительно 10,0 г этанола/л/ч. Выход этанола на ксилозе и/или глюкозе в этом способе составляет по меньшей мере приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 95 или приблизительно 98%. Выход этанола определяется здесь как процент теоретически максимального выхода.

Это изобретение относится также к способу получения продукта ферментации, такого как продукт, выбранный из группы, состоящей из бутанола, молочной кислоты, 3-гидроксипропионовой кислоты, акриловой кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, итаконовой кислот, аминокислоты, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, β-лактамного антибиотика и цефалоспорина. Этот способ предпочтительно предусматривает ферментацию среды, содержащей источник ксилозы, модифицированной клеткой-хозяином, определенной выше, посредством которого эта клетка-хозяин ферментирует ксилозу в этот продукт ферментации.

Это изобретение обеспечивает также способ получения продукта ферментации, такого как продукт, выбранный из группы, состоящей из этанола, бутанола, молочной кислоты, 3-гидроксипропио новой кислоты, акриловой кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, итаконовой кислоты, аминокислоты, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, βлактамного антибиотика и цефалоспорина. Этот способ предпочтительно предусматривает ферментацию среды, содержащей по меньшей мере один источник ксилозы и один источник Ь-арабинозы, клеткой, определенной выше, которая способна использовать как ксилозу, так и Ь-арабинозу, так что эта клетка ферментирует ксилозу и Ь-арабинозу в продукт ферментации.

Это изобретение обеспечивает также способ получения продукта ферментации, такого как продукт, выбранный из группы, состоящей из этанола, бутанола, молочной кислоты, 3-гидроксипропио новой кислоты, акриловой кислоты, уксусной кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, итаконовой кислоты, аминокислоты, 1,3-пропандиола, этилена, глицерина, βлактамного антибиотика и цефалоспорина. Этот способ предпочтительно предусматривает ферментацию среды, содержащей по меньшей мере источник ксилозы и источник Ь-арабинозы, клеткой, определенной выше, и клеткой, способной использовать Ь-арабинозу, посредством чего каждая клетка ферментирует ксилозу и/или арабинозу в продукт ферментации.

Способ этого изобретения может также предусматривать извлечение этого продукта ферментации. Среда, с которой проводят этот способ, может также содержать источник глюкозы.

Способ по этому изобретению может проводиться при аэробных и анаэробных условиях. Предпоч

- 14 019482 тительно этот способ проводят при микроаэрофильных условиях или ограничиваемых кислородом условиях.

Способ анаэробной ферментации определяется здесь как способ ферментации, проводимый в отсутствии кислорода, или способ, в котором кислород, по существу, не потребляется, предпочтительно потребляется менее приблизительно 5, приблизительно 2,5 или приблизительно 1 ммоль/л/ч, и в котором органические молекулы служат в качестве как донора электронов, так и акцепторов электронов.

Способ ограничиваемой кислородом ферментации является способом, в котором потребление кислорода ограничивается переносом кислорода из газа в жидкость. Степень кислородного ограничения определяется количеством и составом входящего потока газа, а также фактическими свойствами смешивания/переноса массы используемого ферментационного оборудования. Предпочтительно в способе при ограничиваемых кислородом условиях скорость потребления кислорода равна по меньшей мере приблизительно 5,5, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 6, например по меньшей мере 7 ммоль/л/ч.

Следующие примеры иллюстрируют это изобретение.

Примеры

Если нет других указаний, используемые способы являются стандартными биохимическими способами. Примеры подходящих справочников общей методологии включают в себя 8ашЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд, а ЬаЬога!огу Мапиа1 (1989) и АизиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1995), 1окп \\Пеу & 8опз, 1пс.

Ксилозоизомеразная активность (определяемая в примерах 1 и 2).

Ксилозоизомеразная активность может быть измерена при 37°С в реакционной смеси, содержащей 50 мМ фосфатный буфер (рН 7,0), 10 мМ ксилозу, 10 мМ МдС1₂ и подходящее количество бесклеточного экстракта. Количество образованной ксилулозы может быть определено по способу с цистеиномкарбазолом (Со1б8!еш апб МсСизкег, Уеаз! 15, 1541-1553, 1999). Альтернативно, активность ксилозоизомеразы анализируют при 30°С с использованием ферментного анализа Кегз!егз-Нббегззоп е! а1. (Ктебс с11агас1епха1юп оГ О-ху1озе 1зошегазез Ьу епхутайс аззауз изтд О-зогЫЮ бебубтодепазе. Епх. МютоЬ. Тес11по1. 9 (1987) 145-148). Активность ксилозоизомеразы ш νίΙΐΌ в бесклеточных экстрактах трансформированных штаммов 8. сегеу131ае зависит от бивалентных катионов (Мд₂ ⁺ или Со₂ ⁺).

Трансформация 8. сегеу131ае.

Трансформацию 8. сегеу131ае выполняли, как описано С1е1/ апб \ообз (2002; ТтапзГотшабоп оГ 1Пе уеаз! Ьу 1Пе ЫАс/88 сатег ΌΝΑ/РЕС тебюб. Мебюбз ш Епхуто1оду 350: 87-96).

ПЦР колоний.

Изолят отдельной колонии выскребали пластиковой зубочисткой и ресуспендировали в 50 мкл воды ιηί11ίρ. Эту пробу инкубировали в течение 10 мин при 99°С. 5 мкл инкубированной пробы использовали в качестве матрицы для реакции ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Рбизюп® (Ебтхутез) в соответствии с инструкциями, обеспечиваемыми поставщиком.

Условия реакции ПЦР:

стадия 1	3’ 98°С
стадия 2	10 98°С
стадия 3	15 58°С повторение стадий 2-4 в течение 30 циклов
стадия 4	30 72°С
стадия 5	4’ 72°С
стадия 6	30 20°С

Предобработка пробы для определений ксилозоизомеразы (общее описание здесь и в примере 3).

0,5 мл 0,1М МОР8-буфера (рН 7,5) добавляли к осадку клеток ночной культуры. Клетки ресуспендировали и переносили в пробирку Эппендорфа на 2 мл, которая уже содержала 0,5 г стеклянных бусин с диаметром 0,4-0,5. Все пробы энергично встряхивали в шейкере для пробирок Эппендорфа (1КА VIВКАХ-УХК) в течение 20 мин при 4°С, при максимальной скорости. Экстракт центрифугировали в течение 5 мин при 14000 об/мин и 4°С. Супернатант, который является бесклеточным экстрактом, переносили в новую пробирку Эппендорфа.

Условия анализа ксилозоизомеразной активности (общее описание здесь и в примере 3).

Следующий способ является модифицированным способом, описанным П1зсЬе-ВогепГгеиб (1. Вю1. Сбеш. (1951) 192, 2, 583-587). Один (1,0) мл субстратной смеси (100 мМ МОР8 рН 7.5, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Ό-ксилоза) смешивали с 50 мкл (разведенного) бесклеточного экстракта, в двух повторностях, на льду. Затем реакционные пробирки помещали в водную баню 50°С на 30 мин. Кроме того, эти реакции проводили при 30°С также в двух повторностях. Реакцию останавливали помещением реакционных пробирок на ледяную воду с последующим добавлением 0,2 мл 1,67% раствора гидрохлорида моногидрата Ь-цистеина (Мегск). Затем эту смесь хорошо смешивали на вортексе. Затем добавляли 6 мл раствора Н₂8О₄ (190 мл воды с 450 мл 95-97% концентрированной Н₂8О₄) с немедленным добавлением 0,2 мл 0,12% (мас./об.) карбазола (Мегск), растворенного в этаноле. Эту конечную смесь смешивали хорошо

- 15 019482 при помощи вортекса и оставляли при комнатной температуре на 60 мин. Поглощение измеряли при 560 нм с использованием пластиковых кювет.

Ц(+)-фруктозу, которая также является кетозой, использовали в качестве эталона. Для этой цели приблизительно 1000 мг Ό-фруктозы точно взвешивали и растворяли в 0,1М М0Р8-буфере, рН 7,5 в мерной колбе. Готовили серию разведений в диапазоне от приблизительно 2 до 20 мкмоль/мл. 50 мкл этих растворов фруктозы использовали в анализе, описанном выше, и поглощение при 560 нм использовали для получения калибровочной кривой. Активность этих проб рассчитывали сравнением оптической плотности при 560 нм с калибровочной кривой.

Концентрацию белка пробы определяли по модифицированному протоколу способа Бредфорд с использованием набора Соотаккю Р1ик Рго!еш Аккау (Тйегто δοίοηΙίΠο). Удельную активность ксилозоизомеразы выражали в виде нмоль/мг белка/мин.

Пример 1. Экспрессия ксилозоизомеразы из Вас!его1бек ишГогпик АТСС 8492 в 8ассйаготусе8 сегеуыае.

1.1.1. Конструирование экспрессирующего вектора ксилозоизомеразы.

Ксилозоизомеразу [Е. С. 4.2.1.2], номер доступа СепВапк ΑΑΥΗ02000036 (8ЕО ГО N0: 1) из Вас(егснбек ιιηίίοπηίδ АТСС 8492 анализировали на частоту использования кодонов. Частоту использования кодонов оптимизировали, как описано в \У0 2006/077258 и \У0 2008/000632 (8ЕО ГО N0: 2).

Ген в соответствии с 8ЕО ГО N0: 2 клонировали перед ТР11-промотором 8. сегеу181ае. Для предотвращения потенциальной неэффективной экспрессии ксилозоизомеразы перед этой кодирующей последовательностью помещали следующую последовательность:

в которой стартовый кодон подчеркнут.

Сайт рестрикции 8ре1 (АСТАСТ) вводили в сильный конститутивный ТР11-промотор с изменением последовательности

ТСТТССТТАААТСТАТААСТАСААААААСАСАТАСАТАААСТАААААТО (первоначальный 7777-промотор) в

ТСТТССТТАААТСТАТААСТАСТАААААСАСАТАСАТАААСТАААААТО.

Это делает возможным функциональное связывание кодирующей последовательности ксилозоизомеразы с оптимизированными кодонами с ТР11-промотором.

Кроме того, терминирующий кодон ТАА изменяли в ТААС, который является наиболее эффективным терминирующим кодоном в дрожжах. Удобные сайты рестрикции добавляли для облегчения клонирования. Эту последовательность синтезировали в СепеАг! АС (КедепкЬигд, Сегтапу). Конечная экспрессирующая конструкция дрожжей ρΥ^^-ΧΕ^^^ (Ваип Ср0) представлена на фиг. 1.

1.2. Трансформация дрожжей.

Штамм 8. сегеу181ае СЕКРК113-7П (МАТа ИКАЗ ΗΙ83 ЬЕИ2 ТКР1 МАБ2-8 8ИС2) и производное ί.ΈΝ.ΡΙ<113-70. в котором СКЕЗ-ген был заменен генами неокислительного участка пентозофосфатного пути (см. выше) (МАТа БКА3 ΗΙ83 ЬЕИ2 ТКР1 МАБ2-8 8ИС2 СКЕ3::[ТР11р-ТАЕ1_АПН1рТК^1_ΡСI1ρ-КΡЕ1_ЕN01ρ-ККI1]), трансформировали конструкцией ρΥI8IТ4-XΚ81-xу1Α (Ваип Ср0). Смеси для трансформации высевали на Υеа8ΐ СагЬоп Ваке (ΥΕΈ) мас./об., сульфат аммония (О|Гсо), 40 мМ КР1 (рН 6,8) и 5 мМ ацетамид. Нетрансформированные клетки не могут расти на этой среде.

Трансформанты характеризовали с использованием ПЦР-способов и/или способов блоттинга по Саузерну.

Пример 2. Рост трансформированных штаммов дрожжей на ксилозе.

2.1. Состав среды.

Эксперименты по росту: штаммы 8ассйаготусек сегеушае выращивают на среде, имеющей следующий состав: 0,67% (мас./об.) азотистого основания дрожжей и либо глюкозу, галактозу, либо ксилозу или комбинацию этих субстратов (см. ниже). Для чашек с агаром эту среду дополняли 2% (мас./об.) бактериологическим агаром.

Получение этанола: культивирование во встряхиваемых колбах выполняли при 30°С в синтетической среде (Уегбиуп е! а1., Υеакΐ 8:501-517, 1992). рН этой среды доводили до 6,0 2М К0Н перед стерилизацией. Для твердой синтетической среды добавляли 1,5% агара.

Предварительные культуры получали инокулированием 100 мл среды, содержащей подходящий сахар, во встряхиваемой колбе на 500 мл замороженной исходной культурой. После инкубирования при 30°С в орбитальном шейкере (200 об/мин), эту культуру использовали для инокулирования каждой из культур во встряхиваемых колбах. Синтетическую среду для анаэробного культивирования дополняли 0,01 г/л^-1 эргостерина и 0,42 г/л^-1 Твина 80, растворенного в этаноле (Апбгеакеп апб 8бег. 1. Се11 РЬукю1. 41:23-36, 1953; и Апбгеакеп апб 8бег. 1. Се11. РЬукю1. 43:271-281, 1954).

2.2. Эксперименты по росту.

Штамм 8ассйаготусек сегеу181ае СЕКРК113-7О или производное, конститутивно экспрессирующее РРР (см. пример 1), трансформированные ρΥI8IТ4-XК81-xу1Α (Ваип СрО), выращивают на чашках с агаром с 2% глюкозой в качестве источника углерода. Когда колонии являются видимыми, отдельные коло

- 16 019482 нии используют для инокуляции жидкой среды с 100 мМ ксилозой, 100 мМ глюкозой и 100 мМ галактозой в качестве источников углерода или их комбинаций. Рост подвергают мониторингу измерением увеличения оптической плотности при 600 нм на спектрофотометре ЬКБ ийтозрес К.

2.3. Получение этанола.

Штамм 8ассйатотусез сегеуШае СЕКРК113-7И или производное, конститутивно экспрессирующее РРР (см. пример 1), трансформированные рУТЗГМ-ХКЗБху^ (Ваип СрО), выращивают на чашках с агаром с 2% глюкозой в качестве источника углерода. Когда колонии являются видимыми, отдельные колонии используют для инокуляции синтетической среды (Уетбиуп е! а1., зирга). Смеси глюкозы, ксилозы или галактозы добавляют к этой среде в качестве источника углерода в диапазоне от 0 до 50 г/л. Рост подвергают мониторингу измерением увеличения оптической плотности при 600 нм на спектрофотометре ЬКВ ИЙтозрес К. Продуцирование этанола и потребления сахара во времени подвергают мониторингу при помощи ВЖХ и/или ЯМР-анализа.

Пример 3.

3.1. Введение четырех конститутивно экспрессируемых генов неокислительного пентозофосфатного пути.

8ассйаготусез сетеу131ае ΒΙΕ104Ρ1, экспрессирующий конститутивно гены ТАЬ1, ТКЬ1, ЯКИ и ЯРЕ1, получали трансформацией СЕКРК113-7И (МАТа ИЯА3 ΗΙ83 ЬЕИ2 ТЯР1 МАЯ2-8 8ИС2) плазмидой рРАТ080 (фиг. 2). В значительной степени плазмиду конструировали с использованием синтетической ДНК, синтезированной СепеЛй АС (ЯедепзЬигд, Сегтапу). Последовательность плазмиды рРАТ080 представлена в 8ЕО ΙΌ N0: 4. Вкратце, плазмида рРАТ080 состоит из промоторного района СЯЕ3-гена, с последующими четырьмя РРР-генами ТАЬ1, ТКЬ1, ЯКИ и ЯРЕ1 под контролем сильных конститутивных промоторов и 3'-некодирующих последовательностей СЯЕ3-гена, как показано на фиг. 2. В качестве селектируемых маркеров на этой плазмиде присутствуют капМХ-ген, придающий устойчивость к С418, и атб8-тен АзретдШиз, позволяющий этим трансформантам расти в ацетамиде в качестве единственного источника азота. После интеграции с последующей внутримолекулярной рекомбинацией эти маркеры теряются и интеграция этой конструкции приводит к инактивации кодирующего района СЯЕ3-гена и сверхэкспрессии генов ТАЬ1, ТКЬ1, ЯРЕ1 и ЯКИ.

Перед трансформацией СЕКРК113-7И, рРАТ080 линеаризовали с использованием рестрикционного фермента (рестриктазы) 8ΠΙ (№ν Епд1апб Вю1аЬз), в соответствии с инструкциями, обеспечиваемыми поставщиком. Смеси для трансформации высевали на среду (на 1 л: 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г декстрозы, 20 г агара), содержащую 100 мкг С418 (8щта А1бпсй) на 1 мл.

Спустя 2-4 дня на этих чашках появлялись колонии, тогда как отрицательный контроль (т.е. отсутствие добавления ДНК в эксперименте по трансформации) приводил к пустым УРИ/С418-чашкам.

Интеграция плазмиды рРАТ080 нацелена на СЯЕ3-локус. Трансформанты характеризовали с использованием ПЦР и способов блоттинга по Саузерну.

Реакции ПЦР, которые указывают на правильную интеграцию одной копии плазмиды рРАТ080, выполняли с праймерами, показанными 8ЕО Ш N0: 5 и 6 и 6 и 7 (см. фиг. 3). С парой праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 5 и 6 проверяли правильную интеграцию в СЯЕ3-локусе. Если плазмида рРАТ080 интегрировалась во множественных копиях (интеграция голова-к-хвосту), пара праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 6 и 7 будет давать один ПЦР-продукт. Если этот последний ПЦР-продукт отсутствует, это указывает на интеграцию только одной копии.

Для подтверждения правильной интеграции одной копии в трансформантах, идентифицированных в качестве таковых с использованием вышеописанного способа ПЦР, выполняли блоттинг-анализ по Саузерну. Для этой цели выделяли хромосомную ДНК из штамма СЕ№РК113-7И дикого типа и трансформантов с использованием стандартных молекулярно-биологических способов. Эту хромосомную ДНК расщепляли рестриктазами Хст! и Рзб, подвергали электрофорезу на 0,7% агарозном геле и ДНК переносили на найлоновую мембрану (НуЬопб №, Атетзйат Рйаттааа Вю1ес11) в соответствии с инструкциями изготовителя.

В качестве зонда для детектирования правильной интеграции плазмиды рРАТ080 использовали зонд, полученный из ЯКИ-гена, присутствующий в плазмиде рРАТ080. Этот зонд был получен с использованием праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 9 и 10 и плазмиды рРАТ080 в качестве матрицы. Мечение этого зонда и последующие процедуры гибридизации и промывок выполняли в соответствии с инструкциями поставщика ЕСЬ Инес! БаЬеНпд апб ОеЮсбоп 8уз1ет (СЕ БаГе 8с1епсез).

Авторадиограмма, представленная на фиг. 4, показывает правильную интеграцию одной копии плазмиды рРАТ080, в соответствии с ожидаемым распределением гибридизации, как может быть выведено из фиг. 3 (панели с). Этот штамм был обозначен как ΒΙΞ104Ρ1.

Для возможности введения генов, кодирующих ксилозоизомеразу и ксилулокиназу (раздел 3.2), необходимо удалить селектируемые маркеры, введенные интеграцией плазмиды рРАТ080. Конструирование плазмиды рРАТ080 было таким, что после интеграции рРАТ080 в этой хромосоме, гомологичные последовательности находятся в тесной близости друг с другом. Эта конструкция позволяет селектируемым маркерам теряться посредством спонтанной внутримолекулярной рекомбинации этих гомологичных районов. Удаление этих маркеров из этого штамма приводит к не имеющему маркеров штамму, ко

- 17 019482 торый является более стабильным при его использовании, чем содержащие маркеры штаммы. Более конкретно, район промотора ОЯЕ3-гена и 3'-некодирующий район СЯЕ3-гена удваиваются после интеграции одной копии рР\УТ080 в ОЯЕ3-локусе 8. сегеу181ае. После вегетативного роста будет иметь место внутримолекулярная рекомбинация, хотя и при низкой частоте. Частота этой рекомбинации зависит от длины гомологии и локуса в этом геноме (неопубликованные данные). После последовательного переноса субфракции этой культуры в свежую среду внутриклеточные рекомбинанты будут накапливаться со временем.

Для этой цели штамм ΒIΕ104Ρ1 культивировали в УРЭ-2% глюкоза, начиная от изолята колонии. 25 мкл ночной культуры использовали для инокуляции свежей среды УРЭ-2% глюкоза. После пяти серийных переносов измеряли оптическую плотность этой культуры и клетки разводили до концентрации приблизительно 5000 на 1 мл. 100 мкл этой клеточной суспензии высевали на среду УеаЛ СагЬоп Бахе (Όίίυο), содержащую 30 мМ КР1 (рН 6,8), 0,1% (ЫН₄)₂80₄, 40 мМ фторацетамид (Атегайат) и 1,8% агар (Όίίοο). Клетки, идентичные клеткам штамма ΒIΕ104Ρ1, т.е. без внутриклеточной рекомбинации, все еще содержат атб8-ген. Для этих клеток фторацетамид является токсичным. Эти клетки будут не способны к росту и не будут образовывать колонии на среде, содержащей фторацетамид. Однако если имеет место внутримолекулярная рекомбинация, варианты ΒIΕ104Ρ1, которые потеряли селектируемые маркеры, будут способны расти на фторацетамидной среде, так как они будут не способны превращать фторацетамид в ингибирующее рост соединение. Эти клетки будут образовывать колонии на этой агаровой среде.

Полученные таким образом устойчивые к фторацетамиду колонии подвергали ПЦР-анализу с использованием праймеров 8ЕО ΙΌ N0: 5 и 6 и 7 и 8. Праймеры 8ЕО ΙΌ N0: 5 и 6 будут давать полосу, если рекомбинация селектируемых маркеров имеет место, как предполагалось, как представлено на фиг.

5. В результате, кодирующий район ОЯЕ3-гена заменяется четырьмя генами ТКЬ1, ТАЬ1, РКП и ЯРЕ1. В этом случае реакция ПЦР с использованием праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 7 и 8 должна приводить к продукту ПЦР, так как праймер 7 праймирует район, который должен быть лишен рекомбинации (см. фиг. 3, панель Ь). Если получают полосу с этими праймерами, это указывает на присутствие полной плазмиды рР\УТ080 в этом геноме, и, следовательно, рекомбинация не происходит.

Если праймеры 8Е0 ΙΌ N0: 5 и 6 не приводят к продукту ПЦР, рекомбинация имеет место, но таким образом, что полная плазмида рР\УТ080 рекомбинируется наружу из генома. Терялись не только селектируемые маркеры, но также эти четыре РРР-гена. Фактически, восстанавливались дрожжи дикого типа.

Изоляты, которые обнаруживали ожидаемые результаты ПЦР, подвергали блот-анализу по Саузерну (у1бе кирга). Этот результат представлен на фиг. 4. Один из штаммов, которые обнаруживали правильное распределение полос на блоте по Саузерну (как можно видеть из фиг. 3), является штаммом, названным ΒIΕ104Ρ1.

3.2. Введение конститутивно экспрессируемых генов, кодирующих ксилозоизомеразу и ксилулокиназу.

Плазмиду рУI8IТ4-XК81-xу1Α Шапп Ср0), представленную на фиг. 1, улучшали для возможности 0418-отбора трансформантов. Для этой цели инсерт 4630 п.н., содержащий ху1А-ген под контролем ТРП-промотора, и ген ХК81-ген под контролем ТРП-промотора, вырезали из плазмиды рΥI8IТ4-XК81ху1А Шапп) (фиг. 1), с использованием рестрикционных ферментов Мйй и 8асТ

Плазмиду рУI#8IТ4, представленную на фиг. 6, расщепляли рестрикционным ферментом Асс65Т

Маркер устойчивости к канамицину (капМХ), присутствующий на плазмиде р427ТЕЕ (ОиаЕуЛепъ Βίοί^Λ АО), позволяющий проводить отбор в Е. той (канамицин) и 8. сегеушае (0418), выделяли при помощи ПЦР с использованием праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 11 и 12. Последовательность праймера 8Е0 ΙΌ N0: 12 была сконструирована таким образом, что МЫ-сайт в капМХ-фрагменте был потерян, что сохраняет МШ-сайт в полученной плазмиде (рР\УТ007, см. ниже) уникальным. Этот продукт ПЦР субклонировали в векторе рСЯII-ТОΡО с использованием набора 2его ΒΙιιπΙ® Т0Р0 РСЯ СШшпд Кй 8^-^^^ Дпуйгодеп). Правильные клоны использовали для вырезания маркера устойчивости капМХ, с использованием рестрикционного фермента Асс65Т Лигирование этого фрагмента с расщепленной плазмидой рУ[#8!Т4 приводило к рР\УТ007, которая представлена на фиг. 7.

Плазмиду рР\УТ007 расщепляли рестрикционными ферментами Мйй и 8асТ После очистки этого вектора лигировали вышеописанный фрагмент 4630 п.н. МЫ-8асТ рУI8IТ4-XК81-xу1Α Шапп). Полученная плазмида названа рР\УТ042, которая представлена на фиг. 8.

Штамм ΒIΕ104Р1 (МАТа ИЯА3 ΗΙ83 ЬЕШ ТЯР1 МАБ2-8 8ИС2 Д0ЯЕ3::[ТРПР-ТАЕ1-АПН1рТΑ^1-Ρ0I1р-ЯΡΕ1-ΕN01р-ΚКI1]) (см. раздел 3.1) трансформировали плазмидой рР\УТ042. Перед трансформацией ΒIΕ104Ρ1, рР\УТ042 линеаризовали с использованием рестрикционного фермента 8ίϊΙ в соответствии с инструкциями, обеспечиваемыми поставщиком. Смеси для трансформации высевали на УРО (на 1 л: 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г декстрозы, 20 г агара), содержащую 100 мкг 0418 (8щта А1бпс11) на 1 мл.

Спустя 2-4 дня на этих чашках появлялись колонии, тогда как отрицательный контроль (т.е. отсутствие добавления ДНК в эксперименте по трансформации) приводил к пустым УРО/0418-чашкам.

- 18 019482

После расщепления плазмиды ρΡνΤ042 с использованием 8ΠΙ ее интеграция направляется на 8ΙΤ4локус (Сой1т-№и£а апб КаЬаск (1986) Мо1еси1аг апб Се11и1аг В1о1о§у Уо1. 6, Νο. 6, 2185-2197) в этом геноме. Трансформанты характеризовали с использованием ПЦР и способов блоттинга по Саузерну.

ПЦР-реакции, использующие ДНК-полимеразу Рйиыоп® (Е|ппхуте5), которые указывали на правильную интеграцию одной копии плазмиды ρΡνΤ042, выполняли с праймерами, показанными 8Е0 ΙΌ N0: 13 и 14 и 14 и 15. Как представлено на фиг. 9, с парой праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 13 и 14 подтверждалась правильная интеграция в 81Т4-локусе. Правильная интеграция этой плазмиды в 81Т4-локусе может быть также подтверждена с парой праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 15 и 16 (фиг. 9). Если плазмида рР\УТ042 интегрировалась во множественных копиях (интеграция голова-к-хвосту), пара праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 14 и будет давать один ПЦР-продукт. Если этот последний ПЦР-продукт отсутствует, это указывает на интеграцию только одной копии плазмиды рР\УТ042.

Штамм с одной копией плазмиды рР\УТ042, интегрированной в этот геном, был назван ГЕ104Р1У9.

3.3. Эксперименты по росту.

Изоляты отдельных колоний штаммов ВГЕ104Р1 и ВГЕ104Р1У9 использовали для инокуляции ΥNВ-среды (Обсо), дополненной 2% глюкозой. Инокулированные колбы инкубировали приблизительно ч при 30°С и 280 об/мин. Определяли оптическую плотность при 600 нм ночных культур. ΥNВ-среду, дополненную 1% глюкозой и 1% ксилозой, инокулировали ночной культурой при начальном 0Ό600 0,2. Клетки выращивали на протяжении ночи при 30°С и 280 об/мин. Затем ΥNВ-среду, содержащую 2% ксилозу и 0,1% глюкозу, инокулировали при начальном 0Ό600 0,2.

Незначительное количество глюкозы, присутствующее в последней среде, потреблялось быстро обоими штаммами. После переноса на ΥNВ с 2% ксилозой в качестве единственного источника углерода при начальном 0Ό600 0,2 только ВШ104Р1У9 был способен расти на этой среде после очень длинной лаг-фазе, приблизительно равной 4 неделям. Если оптическая плотность при 600 нм достигала величины по меньшей мере 2,0, эти клетки переносили в колбу со свежей ΥNВ-средой, содержащей 2% ксилозу, при начальном 0Ό600 0,2.

Это повторялось несколько раз, как показано на фиг. 10. Этот график ясно показывает, что штамм ВГЕ104Р1У9 растет быстро и эффективно на минеральной среде, содержащей 2% ксилозу в качестве единственного источника углерода, тогда как референс-штамм, не имеющий интегрированной плазмиды рР\УТ042, не способен к этому.

3.4. Ксилозоизомеразная активность.

Изоляты отдельных колоний штаммов ВГЕ104Р1 и ВГЕ104Р1У9 использовали для инокуляции среды ΥΡΌ-2% глюкоза. Инокулированные колбы инкубировали в течение приблизительно 16 ч при 30°С и 280 об/мин. Определяли оптическую плотность при 600 нм ночных культур. Клетки собирали центрифугированием. Осадок промывали один раз 0,1М буфером М0Р8 (3-(№морфолино)пропансульфоновой кислотой; 8щта), рН 7,5 и замораживали при -20°С до выполнения анализа. Результаты этого анализа суммированы в таблице ниже.

Штамм ΧΙ-активность при 30°С ΧΙ-активность при 50°С (нмоль/мг белка/мин) (нмоль/мг белка/мин)

Референс-штамм <20 <20

ΒΙΕ104Ρ1

ΒΙΕ104Ρ1Υ9 110 640

Эти величины являются средним двух независимых экспериментов.

3.5. Получение этанола.

Изоляты отдельных колоний штаммов ВГЕ104Р1 и ВГЕ104Р1У9 использовали для инокуляции среды Уегбиуп (Уегбиуп е! а1., УеаД 8:501-517, 1992), дополненной 2% глюкозой в качестве единственного источника углерода. Кроме того, штамм ВГЕ104Р1У9 инокулировали в среду Уегбиуп с 2% ксилозой в качестве источника углерода. Инокулированные колбы инкубировали в течение приблизительно 64 ч при 30°С и 280 об/мин. Определяли оптическую плотность при 600 нм этих культур. Клетки собирали центрифугированием и осадок клеток промывали один раз стерильной водой ιηί11ίρ (МПНроге).

Свежую среду Уегбиуп, дополненную 2% глюкозой и 2% ксилозой, инокулировали тремя предварительными культурами, описанными выше. Количество инокулированных клеток было таким, что начальная 0Ό600 была равна 0,2. Эти колбы закрывали водными затворами, гарантирующими условия анаэробного роста после откачки кислорода из этой среды и головного пространства.

Эти колбы инокулировали в течение 72 ч при 30°С и 280 об/мин. Пробы брали для анализа при 23, 47 и 71 ч. Выполняли следующие анализы: определение 0Ό600, ЯМР-анализ (ксилоза, глюкоза, этанол, уксусная кислота и глицерин). Эти результаты показаны на фиг. 11 и 12 и в табл. ниже. Эти данные представляют оставшееся количество сахаров в указанных точках (глюкозы и ксилозы в граммах на литр) и образование (побочных) продуктов (этанола, глицерина и уксусной кислоты).

На фиг. 11 показано развитие оптической плотности при 600 нм (0Ό600) во времени. Референсштамм, ВГЕ104Р1, достигает его максимума 0Ό600 перед 23 ч или при 24 ч после начала этого экспери

- 19 019482 мента. По-видимому, во временной точке при 23 ч или до этой точки глюкоза истощалась из этой среды (фиг. 12, панель а). Продуцирование этанола также достигало его максимума в момент, когда глюкоза потреблялась этим штаммом дрожжей. Останавливались как рост, так и продуцирование этанола, так как этот штамм не может использовать и ферментировать ксилозу, так как он лишен необходимых активных белков (т.е. ксилозоизомеразы и сверхэкспрессированной ксилулокиназы).

Однако штамм ΒΙΕ104Ρ1Υ9, в котором сверхэкспрессируются ксилозоизомераза, полученная из Вас!его1бе8 ιιηίίοπηίδ. и природная ксилулокиназа, способен расти на ксилозе и ферментировать ксилозу в этанол (фиг. 11 и 12). Спустя приблизительно 1 день анаэробного культивирования, штамм ΒΙΕ104Ρ1Υ9 уже потреблял некоторое количество ксилозы, в то время как вся глюкоза уже была потреблена. Затем оставшееся количество глюкозы ферментировалось в этанол, как видно из фиг. 12 (панель Ь и с) и таблицы ниже. Образование побочного продукта (уксусной кислоты и глицерина) является низким, как видно из таблицы ниже.

На эти результаты не влияли (значимо) предварительные культуры (глюкоза или ксилоза), как видно из результатов, представленных на фиг. 11 и 12.

ΒΙΕ104Ρ1, предварительно выращенный на глюкозе

Время (ч) Глюкоза Ксилоза Глицерин Уксусная кислота Этанол

0	19,5	19,6	0,0	0,0	0,7
23	0,0	20,8	0.5	0,3	9,0
47	0,0	20,7	0,7	0,7	8,8
71	0,0	19,9	0,7	0,9	8,4

ΒΙΕ104Ρ1Υ9, предварительно выращенный на глюкозе

Время (ч) Глюкоза Ксилоза Глицерин Уксусная кислота Этанол

0	19,5	19,6	0,0	0,0	0,7
23	0,0	16,6	0,6	0,5	11,4
47	0,0	6,3	0,7	0,8	14,3
71	0,0	1,7	0,4	1,1	16,8

__ΒΙΕ104Ρ1, предварительно выращенный на ксилозе _____ _____

Время (ч) Глюкоза Ксилоза Глицерин Уксусная кислота Этанол

0	19,5	19,6	0,0	0,0	0,7
23	0,7	17,7	0,0	0,5	11,3
47	0,0	6,1	0,7	0,8	14,9
71	0,0	1,1	0,5	1,1	16,7

Все величины приведены в граммах на литр.

На основании этих результатов, получали посредством расчета 6$ 363 мг ксилозы на 1 г биомассы в час (временной интервал 23-47 ч; оптическая плотность 30 равна 6 г сухого вещества на 1 л), в случае штамма ΒΙΕ104Ρ1Υ9, предварительно выращенного на ксилозе.

Пример 4.

4.1. Введение генов агаА, ;·ιγ;·ιΒ и атаЭ в геном 8. Сегеуыае.

Плазмиду ρΡ\νΤ018, представленную на фиг. 13, конструировали следующим образом: вектор рР\УТ006 (фиг. 14), состоящий из 8Ш2-локуса (6οΙΐΜ-ΝίπΓ;·ι апй КаЬаск (1986) Мо1еси1аг апй Се11 Βίοίοβν νοί. 6, по. 6, 2185-2197) и маркеров, позволяющих отбор трансформантов на антибиотике 6418 и возможность расти на ацетамиде (Ззйе кирга), расщепляли рестрикционными ферментами ΒδίνΙ и М1иГ Гены, кодирующие арабинозоизомеразу (агаА), Ь-рибулокиназу (ΜιΒ) и Ь-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу (атаЭ) из БасЮЬасПМ р1ап!атит, описанные в заявке на патент νΟ 2008/041840, синтезировали в 6епеАг! А6 (КедепкЬитд, бегтапу). Синтезировали один большой фрагмент, несущий три ага-гена, указанные выше, под контролем сильных промоторов (или функционально связанные с сильными промоторами) из 8. сегетыае, т.е. ТЭН3-промоторов, контролирующих экспрессию агаА-гена, ΕNΟ1-промотора, контролирующего 311^-024, и РОП-промотора, контролирующего атаЭ-ген. Этот фрагмент окружали уникальными рестрикционными ферментами Асс651 и ММ. Клонирование этого фрагмента в плазмиду ρΡνΤ006, расщепленный ММ и ΒδίνΙ, приводило к плазмиде ρΡνΤ018 (фиг. 13). Последовательность плазмиды ρΡνΤ018 представлена в 8Ε6 ΙΌ ΝΟ: 17.

ΓΈΝ.ΡΚ113-7Ο (МАТа ИКА3 ΗΙ83 ΓΕυ2 ΤΚΡ1 МАБ2-8 8ИС2) трансформировали плазмидой ρΡνΤ018, которая была линеаризована 8Ш (Νον Επ^Ε-πιά ΒίοΕώδ), в соответствии с инструкциями поставщика. Синтетический 8Ш-сайт был сконструирован в 5'-боковой стороне гена 8ΙΤ2 (см. фиг. 13). Смеси для трансформации высевали на ΥΡΌ (на 1 л: 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г декстрозы, 20 г агара), содержащую 100 мкг 6418 (8щта А1йг1сП) на 1 мл.

Спустя 2-4 дня на этих чашках появлялись колонии, тогда как отрицательный контроль (т.е. отсутствие добавления ДНК в эксперименте по трансформации) приводил к пустым ΥΡΌ/6418-чашкам.

- 20 019482

Интеграция плазмиды рР\УТ018 нацелена на 81Т2-локус. Трансформанты характеризовали с использованием ПЦР и блоттинг-анализа по Саузерну.

Реакции ПЦР, которые указывают на правильную интеграцию одной копии плазмиды рР\УТ018, выполняли с праймерами, показанными 8Е6 ΙΌ N0: 18 и 15 и 15 и 14 (см. фиг. 3). С парой праймеров 8Е0 ΙΌ N0: 18 и 15 проверяли правильную интеграцию в 81Т2-локусе. Если плазмида рР\УТ018 интегрировалась во множественных копиях (интеграция голова-к-хвосту), пара праймеров 8Е6 Ш N0: 15 и 14 будет давать один ПЦР-продукт. Если этот последний ПЦР-продукт отсутствует, это указывает на интеграцию только одной копии рР\УТ018. Штамм, в котором одна копия плазмиды рР\УТ018 была интегрирована в 81Т2-локус, был назван ΒΙΕ104Β2.

Для возможности трансформации этого штамма дрожжей другими конструкциями, необходимо удалить селектируемые маркеры. Конструирование плазмиды рР\УТ018 было таким, что после интеграции рР\УТ018 в хромосому гомологичные последовательности находятся в тесной близости друг к другу. Эта конструкция позволяет селектируемым маркерам теряться посредством спонтанной внутримолекулярной рекомбинации этих гомологичных районов.

После вегетативного роста будет иметь место внутримолекулярная рекомбинация, хотя и при низкой частоте. Частота этой рекомбинации зависит от длины гомологии и локуса в этом геноме (неопубликованные данные). После последующего переноса субфракции этой культуры в свежую среду внутриклеточные рекомбинанты будут накапливаться со временем.

Для этой цели штамм ΒΙΕ104Ρ2 культивировали в УРЭ-среде (на 1 л: 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г декстрозы), начиная от изолята отдельной колонии. 25 мкл ночной культуры использовали для инокуляции свежей среды ΥΡΌ. После по меньшей мере пяти серийных переносов измеряли оптическую плотность этой культуры и клетки разводили до концентрации приблизительно 5000 на 1 мл. 100 мкл этой клеточной суспензии высевали на среду Уеай СагЬоп Ваке (Όίίοο), содержащую 30 мМ КР1 (рН 6,8), 0,1% (ΝΗ₄)₂80₄, 40 мМ фторацетамид (Лтегкйат) и 1,8% агар (Οίίοο). Клетки, идентичные клеткам штамма ΒΙΕ104Β2, т.е. без внутриклеточной рекомбинации, все еще содержат ат48-ген. Для этих клеток фторацетамид является токсичным. Эти клетки будут не способны к росту и не будут образовывать колонии на среде, содержащей фторацетамид. Однако если имела место внутримолекулярная рекомбинация, варианты ΒΙΕ104Ρ2, которые потеряли селектируемые маркеры, будут способны расти на фторацетамидной среде, так как они будут не способны превращать фторацетамид в ингибирующее рост соединение. Эти клетки будут образовывать колонии на этой агаровой среде.

Полученные таким образом устойчивые к фторацетамиду колонии подвергали ПЦР-анализу с использованием праймеров 8Е6 ΙΌ N0: 18 и 15, и 14 и 19. Праймеры 8Е6 ΙΌ N0: 18 и 15 будут давать полосу, если рекомбинация селектируемых маркеров имела место, как предполагалось. В результате, эта кассета с генами агаА, агаВ и агаО под контролем сильных промоторов дрожжей была интегрирована в 8^2-локус генома этой клетки-хозяина. В этом случае ПЦР-реакция с использованием праймеров 8Е6 Ш 14 и 19 не должна приводить к продукту ПЦР, так как праймер 14 праймирует в районе, который должен быть лишен рекомбинации. Если получают полосу с этими последними праймерами, это указывает на присутствие полной плазмиды рР\УТ018 в этом геноме, и, следовательно, рекомбинация не произошла.

Если праймеры 8Е6 ΙΌ N0: 18 и 15 не приводят к продукту ПЦР, рекомбинация имела место, но таким образом, что полная плазмида рР\УТ018 рекомбинировалась наружу из генома. Терялись не только селектируемые маркеры, но также ага-гены. Фактически, восстанавливались дрожжи дикого типа.

Изоляты, которые обнаруживали результаты ПЦР в соответствии с интеграцией одной копии рР\УТ018, подвергали блоттинг-анализу по Саузерну. Хромосомную ДНК штаммов СЕХ.РК113-7О и правильных рекомбинантов расщепляли ЕсоШ и ΗίηάΙΙΙ (двойное расщепление). Получали 8IТ2-зонд С праймерами 8Е6 ΙΌ N0: 20 и 21, с использованием рР\У018 в качестве матрицы. Этот результат эксперимента по гибридизации показан на фиг. 15. Ожидаемое распределение гибридизации может быть выведено из физических карт, как представлено на фиг. 16 (панели а и Ь).

В штамме дикого типа наблюдали полосу 2,35 т.п.н., которая соответствует ожидаемому размеру (фиг. 16, панель а). После интеграции и частичной потери вследствие рекомбинации плазмиды рР\УТ018 была ожидаемой полоса 1,06 т.п.н. (фиг. 16, панель Ь). Действительно, эта полоса наблюдается, как показано на фиг. 15 (дорожка 2).

Один из штаммов, которые показали правильное распределение полос на блоте по Саузерну (как может быть выведено из фиг. 15), является штамм, названный ΒΙΕ104Α2.

4.2. Введение четырех конститутивно экспрессируемых генов неокислительного пентозофосфатного пути.

8ассйаготусек сегеоыае ΒΙΕ104Α2, экспрессирующий гены агаА, агаВ и агаО конститутивно, трансформировали плазмидой рР\УТ080 (фиг. 2). Эта процедура и результаты уже были описаны в примере 3 (раздел 3.1). Вкратце, ΒΙΕ104Α2 трансформировали 8Ш-расщепленной рР\УТ080. Смеси для трансформации высевали на среду ΥΡΌ-агар (на 1 л: 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г декстрозы, 20 г агара), содержащую 100 мкг 6418 (8щта А14пс11) на 1 мл.

Спустя 2-4 дня на этих чашках появлялись колонии, тогда как отрицательный контроль (т.е. отсутствие добавления ДНК в эксперименте по трансформации) приводил к пустым ΥΡΌ/6418-чашкам.

- 21 019482

Смеси для трансформации высевали на УРИ (на 1 л: 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г декстрозы, 20 г агара), содержащую 100 мкг С418 (81дта А1бпс11) на 1 мл.

Спустя 2-4 дня на этих чашках появлялись колонии, тогда как отрицательный контроль (т.е. отсутствие добавления ДНК в эксперименте по трансформации) приводил к пустым УРИ/С418-чашкам.

Интеграция плазмиды ρΡνΤ080 нацелена на СКЕ3-локус. Трансформанты характеризовали с использованием ПЦР и способов блоттинга по Саузерну, как описано в примере 3, раздел 3.1.

Трансформант, обнаруживающий правильную интеграцию одной копии плазмиды ρΡνΤ080, в соответствии с ожидаемым распределением гибридизации, был назван ΒΙΕ104Α2Ε1.

Для возможности введения генов, кодирующих ксилозоизомеразу и ксилулозокиназу (раздел 3.2) необходимо удалить селективные маркеры, вводимые интеграцией плазмиды ρΡνΤ080. Для этой цели штамм ΒΙΕ104Α2Ρ1 культивировали в УРБ-среде. начиная от изолята колонии. 25 мкл ночной культуры использовали для инокуляции свежей УРИ-среды. После пяти серийных переносов измеряли оптическую плотность этой культуры и клетки разводили до концентрации приблизительно 5000 на 1 мл. 100 мкл этой клеточной суспензии высевали на среду УеаЧ СагЬои Ваке (И1Гсо), содержащую 30 мМ КР1 (рН 6,8), 0,1% (ΝΗ₄)₂8Ο₄, 40 мМ фторацетамид (Атегкйат) и 1,8% агар (ИЛсо). Устойчивые к фторацетамиду колонии подвергали ПЦР-анализу и, в случае правильных ПЦР-профилей, блоттинг-анализу по Саузерну (раздел 3.1 примера 3). Одним из штаммов, которые обнаруживали правильное распределение полос на Саузерн-блоте, является штамм, названный ВШ104А2Р1.

4.3. Введение конститутивно экспрессируемых генов, кодирующих ксилозоизомеразу и ксилулозокиназу.

Штамм ΒΙΕ104Α2Ρ1 (МАТа ИВА3 ΗΙ83 ЬЕИ2 ТВР1 МАЬ2-8 8ИС2 8ΙΤ2::[ΤΌΗ3-αταΑ, ΕΝΟ1-αταΒ, РСП-агаИ] ΔСΚΕ3::[ΤΡI1ρ-ΤΑ^1, АИШр-’ГКЫ, ΡСI1ρ-ΚΡΕ1, ΕNΟ1ρ-ΚКI1]) трансформировали плазмидой ρΡVΤ042. Перед трансформацией В1Е104А2Р1, рР^Г042 линеаризовали с использованием рестрикционного фермента 8Ш, в соответствии с инструкциями, обеспечиваемыми поставщиком. Смеси для трансформации высевали на среду УРИ-агар (на 1 л: 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г декстрозы, 20 г агара), содержащую 100 мкг С418 (8щта А1бпс11) на 1 мл.

Спустя 2-4 дня на этих чашках появлялись колонии, тогда как отрицательный контроль (т.е. отсутствие добавления ДНК в эксперименте по трансформации) приводил к пустым УРИ/С418-чашкам.

После расщепления плазмиды ρΡVΤ042 8Ш ее интеграция нацелена на 844-локус (СоШт-ШпГа апб КаЬаск (1986) Мо1еси1аг апб Се11и1аг Вю1оду Уо1. 6, №. 6, 2185-2197) в геноме. Трансформанты характеризовали с использованием ПЦР и блоттинг-анализа по Саузерну, как описано в примере 3 (раздел 3.2).

Штамм с одной копией плазмиды ρΡVΤ042, интегрированной в геном, был назван ВШ104А2Р1У9.

4.1. Эксперименты по росту.

Изоляты отдельных колоний штамма ВШ104А2Р1У9 использовали для инокуляции ΥΝΒ-среды (ИгГсо), дополненной 2% глюкозой или 2% галактозой. Инокулированные колбы инкубировали при 30°С и 280 об/мин, пока не достигалась величина по меньшей мере 2,0 оптической плотности при 600 нм. ΥNΒ-среду, дополненную 1% арабинозой и 1% ксилозой, инокулировали этими ночными культурами при начальном ΟΌ600 0,2. Клетки выращивали при 30°С и 280 об/мин. Оптическую плотность при 600 нм подвергали регулярному мониторингу. При достижении величины оптической плотности, большей чем 2,0, аликвоту этой культуры переносили в свежую среду ΥNΒ, содержащую 2% ксилозу и 0,2% арабинозу. Количество добавляемых клеток было таким, что начальная ΟΌ600 этой культуры была равна 0,2.

Оптическую плотность подвергали регулярному мониторингу. Эти результаты показаны на фиг. 17, панели а (предварительные культуры на галактозе) и панели Ь (предварительные культуры на глюкозе).

Эти результаты ясно показывают, что эти штаммы способны использовать как арабинозу, так и ксилозу.

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Клетка, содержащая гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую ксилозоизомеразу, имеющую по меньшей мере приблизительно 94% идентичность с последовательностью 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3.
2. 2. Клетка по п.1, которая является эукариотической клеткой.
3. 3. Клетка по п.1 или 2, которая является клеткой дрожжей.
4. 4. Клетка по п.3, которая является клеткой дрожжей рода 8ассйаготусек, К1иууеготусек, Сапб1ба,

   Р1сЫа, 8сЫ7окассйаготусек, К1оскега, 8скетапиютусек или Υ;·ιπΌ\νί;·ι.
5. 5. Клетка по п.4, которая является клеткой вида 8. сегеуШае, 8. Ьи1бег1, 8. ЬагпеШ, 8. ех1диик, 8. иуагит, 8. б1ак!а!1сик, К. 1асбк, К. татапик или К. ГгадШк.
6. 6. Клетка по п.1 или 2, которая является клеткой мицелиального гриба.
7. 7. Клетка по п.6, которая является клеткой рода АкрегдШик, РешсНИит, РЫхорик, ^с^обета, Ηυтюо1а, Асгетопшт или Еикагшт.

   - 22 019482
8. 8. Клетка по п.7, которая является клеткой вида АкрегдШик шдег, АкрегдШик огухае, РешсШшт сЬгукодепит или Шпхорих огухае.
9. 9. Клетка по любому из предыдущих пунктов, которая содержит одну или более генетических модификаций, приводящих к

   a) увеличению транспорта ксилозы в эту клетку;

   b) увеличению активности ксилулозокиназы;

   c) увеличению потока через пентозофосфатный путь;

   б) уменьшению активности альдозоредуктазы;

   е) уменьшению чувствительности к катаболитной репрессии;

   Г) увеличению устойчивости к этанолу, осмолярности или органическим кислотам или

   д) уменьшенному продуцированию побочных продуктов.
10. 10. Клетка по п.9, в которой одна или более генетических модификаций приводят к сверхэкспрессии по меньшей мере одного гена, кодирующего фермент неокислительного участка пентозофосфатного пути.
11. 11. Клетка по п.10, в которой геном является ген, кодирующий рибулозо-5-фосфатизомеразу, рибулозо-5-фосфатэпимеразу, транскетолазу или трансальдолазу.
12. 12. Клетка по любому из пп.10-11, в которой одна или более генетических модификаций приводят к сверхэкспрессии, по меньшей мере, генов, кодирующих транскетолазу и трансальдолазу.
13. 13. Клетка по любому из пп.9-12, в которой одна или более генетических модификаций приводят к сверхэкспрессии гена, кодирующего ксилулозокиназу.
14. 14. Клетка по любому из пп.8-13, в которой ген, который сверхэкспрессируется, является геном, который является эндогенным для клетки.
15. 15. Клетка по любому из пп.9-14, в которой одна или более генетических модификаций приводят к уменьшению активности неспецифической альдозоредуктазы в клетке.
16. 16. Клетка по п.15, в которой одна или более генетических модификаций уменьшают экспрессию эндогенного гена, который кодирует неспецифическую альдозоредуктазу или уменьшает активность указанной неспецифической альдозоредуктазы.
17. 17. Клетка по п.16, в которой ген инактивирован делецией по меньшей мере части этого гена или разрушением этого гена.
18. 18. Клетка по п.16 или 17, в которой экспрессия каждого гена в клетке, который кодирует неспецифическую альдозоредуктазу, является уменьшенной.
19. 19. Клетка по любому из предыдущих пунктов, которая способна использовать Ь-арабинозу.
20. 20. Клетка по любому из пп.9-19, в которой гены ТАЬ1, ТКЬ1, ЯРЕ1 и ЯК11 сверхэкспрессируются.
21. 21. Клетка по любому из пп.9-20, в которой кодирующий участок СЯЕ3-гена инактивирован заменой этого кодирующего участка нуклеотидной последовательностью, содержащей гены ТАЬ1, ТКЬ1, ЯРЕ1 и КК11.
22. 22. Клетка по любому из пп.9-21, в которой экспрессируются гены агаА, агаВ и агаЭ из Ьас!оЬасШи§ р1ап!агит.
23. 23. Клетка по любому из пп.9-22, в которой все экспрессируемые гены являются конститутивно экспрессируемыми или конститутивно сверхэкспрессируемыми.
24. 24. Клетка по п.23, в которой один или более конститутивно экспрессируемых или конститутивно сверхэкспрессируемых генов стабильно интегрированы в геном клетки.
25. 25. Клетка по п.24, в которой все конститутивно экспрессируемые или конститутивно сверхэкспрессируемые гены стабильно интегрированы в геном клетки.
26. 26. Способ получения продукта ферментации, включающий ферментацию среды, содержащей источник ксилозы, клеткой по любому из предыдущих пунктов, так что эта клетка ферментирует ксилозу в продукт ферментации.
27. 27. Способ получения продукта ферментации, включающий ферментацию среды, содержащей, по меньшей мере, источник ксилозы и источник Ь-арабинозы, клеткой по любому из пп.19-23, причем указанная клетка ферментирует ксилозу и Ь-арабинозу в продукт ферментации.
28. 28. Способ получения продукта ферментации, включающий ферментацию среды, содержащей, по меньшей мере, источник ксилозы и источник Ь-арабинозы, клеткой, определенной в любом из пп.1-18, и клеткой, способной использовать Ь-арабинозу, где каждая клетка ферментирует ксилозу и/или арабинозу в продукт ферментации.
29. 29. Способ по любому из пп.26-28, который включает выделение продукта ферментации.
30. 30. Способ по любому из пп.26-29, в котором среда содержит также источник глюкозы.
31. 31. Способ по любому из пп.28-30, в котором продуктом ферментации является этанол, бутанол, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, акриловая кислота, уксусная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, итаконовая кислота, аминокислота, 1,3пропандиол, этилен, глицерин, β-лактамный антибиотик и цефалоспорин.
32. 32. Способ по любому из пп.26-31, в котором ферментацию проводят в анаэробных условиях.
33. 33. Способ по любому из пп.26-32, в котором ферментация является аэробной и предпочтительно

    - 23 019482 выполняется при ограничиваемых кислородом условиях.
34. 34. Применение клетки по любому из пп.1-25 в способе получения продукта ферментации.