CN104673731A - 一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法 - Google Patents

一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104673731A
CN104673731A CN201310625826.2A CN201310625826A CN104673731A CN 104673731 A CN104673731 A CN 104673731A CN 201310625826 A CN201310625826 A CN 201310625826A CN 104673731 A CN104673731 A CN 104673731A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
clostridium acetobutylicum
ribulose
phosphate
utilization rate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201310625826.2A
Other languages
English (en)
Inventor
顾阳
金琳
张慧
杨晟
姜卫红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Original Assignee
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS filed Critical Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority to CN201310625826.2A priority Critical patent/CN104673731A/zh
Publication of CN104673731A publication Critical patent/CN104673731A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法。本发明首次揭示丙酮丁醇梭菌中的核酮糖-5-磷酸异构酶基因(rpi)和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(rpe)对于提高丙酮丁醇梭菌的木糖利用率具有显著的作用。本发明还揭示了将上述两个基因与转酮酶基因(tkt)和转醛酶基因(tal)组合表达，优化丙酮丁醇梭菌的木糖利用率。本发明的方法对于优化丙酮丁醇梭菌的木糖利用率效果显著，为以木质纤维素水解液为原料发酵生产丁醇等溶剂的生产改进提供了有效途径。

Description

一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域；具体地说，本发明涉及一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法。
背景技术
丙酮丁醇梭菌能够发酵产生丙酮、乙醇和丁醇3种溶剂，其中丁醇不仅是大宗基础化工原料，也是性能优于乙醇的优质燃料和燃料添加剂。由于石油资源的有限性以及国际原油价格的波动性，利用可再生资源制造生物能源已受到世界各国的普遍重视。自二战以来随着石油工业的发展，生物丁醇发酵由于其较高的原料成本，其大规模发酵一直处于停滞状态，而且随着近年来粮食价格的不断上涨及国家相关粮食安全战略的制定，采用粮食发酵生产燃料丁醇已受到严格限制。
我国传统的丙酮丁醇梭菌发酵法生产丁醇是以粮食原料(如玉米、小麦等)为底物的。较高的粮食价格致使原料费用占溶剂生产总成本的比例偏高(75%以上)，这不仅限制了丁醇产品的市场竞争力，也严重违背了我国的粮食安全战略。因此，就长远而言，以非粮原料，尤其是廉价的木质纤维素资源(如秸秆、稻草等)通过生物转化制造丁醇是今后发展的必然趋势。
丙酮丁醇梭菌除了能够利用葡萄糖、淀粉外，还能利用乳糖、阿拉伯糖、木糖等多种非速效碳源。纤维素和半纤维素在自然界中占到植物界碳素的50%以上，利用纤维素和半纤维素水解液进行生物丁醇发酵，有望大大降低原料成本。木质纤维素水解后的主要碳源组分就是葡萄糖和木糖，因而，丙酮丁醇梭菌宽泛的底物谱使得该菌可以利用纤维素、半纤维素水解液为原料进行生物丁醇的发酵，使其具有很好的工业应用价值。
然而，与葡萄糖利用相比，丙酮丁醇梭菌的木糖利用能力较差，在以木糖为唯一碳源发酵时，原料利用和溶剂合成效率都较低。鉴于木糖是木质纤维原料中含量仅次于葡萄糖的最主要五碳糖，提高丙酮丁醇梭菌的木糖利用能力对于以木质纤维素水解液为原料发酵制造丁醇等溶剂产品技术而言至关重要。
在前期的研究中，顾阳等鉴定到转酮酶基因(tkt)和转醛酶基因(tal)，并通过大肠杆菌来源的tal基因在丙酮丁醇梭菌中的独立高表达提高了该菌的木糖利用能力，而对于其它基因与丙酮丁醇梭菌的木糖利用的相关性，目前还没有相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在丙酮丁醇梭菌中优化木糖利用率的方法。
在本发明的第一方面，提供一种制备木糖利用率提高的丙酮丁醇梭菌的方法，所述方法包括：(1)在丙酮丁醇梭菌中提高核酮糖-5-磷酸异构酶基因(rpi)和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(rpe)的表达或活性。
在本发明的另一方面，提供一种利用丙酮丁醇梭菌生产溶剂的方法，所述的溶剂包括丁醇、乙醇和丙酮，所述方法包括：
(1)在丙酮丁醇梭菌中提高核酮糖-5-磷酸异构酶基因(rpi)和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(rpe)的表达或活性；和
(2)以包含木糖的培养基培养该菌株，从而生产溶剂。
在另一优选例中，所述的方法的(1)中，还包括：在丙酮丁醇梭菌中提高转酮酶基因(tkt)和转醛酶基因(tal)的表达。
在另一优选例中，所述的核酮糖-5-磷酸异构酶基因(rpi)是cac2880；所述的核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(rpe)是cac1730。
在另一优选例中，步骤(1)包括：(a)提供重组质粒，所述重组质粒中包含核酮糖-5-磷酸异构酶基因(rpi)重组表达盒和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(rpe)重组表达盒，选择性地还包含转酮酶基因(tkt)重组表达盒和转醛酶基因(tal)重组表达盒；且，各基因的重组表达盒位于同一重组质粒或不同重组质粒中；和(b)将(a)的重组质粒转化丙酮丁醇梭菌。
在另一优选例中，所述的核酮糖-5-磷酸异构酶的氨基酸序列为：(a)SEQ IDNO:4，或其同功能变体，如将(a)多肽经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；较佳地1-4个；更佳地1-3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代或添加而形成的，且与(a)多肽同功能的多肽。
在另一优选例中，所述的核酮糖-5-磷酸差向异构酶的氨基酸序列为：(a)SEQ ID NO:2，或其同功能变体，如将(a)多肽经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；较佳地1-4个；更佳地1-3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代或添加而形成的，且与(a)多肽同功能的多肽。
在另一优选例中，所述的转酮酶的氨基酸序列为：(a)SEQ ID NO:8，或其同功能变体，如将(a)多肽经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；较佳地1-4个；更佳地1-3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代或添加而形成的，且与(a)多肽同功能的多肽。更佳地，所述的转酮酶的编码基因如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述的转醛酶的氨基酸序列为：(a)SEQ ID NO:6，或其同功能变体，如将(a)多肽经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；较佳地1-4个；更佳地1-3个；更佳地1-2个)氨基酸残基的取代或添加而形成的，且与(a)多肽同功能的多肽。更佳地，所述的转醛酶的编码基因如SEQ ID NO:5所示。
在另一优选例中，所述的核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮酶或转醛酶来源于丙酮丁醇梭菌。
在本发明的另一方面，提供酶在制备木糖利用率提高的丙酮丁醇梭菌中的用途，所述的酶包括：酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶。
在另一优选例中，所述的酶还包括：转酮酶和转醛酶。
在本发明的另一方面，提供一种重组的丙酮丁醇梭菌，所述的丙酮丁醇梭菌中包含外源的核酮糖-5-磷酸异构酶基因(rpi)和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(rpe)；较佳地还包含转酮酶基因(tkt)和转醛酶基因(tal)。
在本发明的另一方面，提供一种用于生产溶剂的试剂盒，所述的溶剂包括丁醇、乙醇和丙酮，所述的试剂盒中包括所述的重组的丙酮丁醇梭菌。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：
丙酮丁醇梭菌的培养基，其中含有木糖。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、所示为功能互补菌株JW3349-2-1730、JW5475-1-rpiB-0762、JW5475-1-rpiB-1341、JW5475-1-rpiB-2880在麦康凯琼脂培养基上的生长情况。
图2、所示过表达菌株824-TTRR与对照株824-P在含有6%木糖的混糖培养基中发酵的生长曲线即OD600变化情况。
图3、所示过表达菌株824-TTRR与对照株824-P在含有6%木糖的混糖培养基中发酵残糖含量变化曲线。
图4、所示为过表达菌株824-TTRR与对照株824-P在含有6%木糖的混糖培养基中发酵产生总溶剂和丁醇含量变化。
具体实施方式
本发明首次鉴定到丙酮丁醇梭菌中的核酮糖-5-磷酸异构酶基因(rpi)和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(rpe)对于提高丙酮丁醇梭菌的木糖利用率具有显著的作用；本发明人还将上述两个基因与转酮酶基因(tkt)和转醛酶基因(tal)组合表达，优化了该菌的木糖利用率。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指相对于细胞而言，所述的酶基因并非来自于其本身，而是通过重组方法构建插入。
如本文所用，如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、转酮酶或转醛酶)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
本发明的核酮糖-5-磷酸异构酶基因(rpi)、核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(rpe)、转酮酶基因(tkt)或转醛酶基因(tal)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
为了增加丙酮丁醇梭菌的对于木糖的利用效率，本发明人作了广泛地研究，找到了适合于进行改良的基因，并构建了相应的构建物。
因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括：核酮糖-5-磷酸异构酶基因(rpi)、核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因(rpe)、转酮酶基因(tkt)或转醛酶基因(tal)的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件(包括启动子、编码DNA以及终止子等)，从而可完整地表达出相应的蛋白。
通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如原核细胞培养用的氨苄青霉素、安普霉素、卡那霉素抗性。
包含上述的适当的多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是丙酮丁醇梭菌。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。作为一种优选的方式，可用电转化的方法进行。
在本发明的具体实施例中，本发明人进行了如下实验研究：(a)通过比较基因组学发现丙酮丁醇梭菌中可能的rpi基因有3个，而rpe只有1个。(b)在大肠杆菌中构建木糖转运缺陷株。(c)在相应的大肠杆菌(E.coli)基因突变株中的功能互补实验，证明了3个可能的rpi基因中只有基因cac2880可以回补E.coli突变株的功能，因此是真正的rpi基因。而唯一备选的rpe基因cac1730也可以回补相应的E.coli突变株的功能，因此也是真正的rpe基因。(d)通过rpi、rpe基因以及另两个戊糖磷酸途径基因—转酮酶基因(tkt)和转醛酶基因(tal)的共表达，获得了过表达菌株824-TTRR，发酵并检测其木糖利用和产酸、产溶剂情况。结果，该菌株在62g/L木糖的P2培养基中发酵，木糖消耗率增加了37.3%，总溶剂提高了42.3%。
本发明还涉及用于生产溶剂的试剂盒，所述的溶剂包括丁醇、乙醇和丙酮，所述试剂盒中包括：重组的丙酮丁醇梭菌，其被置于适当的容器中。
作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括用于培养重组的丙酮丁醇梭菌的培养基，其中包含有木糖。
作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括使用说明书，说明各种应用所述重组的丙酮丁醇梭菌生产溶剂的方法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，
科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。发酵液或糖溶液中糖的百分比为w/v%。
菌株和质粒
实施例中应用的菌株和质粒见表1。
表1
试剂
本发明中使用的PCR纯化和DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自AXYGEN生物科技有限公司，基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
在本发明的下述实施例中，使用的培养基和缓冲液如下：
CGM培养基配方如下(Joseph W.Roos等，Biotechnology andBioengineering，P681-694，Vol557，1985)：2g(NH4)2SO4，1g K2HPO4·3H2O，0.5g KH2PO4，0.1g MgSO4·7H2O，0.015g FeSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.01gMnSO4·H2O，0.002g CoCl2，0.002g ZnSO4，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物(YeastExtraction)，50g葡萄糖，2%琼脂溶于1L水中，121℃灭菌15min。
麦康凯培养基的配制如下(以400ml为例)：
1.配制1%的中性红、结晶紫溶液。
2.称取8g蛋白胨和2g氯化钠，定容至160ml，调节pH至7.2，加入8g琼脂，定容至320ml，121℃灭菌15min。
3.称取4g木糖，用80ml双蒸水溶解，121℃灭菌15min。
4.将两瓶灭菌的溶液混合均匀，加入1.4ml1%的中性红，40ul1%的结晶紫后混匀。(1L的总体系加入1%中性红3-4ml，1%结晶紫0.1ml)
5.加入适当体积的抗生素后倒板。
P2培养基的配制方法如下(F.Monot等，Appl Environ Microbiol，Issue6，Vol44，1982)：
溶液1：60g D-木糖，加H2O定容至840mL；
溶液2：NH4Ac2.2g，K2HPO4·3H2O0.5g，KH2PO40.5g，加H2O定容至100mL；
溶液3：2.0g MgSO4·7H2O，0.1g MnSO4·H2O，0.1g NaCl，0.1g FeSO4·7H2O加H2O定容至100mL；
溶液4：100mg氨基苯甲酸(β-aminobenzoic acid)，100mg维生素B1(thiamine)，1mg生物素(biotin)，加H2O定容至100mL；
溶液1和溶液2在121℃灭菌20min，溶液3和溶液4过滤除菌。溶液1和溶液2冷却后混合均匀，再加入10mL溶液3和1mL溶液4，混匀后分装成38mL/管。
ETM缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4，3010mM MgCl2。121℃灭菌20min。
ET缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4。121℃灭菌20min。
本发明使用的限制性内切酶，Taq DNA聚合酶，T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司，KOD plus DNA聚合酶购自Toyobo公司。
应用的引物序列如表2。
表2
实施例概述
本发明通过在大肠杆菌基因突变株中异源互补预测的rpe、rpi，并鉴定是否能够恢复木糖利用能力。又通过在丙酮丁醇梭菌中组合共表达这四个戊糖磷酸途径关键基因tal、tkt、rpe、rpi，来优化该菌的木糖利用率。
实施例1、大肠杆菌突变株的构建JW5475-1中敲除rpiB(b4090)
购买获得了大肠杆菌rpe基因缺陷菌株JW3349-2和rpiA基因缺陷株JW5475-1。在JW5475-1的基础上，利用大肠杆菌中普遍采用的PCR targeting方法，敲除rpiB(b4090)基因，获得大肠杆菌rpi基因缺陷菌株。
1.1外源同源重组片段构建
以质粒pIJ773为模板，利用引物对rpiB-up-s/rpiB-down-a通过PCR扩增，得到敲除rpiB(b4090)基因的中断盒，其中含有阿普拉霉素(Apramycin)抗性基因。
1.2rpi基因缺陷株的构建
在菌株JW5475-1中转入质粒pKD46，氨苄霉素抗性平板筛选，得到能够实现高效同源重组的菌株。再通过电转的方式导入敲除rpiB(b4090)基因的中断盒，阿普拉霉素平板筛选。然后分别利用引物对rpiB-up-s/rpiB-down-a进行菌落PCR鉴定(反应试剂由Sigma-Aldrich的TargetronTM Gene KnockoutSystem(TA0100)试剂盒提供、条件：95℃5min，94℃30s、55℃30s、2572℃30s30个循环，72℃2min，4℃保存)。鉴定正确得到大肠杆菌rpi基因缺陷株JW5475-1-rpiB。
1.3rpe基因缺陷株(JW3349-2)，rpi基因缺陷株(JW5475-1-rpiB)在麦康凯琼脂培养基上的生长情况
从LB平板上挑取大肠杆菌rpe基因缺陷株(JW3349-2)，rpi基因缺陷株(JW5475-1-rpiB)接入4mL LB液体培养基中，过夜培养。稀释10、102、103后，取2μl点于麦康凯培养基平板，过夜培养。第二日，观察菌落颜色为无色，说明突变株JW3349-2和JW5475-1-rpiB都无法利用木糖。
实施例2、CAC1730、CAC0762、CAC1341、CAC2880在大肠杆菌中的异源功能互补
以丙酮丁醇梭菌ATCC824基因组为模板，设计引物(表2)扩增CAC1730、CAC0762、CAC1341和CAC2880基因片段，酶切处理后与同样酶切处理的载体相连，转化大肠杆菌缺陷株，菌落PCR验证并抽提质粒测序。
2.1载体构建
以ATCC824基因组为模板，以引物对1730-BamH1-s和1730-Pst1-a作为引物，通过PCR扩增CAC1730基因片段，然后使用BamH1和Pst1进行双酶切，并与同样经BamH1和Pst1双酶切的载体pUC118连接，转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。得到质粒pUC118-1730。
2.2异源功能互补菌株的构建
将获得的质粒pUC118-1730以及空白对照质粒pUC118分别以CaCl2热休克法转化大肠杆菌JW3349-2感受态细胞。将获得的质粒pUC118-0762、pUC118-1341、pUC118-2880以及空白对照质粒pUC118分别以CaCl2热休克法转化大肠杆菌JW5475-1-rpiB感受态细胞。
转化方法：42℃热击90sec，然后添加4℃LB液体培养基复苏1hr，然后将细胞以4500rpm离心5min，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16-18hr。
使用引物对1730-BamH1-s和1730-Pst1-a对获得的菌落进行菌落PCR，以检测质粒pUC118-1730是否成功转入大肠杆菌缺陷株中，若正确，得到重组菌株JW3349-2-1730。
使用同样的方法进行菌落PCR验证，得到重组菌株JW5475-1-rpiB-0762(酶切位点：EcoR1/Pst1)、JW5475-1-rpiB-1341(酶切位点：BamH1/Pst1)和JW5475-1-rpiB-2880(酶切位点：BamH1/Pst1)。
同时得到对照菌株JW3349-2-p和JW5475-1-rpiB-p。
2.3异源功能互补菌株的生长情况
从LB平板上挑取重组菌株JW3349-2-1730、JW5475-1-rpiB-0762、JW5475-1-rpiB-1341、JW5475-1-rpiB-2880和对照菌株JW3349-2-p、JW5475-1-rpiB-p的单菌落接入4mL LB液体培养基中，过夜培养。稀释10、102、103后，取2μl点于麦康凯培养基平板，过夜培养。第二日，观察菌落颜色，若为无色，则说明互补菌株仍然无法利用木糖；若为红色，则说明缺陷基因得到互补，菌株能够利用木糖。
结果如图1所示。可见CAC1730与CAC2880能够使得缺陷基因得到互补，菌株能够利用木糖。
实施例3、丙酮丁醇梭菌ATCC824中tal、tkt、rpe、rpi过表达质粒pIMP1-TTRR的构建
以丙酮丁醇梭菌ATCC824基因组为模板，设计引物扩增TTRR片段(Pthl-tal-tkl-Pptb-rpe-Pthl-rpi)，酶切处理后与同样酶切处理的载体相连，转化DH5α，菌落PCR验证并抽提质粒测序。其中，PCR、酶切、连接转化、菌落PCR方法同实施例2。具体过程如下：
以taltkt(BamH1)-F、taltkt-ptb-R、taltkt-ptb-F、ptb-rpe-F、ptb-rpe-R、rpe-thl-F、rpe-thl-R、thl-rpi-F、thl-rpi-R和rpi(Sma1)-R为引物通过overlaop PCR扩增出TTRR片段(Pthl-tal-tkl-Pptb-rpe-Pthl-rpi)。引物taltkt(BamH1)-F、taltkt-ptb-R扩增获得F1，引物taltkt-ptb-F、ptb-rpe-R扩增获得F2，引物ptb-rpe-F、rpe-thl-R扩增获得F3，引物rpe-thl-F、thl-rpi-R扩增获得F4，引物thl-rpi-F、rpi(Sma1)-R扩增获得F5。以F1、F2为模板引物为taltkt(BamH1)-F、ptb-rpe-R扩增获得F1+2，以F3、F4为模板引物为ptb-rpe-F、thl-rpi-R扩增获得F3+4，以F3+F4、F5为模板以ptb-rpe-F、rpi(Sma1)-R为引物扩增获得F3+4+5。以F1+2、F3+4+5为模板以taltkt(BamH1)-F、rpi(Sma1)-R为引物扩增获得TTRR。
使用BamHI及SmaI分别酶切载体pIMP1-Pthl和TTRR片段，二者连接、转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
实施例4、丙酮丁醇梭菌ATCC824中tal、tkt、rpe、rpi过表达菌株824-TTRR的构建
4.1质粒pIMP1-TTRR的甲基化
为防止外源DNA进入丙酮丁醇梭菌后被其限制系统切割降解，需对pIMP1-TTRR质粒进行甲基化(Mermelstein，L.D和Papoutsakis，E.T.ApplEnviron Microbiol.vol59.issue4：p1077-81)。
将pAN1质粒以CaCl2热休克法转化入大肠杆菌ER2275，获得菌株大肠杆菌ER2275/pAN1。将抽提获得的pIMP1-TTRR质粒转化入大肠杆菌ER2275/pAN1感受态细胞，由于pAN1质粒具有壮观霉素抗性，因此涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB培养基平板上培养过夜后，挑取单菌落接至4mL添加有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB液体培养基中过夜培养，获得含pAN1及pIMP1-TTRR的大肠杆菌ER2275，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，将抽提获得的质粒使用SatI酶切验证(以未转化入大肠杆菌ER2275/pAN1的pSY6-ccpA(参见Metabolic Engineering12(2010)446-454)为对照；SatI为Cac824I的同裂酶，与Cac824I具有相同的识别位点)，酶切结果显示，经上述处理的质粒pIMP1-TTRR不能被SatI酶切，而对照可被SatI酶切，根据酶切结果，经上述处理的质粒pIMP1-TTRR的Cac824I酶切位点被甲基化而不被丙酮丁醇梭菌的限制系统所识别。
4.2甲基化的pIMP1-TTRR质粒的电转
将丙酮丁醇梭菌ATCC824于CGM培养基平板上划线培养48hr后，挑取单菌落接入5mL CGM液体培养基中培养16hr，再按1%接种量接入50mL CGM液体培养基中培养，当培养菌体的OD600达到0.6-0.7之间时取出培养菌，用于制备电转感受态细胞。取30mL菌液，于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入30mL4℃的ETM缓冲液悬浮，再于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入1mL4℃的ET缓冲液，获得悬浮菌液。
取上述悬浮菌液190μL，加入10μL(约1～3μg)pIMP1-TTRR甲基化质粒(冰上操作)，混匀后转入电转杯中(2mm直径)，使用Bio-Rad MicroPulserTM电转仪电转，电压1.8kV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基1mL，于37℃培养8hr后，取200μL细胞液涂布于加有25μg/mL红霉素的CGM平板上，于厌氧箱内37℃培养约2～4天。
4.3菌落的PCR验证
pIMP1-TTRR质粒转化入丙酮丁醇梭菌ATCC824后，通过菌落PCR加以验证，随机挑取五个转化子进行验证，并以丙酮丁醇梭菌ATCC824基因组为阴性对照，pIMP1-TTRR质粒为阳性对照，具体过程如下：
PCR反应使用的引物为taltkt(BamH1)-F、rpi(Sma1)-R。
PCR反应体系：与实施例2相同；PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃5min。
将PCR反应获得的产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
获得阳性菌落824-TTRR
4.5以同样的方法电转空载体pIMP1-thl至824，获得对照菌株824-P。
实施例5、丙酮丁醇梭菌重组菌株的木糖利用和产酸、产溶剂情况
从CGM平板上挑取单菌(824-TTRR或824-P)接入含有5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8-10hr，使菌浓OD600nm达到0.4，以5%接入100ml P2培养基中(木糖终浓度约为62g/L)培养发酵，定时取发酵液检测OD600nm值、残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agilent1200HPLC测定)、丙酮、丁醇和乙醇含量(使用Agilent7890A气相色谱仪测定)、以及乙酸、丁酸含量，以丙酮丁醇梭菌824-P作为对照，其中，测定发酵液中的残糖含量和丙酮、丁醇和乙醇含量前需进行如下预处理：
发酵液经离心后分别取上清液测定残糖和丙酮、丁醇、乙醇：
上清液以H2O经20倍稀释后用于残糖测定；取400μL上清液与100μL内标混合均匀测定丙酮、丁醇和乙醇(内标配方为：25g异丁醇，5g异丁酸，50mL37%浓盐酸，加水定容至1L)。
结果如图2-4所示。
根据图2，过表达菌株824-TTRR比对照株824-P更早实现OD600nm值的显著提高，发酵结束时还能保持较高OD600nm值。
根据图3，过表达菌株824-TTRR发酵至132小时，残余木糖为28g/L，考虑到初始木糖量62g/L，计算其消耗掉每升约34g的木糖，木糖利用率显著提高。
根据图4，过表达菌株824-TTRR在含有6%木糖的混糖培养基中发酵产生总溶剂和丁醇的量均发生显著增加。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备木糖利用率提高的丙酮丁醇梭菌的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在丙酮丁醇梭菌中提高核酮糖-5-磷酸异构酶基因和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因的表达或活性。
2.一种利用丙酮丁醇梭菌生产溶剂的方法，所述的溶剂包括丁醇、乙醇和丙酮，其特征在于，所述方法包括：
(1)在丙酮丁醇梭菌中提高核酮糖-5-磷酸异构酶基因和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因的表达或活性；和
(2)以包含木糖的培养基培养该菌株，从而生产溶剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(1)中，还包括：在丙酮丁醇梭菌中提高转酮酶基因和转醛酶基因的表达。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的核酮糖-5-磷酸异构酶基因是cac2880；所述的核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因是cac1730。
5.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：
(a)提供重组质粒，所述重组质粒中包含核酮糖-5-磷酸异构酶基因重组表达盒和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因重组表达盒，选择性地还包含转酮酶基因重组表达盒和转醛酶基因重组表达盒；且，各基因的重组表达盒位于同一重组质粒或不同重组质粒中；和
(b)将(a)的重组质粒转化丙酮丁醇梭菌。
6.酶在制备木糖利用率提高的丙酮丁醇梭菌中的用途，所述的酶包括：酮糖-5-磷酸异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的酶还包括：转酮酶和转醛酶。
8.一种重组的丙酮丁醇梭菌，其特征在于，所述的丙酮丁醇梭菌中包含外源的核酮糖-5-磷酸异构酶基因和核酮糖-5-磷酸差向异构酶基因；较佳地还包含转酮酶基因和转醛酶基因。
9.一种用于生产溶剂的试剂盒，所述的溶剂包括丁醇、乙醇和丙酮，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求8所述的重组的丙酮丁醇梭菌。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：
丙酮丁醇梭菌的培养基，其中含有木糖。
CN201310625826.2A 2013-11-28 2013-11-28 一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法 Pending CN104673731A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310625826.2A CN104673731A (zh) 2013-11-28 2013-11-28 一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310625826.2A CN104673731A (zh) 2013-11-28 2013-11-28 一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104673731A true CN104673731A (zh) 2015-06-03

Family

ID=53309325

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310625826.2A Pending CN104673731A (zh) 2013-11-28 2013-11-28 一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104673731A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111269869A (zh) * 2020-02-10 2020-06-12 南京工业大学 一种重组丙酮丁醇梭菌的构建方法以及在发酵半纤维制备丁醇中的应用
CN111826372A (zh) * 2019-04-15 2020-10-27 中国科学院微生物研究所 利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101965401A (zh) * 2008-03-07 2011-02-02 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 发酵戊糖的细胞
CN102796692A (zh) * 2011-05-25 2012-11-28 中国科学院上海生命科学研究院 一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中糖利用率的方法
CN102985540A (zh) * 2010-06-29 2013-03-20 纳幕尔杜邦公司 在具有提高的核糖-5-磷酸活性的重组发酵单胞菌属中的改善的木糖利用
WO2013071112A1 (en) * 2011-11-10 2013-05-16 Mascoma Corporation A genetically modified strain of s. cerevisiae engineered to ferment xylose and arabinose
WO2013096366A1 (en) * 2011-12-20 2013-06-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Gene inactivation allowing immediate growth on xylose medium by engineered zymomonas

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101965401A (zh) * 2008-03-07 2011-02-02 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 发酵戊糖的细胞
CN102985540A (zh) * 2010-06-29 2013-03-20 纳幕尔杜邦公司 在具有提高的核糖-5-磷酸活性的重组发酵单胞菌属中的改善的木糖利用
CN102796692A (zh) * 2011-05-25 2012-11-28 中国科学院上海生命科学研究院 一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中糖利用率的方法
WO2013071112A1 (en) * 2011-11-10 2013-05-16 Mascoma Corporation A genetically modified strain of s. cerevisiae engineered to ferment xylose and arabinose
WO2013096366A1 (en) * 2011-12-20 2013-06-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Gene inactivation allowing immediate growth on xylose medium by engineered zymomonas

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JORK NOLLING等: "Genome Sequence and Comparative Analysis of the Solvent-Producing Bacterium Clostridium acetobutylicum", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
顾阳等: "生物炼制中的科学难点—戊糖利用及其调控机制", 《中国基础科学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111826372A (zh) * 2019-04-15 2020-10-27 中国科学院微生物研究所 利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用
CN111826372B (zh) * 2019-04-15 2022-03-01 中国科学院微生物研究所 利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用
CN111269869A (zh) * 2020-02-10 2020-06-12 南京工业大学 一种重组丙酮丁醇梭菌的构建方法以及在发酵半纤维制备丁醇中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101883861B (zh) 利用hima表达减少的重组发酵单胞菌属菌株从包含木糖的培养基生产乙醇的方法
CN101970671B (zh) 在包含浓缩糖和乙酸盐的培养基中具有改进的乙醇产量的发酵单胞菌属
US9353376B2 (en) Pentose and glucose fermenting yeast cell
CN103003423B (zh) 在具有另外木糖异构酶活性的重组发酵单胞菌属中改善的木糖利用
CN102796692B (zh) 一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中糖利用率的方法
US8476048B2 (en) Xylose utilizing zymomonas mobilis with improved ethanol production in biomass hydrolysate medium
CN102471780A (zh) 用于生物质的经改善的糖化作用的组合物和方法
US20100105114A1 (en) Methods and Compositions for Regulating Sporulation
WO2012088467A2 (en) Genetically modified clostridium thermocellum engineered to ferment xylose
CN102459570A (zh) 具有改善的阿拉伯糖利用率的发酵单胞菌属细菌
ES2755680T3 (es) Célula de levadura que consume acetato
CA2681380A1 (en) Enhancement of microbial ethanol production
CN103374542B (zh) 一种提高拜氏梭菌木糖消耗率的方法
CN105026561A (zh) 用于改良的日间特性的、光能自养型细菌的营养转化
CN103849576A (zh) 一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株
WO2012068310A2 (en) Compositions and methods for improved saccharification of genetically modified plant-derived biomass
CN103911334B (zh) 一种高抗逆性拜氏梭菌及其应用
CN104673731A (zh) 一种优化丙酮丁醇梭菌木糖利用率的方法
CN103667274A (zh) 一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用
CN103562216A (zh) 纤维糊精和β-D-葡萄糖的增强型发酵
CN106222188B (zh) 一种生产生物燃料的方法
KR101543845B1 (ko) L-갈락토스 대사능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 l-갈락토스를 함유하는 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법
Zhao Genetic characterization and manipulation of strains of Zymomonas mobilis for ethanol and higher value products
Doori et al. Theoretical and practical studies on the metabolic engineering of streptomyces for production of butanols
CN104177480A (zh) 木糖转运蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150603