CN105026561A

CN105026561A - 用于改良的日间特性的、光能自养型细菌的营养转化

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Publication number: CN105026561A
Application number: CN201380061870.3A
Authority: CN
Inventors: 渥美正太; M·R·康纳; J·T·麦尤恩
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2015-11-04
Also published as: US20150240247A1; WO2014052923A2; JP2015530117A; DE112013004774T5; WO2014052923A3

Abstract

本发明公开总体涉及光能自养型物种的重组细菌细胞在日间条件下的生长。具体而言，本发明公开涉及通过表达糖类转运蛋白而在日间条件下生长增加的光能自养型物种的分离的细菌细胞，以及它们的使用方法。

Description

用于改良的日间特性的、光能自养型细菌的营养转化

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年9月28日提交的美国临时申请No.61/707,848的优先权，对于所有目的而言，该申请的内容以引用方式全文并入本文。

技术领域

本发明公开总体涉及光能自养型物种的重组细菌细胞在日间条件下的生长。具体而言，本发明公开涉及在日间条件下通过糖类转运蛋白的表达而使生长增加的光能自养型物种的分离细菌细胞及其使用方法。

背景技术

根据美国能源信息管理局(the US Energy Information Administration(EIA,2007))，2004年中全世界能量相关的CO₂排放为26,922百万公吨，并且比1990年增加26.7％。结果，在过去的150年中，CO₂的大气水平增加大约25％。因此，研发降低CO₂排放的新技术变得越来越重要。

此外，全世界还面临昂贵的气体和油，以及这些珍贵资源的有限储备。生物燃料已经被公认为备选能源。尽管已经尽力改良生物燃料的制备方法，但是需要进一步的研发。

上述问题的一种解决方法是使用用于制备生物燃料的植物生物质。但是，由于在一年的期间内CO₂扩散和封存、生长的季节和太阳能的收集方面的限制，植物制备率具有将太阳能转化为生物质和生物燃料的较低的产率。较高的能量转化是通过诸如微藻类和蓝细菌之类的光合作用微生物有机体而取得的。之前已经报告蓝细菌细长聚球藻(S.elongatus)可以通过引入葡萄糖转运蛋白来改造，从而能够在光能下在外源葡萄糖上生长。但是，这些转化的菌株是不稳定的，并且必须加入光合作用的化学抑制剂，这意味着葡萄糖的利用和光合作用是不相容的(Zhang et al.,FEMSMicrobiology Letters 161(1998)285-292)。使用细长聚球藻蓝细菌的另一个问题在于生长和生物燃料的制备完全取决于光能，这不允许在缺乏光照的条件下生长或制备生物燃料。因此，细长聚球藻的每日的生物质和生物燃料的制备限于日光的时间，该范围每天在9至16个小时，因此导致生物燃料制备率降低以及制备成本升高。

因此，需要此前的光能自养型物种的细菌(例如蓝细菌)在日间条件下利用糖底物生长，从而每天24小时连续地制备生物燃料。

发明概述

为了满足上述需要，本发明公开提供了在日间条件下在糖底物上生长增加的光能自养型物种的重组细菌细胞，用于使重组细菌细胞在日间条件下在糖底物上增加生长的方法，以及重组细菌细胞制备大宗化学品的使用方法。此外，本发明公开至少部分基于以下惊人的发现：经改造从而表达重组的糖类转运蛋白(例如葡萄糖转运蛋白、蔗糖转运蛋白或木糖转运蛋白)的、光能自养型物种的细菌细胞在日间条件下以及特别是在日/夜的昼夜循环的黑暗或夜晚时期可以在外源糖底物上茁壮生长。有利地，重组糖类转运蛋白的表达允许重组细菌细胞在日间条件下利用外源糖底物用于生物质制备。此外，此外，重组细菌细胞无需开始利用糖底物的调节时期。有利地，外源糖底物的利用与光合作用相容并回报光合作用，因此，本发明公开的重组细菌细胞无需光合作用的化学抑制剂。此外，本发明公开的重组细菌细胞无需24小时的光循环(即连续的光输入)而达到持续生长，这降低了使细菌细胞生长的制备成本。如此，本发明的重组细菌细胞能够一天24小时持续地制备大宗化学品(例如生物燃料)，这可以增加重组细菌细胞的制备率并降低大宗化学品的制备成本。

因此，本发明公开的一个方面涉及光能自养型物种的分离的细菌细胞，其中所述的物种包含编码半乳糖转运蛋白的重组多核苷酸，其中半乳糖转运蛋白的表达使得葡萄糖被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在葡萄糖上增加细菌细胞的生长。在某些实施方案中，重组多核苷酸编码半乳糖转运蛋白，其选自细菌galP转运蛋白,真核生物galP转运蛋白,真菌galP转运蛋白,哺乳动物galP转运蛋白,细菌主要易化因子超家族(MFS)转运蛋白,真核生物MFS转运蛋白,真菌MFS转运蛋白,哺乳动物MFS转运蛋白,细菌ATP-结合盒超家族(ABC)转运蛋白,真核生物ABC转运蛋白,真菌ABC转运蛋白,哺乳动物ABC转运蛋白,细菌磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白,真核生物PTS转运蛋白,真菌PTS转运蛋白,哺乳动物PTS转运蛋白,及它们的同系物。在某些实施方案中，重组多核苷酸编码E.coli galP转运蛋白。

本发明公开的另一个方面涉及光能自养型物种的分离的细菌细胞，其中所述的物种包含编码二糖糖类转运蛋白的重组多核苷酸，其中二糖糖类转运蛋白的表达使得二糖糖类被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在二糖糖类上增加细菌细胞的生长。在某些实施方案中，重组多核苷酸编码二糖糖类转运蛋白，其选自蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白,纤维二糖转运蛋白及它们的同系物。在某些实施方案中，重组多核苷酸编码蔗糖转运蛋白。在某些实施方案中，蔗糖转运蛋白选自E.coli CscB蔗糖转运蛋白,枯草芽孢杆菌(B.subtilis)SacP转运蛋白,欧洲油菜(Brassica napus)Sut1转运蛋白,野胡桃(Juglans regia)Sut1转运蛋白,拟南芥(Arabidopsis thaliana)Suc6转运蛋白,拟南芥SUT4转运蛋白,黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Slc45-1转运蛋白,和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)ScrA转运蛋白。在某些实施方案中，蔗糖转运蛋白为E.coli CscB蔗糖转运蛋白。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码果糖激酶蛋白质的至少一种其他的重组多核苷酸。在某些实施方案中，果糖激酶蛋白质选自E.coli CscK果糖激酶蛋白质,a番茄(Lycopersiconesculentum)Frk1果糖激酶蛋白质,番茄Frk2果糖激酶蛋白质,晚期智人(H.sapiens)KHK果糖激酶蛋白质,拟南芥FLN-1果糖激酶蛋白质,拟南芥和FLN-2果糖激酶蛋白质,鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis biovarMicrotus str.)91001NagC1果糖激酶蛋白质,假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)YajF果糖激酶蛋白质,和嗜盐碱单孢菌(Natronomonaspharaonis)Suk果糖激酶蛋白质。在某些实施方案中，果糖激酶蛋白质为E.coli CscK果糖激酶蛋白质。

本发明公开的另一个方面涉及光能自养型物种的分离的细菌细胞，其中所述的物种包含编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸，其中木糖转运蛋白的表达使得木糖被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在木糖上增加细菌细胞的生长。在某些实施方案中，重组多核苷酸编码木糖转运蛋白，其选自E.coli XylE木糖转运蛋白,E.coli xylF/xylG/xylHABC木糖转运蛋白,中间假丝酵母(Candida intermedia)Gxf1转运蛋白,毕赤酵母(Pichiastipitis)Sut1转运蛋白和拟南芥At5g59250转运蛋白。在某些实施方案中，重组多核苷酸编码E.coli XylE木糖转运蛋白。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码木糖异构酶的至少一个其他的重组多核苷酸。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码木酮糖激酶的至少一个其他的重组多核苷酸。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码木糖异构酶的第二重组多核苷酸以及编码木酮糖激酶的第三重组多核苷酸。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，重组多核苷酸进一步编码木糖异构酶和木酮糖激酶。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，木糖异构酶选自E.coli XylA木糖异构酶,拟南芥AT5G57655木糖异构酶,黑曲霉(Aspergillusniger)XyrA木糖异构酶和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)Xyl1木糖异构酶。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，木糖异构酶为E.coli XylA木糖异构酶。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，木酮糖激酶选自E.coli XylB木酮糖激酶,拟南芥XK-1木酮糖激酶,拟南芥XK-2木酮糖激酶,E.coli LynK木酮糖激酶,天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)SCO1170木酮糖激酶,绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)MtlY木酮糖激酶,假结核耶尔森菌SgbK木酮糖激酶和E.coli AtlK木酮糖激酶。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，木酮糖激酶为E.coli XylB木酮糖激酶。

在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，重组多核苷酸和/或至少一个其他的重组多核苷酸稳定地整合至细菌细胞的基因组中。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码糖类转运蛋白的至少一个其他的重组多核苷酸，其中糖类转运蛋白的表达使得糖类被转运至细菌细胞中。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，糖类选自己糖,半乳糖,葡萄糖,果糖,甘露糖,二糖,蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖,纤维二糖,戊糖,木糖,阿拉伯糖,核糖,核酮糖和木酮糖。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含细菌细胞制备至少一种大宗化学品所必须的蛋白质。在某些实施方案中，细菌细胞制备至少一种大宗化学品。在某些实施方案中，细菌细胞在日间条件下持续制备至少一种大宗化学品。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，大宗化学品选自聚合物,2,3-丁二醇,1,3-丙二醇,1,4-丁二醇,羟基脂肪酸酯,聚羟基丁酸酯,异戊二烯,乳酸酯,琥珀酸酯,谷氨酸酯,柠檬酸酯,苹果酸酯,3-羟基丙酸酯,抗坏血酸盐,山梨醇,氨基酸,羟基丁酸酯,类胡罗卜素,番茄红素,β-胡罗卜素,药物中间体,聚酮化合物,斯达汀,ω-3脂肪酸,类异戊二烯,类固醇,抗生素,红霉素,类异戊二烯,类固醇,红霉素和它们的组合。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，大宗化学品为生物燃料，其选自醇,乙醇,丙醇,异丙醇,丙酮,丁醇,异丁醇,2-甲基-1-丁醇,3-甲基-1-丁醇,苯基乙醇,脂肪醇,异戊烯醇,醛,乙酰基醛,丙醛,丁醛,异丁醛,2-甲基-1-丁醛,3-甲基-1-丁醛,苯乙醛,脂肪醛,烃,烷烃,烯烃,类异戊二烯,脂肪酸,蜡酯,乙酯,氢和它们的组合。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞选自蓝细菌,Acaryochloris,鱼腥藻属,螺旋藻属,蓝杆藻属,Gleobacter,微胞藻属,念珠藻属,原绿球藻属,聚球藻属,细长聚球藻,细长聚球藻PCC7942,集胞藻属,Thermosynechococcus,束毛藻属,紫色硫细菌,着色菌科,外硫红螺旋菌科,紫色非硫细菌,醋酸杆菌科,慢生根瘤菌科,丛毛单胞菌科,生丝微菌科,红杆菌科,红游动菌科,红环菌科,Rhodospirillaceae,绿色非硫细菌和绿弯菌科。

本发明公开的另一个方面包括通过以下方式来增加细菌生长的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及在一定条件下使用糖类底物培养细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞的细胞生长相比，可以在黑暗或日间条件下在糖类上增加细胞的生长。

本发明公开的另一个方面包括通过以下方式在黑暗或日间条件下增加细菌细胞的密度的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及在一定条件下使用糖类底物培养细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在糖类上增加细胞的密度。

本发明公开的另一个方面包括通过以下方式在黑暗或日间条件下增加细菌生物质制备的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及在一定条件下使用糖类底物培养细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下增加生物质的制备。

本发明公开的另一个方面包括通过以下方式制备至少一种大宗化学品的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及在一定条件下使用糖类底物培养细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达并且制备至少一种大宗化学品，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中。在某些实施方案中，细菌细胞包含该细菌细胞制备至少一种大宗化学品所必需的蛋白质。

在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，所述的重组多核苷酸编码糖类转运蛋白，其选自己糖糖类转运蛋白,半乳糖转运蛋白,葡萄糖转运蛋白,果糖转运蛋白,甘露糖转运蛋白,主要易化因子超家族(MFS)转运蛋白,ATP-结合盒超家族(ABC)转运蛋白,磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白,二糖糖类转运蛋白,蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白,纤维二糖转运蛋白,戊糖转运蛋白,木糖转运蛋白,阿拉伯糖转运蛋白,核糖转运蛋白,核酮糖转运蛋白和木酮糖转运蛋白。在某些实施方案中，使用糖类培养细菌细胞，其中所述的糖类选自己糖,半乳糖,葡萄糖,果糖,甘露糖,二糖,蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖,纤维二糖,戊糖,木糖,阿拉伯糖,核糖,核酮糖和木酮糖。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，重组多核苷酸编码半乳糖转运蛋白。在某些实施方案中，半乳糖转运蛋白选自细菌galP转运蛋白,真核生物galP转运蛋白,真菌galP转运蛋白,哺乳动物galP转运蛋白,细菌MFS转运蛋白,真核生物MFS转运蛋白,真菌MFS转运蛋白,哺乳动物MFS转运蛋白,细菌PTS转运蛋白,真核生物PTS转运蛋白,真菌PTS转运蛋白和哺乳动物PTS转运蛋白。在某些实施方案中，半乳糖转运蛋白为E.coli galP转运蛋白。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，半乳糖转运蛋白将葡萄糖转运至细菌细胞中。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，使用葡萄糖培养细菌细胞。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，重组多核苷酸编码二糖糖类转运蛋白。在某些实施方案中，二糖糖类转运蛋白选自蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白,纤维二糖转运蛋白和它们的同系物。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，重组多核苷酸编码二糖糖类转运蛋白。在某些实施方案中，二糖糖类转运蛋白选自蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白,纤维二糖转运蛋白和它们的同系物。在某些实施方案中，二糖糖类转运蛋白为蔗糖转运蛋白。在某些实施方案中，蔗糖转运蛋白选自E.coli CscB蔗糖转运蛋白,枯草芽孢杆菌SacP转运蛋白,欧洲油菜Sut1转运蛋白,野胡桃Sut1转运蛋白,拟南芥Suc6转运蛋白,拟南芥SUT4转运蛋白,黑腹果蝇Slc45-1转运蛋白和菊欧文氏菌ScrA转运蛋白。在某些实施方案中，蔗糖转运蛋白为E.coli CscB蔗糖转运蛋白。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码果糖激酶蛋白质的至少一种其他的重组多核苷酸。在某些实施方案中，果糖激酶选自E.coli CscK果糖激酶蛋白质,番茄Frk1果糖激酶蛋白质,番茄Frk2果糖激酶蛋白质,晚期智人KHK果糖激酶蛋白质,拟南芥FLN-1果糖激酶蛋白质,拟南芥和FLN-2果糖激酶蛋白质,鼠疫耶尔森氏菌91001NagC1果糖激酶蛋白质,假结核耶尔森菌YajF果糖激酶蛋白质和嗜盐碱单孢菌Suk果糖激酶蛋白质。在某些实施方案中，果糖激酶蛋白质为E.coliCscK果糖激酶蛋白质。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含将二糖糖类转化成相应的单糖所必需的蛋白质。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，使用糖类培养细菌细胞，其中所述的糖类选自二糖糖类,蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖和纤维二糖。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，重组多核苷酸编码木糖转运蛋白。在某些实施方案中，木糖转运蛋白选自E.coli XylE木糖转运蛋白,E.coli xylF/xylG/xylH ABC木糖转运蛋白,中间假丝酵母Gxf1转运蛋白,毕赤酵母Sut1转运蛋白和拟南芥At5g59250转运蛋白。在某些实施方案中，木糖转运蛋白为E.coli XylE木糖转运蛋白。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码木糖异构酶的至少一种其他的重组多核苷。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码木酮糖激酶的至少一种其他的重组多核苷。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码木糖异构酶的第二重组多核苷酸和编码木酮糖激酶的第三重组多核苷酸。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，重组多核苷酸进一步编码木糖异构酶和木酮糖激酶。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，木糖异构酶选自E.coli XylA木糖异构酶,拟南芥AT5G57655木糖异构酶,黑曲霉XyrA木糖异构酶和红褐肉座菌Xyl1木糖异构酶。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，木糖异构酶为E.coli XylA木糖异构酶。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，木酮糖激酶选自E.coli XylB木酮糖激酶,拟南芥XK-1木酮糖激酶,拟南芥XK-2木酮糖激酶,E.coli LynK木酮糖激酶,天蓝链霉菌SCO1170木酮糖激酶,绿脓杆菌MtlY木酮糖激酶,假结核耶尔森菌SgbK木酮糖激酶和E.coli AtlK木酮糖激酶。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，木酮糖激酶为E.coli XylB木酮糖激酶。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，重组多核苷酸和/或至少一种其他的重组多核苷酸稳定地整合至细菌细胞的基因组中。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞进一步包含编码第二糖类转运蛋白的至少一种其他的重组多核苷酸，其中第二糖类转运蛋白的表达使得第二糖类底物被转运至细菌细胞中。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞持续制备至少一种大宗化学品。在某些实施方案中，每天24小时持续制备至少一种大宗化学品。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，大宗化学品选自聚合物,2,3-丁二醇,1,3-丙二醇,1,4-丁二醇,羟基脂肪酸酯,聚羟基丁酸酯,异戊二烯,乳酸酯,琥珀酸酯,谷氨酸酯,柠檬酸酯,苹果酸酯,3-羟基丙酸酯,抗坏血酸盐,山梨醇,氨基酸,羟基丁酸酯,类胡罗卜素,番茄红素,β-胡罗卜素,药物中间体,聚酮化合物,斯达汀,ω-3脂肪酸,类异戊二烯,类固醇,抗生素,红霉素,类异戊二烯,类固醇,红霉素,生物燃料和它们的组合。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，大宗化学品为生物燃料，其选自醇,乙醇,丙醇,异丙醇,丙酮,丁醇,异丁醇,2-甲基-1-丁醇,3-甲基-1-丁醇,苯基乙醇,脂肪醇,异戊烯醇,醛,乙酰基醛,丙醛,丁醛,异丁醛,2-甲基-1-丁醛,3-甲基-1-丁醛,苯乙醛,脂肪醛,烃,烷烃,烯烃,类异戊二烯,脂肪酸,蜡酯,乙酯,氢和它们的组合。在可以与任意一个之前的实施方案结合的某些实施方案中，细菌细胞选自蓝细菌,Acaryochloris,鱼腥藻属,螺旋藻属,蓝杆藻属,Gleobacter,微胞藻属,念珠藻属,原绿球藻属,聚球藻属,细长聚球藻,细长聚球藻PCC7942,集胞藻属,Thermosynechococcus,束毛藻属,紫色硫细菌,着色菌科,外硫红螺旋菌科,紫色非硫细菌,醋酸杆菌科,慢生根瘤菌科,丛毛单胞菌科,生丝微菌科,红杆菌科,红游动菌科,红环菌科,Rhodospirillaceae,绿色非硫细菌和绿弯菌科。

附图简述

图1A描绘了葡萄糖转运蛋白基因整合至细长聚球藻基因组中的示意图。图1B描绘了使用和未使用5g/L葡萄糖培养的细长聚球藻galP菌株(圆形)和野生型菌株(方形)的生长曲线。图1C描绘了使用和未使用葡萄糖培养的细长聚球藻Glut 1菌株(三角形),glcP菌株(菱形)和野生型菌株(方形)的生长曲线。就图1B和1C而言，空心形状描绘了未使用5g/L葡萄糖的生长，而实心形状描绘了使用5g/L葡萄糖的生长。图1D描绘了具有和不具有glgC删除的细长聚球藻galP菌株(圆形)和野生型菌株(方形)的生长曲线。就图1D而言，使用5g/L葡萄糖培养样品。实心形状描绘了包含glgC基因的菌株，而“x”形状描绘了具有glgC删除的菌株。就图1B-1D而言，白色区域表示光照循环，阴影区域表示黑暗循环。误差条表示3个重复的标准偏差。

图2A描绘了重组事件的示意图，其中使用pAL82质粒，删除glgC基因，从而创建细长聚球藻glgC删除菌株。条表示用于重组的同源区域。箭头表示用于确认重组的引物。图2B描绘了正确重组的PCR证明。使用细长聚球藻野生型菌株(泳道1和4)、AL535菌株(泳道2和5)以及AL536菌株(泳道3和6)的基因组DNA作为模板，使用引物GR050和IM581(泳道1-3，产物大小：1.7kb)、以及IM573和GR015(泳道4-6，产物大小：2.2kb)来实施PCR。

图3A-E描绘了细长聚球藻galP菌株的特征。所有样品都是在持续光照下在具有5g/L葡萄糖的BG-11培养基中生长的。图3A描绘了细长聚球藻野生型菌株的共聚焦显微镜图像(左侧)和透射光显微镜图像(右侧)。图3B描绘了细长聚球藻gfp菌株(左侧)和细长聚球藻galP-gfp菌株(右侧)的共聚焦显微镜图像。图3C描绘了在变化量的IPTG存在下，培养的细长聚球藻galP-gfp菌株的生长曲线。圆形表示无IPTG，方形表示0.01mMIPTG，三角形表示0.1mM IPTG，菱形表示1.0mM IPTG。图3D描绘了在图3C描绘的生长曲线分析过程中，细长聚球藻galP-gfp菌株的荧光分析。Y轴表示GFP荧光强度除以OD₇₃₀。图3E描绘了在可变浓度的碳酸氢钠(NaHCO₃)存在下培养的细长聚球藻galP菌株(不具有gfp；实心形状)和野生型菌株(空心形状)的生长曲线。方形表示无重碳酸盐，圆形表示5mM重碳酸盐，三角形表示10mM重碳酸盐，倒三角形表示20mM重碳酸盐。误差条表示三个重复的标准偏差。

图4A描绘了将蔗糖降解途径整合至细长聚球藻基因组中的示意图。图4B描绘了在形成聚球藻中合成蔗糖的降解途径。灰色箭头表示通过异源的酶催化的步骤。“PPP”相当于戊糖磷酸途径。图4C描绘了细长聚球藻cscB-cscK菌株(圆形)和野生型菌株(方形)的生长曲线。空心形状表示未使用5g/L蔗糖培养的细胞，实心形状表示使用5g/L蔗糖培养的细胞。白色区域表示光照循环，阴影区域表示黑暗循环。误差条表示3个重复的标准偏差。

图5A描绘了木糖降解途径整合至细长聚球藻基因组的示意图。图5B描绘了在细长聚球藻中合成木糖的降解途径。灰色箭头表示通过异源的酶催化的步骤。图5C描绘了细长聚球藻xylEAB菌株(圆形)、xylE菌株(方形)和野生型菌株(三角形)的生长曲线。空心形状表示未使用5g/L木糖培养的细胞，实心形状表示使用5g/L木糖培养的细胞。白色区域表示光照循环，阴影区域表示黑暗循环。误差条表示3个重复的标准偏差。

发明详述

本发明公开至少部分基于以下惊人的发现：糖类转运蛋白(例如葡萄糖转运蛋白、蔗糖转运蛋白或木糖转运蛋白)的重组表达可以使光能自养型物种的细菌细胞在缺乏光照下生长，并由此每天24小时连续地制备大宗化学品，例如生物燃料。有利地，本发明公开的重组细菌细胞无需光合作用的化学抑制剂，它们也不需要持续的光输入以用于生长，因此降低了制备成本。

本发明公开的某些方面提供了光能自养型物种的分离的细菌细胞，其中所述的物种包含编码半乳糖转运蛋白的重组多核苷酸，其中半乳糖转运蛋白的表达使得葡萄糖被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在葡萄糖上增加细菌细胞的生长。本发明公开的其他方面提供了光能自养型物种的分离的细菌细胞，其中所述的物种包含编码二糖糖类转运蛋白的重组多核苷酸，其中二糖糖类转运蛋白的表达使得二糖糖类被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在二糖糖类上增加细菌细胞的生长。本发明公开的其他方面提供了光能自养型物种的分离的细菌细胞，其中所述的物种包含编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸，其中木糖转运蛋白的表达使得木糖被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在木糖上增加细菌细胞的生长。

本发明公开的其他方面提供了通过以下方式来增加细菌生长的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及在一定条件下使用糖类底物培养细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞的细胞生长相比，可以在黑暗或日间条件下在糖类上增加细胞的生长。本发明公开的其他方面提供了通过以下方式在黑暗或日间条件下增加细菌细胞密度或生物质制备的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及在一定条件下使用糖类底物培养细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相同物种的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下增加细胞密度或生物质的制备。

本发明公开的其他方面提供了通过以下方式制备至少一种大宗化学品的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；在一定条件下使用糖类底物培养细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达并制备至少一种大宗化学品，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中。在某些实施方案中，细菌细胞包含该细菌细胞制备至少一种大宗化学品所必须的蛋白质。

分离的细菌细胞

本发明公开的某些方面涉及能够在糖类(例如半乳糖、蔗糖或木糖)上生长的光能自养型物种的重组细菌细胞。

如本文所用，术语“光能自养型细菌”、“光能自养型细菌细胞(多种)”、“光能自养型生物(多种)”或“光能自养型物种的细胞(多种)”是指需要能量实施光合作用并且可以利用二氧化碳作为唯一碳源的细菌细胞。光能自养型细菌使用得自日光的能量将二氧化碳和水转化成在细胞功能(例如生物合成和呼吸)中使用的有机材料。光能自养型细菌通常为革兰氏阴性杆菌，其通过光合作用的过程由日光获得它们的能量。在该过程中，日光能量用于碳水化合物的合成，碳水化合物在光能自养型生物中可以进一步用作生物燃料合成的中间体。被称为不产氧光能自养型生物的某些光能自养型生物仅在厌氧条件下生长，并且不能使用水作为氢的来源，也不能由光合作用制备氧气。其他光能自养型细菌包括产氧光能自养型生物。这些细菌通常为蓝细菌。产氧光能自养型生物在光合作用过程中使用叶绿素色素和光合作用，该过程与藻类和复杂植物中的过程类似。在该过程中，它们使用水作为氢的来源，并且制备氧气作为光合作用的产物。

本发明公开的合适的分离的细菌细胞包括但不限于盐杆菌,日光杆菌,紫色硫细菌,紫色非硫细菌,绿色硫细菌,绿色非硫细菌和蓝细菌。蓝细菌通常包括杆细菌和球细菌的类型，以及某些细丝状形式。合适的蓝细菌的实例包括但不限于原绿球藻属,聚球藻属和念珠藻属多种类型。所述的细胞可以包含类囊体，其为包含叶绿素的细胞质层状膜。有机体制备异形细胞，其为特化细胞，据信在氮化合物的固定中发挥功能。

因此，在某些实施方案中，本发明公开分离的细胞选自蓝细菌,Acaryochloris,鱼腥藻属,螺旋藻属,蓝杆藻属,Gleobacter,微胞藻属,念珠藻属,原绿球藻属,聚球藻属,细长聚球藻,细长聚球藻PCC7942,集胞藻属,Thermosynechococcus,束毛藻属,紫色硫细菌,着色菌科,外硫红螺旋菌科,紫色非硫细菌,醋酸杆菌科,慢生根瘤菌科,丛毛单胞菌科,生丝微菌科,红杆菌科,红游动菌科,红环菌科,Rhodospirillaceae,绿色非硫细菌和绿弯菌科。在其他的实施方案中，光能自养型细菌细胞为蓝细菌。在其他的实施方案中，分离的细菌细胞为聚球藻属。优选地，分离的细菌细胞为细长聚球藻。更优选地，分离的细菌细胞为细长聚球藻PCC7942。

本发明公开的光能自养型物种的分离的细菌细胞是遗传修饰的，其中重组多核苷酸被引入至细菌细胞中，并且如此遗传修饰的细菌细胞不能在自然界中形成。合适的分离的细菌细胞为能够表达一种或多种多核苷酸构建体的细菌细胞，其中所述的构建体编码能够转运所需的糖类的一种或多种蛋白质。在优选的实施方案中，一种或多种蛋白质包括但不限于主要易化因子超家族(MFS)转运蛋白,磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白,ATP-结合盒超家族(ABC)转运蛋白,己糖糖类转运蛋白,半乳糖转运蛋白,葡萄糖转运蛋白,果糖转运蛋白,甘露糖转运蛋白,戊糖转运蛋白,木糖转运蛋白,阿拉伯糖转运蛋白,核糖转运蛋白,核酮糖转运蛋白,木酮糖转运蛋白,蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白和纤维二糖转运蛋白。在优选的实施方案中，所述的一种或多种蛋白质能够转运糖类，其使得在日间条件下能够生长增加、制备生物质和制备大宗化学品。

如本文所用，“日间条件(多种)”或“日间循环(多种)”是指在每日24小时循环内发生的并且包括光照或日光期、以及黑暗或夜晚期的生长条件。

如本文所用，“重组多核苷酸”或“重组核酸”是指核酸的聚合物，其中至少以下一者是真实的：(a)对于给定的宿主有机体，核酸序列是外来的(即不能在给定的宿主有机体中天然发现的)；(b)所述的序列可以在给定的宿主有机体中天然发现，但是以非天然的量(例如高于预期)存在；或者(c)核酸序列包含2个或多个亚序列，该亚序列在自然界中不能以彼此相同的关系发现。例如关于例子(c)，重组核酸序列具有得自不相关的基因的2个或多个序列，所述的基因排列形成新的功能核酸。具体而言，本发明公开描述了表达载体向分离的细菌细胞中的引入，其中所述的表达载体包含编码酶(其不能在所述的细胞中天然发现)的核酸序列，或者包含编码酶(其通常可以在所述的细胞中发现，但是处于不同的调节序列的控制之下)的核酸。关于分离的细菌细胞的基因组，则编码蛋白质的核酸序列是重组的。

“遗传改造的”或“遗传修饰的”是指通过任何重组DNA或RNA技术修饰的光能自养型物种的分离的细菌细胞。换言之，使用重组多核苷酸分子转染、转化或转导分离的细菌细胞，该细胞由此被改变，从而使该细胞改变了所需的蛋白质的表达。用于遗传改造分离的细菌细胞的方法和载体是本领域公知的；例如在Current Protocols inMolecular Biology,Ausubelet al.,eds.(Wiley&Sons,New York,1988,and quarterly updates)中说明了多种技术。遗传改造技术包括但不限于表达载体、靶向同源重组和基因活化(例如参见美国专利No.5,272,071)，以及通过改造的转录因子的反式活化作用(例如参见Segal et al.,1999,Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758-63)。

导致基因表达或功能增加的遗传修饰可以涉及基因的扩增、过度制备、过表达、活化、增强、加入或上调节。更具体而言，关于本文所讨论的增加蛋白质或酶的作用(或活性)，通常是指所考虑的光能自养型细菌细胞的任何遗传修饰，其使得蛋白质或酶的表达和/或功能性(生物活性)增强，并且包括酶的更高的活性(例如特定的活性或体内酶活性)、酶的抑制或降解减轻、以及酶的过表达。例如可以增加基因的拷贝数，通过使用可以给予比天然启动子的表达水平更高的启动子来增加表达水平，或者可以通过遗传改造或传统诱变来改变基因从而增加酶的生物活性。这些修饰中的一些修饰的组合也是可行的。

通常，根据本发明公开，参照由相同有机体(即得自相同的来源或亲代序列)衍生的野生型(即正常的，未修饰的)蛋白质的相同特征来增加或降低突变的或修饰的蛋白质的给定特征(例如蛋白质功能)，并在相同或相当的条件下测量或建立这种给定特征的增加或降低。类似地，参照相同物种(优选地为相同的菌株)的野生型细菌细胞的相同特征在相同或相当的条件下增加或降低遗传修饰的细菌细胞的特征(例如蛋白质的表达和/或生物活性，或者产物的制备)。此类条件包括：检验或培养条件(例如培养基成分、温度、pH等)，在该条件下测量分离的细菌细胞的蛋白质的活性(例如表达或生物活性)或其他特征；以及使用的检验的类型，所评价的宿主细菌细胞等。如上文所讨论，相当的条件为相似地但不必一致的(例如条件中的一些保守变化是可以容许的)、并且与相同条件下制得的比较物相比基本不会改变对微生物生长、酶表达或生物活性的作用的条件。

优选地，光能自养型物种(其具有遗传修饰，该修饰增加或降低给定蛋白质的功能)的遗传修饰的分离的细菌细胞与缺乏所述的蛋白质的相同物种的相应的野生型细菌细胞中野生型蛋白质的活性相比，蛋白质的活性(例如表达、制备和/或生物活性)分别增加或降低至少大约2倍、更优选的是至少大约5倍、更优选的是至少大约10倍、更优选的是至少大约20倍、更优选的是至少大约30倍、更优选的是至少大约40倍、更优选的是至少大约50倍、更优选的是至少大约75倍、更优选的是至少大约100倍、更优选的是至少大约125倍、更优选的是至少大约150倍、或者由至少大约2倍开始的任何完全整数的增长(例如3倍、4倍、5倍、6倍等)。

糖类转运蛋白

本发明公开的其他方面涉及光能自养型物种的分离的细菌细胞，其中所述的物种包含编码糖类转运蛋白(例如半乳糖转运蛋白、蔗糖转运蛋白或木糖转运蛋白)的重组多核苷酸。

本发明公开的糖类转运蛋白包括但不限于能够转运被本发明公开的光能自养型细菌细胞所利用的足量的糖类底物而不具有毒性的任何转运蛋白。此外，利用糖类底物会在黑暗和/或日间条件下增加光能自养型细菌细胞的生长、细胞密度和/或生物质制备。

合适的糖类转运蛋白包括但不限于主要易化因子超家族(MFS)转运蛋白,磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白,ATP-结合盒(ABC)超家族转运蛋白,己糖糖类转运蛋白,二糖糖类转运蛋白和戊糖转运蛋白。

合适的己糖糖类转运蛋白的实例包括但不限于：半乳糖转运蛋白，例如galP转运蛋白,MFS转运蛋白,PTS转运蛋白和Escherichia coli的SyjfF/ytfR/ytfT/ytfQ ABC系统；葡萄糖转运蛋白，例如Escherichia coli的ptsI/ptsH/ptsG/crr PTS系统,晚期智人的GLUT1和GLUT3MFS转运蛋白和集胞藻属物种PCC6803的glcP MFS转运蛋白；果糖转运蛋白，例如晚期智人的GLUT5 MFS转运蛋白；甘露糖转运蛋白，例如Escherichia coli的manX/manY/manZ PTS系统和转运甘露糖的葡萄糖特异性的转运蛋白。

合适的二糖糖类转运蛋白的实例包括但不限于：蔗糖转运蛋白，例如枯草芽胞杆菌的sacP PTS系统和Escherichia coli EC3132的cscB MFS转运蛋白；乳糖转运蛋白，例如得自Escherichia coli的lacY MFS转运蛋白；乳果糖转运蛋白，例如得自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的LacE2MFS转运蛋白；麦芽糖转运蛋白，例如Escherichia coli的malE/malF/malG/malK ABC系统；海藻糖转运蛋白，例如Escherichia coli的TreB PTS蛋白质；以及纤维二糖转运蛋白，例如肺炎链球菌中的CelDPTS系统。

合适的戊糖转运蛋白的实例包括但不限于：木糖转运蛋白，例如E.colixylE MFS转运蛋白和Escherichia coli的xylF/xylG/xylH ABC系统；阿拉伯糖转运蛋白，例如Escherichia coli的araJ MFS转运蛋白；核糖转运蛋白，例如Escherichia coli的Rbs ABC转运蛋白系统；核酮糖转运蛋白；以及木酮糖转运蛋白，例如Leuconostoc kimchii的MFS转运蛋白(LKI_09995)。

此外，合适的糖类转运蛋白还包括但不限于与它们的内源形式发生突变或改变从而能够转运本发明公开的光能自养型细菌细胞使用的足量的糖类底物而不具有毒性的转运蛋白。

此外，本发明所述的糖类转运蛋白可以使用其同源蛋白质容易地替代。如本文所用，“同源蛋白质”是指具有以下多肽序列的蛋白质，其中所述的多肽序列与本说明或所引用的参考文献中所述的任意一种蛋白质具有至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％或至少99％的一致性。同源蛋白质保留了被公认为对于该蛋白质而言是保守的氨基酸残基。同源蛋白质可以具有被替代或发现为不同的氨基酸或插入或删除的氨基酸(多个)的非保守的氨基酸残基，只要它们不影响或对同源蛋白质的功能或活性不具有明显的作用即可。同源蛋白质具有与本说明书或所引用的参考文献中所述的任意一种蛋白质的功能或活性基本相同的功能或活性。同源蛋白质可以在自然界中发现，或者为其改造的突变体。

半乳糖转运蛋白

在某些实施方案中，本发明公开的分离的细菌细胞包含编码半乳糖转运蛋白的重组多核苷酸，其中所述的半乳糖转运蛋白能够将葡萄糖转移至细菌细胞中。半乳糖转运蛋白是通常将半乳糖转移至细胞中的完整膜蛋白。但是某些半乳糖转运蛋白(例如E.coli半乳糖转运蛋白galP和主要易化因子超家族(MFS)转运蛋白的其他成员)已经显示还能够将葡萄糖转运至细胞中(Flores N et alNat Biotech 14(5):620–623.1996)。与葡萄糖转运蛋白将葡萄糖转运至细胞中的水平相比，此类半乳糖转运蛋白显示将低水平的葡萄糖转运至光能自养型细菌细胞中，例如细长聚球藻。不希望被理论所束缚，认为化能异养型微生物有机体(例如E.coli)采用高百分率的葡萄糖摄取用于能量的消耗(例如燃烧成CO₂—通过制备的生物质与消耗的糖类来测量)，而光能自养型细菌细胞(例如细长聚球藻)通常通过光合作用生成大部分的能量，并由此仅采用葡萄糖摄取作为用于生物合成的碳骨架来源。不希望被理论所束缚，还认为将高水平的葡萄糖转运至细胞中对某些光能自养型细菌细胞(例如蓝细菌细长聚球藻)可以是具有毒性的。但是，不希望被理论所束缚，还认为转运低水平的葡萄糖是无毒的，并且可以被光能自养型细菌细胞(例如蓝细菌细长聚球藻)所采用，从而在日间周期的黑暗期间生长。

半乳糖转运蛋白可以是需要能量将糖类转运至细胞中的活性转运蛋白。可以通过ATP或者通过将离子共转运至其电化学梯度以下来提供能量。例如ATP-结合盒(ABC)转运蛋白利用ATP将糖类转运至光能自养型细菌细胞。备选地，半乳糖转运蛋白可以为利用促进扩散将糖类转运至细胞中的被动转运蛋白。在某些实施方案中，半乳糖转运蛋白为galP转运蛋白。galP转运蛋白为转运蛋白的主要易化因子超家族的家族成员。MTS转运蛋白为糖类-质子(H⁺)共转运蛋白，其利用电化学H⁺梯度，通过继发的主动转运至细胞中而逆向浓度梯度将糖类泵送至细菌细胞细胞质中。

合适的半乳糖转运系统的另一个实例为磷酸转移酶系统。磷酸转移酶系统(PTS)也称为PEP基团移位，是细菌细胞用于糖类摄取而采用的主动转运的不同方法，其中能量来源得自磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)。PTS系统称为多成分系统，其涉及质膜的酶和细胞质中的那些酶。这种转运的实例在E.coli中发现。PTS系统涉及将许多糖类转运至细菌细胞中，包括半乳糖,葡萄糖,甘露糖,果糖和纤维二糖。

因此，在某些实施方案中，半乳糖转运蛋白选自细菌galP转运蛋白,真核生物galP转运蛋白,真菌galP转运蛋白,哺乳动物galP转运蛋白,细菌主要易化因子超家族(MFS)转运蛋白,真核生物MFS转运蛋白,真菌MFS转运蛋白,哺乳动物MFS转运蛋白,细菌ATP-结合盒超家族(ABC)转运蛋白,真核生物ABC转运蛋白,真菌ABC转运蛋白,哺乳动物ABC转运蛋白,细菌磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白,真核生物PTS转运蛋白,真菌PTS转运蛋白,哺乳动物PTS转运蛋白和它们的同系物。在某些优选的实施方案中，半乳糖转运蛋白为E.coli galP转运蛋白或其同系物。在其他优选的实施方案中，半乳糖转运蛋白为与SEQ ID NO:2具有至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％一致性或100％一致性的氨基酸序列的E.coli galP转运蛋白。

在其他的实施方案中，编码半乳糖转运蛋白的重组多核苷酸稳定的整合至分离的细菌细胞的基因组中。稳定地将重组多核苷酸整合至细菌细胞基因组中的方法是本领域公知的，并且包括但不限于同源重组。

除了半乳糖转运蛋白以外，本发明公开的分离的细菌细胞还可以包含编码糖类转运蛋白的至少一个其他的重组多核苷酸，其中糖类转运蛋白的表达使得糖类被转运至光能自养型细菌细胞中。糖类转运蛋白是本领域公知的，并且包括但不限于：将转运己糖糖类的蛋白质，例如半乳糖,果糖,甘露糖等；转运二糖糖类的蛋白质，例如蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖,纤维二糖；以及转运戊糖糖类的蛋白质，例如木糖,阿拉伯糖,核糖,核酮糖,木酮糖等。

本发明公开的其他方面涉及由重组多核苷酸的表达而得到的改良的特征，其中所述的重组多核苷酸编码本发明公开的半乳糖转运蛋白。这些改良的特征包括但不限于在黑暗或日间条件下在葡萄糖上的生长增加。当与相同物种的相应的光能自养型细菌细胞相比时，这些特征得到改良，其中所述的物种不包含(即缺乏)编码半乳糖转运蛋白的重组多核苷酸。因此，在某些实施方案中，本发明公开的分离的细菌细胞与相应的光能自养型细菌细胞(缺乏编码本发明公开的半乳糖转运蛋白的重组多核苷酸)相比时，在黑暗或日间条件下在葡萄糖上具有增加的生长、细胞密度和/或生物质制备。在其他的实施方案中，在黑暗或日间条件下在葡萄糖上，分离的细菌细胞的生长、细胞密度和/或生物质制备与相应的光能自养型细菌细胞(缺乏编码本发明公开的半乳糖转运蛋白的重组多核苷酸)相比，增加至少5％,至少10％,至少15％,至少20％,至少25％,至少30％,至少35％,至少36％,至少37％,至少38％,至少39％,至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少100％,至少110％,至少120％,至少125％,至少130％,至少140％,至少150％,至少175％,至少200％,至少225％,至少250％,至少275％,至少300％,至少350％,至少400％,至少450％,至少500％,5％至500％之间的整数的任何百分率(例如6％、7％、8％等)或更高。

二糖类转运蛋白

在其他实施方案中，本发明公开的光能自养型物种的分离的细菌细胞包含编码二糖转运蛋白(例如蔗糖转运蛋白)的重组多核苷酸，其中二糖糖类转运蛋白的表达使得二糖糖类被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在二糖糖类上增加细菌细胞的生长。在一些实施方案中，细菌细胞还包含将二糖糖类转化成其相应的单糖所必需的蛋白质。用于将二糖糖类(例如蔗糖)转化成其相应的单糖所必需的蛋白质是本领域公知的。

二糖转运蛋白可以为蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白或纤维二糖转运蛋白。

蔗糖为蓝细菌(例如细长聚球藻)的天然代谢物，并且可以响应于渗透压而合成(Ducat DC et al.,(2012)Appl Environ Microbiol 78(8):2660-2668；and Suzuki E et al,(2010)Appl Environ Microbiol 76(10):3153-3159)。因此，在某些优选的实施方案中，二糖转运蛋白为蔗糖转运蛋白。蔗糖转运蛋白可以为E.coli CscB蔗糖转运蛋白,枯草芽孢杆菌SacP转运蛋白,欧洲油菜Sut1转运蛋白,野胡桃Sut1转运蛋白,拟南芥Suc6转运蛋白,拟南芥SUT4转运蛋白,黑腹果蝇Slc45-1转运蛋白,菊欧文氏菌ScrA转运蛋白和它们同系物。在某些优选的实施方案中，蔗糖转运蛋白为E.coli CscB蔗糖转运蛋白或其同系物。在其他优选的实施方案中，蔗糖转运蛋白为与SEQ ID NO:14具有至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％一致性或100％一致性的氨基酸序列的E.coliCscB蔗糖转运蛋白。

在其他的实施方案中，编码二糖转运蛋白的重组多核苷酸稳定的整合至分离的细菌细胞的基因组中。稳定地将重组多核苷酸整合至细菌细胞基因组中的方法是本领域公知的，并且包括但不限于同源重组。

除了二糖转运蛋白以外，本发明公开的分离的细菌细胞还可以包含编码糖类转运蛋白的至少一个其他的重组多核苷酸，其中糖类转运蛋白的表达使得糖类被转运至光能自养型细菌细胞中。糖类转运蛋白是本领域公知的，并且包括但不限于：将转运己糖糖类的蛋白质，例如半乳糖,果糖,甘露糖等；转运二糖糖类的蛋白质，例如蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖,纤维二糖；以及转运戊糖糖类的蛋白质，例如木糖,阿拉伯糖,核糖,核酮糖,木酮糖等。

本发明公开的其他方面涉及由重组多核苷酸的表达而得到的改良的特征，其中所述的重组多核苷酸编码本发明公开的二糖转运蛋白。这些改良的特征包括但不限于在黑暗或日间条件下在二糖(例如蔗糖)上的生长增加。当与相同物种的相应的光能自养型细菌细胞相比时，这些特征得到改良，其中所述的物种不包含(即缺乏)编码二糖转运蛋白的重组多核苷酸。因此，在某些实施方案中，本发明公开的分离的细菌细胞与相应的光能自养型细菌细胞(缺乏编码本发明公开的二糖转运蛋白的重组多核苷酸)相比时，在黑暗或日间条件下在二糖(例如蔗糖)上具有增加的生长、细胞密度和/或生物质制备。在其他的实施方案中，在黑暗或日间条件下在二糖(例如蔗糖)上，分离的细菌细胞的生长、细胞密度和/或生物质制备与相应的光能自养型细菌细胞(缺乏编码本发明公开的二糖转运蛋白的重组多核苷酸)相比，增加至少5％,至少10％,至少15％,至少20％,至少25％,至少30％,至少35％,至少36％,至少37％,至少38％,至少39％,至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少100％,至少110％,至少120％,至少125％,至少130％,至少140％,至少150％,至少175％,至少200％,至少225％,至少250％,至少275％,至少300％,至少350％,至少400％,至少450％,至少500％,5％至500％之间的整数的任何百分率(例如6％、7％、8％等)或更高。

木糖转运蛋白

木糖为可大量得到的半纤维素生物质的主要部分，并且可以为大宗化学品(例如生物燃料)的微生物制备提供廉价的可再生供料(Steen EJ et al.,(2010)Nature 463(7280):559-562)。但是，木糖并非为光能自养型细菌细胞(例如蓝细菌细长聚球藻)的已知代谢物。

因此，在其他的实施方案中，本发明公开的光能自养型物种的分离的细菌细胞包含编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸，其中木糖转运蛋白的表达使得木糖被转运至细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在木糖上增加细菌细胞的生长。

木糖转运蛋白可以为E.coli XylE木糖转运蛋白,E.coli xylF/xylG/xylHABC木糖转运蛋白,中间假丝酵母Gxf1转运蛋白,毕赤酵母Sut1转运蛋白,拟南芥At5g59250转运蛋白及它们的同系物。在其他优选的实施方案中，木糖转运蛋白为与SEQ ID NO:8具有至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％一致性或100％一致性的氨基酸序列的E.coli XylE木糖转运蛋白。

在其他的实施方案中，编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸稳定的整合至分离的细菌细胞的基因组中。稳定地将重组多核苷酸整合至细菌细胞基因组中的方法是本领域公知的，并且包括但不限于同源重组。

除了木糖转运蛋白以外，本发明公开的分离的细菌细胞还可以包含编码糖类转运蛋白的至少一个其他的重组多核苷酸，其中糖类转运蛋白的表达使得糖类被转运至光能自养型细菌细胞中。糖类转运蛋白是本领域公知的，并且包括但不限于：将转运己糖糖类的蛋白质，例如半乳糖,果糖,甘露糖等；转运二糖糖类的蛋白质，例如蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖,纤维二糖；以及转运戊糖糖类的蛋白质，例如木糖,阿拉伯糖,核糖,核酮糖,木酮糖等。

本发明公开的其他方面涉及由重组多核苷酸的表达而得到的改良的特征，其中所述的重组多核苷酸编码本发明公开的木糖转运蛋白。这些改良的特征包括但不限于在黑暗或日间条件下在木糖上的生长增加。当与相同物种的相应的光能自养型细菌细胞相比时，这些特征得到改良，其中所述的物种不包含(即缺乏)编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸。因此，在某些实施方案中，本发明公开的分离的细菌细胞与相应的光能自养型细菌细胞(缺乏编码本发明公开的木糖转运蛋白的重组多核苷酸)相比时，在黑暗或日间条件下在木糖上具有增加的生长、细胞密度和/或生物质制备。在其他的实施方案中，在黑暗或日间条件下在木糖上，分离的细菌细胞的生长、细胞密度和/或生物质制备与相应的光能自养型细菌细胞(缺乏编码本发明公开的二糖转运蛋白的重组多核苷酸)相比，增加至少5％,至少10％,至少15％,至少20％,至少25％,至少30％,至少35％,至少36％,至少37％,至少38％,至少39％,至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少100％,至少110％,至少120％,至少125％,至少130％,至少140％,至少150％,至少175％,至少200％,至少225％,至少250％,至少275％,至少300％,至少350％,至少400％,至少450％,至少500％,5％至500％之间的整数的任何百分率(例如6％、7％、8％等)或更高。

其他的蛋白质成分

在其他实施方案中，本发明公开的光能自养型物种的分离的细菌细胞(包含糖类转运蛋白的重组多核苷酸)可以进一步包含编码至少一个下游代谢酶的至少一个其他的重组多核苷酸，其中所述的代谢酶有利于将本公开的糖类引入至分离的细菌细胞的中心代谢中。编码至少一个下游代谢酶的至少一个其他的重组多核苷酸可以稳定地整合至分离的细菌细胞的基因组中。将重组多核苷酸稳定地整合至细菌细胞的基因组中的方法是本领域公知的，并且包括但不限于同源重组。

在某些实施方案中，至少一个下游代谢酶有利于将本发明公开的己糖糖类引入至本发明公开的分离的细菌细胞的中心代谢中，其中所述的细菌细胞包含编码己糖糖类转运蛋白的重组多核苷酸。合适的下游代谢半乳糖酶的实例包括但不限于半乳糖-1-差向异构酶,半乳糖激酶,半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶。合适的下游代谢葡萄糖酶的实例包括但不限于葡萄糖激酶。合适的下游代谢果糖酶的实例包括但不限于甘露糖(果糖)激酶和果糖激酶。合适的下游代谢甘露糖酶的实例包括但不限于甘露糖(果糖)激酶和甘露糖-6-磷酸异构酶。

在某些实施方案中，至少一种下游代谢酶有利于将本发明公开的二糖糖类引入至本发明公开的分离的细菌细胞的中心代谢中，其中所述的细菌细胞包含编码二糖糖类转运蛋白的重组多核苷酸。合适的下游代谢乳糖酶的实例包括但不限于β-半乳糖苷酶。合适的下游代谢麦芽糖酶的实例包括但不限于麦芽糖磷酸化酶和β-葡萄糖磷酸变位酶。合适的下游代谢海藻糖酶的实例包括但不限于得自枯草芽孢杆菌的treA，和得自乳酸乳球菌(L.lactis)的pgmB。合适的下游代谢纤维二糖酶的实例包括但不限于得自红褐肉座菌的Cel1a,Cel3a BGLI或BGLII。

在某些实施方案中，至少一种下游代谢酶有利于将蔗糖引入至本发明公开的分离的细菌细胞的中心代谢中，其中所述的细菌细胞包含编码蔗糖转运蛋白的重组多核苷酸。合适的下游代谢蔗糖酶的实例包括但不限于果糖激酶,蔗糖酶-6-磷酸水解酶和蔗糖转化酶。合适的果糖激酶的实例包括但不限于：E.coli cscK基因编码的CscK蛋白质,番茄Frk1果糖激酶蛋白质,番茄Frk2果糖激酶蛋白质,晚期智人KHK果糖激酶蛋白质,拟南芥FLN-1果糖激酶蛋白质,拟南芥和FLN-2果糖激酶蛋白质,鼠疫耶尔森氏菌91001 NagC1果糖激酶蛋白质,假结核耶尔森菌YajF果糖激酶蛋白质,和嗜盐碱单孢菌Suk果糖激酶蛋白质和它们的同系物。在某些优选的实施方案中，果糖激酶为E.coli cscK基因编码的CscK蛋白质或其同系物。在其他优选的实施方案中，果糖激酶为与SEQ ID NO:16具有至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％一致性或100％一致性的氨基酸序列的CscK蛋白质。

在某些实施方案中，至少一种下游代谢酶有利于将本发明公开的戊糖糖类引入至分离的细菌细胞的中心代谢中，其中所述的细菌细胞包含编码蔗糖转运蛋白的重组多核苷酸。合适的下游代谢阿拉伯糖酶的实例包括但不限于L-阿拉伯糖异构酶,L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶。合适的下游代谢核糖酶的实例包括但不限于得自E.coli的RbsK。

在某些实施方案中，至少一种下游代谢酶有利于将木糖引入至本发明公开的分离的细菌细胞的中心代谢中，其中所述的细菌细胞包含编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸。合适的下游代谢木糖酶的实例包括但不限于木糖异构酶和木酮糖激酶。本发明公开的分离的细菌细胞(包含编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸)可以进一步包含编码木糖异构酶的其他的重组多核苷酸和/或编码木酮糖激酶的其他的重组多核苷酸。备选地，本发明公开的分离的细菌细胞(包含编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸)可以进一步包含编码木糖异构酶和木酮糖激酶的其他的重组多核苷酸。优选地，本发明公开的可以在木糖上生长的、分离的细菌细胞包含编码木糖转运蛋白,木糖异构酶和木酮糖激酶的重组多核苷酸。在某些实施方案中，木糖异构酶为E.colixylA基因编码的XylA蛋白质,拟南芥AT5G57655木糖异构酶,黑曲霉XyrA木糖异构酶,红褐肉座菌Xyl1木糖异构酶和它们的同系物。在某些优选的实施方案中，木糖异构酶为由E.coli xylA基因编码的XylA蛋白质或其同系物。在其他优选的实施方案中，木糖异构酶为与SEQ IDNO:10具有至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％一致性或100％一致性的氨基酸序列的E.coli XylA蛋白质。

在其他实施方案中，木酮糖激酶为由E.coli xylB基因编码的XylB蛋白质,拟南芥XK-1木酮糖激酶,拟南芥XK-2木酮糖激酶,E.coli LynK木酮糖激酶,天蓝链霉菌SCO1170木酮糖激酶,绿脓杆菌MtlY木酮糖激酶,假结核耶尔森菌SgbK木酮糖激酶,E.coli AtlK木酮糖激酶或其同系物。在某些优选的实施方案中，木酮糖激酶为由E.colixylB基因编码的XylB蛋白质或其同系物。在其他优选的实施方案中，木酮糖激酶为与SEQ ID NO:12具有至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％一致性或100％一致性的氨基酸序列的E.coli XylB蛋白质。

此外，本发明公开的分离的细菌细胞可以被改造，从而表达所公开的糖类转运蛋白和下游代谢酶的组合。此类组合的非限定性实例包括：葡萄糖和果糖与代谢酶的转运；葡萄糖和木糖与代谢酶的转运；葡萄糖,木糖和阿拉伯糖与代谢酶的转运；葡萄糖,果糖,木糖和阿拉伯糖与代谢酶的转运；葡萄糖,果糖,甘露糖,半乳糖,木糖和阿拉伯糖与代谢酶的转运；以及蔗糖和乳糖与代谢酶的转运。

编码糖类转运蛋白的多核苷酸构建体

本发明公开的其他方面涉及包含多核苷酸序列的多核苷酸构建体，其中所述的多核苷酸序列编码一种或多种糖类转运蛋白和/或下游代谢酶。本发明公开的多核苷酸可以与启动子和可任选的控制序列可操作地连接，这样使题述蛋白质在合适条件下培养的、本发明公开的分离的细菌细胞中表达。启动子和控制序列对于本发明公开的各种分离的细菌细胞的光能自养型物种而言可以是特异性的。在一些实施方案中，表达载体包含多核苷酸构建体。用于设计和制备多核苷酸构建体和表达载体的方法是本领域那些技术人员所公知的。

如本文所用，术语“多核苷酸序列”、“多核苷酸的序列”及其变体通常为多聚脱氧核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(包含D-核糖)、任何其他类型的多核苷酸(其为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷)，以及包含非核苷酸骨架的其他聚合物，只要该聚合物包含在允许碱基配对和碱基堆叠的构造中包含核碱基(如同在DNA和RNA中发现的那些)即可。因此，这些术语包含已知类型的多核苷酸序列的修饰，例如一个或多个天然形成的核苷酸被类似物取代；核苷酸内修饰，例如使用不带电荷的连接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)、使用带负电荷的连接(例如磷硫酰、二硫代磷酸盐等)、以及使用带正电荷的连接(例如氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯等)的那些；包含悬垂部分的那些，例如蛋白质(包含核酸酶、毒素、抗生素、信号肽、聚-L-赖氨酸等)；使用插入剂的那些(例如吖啶、补骨脂素等)；以及包含螯合剂的那些(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)。如本文所用，用于核苷酸和多核苷酸的符号为由the IUPAC-IUB Commission of BiochemicalNomenclature建议的那些(Biochem.9:4022,1970)。

通过本领域那些普通技术人员已知的任何合适的方法来制备编码题述蛋白质的多核苷酸的序列，包括例如直接化学合成或克隆。就直接化学合成而言，多核苷酸聚合物的形成通常涉及向加长的核苷酸链的末端5'-羟基上依次加入3'-封端的和5'-封端的核苷酸单体，其中每次加入都受到加长链的末端5'-羟基对所加入单体的3'-位置的亲核攻击的影响，其中所述的单体通常为磷衍生物，例如磷酸三酯、亚磷酰胺等。这些方法是本领域那些普通技术人员已知的，并且在相关的教科书和文献中有所描述(例如Matteuci et al.(1980)Tet.Lett.521:719；美国专利No.4,500,707；5,436,327；和5,700,637)。此外，所需的序列可以通过使用合适的限制性酶分开DNA、使用凝胶电泳分离片段、此后通过本领域那些普通技术人员已知的技术(例如利用聚合酶链式反应)由凝胶回收所需的多核苷酸序列来由天然来源分离所需的序列(PCR；例如美国专利No.4,683,195)。

可以将编码所需的题述蛋白质的各多核苷酸序列整合至表达载体中。“表达载体”或“载体”是指这样的化合物和/或组合物，其转导、转化或感染本发明公开的分离的细菌细胞，由此使该细胞除了表达细胞内源的多核苷酸和/或蛋白质以外的或者以并非在细胞中天然形成的方式表达多核苷酸和/或蛋白质。表达载体包含将被分离的细菌细胞表达的多核苷酸序列(通常为RNA或DNA)。可任选地，表达载体还包含有助于使多核苷酸进入至分离的细菌细胞中的材料，例如病毒、脂质体、蛋白质包衣等。本发明公开考虑使用的表达载体包括可以向其中插入多核苷酸序列、以及任何优选的或所需的操纵元件的那些。此外，表达载体可以被转移至分离的细菌细胞中并在其中复制。一旦载体转移至或转化至合适的分离的细菌细胞中，则该载体可以独立于宿主基因组复制和发挥功能，或者在一些情况下可以自身整合至基因组中。表达载体的实例包括但不限于质粒、噬菌体颗粒或者简单地，潜在的基因插入物。优选的表达载体为质粒，特别是具有限制性位点的那些，其中这些质粒已经很好地记录于文件中并包含多核苷酸序列转录优选的或必需的操纵元件。此类质粒以及其他表达载体是本领域那些普通技术人员公知的。

引入单独的多核苷酸序列可以通过已知的方法来完成，包括例如使用限制性酶(例如BamHI,EcoRI,Hhal,Xhol,Xmal等)切割表达载体(例如质粒)中的特定位点。限制性酶制造出单链末端，其可以与具有或经合成而具有末端的多核苷酸序列退火，其中所述的末端具有与切割的表达载体的末端互补的序列。使用合适的酶(例如DNA连接酶)来进行退火。如本领域那些普通技术人员所理解的那样，表达载体和所需的多核苷酸序列通常使用相同的限制性酶切割，因此确保表达载体的末端和多核苷酸序列的末端彼此互补。此外，可以使用DNA连接体来促进多核苷酸序列连接到表达载体中。

此外，还可以通过使用本领域具有普通技术的那些人员已知的方法将一系列单独的多核苷酸序列结合起来(例如美国专利No.4,683,195)。例如可以在分开的PCR中最初生成各个所需的多核苷酸序列。此后，设计特定的引物，使得PCR产物的末端包含互补序列。将PCR产物被混合、变性和再退火时，所述的链在3'末端的重叠部分可以具有匹配的序列并且可以作为彼此的引物。该重叠部分通过DNA聚合酶的延伸制备出其中原始序列被“拼接”在一起的分子。按照这种方式，一系列单独的多核苷酸序列可以被“拼接”在一起，并随后同时转导致分离的细菌细胞中。因此，多个多核苷酸序列的每一个序列的表达都受到影响。

然后，将单独的多核苷酸序列或“拼接的”多核苷酸序列引入至表达载体中。对于将多核苷酸序列引入至表达载体中的工艺，本发明公开没有限定。本领域那些普通技术人员熟悉用于将多核苷酸序列引入至表达载体中的必需步骤。典型的表达载体包含所需的多核苷酸序列，其前方为一个或多个调节区域，以及核糖体结合位点，例如长度为3-9个核苷酸并且在E.coli中位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的核苷酸序列(参见Shine etal.(1975),Nature 254:34 and Steitz,Biological Regulation and Development:Gene Expression(ed.R.F.Goldberger),vol.1,p.349,1979,Plenum Publishing,NY)。

调节区域包括例如包含启动子和操纵子的那些区域。启动子与所需的多核苷酸序列可操作地连接，由此通过RNA聚合酶引发多核苷酸序列的转录。操纵子为与启动子相邻的多核苷酸序列，其包含蛋白质-结合结构域，其中阻抑蛋白可以结合。在阻抑蛋白缺乏下，通过启动子引发转录。当阻抑蛋白存在时，对操纵子的蛋白质-结合结构域具有特异性的阻抑蛋白与操纵子结合，从而抑制转录。按照这种方式，基于所用的具体的调节区域以及相应的阻抑蛋白的存在或缺乏来完成转录的控制。其实例包括乳糖启动子(当Lad阻抑蛋白与乳糖结合时，构造发生改变，从而阻止Lad阻抑蛋白与操纵子结合)和色氨酸启动子(当TrpR阻抑蛋白与色氨酸复合时，TrpR阻抑蛋白具有与操纵子结合的构造；在色氨酸缺乏下，TrpR阻抑蛋白具有不与操纵子结合的构造)。另一个实例为tac启动子(参见deBoer etal.(1983)Proc Natl Acad Sci USA,80:21-25)。如本领域那些普通技术人员所理解的那样，在本发明公开中可以使用这些和其他的表达载体，并且在这一方面，本发明公开没有限定。在某些实施方案中，启动子为lac-可调节的P_trc启动子。

尽管任何合适的表达载体都可以用于引入所需的序列，但是容易获得的表达载体包括但不限于：质粒，例如pAM2991,pSClOl,pBR322,pBBRlMCS-3,pUR,pEX,pMRlOO,pCR4,pBAD24,pUC19；和噬菌体，例如Ml 3噬菌体和λ噬菌体。当然，此类表达载体可以仅适用于光能自养型物种的特定的细菌细胞。但是，本领域的任一普通技术人员都可以通过常规试验容易地测定任何特定的表达载体是否适用于任何给定的分离的细菌细胞。例如可以将表达载体引入至分离的细菌细胞中，然后针对活力和载体中所包含的序列的表达进行监测。此外，可以参照相关的教科书和文献，其描述了表达载体以及它们对任何特定的分离的细菌细胞的适应性。

制备和培养分离的细菌细胞的方法

本发明公开的表达载体被引入或转移至本发明公开的光能自养型物种的分离的细菌细胞中。用于将表达载体转移至分离的细菌细胞中的此类方法是本领域那些普通技术人员所公知的。例如使用表达载体转化细菌细胞的一种方法涉及氯化钙处理，其中通过钙沉淀物诱导表达载体。此外，根据相似的过程还可以使用其他盐，例如磷酸钙。此外，可以使用电穿孔(即应用电流来增加细胞对多核苷酸序列的渗透性)来转染分离的细菌细胞。此外，多核苷酸序列的微注射提供了转染分离的细菌细胞的能力。此外，还可以使用其他手段，例如脂质复合物、脂质体和树状聚合物。本领域那些普通技术人员可以使用这些或其他的方法使用所需的序列来转染分离的细菌细胞。

为了识别转化的细菌细胞，多种方法可以利用。例如可以使用适当的稀释将潜在转化的细菌细胞的培养物分成单独的细胞，此后单独的生长，并针对所需多核苷酸序列的表达来进行测试。此外，当使用质粒时，常用的实践涉及基于抗微生物抗性进行细胞的选择，其中所述的抗微生物抗性是有意地包含在表达载体中的基因所赋予的，例如amp,kan,gpt,neo和hyg基因。

一旦分离的细菌细胞被表达载体转化，便允许分离的细菌细胞生长。本发明公开的方法包括培养分离的细菌细胞，使得细胞中的重组多核苷酸被表达。就光能自养型物种的细菌细胞而言，上述工艺需要在合适的培养基中培养所述的细胞。通常，细胞在合适的培养基中可以在大约25℃至大约35℃的温度下生长。本发明公开的优选的生长培养基为普通的商业制备培养基，例如BG-11培养基。此外，还可以使用其他定义的或合成的生长培养基，并且适用于使光能自养型物种的特定细菌细胞的生长的培养基是微生物学或细菌学领域一些技术人员已知的。

根据本公开的一些方面，培养基可以包含用于分离的细菌细胞的碳源。此外“碳源”通常是指适用于细菌细胞生长的碳源的底物或化合物。碳源可以为多种形式，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽等。这些物质包括例如：多种单糖，例如葡萄糖,半乳糖,木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖和乳糖；寡糖；多糖；生物质聚合物，例如纤维素和半纤维素；饱和的或不饱和的脂肪酸；琥珀酸酯；乳酸酯；醋酸酯；乙醇等；或它们的混合物。通过使用离子液体处理植物生物质而生成多种生物质聚合物。然后，可以将这种处理的生物质加入至培养物中，使得培养物包含多于一种的生物质聚合物。在本方面公开的优选的实施方案中，碳源为糖类底物，例如单糖或二糖。

除了合适的碳源，用于制备生物燃料的发酵培养基可以包含本领域那些技术人员已知的、适用于培养物生长并且促进制备脂肪酸衍生的分子所必需的酶途径的、合适的矿物、盐、辅助因子、缓冲剂和其他成分。可以在需氧或厌氧条件下进行反应，其中基于微生物有机体的需要，需氧、缺氧或厌氧条件是优选的。当分离的细菌细胞生长和/或繁殖时，制备大宗化学品(例如生物燃料)所必需的蛋白质被表达。

与细菌细胞的生长、细胞密度和生物质制备的增加有关的实施方案

如本文所公开，糖类转运蛋白的表达使得光能自养型细菌物种的细菌细胞与相同物种的野生型或非转化光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在糖类底物上的生长增加、细胞密度增加以及生物质的制备增加。

因此，本发明公开的某些实施方案涉及通过以下方式来增加细菌生长的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及在一定条件下使用糖类底物培养细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中，从而与相同物种(缺乏编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸)的相应的光能自养型细菌细胞的细胞生长相比，可以在黑暗或日间条件下在糖类上增加细胞的生长。在其他的实施方案中，在黑暗或日间条件下在糖类底物上表达糖类转运蛋白的细菌细胞的生长与相同物种(缺乏编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸)的相应的光能自养型细菌细胞相比，增加至少5％,至少10％,至少15％,至少20％,至少25％,至少30％,至少35％,至少36％,至少37％,至少38％,至少39％,至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少100％,至少110％,至少120％,至少125％,至少130％,至少140％,至少150％,至少175％,至少200％,至少225％,至少250％,至少275％,至少300％,至少350％,至少400％,至少450％,至少500％,5％至500％之间的整数的任何百分率(例如6％、7％、8％等)或更高。

其他实施方案涉及通过以下方式在黑暗或日间条件下增加细菌细胞密度的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及在一定条件下使用糖类底物培养细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中，从而与相同物种(缺乏编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸)的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在糖类上增加细胞的密度。在其他的实施方案中，在黑暗或日间条件下在糖类底物上表达糖类转运蛋白的细菌细胞的细胞密度与相同物种(缺乏编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸)的相应的光能自养型细菌细胞相比，增加至少5％,至少10％,至少15％,至少20％,至少25％,至少30％,至少35％,至少36％,至少37％,至少38％,至少39％,至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少100％,至少110％,至少120％,至少125％,至少130％,至少140％,至少150％,至少175％,至少200％,至少225％,至少250％,至少275％,至少300％,至少350％,至少400％,至少450％,至少500％,5％至500％之间的整数的任何百分率(例如6％、7％、8％等)或更高。

其他实施方案涉及通过以下方式在黑暗或日间条件下增加细菌生物质制备的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及在一定条件下使用糖类底物培养光能自养型细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中，从而与相同物种(缺乏编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸)的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下增加生物质的制备。在其他的实施方案中，在日间条件下在糖类底物上表达糖类转运蛋白的细菌细胞的生物质生产与相同物种(缺乏编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸)的相应的光能自养型细菌细胞相比，增加至少5％,至少10％,至少15％,至少20％,至少25％,至少30％,至少35％,至少36％,至少37％,至少38％,至少39％,至少40％,至少45％,至少50％,至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少100％,至少110％,至少120％,至少125％,至少130％,至少140％,至少150％,至少175％,至少200％,至少225％,至少250％,至少275％,至少300％,至少350％,至少400％,至少450％,至少500％,5％至500％之间的整数的任何百分率(例如6％、7％、8％等)或更高。

在其他实施方案中，重组多核苷酸编码糖类转运蛋白，其选自己糖糖类转运蛋白,半乳糖转运蛋白,葡萄糖转运蛋白,果糖转运蛋白,甘露糖转运蛋白,主要易化因子超家族(MFS)转运蛋白,磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白,戊糖转运蛋白,木糖转运蛋白,阿拉伯糖转运蛋白,核糖转运蛋白,核酮糖转运蛋白,木酮糖转运蛋白和它们的同系物。在其他的实施方案中，重组多核苷酸编码二糖糖类转运蛋白，其选自蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白,纤维二糖转运蛋白和它们的同系物。在其中细菌细胞包含二糖糖类转运蛋白的实施方案中，细菌细胞可以进一步包含将二糖糖类转化成其相应的单糖所必需的蛋白质。

在某些实施方案中，重组多核苷酸编码半乳糖转运蛋白。在其他的实施方案中，半乳糖转运蛋白选自细菌galP转运蛋白,E.coli galP转运蛋白,真核生物galP转运蛋白,真菌galP转运蛋白,哺乳动物galP转运蛋白,细菌MFS转运蛋白,真核生物MFS,真菌MFS,哺乳动物MFS,细菌PTS转运蛋白,真核生物PTS,真菌PTS,哺乳动物PTS和它们的同系物。优选地，半乳糖转运蛋白将葡萄糖转运至细菌细胞中。

在其他实施方案中，重组多核苷酸编码二糖类转运蛋白。在某些实施方案中，二糖类转运蛋白选自蔗糖转运蛋白,果糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白,纤维二糖转运蛋白和它们的同系物。优选地，二糖类转运蛋白为蔗糖转运蛋白。更优选地，蔗糖转运蛋白为E.coli CscB蔗糖转运蛋白。在其他的实施方案中，本发明公开的细菌细胞进一步包含编码本发明公开的果糖激酶蛋白质的至少一种其他的重组多核苷酸，其中所述的细菌细胞包含编码蔗糖转运蛋白的重组多核苷酸。

在其他的实施方案中，重组多核苷酸编码木糖转运蛋白。在某些优选的实施方案中，木糖转运蛋白为E.coli XylE木糖转运蛋白。在其他的实施方案中，本发明公开的细菌细胞(包含编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸)进一步包含编码本发明公开的木糖异构酶和/或木酮糖激酶蛋白质的重组多核苷酸。在某些实施方案中，木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶蛋白质由单一的重组多核苷酸编码。优选地，木糖异构酶为E.coli XylA木糖异构酶，而木酮糖激酶为E.coli XylB木酮糖激酶。

在其他的实施方案中，重组多核苷酸稳定地整合至细菌细胞的基因组中。将重组多核苷酸稳定地整合至细菌细胞基因组中的方法是本领域公知的，并且包括但不限于同源重组。

除了糖类转运蛋白以外，本发明公开的细菌细胞还可以包含编码第二糖类转运蛋白、第三糖类转运蛋白、第四糖类转运蛋白、第五糖类转运蛋白或者更低的糖类转运蛋白的至少一个其他的重组多核苷酸，其中各糖类转运蛋白的表达使得第二、第三、第四、第五或更多的糖类转运至细菌细胞中。第二、第三、第四、第五或更多的糖类转运蛋白可以转运与第一糖类转运蛋白相同类型的糖类，或者可以转运与第一糖类转运蛋白所转运的糖类不同的糖类。第二、第三、第四、第五或更多的糖类转运蛋白可以为所公开的糖类转运蛋白的任意一种。

本发明公开的方法利用了表达糖类转运蛋白的光能自养型物种的细菌细胞。这些细菌细胞可以利用外源糖类底物作为碳源，以便在昼夜循环的黑暗期间生长。此外，表达糖类转运蛋白的细菌细胞对外源糖类底物的利用与细菌细胞所实施的光合作用是相容的，并且会回报光合作用。按照这种方式，细菌细胞可以每天24小时连续生长。外源糖类底物作为培养细菌细胞的步骤的一部分提供，并且可以在培养基中提供。

在培养光能自养型物种的细菌细胞的过程中所加入的合适的糖类底物包括可以被细菌细胞所表达的糖类转运蛋白所转运的糖类。合适的糖类的实例包括但不限于：己糖，例如半乳糖,葡萄糖,果糖和甘露糖；以及戊糖，例如木糖,阿拉伯糖,核糖,核酮糖和木酮糖。合适的糖类的其他实例包括二糖糖类，例如蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖和纤维二糖。

此外，糖类底物还可以包括但不限于植物生物质,木质纤维素生物质,生物质聚合物,木质纤维素,纤维素,半纤维素,多糖或它们的混合物。此类组合物的来源包括但不限于草(例如柳枝稷,芒属),稻壳,甘蔗渣,棉花,黄麻纤维,桉树,大麻,亚麻,竹子,剑麻,麻焦,稻草,树叶,草屑,玉米秸,玉米穗芯,乾酒糟,豆科植物,高粱,甘蔗,甜菜糖浆,木屑,锯末和生物质农作物(例如海甘蓝)。此外，此类底物的来源可以是未精制的植物供料(例如离子液体处理的生物质)或精制的生物质聚合物(例如山毛榉材木聚糖或磷酸膨胀的纤维素)。

因此，在某些实施方案中，使用糖类培养光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的糖类选自己糖,半乳糖,葡萄糖,果糖,甘露糖,戊糖,木糖,阿拉伯糖,核糖,核酮糖和木酮糖。在其他的实施方案中，使用糖类培养细菌细胞，其中所述的糖类选自二糖糖类,蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖和纤维二糖。在某些优选的实施方案中，使用葡萄糖培养细菌细胞。

此外，本发明公开的光能自养型物种的细菌细胞可以通过随机诱变而突变，从而生成突变体文库，对该文库，可以针对在完全和延长缺乏光照的情况下可以利用糖类底物作为碳源的细菌突变体来进行筛选。随机诱变和筛选的方法是本领域公知的。随机诱变的方法的实例包括但不限于化学诱变和辐射诱变。

制备大宗化学品的方法

本发明公开的某些方面进一步涉及制备大宗化学品的光能自养型物种的分离的细菌细胞以及制备大宗化学品的方法。大宗化学品包括但不限于可以被所公开的分离的细菌细胞直接制备或作为副产物制备的任何可销售或可市场化的化学品。大宗化学品的实例包括但不限于生物燃料,聚合物,专用化学品和药物中间体。生物燃料包括但不限于：醇，例如乙醇,丙醇,异丙醇,丙酮,丁醇,异丁醇,2-甲基-1-丁醇,3-甲基-1-丁醇,苯基乙醇,脂肪醇和异戊烯醇；醛，例如乙酰基醛,丙醛,丁醛,异丁醛,2-甲基-1-丁醛,3-甲基-1-丁醛,苯乙醛和脂肪醛；烃，例如烷烃,烯烃,类异戊二烯,脂肪酸,蜡酯和乙酯；以及无机燃料，例如氢。聚合物包括但不限于2,3-丁二醇,1,3-丙二醇,1,4-丁二醇,羟基脂肪酸酯,聚羟基丁酸酯和异戊二烯。专用化学品包括但不限于类胡罗卜素，例如番茄红素,β-胡罗卜素等。药物中间体包括但不限于聚酮化合物,斯达汀,ω-3脂肪酸,类异戊二烯,类固醇好和红霉素(抗生素)。大宗化学品的其他实例包括但不限于乳酸酯,琥珀酸酯,谷氨酸酯,柠檬酸酯,苹果酸酯,3-羟基丙酸酯,抗坏血酸盐,山梨醇,氨基酸(亮氨酸,缬氨酸,异亮氨酸等)和羟基丁酸酯。

在一些实施方案中，本发明公开的分离的细菌细胞天然产生用于制备所需的大宗化学品的任意一种前体。编码所需的酶的这些基因对于分离的细菌细胞可以是异源的，或者这些基因对于分离的细菌细胞可以是内源的，但是与异源启动子和/或控制区域可操作地连接，其中所述的启动子和/或控制区域可以使基因(多个)在细菌细胞中更高地表达。例如在某些实施方案中，本发明公开的分离的细菌细胞可以经过修饰从而过表达与糖类消化有关的代谢基因，包括但不限于糖分解、磷酸戊糖和三羧酸循环基因。

在其他实施方案中，本发明公开的分离的细菌细胞不能天然产生所需的大宗化学品，因此包含能够表达用于制备所需的大宗化学品所必需的一个或多个基因的异源多核苷酸构建体。允许细菌细胞产生大宗化学品的此类异源基因的实例在PCT公开WO 2010/071581和美国专利申请公开No.US 2010/0068776和US 2011/0053216中有所描述。

此外，本发明公开的分离的细菌细胞可以被改造，从而通过表达例如得自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的丙酮酸脱羧酶(pdc)和醇脱氢酶(adhB)(或它们的同系物)而制备乙醇。此外，本发明公开的分离的细菌细胞还可以被改造，从而通过表达例如得自枯草芽孢杆菌的2-乙酰乳酸合成酶(alsS)，得自Escherichia coli的乙酰羟酸合成酶(ilvC)和二羟酸脱水酶(ilvD)，和得自乳酸链球菌(Lactococcus lactis)的2-酮异戊酸脱羧酶(kivd)而制备异丁醛。本发明公开的分离的细菌细胞可以进一步被改造，从而通过表达例如负责制备异丁醛的所有基因以及得自Escherichia coli的醇脱氢酶(yqhD)而制备异丁醇。此外，本发明公开的分离的细菌细胞可以被改造，从而通过表达例如得自乳酸链球菌的2-酮异戊酸脱羧酶(kivd)和得自Escherichia coli的醇脱氢酶(yqhD)而制备更高级的链醇，例如1-丙醇,1-丁醇,2-甲基-1-丁醇,3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇。

本发明公开还提供了分离通过本发明公开的方法而制备的大宗化学品。分离大宗化学品涉及将分离的细菌细胞和其部分的至少一部分或全部(大宗化学品通过其制备)与分离的大宗化学品分开。分离的大宗化学品可以不含或基本不含由细菌细胞和其部分的至少一部分或全部形成的杂质。分离的大宗化学品基本不含这些杂质，此时保留的杂质的量和性质不含感染大宗化学品的使用。

因此，在某些实施方案中，包含本发明公开的糖类转运蛋白的、光能自养型物种的分离的细菌细胞进一步包含细菌细胞制备至少一种大宗化学品所必需的蛋白质。在某些实施方案中，分离的细菌细胞制备至少一种大宗化学品。

本发明公开的其他方面涉及通过以下方式来制备至少一种大宗化学品的方法：提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；在一定条件下使用糖类底物培养光能自养型细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达并制备至少一种大宗化学品；以及收集至少一种大宗化学品，其中所述的重组多核苷酸的表达使得糖类底物被转运至细菌细胞中。在某些实施方案中，细菌细胞包含该细菌细胞制备至少一种大宗化学品所必需的蛋白质。示例性糖类转运蛋白和糖类底物在之前的部分中描述。在其中细菌细胞表达二糖糖类转运蛋白的实施方案中，细菌细胞可以进一步包含将二糖糖类转化成其相应的单糖所必需的蛋白质。在其他的实施方案中，重组多核苷酸稳定地整合至细菌细胞的基因组中。在其他实施方案中，细菌细胞进一步包含编码第二糖类转运蛋白、第三糖类转运蛋白、第四糖类转运蛋白、第五糖类转运蛋白或更多的糖类转运蛋白的至少一种其他的重组多核苷酸，其中各糖类转运蛋白的表达使得第二、第三、第四、第五或更高的糖类底物被转运至细菌细胞中。第二、第三、第四、第五或更高的糖类转运蛋白可以转运与第一糖类转运蛋白相同的糖类底物，或者可以转运与第一糖类转运蛋白所转运的糖类不同的糖类底物。第二、第三、第四、第五或更高的糖类转运蛋白可以为所公开的糖类转运蛋白的任意一种。

如本文所公开，糖类转运蛋白(例如半乳糖转运蛋白,二糖类转运蛋白或木糖转运蛋白)的表达可以使细菌细胞在日间条件下连续地制备大宗化学品。换言之，细菌细胞通过利用光合作用在白天过程中以及通过利用外源提供的糖类底物作为碳源在夜晚(即在黑暗中)过程中制备大宗化学品。这依次使得细菌细胞在一天24小时中连续制备至少一种大宗化学品。因此，在某些实施方案中，细菌细胞在日间条件下连续地制备至少一种大宗化学品。优选地。每天24小时连续地制备至少一种大宗化学品。

在其他的实施方案中，至少一种制备的大宗化学品选自聚合物,2,3-丁二醇,1,3-丙二醇,1,4-丁二醇,羟基脂肪酸酯,聚羟基丁酸酯,异戊二烯,乳酸酯,琥珀酸酯,谷氨酸酯,柠檬酸酯,苹果酸酯,3-羟基丙酸酯,抗坏血酸盐,山梨醇,氨基酸,羟基丁酸酯,类胡罗卜素,番茄红素,β-胡罗卜素,药物中间体,聚酮化合物,斯达汀,ω-3脂肪酸,类异戊二烯,类固醇,抗生素,红霉素,类异戊二烯,类固醇,红霉素,生物燃料和它们的组合。在其他的实施方案中，所制备的大宗化学品为生物燃料，其选自醇,乙醇,丙醇,异丙醇,丙酮,丁醇,异丁醇,2-甲基-1-丁醇,3-甲基-1-丁醇,苯基乙醇,脂肪醇,异戊烯醇,醛,乙酰基醛,丙醛,丁醛,异丁醛,2-甲基-1-丁醛,3-甲基-1-丁醛,苯乙醛,脂肪醛,烃,烷烃,烯烃,类异戊二烯,脂肪酸,蜡酯,乙酯,氢和它们的组合。

补充信息

除非另作说明，本发明公开的实施使用了分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术，它们都在本领域的技术范围内。此类技术在文献中进行了充分的说明，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)；Oligonucleotide Synthesis(Gait,ed.,1984)；Animal Cell Culture(Freshney,ed.,1987)；Handbook of Experimental Immunology(Weir&Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller&Calos,eds.,1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；CurrentProtocols in Immunology(Coligan et al.,eds.,1991)；The ImmunoassayHandbook(Wild ed.,Stockton Press NY,1994)；Bioconjugate Techniques(Hermanson,ed.,Academic Press,1996)；饥饿Methods of ImmunologicalAnalysis(Masseyeff,Albert,and Staines,eds.,Weinheim:VCH Verlagsgesellschaft mbH,1993)。

如果编码蛋白质的核酸序列与编码第二蛋白质的核酸序列具有相似的序列，则该蛋白质与第二蛋白质具有“同源性”或是“同源的”。备选地，如果2个蛋白质具有“相似的”氨基酸序列，则蛋白质与第二蛋白质具有同源性。因此，术语“同源的蛋白质”被定义为2个蛋白质具有相似的氨基酸序列。

如本文所用，当氨基酸序列具有至少大约30％,40％,50％60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的一致性时，这2个蛋白质(或蛋白质的区域)是基本同源的。类似地，当核酸序列具有至少大约30％,40％,50％60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％的一致性时，这2个多核苷酸(或多核苷酸的区域)是基本同源的。为了测定2个氨基酸序列或2个核苷酸序列的百分一致性，为了达到最佳比较的目的，对序列进行比对(例如为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一者或二者中引入空位，并且为了比较可以忽略非同源的序列)。然后，比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则在该位置处，分子是一致的(如本文所用，氨基酸或核酸“一致性”相当于氨基酸或核酸“同源性”)。2个序列之间的百分一致性为考虑了空位的数量和各空位的长度的、序列所共有的一致位置的数量的函数，需要引入该函数用于2个序列的最佳比对。

在2个序列之间的百分一致性为考虑了空位的数量和各空位的长度的、序列所共有的一致位置的数量的函数，需要引入该函数用于2个序列的最佳比对。为了进行序列比较，通常一个序列作为参照序列，测试序列与该序列比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法的程序参数。可以使用缺省的程序参数，或者可以指定备选的参数。序列比价算法随后根据程序参数来计算测试序列相对于参照序列的序列百分一致性。当比较2个序列的一致性时，序列不必是连续的，但是任何空位都带有罚分，其将降低总体的百分一致性。对于blastn而言，缺省的参数为空位开放罚分＝5，并且空位拓展罚分＝2。对于blastp而言，缺省参数为空位开放罚分＝11，并且空位扩增罚分＝1。

如本文所用，“比较窗”包含涉及任意一种数量的连续位置的节段，其中所述的任意一种数量选自20至600，通常为大约50至大约200，更通常为大约100至大约150，其中在2个序列最佳比对后，可以将序列与相同数量的连续位置的参照序列比较。用于比较的序列的比对方法是本领域公知的。可以使用已知的算法来实施用于比较的序列的最佳比对(例如Smith和Waterman的局部同源性算法,Adv Appl Math,2:482,1981；Needleman和Wunsch的同源性比对算法,J Mol Biol,48:443,1970；Pearson和Lipman的相似性检索方法,Proc NatlAcad Sci USA,85:2444,1988；计算机实施的以下这些算法FASTDB(Intelligenetics),BLAST(National Centerfor Biomedical Information),GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA(在Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group,Madison,WI)中),或者通过人工比对和肉眼检查)。

适用于测定序列百分一致性和序列百分相似性的算法的优选实例为FASTA算法(Pearson and Lipman,Proc Natl Acad Sci USA,85:2444,1988；and Pearson,Methods Enzymol,266:227-258,1996)。在用于计算百分一致性的DNA序列的FASTA比对中，所用的优选参数被优化：BL50矩阵15:-5,k-tuple＝2；邻接罚分＝40,优化＝28；空位罚分-12,空位长度罚分＝-2；以及宽度＝16。

适用于测定序列百分一致性和序列百分相似性的算法的另一个优选的实例为BLAST和BLAST 2.0算法(分别参见Altschul et al.,NucAcids Res,25:3389-3402,1977；和Altschul et al.,J Mol Biol,215:403-410,1990)。使用BLAST和BLAST 2.0，其参数如本文所述，从而测定本发明公开的核酸和蛋白质的序列百分一致性。用于进行ABLST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information)的网站公共获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字段(word)来识别高比值片段对(HSP)，其中当所述的字段与数据库序列中相同长度的字段比对时，其匹配或满足一些正值的阈值得分T。T称为相邻字段得分阈值。这些最初相邻字段的相似性区段(hit)作为引发搜索以找到包含该相似性区段的更长的HSP的种子。字段的相似性区段沿着每个序列的2个方向延伸，直至累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于匹配的残基对，给分；总是>0)和N(对于错配的残基，罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，在各方向上的字段的相似性区段的延伸被中止：当累积比对得分由其取得的最大值跌落数量X时；当累积得分由于一个或多个负评分残基比对的累积而达到0或0以下时；或者当达到序列的任一个末端时。BLAST算法参数W,T和X测定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字段长度(W)：11、期望值(E)：10、M＝5、N＝-4、和双链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字段长度：3、期望值(E)：10，以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoffand Henikoff,ProcNatlAcad Sci USA,89:10915,1989)比对(B)：50、期望值(E)：10、M＝5、N＝-4、和双链比较作为缺省值。

BLAST算法还对2个序列之间的相似性进行统计学分析(例如参见Karlin and Altschul,Proc Natl Acad Sci USA,90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小合计概率(P(N))，其提供了2条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如如果在测试核酸与参照核酸的比较中，最小合计概率小于大约0.2，更优选的是小于大约0.01或者最优选的是小于大约0.001，则认为核酸与参照序列相似。

有用的算法的另一个实例为PILEUP。PILEUP使用渐进性成对比对由一组相关的序列创建多个序列比对，以显示关系和序列百分一致性。此外，还绘制了树或树形图(dendogram)，其显示用于创建比对的聚类关系。PILEUP使用了渐进性比对方法的简化方法(Feng and Doolittle,J Mol Evol,35:351-360,1987)，其使用了与公开的方法类似的方法(Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-153,1989)。所述的程序可以比对多达300个序列，每个序列的最大长度为5000核苷酸或氨基酸。多个比对过程开始于2个最相似序列的成对比对，从而产生2个比对序列的聚类。然后，将该聚类与下一个最相关的序列或比对序列的聚类比对。通过简单地延伸2个单独序列的成对比对来比对序列的2个聚类。通过一系列渐进性成对比对而取得最终的比对。通过指定特定的序列以及序列比较区域的氨基酸或核苷酸坐标并通过指定程序参数来运行程序。使用PILEUP，使用以下参数将参照序列与其他测试序列比较，从而测定序列的百分一致性关系：缺省空位加权(3.00)、缺省空位长度加权(0.10)和加权的末端空位。PILEUP可以得自可以得自GCG序列分析软件包，例如7.0版(Devereaux et al.,Nuc Acids Res,12:387-395,1984)。

适用于多个DNA和氨基酸序列比对的算法的另一个优选实例为CLUSTALW程序(Thompson et al.,Nucl Acids.Res,22:4673-4680,1994)。ClustalW在多组序列之间实施多个成对比较，并基于同源性将它们集合至多个比对中。空位开放罚分和空位延伸罚分分别为10和0.05。对于氨基酸比对而言，BLOSUM算法可以用作蛋白质加权矩阵(Henikoff andHenikoff,Proc NatlAcad Sci USA,89:10915-10919,1992)。

本发明公开的多核苷酸进一步包含这样的多核苷酸，其编码了表4中基因所编码的多肽的保守修饰的变体以及SEQS ID NO:1-16的核酸和氨基酸序列。如本文所用，“保守修饰的变体”包含使用化学相似的氨基酸取代氨基酸的单个突变。提供功能相似的氨基酸的保守取代的表是本领域公知的。此类保守修饰的变体除了本发明公开的多态性变体、种间类似物和等位基因之外，并且不排除多态性变体、种间类似物和等位基因。以下8组包含用于彼此保守取代的氨基酸。1.丙氨酸(A),甘氨酸(G)；2.天冬氨酸(D),谷氨酸(E)；3.天冬酰氨(N),谷氨酰胺(Q)；4.精氨酸(R),赖氨酸(K)；5.异亮氨酸(I),亮氨酸(L),蛋氨酸(M),缬氨酸(V)；6.苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W)；7.丝氨酸(S),苏氨酸(T)；和8.半胱氨酸(C),蛋氨酸(M)。

当术语“衍生自”或“由……衍生”用于指核酸或蛋白质时，其是指该序列与所关注的有机体的序列是一致的或基本一致的。

当术语“相应的”用于指蓝细菌时，其是指与所关注的细菌同属且同种的的细菌。例如关于包含编码半乳糖转运蛋白的重组多核苷酸的细长聚球藻，“相应的细菌”为缺乏重组多核苷酸(例如缺乏重组多核苷酸或者不表达半乳糖转运蛋白)的细长聚球藻(野生型、亲代或其他相当的)。

当术语“降低”、“减少”和“减低”用于指生物功能(例如酶活性、化合物的制备、蛋白质的表达等)时，其是指功能可测量地减小优选为至少10％、更优选为至少50％、还要更优选为至少75％并且最优选为至少90％。根据功能，减低可以为10％至100％。术语“基本减低”等是指减低至少50％,75％,90％,95％或100％。

当术语“增加”、“提高”和“升高”用于指生物功能(例如酶活性、化合物的制备、蛋白质的表达等)时，其是指功能可测量地增大优选为至少10％、更优选为至少50％、还要更优选为至少75％并且最优选为至少90％。根据功能，升高可以为10％至100％；或者至少10倍、100倍或1000倍直至100倍、1000倍或10000倍更或高。术语“基本升高”等是指升高至少50％,75％,90％,95％或100％。

如本文所用，术语“分离的”和“纯化的”是指与至少一种成分分离的材料，其中所述的成分与所分离的材料是天然相关的(即与原始环境分离)。当术语“分离的”用于指生物合成制备的化学品时，其是指已经与细菌(生产化学品)的培养基分离的化学品。因此，分离的化学品不含外来的或不需要的化合物(例如底物分子、细菌成分等)。

如本文所用，除非另作说明，单数形式“a”、“an”和“the”包含复数参照物。例如“a”半乳糖转运蛋白包含一种或多种半乳糖转运蛋白。

如本文所用，短语“包含”是无限度的，表明此类实施方案可以包含其他的元素。相反，短语“由......组成”是封闭性的，表明此类实施方案不包含其他的元素(除了痕量杂质以外)。短语“基本由......组成”是部分封闭性的，表明此类实施方案可以进一步包含不会大幅改变此类实施方案的基本特征的元素。应该理解的是本发明中以“包含”来描述的方面和实施方案包含“由这些方面和实施方案组成”和/或“基本上由这些方面和实施方案组成”。

应该理解的是尽管连同优选的实施方案描述了本发明所述的组合物和方面，但是之前的描述意图说明并且并未限定本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书来定义。在由所附的权利要求定义的范围内的其他方面、优点和修改对于本发明公开所属领域的那些技术人员而言是显而易见的。

以下实施例仅是示例性的，无意于以任何方式限定本发明公开的范围。

实施例

实施例1：葡萄糖转运蛋白在细长聚球藻PCC7942中的表达

光能自养型细菌细胞(例如蓝细菌)可以作为将可再生的太阳能转化成大宗化学品(包括生物燃料)的平台来研发。为了取得这种转化，事先对模型蓝细菌(细长聚球藻PCC7942)进行改造，以制备异丁醛和异丁醇(参见PCT公开WO 2010/071851)。但是，细长聚球藻为专性光能自养型生物，其严格依赖于光合作用衍生的能量的生成而用于生长，因此不能在缺乏光能的情况下形成生物质或产物。为了使任何蓝细菌燃料的转化具有经济竞争性，必须由太阳提供光能，因此每天仅可利用大约9至16个小时。为了改善这种情况，研发3种细长聚球藻菌株，使每种菌株在夜晚时间(即昼夜循环的黑暗时期)分别在葡萄糖、蔗糖和木糖上生长。为了在夜晚时间利用葡萄糖、蔗糖和木糖，将葡萄糖-、蔗糖-和木糖-特异性的糖类转运蛋白均引入至细长聚球藻PCC7942中。

材料和方法

试剂。糖化物葡萄糖,果糖,蔗糖和木糖得自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。IPTG得自Fisher Scientific(Hanover Park,IL)。Phusion聚合酶购自NEB(Ipswich,MA)。KOD聚合酶购自EMD4Biosciences(San Diego,CA)。庆大霉素购自MPBiomedicals(SantaAna,CA)。寡核苷酸由Integrated DNATechnologies,Inc.(SanDiego,CA)合成。

培养条件。使所有的蓝细菌菌株在30℃下在BG-11培养基中生长(RippkaR,et al.,(1979)Journal ofGeneralMicrobiology 111(1):1-61)。将培养物保持在维度为56cm x 36cm x 76cm的Custom箱中。该箱装配有得自Verilux的2CFL自然光谱灯泡(评估为26瓦)。光的荧光速率为25μEs^-1m-²。摇床保持摇动(设定在100rpm下)。用于日间试验的预培养物在日间光照条件下保持至少72小时，以确保合适的昼夜节律。生长检验在30mL试管中使用总体积为10mL培养物。通过测量OD₇₃₀来监测细胞生长。

对于使用细长聚球藻菌株的生长检验而言，将指数期细胞在包含20μg/mL奇霉素和0.1mM IPTG的10mL BG-11培养基中稀释至OD₇₃₀为0.2。野生型检验省略奇霉素。

为了测试污染检验，使用亮视野显微镜。在Petroff-Hausser CountingChamber载玻片内计数细胞，以确保始终是恒定体积的。随机选择计数室，并记录绿色细胞与无色细胞。对于所有所报告的结果，绿色细胞高于99％的培养基(其中n≥500)。

质粒构建。在实施例1中使用的所有细长聚球藻菌株和质粒都在表1中描述。所用的所有引物均列于表2中。

表1.菌株、质粒和基因型

菌株	相关基因型
		AL257	细长聚球藻PCC7942(野生型)
AL358	Ptrc:glcP整合在NSI处
		AL360	Ptrc:GLUT1整合在NSI处
AL361	Ptrc:galP整合在NSI处
		AL434	Ptrc:xylE-xylA-xylB整合在NSI处
AL504	Ptrc:gfp整合在NSI处
		AL505	Ptrc:galP-gfp整合在NSI处
AL535	与AL361相同,除了ΔglgC
		AL536	与野生型相同,除了ΔglgC
AL1030	Ptrc:cscK-cscB整合在NSI处
		AL1067	Ptrc:xylE整合在NSI处

		质粒	野生型

pAM2991	NSI靶向载体；Ptrc
		pBBR1MCS-5	gm^r；广宿主载体
pSA69	P15Aori；amp^r；P_LlacO1::alsS-ilvC-ilvD
		pAL18	与pAM2991相同,除了Ptrc:GLUT1；lacI^q
pAL40	与pAM2991相同,除了Ptrc:galP；lacI^q
		pAL46	与pAM2991相同,除了Ptrc:glcP；lacI^q
pAL61	与pAM2991相同,除了Ptrc:gfp；lacI^q
		pAL63	与pAM2991相同,除了Ptrc:gfp-galP；lacI^q
pAL65	与pAM2991相同,除了Ptrc:xylE；lacI^q
		pAL70	与pAM2991相同,除了Ptrc:xylE-xylA-xylB；lacI^q
pAL82	Glg敲除载体；gm^r
		pAL288	与pAM2991相同,除了Ptrc:cscK-cscB；lacI^q

表2.引物

galP,xylE,xylA,和xylB基因分离自E.coli基因组DNA(gDNA)。glcP基因分离自集胞藻属菌种PCC6803 gDNA(ATCC)。cscB和cscK基因分离自E.coli ATCC700927(ATCC)gDNA。glut1基因分离自人类红细胞。各基因的GeneID编号和核苷酸序列列于表3中。

表3.基因和来源

基因名称	来源	GeneID
			galP	E.coli	947434
glcP	集胞藻属菌种PCC6803	952710
			glut1	晚期智人	6513
xylE	E.coli	948529
			xylA	E.coli	948141
xylB	E.coli	948133
			cscB	E.coli ATCC700927	958132
cscK	E.coli ATCC700927	956713

使用引物MC127和MC128扩增galP基因，使用MfeI和BgIII消化，然后与使用EcoRI和BamHI消化的pAM 2991连接，从而创建pAL40。由JM05和JM06扩增xylE基因，使用EcoRI和BamHI消化，并与使用相同的酶消化的pAM2991连接，从而创建pAL65。使用JM07和JM08扩增xylAB基因，并使用AvrII和BamHI消化，然后与类似消化的pAL65连接，从而创建pAL70。使用MC170和MC171扩增glcP基因，使用BamHI和EcoRI消化，并与类似消化的pAM 2991连接，从而创建pAL46。使用JM55和JM56扩增cscB和cscK基因，使用EcoRI和BamHI消化，并与类似消化的pAM 2991连接，从而创建pAL289。

构建pAL82质粒，从而删除得自细长聚球藻染色体的glgC基因(图3)。用于同源重组的区域(590,459-593,751)使用引物GR005和GR006由细长聚球藻DNA扩增。使用XhoI和MluI消化产物，并与相同的酶消化的pSA69连接(Atsumi S et al.,(2008)Nature 451(7174):86-89)，从而创建pGR01。为了克隆庆大霉素抗性基因，使用pBBR1MCS-5(KovachMe et al.,(1994)Biotechniques 16(5):800-802)作为PCR模板，并使用引物IM573和IM574。使用SalI和NheI消化PCR产物，并与使用相同的酶切割的pGR01连接，从而创建pAL82。

细长聚球藻的转化。按照之前所述实施细长聚球藻的转化(Golden S etal.,(1987)Methods Enzymol 153:215-246)。通过将克隆转移至新鲜的选择性平板上多次分离菌株。通过PCR证明正确的重组，从而证实靶向基因整合至染色体的NSI处。所用的并生成的菌株列于表1中。

共聚焦显微镜。使用Olympus_America FV1000系统取得所有的共聚焦显微镜图像。使用488nm激光用于激发所有的突变体。发射滤波器设定为500nm-600nm。针孔光圈设定为100μm。激光％设定为11.5％。将细胞放置在玻璃底盘上用于成像。

平板读取器的GFP检验。使用Microtek Synergy H1平板读取器(BioTek)实施所有的GFP检验。仅BG-11培养基用作空白，激发和发射波长分别设定为485nm和528nm。

葡萄糖和木糖的消耗检验。通过装配有Aminex HPX-87柱(Bio-Rad)和折射率检测器的HighPerformance Liquid Chromatograph(Shimadzu)来测量培养基中葡萄糖和木糖的浓度。将样品离心，并使用FiltrEX96孔过滤板过滤(Corning)。

结果

在葡萄糖上生长。我们测定通过在细长聚球藻细胞中诱导糖类的有效摄取而使得细长聚球藻具有在黑暗条件下生长的能力。在细长聚球藻中，葡萄糖为葡萄糖以糖原形式作为普通的能量储存分子(Smith AJ(1983)AnnMicrobiol(Paris)134B(1):93-113)。在代谢的整个光照期间，在细胞内形成糖原，然后该糖原用作能源从而在整个黑暗期间保持必需的化学过程(Smith AJ(1983)Ann Microbiol(Paris)134B(1):93-113)。因此，用于断裂内源葡萄糖的所有必需的基因都应该存在于细长聚球藻中。

为了改造细长聚球藻的异养行为，我们使用编码糖类转运蛋白的异源基因试图赋予细长聚球藻以异养行为。我们将得自多种有机体的3种葡萄糖转运蛋白单独整合至细长聚球藻细胞染色体(图1)中。3种转运蛋白为得自集胞藻属菌种PCC6803(Zhang CC et al.,(1989)Mol Microbiol3(9):1221-122)的GlcP转运蛋白，得自Escherichia coli(Hernandez-MontalvoV et al.,(2003)Biotechnol Bioeng 83(6):687-694)的GalP转运蛋白，以及得自人类红细胞的Glut1转运蛋白(Mueckler M et al.,(1985)Science229(4717):941-945)。各基因均被整合至细长聚球藻染色体的中性位点(NSI)处，处于异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子Ptrc的控制之下(图1A)。在葡萄糖存在和缺乏下培养时，在日间照明条件下测量所得的3种菌株和野生型对照的生长(图1B和1C)。

galP菌株。为了放大在细胞外葡萄糖上能够生长和不能生长的菌株之间的生长差异，设定条件，从而限定CO₂的量和光强度(25μE/m²/s)。在光照循环(48-60h)中，基于OD₇₃₀，野生型细长聚球藻的基线生长速率为0.161天^-1，并且在黑暗循环中不生长(图1B和表4)。当野生型对照在光照存在下使用葡萄糖培养时，以更高的速率生长(0.204天^-1)，而在黑暗循环中尚未展示生长(图1B)。所有时期的生长速率报告于表4中。在显微镜分析下(1,000X)，在葡萄糖存在或缺乏下，细胞的形态学未变化，例如所生长的细胞生长的尺寸和形状。

在表4中，在整个日间条件下由OD₇₃₀来计算生长速率。所有生长速率以天^-1报告。在表中，“±”表示标准偏差。经计算低于0.050天^-1的任何生长速率都被认为是无意义的，并且在表中以不可检测表示(nd)。在表中，“L”相当于光照条件；“D”相当于黑暗条件；“OE”相当于过表达；“KO”相当于删除；“Xyl”相当于木糖；“Glc”相当于葡萄糖；“Suc”相当于蔗糖；以及“n/a”相当于未分析的。

表4.在各种底物上的生长速率

当在葡萄糖存在下培养时显示出生长一贯地增加的唯一的重组细长聚球藻菌株为表达GalP转运蛋白的菌株(图1B)

与野生型对照相比，除了生长增加，表达GalP转运蛋白的菌株(galP菌株)显示即使在黑暗循环(OD₇₃₀为大约1)下也生长，其中野生型对照显示未生长(OD₇₃₀低于0.4)(图1B和1C)。当在光照条件下使用葡萄糖培养时galP菌株的生长速率为0.540天^-1，而在黑暗条件下使用葡萄糖培养时的生长速率为0.199天^-1。在葡萄糖存在下，在光照条件下，galP菌株的生长速率是在相同条件(0.204天^-1)下生长的野生型对照的164％以上。但是，使用HPLC分析未检测到galP菌株在96小时后对葡萄糖的消耗。生物质的干重在试验过程中增加仅0.1g/L。

glcP和glut1菌株。包含GlcP转运蛋白的菌株在第一光照循环中显示良好的生长，但是在随后的循环中生长停滞(图1C)。该结果符合之前的结果(Zhang C-C et al.,(1998)FEMS Microbiol Lett 161(2):285-292；andStebegg R et al.,(2012)JBacteriol 194(17):4601-4607)。此外，包含Glut1转运蛋白的菌株展示出生长受损(图1C)。通过显微镜分析证明所有生长检验都不含污染。上述结果证明一旦葡萄糖被转运至细胞中，细长聚球藻便可以代谢葡萄糖用于生长。

galP-ΔglgC菌株。由于细长聚球藻天然储存糖原形式的固定碳(StanierR(1975)Biochem Soc Trans 3(3):352-359)，所以我们假设一部分转运的葡萄糖被捕获并储存，而非贡献于细胞的生长。为了测试这种可能性，我们删除了galP菌株(galP-ΔglgC菌株)和野生型对照中用于形成糖原所必需的基因glgC(图2)。我们检验这些菌株以测试生长行为的任何变化。包含glgC删除的galP-ΔglgC菌株和野生型对照在葡萄糖存在下不能显著生长(图1D)。

galP表达的特征。为了表征galP在galP菌株中的表达，将gfp融合至galP的3’末端(表示为galP-gfp)。使用荧光共聚焦显微镜检查单独表达galP-gfp或gfp的菌株(图3A和3B)。表达galP-gfp的菌株显示荧光信号仅存在于细胞膜上(图3B)，而表达gfp的对照菌株显示荧光信号在整个细胞质中(图3A)，并且野生型对照菌株未显示荧光信号(图3A)。这些结果表明GalP转运蛋白成功地定位于细长聚球藻的膜上，因此允许有效地将葡萄糖转运至细胞中。

此外，使用多种浓度的IPTG培养galP和galP-gfp菌株，并且在连续的光照条件下测量它们的生长(图3C)。IPTG浓度的改变导致培养物生长的改变。galP菌株也是如此。但是，通过加入任何量的IPTG(至多达1mM)未改变野生型对照的生长。由使用0.1mM IPTG诱导得到最佳生长，而使用1mM诱导导致细胞生长稍微降低(图3C)。

此外，在整个生长检验中还测量了galP-gfp菌株的培养物的荧光强度(图3D)。使用过程浓度的IPTG培养的细胞来测量galP-gfp菌株的GFP荧光强度的时间过程和galP-gfp菌株的OD₇₃₀(图3D)。标准的荧光强度(RFU/OD₇₃₀)表明使用1mM IPTG和0.1mM IPTG进行培养得到GalP-GFP融合蛋白的相似水平的表达，并且在该构建体中，使用0.1mMIPTG使得自P_trc启动子的表达达到饱和。

此外，我们还表征了重碳酸盐对异养生长的影响(图3E)。本试验用于测定galP菌株的异养生长是否仅是由于检验条件所引入的碳限定而是可测量的。当galP菌株在连续光照条件下，在重碳酸盐缺乏或者在多种浓度的重碳酸盐存在下培养时，显示出相似的生长(图3E)。但是，更高浓度的重碳酸盐稍微增强了野生型对照的生长(图3E)。野生型对照的生长速率由未使用重碳酸盐培养时的0.259天^-1增加至使用20mM重碳酸盐的0.398天^-1，而galP菌株的生长速率在重碳酸盐存在下无变化(～0.636天^-1)。这些结果表明在5g/L葡萄糖存在下，碳固定并非galP菌株生长的限速步骤。但是，在5g/L葡萄糖存在下，碳固定显示对于野生型对照而言限制了生长。

在蔗糖上生长。蔗糖为细长聚球藻的天然代谢物，并且显示其合成响应于渗透压(Ducat DC et al.,(2012)Appl Environ Microbiol 78(8):2660-2668；and Suzuki E et al,(2010)Appl Environ Microbiol 76(10):3153-3159)。

与未使用蔗糖培养野生型细长聚球藻时在光照条件下的生长速率(0.161天^-1)和在黑暗条件下的未生长相比，当野生型细长聚球藻在蔗糖存在下培养时，其生长速率增加，在光照条件下为0.310天_- ¹，在黑暗条件下为0.087天^-1(图4C)。该结果证明细长聚球藻可微弱地渗透蔗糖，并且可以利用蔗糖为碳源。

为了改善使用蔗糖的细长聚球藻的生长速率，将E.coli ATCC700927蔗糖转运蛋白基因cscB和E.coli ATCC700927果糖激酶基因cscK整合至细长聚球藻基因组中(图4A)。该基因已经显示在细长聚球藻细胞中合适地表达。构建该菌株，从而更完全地允许蔗糖通过CscB转运蛋白进入至细胞中，并通过内源蔗糖的蔗糖转化酶(由SYNPCC7942_0397编码)水解成葡萄糖和果糖。果糖激酶基因cscK过表达，从而使果糖-6-磷酸(其为氧化磷酸戊糖途径中的中心代谢物)形成最大碳流通(图4B)。

该结果显示当cscK-cscB菌株在5g/L蔗糖存在下培养时，在光照条件下具有增加的生长速率(0.376天^-1)(图4C)。这表示与野生型对照的生长速率(0.310天^-1)相比，增加大约21.3％。此外，结果还显示当cscK-cscB菌株在5g/L蔗糖存在下培养时，在黑暗条件下具有增加的生长速率(0.128天^-1)(图4C)。这表示与野生型对照的生长速率(0.087天^-1)相比，增加大约47.1％。尽管蔗糖增加了野生型对照的生长，但是蔗糖对生长的影响在cscK-cscB菌株中比在野生型对照中更大。

在木糖上生长。木糖为可大量得到的半纤维素生物质的主要部分，并且可以为用于生物燃料和化学品的微生物制备的、有前途的廉价可再生供料(Steen EJ et al.,(2010)Nature 463(7280):559-562)。但是，木糖并非为蓝细菌(例如细长聚球藻)的已知代谢物(图5)。

为了改造细长聚球藻以利用木糖，将编码木糖转运蛋白的E.coli xylE基因整合至细长聚球藻中(图5A)。但是，当该菌株在日间条件下在木糖存在下培养时，木糖转运蛋白的表达不会改良该菌株的生长(图5C)。

基于这些结果，我们假设下游木糖代谢酶由允许木糖转化成中心代谢物的细长聚球藻中缺失。基于细长聚球藻基因组序列分析，我们测定细长聚球藻基因组不包含编码木糖异构酶和木酮糖激酶的基因。木糖异构酶和木酮糖激酶负责木糖降解的头2步(图5B)。

因此，我们改造细长聚球藻，从而表达编码木糖异构酶和木酮糖激酶的E.coli基因(分别为xylA和xylB)。为了将木糖异构酶和木酮糖激酶引入至细长聚球藻中，将包含E.coli xylE,xylA和xylB基因的操纵子整合至细长聚球藻基因组中，从而生成xylEAB菌株(图5A)。

这种xylEAB菌株显示在日间条件下异养生长(图5B)。此外，当使用木糖培养该菌株时，xylE-xylA-xylB操纵子还允许在黑暗条件下异养生长，而野生型对照显示当在黑暗条件下使用木糖培养时显示不生长(图5B)。当xylEAB菌株在木糖存在下培养时，该菌株在光照条件下的生长速率为0.471天^-1，在黑暗条件下为0.291天^-1。这与野生型对照相反，野生型对照在相同的各条件下的生长速率为0.350天^-1和0.062天^-1。因此，xylEAB菌株在光照条件下具有生长速率，该生长速率比在相同条件下生长的野生型对照的生长速率高大约34.6％。此外，xylEAB菌株在黑暗条件下具有生长速率，该生长速率比在相同条件下生长的野生型对照的生长速率高大约369％。通过HPLC测量的木糖消耗速率在96h生长期间平均为大约10mgh^-1。

有趣地，当在各自的糖类存在下培养时，在光照条件下，galP菌株的生长比xylEAB菌株的生长更快(图1B和5C)。但是，当在各自的糖类存在下培养时，在黑暗条件下，xylEAB菌株的生长比galP菌株的生长更快(图1B和5C)。

实施例2：糖类转运蛋白在细长聚球藻PCC7942中的表达

如实施例1中所述，将用于备选的单糖和二糖糖类的糖类转运蛋白克隆至细长聚球藻PCC7942的中性位点I(NSI)中，处于P_TRC启动子的控制之下。克隆的糖类转运蛋白包括但不限于：

葡萄糖转运蛋白–Escherichia coli的ptsI/ptsH/ptsG/crr PTS系统，以及晚期智人的GLUT3 MFS转运蛋白。

果糖转运蛋白–晚期智人的GLUT5 MFS转运蛋白。

甘露糖转运蛋白–Escherichia coli的manX/manY/manZ PTS系统。此外，还测试葡萄糖特异性转运蛋白对甘露糖的摄取。

半乳糖转运蛋白–Escherichia coli的yjfF/ytfR/ytfT/ytfQ ABC系统。

木糖转运蛋白–Escherichia coli的xylF/xylG/xylH ABC系统。

阿拉伯糖–Escherichia coli的araJ MFS转运蛋白。

蔗糖–枯草芽孢杆菌sacP PTS系统。

乳糖–Escherichia coli的lacY MFS转运蛋白。

麦芽糖–Escherichia coli的malE/malF/malG/malK ABC系统。

实施例3：将代谢基因整合至细长聚球藻PCC7942中

将下游代谢基因整合至使用实施例2的糖类转运蛋白转化的细长聚球藻PCC7942菌株中，从而促进糖类引入至它们的中心代谢中。如实施例1所述，通过将各糖类特异性代谢基因(在包括单一基因或完整列表的多种组合中)克隆至它们相应的糖类转运蛋白的上游，并将它们整合至细长聚球藻PCC7942的NSI中处于P_TRC启动子的控制之下，从而完成整合。

以下为糖类及它们相应的代谢基因的非限定性实例：

葡萄糖–Escherichia coli的葡萄糖激酶(glk)，用于将葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。

果糖–Escherichia coli的甘露糖(果糖)激酶(mak)和Escherichia coliEC3132的果糖激酶(cscK)，用于将果糖磷酸化成果糖-6-磷酸。

甘露糖–Escherichia coli的甘露糖(果糖)激酶(mak)，其用于将甘露糖磷酸化成甘露糖-6-磷酸；以及对于所有系统，Escherichia coli的甘露糖-6-磷酸异构酶(manA)，用于将甘露糖-6-磷酸异构化成果糖-6-磷酸。

半乳糖–Escherichia coli的半乳糖-1-差向异构酶(galM)，用于将β-D-半乳糖差向异构形成α-D-半乳糖；Escherichia coli的半乳糖激酶(galK)，用于将α-D-半乳糖磷酸化成α-D-半乳糖-1-磷酸；Escherichia coli的半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(galT)，用于将α-D-半乳糖-1-磷酸转化成尿苷酰二磷酸(UDP)-D-半乳糖；以及Escherichia coli的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶(galE)，用于将UDP-D-半乳糖差向异构形成UDP-D-葡萄糖。

阿拉伯糖–Escherichia coli的L-阿拉伯糖异构酶(araA)，用于将L-阿拉伯糖差向异构形成L-核酮糖；Escherichia coli的L-核酮糖激酶(araB)，用于将L-核酮糖磷酸化成L-核酮糖-5-磷酸；以及L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶，用于将L-核酮糖-5-磷酸差向异构形成木酮糖-5-磷酸。

蔗糖–与PTS转运系统协同，得自枯草芽孢杆菌的蔗糖酶-6-磷酸水解酶(sacA)，用于将蔗糖-6-磷酸水化成β-D-葡萄糖-6-磷酸和β-D-果糖；以及之前所述的果糖降解酶。就MFS转运系统的用途而言，得自Escherichiacoli EC3132的蔗糖转化酶(cscA)，用于将蔗糖水化成β-D-葡萄糖和β-D-果糖；以及之前所述的果糖降解酶。

麦芽糖–得自乳酸链球菌的麦芽糖磷酸化酶(malP)，用于将麦芽糖磷酸化成β-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖-1-磷酸；以及得自乳酸链球菌的β-葡萄糖磷酸变位酶(pgm)，用于将β-D-葡萄糖-1-磷酸转化成β-D-葡萄糖-6-磷酸。

乳糖–得自Escherichia coli的β-半乳糖苷酶(lacZ)，用于将乳糖水化成β-D-半乳糖和β-D-葡萄糖；以及之前所述的半乳糖降解酶。

实施例4：在细长聚球藻PCC7942中糖类催化途径的组合

在实施例3中所述的每一个所述的糖类分解代谢途径被克隆和表征后，在细长聚球藻PC7942中构建分解代谢途径的不同组合，从而进一步扩大单独菌株的底物的利用。

以下为途径组合的非限定性列表：

葡萄糖和果糖的转运/代谢

葡萄糖和木糖的转运/代谢

葡萄糖,木糖,和阿拉伯糖的转运/代谢

葡萄糖,果糖,木糖,和阿拉伯糖的转运/代谢

葡萄糖,果糖,甘露糖,半乳糖,木糖,和阿拉伯糖的转运/代谢

蔗糖和乳糖的转运/代谢

实施例5：在其他的光能自养型或光能异养型蓝细菌中糖类分解代谢途径的构建

将实施例4中所述的糖类分解代谢途径构建至蓝细菌的其他光能自养型或光能异养型菌株中，其包括但不限于耐热蓝细菌Thermosynechococcuselongatus BP-1,海洋蓝细菌聚球藻属菌种WH8102,细长聚球藻PCC7002和集胞藻属菌种PCC6803。作为基准，将葡萄糖途径构建至海洋能自养型生物细长聚球藻PCC7002和嗜热淡水光能自养型生物Thermosynechococcuselongatus BP-1。对于所有的单糖和二糖途径，通过引入所述的途径，集胞藻属菌种PCC6803的糖类利用能力扩大至葡萄糖以外。

实施例6：在细长聚球藻PCC7942中，大宗化学品的制备

大宗化学品(包括但不限于生物燃料、聚合物、专用化学品和药物中间体)的制备在包含多种糖类转运蛋白和实施例1-4所述的糖类分解代谢途径的细长聚球藻PCC7942菌株中增加。生物燃料包括但不限于：醇，例如乙醇,丙醇,异丙醇,丙酮,丁醇,异丁醇,2-甲基-1-丁醇,3-甲基-1-丁醇,苯基乙醇,脂肪醇和异戊烯醇；醛，例如乙酰基醛,丙醛,丁醛,异丁醛,2-甲基-1-丁醛,3-甲基-1-丁醛,苯乙醛和脂肪醛；烃，例如烷烃,烯烃,类异戊二烯,脂肪酸,蜡酯和乙酯；以及无机燃料，例如氢。聚合物包括但不限于2,3-丁二醇,1,3-丙二醇,1,4-丁二醇,羟基脂肪酸酯,聚羟基丁酸酯和异戊二烯。专用化学品包括但不限于类胡罗卜素，例如番茄红素,β-胡罗卜素等。药物中间体包括但不限于聚酮化合物,斯达汀,ω-3脂肪酸,类异戊二烯,类固醇好和红霉素(抗生素)。大宗化学品的其他实例包括但不限于乳酸酯,琥珀酸酯,谷氨酸酯,柠檬酸酯,苹果酸酯,3-羟基丙酸酯,抗坏血酸盐,山梨醇,氨基酸(亮氨酸,缬氨酸,异亮氨酸等)和羟基丁酸酯。

能够代谢一种或多种单糖或二糖糖类的细长聚球藻PCC7942菌株经改造而制备多种生物燃料。

所制备的生物燃料包括但不限于：

乙醇：得自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶(pdc)和醇脱氢酶(adhB)的整合。

异丁醛：得自枯草芽胞杆菌的2-乙酰乳酸合成酶(alsS)、得自Escherichia coli的乙酰羟酸异构体还原酶(ilvC)和二羟酸脱水酶(ilvD)、以及得自乳酸链球菌的2-酮异戊酸脱羧酶(kivd)。

异丁醇：得自Escherichia coli、负责异丁醛制备的所有基因以及醇脱氢酶的整合(yqhD)。

其他高级链醇：1-丙醇,1-丁醇,2-甲基-1-丁醇,3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇最低程度地需要得自乳酸链球菌的2-酮异戊酸脱羧酶(kivd)和得自Escherichia coli的醇脱氢酶(yqhD)。

2,3-丁二醇：得自枯草芽孢杆菌的2-乙酰乳酸合成酶(alsS)、得自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的2-乙酰乳酸脱羧酶(alsD)、得自氏梭状芽胞杆菌(Clostridium beijerinckii)的仲醇脱氢酶(adh)的整合。

实施例7：改造细长聚球藻PCC7942菌株用于在缺乏光照下无条件生长

通过随机诱变，细长聚球藻PCC7942菌株改造成在光照缺乏下能够在糖类底物上无条件生长。简言之，使用化学诱变剂(例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲基磺酸乙酯(EMS))在穿过带有功能葡萄糖转运途径的细长聚球藻PCC7942的基因组中诱导随机点突变。诱变后，在光能自养型在短时间(1～2周)内富集培养物，从而确保光合作用的能力得到保留。此后，将细胞平板接种于包含10g/L葡萄糖的BG-11平板上，并在黑暗下在30℃下温育，从而选择在缺乏光照下能够在葡萄糖上生长的菌株。通过PCR证明能够生长的菌株，从而确保它们是细长聚球藻PCC7942的衍生物，此后对完整的基因组进行测序并进一步分析。

序列

SEQ ID NO:1：E.coli galP核苷酸序列：

SEQ ID NO:2：E.coli galP氨基酸序列：

SEQ ID NO:3：集胞藻属菌种PCC6803 glcP核苷酸序列

SEQ ID NO:4：集胞藻属菌种PCC6803 glcP氨基酸序列

SEQ ID NO:5：晚期智人glut1核苷酸序列：

ATGGAACCCAGCTCCAAGAAATTGACCGGACGCCTGATGCTGGCCGTTGGAGGGGCCGTGCTGGGCTCGCTGCAGTTTGGCTACAACACCGGCGTGATCAATGCGCCGCAGAAAGTGATTGAAGAATTTTACAACCAAACCTGGGTCCATCGCTACGGCGAGAGCATCCTGCCCACAACCCTCACCACCCTGTGGAGCCTGAGCGTCGCCATTTTTAGTGTGGGAGGTATGATCGGCAGCTTCTCCGTGGGCTTGTTCGTCAATCGCTTTGGTCGGCGCAACTCCATGCTCATGATGAACCTGTTGGCCTTTGTGTCTGCGGTCCTCATGGGCTTCAGCAAACTGGGAAAGTCGTTTGAAATGCTGATCCTCGGTCGCTTCATTATCGGCGTGTACTGTGGCTTGACTACCGGCTTTGTTCCTATGTACGTGGGGGAGGTGTCGCCCACCGCACTCCGCGGTGCGCTGGGTACGTTGCATCAATTGGGCATCGTGGTGGGCATTCTCATCGCCCAGGTGTTTGGCCTGGATAGCATCATGGGTAACAAAGATTTGTGGCCGCTGCTCCTGAGTATCATTTTCATCCCCGCACTGTTGCAATGTATCGTGCTCCCTTTTTGCCCGGAATCCCCCCGTTTTCTCCTCATCAACCGCAACGAAGAAAACCGCGCCAAAAGCGTGCTCAAAAAGTTGCGAGGGACCGCCGATGTGACTCACGACTTGCAGGAGATGAAAGAGGAGAGCCGTCAGATGATGCGCGAGAAGAAGGTGACAATTCTGGAACTGTTCCGCAGCCCTGCGTACCGCCAACCAATCTTGATTGCAGTCGTGCTGCAACTCAGCCAGCAGTTGAGCGGCATTAACGCTGTCTTTTACTATTCCACCTCGATCTTTGAAAAAGCAGGCGTGCAGCAACCCGTCTACGCCACCATTGGATCGGGGATCGTGAATACCGCTTTTACCGTTGTGTCGCTGTTTGTCGTTGAACGAGCTGGACGGCGAACTCTCCACCTGATTGGTCTGGCCGGGATGGCTGGATGCGCCATCCTGATGACCATTGCACTGGCCCTCCTGGAACAACTGCCCTGGATGAGCTACCTCTCTATTGTTGCCATCTTTGGCTTCGTGGCGTTCTTTGAGGTTGGTCCGGGTCCAATCCCATGGTTTATCGTGGCTGAACTCTTTAGCCAGGGTCCACGTCCGGCTGCGATTGCTGTGGCAGGTTTTTCGAATTGGACGAGTAACTTCATCGTCGGCATGTGTTTTCAATACGTCGAACAGCTCTGTGGCCCATACGTGTTTATCATCTTCACCGTCTTGCTCGTCCTGTTCTTTATCTTTACATACTTCAAAGTGCCCGAAACCAAAGGGCGGACCTTTGATGAAATCGCCAGCGGCTTTCGGCAGGGAGGAGCCAGCCAGAGCGATAAGACCCCAGAGGAGTTGTTTCACCCATTGGGGGCTGATAGCCAAGTGTGA

SEQ ID NO:6：晚期智人glut1核苷酸序列：

SEQ ID NO:7：E.coli XylE核苷酸序列：

SEQ ID NO:8：E.coli xylE氨基酸序列：

SEQ ID NO:9：E.coli xylA核苷酸序列：

SEQ ID NO:10：E.coli xylA氨基酸序列：

SEQ ID NO:11：E.coli xylB核苷酸序列：

SEQ ID NO:12：E.coli xylB氨基酸序列：

SEQ ID NO:13：E.coli ATCC700927 cscB核苷酸序列

SEQ ID NO:14：E.coli ATCC700927 cscB氨基酸序列：

SEQ ID NO:15：E.coli ATCC700927 cscK核苷酸序列：

SEQ ID NO:16：E.coli ATCC700927 cscB氨基酸序列：

Claims

1.一种光能自养型物种的分离的细菌细胞，其包含编码半乳糖转运蛋白的重组多核苷酸，其中所述的半乳糖转运蛋白的表达使得葡萄糖被转运至所述的细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在葡萄糖上增加所述的细菌细胞的生长。

2.权利要求1所述的分离的细菌细胞，其中所述的重组多核苷酸编码半乳糖转运蛋白，其选自细菌galP转运蛋白,真核生物galP转运蛋白,真菌galP转运蛋白,哺乳动物galP转运蛋白,细菌主要易化因子超家族(MFS)转运蛋白,真核生物MFS转运蛋白,真菌MFS转运蛋白,哺乳动物MFS转运蛋白,细菌ATP-结合盒超家族(ABC)转运蛋白,真核生物ABC转运蛋白,真菌ABC转运蛋白,哺乳动物ABC转运蛋白,细菌磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白,真核生物PTS转运蛋白,真菌PTS转运蛋白,哺乳动物PTS转运蛋白和它们的同系物。

3.权利要求1所述的分离的细菌细胞，其中所述的重组多核苷酸编码E.coli galP转运蛋白。

4.一种光能自养型物种的分离的细菌细胞，其包含编码二糖糖类转运蛋白的重组多核苷酸，其中所述的二糖糖类转运蛋白的表达使得二糖糖类被转运至所述的细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在二糖糖类上增加所述的细菌细胞的生长。

5.权利要求4所述的细菌细胞，其中所述的重组多核苷酸编码二糖糖类转运蛋白，其选自蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白,纤维二糖转运蛋白和它们的同系物。

6.权利要求4所述的细菌细胞，其中所述的重组多核苷酸编码蔗糖转运蛋白。

7.权利要求6所述的细菌细胞，其中所述的蔗糖转运蛋白选自E.coliCscB蔗糖转运蛋白,枯草芽孢杆菌SacP转运蛋白,欧洲油菜Sut1转运蛋白,野胡桃Sut1转运蛋白,拟南芥Suc6转运蛋白,拟南芥SUT4转运蛋白,黑腹果蝇Slc45-1转运蛋白和菊欧文氏菌ScrA转运蛋白。

8.权利要求6所述的细菌细胞，其中所述的蔗糖转运蛋白选自E.coliCscB蔗糖转运蛋白。

9.权利要求4所述的细菌细胞，其中所述的细菌细胞进一步包含编码果糖激酶蛋白质的至少一个其他的重组多核苷酸。

10.权利要求9所述的细菌细胞，其中所述的果糖激酶蛋白质选自E.coli CscK果糖激酶蛋白质,番茄Frk1果糖激酶蛋白质,番茄Frk2果糖激酶蛋白质,晚期智人KHK果糖激酶蛋白质,拟南芥FLN-1果糖激酶蛋白质,拟南芥和FLN-2果糖激酶蛋白质,鼠疫耶尔森氏菌91001 NagC1果糖激酶蛋白质,假结核耶尔森菌YajF果糖激酶蛋白质和嗜盐碱单孢菌Suk果糖激酶蛋白质。

11.权利要求9所述的细菌细胞，其中所述的果糖激酶蛋白质为E.coliCscK果糖激酶蛋白质。

12.一种光能自养型物种的分离的细菌细胞，其包含编码木糖转运蛋白的重组多核苷酸，其中所述的木糖转运蛋白的表达使得木糖被转运至所述的细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下在木糖上增加所述的细菌细胞的生长。

13.权利要求12所述的分离的细菌细胞，其中所述的重组多核苷酸编码木糖转运蛋白，其选自E.coli XylE木糖转运蛋白,E.coli xylF/xylG/xylHABC木糖转运蛋白,中间假丝酵母Gxf1转运蛋白,毕赤酵母Sut1转运蛋白和拟南芥At5g59250转运蛋白。

14.权利要求12所述的分离的细菌细胞，其中所述的重组多核苷酸编码E.coli XylE木糖转运蛋白。

15.权利要求12所述的分离的细菌细胞，其中所述的细菌细胞进一步包含编码木糖异构酶的至少一个其他的重组多核苷酸。

16.权利要求12所述的分离的细菌细胞，其中所述的细菌细胞进一步包含编码木酮糖激酶的至少一个其他的重组多核苷酸。

17.权利要求12所述的分离的细菌细胞，其中所述的细菌细胞进一步包含编码木糖异构酶的第二重组多核苷酸和编码木酮糖激酶的第三重组多核苷酸。

18.权利要求12所述的分离的细菌细胞，其中所述的重组多核苷酸进一步包含木糖异构酶和木酮糖激酶。

19.权利要求15所述的分离的细菌细胞，其中所述的木糖异构酶选自E.coli XylA木糖异构酶,拟南芥AT5G57655木糖异构酶,黑曲霉XyrA木糖异构酶和红褐肉座菌Xyl1木糖异构酶。

20.权利要求19所述的分离的细菌细胞，其中所述的木糖异构酶为E.coli XylA木糖异构酶。

21.权利要求16所述的分离的细菌细胞，其中所述的木酮糖激酶选自E.coli XylB木酮糖激酶,拟南芥XK-1木酮糖激酶,拟南芥XK-2木酮糖激酶,E.coli LynK木酮糖激酶,天蓝链霉菌SCO1170木酮糖激酶,绿脓杆菌MtlY木酮糖激酶,假结核耶尔森菌SgbK木酮糖激酶和E.coli AtlK木酮糖激酶。

22.权利要求21所述的分离的细菌细胞，其中所述的木酮糖激酶为E.coli XylB木酮糖激酶。

23.权利要求1-22的任意一项所述的分离的细菌细胞，其中所述的重组多核苷酸和/或至少一个其他的重组多核苷酸稳定地整合至所述的细菌细胞的基因组中。

24.权利要求1-22的任意一项所述的分离的细菌细胞，其中所述的细菌细胞进一步包含编码糖类转运蛋白的至少一个其他的重组多核苷酸，其中所述的糖类转运蛋白的表达使得糖类转运至所述的细菌细胞中。

25.权利要求24所述的分离的细菌细胞，其中所述的糖类选自己糖,半乳糖,葡萄糖,果糖,甘露糖,二糖,蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖,纤维二糖,戊糖,木糖,阿拉伯糖,核糖,核酮糖和木酮糖。

26.权利要求1-22的任意一项所述的分离的细菌细胞，其中所述的细菌细胞进一步包含所述的光能自养型细菌细胞制备至少一种大宗化学品所必需的所述的蛋白质。

27.权利要求26所述的分离的细菌细胞，其中所述的细菌细胞制备所述的至少一种大宗化学品。

28.权利要求27所述的分离的细菌细胞，其中所述的细菌细胞在日间条件下连续制备所述的至少一种大宗化学品。

29.权利要求26所述的分离的细菌细胞，其中所述的大宗化学品选自聚合物,2,3-丁二醇,1,3-丙二醇,1,4-丁二醇,羟基脂肪酸酯,聚羟基丁酸酯,异戊二烯,乳酸酯,琥珀酸酯,谷氨酸酯,柠檬酸酯,苹果酸酯,3-羟基丙酸酯,抗坏血酸盐,山梨醇,氨基酸,羟基丁酸酯,类胡罗卜素,番茄红素,β-胡罗卜素,药物中间体,聚酮化合物,斯达汀,ω-3脂肪酸,类异戊二烯,类固醇,抗生素,红霉素,类异戊二烯,类固醇,红霉素和它们的组合。

30.权利要求26所述的分离的细菌细胞，其中所述的大宗化学品为生物燃料，其选自醇,乙醇,丙醇,异丙醇,丙酮,丁醇,异丁醇,2-甲基-1-丁醇,3-甲基-1-丁醇,苯基乙醇,脂肪醇,异戊烯醇,醛,乙酰基醛,丙醛,丁醛,异丁醛,2-甲基-1-丁醛,3-甲基-1-丁醛,苯乙醛,脂肪醛,烃,烷烃,烯烃,类异戊二烯,脂肪酸,蜡酯,乙酯,氢和它们的组合。

31.权利要求1-22的任意一项所述的分离的细菌细胞，其中所述的细菌细胞选自蓝细菌,Acaryochloris,鱼腥藻属,螺旋藻属,蓝杆藻属,Gleobacter,微胞藻属,念珠藻属,原绿球藻属,聚球藻属,细长聚球藻,细长聚球藻PCC7942,集胞藻属,Thermosynechococcus,束毛藻属,紫色硫细菌,着色菌科,外硫红螺旋菌科,紫色非硫细菌,醋酸杆菌科,慢生根瘤菌科,丛毛单胞菌科,生丝微菌科,红杆菌科,红游动菌科,红环菌科,Rhodospirillaceae,绿色非硫细菌和绿弯菌科。

32.一种增加细菌细胞生长的方法，其包括：

提供光能自养型物种的细菌细胞，其中所述的光能自养型物种包含编码糖类转运蛋白的重组多核苷酸；以及

在一定条件下使用糖类底物培养所述的细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达；

其中所述的重组多核苷酸的表达使得所述的糖类底物被转运至所述的细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞的细胞生长相比，可以在黑暗或日间条件下在糖类上增加细胞的生长。

33.一种在黑暗或日间条件下增加细菌细胞密度的方法，其包括：

其中所述的重组多核苷酸的表达使得所述的糖类底物被转运至所述的细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下增加细胞的密度。

34.一种在黑暗或日间条件下增加细菌生物质制备的方法，其包括：

其中所述的重组多核苷酸的表达使得所述的糖类底物被转运至所述的细菌细胞中，从而与缺乏所述的重组多核苷酸的相应的光能自养型细菌细胞相比，可以在黑暗或日间条件下增加生物质的制备。

35.一种制备至少一种大宗化学品的方法，其包括：

在一定条件下使用糖类底物培养所述的细菌细胞，由此所述的重组多核苷酸被表达并且制备至少一种大宗化学品；以及

收集所述的至少一种大宗化学品；

其中所述的重组多核苷酸的表达使得所述的糖类底物被转运至所述的细菌细胞中。

36.权利要求32-35的任意一项所述的方法，其中所述的重组多核苷酸编码糖类转运蛋白，其选自己糖糖类转运蛋白,半乳糖转运蛋白,葡萄糖转运蛋白,糖转运蛋白,甘露糖转运蛋白,主要易化因子超家族(MFS)转运蛋白,ATP-结合盒超家族(ABC)转运蛋白,磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白,二糖糖类转运蛋白,蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白,纤维二糖转运蛋白,戊糖转运蛋白,木糖转运蛋白,阿拉伯糖转运蛋白,核糖转运蛋白,核酮糖转运蛋白和木酮糖转运蛋白。

37.权利要求36所述的方法，其中使用糖类培养所述的细菌细胞，其中所述的糖类选自己糖,半乳糖,葡萄糖,果糖,甘露糖,二糖,蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖,纤维二糖,戊糖,木糖,阿拉伯糖,核糖,核酮糖和木酮糖。

38.权利要求32-35的任意一项所述的方法，其中所述的重组多核苷酸编码半乳糖转运蛋白。

39.权利要求38所述的方法，其中所述的半乳糖转运蛋白选自细菌galP转运蛋白,真核生物galP转运蛋白,真菌galP转运蛋白,哺乳动物galP转运蛋白,细菌MFS转运蛋白,真核生物MFS转运蛋白,真菌MFS转运蛋白,哺乳动物MFS转运蛋白,细菌PTS转运蛋白,真核生物PTS转运蛋白,真菌PTS转运蛋白和哺乳动物PTS转运蛋白。

40.权利要求38所述的方法，其中所述的半乳糖转运蛋白为E.coligalP转运蛋白。

41.权利要求38所述的方法，其中所述的半乳糖转运蛋白将葡萄糖转运至所述的细菌细胞中。

42.权利要求38所述的方法，其中使用葡萄糖培养所述的细菌细胞。

43.权利要求32-35的任意一项所述的方法，其中所述的重组多核苷酸编码二糖糖类转运蛋白。

44.权利要求43所述的方法，其中所述的二糖糖类转运蛋白选自蔗糖转运蛋白,乳糖转运蛋白,乳果糖转运蛋白,麦芽糖转运蛋白,海藻糖转运蛋白,纤维二糖转运蛋白和它们的同系物。

45.权利要求43所述的方法，其中所述的二糖糖类转运蛋白为蔗糖转运蛋白。

46.权利要求45所述的方法，其中所述的蔗糖转运蛋白选自E.coliCscB蔗糖转运蛋白,枯草芽孢杆菌SacP转运蛋白,欧洲油菜Sut1转运蛋白,野胡桃Sut1转运蛋白,拟南芥Suc6转运蛋白,拟南芥SUT4转运蛋白,黑腹果蝇Slc45-1转运蛋白和菊欧文氏菌ScrA转运蛋白。

47.权利要求45所述的方法，其中所述的蔗糖转运蛋白为E.coli CscB蔗糖转运蛋白。

48.权利要求43所述的方法，其中所述的细菌细胞进一步包含编码果糖激酶蛋白质的至少一个其他的重组多核苷酸。

49.权利要求48述的方法，其中所述的果糖激酶蛋白质选自E.coliCscK果糖激酶蛋白质,番茄Frk1果糖激酶蛋白质,番茄Frk2果糖激酶蛋白质,晚期智人KHK果糖激酶蛋白质,拟南芥FLN-1果糖激酶蛋白质,拟南芥和LN-2果糖激酶蛋白质,鼠疫耶尔森氏菌91001 NagC1果糖激酶蛋白质,假结核耶尔森菌YajF果糖激酶蛋白质和嗜盐碱单孢菌Suk果糖激酶蛋白质。

50.权利要求48述的方法，其中所述的果糖激酶蛋白质为E.coli CscK果糖激酶蛋白质。

51.权利要求43的方法，其中所述的细菌细胞进一步包含将所述的二糖糖类转化成其相应的单糖所必需的蛋白质。

52.权利要求43的方法，其中使用糖类培养所述的细菌细胞，其中所述的糖类选自二糖糖类,蔗糖,乳糖,乳果糖,麦芽糖,海藻糖和纤维二糖。

53.权利要求32-35的任意一项所述的方法，其中所述的重组多核苷酸编码木糖转运蛋白。

54.权利要求53的方法，其中所述的重组多核苷酸编码木糖转运蛋白，其选自E.coli XylE木糖转运蛋白,E.coli xylF/xylG/xylHABC木糖转运蛋白,中间假丝酵母Gxf1转运蛋白,毕赤酵母Sut1转运蛋白和拟南芥At5g59250转运蛋白。

55.权利要求53的方法，其中所述的木糖转运蛋白为E.coli XylE木糖转运蛋白。

56.权利要求53的方法，其中所述的细菌细胞进一步包含编码木糖异构酶的至少一个其他的重组多核苷酸。

57.权利要求53的方法，其中所述的细菌细胞进一步包含编码木酮糖激酶的至少一个其他的重组多核苷酸。

58.权利要求53的方法，其中所述的细菌细胞进一步包含编码木糖异构酶的第二重组多核苷酸和编码木酮糖激酶的第三重组多核苷酸。

59.权利要求53的方法，其中所述的重组多核苷酸进一步编码木糖异构酶和木酮糖激酶。

60.权利要求56的方法，其中所述的木糖异构酶选自E.coli XylA木糖异构酶,拟南芥AT5G57655木糖异构酶,黑曲霉XyrA木糖异构酶和红褐肉座菌Xyl1木糖异构酶。

61.权利要求56的方法，其中所述的木糖异构酶为E.coli XylA木糖异构酶。

62.权利要求57的方法，其中所述的木酮糖激酶选自E.coli XylB木酮糖激酶,拟南芥XK-1木酮糖激酶,拟南芥XK-2木酮糖激酶,E.coliLynK木酮糖激酶,天蓝链霉菌SCO1170木酮糖激酶,绿脓杆菌MtlY木酮糖激酶,假结核耶尔森菌SgbK木酮糖激酶和E.coli AtlK木酮糖激酶。

63.权利要求57的方法，其中所述的木酮糖激酶为E.coli XylB木酮糖激酶。

64.权利要求32-35的任意一项所述的方法，其中所述的重组多核苷酸和/或至少一个其他的重组多核苷酸稳定地整合至所述的细菌细胞的基因组中。

65.权利要求32-35的任意一项所述的方法，其中所述的细菌细胞进一步包含编码第二糖类转运蛋白的至少一个其他的重组多核苷酸，其中所述的第二糖类转运蛋白的表达使得第二糖类底物转运至所述的细菌细胞中。

66.权利要求32-35的任意一项所述的方法，其中所述的细菌细胞连续地制备所述的至少一种大宗化学品。

67.权利要求66的方法，其中所述的至少一种大宗化学品一天24小时连续地制备。

68.权利要求66的方法，其中所述的大宗化学品选自聚合物,2,3-丁二醇,1,3-丙二醇,1,4-丁二醇,羟基脂肪酸酯,聚羟基丁酸酯,异戊二烯,乳酸酯,琥珀酸酯,谷氨酸酯,柠檬酸酯,苹果酸酯,3-羟基丙酸酯,抗坏血酸盐,山梨醇,氨基酸,羟基丁酸酯,类胡罗卜素,番茄红素,β-胡罗卜素,药物中间体,聚酮化合物,斯达汀,ω-3脂肪酸,类异戊二烯,类固醇,抗生素,红霉素,类异戊二烯,类固醇,红霉素,生物燃料和它们的组合。

69.权利要求66的方法，其中所述的大宗化学品为生物燃料，其选自醇,乙醇,丙醇,异丙醇,丙酮,丁醇,异丁醇,2-甲基-1-丁醇,3-甲基-1-丁醇,苯基乙醇,脂肪醇,异戊烯醇,醛,乙酰基醛,丙醛,丁醛,异丁醛,2-甲基-1-丁醛,3-甲基-1-丁醛,苯乙醛,脂肪醛,烃,烷烃,烯烃,类异戊二烯,脂肪酸,蜡酯,乙酯,氢和它们的组合。

70.权利要求32-35的任意一项所述的方法，其中所述的细菌细胞选自蓝细菌,Acaryochloris,鱼腥藻属,螺旋藻属,蓝杆藻属,Gleobacter,微胞藻属,念珠藻属,原绿球藻属,聚球藻属,细长聚球藻,细长聚球藻PCC7942,集胞藻属,Thermosynechococcus,束毛藻属,紫色硫细菌,着色菌科,外硫红螺旋菌科,紫色非硫细菌,醋酸杆菌科,慢生根瘤菌科,丛毛单胞菌科,生丝微菌科,红杆菌科,红游动菌科,红环菌科,Rhodospirillaceae,绿色非硫细菌和绿弯菌科。