CN108070602B - 一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，将一种能够特异性延缓及减少芽孢生成的基因通过质粒或基因组重组的方式，在生产菌株中表达，以延长生产菌株的发酵周期，提高发酵菌株的生产效率。所得菌株的出芽孢的比例比对照菌降低50％以上，且生成芽孢的时间滞后12小时以上，十分有利于在稳定期进行的工业发酵生产。

Description

一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，将一种能够特异性延缓及减少芽孢生成的基因通过质粒或基因组重组的方式，在生产菌株中表达，以延长生产菌株的发酵周期，提高发酵菌株的生产效率。

背景技术：

芽孢杆菌生长迅速，发酵密度高，目前在工业/食品行业用酶发酵生产以及制药领域中有着举足轻重的地位；芽孢杆菌生产菌株主要包括枯草芽孢杆菌、解链淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及短小芽孢杆菌等，这些菌株顾名思义，在发酵后期，尤其是在高密度培养状态下，细胞会很快进入产芽孢的休眠体形式。在细胞变成芽孢休眠体后，发酵生产活动随即停止。因此，通常会在发酵过程中对培养液成份进行实时调控，以减缓芽孢的生成；此外，还常常通过对生产菌株进行遗传改造，通过人工诱变或基因敲除的方式将相关的转录因子(如SigF等)缺失，从而使生产菌株变成不能形成芽孢的微生物，但这种方式往往也有一些问题存在，一方面是由于芽孢生成是这类微生物固有的生命活动，对其进行强行缺失后会引发一些意想不到的微生物生理生化特性的改变，其结果是，这类生产菌株突变体在发酵生产时存在一定的缺陷，如细胞生物量很难提高，以及宿主细胞的分泌能力变弱等。

近年来，针对芽孢杆菌开展了全面的系统生物学的研究，并且随着芽孢杆菌操作改造效率的提高，许多种属相近的微生物的基因经平行遗传转入芽孢杆菌越来越频繁，芽孢杆菌性状的改变也因此更加快捷。

在本发明中，通过将多种其它来源的微生物基因库转入枯草芽孢杆菌164s中，发现其中编号为2367的基因在枯草芽孢杆菌的表达可明显降低该微生物形成芽孢的比率，并且生成芽孢的时间显著滞后，而其它生物特性没有改变，这一特征可以应用于对芽孢杆菌发酵生产菌株的改造。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，所述改造是通过在宿主细胞中表达调节基因A来完成的；

所述调节基因A为如下(a)、(b)或(c)所述的基因：

(a)其核苷酸为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(即基因2367)或其互补的核苷酸序列；

(b)其核苷酸为与(a)同源性高于90％，且编码具有相同生物学功能蛋白质的序列；

(c)其核苷酸为对(a)所述序列进行局部序列的取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且与(a)所编码蛋白质具有相同生物学功能的序列；

所述调节基因A的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的改造是通过构建包含上述基因的质粒并转入宿主细胞，或在宿主基因组上整合了表达上述基因的遗传操作来完成；

所述芽孢杆菌，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解链淀粉芽孢等，其改造完成后，可以在高密度发酵过程中，明显减少并推迟芽孢的生成，因此可用于芽孢杆菌的外源蛋白或多肽类产品的发酵生产。

所述减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，通过构建包含上述基因的质粒并转入宿主细胞，具体如下：

(1)通过PCR的方式获得调节基因A，并将其构建到表达载体上得到重组载体；

优选地，所述表达载体为pMK4质粒；

进一步地，所述重组载体为pMK4-2367，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)将重组载体在宿主细胞中进行表达获得重组菌株；

所述减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法，通过在宿主基因组上整合表达上述基因，具体如下：

(1)合成线性DNA片断amyLRE-2367；

(2)将amyLRE-2367在宿主细胞中表达，获得2367基因重组整合到了宿主细胞基因组中的重组菌株；

所述amyLRE-2367的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

有益效果：

利用本发明中所构建的芽孢杆菌进行长时间发酵，结果显示，表达了如SEQ IDNO.1所示的基因2367的芽孢杆菌，出芽孢的比例比对照枯草芽孢杆菌164s降低50％以上，且生成芽孢的时间滞后12小时以上，十分有利于在稳定期进行的工业发酵生产。

附图说明：

图1是带有基因2367的表达质粒pMK4-2367的质粒图；

图2是含有基因2367的线性DNA片断amyLRE-2367的示意图；

图3是枯草芽孢杆菌164s、164s/pMK4-2367及164s/2367的发酵生长曲线；

图4是枯草芽孢杆菌164s、164s/pMK4-2367及164s/2367的芽孢镜检结果。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例中所用实验方法如非特别说明均为公知的常用微生物、生物化学或分子生物学技术；所用实验材料，除非特别说明，均购自商业公司。

其中，枯草芽孢杆菌164s是从美国ATCC菌种保藏中心购得的，通常又被命名为ATCC 6051a。

实施例1质粒pMK4-2367的构建

所用质粒pMK4-P43-GFP是在pMK4的基础上构建而来，pMK4购自BGSC(BacillusGenetic Stock Center)，启动子P43经PCR和DNA酶切连接，插入pMK4质粒上的PstI/XmaI位点之间，再将表达GFP的DNA片断插入pMK4-P43质粒上的XmaI/EcoRI位点之间，得到质粒pMK4-P43-GFP。然后，本实例通过融合PCR，将启动子P43、基因2367(SEQ ID NO.1所示序列)无缝连接，构建到pMK4中，得到质粒pMK4-2367(SEQ ID NO.3所示序列)。所构建的序列送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。

构建过程如下：

以引物2367-F(SEQ ID NO.5)和2367-R(SEQ ID NO.6)为引物，以含有基因2367的TA克隆质粒为模板，扩增获取基因2367；

以P43-F(SEQ ID NO.7)和P43-XmaR(SEQ ID NO.8)为引物，以质粒pMK4-P43-GFP为模板，获得线性的质粒DNA片段pMK4-P43；获得的PCR产物利用Dpn I处理，除去模板DNApMK4-P43-GFP。

PCR反应体系如下：

将上述获得的两种PCR产物以摩尔比1：1进行混合作模板，利用融合PCR方法进行两个片断的拼接，并转入大肠杆菌JM109。

融合PCR的标准程序如下：预变性98℃2min；变性98℃25s；退火50℃30s；延伸72℃，1kb/min，6个循环。PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化。

融合PCR反应体系如下：

实施例2表达基因2367的重组枯草芽孢杆菌的制备

表达基因2367的重组枯草芽孢杆菌有两种：

一种为质粒表达，即，将实施例1构建的质粒pMK4-2367转入高转化效率的枯草芽孢杆菌164s菌株中，得到菌株164s/pMK4-2367。

另一种重组杆菌也是基于枯草芽孢杆菌164s，但是利用了线性片断amyLRE-2367。图2所示的包含有基因2367的线性DNA片段amyLRE-2367由四部分组成，分别带有用于枯草芽孢杆菌淀粉酶(amyE)基因同源重组的片段amyE-L及amyE-R，和抗性基因ermC，amyLRE-2367的序列由SEQ ID NO.4所示，该长片段线线性DNA由工生物工程(上海)股份有限公司化学合成，取100ng的DNA片段用于枯草芽孢杆菌164s的转化。转化方法具体如下：

首先用无菌牙签将单菌落164s接种到装有3mL液体LB培养基的试管中，放在恒温振荡培养箱37℃、200r/min培养10～12h；取300μL转接到装有3mL预热的液体木糖培养基的试管中，每升木糖培养基含有20g木糖，10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母膏，培养液放在恒温震荡培养箱中37℃、200r/min继续培养3h即制成164s的感受态细胞，然后分装500μL培养液到2mL离心管中；将amyLRE-2367加入装有感受态细胞的小离心管，用移液枪打匀，放到恒温振荡培养箱37℃、200r/min混合培养1.5h，涂到含10mg/L红霉素抗性的固体LB平板，放到37℃恒温箱过夜培养。

培养板上长出的阳性克隆再利用PCR方法进行鉴定，确定基因2367经基因重组整合到了枯草芽孢杆菌164s基因组中amyE基因的位点，所获得的分子改造菌株命名为164s/2367。

实施例3枯草芽孢杆菌164s、164s/pMK4-2367及164s/2367的发酵培养及芽孢染色处理

枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵培养如下：

将枯草芽孢杆菌164s，164s/pMK4-2367以及164s/2367单克隆菌落分别接种到3mLLB培养液，30℃、200r/min培养10h，然后以1％的体积比接种到含有50mL LB培养基的500mL摇瓶中，30℃，200r/min连续培养，每3h取一次发酵液样品，绘制枯草芽孢杆菌164s，164s/pMK4-2367及164s/2367的发酵生长曲线图(图3)，由图看出，整合了基因2367的重组表达菌株164s/2367与原始菌株164s的生长曲线十分接近，而转入了表达质粒164s/pMK4-2367的生长生长略微缓于其余两株菌，那是由于红霉素抗性造成的。

在发酵后期，从发酵液样品中取20μL用于芽孢染色(参考Schaeffer和Fulton的染色方法)，具体如下：首先将20μL菌液涂载玻片，利用酒精灯进行烘烤固定；待载玻片冷却后加5％的孔雀绿染液，染色10min；水洗载玻片，直到流出水无绿色为止；加0.5％番红染液，复染2min后水洗载玻片，直到流出水为无色为止；水洗载玻片，用吸水纸吸干；油镜观察并拍照记录染色情况(见图4)，可见在同样的发酵时间点(54h)，表达了2367的重组菌的芽孢形成比例明显低下，形成芽孢的细胞占全部细胞的比例为20％以下，而对照164s的芽孢形成率约为50％。同时，其最早观察到芽孢的时间(36h)较164s(24h)生成芽孢的时间滞后12小时。

序列表

<110> 山东隆科特酶制剂有限公司

<120> 一种减少及推迟芽孢杆菌芽孢生成的分子改造方法

<130> 1

<141> 2017-12-12

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgaaaaaat cagctgttaa tccatggctt gttgtccttg gtacagtcat agtacaaatg 60

ggtcttggga cgatatatac atggagttta ttcaatcagc ctttagttag taaatacggt 120

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ggactagcat taggacttgg attaatactt agttcacaag cttcctcatt aatattgctt 300

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tcaaatttaa taaaatggtt tccagagcgg aaaggtttaa ttgctgggat ttccgtctct 420

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ggtgtatcac aagcatttat atattggggt ttaattgtta cagctatgat tgtccttgga 540

gcttgtttaa tccatcaagc tgctgatcaa agtgcagttc aggaaacaaa aactcatgaa 600

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ttaggtcgta ttattctagg accgttatca gataaaattg gccgtttaaa aatcgttact 840

ggtacttttg ttgttatggc aagttcagta ttagttctaa gtttcgtaga tttaaattat 900

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gtgtatcaag gatttggatt tggagcgctt gccggttcct ttatcggtgc actgctaggt 1080

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atgttaattc aagcacctaa tcagaaaaaa gaacaagaag aagagtaccg tagcgtagca 1200

taa 1203

<210> 2

<211> 400

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Lys Lys Ser Ala Val Asn Pro Trp Leu Val Val Leu Gly Thr Val

1 5 10 15

Ile Val Gln Met Gly Leu Gly Thr Ile Tyr Thr Trp Ser Leu Phe Asn

20 25 30

Gln Pro Leu Val Ser Lys Tyr Gly Trp Ser Leu Asn Ala Val Ala Ile

35 40 45

Thr Phe Ser Ile Thr Ser Leu Ser Leu Ala Phe Ser Thr Leu Phe Ala

50 55 60

Ser Lys Leu Gln Glu Lys Trp Gly Leu Arg Lys Leu Ile Met Ile Ala

65 70 75 80

Gly Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ile Leu Ser Ser Gln Ala Ser Ser

85 90 95

Leu Ile Leu Leu Tyr Val Leu Ala Gly Val Val Val Gly Tyr Ala Asp

100 105 110

Gly Thr Ala Tyr Ile Thr Ser Leu Ser Asn Leu Ile Lys Trp Phe Pro

115 120 125

Glu Arg Lys Gly Leu Ile Ala Gly Ile Ser Val Ser Ala Tyr Gly Ser

130 135 140

Gly Ser Leu Ile Phe Lys Tyr Val Asn Ala Gln Leu Ile Glu Ser Val

145 150 155 160

Gly Val Ser Gln Ala Phe Ile Tyr Trp Gly Leu Ile Val Thr Ala Met

165 170 175

Ile Val Leu Gly Ala Cys Leu Ile His Gln Ala Ala Asp Gln Ser Ala

180 185 190

Val Gln Glu Thr Lys Thr His Glu Tyr Thr Thr Lys Glu Met Leu Gly

195 200 205

Thr Lys Gln Val Tyr Leu Leu Phe Ile Met Leu Phe Thr Ser Cys Met

210 215 220

Ser Gly Leu Tyr Leu Ile Gly Met Val Lys Asp Ile Gly Val Glu Leu

225 230 235 240

Val Gly Leu Ser Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala Val Ala Met Val Ala

245 250 255

Ile Phe Asn Thr Leu Gly Arg Ile Ile Leu Gly Pro Leu Ser Asp Lys

260 265 270

Ile Gly Arg Leu Lys Ile Val Thr Gly Thr Phe Val Val Met Ala Ser

275 280 285

Ser Val Leu Val Leu Ser Phe Val Asp Leu Asn Tyr Gly Ile Tyr Phe

290 295 300

Val Cys Val Ala Ser Val Ala Phe Cys Phe Gly Gly Asn Ile Thr Ile

305 310 315 320

Phe Pro Ala Ile Val Gly Asp Phe Phe Gly Met Lys Asn His Ser Lys

325 330 335

Asn Tyr Gly Ile Val Tyr Gln Gly Phe Gly Phe Gly Ala Leu Ala Gly

340 345 350

Ser Phe Ile Gly Ala Leu Leu Gly Gly Phe Lys Pro Thr Phe Met Val

355 360 365

Ile Gly Leu Leu Cys Val Val Ser Phe Ile Ile Ala Met Leu Ile Gln

370 375 380

Ala Pro Asn Gln Lys Lys Glu Gln Glu Glu Glu Tyr Arg Ser Val Ala

385 390 395 400

<210> 3

<211> 7069

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

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cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgg 240

ctgcagatag gtggtatgtt ttcgcttgaa cttttaaata cagccattga acatacggtt 300

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atacacaacg aaagaaatgt taggtacaaa acaagtatac ttattattta ttatgttatt 1200

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atcattttgt gattaatttc tcttttttct tgttctgtta agtcataaag ttcactagct 4140

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tcttttaagt aatctaaatc cccatttttt aatttctttt tagcctcttt aaataatcct 4260

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acgactttta gtataaccac agaaattgat attagtgttt tataccgaaa cataaaacaa 5580

gaaggatata aattttaccc tgcatttatt ttcttagtga caagggtgat aaactcaaat 5640

acagctttta gaactggtta caatagcgac ggagagttag gttattggga taagttagag 5700

ccactttata caatttttga tggtgtatct aaaacattct ctggtatttg gactcctgta 5760

aagaatgact tcaaagagtt ttatgattta tacctttctg atgtagagaa atataatggt 5820

tcggggaaat tgtttcccaa aacacctata cctgaaaatg ctttttctct ttctattatt 5880

ccatggactt catttactgg gtttaactta aatatcaata ataatagtaa ttaccttcta 5940

cccattatta cagcaggaaa attcattaat aaaggtaatt caatatattt accgctatct 6000

ttacaggtac atcattctgt ttgtgatggt tatcatgcag gattgtttat gaactctatt 6060

caggaattgt cagataggcc taatgactgg cttttataat atgagataat gccgactgta 6120

ctttttacag tcggttttct aatgtcacta acctgccccg ttagttgaag aaggttttta 6180

tattacagct ccagatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 6240

aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 6300

gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 6360

cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 6420

gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 6480

agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 6540

ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 6600

cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 6660

acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 6720

gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 6780

ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 6840

agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 6900

cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 6960

tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 7020

gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaaga 7069

<210> 4

<211> 4719

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

aagacctcga gaacccgaca tccggcgttc tcatggcggt gcttgccgcc agcggtattc 60

cgtatgtcaa gtggctgcgg tttatggtgc cgcttgctct gatttggttc ttgatcgggc 120

ttgtctttat cgtgatcgga gtcatgatca attgggggcc gttttaacga ttgctgcccg 180

ccggcttgta cggcgggctt ttgagttatt cattgcagaa gcgcaggctg ttattgtaac 240

atgtaagcca taagccattc gtaaaagtgc gggaggaagg tcatgaataa tctgcgtaat 300

agactttcag gcgtgaatgg gaaaaataag agagtaaaag aaaaagaaca aaaaatctgg 360

tcggagattg ggatgatagc gggagcattt gcgctgcttg atgtgatcat ccgcggcatt 420

atgtttgaat ttccgtttaa agaatgggct gcaagccttg tgtttttgtt catcattatc 480

ttatattact gcatcagggc tgcggcatcc ggaatgctca tgccgagaat agacaccaaa 540

gaagaactgc aaaaacgggt gaagcagcag cgaatagaat caattgcggt cgcctttgcg 600

gtagtggtgc ttacgatgta cgacaggggg attccccata cattcttcgc ttggctgaaa 660

atgattcttc tttttatcgt ctgcggcggc gttctgtttc tgcttcggta tgtgattgtg 720

aagctggctt acagaagagc ggtaaaagaa gaaataaaaa agaaatcatc ttttttgttt 780

ggaaagcgag ggaagcgttc acagtttcgg gcagcttttt ttataggaac attgatttgt 840

attcactctg ccaagttgtt ttgatagagt gattgtgata attttaaatg taagcgttaa 900

caaaattctc cagtcttcac atcggtttga aaggaggaag cggaagaatg aagtaagagg 960

gatttttgac tccgaagtaa gtcttcaaaa aatcaaataa ggagtgtcaa ggctagcaag 1020

ataggtggta tgttttcgct tgaactttta aatacagcca ttgaacatac ggttgattta 1080

ataactgaca aacatcaccc tcttgctaaa gcggccaagg acgctgccgc cggggctgtt 1140

tgcgtttttg ccgtgatttc gtgtatcatt ggtttactta tttttttgcc aaagctgtaa 1200

tggctgaaaa ttcttacatt tattttacat ttttagaaat gggcgtgaaa aaaagcgcgc 1260

gattatgtaa aatataaagt gatagcggta ccccgggaac aaggaggaat aaaaaatgaa 1320

aaaatcagct gttaatccat ggcttgttgt ccttggtaca gtcatagtac aaatgggtct 1380

tgggacgata tatacatgga gtttattcaa tcagccttta gttagtaaat acggttggag 1440

tcttaacgca gttgcgataa ctttctcaat tactagtctt tctttagcat tttcaacttt 1500

atttgcgagt aaattgcaag aaaaatgggg acttcgtaaa cttattatga tagctggact 1560

agcattagga cttggattaa tacttagttc acaagcttcc tcattaatat tgctttatgt 1620

actagcggga gttgttgtag gatatgcaga tggtacagca tatatcactt cattatcaaa 1680

tttaataaaa tggtttccag agcggaaagg tttaattgct gggatttccg tctctgcata 1740

tggttctggt agcttaatct ttaaatacgt taacgcacag ttaattgaat cagttggtgt 1800

atcacaagca tttatatatt ggggtttaat tgttacagct atgattgtcc ttggagcttg 1860

tttaatccat caagctgctg atcaaagtgc agttcaggaa acaaaaactc atgaatacac 1920

aacgaaagaa atgttaggta caaaacaagt atacttatta tttattatgt tatttacatc 1980

atgtatgagt ggcttatact taattggtat ggtaaaagac attggtgttg aacttgtagg 2040

gcttagcgca gcgacagcag ctaatgcggt agctatggtt gcaatattca acacgttagg 2100

tcgtattatt ctaggaccgt tatcagataa aattggccgt ttaaaaatcg ttactggtac 2160

ttttgttgtt atggcaagtt cagtattagt tctaagtttc gtagatttaa attatggtat 2220

ttacttcgta tgtgtagcaa gtgtagcatt ttgctttggt ggaaatatta ctattttccc 2280

agctattgtt ggtgatttct tcggtatgaa aaaccatagt aagaattacg gaattgtgta 2340

tcaaggattt ggatttggag cgcttgccgg ttcctttatc ggtgcactgc taggtggatt 2400

caaaccaacc ttcatggtga tcggcctatt atgtgtcgtg tcatttatta tcgcaatgtt 2460

aattcaagca cctaatcaga aaaaagaaca agaagaagag taccgtagcg tagcataaat 2520

gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggtt agtcgttaaa ccgtgtgctc 2580

tacgaccaaa actataaaac ctttaagaac tttctttttt tacaagaaaa aagaaattag 2640

ataaatctct catatctttt attcaataat cgcatccgat tgcagtataa atttaacgat 2700

cactcatcat gttcatattt atcagagctc gtgctataat tatactaatt ttataaggag 2760

gaaaaaatat gggcattttt agtatttttg taatcagcac agttcattat caaccaaaca 2820

aaaaataagt ggttataatg aatcgttaat aagcaaaatt catataacca aattaaggag 2880

ggaaataatg aacgagaaaa atataaaaca cagtcaaaac tttattactt caaaacataa 2940

tatagataaa ataatgacaa atataagatt aaatgaacat gataatatct ttgaaatcgg 3000

ctcaggaaaa ggccatttta cccttgaatt agtaaagagg tgtaatttcg taactgccat 3060

tgaaatagac cataaattat gcaaaactac agaaaataaa cttgttgatc acgataattt 3120

ccaagtttta aacaaggata tattgcagtt taaatttcct aaaaaccaat cctataaaat 3180

atatggtaat ataccttata acataagtac ggatataata cgcaaaattg tttttgatag 3240

tatagctaat gagatttatt taatcgtgga atacgggttt gctaaaagat tattaaatac 3300

aaaacgctca ttggcattac ttttaatggc agaagttgat atttctatat taagtatggt 3360

tccaagagaa tattttcatc ctaaacctaa agtgaatagc tcacttatca gattaagtag 3420

aaaaaaatca agaatatcac acaaagataa acaaaagtat aattatttcg ttatgaaatg 3480

ggttaacaaa gaatacaaga aaatatttac aaaaaatcaa tttaacaatt ccttaaaaca 3540

tgcaggaatt gacgatttaa acaatattag ctttgaacaa ttcttatctc ttttcaatag 3600

ctataaatta tttaataagt aagttaaggg atgcataaac tgcatccctt aacttgtttt 3660

tcgtgtgcct attttttgtg aatcgattat gtcttttgcg cagtcggcgg gcaaggctag 3720

acgggactta ccgaaagaaa ccatcaatga tggtttcttt tttgttcata aatcagacaa 3780

aacttttctc ttgcaaaagt ttgtgaagtg ttgcacaata taaatgtgaa atacttcaca 3840

aacaaaaaga catcaaagag aaacataccc tggaaggatg attaatgatg aacaaacatg 3900

taaataaagt agctttaatc ggagcgggtt ttgttggaag cagttatgca tttgcgttaa 3960

ttaaccaagg aatcacagat gagcttgtgg tcattgatgt aaataaagaa aaagcaatgg 4020

gcgatgtgat ggatttaaac cacggaaagg cgtttgcgcc acaaccggtc aaaacatctt 4080

acggaacata tgaagactgc aaggatgctg atattgtctg catttgcgcc ggagcaaacc 4140

aaaaacctgg tgagacacgc cttgaattag tagaaaagaa cttgaagatt ttcaaaggca 4200

tcgttagtga agtcatggcg agcggatttg acggcatttt cttagtcgcg acaaatccgg 4260

ttgatatcct gacttacgca acatggaaat tcagcggcct gccaaaagag cgggtgattg 4320

gaagcggcac aacacttgat tctgcgagat tccgtttcat gctgagcgaa tactttggcg 4380

cagcgcctca aaacgtacac gcgcatatta tcggagagca cggcgacaca gagcttcctg 4440

tttggagcca cgcgaatgtc ggcggtgtgc cggtcagtga actcgttgag aaaaacgatg 4500

cgtacaaaca agaggagctg gaccaaattg tagatgatgt gaaaaacgca gcttaccata 4560

tcattgagaa aaaaggcgcg acttattatg gggttgcgat gagtcttgct cgcattacaa 4620

aagccattct tcataatgaa aacagcatat taactgtcag cacatatttg gacgggcaat 4680

acggtgcaga tgacgtgtac atcggtgtcc cggggtaca 4719

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cccgggaaca aggaggaata aaaaatgaaa aaatcagctg ttaatccatg 50

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cgacggccag tgaattcatt tatgctacgc tacggtactc ttc 43

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gctgattttt tcatttttta ttcctccttg ttcccggggt 40

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gagtaccgta gcgtagcata aatgaattca ctggccgtcg ttttacaac 49

Claims (4)

1.一种减少及推迟枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6051a芽孢生成的分子改造方法，其特征在于，是通过在宿主细胞中表达SEQ ID NO.1所示的调节基因来完成的。

2.如权利要求1所述的一种减少及推迟枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6051a芽孢生成的分子改造方法，其特征在于，通过构建包含SEQ ID NO.1所示的调节基因的质粒并转入宿主细胞来实现，具体如下：

(1)通过PCR的方式获得调节基因，并将其构建到表达载体上得到重组载体；

(2)将重组载体在宿主细胞中进行表达获得重组菌株。

3.如权利要求2所述的一种减少及推迟枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6051a芽孢生成的分子改造方法，其特征在于，所述表达载体为pMK4质粒；所述重组载体为pMK4-2367，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求1所述的一种减少及推迟枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6051a芽孢生成的分子改造方法，其特征在于，通过在宿主基因组上整合表达SEQ ID NO.1所示的调节基因来实现，具体如下：

(1)合成线性DNA片段amyLRE-2367；

(2)将amyLRE-2367在宿主细胞中表达，获得2367基因重组整合到了宿主细胞基因组中的重组菌株；

所述amyLRE-2367的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

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