CN103451224A - 枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法。本发明的方法利用upp正负筛选系统，对枯草芽孢杆菌基因组进行无痕修饰。本发明的方法利用ComK表达系统，使枯草芽孢杆菌具有优异dsDNA转化效率，可达3～5×10³cfu/μg dsDNA。同时利用了外源核酸内切酶I-SceI表达系统，将双链DNA断裂引入至基因组，显著提高了负筛选分子内基因重组效率，最高可达8×10^-4。本发明的方法可以迭代修饰枯草芽孢杆菌基因组多个目的核酸序列，包括引入基因突变至基因组，从基因组中敲除目的基因序列以及大片段基因组序列删除等。

Description

枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法

技术领域

本发明属于基因组改造技术领域，具体地涉及一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法。 

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种，广泛存在于自然界。无致病性，对人畜无害，不污染环境，具有较强的抗逆能力和抗菌防病作用，被广泛用为分子生物学研究模式生物以及工业化生产高产菌株宿主。近年來，随着第二代和第三代高通量测序技术的快速发展，处于功能基因组时代的比较基因组测序，逆向代谢工程，适应性进化等方面分子生物学研究迫切需要一种快速，无痕，高效的等位基因置换和基因组修饰工具。 

枯草芽孢杆菌虽然在自然条件下也可形成感受态吸收外源DNA，但是通常形成时期是处于对数生长末期开始形成，而通常形成感受态的比例不高，约占5%～15%。这直接导致外源DNA转化效率较低，加大了基因操作的难度。目前，应用于枯草芽孢杆菌感受态制备的方法有多种，如Spizizen转化、噬菌体转导，原生质体转化和电转等。以传统的Spizizen转化方法为例，该方法主要原理是，使枯草芽孢杆菌生长在相对贫瘠的培养基中，诱导细胞形成自然感受态能力，这种技术较成熟，但是具有转化效率低，制备过程复杂，培养基配制过程不易等缺点。另外几种方法虽然具有较高的转化效率，但是制备过程过于复杂。目前已经有文献表明，处于枯草芽孢杆菌感受态形成过程中ComK蛋白的强表达可以进一步激活自身的转录而大幅度提高其在胞内的浓度，并且激活晚期感受态基因（包括与DNA吸附、吸收和重组的有关的基因）开始转录，可大幅度的提高细胞形成感受态的比率，对于外源DNA的转化效率已经可以达到10³ cfu/μg dsDNA。 

正负选择系统是基因组修饰的常用筛选方法之一，为了更好地筛选发生同源重组的阳性转化子，1988年Mansour等人设计了正负双向选择系统（Positive-Negative Selection，PNS），解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。常用的正选择标记有：氯霉素（crm）、新霉素磷酸转移酶（neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）等。常用的负选择标记基因有mazF、blaI、ysbC、hwel、upp等。其中，mazF用时间长之后会积累产生抗mazF敏感性菌株的可能性，blaI和ysbC需要宿主细胞为对应的营养缺陷型菌株，而hwel为来自真核细胞表达蛋白，在原核细胞内的表达需要精心的拼接和密码子优化修饰，应用上较为繁琐。而upp为枯草芽孢杆菌内源基因，编码尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRTase），催化尿嘧啶生成尿苷单磷酸（UMP），从而利用胞外尿嘧啶。嘧啶类似物5-氟尿嘧啶（5FU）也能够被UPRTase催化生成5-F-dUMP，而5-F-dUMP是枯草芽孢杆菌胸苷酸合成酶的强烈抑制剂，会导致细胞死亡。枯草芽孢杆菌upp基因缺失突变株可以在低浓度（10-20μM）的5FU负筛选 培养基上生长，因此可以将upp基因作为负筛选标记。 

传统应用upp基因的枯草芽孢杆菌高效基因组修饰的技术方法是：首先构建枯草芽孢杆菌upp缺失宿主菌，其次将upp基因和抗性基因连接在一起组成“upp通用盒子”，然后将目标基因上下游同源臂与upp基因通过融合PCR方法融合为dsDNA片段，进一步通过同源重组方式将dsDNA片段整合至upp缺失枯草芽孢杆菌基因组。利用抗性基因筛选阳性转化子，最后通过细胞内同源臂的第二次分子内同源重组弹出upp基因，利用5FU负筛选培养基筛选阳性转化子并通过测序进行验证。该方法存在一些缺陷：一方面，枯草芽孢杆菌感受态细胞对于外源DNA的吸收能力较低（如Spizizen方法），导致外源DNA第一次基因重组效率较低；另一方面，整个基因组修饰过程涉及到的第二次分子内的基因重组仅为负筛选，假阳性率较高，给菌株筛选带来一定难度；同时第二次分子内同源重组的效率较低，文献报道仅为10^-7～10^-6数量级左右，同样很难筛选出阳性重组菌株。 

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种能显著提高分子内重组效率并且不留下任何筛选标记的枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法。 

本发明的第二个目的是提供第二种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法。 

本发明的技术方案概述如下： 

一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法，包括如下步骤： 

（1）构建含有I-SceI酶切位点的模板质粒pSS、温度敏感型I-SceI表达质粒pEBS-copl和含有ComK诱导表达系统整合质粒pST；所述质粒pSS含有正筛选标记基因cat，负筛选标记基因upp和I-SceI酶切识别位点； 

（2）将所述质粒pST整合至菌株B.subtilis168，获得了upp缺失和ComK表达系统整合菌株BTK； 

（3）将所述质粒pEBS-copl转化至所述菌株BTK，获得无痕修饰出发菌株BUK； 

（4）以所述质粒pSS为模板，通过PCR获得正负筛选盒子；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR获得目标操作基因的含有DR序列的上游同源臂F和含有DR序列的下游同源臂B；将所述含有DR序列的上游同源臂F、正负筛选盒子和含有DR序列的下游同源臂B通过融合PCR得到目的dsDNA片段1； 

（5）阿拉伯糖诱导无痕修饰出发菌株BUK形成感受态细胞；用所述dsDNA片段1转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记氯霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-I； 

（6）将所述发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-I接种于LB液体培养基，在培养过程中加入木糖，通过木糖诱导核酸内切酶I-SceI表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除两DR区之间所有的筛选标记的细胞，涂布于5FU负筛选平板上筛选出基因组无痕修饰的阳性菌株BUK-II。 

另一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法，包括如下步骤： 

（1）构建含有I-SceI酶切位点的模板质粒pSS、温度敏感型I-SceI表达质粒pEBS-copl和含 有ComK诱导表达系统整合质粒pST；所述质粒pSS含有正筛选标记基因cat，负筛选标记基因upp和I-SceI酶切识别位点； 

（2）将所述质粒pST整合至菌株B.subtilis168，获得了upp缺失和ComK表达系统整合菌株BTK; 

（3）将所述质粒pEBS-copl转化至所述菌株BTK，获得无痕修饰出发菌株BUK; 

（4）以所述质粒pSS为模板，通过PCR获得正负筛选盒子；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR分别获得目标删除区域的上游同源臂A、上游同源臂C和下游同源臂E；将上游同源臂A、下游同源臂E、正负筛选盒子和上游同源臂C通过融合PCR得到融合dsDNA片段2； 

（5）阿拉伯糖诱导无痕修饰出发菌株BUK形成感受态细胞；用所述dsDNA片段2转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记氯霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-III； 

（6）以质粒pDK为模板，通过PCR获得Kan基因并引入I-SceI酶切识别位点；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR分别获得目标删除区域的下游同源臂D和下游同源臂E；将下游同源臂D、含有I-SceI酶切识别位点的Kan基因和下游同源臂E通过融合PCR得到融合dsDNA片段3； 

（7）阿拉伯糖诱导菌株BUK-III形成感受态细胞；用所述dsDNA片段3转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记卡那霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-IV； 

（8）将所述阳性转化子BUK-IV接种于LB液体培养基，在培养过程中加入木糖，通过木糖诱导核酸内切酶I-SceI表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除同源臂E之间所有的筛选标记的细胞，涂布于5FU负筛选平板上筛选出基因组无痕修饰的阳性菌株BUK-V。 

本发明的优点： 

本发明以构建负筛选标记upp缺失的出发菌株的同时，引入阿拉伯糖诱导的内源感受态调节蛋白ComK表达系统，可使出发菌株在6h培养过程内即可形成感受态，大大减化了常规感受态的制备流程，并且也不需要借助额外的实验设备，同时具有优异的转化外源DNA能力。其中外源dsDNA片段的重组效率高达3～5×10³cfu/μg dsDNA，是传统Spizizen转化效率（1～3×10¹cfu/μg dsDNA）的100倍以上（见表3）。 

本发明使用了外源核酸内切酶I-SceI，通过木糖诱导，可以将一个或多个双链DNA断裂引入至基因组。基因组双链断裂诱发细胞产生SOS应激响应，并同时提高分子内基因重组效率，可得到更多目的阳性转化子。其中分子内重组效率最高可达8×10^-4，是未采用I-SceI诱导重组效率的100倍左右（见表3）。 

本发明可以连续/迭代修饰枯草芽孢杆菌基因组的一个或多个目的核酸序列，包括添加一个或多个核苷酸至基因组，从基因组中敲除目的基因序列，改变基因组上一个或多个内源基因、基因间基因序列以及大片段基因序列删除等。 

附图说明

图1为含有I-SceI酶切位点的模板质粒pSS和温度敏感型I-SceI表达质粒pEBS-copl的图谱。 

图2为枯草芽孢杆菌无痕基因组修饰出发菌株BUK的构建。 

图3为一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰流程图（基因突变）。 

图4为一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰流程图（基因敲除）。 

图5为另一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰流程图（大片段基因组序列删除）。 

图6为PCR验证无痕ccpN点突变和无痕ccpN敲除。 

图7为PCR验证无痕基因组大片段删除75.9kb-DEL。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。 

本发明所用到的原始菌株B.subtilis168来源为BGSC（Bacillus Genetic Stock Center，http://www.bgsc.org/）。 

本发明所用到的原始质粒pE194、pAX01、pC194和pDK来源为BGSC。 

pTKRED来源于参考文献：KuhlmanTE,Cox EC:Site-specific chromosomal integration of large synthetic constructs.Nucleic Acids Res 2010,38:e92。 

本发明所用到的所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买（http://www.thermoscientificbio.com/fermentas）。其他生化试剂从生工生物工程（上海）股份有限公司购买（http://www.sangon.com/）。 

实施例1 

1、含有I-SceI酶切位点的模板质粒pSS的构建（图谱见图1A） 

利用PCR反应以pC194质粒为模版使用上下游引物pSS-P1和pSS-P2获得cat基因、以B.subtilis168基因组为模版使用上下游引物pSS-P3和pSS-P4获得upp基因，再以上面的两个片段为模版，利用融合PCR反应使用上下游引物pSS-P1和pSS-P4获得重组片段cat-upp。将该重组片段与pUC18（通用质粒）质粒经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到基础操作质粒pSS（所用引物序列见表2）。 

2、温度敏感型表达质粒pEBS-copl的构建（图谱见图1B） 

利用PCR反应以pE194质粒为模版使用上下游引物pEBS-P1和pEBS-P2获得erm基因，将该片段与pUC18质粒经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到温度敏感型质粒pEB。以pTKRED为模版使用上下游引物pEBS-P3和pEBS-P4获得I-SceI编码基因，将该片段与质粒pAX01经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到质粒pAX01-SceI。以pAX01-SceI为模版使用上下游引物pEBS-P5和pEBS-P6获得含有I-SceI编码基因、木糖诱导启动子P_xylA、木糖操纵子阻遏蛋白xylR编码基因的片段，将该片段与质粒pEB经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到质粒pEBS。以pEBS质粒为模板，以pEBS-P7和pEBS-P8为引物，使用NEB公司的Phusion^TM Site-directed Mutagenesis kit对pEBS质粒进行定点突变，最终获得具有C1258G目的突变的温度敏感型表达质粒pEBS-copl（所用引物序列见表2）。 

3、含有ComK诱导表达系统整合质粒pST的构建（图谱见图2A） 

以pSS为出发质粒，构建包含有以下基因元件的整合型质粒pST：comK内源感受态调节因子编码基因、araR阿拉伯糖启动子阻遏蛋白，P_ara阿拉伯糖启动子，以及两个同源臂upp-F和upp-B（均约1000bp大小）。具体构建流程：利用PCR反应以B. subtilis 168基因组为模版，使用上下游引物pST-P1和pST-P2获得同源臂upp-F，将该片段与pSS质粒经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到质粒pSS-F。利用PCR反应以B.subtilis168基因组为模版，使用上下游引物pST-P3和pST-P4获得同源臂upp-B，将该片段与pSS-F质粒经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到质粒pSS-FB。利用PCR反应以B.subtilis168基因组为模版，使用上下游引物pST-P5和pST-P6获得comK基因。利用PCR反应以B.subtilis168基因组为模版使用上下游引物pST-P7和pST-P8获得含有P_ara启动子和araR基因的片段。采用融合PCR，将上述两个PCR片段融合获得P_ara-comK-araR重组片段，与质粒pSS-FB经酶切、酶连、转化、验证等操作后得到质粒pST（所用引物序列见表2）。 

4、无痕修饰出发菌株BUK的获得（见图2B）： 

通过Spizizen转化方法，以双交换基因重组方式，将上述质粒pST转化至菌株B.subtilis168，置换基因组上upp基因编码区域，在5FU负筛选平板上筛选出阳性转化子，将其命名为BTK。然后，将温度敏感型表达质粒pEBS-copl转化至菌株BTK，在红霉素筛选平板上筛选出阳性转化子，获得基因组无痕修饰出发菌株BUK。 

其中，抗生素筛选平板为加入抗生素的LB固体培养基。 

红霉素筛选平板为加入红霉素使其终浓度是1μg/mL。 

氯霉素筛选平板为加入氯霉素使其终浓度是5μg/mL。 

卡那霉素筛选平板为加入卡那霉素使其终浓度是5μg/mL。 

LB液体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，调节pH至7.5。0.1Mpa压力下灭菌20min。LB固体培养基配方为：在LB液体培养基中加入琼脂粉（终浓度15g/L），0.1Mpa压力下灭菌20min。 

5FU负筛选培养基配方见表1： 

表15FU负筛选培养基配制表 

表1中成分的百分比浓度均为质量体积百分比。 

表1中的10×Spizzen基本盐：2g/L（NH₄）₂SO₄，18.3g/L K₂HPO₄，6g/L KH₂PO₄，12g/L C₆H₅Na₃O₇·2H₂O，pH7.2，0.1Mpa压力下灭菌20min。 

表1中的1000×微量元素：27g/L FeCl₃·6H₂O，2g/L ZnCl₂·4H₂O，2g/LCaCl₂·2H₂O，2g/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.9g/L CuSO₄·5H₂O，0.5g/L H₃BO₃pH7.2，0.1Mpa压力下灭菌20min。 

实施例2：无痕基因操作引入基因突变（ccpN*G130T）见图3 

（1）以质粒pSS为模板，以引物ccpN-Mut-P3和ccpN-Mut-P4为扩增引物，PCR获得正负筛选盒子；以B.subtilis168基因组为模板，以ccpN-Mut-P1和含有目的基因突变（G130T）ccpN-Mut-P2为引物，PCR获得包含有目的突变（G130T）DR序列的上游同源臂F-1（1379bp）；以B.subtilis168为模板，以含有目的基因突变（G130T）的ccpN-Mut-P5和ccpN-Mut-P6为引物，PCR获得包含有目的突变（G130T）DR序列的下游同源臂B-1（1339bp）；将所述含有目的突变（G130T）DR序列的上游同源臂F-1、正负筛选盒子和含有目的突变（G130T）DR序列的下游同源臂B-1，以ccpN-Mut-P7和ccpN-Mut-P8为引物，通过融合PCR得到目的dsDNA片段1-A； 

（2）将BUK接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按照10%接种量转接于5mL LB液体培养基，当菌体密度OD₆₀₀达到1左右，加入阿拉伯糖使终浓度为0.4%，诱导ComK表达，继续培养2h即可形成感受态细胞。将形成的感受态细胞100μL，加入0.2μg所述目的dsDNA片段1-A，37℃温浴90min，加入1mL LB液体培养基后37℃继续培养1h，涂氯霉素筛选平板，37℃培养12～16h。 

（3）将氯霉素筛选平板上得到的菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12～14h后提取基因组，以ccpN-Mut-P7和ccpN-Mut-P8为引物，PCR筛选出成功发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-I-A；其中，目的dsDNA片段1-A双交换基因重组效率计算方式及结果汇总见表3。 

（4）将BUK-I-A接种于5mL LB液体培养基中，30℃，220rpm培养。当菌体密度OD₆₀₀达到1左右，添加木糖，使终浓度为1%，诱导温度敏感型表达质粒pEBS-copl上I-SceI基因的表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除两DR区之间所有的筛选标记的细胞，继续培养6h后，选择适量菌液涂布于5FU负筛选平板，37℃培养24h。 

（5）将5FU负筛选平板上得到的菌落同时转接于氯霉素筛选平板和红霉素筛选平板，37℃培养12h。 

（6）将成功丢失了氯霉素抗性的菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h后提取基因组，以ccpN-Mut-P7和ccpN-Mut-P8为引物，PCR筛选出成功丢失正负筛选盒子的阳性转化子，即为无痕修饰的阳性菌株（无痕基因突变成功的目的菌株）BUK-II-A。其中，对于分子内重组效率数据的计算方式及结果汇总见表3。另外，ccpN突变涉及的两次PCR筛选汇总结果见图6A。泳道M：1kb DNA Ladder；泳道A1：模板为菌株BUK-I-A；泳道A2：模板为菌株BUK-II-A；泳道A3：模板为dsDNA片段1-A（阳性对照）；泳道A4：模板为菌株BUK（阴性对照）； 

实施例3：无痕基因操作引入基因敲除（ΔccpN）见图4 

（1）以质粒pSS为模板，以引物ccpN-Del-P3和ccpN-Del-P4为扩增引物，PCR获得正负筛选盒子；以B.subtilis168基因组为模板，以ccpN-Del-P1和ccpN-Del-P2为引物，PCR获得包含有DR序列的上游同源臂F-2（1110bp）；以B.subtilis168基因组为模板，以含有DR序列的ccpN-Del-P5和ccpN-Del-P6为引物，PCR获得包含有DR序列的下游同源臂B-2（1140bp）；将所述含有DR序列的上游同源臂F-2、正负筛选盒子和含有DR序列的下游同源臂B-2，以ccpN-Del-P7和ccpN-Del-P8为引物，通过融合PCR得到目的dsDNA片段1-B； 

（2）将BUK接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按照10%接种量转接于5mL LB液体培养基，当菌体密度OD₆₀₀达到1左右，加入阿拉伯糖使终浓度为0.4%，诱导ComK表达，继续培养2h即可形成感受态细胞。将形成的感受态细胞100μL，加入0.2μg所述目的dsDNA片段1-B，37℃温浴90min，加入1mL LB液体培养基后37℃继续培养1h，涂氯霉素筛选平板，37℃培养12h。 

（3）将氯霉素筛选平板上得到的菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h提取基因组，以ccpN-Del-P7和ccpN-Del-P8为引物，PCR筛选出成功发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-I-B；其中，目的dsDNA片段1-B双交换基因重组效率计算方式及结果汇总见表3。 

（4）将BUK-I-B接种于5mL LB液体培养基中，30℃，220rpm培养。当菌体密度OD₆₀₀达到1左右，添加木糖使终浓度为1%，诱导温度敏感型表达质粒pEBS-copl上I-SceI基因的表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除两DR区之间所有的筛选标记的细胞，继续培养6h后，选择适量菌液涂布于5FU负筛选平板，37℃培养24h。 

（5）将5FU负筛选平板上得到的菌落同时转接于氯霉素筛选平板和红霉素筛选平板，37℃培养12h。 

（6）将成功丢失了氯霉素抗性的菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h后提取基因组，以ccpN-Del-P7和ccpN-Del-P8为引物，PCR筛选出成功丢失正负筛选盒子的阳性转化子，即为无痕修饰的阳性菌株（无痕基因敲除成功的目的菌株）BUK-II-B。其中，对于分子内重组效率数据的计算方式及结果汇总见表3。另外，ccpN敲除涉及的两次PCR筛选汇总结果见图6B：泳道M：1kb DNA Ladder；泳道B5：模板为菌株BUK-I-B；泳道B6：模板为菌株BUK-II-B；泳道B7：模板为dsDNA片段1-B（阳性对照）；泳道B8：模板为菌株BUK（阴性对照）； 

实施例4：无痕基因操作进行大片段基因序列删除(75.9kb-DEL)见图5 

（1）以质粒pSS为模板，以引物75.9kb-Del-P5和75.9kb-Del-P6为扩增引物，PCR获得正负筛选盒子；以B.subtilis168基因组为模板，以75.9kb-Del-P1和75.9KB-Del-P2为引物，PCR获得目标删除区域的上游同源臂A；以B.subtilis168基因组为模板，以75.9kb-Del-P3和75.9kb-Del-P4为引物，PCR获得目标删除区域的下游同源臂E；以B.subtilis168基因组为模板，以75.9kb-Del-P7和75.9KB-Del-P8为引物，PCR获得目标删除区域的上游同源臂C；将上游同源臂A、下游同源臂E、正负筛选盒子和上游同源臂C通过融合PCR得到融合dsDNA 片段2； 

（2）将BUK接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按照10%接种量转接于5mL LB液体培养基，当菌体密度OD₆₀₀达到1左右，加入阿拉伯糖使终浓度为0.4%，诱导ComK表达，继续培养2h即可形成感受态细胞。将形成的感受态细胞100μL，加入0.2μg所述dsDNA片段2，37℃温浴90min，加入1mL LB液体培养基后37℃继续培养1h，涂氯霉素筛选平板，37℃培养12h。 

（3）将氯霉素筛选平板上得到的菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h后提取基因组，以75.9kb-Del-P1和75.9kb-Del-P8为引物，PCR筛选出成功发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-III；其中，目的dsDNA片段2双交换基因重组效率计算方式及结果汇总见表3。 

（4）以质粒pDK为模板，以引物75.9kb-Del-P11和75.9kb-Del-P12为扩增引物，通过PCR获得Kan基因并引入I-SceI酶切识别位点；以B.subtilis168基因组为模板，以75.9kb-Del-P9和75.9kb-Del-P10为引物，PCR获得目标删除区域的下游同源臂D；以B.subtilis168基因组为模板，以P75.9kb-Del-P13和75.9kb-Del-P14为引物，PCR获得目标删除区域的下游同源臂E；将下游同源臂D、含有I-SceI酶切识别位点的Kan基因和下游同源臂E通过融合PCR得到融合dsDNA片段3； 

（5）将BUK-III接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按照10%接种量转接于5mL LB液体培养基，当菌体密度OD₆₀₀达到1左右，加入阿拉伯糖使终浓度为0.4%，诱导ComK表达，继续培养2h即可形成感受态细胞。将形成的感受态细胞100μL，加入0.2 μg所述dsDNA片段3，37℃温浴90min，加入1mL LB液体培养基后37℃继续培养1h，涂卡那霉素筛选平板，37℃培养12h。 

（6）将卡那霉素筛选平板上得到的菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h提取基因组，以75.9kb-Del-P9和75.9kb-Del-P14为引物，PCR筛选出成功发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-IV；其中，目的dsDNA片段3双交换基因重组效率计算方式及结果汇总见表3。 

（7）将BUK-IV接种于5mL LB液体培养基中，30℃，220rpm培养。当菌体密度OD₆₀₀达到1左右，添加木糖使浓度为2%，诱导温度敏感型表达质粒pEBS-copl上I-SceI基因的表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除同源臂E之间所有的筛选标记的细胞，继续培养6h，选择适量菌液涂布于5FU负筛选平板，37℃培养24h。 

（8）将5FU负筛选平板上得到的菌落同时转接于氯霉素筛选平板、卡那霉素筛选平板和红霉素筛选平板，37℃培养12h。 

（9）将成功丢失了氯霉素抗性和卡那霉素抗性的菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h后提取基因组，以75.9kb-DEL-P17和75.9kb-DEL-P18为引物，以及以75.9kb-DEL-P15和75.9kb-DEL-P16为引物PCR筛选出成功丢失正负筛选盒子的阳性转化子，即为基因组无痕修饰的阳性菌株（无痕大片段基因删除的目的菌株）BUK-V。其中，对于分子内重组效率数据的计算方式及结果汇总见表3。另外，75.9kb大片段基因组序列删 除的PCR验证结果汇总见图7。a区域，验证无痕基因组大片段删除75.9kb-DEL，扩增引物为75.9kb-DEL-P15和75.9kb-DEL-P16，扩增目的片段pksG基因(1789763-1791405SubtiList coordinates)；b区域，验证无痕基因组大片段删除75.9kb-DEL，扩增引物为75.9kb-DEL-P17和75.9kb-DEL-P18，扩增目的片段为75.9kb DNA片段；泳道M：1kb DNA Ladder；泳道1：模板为菌株BUK-V；泳道2：模板为菌株BUK-IV；泳道3：模板为菌株BUK； 

表2引物序列汇总 

表3双交换基因重组效率和分子内重组效率数据a 

^a数据为三次独立实验获得。 

^bccpN*，ccpN基因点突变（G130T）；ΔccpN，ccpN基因敲除；75.9kb-DEL，75.9kb大片段基因组序列删除（1781306-1857233SubtiList coordinates）。 

^c双交换基因重组效率计算方式为：Cm^R（或Km^R）阳性转化子数目/μg dsDNA片段。 

^d分子内重组效率数据计算方式为：Nr/Nt。其中，Nr：30℃木糖诱导步骤中，100μl菌液获得的5FU^RCm^S细胞数量；Nt：30℃木糖诱导步骤中，100μl菌液所含总细胞数量。 

Claims (2)

1.一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法，其特征是包括如下步骤：

（1）构建含有I-SceI酶切位点的模板质粒pSS、温度敏感型I-SceI表达质粒pEBS-copl和含有ComK诱导表达系统整合质粒pST；所述质粒pSS含有正筛选标记基因cat，负筛选标记基因upp和I-SceI酶切识别位点；

（2）将所述质粒pST整合至菌株B.subtilis168，获得了upp缺失和ComK表达系统整合菌株BTK；

（3）将所述质粒pEBS-copl转化至所述菌株BTK，获得无痕修饰出发菌株BUK；

（4）以所述质粒pSS为模板，通过PCR获得正负筛选盒子；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR获得目标操作基因的含有DR序列的上游同源臂F和含有DR序列的下游同源臂B；将所述含有DR序列的上游同源臂F、正负筛选盒子和含有DR序列的下游同源臂B通过融合PCR得到目的dsDNA片段1；

（5）阿拉伯糖诱导无痕修饰出发菌株BUK形成感受态细胞；用所述dsDNA片段1转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记氯霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-I；

（6）将所述发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-I接种于LB液体培养基，在培养过程中加入木糖，通过木糖诱导核酸内切酶I-SceI表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除两DR区之间所有的筛选标记的细胞，涂布于5FU负筛选平板上筛选出基因组无痕修饰的阳性菌株BUK-II。

2.一种枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法，其特征是包括如下步骤：

（1）构建含有I-SceI酶切位点的模板质粒pSS、温度敏感型I-SceI表达质粒pEBS-copl和含有ComK诱导表达系统整合质粒pST；所述质粒pSS含有正筛选标记基因cat，负筛选标记基因upp和I-SceI酶切识别位点；

（2）将所述质粒pST整合至菌株B.subtilis168，获得了upp缺失和ComK表达系统整合菌株BTK;

（3）将所述质粒pEBS-copl转化至所述菌株BTK，获得无痕修饰出发菌株BUK;

（4）以所述质粒pSS为模板，通过PCR获得正负筛选盒子；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR分别获得目标删除区域的上游同源臂A、上游同源臂C和下游同源臂E；将上游同源臂A、下游同源臂E、正负筛选盒子和上游同源臂C通过融合PCR得到融合dsDNA片段2；

（5）阿拉伯糖诱导无痕修饰出发菌株BUK形成感受态细胞；用所述dsDNA片段2转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记氯霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-III；

（6）以质粒pDK为模板，通过PCR获得Kan基因并引入I-SceI酶切识别位点；以枯草芽孢杆菌基因组为模板，通过PCR分别获得目标删除区域的下游同源臂D和下游同源臂E；将下游同源臂D、含有I-SceI酶切识别位点的Kan基因和下游同源臂E通过融合PCR得到融合dsDNA片段3；

（7）阿拉伯糖诱导菌株BUK-III形成感受态细胞；用所述dsDNA片段3转化至所述感受态细胞中，通过正筛选标记卡那霉素抗性来筛选发生双交换基因重组的阳性转化子BUK-IV；

（8）将所述阳性转化子BUK-IV接种于LB液体培养基，在培养过程中加入木糖，通过木糖诱导核酸内切酶I-SceI表达，得到基因组上DNA双链断裂，发生分子内同源重组删除同源臂E之间所有的筛选标记的细胞，涂布于5FU负筛选平板上筛选出基因组无痕修饰的阳性菌株BUK-V。

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