CN114032248B - 一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法。将pilA基因的启动子片段PpilA和sacB基因的ORF片段融合获得PpilA‑SacB的模块，扩增出四环素抗性基因，获得Ptet‑TCR模块，将PpilA‑SacB模块和Ptet‑TCR模块构建到pBJ113载体的BamHI和XbaI位点，获得质粒pBJ116。本发明的质粒pBJ116，其含有卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，通过两次正负筛选系统，实现黄色黏球菌基因组上大片段的敲除。经试验发现，本发明的方法获得的Myxochelin A编码基因ΔMXAN_3618突变体产生铁载体的水平显著降低，并且捕食铜绿假单胞菌的能力显著降低。并且该方法所需的时间较短。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法。
背景技术
黏细菌能够产生结构新颖、种类丰富、作用机制多样的生物活性代谢产物，主要包括：肽类，大环类，芳香族等，在农业、医药等方面具有重要的研究和应用价值。由于绝大多数黏细菌存在聚团生长、菌落生长缓慢、难以形成单菌落等现象使得其很难进行遗传操作，严重阻碍了黏细菌中生物活性代谢产物的开发和利用。黄色黏球菌DK1622具有较好的分散性和较快的生长速度是研究黏细菌生物活性代谢产物异源表达的理想模式菌株。但是现有的敲除方法在构建基因组大片段敲除方面存在筛选强度大、突变体纯化时间长等问题，严重制约了DK1622作为底盘工程菌株的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄色黏球菌大片段敲除质粒，即利用其构建黄色黏球菌大片段敲除的方法。本发明是基于同源重组技术利用两种不同的正负筛选技术，将DK1622基因组上的目的片段敲除。该方法不但提高了黏细菌突变体的筛选效率，而且缩短了获得突变体的时间。
本发明的第一个目的是提供大片段敲除质粒pBJ116，将pilA基因的启动子片段PpilA和sacB基因的ORF片段融合获得PpilA-SacB的模块，扩增出四环素抗性基因，获得Ptet-TCR模块，将PpilA-SacB模块和Ptet-TCR模块构建到pBJ113载体的BamHI和XbaI位点，获得质粒pBJ116；
所述的pilA基因的启动子片段PpilA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的sacB基因的ORF片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，所述的四环素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选，所述的大片段敲除质粒pBJ116的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个目的是提供敲除质粒pBJ116在敲除目的片段中的应用。
优选是大片段敲除质粒pBJ116在敲除黄色黏球菌中目的片段中的应用
本发明的第三个目的是提供一种大片段敲除的方法，设定待敲除基因的上游同源臂和下游同源臂序列，扩增后，将上游同源臂插入质粒pBJ116的PpilA-SacB模块的前面，将下游同源臂插入质粒pBJ116的Ptet-TCR模块的后面，获得敲除质粒，将敲除质粒转入宿主菌中与待敲除基因发生同源重组，利用卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，筛选获得敲除待敲除基因的宿主菌。
优选，所述的宿主菌是黄色黏球菌。
优选，所述的待敲除基因是Myxochelin A编码基因MXAN_3618。
优选，具体的步骤为：
首先构建MXAN_3618基因的上游同源臂MyxA-Up-flank，利用引物MyxA-1和MyxA-2扩增上游同源臂1-2；同时利用引物MyxA-3和MyxA-4扩增上游同源臂3，以上游同源臂1-2和上游同源臂3为模板，利用MyxA-1和MyxA-4引物进行PCR扩增，获得上游同源臂的融合片段MyxA-Up-flank，利用同源重组将这该片段构建到pBJ116质粒的SacI和BamHI位点，获得pBJ116-MyxA(Up)质粒；利用引物MyxA-5和MyxA-6扩增下游同源臂2，利用引物MyxA-7和MyxA-8扩增下游同源臂3-4，以下游同源臂2和下游同源臂3-4为模板，利用MyxA-5和MyxA-8引物进行PCR扩增，获得下游同源臂的融合片段MyxA-Down-flank，利用同源重组将这该片段构建到pBJ116-MyxA(Up)质粒的XbaI和SalI位点，从而获得pBJ116-MyxA敲除质粒；将连接的质粒转化到大肠杆菌中，提取pBJ116-MyxA敲除质粒；
制得黄色黏球菌DK1622感受态，将pBJ116-MyxA敲除质粒转化到黄色黏球菌DK1622感受态中，利用含卡那霉素的培养基筛选，获得单交换菌株，再利用含半乳糖的培养基筛选双交换菌株，然后用含四环素的培养基筛选，再利用含有蔗糖的培养基筛选，获得基因MXAN_3618敲除的黄色黏球菌；
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| MyxA-1 | acggccagtgaattcgagctcGCTCGTCCTGAGCGCCGA |
| MyxA-2 | gtcactcactgCTCTTCGGGGAGGGTGAGC |
| MyxA-3 | cccgaagagCAGTGAGTGACCCGCAGGC |
| MyxA-4 | cagcacgggtcttcaggatccCTACTGGGATACTGACTCGGTCG |
| MyxA-5 | gcgcagggctttatttctagaATGACTGACATCTCTCGGGCC |
| MyxA-6 | gtcactcactgCTCTTCGGGGAGGGTGAGC |
| MyxA-7 | cccgaagagCAGTGAGTGACCCGCAGGC |
| MyxA-8 | cttgcatgcctgcaggtcgacAGCCCACCCGATCTCCCC |
本发明第四个目的是提供敲除黄色黏球菌的MyxochelinA编码基因ΔMXAN_3618在降低黄色黏球菌捕食铜绿假单胞菌中的应用。
本发明的质粒pBJ116，其含有卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，通过两次正负筛选系统，实现黄色黏球菌基因组上大片段的敲除。经试验发现，本发明的方法获得的Myxochelin A编码基因ΔMXAN_3618突变体产生铁载体的水平显著降低，并且捕食铜绿假单胞菌的能力显著降低。并且该方法所需的时间较短。
附图说明
图1是pBJ116敲除系统构建的示意图。(A)pBJ116构建；(B)ΔMXAN_3618突变体构建的流程图。
图2是ΔMXAN_3618突变体PCR鉴定结果。
图3是ΔMXAN_3618突变体突变位点的测序分析。
图4是竞争实验分析MXAN_3618基因缺失对黏细菌捕食铜绿假单胞菌的影响。
具体实施方式
下面是本发明具体的实施示例。需要指出的是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在本发明的思路和范围下对实施方案的细节和形式进行的修改和替换均落入本发明的保护范围内。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1：
本发明涉及的黄色黏球菌DK1622菌株是模式菌种。
本实施例提供一种构建黄色黏球菌大片段敲除的方法，首先是改造pBJ113自杀载体。以黄色黏球菌DK1622的基因组为模板，利用引物pilA-1和pilA-2扩增pilA基因的启动子片段PpilA(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；以pJQ200SK质粒为模板，利用引物SacB-1和SacB-2扩增sacB基因的ORF片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；pilA基因的启动子片段PpilA的3’端和sacB基因的ORF片段5’端有20bp的同源序列，以pilA基因的启动子片段PpilA和sacB基因的ORF片段为模板，利用pilA-1和SacB-2引物进行PCR扩增，获得PpilA片段和sacB基因的ORF融合片段，即PpilA-SacB的模块。以pSWU30质粒为模板，利用引物TCR-5HR和TCR-3HR扩增四环素抗性基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，获得Ptet-TCR的模块。利用同源重组试剂盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit，货号C113-02)将PpilA-SacB模块和Ptet-TCR模块构建到pBJ113载体的BamHI和XbaI位点，获得pBJ116质粒(图1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
本实施例采用的pBJ116敲除系统构建黄色黏球菌中铁载体MyxochelinA的合成基因簇关键基因MXAN_3618(GenBank登录号：NC_008095)，方法如下：首先构建MXAN_3618基因的上游同源臂(MyxA-Up-flank)，利用引物MyxA-1和MyxA-2扩增上游同源臂1-2(MyxA-Up-flank 1-2)；同时利用引物MyxA-3和MyxA-4扩增上游同源臂3(MyxA-Up-flank 3)。引物MyxA-2和MyxA-3有20bp的同源序列，以上游同源臂1-2和上游同源臂3为模板，利用MyxA-1和MyxA-4引物进行PCR扩增，获得上游同源臂的融合片段(MyxA-Up-flank)，利用同源重组试剂盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit，货号C113-02)将这该片段构建到pBJ116质粒的SacI和BamHI位点，获得pBJ116-MyxA(Up)质粒。同样，利用引物MyxA-5和MyxA-6扩增下游同源臂2(MyxA-Down-flank 2)；利用引物MyxA-7和MyxA-8扩增下游同源臂3-4(MyxA-Down-flank 3-4)。引物MyxA-6和MyxA-7有20bp的同源序列，以下游同源臂2和下游同源臂3-4为模板，利用MyxA-5和MyxA-8引物进行PCR扩增，获得下游同源臂的融合片段(MyxA-Down-flank)，利用同源重组试剂盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit，货号C113-02)将这该片段构建到pBJ116-MyxA(Up)质粒的XbaI和SalI位点，从而获得pBJ116-MyxA敲除质粒(图1)。将连接的质粒转化到大肠杆菌中，提取pBJ116-MyxA敲除质粒使得质粒浓度在800-1000ng/μL。
将CTT平板(培养基配方：10g酪蛋白胨；1.98g MgSO4·7H2O；10mM Tris·HCl pH7.6；1mM KH2PO4/K2HPO4 pH 7.6；用KOH调节培养基的pH 7.6，定容到1L。固体培养基加入15g琼脂，121℃湿热灭菌30min)上的黄色黏球菌DK1622刮取大米粒大小重悬到100mL的CTT液体培养基中，30℃，200rpm，震荡培养24h。然后，8000rpm，5min离心收集菌体，并用灭菌的ddH2O洗三次，重悬到适量的ddH2O中，制得感受态。取40μL的感受态加入1-2μL的pBJ116-MyxA敲除质粒。通过电转化的方法将质粒转化到DK1622中，加入1mL的CTT液体培养基30℃，200rpm，震荡培养4-6h，采用软琼脂稀释涂布到CTT+Kan(50μg/mL)平板，置于30℃培养箱中，培养3-7天。待长出转化子后，挑取转化子到新的CTT+Kan(50μg/mL)平板上，刮取少量菌体，提取基因组，然后利用MyxA-5DET和pBJ116-3DET(或MyxA-3DET和pBJ116-5DET)进行单交换菌株的PCR验证，获得正确的单交换菌株。
采用半乳糖负向筛选第一次双交换的菌株，其方法是：刮取适量CTT+Kan平板上生长的单交换菌株，进行梯度稀释。然后，采用软琼脂稀释涂布到CTT+1％半乳糖(质量百分比浓度)+盐酸四环素(Tcr)(10μg/mL)的培养基筛选第一次双交换的菌株。待长出单菌落后，将单菌落转接到新的CTT+1％半乳糖+Tcr平板上培养。提取基因组利用引物3618-5DET和3618-3DET对双交换菌株进行PCR验证，获得正确的含有SacB-Tcr模块的双交换菌株。
采用蔗糖负向筛选获得目标的菌株，其方法是：刮取适量CTT+1％半乳糖+Tcr平板上生长的双交换菌株，进行梯度稀释。然后，采用软琼脂稀释涂布到CTT+12％蔗糖(质量百分比浓度)的培养基筛选目标的菌株。在进行蔗糖负向筛选时选择的蔗糖浓度为12％，发现蔗糖的筛选效果比较好。同样，利用MyxA-5DET和MyxA-3DET引物对突变体进行鉴定，结果如图2所示，5号和9号突变体能够扩增出预期的3100bp左右的条带，表明ΔMXAN_3618突变体构建成功。选择9号ΔMXAN_3618突变体提取基因组，扩增敲除位点两侧的序列进行测序分析，结果如图3所示。结果表明，测序的结果与设计的位点一致，证明敲除突变体构建成功。该结果证实了利用pBJ116质粒在DK1622中进行大片段的敲除是可行的。
我们采用竞争实验分析了MXAN_3618基因缺失对捕食能力的影响，验证该方法获得突变体的功能。结果如图4所示，与DK1622相比，在TPM条件下，MXAN_3618基因缺失的确导致粘细菌捕食能力的降低。
表1本发明中所涉及的引物序列
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 299
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaagacccg tgctgcggag ttgctgggcc tttcgttccg ttcattccgc taccggttgg 60
ccaagcatgg gctgacggat gacttggagc ccgggagcgc ttcggatgcg taggctgatc 120
gacagttatc gtcagcgtca ctgccgaatt ttgtcagccc tggacccatc ctcgccgagg 180
ggattgttcc aagccttgag aattgggggg cttggagtgc gcacctgggt tggcatgcgt 240
agtgctaatc ccatccgcgg gcgcagtgcc ccccgttgca accttctctg aggaccccc 299
<210> 2
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60
gcaggaggcg caactcaagc gtttgcgaaa gaaacgaacc aaaagccata taaggaaaca 120
tacggcattt cccatattac acgccatgat atgctgcaaa tccctgaaca gcaaaaaaat 180
gaaaaatatc aagttcctga attcgattcg tccacaatta aaaatatctc ttctgcaaaa 240
ggcctggacg tttgggacag ctggccatta caaaacgctg acggcactgt cgcaaactat 300
cacggctacc acatcgtctt tgcattagcc ggagatccta aaaatgcgga tgacacatcg 360
atttacatgt tctatcaaaa agtcggcgaa acttctattg acagctggaa aaacgctggc 420
cgcgtcttta aagacagcga caaattcgat gcaaatgatt ctatcctaaa agaccaaaca 480
caagaatggt caggttcagc cacatttaca tctgacggaa aaatccgttt attctacact 540
gatttctccg gtaaacatta cggcaaacaa acactgacaa ctgcacaagt taacgtatca 600
gcatcagaca gctctttgaa catcaacggt gtagaggatt ataaatcaat ctttgacggt 660
gacggaaaaa cgtatcaaaa tgtacagcag ttcatcgatg aaggcaacta cagctcaggc 720
gacaaccata cgctgagaga tcctcactac gtagaagata aaggccacaa atacttagta 780
tttgaagcaa acactggaac tgaagatggc taccaaggcg aagaatcttt atttaacaaa 840
gcatactatg gcaaaagcac atcattcttc cgtcaagaaa gtcaaaaact tctgcaaagc 900
gataaaaaac gcacggctga gttagcaaac ggcgctctcg gtatgattga gctaaacgat 960
gattacacac tgaaaaaagt gatgaaaccg ctgattgcat ctaacacagt aacagatgaa 1020
attgaacgcg cgaacgtctt taaaatgaac ggcaaatggt acctgttcac tgactcccgc 1080
ggatcaaaaa tgacgattga cggcattacg tctaacgata tttacatgct tggttatgtt 1140
tctaattctt taactggccc atacaagccg ctgaacaaaa ctggccttgt gttaaaaatg 1200
gatcttgatc ctaacgatgt aacctttact tactcacact tcgctgtacc tcaagcgaaa 1260
ggaaacaatg tcgtgattac aagctatatg acaaacagag gattctacgc agacaaacaa 1320
tcaacgtttg cgccaagctt cctgctgaac atcaaaggca agaaaacatc tgttgtcaaa 1380
gacagcatcc ttgaacaagg acaattaaca gttaacaaat aa 1422
<210> 3
<211> 1321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aataaagccc tgcgcagcgc gcagggtcag cctgaatacg cgtaattctc atgtttgaca 60
gcttatcatc gattagcttt aatgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 120
ggcaccgtgt atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga 180
tgctgtaggc ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca 240
ttccgacagc atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt tgatgcaatt 300
tctatgcgca cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc cagtcctgct 360
cgcttcgcta cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac ccgtcctgtg 420
gattctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg 480
cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag 540
cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat 600
ctccttacat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg 660
ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgccga ccgatgccct tgagagcctt 720
caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac 780
tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg 840
cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat 900
cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa 960
gcaggccatt atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc 1020
gacgcgaggc tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat 1080
gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca 1140
aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc 1200
gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct 1260
ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg 1320
a 1321
<210> 4
<211> 8502
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataaaat tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 240
gctcattttt taaccaatag accgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaatagc 300
ccgagataga gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 360
actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 420
cacccaaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 480
ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 540
agaaagcgaa aggagcgggc gctaaggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 600
ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtactatggt tgctttgacg 660
tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc 720
gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg 780
ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc 840
ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctg 900
aagacccgtg ctgcggagtt gctgggcctt tcgttccgtt cattccgcta ccggttggcc 960
aagcatgggc tgacggatga cttggagccc gggagcgctt cggatgcgta ggctgatcga 1020
cagttatcgt cagcgtcact gccgaatttt gtcagccctg gacccatcct cgccgagggg 1080
attgttccaa gccttgagaa ttggggggct tggagtgcgc acctgggttg gcatgcgtag 1140
tgctaatccc atccgcgggc gcagtgcccc ccgttgcaac cttctctgag gacccccatg 1200
aacatcaaaa agtttgcaaa acaagcaaca gtattaacct ttactaccgc actgctggca 1260
ggaggcgcaa ctcaagcgtt tgcgaaagaa acgaaccaaa agccatataa ggaaacatac 1320
ggcatttccc atattacacg ccatgatatg ctgcaaatcc ctgaacagca aaaaaatgaa 1380
aaatatcaag ttcctgaatt cgattcgtcc acaattaaaa atatctcttc tgcaaaaggc 1440
ctggacgttt gggacagctg gccattacaa aacgctgacg gcactgtcgc aaactatcac 1500
ggctaccaca tcgtctttgc attagccgga gatcctaaaa atgcggatga cacatcgatt 1560
tacatgttct atcaaaaagt cggcgaaact tctattgaca gctggaaaaa cgctggccgc 1620
gtctttaaag acagcgacaa attcgatgca aatgattcta tcctaaaaga ccaaacacaa 1680
gaatggtcag gttcagccac atttacatct gacggaaaaa tccgtttatt ctacactgat 1740
ttctccggta aacattacgg caaacaaaca ctgacaactg cacaagttaa cgtatcagca 1800
tcagacagct ctttgaacat caacggtgta gaggattata aatcaatctt tgacggtgac 1860
ggaaaaacgt atcaaaatgt acagcagttc atcgatgaag gcaactacag ctcaggcgac 1920
aaccatacgc tgagagatcc tcactacgta gaagataaag gccacaaata cttagtattt 1980
gaagcaaaca ctggaactga agatggctac caaggcgaag aatctttatt taacaaagca 2040
tactatggca aaagcacatc attcttccgt caagaaagtc aaaaacttct gcaaagcgat 2100
aaaaaacgca cggctgagtt agcaaacggc gctctcggta tgattgagct aaacgatgat 2160
tacacactga aaaaagtgat gaaaccgctg attgcatcta acacagtaac agatgaaatt 2220
gaacgcgcga acgtctttaa aatgaacggc aaatggtacc tgttcactga ctcccgcgga 2280
tcaaaaatga cgattgacgg cattacgtct aacgatattt acatgcttgg ttatgtttct 2340
aattctttaa ctggcccata caagccgctg aacaaaactg gccttgtgtt aaaaatggat 2400
cttgatccta acgatgtaac ctttacttac tcacacttcg ctgtacctca agcgaaagga 2460
aacaatgtcg tgattacaag ctatatgaca aacagaggat tctacgcaga caaacaatca 2520
acgtttgcgc caagcttcct gctgaacatc aaaggcaaga aaacatctgt tgtcaaagac 2580
agcatccttg aacaaggaca attaacagtt aacaaataaa aacgcaaaag aaaatgccga 2640
tggccgcggc gttgtgagct tccattcagg tcgaggtggc ccggctccat gcaccgcgac 2700
gcaacgcggg gaggcagaca aggtataggg cggcgcctac aatccatgcc aacccgttcc 2760
atgtgctcgc cgaggcggca taaatcgccg tgacgatcag cggtccagtg atcgaagtta 2820
ggctggtaag agccgcgagc gatccttgaa gctgtccctg atggtcgtca tctacctgcc 2880
tggacagcat ggcctgcaac gcgggcatcc cgatgccgcc ggaagcgaga agaatcataa 2940
tggggaaggc catccagcct cgcgtcgcga acgccagcaa gacgtagccc agcgcgtcgg 3000
ccgccatgcc ggcgataatg gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg ggaccagtga 3060
cgaaggcttg agcgagggcg tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg ccgatcatcg 3120
tcgcgctcca gcgaaagcgg tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc ggcacctgtc 3180
ctacgagttg catgataaag aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc atgccccgcg 3240
cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcgg cgctctccct 3300
tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg agcaccgccg 3360
ccgcaaggaa tggtgcatgt aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc acggggcctg 3420
ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc cgatcttccc 3480
catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg gtgatgccgg 3540
ccacgatgcg tccggcgtag agaatccaca ggacgggtgt ggtcgccatg atcgcgtagt 3600
cgatagtggc tccaagtagc gaagcgagca ggactgggcg gcggccaaag cggtcggaca 3660
gtgctccgag aacgggtgcg catagaaatt gcatcaacgc atatagcgct agcagcacgc 3720
catagtgact ggcgatgctg tcggaatgga cgatatcccg caagaggccc ggcagtaccg 3780
gcataaccaa gcctatgcct acagcatcca gggtgacggt gccgaggatg acgatgagcg 3840
cattgttaga tttcatacac ggtgcctgac tgcgttagca atttaactgt gataaactac 3900
cgcattaaag ctaatcgatg ataagctgtc aaacatgaga attacgcgta ttcaggctga 3960
ccctgcgcgc tgcgcagggc tttatttcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggcg 4020
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 4080
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 4140
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 4200
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 4260
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 4320
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 4380
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 4440
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 4500
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 4560
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 4620
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 4680
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 4740
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 4800
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 4860
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 4920
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 4980
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 5040
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 5100
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta attccatatg gtgcactctc agtacaatct 5160
gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat 5220
ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 5280
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 5340
accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagaa cagtcggtac ggctgaccat cgggtgccag 5400
tgcgggagtt tcgttcagca ctgtcctgct ccttgtgatg gtttacaaac gtaaaaagtc 5460
tctttaatac ctgtttttgc ttcatattgt tcagcgacag cttgctgtac ggcaggcacc 5520
agctcttccg ggatcagcgc gacgatacag ccgccaaatc cgccgccggt catgcgtacg 5580
ccacctttgt cgccaatcac agctttgacg atttctacca gagtgtcaat ttgcggcacg 5640
gtgatttcga aatcatcgcg catagaggca tgagactccg ccatcaactc gcccatacgt 5700
ttcaggtcgc cttgctccag cgcgctggca gcttcaacgg tgcgggcgtt ttcagtcagt 5760
atatgacgca cgcgttttgc cacgatcggg tccagttcat gcgcaacagc gttgaactct 5820
tcaatggtga catcacgcag ggctggctgc tggaagaaac gcgcaccggt ttcgcactgt 5880
tcacgacggg tgttgtattc gctgccaacc agggtacgtt tgaagttact gttgatgatg 5940
acgacagcca cacctttggg catggaaact gctttggtcc ccagtgagcg gcaatcgatc 6000
agcaaggcat gatctttctt gccgagcgcg gaaattagct gatccatgat cccgcagtta 6060
cagcctacaa actggttttc tgcttcctga ccgttaagcg cgatttgtgc gccgtccagc 6120
ggcagatgat aaagctgctg caatacggtt ccgaccgcga cttccagtga agcggaagaa 6180
cttaacccgg caccctgcgg cacattgccg ctgatcacca tgtccacgcc gccgaagctg 6240
ttgttacgca gttgcagatg tttcaccacg ccacgaacgt agttagccca ttgatagttt 6300
tcatgtgcga caatgggcgc atcgagggaa aactcgtcga gctgattttc ataatcggct 6360
gccatcacgc gaactttacg gtcatcgcgt ggtgcacaac tgatcacggt ttgataatca 6420
atcgcgcagg gcagaacgaa accgtcgttg tagtcggtgt gttcaccaat caaattcacg 6480
cggccaggcg cctgaatggt gtgagtggca gggtagccaa atgcgttggc aaacagagat 6540
tgtgtttttt ctttcagact catttcttac actccggatt cgcgaaaatg gatatcgctg 6600
actgcgcgca aacgctctgc tgcctgttct gcggtcaggt ctcgctgggt ctctgccagc 6660
atttcataac caaccataaa tttacgtacg gtggcggagc gcagcagagg cggataaaag 6720
tgcgcgtgca gcccttattg cccgacggat ctcccgaccg gtgggcgaag aactccagca 6780
tgagatcccc gcgctggagg atcatccagc cggcgtcccg gaaaacgatt ccgaagccca 6840
acctttcata gaaggcggcg gtggaatcga aatctcgtga tggcaggttg ggcgtcgctt 6900
ggtcggtcat ttcgaacccc agagtcccgc tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa 6960
ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca 7020
ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc 7080
cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat 7140
attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc 7200
cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc 7260
ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg 7320
gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat 7380
gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc 7440
gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg 7500
aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc 7560
accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac 7620
ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac 7680
ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca 7740
tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc 7800
catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc 7860
cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca 7920
agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac 7980
attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta 8040
gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca gcgtgaagcg gtcgggtgga tcaaaagtgc 8100
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 8160
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 8220
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 8280
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 8340
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 8400
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 8460
cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 8502
Claims (2)
1.敲除黄色黏球菌的Myxochelin A编码基因∆MXAN_3618在降低黄色黏球菌捕食铜绿假单胞菌中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的敲除黄色黏球菌的Myxochelin A编码基因∆MXAN_3618的方法是：构建MXAN_3618基因的上游同源臂MyxA-Up-flank，利用引物MyxA-1和MyxA-2扩增上游同源臂1-2；同时利用引物MyxA-3和MyxA-4扩增上游同源臂3，以上游同源臂1-2和上游同源臂3为模板，利用MyxA-1和MyxA-4引物进行PCR扩增，获得上游同源臂的融合片段MyxA-Up-flank，利用同源重组将该片段构建到pBJ116质粒的SacI和BamHI位点，获得pBJ116-MyxA（Up）质粒；利用引物MyxA-5和MyxA-6扩增下游同源臂2，利用引物MyxA-7和MyxA-8扩增下游同源臂3-4，以下游同源臂2和下游同源臂3-4为模板，利用MyxA-5和MyxA-8引物进行PCR扩增，获得下游同源臂的融合片段MyxA-Down-flank，利用同源重组将这该片段构建到pBJ116-MyxA（Up）质粒的XbaI和SalI位点，从而获得pBJ116-MyxA敲除质粒；将连接的质粒转化到大肠杆菌中，提取pBJ116-MyxA敲除质粒；所述的大片段敲除质粒pBJ116的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
制得黄色黏球菌DK1622感受态，将pBJ116-MyxA敲除质粒转化到黄色黏球菌DK1622感受态中，利用含卡那霉素的培养基筛选，获得单交换菌株，再利用含半乳糖的培养基筛选双交换菌株，然后用含四环素的培养基筛选，再利用含有蔗糖的培养基筛选，获得基因MXAN_ 3618敲除的黄色黏球菌；
所述的MyxA-1，其为5’-acggccagtgaattcgagctcGCTCGTCCTGAGCGCCGA-3’；
所述的MyxA-2，其为5’-gtcactcactgCTCTTCGGGGAGGGTGAGC-3’；
所述的MyxA-3，其为5’-cccgaagagCAGTGAGTGACCCGCAGGC-3’；
所述的MyxA-4，其为5’-cagcacgggtcttcaggatccCTACTGGGATACTGACTCGGTCG-3’；
所述的MyxA-5，其为5’-gcgcagggctttatttctagaATGACTGACATCTCTCGGGCC-3’；
所述的MyxA-6，其为5’-gtcactcactgCTCTTCGGGGAGGGTGAGC-3’；
所述的MyxA-7，其为5’-cccgaagagCAGTGAGTGACCCGCAGGC-3’；
所述的MyxA-8，其为5’-cttgcatgcctgcaggtcgacAGCCCACCCGATCTCCCC-3’。
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Citations (5)
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| CN103451224A (zh) * | 2013-08-26 | 2013-12-18 | 天津大学 | 枯草芽孢杆菌基因组无痕修饰方法 |
| WO2015158115A1 (zh) * | 2014-04-14 | 2015-10-22 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种简便高效的基因编辑方法 |
| CN106676119A (zh) * | 2015-11-05 | 2017-05-17 | 中国科学院微生物研究所 | 细菌无痕遗传操作载体及其构建方法与应用 |
| CN109913491A (zh) * | 2018-11-11 | 2019-06-21 | 江苏省农业科学院 | sacB介导的绿针假单胞菌遗传操作方法 |
-
2021
- 2021-11-02 CN CN202111289676.3A patent/CN114032248B/zh active Active
Patent Citations (5)
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|---|
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| Engineering Pseudochelin Production in Myxococcus xanthus;Juliane Korp 等;《Applied and Environmental Microbiology》;第84卷(第22期);参见全文 * |
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| 彭冉.黄色粘球菌CRISPR系统的功能分析及CRISPR/Cas9在粘球菌中的应用研究.《中国博士学位论文全文数据库》.2017,(2017年第08期),参见摘要，第121页最后一段至122页第一段. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114032248A (zh) | 2022-02-11 |
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