CN111363711B - 一种利用重组谷氨酸棒杆菌吸附固定化发酵生产赖氨酸的方法 - Google Patents

一种利用重组谷氨酸棒杆菌吸附固定化发酵生产赖氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用一种利用重组谷氨酸棒杆菌吸附固定化发酵生产赖氨酸的方法，所述的重组谷氨酸棒杆菌是通过在谷氨酸棒杆菌中敲除胞外核酸酶ExeR的同时过表达三磷酸腺苷酶ATPase构建得到的。重组谷氨酸棒杆菌能有效提高谷氨酸棒杆菌的eDNA的分泌，降低谷氨酸棒杆菌eDNA的降解，使得谷氨酸棒杆菌更容易吸附在固体载体的表面进行固定化发酵，从而使得谷氨酸棒杆菌固定化连续发酵的产量比游离发酵的原始菌提高了49.67％，且发酵周期缩短了29.17％。

Description

一种利用重组谷氨酸棒杆菌吸附固定化发酵生产赖氨酸的 方法
技术领域
本发明属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及到一种利用重组谷氨酸棒杆菌吸附固定化发酵生产赖氨酸的方法。
背景技术
L～赖氨酸属于天冬氨酸家族氨基酸，为人类和动物所必需的自身不能合成的氨基酸之一，被广泛用于饲料添加剂、食品强化剂和医药产品等方面，其中90％以上的赖氨酸产品用作饲料添加剂。
生物膜广泛存在于自然界，在生物膜形成过程中，细菌自身分泌产生的的胞外聚合物(EPS)是生物膜形成的物质基础，具有分层分布的特点，对细菌的粘附及聚集特性起到了关键作用。
固定化连续发酵技术现如今已经投入到生产当中，其中用生物膜的方式进行固定化连续发酵已初见成效。然而，在谷氨酸棒杆菌中，基于生物膜的方式经行固定化连续发酵却鲜有报道。
谷氨酸棒杆菌作为重要的工业菌株，其成膜能力非常弱，难以连续化发酵，因此我们需要对该菌株进行分子改造，使其成膜效果增强，以实现后期固定化连续发酵。
已经有研究表明eDNA可以增加菌体初始对载体以及菌体自身之间的粘附，从而促使生物膜的后期形成，并且可以稳固生物膜的结构。生物膜的形成从第一批细胞到载体上就已经开始了，细胞开始分泌出DNA，DNA作为一种载体与细胞之间的粘合剂使得细胞与载体之间无法分开，接着以相同的方法拉近细胞与细胞之间的距离。随后细胞便会分泌出多糖和蛋白用来巩固DNA形成的网状结构，使生物膜不易被破坏。
之前有专利报导过一株过表达三磷酸腺苷酶ATPase的谷氨酸棒杆菌和一株敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌。这两个专利所采用的菌株均用于生产脯氨酸。脯氨酸的代谢途径和生产菌株及其发酵条件与赖氨酸有很大不同。在本研究中，研究人员针对生产赖氨酸的菌株发酵过程进行研究，通过大量实验我们发现，只操作一个基因对于赖氨酸产量的提升有限，同时操作两个基因后赖氨酸产量提升明显。因此，为了进一步提高赖氨酸的产量，我们敲除了赖氨酸生产菌株的胞外核酸酶基因ExeR，同时还增强表达三磷酸腺苷酶ATPase。发明人还研究了适合该类重组菌株的固定化批次发酵方法，从而使的重组菌固定化发酵的赖氨酸产量比原始菌游离发酵的赖氨酸产量提高了49.67％，发酵性能明显优于仅敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌和仅过表达三磷酸腺苷酶ATPase的谷氨酸棒杆菌。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种生产赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，以提高谷氨酸棒杆菌的固定化成膜能力，解决现有技术中赖氨酸生产菌株成膜能力弱，不能用于固定化连续发酵的问题。
本发明还要要解决的技术问题是，提供上述重组谷氨酸棒杆菌通过固定化连续化发酵生产赖氨酸的方法，以解决谷氨酸棒杆菌单批发酵周期过长的问题，缩短了谷氨酸棒杆菌单批发酵的周期，其在固定化连续发酵中的优势更加明显。
发明思路：为了提高eDNA的量进而强化菌株固定化成膜的能力，我们首先敲除了谷氨酸棒杆菌的胞外核酸酶基因ExeR，接着我们又在敲除ExeR的基础上过表达IV型分泌系统蛋白三磷酸腺苷酶ATPase从而促使DNA的分泌使得成膜效果增强。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种重组谷氨酸棒杆菌，重组谷氨酸棒杆菌的胞外核酸酶ExeR被失活，同时三磷酸腺苷酶ATPase的表达被增强；其是通过在谷氨酸棒杆菌中敲除胞外核酸酶ExeR的同时过表达三磷酸腺苷酶ATPase构建得到的。
其中，所述的敲除胞外核酸酶ExeR的同时过表达三磷酸腺苷酶ATPase是指通过使用基因敲除或基因失活技术使谷氨酸棒杆菌基因组中的ExeR基因失活，并在ExeR基因失活谷氨酸棒杆菌中通过基因增强表达技术强化表达ATPase酶的基因。
其中，所述的谷氨酸棒杆菌为ATCC31269。
其中，所述胞外核酸酶ExeR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，所述三磷酸腺苷酶ATPase的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法包括如下步骤：
(1)对谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组进行PCR，扩增，得到ExeR基因敲除位点的上游基因片段ExeR-R和下游基因片段ExeR-L，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示；
(2)对敲除质粒pJYS3_crtYf进行PCR，扩增crRNA序列，具体为使用引物5和引物6将在ExeR基因组敲除位点上挑选的20bp CRISPR-cpf1识别序列替换质粒上原有的识别序列，得到ExeR-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(3)将步骤(1)得到的ExeR-R、ExeR-L和步骤(2)得到的ExeR-1克隆到ApaI/SwaI酶切过的pJYS3_crtYf质粒上，得到敲除质粒pJYS3_ExeR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
(4)将步骤(3)得到的敲除质粒pJYS3_ExeR导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，筛选得到ExeR基因敲除的谷氨酸棒杆菌；通过测序验证基因敲除是否符合预期，测序服务由苏州金唯智生物科技有限公司提供。测序验证正确的敲除菌株命名为ΔExeR菌株；ExeR基因敲除成功后序列如SEQ ID NO.19所示；
(5)对谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组进行PCR，扩增ATPase基因，得到扩增的ATPase基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(6)将步骤(5)得到的ATPase基因片段克隆到过表达质粒pXMJ19上，得到过重组质粒pXMJ19*ATP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21；
(7)将步骤(6)得到的重组质粒导入谷氨酸棒杆菌ΔExeR中，筛选得到敲除胞外核酸酶ExeR的同时过表达三磷酸腺苷酶ATPase的重组谷氨酸棒杆菌ΔExeR+ATP。
步骤(1)中，扩增ExeR-R基因设计的引物的序列如下：引物1的核苷酸序列如SEQID NO.7所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；扩增ExeR-L基因设计的引物的序列如下：引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
步骤(1)中，所述PCR扩增的方法为：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环。
步骤(2)中，扩增ExeR-1基因设计的引物的序列如下：引物5的核苷酸序列如SEQID NO.11所示；引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
步骤(2)中，所述PCR扩增的方法为：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸10秒钟，进行30个循环。
步骤(5)中，扩增ATPase基因设计的引物的序列如下：引物7的核苷酸序列如SEQID NO.13所示；引物8的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
步骤(5)中，所述PCR扩增的方法为：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环。
步骤(6)中，所述的过表达质粒为pXMJ19。
上述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产赖氨酸的方法也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述的发酵为固定化发酵，其包括如下步骤：将上述重组谷氨酸棒杆菌在含有固体载体的培养基中进行发酵，得到赖氨酸发酵液。
具体的，包括如下步骤：
(i)将重组谷氨酸棒杆菌接种到种子培养基中，培养，得到种子液；
(ii)将固定化载体置于发酵培养基中，再向发酵培养基中接入种子液，批次发酵，得到发酵液。
其中，每一批发酵结束后，用新的发酵培养基替换得到的发酵液，培养至糖耗尽，结束发酵，约70h，即得到赖氨酸；其中，所述的糖为糖为葡萄糖、糖蜜和蔗糖的三种组合。
步骤(i)中，种子培养基中各组分的浓度为：蔗糖15～35g/L、蛋白胨5～15g/L、酵母粉1～10g/L、硫酸铵5～10g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、磷酸氢二钾5～15g/L、尿素1～5g/L，溶剂为水；所述的培养为在28～34℃，200～250rpm条件下培养10～14h。
步骤(ii)中，所述的固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、沸石、丝绸、甘蔗渣、玉米秸秆、活性炭、塑料和玻璃中的任意一种或几种的组合；可以将固定化载体制成片状、纤维状、丝网或者微球形态。
优选地，对片状固定化载体进行预处理；所述的预处理为将固定化载体剪成2～8cm×2～8cm的正方形(优选5cm×5cm)，用纯水洗净烘干后于乙醇中浸泡1h，再用纯水清洗后沸水浴10～40min(优选20min)后干燥；固定化载体的用量为1～100g/L发酵培养基；所述的灭菌为115℃灭菌15min。
步骤(ii)中，发酵培养基中各组分的浓度为：葡萄糖80～300g/L、硫酸铵30～50g/L、硫酸镁0.5～1.5g/L、糖蜜10～25g/L、玉米浆10～25g/L、磷酸二氢钾1～5g/L、硫酸亚铁100～300mg/L、硫酸锰100～200mg/L、烟酰胺40～80mg/L、泛酸钙5～15mg/L、VB1 5～15mg/L、硫酸铜0.5～2mg/L、硫酸锌0.5～2mg/L、生物素0.5～2mg/L、碳酸钙10～50g/L，溶剂为水。
步骤(ii)中，每500mL的摇瓶加入50mL的发酵培养基，接入10％～30％(v/v)的种子液，在28～34℃，200～250rpm/min条件下发酵60～90h(优选72h)。
其中，本发明申请赖氨酸的代谢途径和生产菌株和发酵条件与脯氨酸有很大不同。本发明申请中的生产菌株为ATCC31269，而现有技术中产赖氨酸的菌株为ATCC13032；并且与现有技术中赖氨酸的发酵培养基相比，本发明申请中的发酵培养基也不同；此外，谷氨酸发酵产脯氨酸，是以谷氨酸作为前体物质转化而来，而发酵生产赖氨酸的途径则更为复杂，且前体物质为α-酮戊二酸与乙酰辅酶A。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的优势：
1、本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌固定化发酵产赖氨酸的方法，利用纤维(棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆)作为固定化材料，固定的菌体可以反复利用。
2、本发明实现了连续化(或反复批次发酵)生产赖氨酸，这是目前包括大生产上还没有实现的方式。
3、本发明构建了一株在敲除胞外核酸酶ExeR的同时过表达三磷酸腺苷酶ATPase的谷氨酸棒杆菌，提高了谷氨酸棒杆菌的eDNA的分泌，降低了谷氨酸棒杆菌eDNA的降解，使得谷氨酸棒杆菌固定化连续发酵的产量比游离发酵的原始菌提高了49.67％，且发酵周期缩短了29.17％；小试规模的产量能够达到30g/L左右。
附图说明
图1为pJYS3_ExeR和pXMJ19/*ATP质粒琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1为原始质粒pXMJ19，泳道2为重组质粒pXMJ19/*ATP，泳道3为pJYS3_crtYf，泳道4为pJYS3_ExeR，泳道5为Marker。原始的pXMJ19质粒大小为6601bp，而重组质粒pXMJ19/*ATP的大小为7741bp。从图中可以看出ATPase基因片段已经插入表达质粒pXMJ19。Marker的大小为12000bp。
图2为ΔExeR菌株和原始菌基因组上ExeR基因的PCR琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1、2为ΔExeR菌株基因组上ExeR基因的PCR产物，泳道3、4为原始菌株基因组上ExeR基因的PCR产物，泳道5为Marker。使用引物9和引物10对敲除菌株的基因组经行PCR，敲除成功的突变菌基因组上ExeR基因的PCR产物为1494bp，而对照的野生菌为2619bp。Marker的大小为5000bp。
图3为谷氨酸棒状杆菌原始菌和重组菌的电镜图。
图4为谷氨酸棒状杆菌原始菌、重组菌、ATP菌株、ΔExeR菌株固定发酵与游离发酵周期图。
图5为谷氨酸棒状杆菌原始菌和重组菌结晶紫染色法半定量测生物膜量的实验数据。
图6为谷氨酸棒状杆菌原始菌、重组菌、ATP菌株、ΔExeR菌株固定发酵与游离发酵的赖氨酸产量对比图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例使用的质粒pJYS3_crtYf与pXMJ19从武汉淼灵生物科技有限公司购买。如无特别说明，所有酶均从TAKARA购买，质粒提取及胶回收试剂盒从TAKARA购买，一步克隆试剂盒从南京诺唯赞生物科技有限公司购买。产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌原始菌株(后简写为原始菌)为谷氨酸棒状杆菌ATCC31269，购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)，商品编号ATCC31269。
实施例1：构建胞外核酸酶ExeR敲除质粒。
使用谷氨酸棒状杆菌原始菌的染色体进行PCR，扩增ExeR基因敲除位点上下游两个基因片段，命名为ExeR-R、ExeR-L；具体而言，序列ExeR-R使用下述引物1和引物2，在以下反应条件下进行PCR：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环：扩增了1048bp的基因片段(SEQ ID NO.3)。序列ExeR-L使用下述引物3和引物4，在以下反应条件下进行PCR：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环：扩增了1035bp的基因片段(SEQ ID NO.4)。
PCR扩增的反应体系如下，总体系100μL(如无特殊说明，其余所有PCR反应均以此体系为准)。
Figure BDA0002411029370000061
Figure BDA0002411029370000071
对质粒pJYS3_crtYf进行PCR，扩增crRNA序列。使用引物5和引物6将在ExeR基因组敲除位点上挑选的21bp CRISPR-cpf1识别序列(SEQ ID NO.22)，即ExeR基因上21bpCRISPR-cpf1识别序列替换质粒上原有的识别序列(SEQ ID NO.23)，即crtYf基因上21bpCRISPR-cpf1识别序列。替换后的序列命名为ExeR-1，具体而言，序列ExeR-1使用下述引物5和引物6，在以下反应条件下进行PCR：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸10秒钟，进行30个循环：扩增了110bp的基因片段(SEQ ID NO.5)。
将序列ExeR-R、ExeR-L和ExeR-1克隆到ApaI/SwaI酶切过的pJYS3_crtYf质粒上，得到敲除质粒pJYS3_ExeR；琼脂糖凝胶电泳见图1。泳道3是原始pJYS3_crtYf质粒，泳道4是构建好的质粒pJYS3_ExeR，泳道5是Marker。其中，原始的pJYS3_crtYf质粒大小为11982bp(SEQ ID NO.27)，而重组质粒pJYS3_ExeR的大小为11895bp(SEQID NO.20)。
扩增的ExeR-R序列含有20bp与载体同源的序列以及30bp与ExeR-L同源的序列。此外，引物1具有ApaI的限制酶识别位点。扩增的ExeR-L序列含有30bp与ExeR-R同源的序列以及25bp与ExeR-1同源的序列。扩增的ExeR-1序列含有25bp与ExeR-L同源的序列以及16bp与载体同源的序列。此外，引物6具有SwaI的限制酶识别位点。限制酶识别位点用粗体标出。
表1
引物1 5’～aagtagaacaactgttcaccgggcccacggaatcatctacc～3’(SEQ ID NO.7)
引物2 5’～ggcgtgctggagtcggttccggcaggatta～3’(SEQ ID NO.8)
引物3 5’～taatcctgccggaaccgactccagcacgcc～3’(SEQ ID NO.9)
引物4 5’～tgagctagctgtcaatctagagcgtcgaattcggt～3’(SEQ ID NO.10)
引物5 5’～acgctctagattgacagctagctca～3’(SEQ ID NO.11)
引物6 5’～ctgagcctttcgttttatttaaatgtaacgctccaaccgtcgaggatctacaacagtaga～3’(SEQ ID NO.12)
实施例2：构建三磷酸腺苷酶ATPase过表达质粒。
使用谷氨酸棒状杆菌原始菌的染色体进行PCR，扩增ATPase基因。
具体而言，使用下述引物7和引物8，在以下反应条件下进行PCR：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环：扩增了1186bp的基因片段(SEQID NO.6)
扩增的序列含有ATPase编码序列，以及20bp与载体同源的序列。此外，引物7具有BamHI的限制酶识别位点，引物8具有BamHI的限制酶识别位点。BamHI限制酶识别位点用粗体标出。
表2
引物7 5’～gcctgcaggtcgactctagaggatccatgactgacattgatctggt～3’(SEQ ID NO.13)
引物8 5’～aattcgagctcggtacccggggatccctagggcataaaccatgcct～3’(SEQ ID NO.14)
将获得的多核苷酸与用限制酶BamHI处理的pXMJ19质粒进行一部克隆，得到用于过表达三磷酸腺苷酶ATPase基因的重组质粒pXMJ19/*ATP，琼脂糖凝胶电泳见图1，泳道1是原始pXMJ19质粒，泳道2是构建好的质粒pXMJ19/*ATP，泳道5是Marker。其中，原始的pXMJ19质粒大小为6601bp(SEQ ID NO.24)，而重组质粒pXMJ19/*ATP的大小为7741bp(SEQ IDNO.21)。从图中可以看出ATPase基因片段已经插入表达质粒pXMJ19。
实施例3：构建胞外核酸酶ExeR基因失活的同时过表达三磷酸腺苷酶ATPase菌株
将得到的pJYS3_ExeR重组质粒导入谷氨酸棒状杆菌原始菌感受态细胞中，在含有25ug/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选，培养2～3天后挑出转化子，通过菌落PCR验证基因组上的ExeR基因是否缺失。使用引物9和引物10对敲除菌株的基因组经行PCR，敲除成功的突变菌基因组上ExeR基因的PCR产物为1494bp(SEQ ID NO.25)，而对照的野生菌为2619bp(SEQ ID NO.26)。琼脂糖凝胶电泳见图2，泳道1、2是突变菌基因组上ExeR基因的PCR产物，泳道3、4是对照的野生菌的PCR产物，泳道5是Marker。最终通过测序验证谷氨酸棒状杆菌原始菌基因组上的ExeR基因是否敲除成功，测序服务由苏州金唯智生物科技有限公司提供。得到胞外核酸酶ExeR基因失活菌株，命名为△ExeR菌株，ExeR基因敲除成功后序列如SEQID NO.19所示。
再将得到的pXMJ19/*ATP重组质粒导入△ExeR菌株的感受态细胞中，在含有6.5ug/mL氯霉素的LB平板上进行筛选，培养2～3天后挑出转化子，然后进行菌落PCR验证，得到敲除胞外核酸酶ExeR基因的同时过表达三磷酸腺苷酶ATPase的重组菌株，命名为ΔExeR+ATP菌株，即本专利所述的重组菌。使用引物11和引物12进行PCR，以证实基因是否插入到重组质粒中。
表3
引物9 5’～gtgagaccaaaggtgaactg～3’(SEQ ID NO.15)
引物10 5’～gtaggttctgcaggatcagt～3’(SEQ ID NO.16)
引物11 5’～ggaattgtgagcggataaca～3’(SEQ ID NO.17)
引物12 5’～gtatcaggctgaaaatcttc～3’(SEQ ID NO.18)
改造菌株构造成功后进行96孔板以及SEM电镜实验。96孔板实验数据见图5，可见改造后的重组菌在12h的生物量与原始菌相比提升了59％，而随菌株继续生长，生物量的差距逐渐缩小。电镜照片见图3，可以直观具体的看重组菌的生物膜比原始菌更厚，形成块状，而原始菌的生物膜较薄。成膜效果提升之后进行固定化连续发酵。
实施例4：重组菌在不同载体上固定化发酵产赖氨酸
化培养基成分如下：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。
种子培养基是：蔗糖25g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵5g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢二钾12g/L、尿素5g/L。
发酵培养基配方：葡萄糖100g/L、硫酸铵40g/L、硫酸镁1g/L、糖蜜20g/L、玉米浆20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸亚铁150mg/L、硫酸锰100mg/L、烟酰胺50mg/L、泛酸钙10mg/L、VB1 10mg/L、硫酸铜1mg/L、硫酸锌1mg/L、生物素2mg/L、碳酸钙40g/L。
每50mL离心管加5mL活化培养基，接入实施例3制备的重组菌，在30℃，220rpm条件下活化20h。
活化完成后分别倒入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，在30℃，220rpm条件下培养12h。
每500mL的摇瓶倒入50mL的发酵培养基，将表4所示的载体也放入发酵培养基中一起灭菌，115℃，15min。载体用量优选30g/L。
向在发酵培养基中接入5mL种子液，在30℃，220rpm条件下发酵72h。
固定化连续发酵：在发酵过程中，第一批时菌体已经吸附到固定化载体上，此时摇瓶培养已经过约72h，第二批时倒掉发酵液，留下吸附着菌的固定化载体，再倒入新的50mL发酵培养基，培养至糖耗尽，糖为葡萄糖、糖蜜、和蔗糖三种的组合，约60h，测得发酵周期数据与赖氨酸产量数据，随后批次固定化连续发酵均采用此法，最终10批次连续发酵数据见表4。
表4不同载体的10批次连续固定化发酵(重组菌固定化)
固定化材料 平均发酵周期(h) 平均赖氨酸产量(g/L)
棉纤维织物 51 30.15
无纺布 59 25.51
聚酯纤维 53 28.17
聚乙烯醇纤维 54 26.78
沸石 72 19.80
细菌纤维素膜 68 24.21
丝绸 70 21.56
甘蔗渣 69 22.84
玉米秸秆 71 26.59
活性炭 68 28.89
塑料 72 21.65
玻璃 72 20.54
由表4可知，棉纤维最有利于固定化连续发酵，所以后续固定化连续发酵都将以棉纤维作为固定化载体。
实施例5：重组菌赖氨酸发酵实验(重组菌在棉纤维载体上固定)
活化培养基成分如下：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。
种子培养基是：蔗糖25g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵5g/L、七水硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢二钾12g/L、尿素5g/L。
发酵培养基配方：葡萄糖100g/L、硫酸铵40g/L、硫酸镁1g/L、糖蜜20g/L、玉米浆20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸亚铁150mg/L、硫酸锰100mg/L、烟酰胺50mg/L、泛酸钙10mg/L、VB1 10mg/L、硫酸铜1mg/L、硫酸锌1mg/L、生物素2mg/L、碳酸钙40g/L。
每50mL离心管加5mL活化培养基，接入实施例3制备的重组菌，在30℃，220rpm条件下活化20h。
活化完成后分别倒入装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，在30℃，220rpm条件下培养12h。
每500mL的摇瓶倒入50mL的发酵培养基，将预处理后的棉纤维载体也放入发酵培养基中一起灭菌，115℃，15min。
向在发酵培养基中接入5mL种子液，在30℃，220rpm条件下发酵72h。
固定化连续发酵：在发酵过程中，第一批时菌体已经吸附到固定化载体上，此时摇瓶培养已经过约72h，第二批时倒掉发酵液，留下吸附着菌的固定化载体，再倒入新的50mL发酵培养基，培养至糖耗尽，糖为葡萄糖、糖蜜、和蔗糖三种的组合，约60h，测得发酵周期数据，见图4；赖氨酸产量见图6。随后批次固定化连续发酵均采用此法。
棉纤维载体材料的预处理：将棉纤维载体剪成5cm×5cm的正方形，用纯水洗净烘干后于乙醇中浸泡1h，再用纯水清洗2遍后沸水浴20min后放入烘箱烘干，称重1.5g，然后放入倒有发酵液的摇瓶当中一起灭菌，115℃，15min。
对比例1：原始菌的固定化发酵(原始菌)
将实施例5中接入的重组菌更换为原始出发菌，其余步骤同实施例5，得发酵周期数据见图4；赖氨酸产量见图6。
对比例2：重组菌的游离发酵(重组菌)
发酵培养基中不加入载体，其余步骤同实施例5，测得发酵周期数据见图4；赖氨酸产量见图6。
对比例3：原始菌的游离发酵(原始菌)
将实施例5中接入的重组菌更换为原始出发菌，发酵培养基中不加入载体，其余步骤同实施例5，测得发酵周期数据见图4；赖氨酸产量见图6。
从图4可以看出，相比于游离发酵，固定化发酵的周期均缩短，其中，重组菌固定化发酵周期比原始菌游离的发酵周期缩短29.17％；从图6可以看出，相比于游离发酵，固定化发酵所得赖氨酸的产量均有提升，且重组菌固定化产量比原始菌固定化产量高49.67％。上述发酵周期的缩短以及赖氨酸产量的提高均是因为采用固定化发酵和重组菌加强了谷氨酸棒杆菌的成膜能力。
对比例4：谷氨酸棒杆菌中ExeR基因失活菌株的构建
将得到的pJYS3_ExeR重组质粒导入谷氨酸棒状杆菌原始菌感受态细胞中，在含有25ug/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选，培养2～3天后挑出转化子，通过菌落PCR验证基因组上的ExeR基因是否缺失。使用引物9和引物10对敲除菌株的基因组经行PCR，敲除成功的突变菌基因组上ExeR基因的PCR产物为1494bp(SEQ ID NO.25)，而对照的野生菌为2619bp(SEQ ID NO.26)。琼脂糖凝胶电泳见图2，泳道1、2是突变菌基因组上ExeR基因的PCR产物，泳道3、4是对照的野生菌的PCR产物，泳道5是Marker。最终通过测序验证谷氨酸棒状杆菌原始菌基因组上的ExeR基因是否敲除成功，测序服务由苏州金唯智生物科技有限公司提供。得到胞外核酸酶ExeR基因失活菌株，命名为ΔExeR菌株。
对比例5：谷氨酸棒杆菌中过表达三磷酸腺苷酶ATPase菌株的构建
将得到的pXMJ19/*ATP重组质粒导入谷氨酸棒状杆菌原始菌感受态细胞中，在含有6.5ug/mL氯霉素的LB平板上进行筛选，培养2～3天后挑出转化子，然后进行菌落PCR验证，得到过表达三磷酸腺苷酶ATPase的重组菌株，命名为ATP菌株。
对比例6：ΔExeR菌株固定化发酵
将实施例5中接入的重组菌更换为ΔExeR菌株(在谷氨酸棒状杆菌原始菌敲除ExeR基因)，其余步骤同实施例5，得发酵周期数据见图4；赖氨酸产量见图6。
对比例7：ATP菌株固定化发酵
将实施例5中接入的重组菌更换为ATP菌株(在谷氨酸棒状杆菌原始菌过量表达ATPase基因)，其余步骤同实施例5，得发酵周期数据见图4；赖氨酸产量见图6。
通过对原始菌、重组菌、ΔExeR菌株与ATP菌株的发酵数据对比可以看出，单独敲除ExeR基因或单独过表达ATPase基因都能提高发酵产量和缩短发酵周期，且从赖氨酸产量看，单独敲除ExeR基因的效果略好过单独过表达ATPase基因。由图6可知，ATP菌株固定化发酵的赖氨酸产量比原始菌固定化发酵的赖氨酸产量提高了2.56％，而ΔExeR菌株固定化发酵的赖氨酸产量比原始菌固定化发酵的赖氨酸产量提高了9.00％，而重组菌固定化发酵的赖氨酸产量比原始菌固定化发酵的赖氨酸产量提高了28.54％。综上所述，从赖氨酸产量来看，重组菌的的发酵性能最佳。
实施例5：还原糖的测定方法
运用DNS(二硝基水杨酸)在碱性条件下，与还原糖发生氧化还原反应，生成3～氨基～5～硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例，用紫外分光光度计(OD540)测定还原糖含量。
样品适当稀释后，使预计含糖量在0.1～1.0mg/mL之间，取稀释后的0.5mL样品于10mL刻度试管中，再加入0.5mL DNS，沸水煮沸5min，立即冷却5min，加8mL纯水混匀，另设0.5mL纯水和0.5mL DNS样品为空白样。事先做好本次实验使用的DNS还原糖含量标准曲线，用紫外分光光度计在540nm波长下检测吸光值，作为还原糖含量的量度。
实施例6：赖氨酸含量的测定
每瓶发酵液取样100μL用0.1M盐酸溶液稀释50倍，再将每个样品分别取400μL稀释液，接着进行PITC柱前衍生，用RP～HPLC法进行赖氨酸含量检测，计算出每个样品的赖氨酸浓度。
利用出发菌和本发明构建的重组菌进行固定化连续发酵实验，通过10批次发酵实验，发酵结果见表5。从图6可以看出，改造后的菌株固定化连续发酵的赖氨酸产量比游离发酵的原始菌高出49.67％。从图4可以看出，改造后的菌株固定化发酵周期比原始菌缩短29.17％。
表5固定化菌株连续发酵10次的赖氨酸的产量(g/L)
Figure BDA0002411029370000131
Figure BDA0002411029370000141
实施例7：结晶紫染色法半定量测生物膜量
在无色96孔板中加入200μL发酵培养基(不加固定化载体与碳酸钙)，再分别加入20μL的原始菌与重组菌，培养到12h、24h、36h、48h时用结晶紫染色法和酶标仪测OD 570nm。从图5中可以看出敲除胞外核酸酶ExeR的同时过表达三磷酸腺苷酶ATPase的重组菌成膜能力明显提高。
本发明提供了一种敲除胞外核酸酶ExeR的同时过表达三磷酸腺苷酶ATPase的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和在产赖氨酸中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种利用重组谷氨酸棒杆菌吸附固定化发酵生产赖氨酸的方法
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2751
<212> DNA
<213> 胞外核酸酶(ExeR)
<400> 1
atgtctcgca tttctgcgcg cactctggca atcgcacttg ccggtgcaac cgcggccagc 60
ctggcagttg ttccagcagc aacagctaat cctgccggaa ccgctcctgt catcaacgaa 120
atctacggag gcggtggaaa cagcggatcg ttgttctcca acgacttcat tgagctctac 180
aacccaacct caggggacat ttccctcgac ggttggagcg ttacctacta cgcagccaac 240
ggtaactccg gcggaaccac aaacctgacc ggaaacatcc ctgccaacgg ttactacctc 300
atccagcaac gcgcaggcag caacaacacc ggcgctctgc ctaccccaga cgccaccggt 360
aacttggcaa tgggtgcctc ccaaggatca gttgcactga ccgacaactc tggcctaacc 420
gctgaccttg tcggattcgg tggcacgtcc atgtttgaag gaacagctgc tgcacctgag 480
accagcaaca aattgtctgt tcaacgcaaa gaagttggcg ctgactctga taacaactcc 540
gtagacttcg agactggagc tccaactcca acgtcctcgg gaggatccgc tcctgttgac 600
ccaggcgagc cagaaactcc agtaaaccct ggggaaacag tctccatcgc acaaatccaa 660
ggaaccggtc tcgctacccc actcgagggt cagaccgtca ccaccgaagg tattgtcact 720
gccgtttacg cagaaggtgg cttcaacggt tactacatcc agacacctgg atctggtact 780
gcaccaaagg ttgctggcga cgcatccgac ggcatcttcg tctacgtggg aagcaatggt 840
tcctacccag agctcggcgc atctgtcacc gtcactggca aggccaccga acactacgag 900
atgactcagc taggcaactc ctccttcacc gtttcggaca ccgcattcga gccagtaacc 960
ccactcgaac tggacaccgt tcctactggc gatgacattc gcgaagcata cgaaggcatg 1020
ctgctgaagc caaccggcgc tcacaccgtg accaacaact acgcaaccaa caccttcggt 1080
gaaattgccc tcgccccagg taacgagcct ttgtaccagg ccactcaaat ggtggcaccg 1140
ggagccgaag cgattgcgta cgaggcggaa aacgtcgcaa agcaaattac gctggatgac 1200
ggacgctccg gcaactacac tcgcggcgac tccagcacgc ctatggcatg gcttgtgcag 1260
gacggtggcg agaccatcaa gtccatccgc accggcgacc aggtggaatt ccaggcacca 1320
gtaatcttcg attaccgcta cgacctgtgg aaattccagc caaccacccc tgtcaccggc 1380
aacaccgcaa gctccgacct tcctatcacc tgggatgaca cccgcgcggc tgagctagct 1440
tcaatcaatg acgttgctgg cgaattccac atcgcaagct tcaacgtgct caactacttc 1500
acctctctcg gcgaagatga accaggctgc agcgcataca gggatatcaa caacacccca 1560
gtcaccgcca acaactgtaa cgtccgtggc gcttacaccg aagaagcact cgaagatcag 1620
cagagcaaga tcgtcgaagc aatcaaccgc cttgacgtcg atgttcttgg acttgaagaa 1680
atcgaaaaca ccgcgaccgt caccggcgac gtctcccgtc gcgatgacgc actcaatacc 1740
ctcgtcgcag cactcaacga agcagttgga tccgatcgct gggcggccgt cgaatctcca 1800
gaacaattgg gcaccgatga agactacatc cgcgtcgcct tcatctacga ccaaaccacc 1860
gtcaagcccg tcggcgaatc ccgaatcttc gacgacgcag ccttcaccgg caccgcacgc 1920
cagccactcg cacaggaatt ccagccactc aacgacagcg agaaatcctt cgtcggcgta 1980
gtcaaccact tcaagtccaa gggctctgtc actcgtggag acgccgacac cggcgacggc 2040
caaggcaaca acgccaacgt tcgcgtcgca caggcacagg cactcatcga ccacctggaa 2100
aaccaggacg actgggcatc caagccaatc ttcatcctcg gcgacaccaa ctcctacgcc 2160
aaggaaaccg cgatgaccac cctttacggc gctggctaca ccaacatcgc caccgaattc 2220
gacgctggct acagctacca gttctccggc cgcattggca gcctcgacca cgcactcggc 2280
aacgaagcag ccatgaagca cgtcatcgac gccgaggtct gggacatcaa cgctgacgaa 2340
gcaatcgcat tcgaatactc ccgtcgactc aacaacacct ccgacgtatt cgagaacaac 2400
gtcttccgct cctccgacca cgacccgatc aaggtcggat tcaacctcag cgagaccact 2460
gagcccacca ttccggtaga gcccactgat cctgcagaac ctaccgatcc aactacccca 2520
gttaagccaa ctgatccggt agagaccacg gatccatctg agccaaccga ccctgcagaa 2580
cctactgatc cagctgaacc aactgaccct gaggaaacga agaagccaga ggagccgaag 2640
aaccctggtt cctccaacgg aagctcccaa tacgccacca ttgcagcaat catcgcagca 2700
atcctaggtg ccattgcttt ggccttccag ttcttcccat tcaagttcta a 2751
<210> 2
<211> 1134
<212> DNA
<213> 三磷酸腺苷酶(ATPase)
<400> 2
atgactgaca ttgatctggt ggtggaaaac gtccaaagga ttatcgccac caaagagaca 60
ccgccgacct ctgcggaaat agcgagcctg attcgggaac aagcaggcgt gatcagtaac 120
gaggacatcg tgatggtgtt gcgtcgactg cgcagtgatt ctgtgggcgt gggaccgttg 180
gaatctctgc ttgcgcttcc tggcgtgacg gatgtgttgg ttaatgccca tgacagcgtg 240
tggattgatc gcggtcaggg cgtggagaaa gtcgacatgg atctgggctc agaggaggcg 300
gtgcgtcgcc ttgccacccg gttggcgttg acctgtggca gacgcttaga tgatgcgcag 360
cctttcgctg atggccgaat caccagggac gacggcagcg tgttgcgcat tcacgcggtg 420
ttggcaccct tggcggaatc cggcacgtgc atcagtgtgc gagtactgcg tcaagcacgg 480
ctgagccttg atgatcttat ccaaagcggc acggtgcctg aggacatcgc gcctgcgctc 540
cggaacatca tcaatcaacg gcgctcgttc cttgttgtcg gtggcaccgg cacagggaaa 600
accacattgc tgtccgcgat gctcaccgaa gttcccgctg atcaacgaat catctgcatc 660
gaggacaccg cagagcttca tcccggccat ccaagcacca tcaacttggt gtctcgccaa 720
gcaaacgtcg agggcgccgg cgccgtgagc atggcggatt tgttgaaaca atcgctgcgc 780
atgaggcctg accggattgt cgtcggagag attcgcggtg cggaagtcgt ggatcttttg 840
gctgcgatga ataccggaca cgacggcggt gctggcacca ttcacgcgaa ctccatctct 900
gaagttcccg cgcgcatgga agctcttgcg gcgaccggcg gattggaccg catggcattg 960
cattctcaac tcgcggccgc agtggacatt gtgctggtca tgaaacacac cccttttggc 1020
cgcaggctag ctcaactcgg ggtgctccgc ggaaatcctg tgaccacgca ggtggtgtgg 1080
gatttggacc acggcatgca cgaagggagc gaagaggcat ggtttatgcc ctag 1134
<210> 3
<211> 1048
<212> DNA
<213> ExeR-R
<400> 3
aagtagaaca actgttcacc gggcccacgg aatcatctac ctcaagctcg aagcgctttc 60
cctgacggac atcggaaacg ccagaaactc cgatacgtcc gagggcgcgg tgtaccgcct 120
gcccctgggg atccagaatc tcagccttag gcatgacatt gacaactaca cgggccacgg 180
tattttccct tactcaagaa atggggagga caatgtttta cgagcacaag tgtaactgtt 240
gccactggtc aaacctagcc agcccttaga tagggagatt ctcctcgatt gcttccacta 300
cctcagctgc agatggttcc gtccgaggag caaagcgctt aatcgtatta ccttctgcat 360
ctaccaggaa tttctcaaaa ttccactcga tttcgctacc atcagttgcc tctttgagca 420
ccttgtacag ggggtgggca ccctccccat tcacctcggt tttgctcaag agcgggaagg 480
tgacgtcgta ctgattttgc gcgaaagcac acacctcagc gtcggttcca ggttcctggc 540
cgttgaattg attgcagggc acgccaatga caaagaagcc tcgatcttgg tattcctcat 600
acagtttttg aagcccttca tactgtggcg tgagtccgca cttggatgcc acgttcacga 660
tgagcaaaag gtggcccgcc caatccgcca tggtggtttc tgtgccgtcg ttgagagtta 720
cgctgatgtc atgaatagaa gtcataatcg caaccctagt tgagggggag gatttagtgc 780
atcatctaaa taaaggtcag ctaataggtg aactttggtg agaccaaagg tgaactgcca 840
ggtcgaccaa attgctcgcc aagcagactc cgaaaaacac gggtaattca tatggcttgt 900
atctaatcca tactgaacag aggacctctc ctatgtctcg catttctgcg cgcactctgg 960
caatcgcact tgccggtgca accgcggcca gcctggcagt tgttccagca gcaacagcta 1020
atcctgccgg aaccgactcc agcacgcc 1048
<210> 4
<211> 1035
<212> DNA
<213> ExeR-L
<400> 4
taatcctgcc ggaaccgact ccagcacgcc tatggcatgg cttgtgcagg acggtggcga 60
gaccatcaag tccatccgca ccggcgacca ggtggaattc caggcaccag taatcttcga 120
ttaccgctac gacctgtgga aattccagcc aaccacccct gtcaccggca acaccgcaag 180
ctccgacctt cctatcacct gggatgacac ccgcgcggct gagctagctt caatcaatga 240
cgttgctggc gaattccaca tcgcaagctt caacgtgctc aactacttca cctctctcgg 300
cgaagatgaa ccaggctgca gcgcatacag ggatatcaac aacaccccag tcaccgccaa 360
caactgtaac gtccgtggcg cttacaccga agaagcactc gaagatcagc agagcaagat 420
cgtcgaagca atcaaccgcc ttgacgtcga tgttcttgga cttgaagaaa tcgaaaacac 480
cgcgaccgtc accggcgacg tctcccgtcg cgatgacgca ctcaataccc tcgtcgcagc 540
actcaacgaa gcagttggat ccgatcgctg ggcggccgtc gaatctccag aacaattggg 600
caccgatgaa gactacatcc gcgtcgcctt catctacgac caaaccaccg tcaagcccgt 660
cggcgaatcc cgaatcttcg acgacgcagc cttcaccggc accgcacgcc agccactcgc 720
acaggaattc cagccactca acgacagcga gaaatccttc gtcggcgtag tcaaccactt 780
caagtccaag ggctctgtca ctcgtggaga cgccgacacc ggcgacggcc aaggcaacaa 840
cgccaacgtt cgcgtcgcac aggcacaggc actcatcgac cacctggaaa accaggacga 900
ctgggcatcc aagccaatct tcatcctcgg cgacaccaac tcctacgcca aggaaaccgc 960
gatgaccacc ctttacggcg ctggctacac caacatcgcc accgaattcg acgctctaga 1020
ttgacagcta gctca 1035
<210> 5
<211> 110
<212> DNA
<213> ExeR-1
<400> 5
acgctctaga ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg gatccgaatt tctactgttg 60
tagatcctcg acggttggag cgttacattt aaataaaacg aaaggctcag 110
<210> 6
<211> 1186
<212> DNA
<213> ATPase
<400> 6
gcctgcaggt cgactctaga ggatccatga ctgacattga tctggtggtg gaaaacgtcc 60
aaaggattat cgccaccaaa gagacaccgc cgacctctgc ggaaatagcg agcctgattc 120
gggaacaagc aggcgtgatc agtaacgagg acatcgtgat ggtgttgcgt cgactgcgca 180
gtgattctgt gggcgtggga ccgttggaat ctctgcttgc gcttcctggc gtgacggatg 240
tgttggttaa tgcccatgac agcgtgtgga ttgatcgcgg tcagggcgtg gagaaagtcg 300
acatggatct gggctcagag gaggcggtgc gtcgccttgc cacccggttg gcgttgacct 360
gtggcagacg cttagatgat gcgcagcctt tcgctgatgg ccgaatcacc agggacgacg 420
gcagcgtgtt gcgcattcac gcggtgttgg cacccttggc ggaatccggc acgtgcatca 480
gtgtgcgagt actgcgtcaa gcacggctga gccttgatga tcttatccaa agcggcacgg 540
tgcctgagga catcgcgcct gcgctccgga acatcatcaa tcaacggcgc tcgttccttg 600
ttgtcggtgg caccggcaca gggaaaacca cattgctgtc cgcgatgctc accgaagttc 660
ccgctgatca acgaatcatc tgcatcgagg acaccgcaga gcttcatccc ggccatccaa 720
gcaccatcaa cttggtgtct cgccaagcaa acgtcgaggg cgccggcgcc gtgagcatgg 780
cggatttgtt gaaacaatcg ctgcgcatga ggcctgaccg gattgtcgtc ggagagattc 840
gcggtgcgga agtcgtggat cttttggctg cgatgaatac cggacacgac ggcggtgctg 900
gcaccattca cgcgaactcc atctctgaag ttcccgcgcg catggaagct cttgcggcga 960
ccggcggatt ggaccgcatg gcattgcatt ctcaactcgc ggccgcagtg gacattgtgc 1020
tggtcatgaa acacacccct tttggccgca ggctagctca actcggggtg ctccgcggaa 1080
atcctgtgac cacgcaggtg gtgtgggatt tggaccacgg catgcacgaa gggagcgaag 1140
aggcatggtt tatgccctag ggatccccgg gtaccgagct cgaatt 1186
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 引物1(Primer 1)
<400> 7
aagtagaaca actgttcacc gggcccacgg aatcatctac c 41
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物2(Primer 2)
<400> 8
ggcgtgctgg agtcggttcc ggcaggatta 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物3(Primer 3)
<400> 9
taatcctgcc ggaaccgact ccagcacgcc 30
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 引物4(Primer 4)
<400> 10
tgagctagct gtcaatctag agcgtcgaat tcggt 35
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物5(Primer 5)
<400> 11
acgctctaga ttgacagcta gctca 25
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 引物6(Primer 6)
<400> 12
ctgagccttt cgttttattt aaatgtaacg ctccaaccgt cgaggatcta caacagtaga 60
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物7(Primer 7)
<400> 13
gcctgcaggt cgactctaga ggatccatga ctgacattga tctggt 46
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物8(Primer 8)
<400> 14
aattcgagct cggtacccgg ggatccctag ggcataaacc atgcct 46
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物9(Primer 9)
<400> 15
gtgagaccaa aggtgaactg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物10(Primer 10)
<400> 16
gtaggttctg caggatcagt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物11(Primer 11)
<400> 17
ggaattgtga gcggataaca 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物12(Primer 12)
<400> 18
gtatcaggct gaaaatcttc 20
<210> 19
<211> 1626
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 19
atgtctcgca tttctgcgcg cactctggca atcgcacttg ccggtgcaac cgcggccagc 60
ctggcagttg ttccagcagc aacagctaat cctgccggaa ccgactccag cacgcctatg 120
gcatggcttg tgcaggacgg tggcgagacc atcaagtcca tccgcaccgg cgaccaggtg 180
gaattccagg caccagtaat cttcgattac cgctacgacc tgtggaaatt ccagccaacc 240
acccctgtca ccggcaacac cgcaagctcc gaccttccta tcacctggga tgacacccgc 300
gcggctgagc tagcttcaat caatgacgtt gctggcgaat tccacatcgc aagcttcaac 360
gtgctcaact acttcacctc tctcggcgaa gatgaaccag gctgcagcgc atacagggat 420
atcaacaaca ccccagtcac cgccaacaac tgtaacgtcc gtggcgctta caccgaagaa 480
gcactcgaag atcagcagag caagatcgtc gaagcaatca accgccttga cgtcgatgtt 540
cttggacttg aagaaatcga aaacaccgcg accgtcaccg gcgacgtctc ccgtcgcgat 600
gacgcactca ataccctcgt cgcagcactc aacgaagcag ttggatccga tcgctgggcg 660
gccgtcgaat ctccagaaca attgggcacc gatgaagact acatccgcgt cgccttcatc 720
tacgaccaaa ccaccgtcaa gcccgtcggc gaatcccgaa tcttcgacga cgcagccttc 780
accggcaccg cacgccagcc actcgcacag gaattccagc cactcaacga cagcgagaaa 840
tccttcgtcg gcgtagtcaa ccacttcaag tccaagggct ctgtcactcg tggagacgcc 900
gacaccggcg acggccaagg caacaacgcc aacgttcgcg tcgcacaggc acaggcactc 960
atcgaccacc tggaaaacca ggacgactgg gcatccaagc caatcttcat cctcggcgac 1020
accaactcct acgccaagga aaccgcgatg accacccttt acggcgctgg ctacaccaac 1080
atcgccaccg aattcgacgc tggctacagc taccagttct ccggccgcat tggcagcctc 1140
gaccacgcac tcggcaacga agcagccatg aagcacgtca tcgacgccga ggtctgggac 1200
atcaacgctg acgaagcaat cgcattcgaa tactcccgtc gactcaacaa cacctccgac 1260
gtattcgaga acaacgtctt ccgctcctcc gaccacgacc cgatcaaggt cggattcaac 1320
ctcagcgaga ccactgagcc caccattccg gtagagccca ctgatcctgc agaacctacc 1380
gatccaacta ccccagttaa gccaactgat ccggtagaga ccacggatcc atctgagcca 1440
accgaccctg cagaacctac tgatccagct gaaccaactg accctgagga aacgaagaag 1500
ccagaggagc cgaagaaccc tggttcctcc aacggaagct cccaatacgc caccattgca 1560
gcaatcatcg cagcaatcct aggtgccatt gctttggcct tccagttctt cccattcaag 1620
ttctaa 1626
<210> 20
<211> 11895
<212> DNA
<213> 敲除质粒(pJYS3_ExeR)
<400> 20
taattatcat tgactagccc atctcaattg gtatagtgat taaaatcacc tagaccaatt 60
gagatgtatg tctgaattag ttgttttcaa agcaaatgaa ctagcgatta gtcgctatga 120
cttaacggag catgaaacca agctaatttt atgctgtgtg gcactactca accccacgat 180
tgaaaaccct acaaggaaag aacggacggt atcgttcact tataaccaat acgctcagat 240
gatgaacatc agtagggaaa atgcttatgg tgtattagct aaagcaacca gagagctgat 300
gacgagaact gtggaaatca ggaatccttt ggttaaaggc tttgagattt tccagtggac 360
aaactatgcc aagttctcaa gcgaaaaatt agaattagtt tttagtgaag agatattgcc 420
ttatcttttc cagttaaaaa aattcataaa atataatctg gaacatgtta agtcttttga 480
aaacaaatac tctatgagga tttatgagtg gttattaaaa gaactaacac aaaagaaaac 540
tcacaaggca aatatagaga ttagccttga tgaatttaag ttcatgttaa tgcttgaaaa 600
taactaccat gagtttaaaa ggcttaacca atgggttttg aaaccaataa gtaaagattt 660
aaacacttac agcaatatga aattggtggt tgataagcga ggccgcccga ctgatacgtt 720
gattttccaa gttgaactag atagacaaat ggatctcgta accgaacttg agaacaacca 780
gataaaaatg aatggtgaca aaataccaac aaccattaca tcagattcct acctacataa 840
cggactaaga aaaacactac acgatgcttt aactgcaaaa attcagctca ccagttttga 900
ggcaaaattt ttgagtgaca tgcaaagtaa gcatgatctc aatggttcgt tctcatggct 960
cacgcaaaaa caacgaacca cactagagaa catactggct aaatacggaa ggatctgagg 1020
ttcttatggc tcttgtatct atcagtgaag catcaagact aacaaacaaa agtagaacaa 1080
ctgttcaccg ggcccacgga atcatctacc tcaagctcga agcgctttcc ctgacggaca 1140
tcggaaacgc cagaaactcc gatacgtccg agggcgcggt gtaccgcctg cccctgggga 1200
tccagaatct cagccttagg catgacattg acaactacac gggccacggt attttccctt 1260
actcaagaaa tggggaggac aatgttttac gagcacaagt gtaactgttg ccactggtca 1320
aacctagcca gcccttagat agggagattc tcctcgattg cttccactac ctcagctgca 1380
gatggttccg tccgaggagc aaagcgctta atcgtattac cttctgcatc taccaggaat 1440
ttctcaaaat tccactcgat ttcgctacca tcagttgcct ctttgagcac cttgtacagg 1500
gggtgggcac cctccccatt cacctcggtt ttgctcaaga gcgggaaggt gacgtcgtac 1560
tgattttgcg cgaaagcaca cacctcagcg tcggttccag gttcctggcc gttgaattga 1620
ttgcagggca cgccaatgac aaagaagcct cgatcttggt attcctcata cagtttttga 1680
agcccttcat actgtggcgt gagtccgcac ttggatgcca cgttcacgat gagcaaaagg 1740
tggcccgccc aatccgccat ggtggtttct gtgccgtcgt tgagagttac gctgatgtca 1800
tgaatagaag tcataatcgc aaccctagtt gagggggagg atttagtgca tcatctaaat 1860
aaaggtcagc taataggtga actttggtga gaccaaaggt gaactgccag gtcgaccaaa 1920
ttgctcgcca agcagactcc gaaaaacacg ggtaattcat atggcttgta tctaatccat 1980
actgaacaga ggacctctcc tatgtctcgc atttctgcgc gcactctggc aatcgcactt 2040
gccggtgcaa ccgcggccag cctggcagtt gttccagcag caacagctaa tcctgccgga 2100
accgactcca gcacgcctat ggcatggctt gtgcaggacg gtggcgagac catcaagtcc 2160
atccgcaccg gcgaccaggt ggaattccag gcaccagtaa tcttcgatta ccgctacgac 2220
ctgtggaaat tccagccaac cacccctgtc accggcaaca ccgcaagctc cgaccttcct 2280
atcacctggg atgacacccg cgcggctgag ctagcttcaa tcaatgacgt tgctggcgaa 2340
ttccacatcg caagcttcaa cgtgctcaac tacttcacct ctctcggcga agatgaacca 2400
ggctgcagcg catacaggga tatcaacaac accccagtca ccgccaacaa ctgtaacgtc 2460
cgtggcgctt acaccgaaga agcactcgaa gatcagcaga gcaagatcgt cgaagcaatc 2520
aaccgccttg acgtcgatgt tcttggactt gaagaaatcg aaaacaccgc gaccgtcacc 2580
ggcgacgtct cccgtcgcga tgacgcactc aataccctcg tcgcagcact caacgaagca 2640
gttggatccg atcgctgggc ggccgtcgaa tctccagaac aattgggcac cgatgaagac 2700
tacatccgcg tcgccttcat ctacgaccaa accaccgtca agcccgtcgg cgaatcccga 2760
atcttcgacg acgcagcctt caccggcacc gcacgccagc cactcgcaca ggaattccag 2820
ccactcaacg acagcgagaa atccttcgtc ggcgtagtca accacttcaa gtccaagggc 2880
tctgtcactc gtggagacgc cgacaccggc gacggccaag gcaacaacgc caacgttcgc 2940
gtcgcacagg cacaggcact catcgaccac ctggaaaacc aggacgactg ggcatccaag 3000
ccaatcttca tcctcggcga caccaactcc tacgccaagg aaaccgcgat gaccaccctt 3060
tacggcgctg gctacaccaa catcgccacc gaattcgacg ctctagattg acagctagct 3120
cagtcctagg tataatggat ccgaatttct actgttgtag atcctcgacg gttggagcgt 3180
tacatttaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt 3240
ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg 3300
aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt 3360
aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct taagcttgca 3420
tgcctgcagg tcgacttagt tattgcggtt ctggacaaat tcaaagtatt cttcgttctt 3480
aatgacgaga ttcagcttct tgccttcctg gttgttcttg atgcgaccca ggagcatgag 3540
acccttcaga ccgatgtggt aggcgccgtt tgcatcagcg tcctgtggca tgttctttgg 3600
agcctggcgg gaatcgaaga agttgccgtt gacgtcggcc actggggaga tgaggtaatc 3660
cagctcggtg ccggtcttgg agttgcgcat ctgcaggatg gtgttgagca cagaggtcag 3720
ctttgcgaag aacttcttgt cggattcgcc gcagattgca gccttgatgc actcgccgtg 3780
gccgtattcg atggagtaat ccttcaggag cttctccagt tccttggttg ggtacacttc 3840
gcgggtatcc cagttgtggt tcttgtcgga gttgcggaag ttgatgaggc gggagccgaa 3900
ggatgcgatg gtccacttgc ccttggctgc cttatcgccg aagttcttgt agtcgaagga 3960
gaattcgaag tagcccttat ccaggttgta gcagatcttg tcgaacttgg agaagaactc 4020
ctgggacttg gagacggatt cgtactttgg gtagagctgg ttgacgaagc cggtcactgg 4080
gcagatctta gaggtgaagc cagctggcac gtagtagatg atgccggtct gcttgcccat 4140
cttcttgaag gtctcgaatg gggcggtcag ctggtatgca cggaggacgc cgccggtctt 4200
atcgaattcg ttgtccttga acacgaggta gttcagcttc tcgatgagca tcttttccag 4260
cttctggtag acctgcttct ccaccttgaa gcggccgcgc ttgaagccga agttcaggtc 4320
ttcgaagacc acgattgcgt tgtactcgat caccagctta gcgatttcgt ggaccacctg 4380
ggagaggtag ccttccttca tttccttgat gttgttgatc ttcttccaat ccttgcgagc 4440
ggaatcgcgg tccttctcga tagcggccag cttgtcgtgg tagttggtct tcatgcgatc 4500
gttgccgatg atgttgaagg tgtcctgctt gatgatgttg cccttgccgt cgaccagggt 4560
gtagtaggcg aggtggcgtt cgccgcgatc gatggacagg atgtgcacgt cgttagcctt 4620
ctccttcagg agcaggttga tttcatcgtt gaacttgttg gcgccggagg acttgaagtt 4680
gatggtgatt gggcagtgga agaagaactt gtcctcggtg aagcgcttat ccttgatcag 4740
gtcgtactcg aacacggatt ccttctttgg gttatccttg ttcttgttgg cgattgcttc 4800
cttggctggg tgggtgatct tctttgggat ggactgcttg cggtagaaca gctctgcttc 4860
gccgttgagc ttgtagacca catcctgcag gttgcgttcg tcgaagagtg ccttccagta 4920
gagggtgtgc aggtttgggc ggcccttgga gtaagcggag aagtccttgt tgtagatctg 4980
gaagaggtac agcttgccct ggttgaccac ggaatcgatg taggactcgg agatgttttc 5040
gaaggtcagc ttgtagccct ggttctccac ttcgcggtag aattcatcga tggagttgta 5100
gcgctgggta tcggagaagc ggaagccgaa gtccttccac tctgggtgct tggagatgga 5160
ctgcttgtag aaatcgatga acttgcggca gtcttcgatg ttgaactcga acttttcgta 5220
gcccttctgt ggggagccgt tcttggtgtg ggtggagtgg ttgcggatgc gcaggatatc 5280
ttcggatggg ttgtagaact tgatggactt tgcggagaag aagacctttg ggagcatctt 5340
gttagcgcct gggagcagct tgtacacgat cttcttgtag ccctcgccct tgttttcctt 5400
gatggcctta tcgtcgaaga tcttgttgtt cttcttgttc atcacgccca ggtagtactt 5460
atcgtccttg atgaagagga tggcggtgtt atctggttcc ttgttcttgt cccagccgtt 5520
tgccagggtg gagttctcga agttgagctt gaacttttca tcggagtatg gcttctgggt 5580
gatgtagttg cggatcttgt tgtacagtgg gacgatgtta gcgagttcga agtagcactc 5640
ttcgaacacc aggtagaagt gctcatcctt gtcgaggatg ttggccttgt cttcggactg 5700
ggagatgtgg aagatcttca gcttgtggag caggttgttg gtctgatcga gcaggtcctt 5760
gattgccttc acatcgtcct cagcggaggc ctggagcaga tccttcttgc cctggttctg 5820
gtacttgatg gagatctggg ccaggttatc cttgttctgt gcgatttcgt cgaagatcat 5880
tgggattgca gcgaagtttg cgaggatctc ttcgaagcgg cactgcttat cgatgtcgcg 5940
gtgcttgttg aactcttcga gagccagctt gatggtctcg agggacaggt acttagcctt 6000
ttcggtcttc ttggcgatca gctcctgttc cttcttggat gggttatcga ggttctttgg 6060
ggcgatctgc tgggtgatgt attccaggac tgcggtgccg atcacggagt aatcgtcgaa 6120
gacctgctgg gagagatcgg tcagggactt gtcgttcttg aagtagatct tggagagatc 6180
cagcttctga gccttcagat cgtcgaagag cagggagagg gtctccttga tggacttctc 6240
ttccacggtc ttgaaggctg cgatctgttc gtagaaggac tgcatggtgg tgaccacatc 6300
ggaatcgtcc tccagcttgt cgatgacgaa ggacttggat tcggtgtcgg acaggatctg 6360
cttgaagagc acggacatct tgtacttctt cagggtctta tcgttgatct gctgggagta 6420
gaggttgatg tactcgttga tgcccttgcg cttggtgttt tcgccgttga cgaacttgcc 6480
gccgatgatg gtgttgaact tggtgatgcc ggactggttc aggtagttgt tgaagttggc 6540
gatctcgaac acttcatcga gggagaagac gcgctggttc acttcagagg tcttgtaatc 6600
gatgtcgaag gtgagctctt cggccaggtc cttcttgatc tgctcgtagt tgatagcttc 6660
tggggcctta tccttcaggg actcgtactt tgccttgttt tcgaggaact ttggcaggtt 6720
atcgtcgacg atgcggtaga tgatagaggt tgggatatcg ttggaggagt acacgttctt 6780
gcggttttcg tggaagccct tgaagtaggt ggtccagccc ttgaaggact tgatgatctc 6840
cagagcttca tcgatgtcgg tgatgtcgga gttggccttg aagagctcga tgccgttatc 6900
cttggactgc ttgagccaca ggatgagatc ggattcctgg cccttctttg cgtcgatcag 6960
gttctggttg aagaggttct tgaacttctc ggaatccttg atgtattcgg agatctgctt 7020
cttgatggta tccttagcgg acttgaagtc cttctgcagg ttatcgtcat cggacttctt 7080
gagcttgaag tagacatcgg agtagttctg gagcaggtcc tcggagatgc acacggagga 7140
caggatctct tcgatgaaga actggtggta cttgtcgatg atctgctttg ccttcttgta 7200
atccttagcg cgcttttcgt catccaggat gaggccgcgt gccttgatgt tttcgagggt 7260
cttgccttgg gggatcagct caaaacggag ggtcttggac agggagtatt tattcacaaa 7320
ctcttggtag atggacatcg ttcaagtcct ttccaattcc acacatggta ccacacgatg 7380
attaattgta aacagctcag gtcatgattc cgcgaacccc agagtcccgc tcagaagaac 7440
tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc 7500
acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac 7560
gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag 7620
cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc 7680
tcgccgtcgg gcatccgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga 7740
tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc 7800
tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc 7860
cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg 7920
agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg 7980
tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg 8040
tcttggagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc 8100
tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca 8160
tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca 8220
atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag 8280
atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag 8340
ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat 8400
cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc 8460
cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc 8520
tacgtgttcc gcttccggtg accgcctcga tgatcgccgg gtgggcgtgg cccaaggagg 8580
atcatccagc cattcggggt cgttcactgg ttcccctttc tgatttctgg catagaagaa 8640
cccccgtgaa ctgtgtggtt ccgggggttg ctgatttttg cgagacttct cgcgcaattc 8700
cctagcttag gtgaaaacac catgaaacac tagggaaaca cccatgaaac acccattagg 8760
gcagtagggc ggcttcttcg tctagggctt gcatttgggc ggtgatctgg tctttagcgt 8820
gtgaaagtgt gtcgtaggtg gcgtgctcaa tgcactcgaa cgtcacgtca tttaccgggt 8880
cacggtgggc aaagagaact agtgggttag acattgtttt cctcgttgtc ggtggtggtg 8940
agcttttcta gccgctcggt aaacgcggcg atcatgaact cttggaggtt ttcaccgttc 9000
tgcatgcctg cgcgcttcat gtcctcacgt agtgccaaag gaacgcgtgc ggtgaccacg 9060
acgggcttag cctttgcctg cgcttctagt gcttcgatgg tggcttgtgc ctgcgcttgc 9120
tgcgcctgta gtgcctgttg agcttcttgt agttgctgtt ctagctgtgc cttggttgcc 9180
atgctttaag actctagtag ctttcctgcg atatgtcatg cgcatgcgta gcaaacattg 9240
tcctgcaact cattcattat gtgcagtgct cctgttacta gtcgtacata ctcatattta 9300
cctagtctgc atgcagtgca tgcacatgca gtcatgtcgt gctaatgtgt aaaacatgta 9360
catgcagatt gctgggggtg cagggggcgg agccaccctg tccatgcggg gtgtggggct 9420
tgccccgccg gtacagacag tgagcaccgg ggcacctagt cgcggatacc ccccctaggt 9480
atcggacacg taaccctccc atgtcgatgc aaatctttaa cattgagtac gggtaagctg 9540
gcacgcatag ccaagctagg cggccaccaa acaccactaa aaattaatag tccctagaca 9600
agacaaaccc ccgtgcgagc taccaactca tatgcacggg ggccacataa cccgaagggg 9660
tttcaattga caaccatagc actagctaag acaacgggca caacacccgc acaaactcgc 9720
actgcgcaac cccgcacaac atcgggtcta ggtaacactg aaatagaagt gaacacctct 9780
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aacgtcatgt acaagatcac caatagtaag gctctggcgg ggtgccatag gtggcgcagg 9900
gacgaagctg ttgcggtgtc ctggtcgtct aacggtgctt cgcagtttga gggtctgcaa 9960
aactctcact ctcgctgggg gtcatctctg gctgaattgg aagtcatggg cgaacgccgc 10020
attgagctgg ctattgctac taagaatcac ttggcggcgg gtggcgcgct catgatgttt 10080
gtgggcactg ttcgacacaa ccgctcacag tcatttgcgc aggttgaagc gggtattaag 10140
actgcgtact cttcgatggt gaaaacatct cagtggaaga aagaacgtgc acggtacggg 10200
gtggagcaca cctatagtga ctatgaggtc acagactctt gggcgaacgg ttggcacttg 10260
caccgcaaca tgctgttgtt cttggatcgt ccactgtctg acgatgaact caaggcgttt 10320
gaggattcca tgttttcccg ctggtctgct ggtgtggtta aggccggtat ggacgcgcca 10380
ctgcgtgagc acggggtcaa acttgatcag gtgtctacct ggggtggaga cgctgcgaaa 10440
atggcaacct acctcgctaa gggcatgtct caggaactga ctggctccgc tactaaaacc 10500
gcgtctaagg ggtcgtacac gccgtttcag atgttggata tgttggccga tcaaagcgac 10560
gccggcgagg atatggacgc tgttttggtg gctcggtggc gtgagtatga ggttggttct 10620
aaaaacctgc gttcgtcctg gtcacgtggg gctaagcgtg ctttgggcat tgattacata 10680
gacgctgatg tacgtcgtga aatggaagaa gaactgtaca agctcgccgg tctggaagca 10740
ccggaacggg tcgaatcaac ccgcgttgct gttgctttgg tgaagcccga tgattggaaa 10800
ctgattcagt ctgatttcgc ggttaggcag tacgttctcg attgcgtgga taaggctaag 10860
gacgtggccg ctgcgcaacg tgtcgctaat gaggtgctgg caagtctggg tgtggattcc 10920
accccgtgca tgatcgttat ggatgatgtg gacttggacg cggttctgcc tactcatggg 10980
gacgctacta agcgtgatct gaatgcggcg gtgttcgcgg gtaatgagca gactattctt 11040
cgcacccact aaaagcggca taaaccccgt tcgatatttt gtgcgatgaa tttatggtca 11100
atgtcgcggg ggcaaactat gatgggtctt gttgttggcg tcccggagcg taaaggatct 11160
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 11220
actgagcgtc agaccttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc agtctgaatg 11280
acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag gaactgctga 11340
acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc tgagaagccc 11400
gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa aaggcgcctg 11460
tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg aatgtcacga 11520
aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca gcgatttgcc 11580
cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt gtagaggagc 11640
aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta gtgagttata 11700
cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc tataaattat 11760
aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta cagagggtct 11820
agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac ccacaactca 11880
aaggaaaagg actag 11895
<210> 21
<211> 7741
<212> DNA
<213> 重组质粒(pXMJ19*ATP)
<400> 21
aattaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc atgactgaca ttgatctggt 60
ggtggaaaac gtccaaagga ttatcgccac caaagagaca ccgccgacct ctgcggaaat 120
agcgagcctg attcgggaac aagcaggcgt gatcagtaac gaggacatcg tgatggtgtt 180
gcgtcgactg cgcagtgatt ctgtgggcgt gggaccgttg gaatctctgc ttgcgcttcc 240
tggcgtgacg gatgtgttgg ttaatgccca tgacagcgtg tggattgatc gcggtcaggg 300
cgtggagaaa gtcgacatgg atctgggctc agaggaggcg gtgcgtcgcc ttgccacccg 360
gttggcgttg acctgtggca gacgcttaga tgatgcgcag cctttcgctg atggccgaat 420
caccagggac gacggcagcg tgttgcgcat tcacgcggtg ttggcaccct tggcggaatc 480
cggcacgtgc atcagtgtgc gagtactgcg tcaagcacgg ctgagccttg atgatcttat 540
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gctcaccgaa gttcccgctg atcaacgaat catctgcatc gaggacaccg cagagcttca 720
tcccggccat ccaagcacca tcaacttggt gtctcgccaa gcaaacgtcg agggcgccgg 780
cgccgtgagc atggcggatt tgttgaaaca atcgctgcgc atgaggcctg accggattgt 840
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catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 1440
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tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 1680
aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 1740
tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 1800
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aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 1920
tgatgagcac ttttgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 1980
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 2040
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aatgcactcg aacgtcacgt catttaccgg gtcacggtgg gcaaagagaa ctagtgggtt 3180
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gtagttgctg ttctagctgt gccttggttg ccatgcttta agactctagt agctttcctg 3480
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cagtcatgtc gtgctaatgt gtaaaacatg tacatgcaga ttgctggggg tgcagggggc 3660
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catatgcacg ggggccacat aacccgaagg ggtttcaatt gacaaccata gcactagcta 3960
agacaacggg cacaacaccc gcacaaactc gcactgcgca accccgcaca acatcgggtc 4020
taggtaacac tgagtaacac tgaaatagaa gtgaacacct ctaaggaacc gcaggtcaat 4080
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gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 7080
cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 7140
gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 7200
gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 7260
ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 7320
cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 7380
tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 7440
cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca 7500
cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 7560
tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 7620
ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 7680
atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 7740
t 7741
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<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
<213> crtYf基因上的识别序列(Recognition sequence on crtYf gene)
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<212> DNA
<213> 质粒(pXMJ19)
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tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 540
aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 600
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gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 900
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 960
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 1020
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 1080
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 1140
cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 1200
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 1260
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 1320
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 1380
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 1440
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 1500
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 1560
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 1620
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg gggtgggcga 1680
agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccattcggg gtcgttcact 1740
ggttcccctt tctgatttct ggcatagaag aacccccgtg aactgtgtgg ttccgggggt 1800
tgctgatttt tgcgagactt ctcgcgcaat tccctagctt aggtgaaaac accatgaaac 1860
actagggaaa cacccatgaa acacccatta gggcagtagg gcggcttctt cgtctagggc 1920
ttgcatttgg gcggtgatct ggtctttagc gtgtgaaagt gtgtcgtagg tggcgtgctc 1980
aatgcactcg aacgtcacgt catttaccgg gtcacggtgg gcaaagagaa ctagtgggtt 2040
agacattgtt ttcctcgttg tcggtggtgg tgagcttttc tagccgctcg gtaaacgcgg 2100
cgatcatgaa ctcttggagg ttttcaccgt tctgcatgcc tgcgcgcttc atgtcctcac 2160
gtagtgccaa aggaacgcgt gcggtgacca cgacgggctt agcctttgcc tgcgcttcta 2220
gtgcttcgat ggtggcttgt gcctgcgctt gctgcgcctg tagtgcctgt tgagcttctt 2280
gtagttgctg ttctagctgt gccttggttg ccatgcttta agactctagt agctttcctg 2340
cgatatgtca tgcgcatgcg tagcaaacat tgtcctgcaa ctcattcatt atgtgcagtg 2400
ctcctgttac tagtcgtaca tactcatatt tacctagtct gcatgcagtg catgcacatg 2460
cagtcatgtc gtgctaatgt gtaaaacatg tacatgcaga ttgctggggg tgcagggggc 2520
ggagccaccc tgtccatgcg gggtgtgggg cttgccccgc cggtacagac agtgagcacc 2580
ggggcaccta gtcgcggata ccccccctag gtatcggaca cgtaaccctc ccatgtcgat 2640
gcaaatcttt aacattgagt acgggtaagc tggcacgcat agccaagcta ggcggccacc 2700
aaacaccact aaaaattaat agtccctaga caagacaaac ccccgtgcga gctaccaact 2760
catatgcacg ggggccacat aacccgaagg ggtttcaatt gacaaccata gcactagcta 2820
agacaacggg cacaacaccc gcacaaactc gcactgcgca accccgcaca acatcgggtc 2880
taggtaacac tgagtaacac tgaaatagaa gtgaacacct ctaaggaacc gcaggtcaat 2940
gagggttcta aggtcactcg cgctagggcg tggcgtaggc aaaacgtcat gtacaagatc 3000
accaatagta aggctctggc ggggtgccat aggtggcgca gggacgaagc tgttgcggtg 3060
tcctggtcgt ctaacggtgc ttcgcagttt gagggtctgc aaaactctca ctctcgctgg 3120
gggtcacctc tggctgaatt ggaagtcatg ggcgaacgcc gcattgagct ggctattgct 3180
actaagaatc acttggcggc gggtggcgcg ctcatgatgt ttgtgggcac tgttcgacac 3240
aaccgctcac agtcatttgc gcaggttgaa gcgggtatta agactgcgta ctcttcgatg 3300
gtgaaaacat ctcagtggaa gaaagaacgt gcacggtacg gggtggagca cacctatagt 3360
gactatgagg tcacagactc ttgggcgaac ggttggcact tgcaccgcaa catgctgttg 3420
ttcttggatc gtccactgtc tgacgatgaa ctcaaggcgt ttgaggattc catgttttcc 3480
cgctggtctg ctggtgtggt taaggccggt atggacgcgc cactgcgtga gcacggggtc 3540
aaacttgatc aggtgtctac ctggggtgga gacgctgcga aaatggcaac ctacctcgct 3600
aagggcatgt ctcaggaact gactggctcc gctactaaaa ccgcgtctaa ggggtcgtac 3660
acgccgtttc agatgttgga tatgttggcc gatcaaagcg acgccggcga ggatatggac 3720
gctgttttgg tggctcggtg gcgtgagtat gaggttggtt ctaaaaacct gcgttcgtcc 3780
tggtcacgtg gggctaagcg tgctttgggc attgattaca tagacgctga tgtacgtcgt 3840
gaaatggaag aagaactgta caagctcgcc ggtctggaag caccggaacg ggtcgaatca 3900
acccgcgttg ctgttgcttt ggtgaagccc gatgattgga aactgattca gtctgatttc 3960
gcggttaggc agtacgttct cgattgcgtg gataaggcta aggacgtggc cgctgcgcaa 4020
cgtgtcgcta atgaggtgct ggcaagtctg ggtgtggatt ccaccccgtg catgatcgtt 4080
atggatgatg tggacttgga cgcggttctg cctactcatg gggacgctac taagcgtgat 4140
ctgaatgcgg cggtgttcgc gggtaatgag cagactattc ttcgcaccca ctaaaagcgg 4200
cataaacccc gttcgatatt ttgtgcgatg aatttatggt caatgtcgcg ggggcaaact 4260
atgatgggtc ttgttgttgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa 4320
ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc 4380
gaagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac 4440
tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc 4500
tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa 4560
acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc 4620
cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg 4680
ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg 4740
tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 4800
gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaactccgga 4860
tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 4920
ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 4980
tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 5040
gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc 5100
gaagctcggc ggatttgtcc tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg 5160
tgtccggatc ggtcaaatac gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg 5220
atccccggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 5280
ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc 5340
gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 5400
cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 5460
ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 5520
tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 5580
ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 5640
ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 5700
gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 5760
tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 5820
tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 5880
gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 5940
cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 6000
gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 6060
gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 6120
ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 6180
cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 6240
tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 6300
cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca 6360
cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 6420
tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 6480
ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 6540
atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 6600
t 6601
<210> 25
<211> 1494
<212> DNA
<213> 敲除后的ExeR基因PCR(DNA)
<400> 25
gtgagaccaa aggtgaactg ccaggtcgac caaattgctc gccaagcaga ctccgaaaaa 60
cacgggtaat tcatatggct tgtatctaat ccatactgaa cagaggacct ctcctatgtc 120
tcgcatttct gcgcgcactc tggcaatcgc acttgccggt gcaaccgcgg ccagcctggc 180
agttgttcca gcagcaacag ctaatcctgc cggaaccgac tccagcacgc ctatggcatg 240
gcttgtgcag gacggtggcg agaccatcaa gtccatccgc accggcgacc aggtggaatt 300
ccaggcacca gtaatcttcg attaccgcta cgacctgtgg aaattccagc caaccacccc 360
tgtcaccggc aacaccgcaa gctccgacct tcctatcacc tgggatgaca cccgcgcggc 420
tgagctagct tcaatcaatg acgttgctgg cgaattccac atcgcaagct tcaacgtgct 480
caactacttc acctctctcg gcgaagatga accaggctgc agcgcataca gggatatcaa 540
caacacccca gtcaccgcca acaactgtaa cgtccgtggc gcttacaccg aagaagcact 600
cgaagatcag cagagcaaga tcgtcgaagc aatcaaccgc cttgacgtcg atgttcttgg 660
acttgaagaa atcgaaaaca ccgcgaccgt caccggcgac gtctcccgtc gcgatgacgc 720
actcaatacc ctcgtcgcag cactcaacga agcagttgga tccgatcgct gggcggccgt 780
cgaatctcca gaacaattgg gcaccgatga agactacatc cgcgtcgcct tcatctacga 840
ccaaaccacc gtcaagcccg tcggcgaatc ccgaatcttc gacgacgcag ccttcaccgg 900
caccgcacgc cagccactcg cacaggaatt ccagccactc aacgacagcg agaaatcctt 960
cgtcggcgta gtcaaccact tcaagtccaa gggctctgtc actcgtggag acgccgacac 1020
cggcgacggc caaggcaaca acgccaacgt tcgcgtcgca caggcacagg cactcatcga 1080
ccacctggaa aaccaggacg actgggcatc caagccaatc ttcatcctcg gcgacaccaa 1140
ctcctacgcc aaggaaaccg cgatgaccac cctttacggc gctggctaca ccaacatcgc 1200
caccgaattc gacgctggct acagctacca gttctccggc cgcattggca gcctcgacca 1260
cgcactcggc aacgaagcag ccatgaagca cgtcatcgac gccgaggtct gggacatcaa 1320
cgctgacgaa gcaatcgcat tcgaatactc ccgtcgactc aacaacacct ccgacgtatt 1380
cgagaacaac gtcttccgct cctccgacca cgacccgatc aaggtcggat tcaacctcag 1440
cgagaccact gagcccacca ttccggtaga gcccactgat cctgcagaac ctac 1494
<210> 26
<211> 2619
<212> DNA
<213> 未敲除的ExeR基因PCR(DNA)
<400> 26
gtgagaccaa aggtgaactg ccaggtcgac caaattgctc gccaagcaga ctccgaaaaa 60
cacgggtaat tcatatggct tgtatctaat ccatactgaa cagaggacct ctcctatgtc 120
tcgcatttct gcgcgcactc tggcaatcgc acttgccggt gcaaccgcgg ccagcctggc 180
agttgttcca gcagcaacag ctaatcctgc cggaaccgct cctgtcatca acgaaatcta 240
cggaggcggt ggaaacagcg gatcgttgtt ctccaacgac ttcattgagc tctacaaccc 300
aacctcaggg gacatttccc tcgacggttg gagcgttacc tactacgcag ccaacggtaa 360
ctccggcgga accacaaacc tgaccggaaa catccctgcc aacggttact acctcatcca 420
gcaacgcgca ggcagcaaca acaccggcgc tctgcctacc ccagacgcca ccggtaactt 480
ggcaatgggt gcctcccaag gatcagttgc actgaccgac aactctggcc taaccgctga 540
ccttgtcgga ttcggtggca cgtccatgtt tgaaggaaca gctgctgcac ctgagaccag 600
caacaaattg tctgttcaac gcaaagaagt tggcgctgac tctgataaca actccgtaga 660
cttcgagact ggagctccaa ctccaacgtc ctcgggagga tccgctcctg ttgacccagg 720
cgagccagaa actccagtaa accctgggga aacagtctcc atcgcacaaa tccaaggaac 780
cggtctcgct accccactcg agggtcagac cgtcaccacc gaaggtattg tcactgccgt 840
ttacgcagaa ggtggcttca acggttacta catccagaca cctggatctg gtactgcacc 900
aaaggttgct ggcgacgcat ccgacggcat cttcgtctac gtgggaagca atggttccta 960
cccagagctc ggcgcatctg tcaccgtcac tggcaaggcc accgaacact acgagatgac 1020
tcagctaggc aactcctcct tcaccgtttc ggacaccgca ttcgagccag taaccccact 1080
cgaactggac accgttccta ctggcgatga cattcgcgaa gcatacgaag gcatgctgct 1140
gaagccaacc ggcgctcaca ccgtgaccaa caactacgca accaacacct tcggtgaaat 1200
tgccctcgcc ccaggtaacg agcctttgta ccaggccact caaatggtgg caccgggagc 1260
cgaagcgatt gcgtacgagg cggaaaacgt cgcaaagcaa attacgctgg atgacggacg 1320
ctccggcaac tacactcgcg gcgactccag cacgcctatg gcatggcttg tgcaggacgg 1380
tggcgagacc atcaagtcca tccgcaccgg cgaccaggtg gaattccagg caccagtaat 1440
cttcgattac cgctacgacc tgtggaaatt ccagccaacc acccctgtca ccggcaacac 1500
cgcaagctcc gaccttccta tcacctggga tgacacccgc gcggctgagc tagcttcaat 1560
caatgacgtt gctggcgaat tccacatcgc aagcttcaac gtgctcaact acttcacctc 1620
tctcggcgaa gatgaaccag gctgcagcgc atacagggat atcaacaaca ccccagtcac 1680
cgccaacaac tgtaacgtcc gtggcgctta caccgaagaa gcactcgaag atcagcagag 1740
caagatcgtc gaagcaatca accgccttga cgtcgatgtt cttggacttg aagaaatcga 1800
aaacaccgcg accgtcaccg gcgacgtctc ccgtcgcgat gacgcactca ataccctcgt 1860
cgcagcactc aacgaagcag ttggatccga tcgctgggcg gccgtcgaat ctccagaaca 1920
attgggcacc gatgaagact acatccgcgt cgccttcatc tacgaccaaa ccaccgtcaa 1980
gcccgtcggc gaatcccgaa tcttcgacga cgcagccttc accggcaccg cacgccagcc 2040
actcgcacag gaattccagc cactcaacga cagcgagaaa tccttcgtcg gcgtagtcaa 2100
ccacttcaag tccaagggct ctgtcactcg tggagacgcc gacaccggcg acggccaagg 2160
caacaacgcc aacgttcgcg tcgcacaggc acaggcactc atcgaccacc tggaaaacca 2220
ggacgactgg gcatccaagc caatcttcat cctcggcgac accaactcct acgccaagga 2280
aaccgcgatg accacccttt acggcgctgg ctacaccaac atcgccaccg aattcgacgc 2340
tggctacagc taccagttct ccggccgcat tggcagcctc gaccacgcac tcggcaacga 2400
agcagccatg aagcacgtca tcgacgccga ggtctgggac atcaacgctg acgaagcaat 2460
cgcattcgaa tactcccgtc gactcaacaa cacctccgac gtattcgaga acaacgtctt 2520
ccgctcctcc gaccacgacc cgatcaaggt cggattcaac ctcagcgaga ccactgagcc 2580
caccattccg gtagagccca ctgatcctgc agaacctac 2619
<210> 27
<211> 11982
<212> DNA
<213> 质粒(pJYS3_crtYf)
<400> 27
taattatcat tgactagccc atctcaattg gtatagtgat taaaatcacc tagaccaatt 60
gagatgtatg tctgaattag ttgttttcaa agcaaatgaa ctagcgatta gtcgctatga 120
cttaacggag catgaaacca agctaatttt atgctgtgtg gcactactca accccacgat 180
tgaaaaccct acaaggaaag aacggacggt atcgttcact tataaccaat acgctcagat 240
gatgaacatc agtagggaaa atgcttatgg tgtattagct aaagcaacca gagagctgat 300
gacgagaact gtggaaatca ggaatccttt ggttaaaggc tttgagattt tccagtggac 360
aaactatgcc aagttctcaa gcgaaaaatt agaattagtt tttagtgaag agatattgcc 420
ttatcttttc cagttaaaaa aattcataaa atataatctg gaacatgtta agtcttttga 480
aaacaaatac tctatgagga tttatgagtg gttattaaaa gaactaacac aaaagaaaac 540
tcacaaggca aatatagaga ttagccttga tgaatttaag ttcatgttaa tgcttgaaaa 600
taactaccat gagtttaaaa ggcttaacca atgggttttg aaaccaataa gtaaagattt 660
aaacacttac agcaatatga aattggtggt tgataagcga ggccgcccga ctgatacgtt 720
gattttccaa gttgaactag atagacaaat ggatctcgta accgaacttg agaacaacca 780
gataaaaatg aatggtgaca aaataccaac aaccattaca tcagattcct acctacataa 840
cggactaaga aaaacactac acgatgcttt aactgcaaaa attcagctca ccagttttga 900
ggcaaaattt ttgagtgaca tgcaaagtaa gcatgatctc aatggttcgt tctcatggct 960
cacgcaaaaa caacgaacca cactagagaa catactggct aaatacggaa ggatctgagg 1020
ttcttatggc tcttgtatct atcagtgaag catcaagact aacaaacaaa agtagaacaa 1080
ctgttcaccg ggcccgtggg tggctaggca agttacagaa ctgatcggat aaaagcagag 1140
ttatatctga tgaattgcta ttagcagtat cgttatcaca gcaccaacaa agtagttcag 1200
ccacaggaaa actttccaac tgcgattagc ctgttcacaa ctggcatctg taatgttcca 1260
aaatcgtgcg gcattaaata cgtaagttag aatcgcaatc ccgatgatcc acgccggatt 1320
aggcaaagta gtgactaaca cagcagctag taaataaagt actactgaaa gccgaatggc 1380
tccacgcgcc ccaattacag tggcaattga gctcagatta gcttcccggt ctgcattaac 1440
atcctgtact gctccaagga tctgactggc catgccccac aagaaaaagg atcccagtgc 1500
tatccacatc gctgctgaag gagatgttcc agtgatcgtt gcaccgatta atgcaggtga 1560
agtgaagtga gtagaagatg ttagagcatc gataaagggg cgttctttaa aacgcaattt 1620
cggtgctgaa taagcaatca ctgctagcac tgagagtgtc agccataaag acgacatcca 1680
ggtgccaaat atgaaaagaa taactaggaa aggaattgtt gagatagccg aggcccataa 1740
cagtgtgctg tgggaacttt tcggtagcac ggccccctcg acgccgcctt tgcggggatt 1800
acgcatatca gattcgtaat caaaaacatc gttgatacca tacatggcga tgttatacgg 1860
gataagaaaa aatacgatgc ctagccaaaa cagccagtca atctctcctg catttaatag 1920
gtaggccaga ccaaaggggt aggcggtatt gatccagcta atggggcgag atgacaatag 1980
aattagtctt attttttcca tcatgactac ggcttttctg gctcagattg cgtggtggtg 2040
gatcgcaccc aatgagaact aggagagtac ctagataaat aaaggccata aaaatatcgc 2100
tatcttgctc attttgtgaa atatcgatga tagggatcaa aatttaatga tcgtatgagg 2160
tcttttgaga tggtgtcgtt ttaggcggca atggttcggg cagtggtcct gcactggtat 2220
cggcatgtaa acgcttaata atattctcgg cagaaattaa acacatgggt attcctacac 2280
ccgggacggt ggtggcaccg gaatagaaga ggttattgac cttgcgggag ctattgcgcc 2340
ctcttaagaa agcggactgt ctgagggtat gtgctggacc cagcgcactg cctacccatg 2400
aatggtagcg gtgctcaaaa tccgcagggc caatggtgcg tttgaccaca attcggtcag 2460
tgaggtcagg gatgccggct tgcgtagcaa tttgattgat tgcatgtgac gcgattgttt 2520
ccacggatgc tgaagccgac tgcatatacg catcaccgtg gccgatgctg ctagaggcct 2580
tggtcggaat taaaacaaaa aggttttcgt atccagcagg tgcaacgccg tcttcggacg 2640
ttgaaggctt ggagacataa atggaatttg atgcattgtg ggggcgggta agttgaggcc 2700
cgtcgaaaac tacagcaaaa tcatctgtcc aatcttcact gaagaaaagg ttgtgatggt 2760
cgagctgggg taactctcct tttacgccca ggaggattaa taccgctcca attccaggat 2820
tgcgattgga ccaatatcgt tcgggatagg ttcgaagttc ccggggaagc agattatttt 2880
ctgtatggtg taggtcgcct gctgaaacca caagatccgc atctagattt tgcacttttc 2940
tgttgtgaag caagctcaca cctgtggcgc ttgtgttgcc cctcgatgaa gcagtgttga 3000
tggaaatgac ctcagaatcg agttgaaact caaccccgtt ttccagcgct aactgatgca 3060
gagcgttaac cactgcagta aaaccaccta tagggtattt cactccctgc accaaatcgg 3120
tatgactcat caagtggtac atcgatgggg tagtagtggg tcgggaagac aggaagactg 3180
ctggataggc tagattgaca gctagctcag tcctaggtat aatggatccg aatttctact 3240
gttgtagatc aggcaaccat agggcaggaa atttaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 3300
gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 3360
ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc 3420
ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt 3480
gcgtttctac aaactcttaa gcttgcatgc ctgcaggtcg acttagttat tgcggttctg 3540
gacaaattca aagtattctt cgttcttaat gacgagattc agcttcttgc cttcctggtt 3600
gttcttgatg cgacccagga gcatgagacc cttcagaccg atgtggtagg cgccgtttgc 3660
atcagcgtcc tgtggcatgt tctttggagc ctggcgggaa tcgaagaagt tgccgttgac 3720
gtcggccact ggggagatga ggtaatccag ctcggtgccg gtcttggagt tgcgcatctg 3780
caggatggtg ttgagcacag aggtcagctt tgcgaagaac ttcttgtcgg attcgccgca 3840
gattgcagcc ttgatgcact cgccgtggcc gtattcgatg gagtaatcct tcaggagctt 3900
ctccagttcc ttggttgggt acacttcgcg ggtatcccag ttgtggttct tgtcggagtt 3960
gcggaagttg atgaggcggg agccgaagga tgcgatggtc cacttgccct tggctgcctt 4020
atcgccgaag ttcttgtagt cgaaggagaa ttcgaagtag cccttatcca ggttgtagca 4080
gatcttgtcg aacttggaga agaactcctg ggacttggag acggattcgt actttgggta 4140
gagctggttg acgaagccgg tcactgggca gatcttagag gtgaagccag ctggcacgta 4200
gtagatgatg ccggtctgct tgcccatctt cttgaaggtc tcgaatgggg cggtcagctg 4260
gtatgcacgg aggacgccgc cggtcttatc gaattcgttg tccttgaaca cgaggtagtt 4320
cagcttctcg atgagcatct tttccagctt ctggtagacc tgcttctcca ccttgaagcg 4380
gccgcgcttg aagccgaagt tcaggtcttc gaagaccacg attgcgttgt actcgatcac 4440
cagcttagcg atttcgtgga ccacctggga gaggtagcct tccttcattt ccttgatgtt 4500
gttgatcttc ttccaatcct tgcgagcgga atcgcggtcc ttctcgatag cggccagctt 4560
gtcgtggtag ttggtcttca tgcgatcgtt gccgatgatg ttgaaggtgt cctgcttgat 4620
gatgttgccc ttgccgtcga ccagggtgta gtaggcgagg tggcgttcgc cgcgatcgat 4680
ggacaggatg tgcacgtcgt tagccttctc cttcaggagc aggttgattt catcgttgaa 4740
cttgttggcg ccggaggact tgaagttgat ggtgattggg cagtggaaga agaacttgtc 4800
ctcggtgaag cgcttatcct tgatcaggtc gtactcgaac acggattcct tctttgggtt 4860
atccttgttc ttgttggcga ttgcttcctt ggctgggtgg gtgatcttct ttgggatgga 4920
ctgcttgcgg tagaacagct ctgcttcgcc gttgagcttg tagaccacat cctgcaggtt 4980
gcgttcgtcg aagagtgcct tccagtagag ggtgtgcagg tttgggcggc ccttggagta 5040
agcggagaag tccttgttgt agatctggaa gaggtacagc ttgccctggt tgaccacgga 5100
atcgatgtag gactcggaga tgttttcgaa ggtcagcttg tagccctggt tctccacttc 5160
gcggtagaat tcatcgatgg agttgtagcg ctgggtatcg gagaagcgga agccgaagtc 5220
cttccactct gggtgcttgg agatggactg cttgtagaaa tcgatgaact tgcggcagtc 5280
ttcgatgttg aactcgaact tttcgtagcc cttctgtggg gagccgttct tggtgtgggt 5340
ggagtggttg cggatgcgca ggatatcttc ggatgggttg tagaacttga tggactttgc 5400
ggagaagaag acctttggga gcatcttgtt agcgcctggg agcagcttgt acacgatctt 5460
cttgtagccc tcgcccttgt tttccttgat ggccttatcg tcgaagatct tgttgttctt 5520
cttgttcatc acgcccaggt agtacttatc gtccttgatg aagaggatgg cggtgttatc 5580
tggttccttg ttcttgtccc agccgtttgc cagggtggag ttctcgaagt tgagcttgaa 5640
cttttcatcg gagtatggct tctgggtgat gtagttgcgg atcttgttgt acagtgggac 5700
gatgttagcg agttcgaagt agcactcttc gaacaccagg tagaagtgct catccttgtc 5760
gaggatgttg gccttgtctt cggactggga gatgtggaag atcttcagct tgtggagcag 5820
gttgttggtc tgatcgagca ggtccttgat tgccttcaca tcgtcctcag cggaggcctg 5880
gagcagatcc ttcttgccct ggttctggta cttgatggag atctgggcca ggttatcctt 5940
gttctgtgcg atttcgtcga agatcattgg gattgcagcg aagtttgcga ggatctcttc 6000
gaagcggcac tgcttatcga tgtcgcggtg cttgttgaac tcttcgagag ccagcttgat 6060
ggtctcgagg gacaggtact tagccttttc ggtcttcttg gcgatcagct cctgttcctt 6120
cttggatggg ttatcgaggt tctttggggc gatctgctgg gtgatgtatt ccaggactgc 6180
ggtgccgatc acggagtaat cgtcgaagac ctgctgggag agatcggtca gggacttgtc 6240
gttcttgaag tagatcttgg agagatccag cttctgagcc ttcagatcgt cgaagagcag 6300
ggagagggtc tccttgatgg acttctcttc cacggtcttg aaggctgcga tctgttcgta 6360
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ggtgttttcg ccgttgacga acttgccgcc gatgatggtg ttgaacttgg tgatgccgga 6600
ctggttcagg tagttgttga agttggcgat ctcgaacact tcatcgaggg agaagacgcg 6660
ctggttcact tcagaggtct tgtaatcgat gtcgaaggtg agctcttcgg ccaggtcctt 6720
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cttgttttcg aggaactttg gcaggttatc gtcgacgatg cggtagatga tagaggttgg 6840
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ccagcccttg aaggacttga tgatctccag agcttcatcg atgtcggtga tgtcggagtt 6960
ggccttgaag agctcgatgc cgttatcctt ggactgcttg agccacagga tgagatcgga 7020
ttcctggccc ttctttgcgt cgatcaggtt ctggttgaag aggttcttga acttctcgga 7080
atccttgatg tattcggaga tctgcttctt gatggtatcc ttagcggact tgaagtcctt 7140
ctgcaggtta tcgtcatcgg acttcttgag cttgaagtag acatcggagt agttctggag 7200
caggtcctcg gagatgcaca cggaggacag gatctcttcg atgaagaact ggtggtactt 7260
gtcgatgatc tgctttgcct tcttgtaatc cttagcgcgc ttttcgtcat ccaggatgag 7320
gccgcgtgcc ttgatgtttt cgagggtctt gccttggggg atcagctcaa aacggagggt 7380
cttggacagg gagtatttat tcacaaactc ttggtagatg gacatcgttc aagtcctttc 7440
caattccaca catggtacca cacgatgatt aattgtaaac agctcaggtc atgattccgc 7500
gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 7560
gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 7620
tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 7680
cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 7740
gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tccgcgcctt gagcctggcg 7800
aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 7860
ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 7920
caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 7980
tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 8040
cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 8100
gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct tggagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 8160
gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 8220
cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 8280
gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga 8340
tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggca agaaagccat ccagtttact 8400
ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct 8460
gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt 8520
ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt 8580
cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac gtgttccgct tccggtgacc gcctcgatga 8640
tcgccgggtg ggcgtggccc aaggaggatc atccagccat tcggggtcgt tcactggttc 8700
ccctttctga tttctggcat agaagaaccc ccgtgaactg tgtggttccg ggggttgctg 8760
atttttgcga gacttctcgc gcaattccct agcttaggtg aaaacaccat gaaacactag 8820
ggaaacaccc atgaaacacc cattagggca gtagggcggc ttcttcgtct agggcttgca 8880
tttgggcggt gatctggtct ttagcgtgtg aaagtgtgtc gtaggtggcg tgctcaatgc 8940
actcgaacgt cacgtcattt accgggtcac ggtgggcaaa gagaactagt gggttagaca 9000
ttgttttcct cgttgtcggt ggtggtgagc ttttctagcc gctcggtaaa cgcggcgatc 9060
atgaactctt ggaggttttc accgttctgc atgcctgcgc gcttcatgtc ctcacgtagt 9120
gccaaaggaa cgcgtgcggt gaccacgacg ggcttagcct ttgcctgcgc ttctagtgct 9180
tcgatggtgg cttgtgcctg cgcttgctgc gcctgtagtg cctgttgagc ttcttgtagt 9240
tgctgttcta gctgtgcctt ggttgccatg ctttaagact ctagtagctt tcctgcgata 9300
tgtcatgcgc atgcgtagca aacattgtcc tgcaactcat tcattatgtg cagtgctcct 9360
gttactagtc gtacatactc atatttacct agtctgcatg cagtgcatgc acatgcagtc 9420
atgtcgtgct aatgtgtaaa acatgtacat gcagattgct gggggtgcag ggggcggagc 9480
caccctgtcc atgcggggtg tggggcttgc cccgccggta cagacagtga gcaccggggc 9540
acctagtcgc ggataccccc cctaggtatc ggacacgtaa ccctcccatg tcgatgcaaa 9600
tctttaacat tgagtacggg taagctggca cgcatagcca agctaggcgg ccaccaaaca 9660
ccactaaaaa ttaatagtcc ctagacaaga caaacccccg tgcgagctac caactcatat 9720
gcacgggggc cacataaccc gaaggggttt caattgacaa ccatagcact agctaagaca 9780
acgggcacaa cacccgcaca aactcgcact gcgcaacccc gcacaacatc gggtctaggt 9840
aacactgaaa tagaagtgaa cacctctaag gaaccgcagg tcaatgaggg ttctaaggtc 9900
actcgcgcta gggcgtggcg taggcaaaac gtcatgtaca agatcaccaa tagtaaggct 9960
ctggcggggt gccataggtg gcgcagggac gaagctgttg cggtgtcctg gtcgtctaac 10020
ggtgcttcgc agtttgaggg tctgcaaaac tctcactctc gctgggggtc atctctggct 10080
gaattggaag tcatgggcga acgccgcatt gagctggcta ttgctactaa gaatcacttg 10140
gcggcgggtg gcgcgctcat gatgtttgtg ggcactgttc gacacaaccg ctcacagtca 10200
tttgcgcagg ttgaagcggg tattaagact gcgtactctt cgatggtgaa aacatctcag 10260
tggaagaaag aacgtgcacg gtacggggtg gagcacacct atagtgacta tgaggtcaca 10320
gactcttggg cgaacggttg gcacttgcac cgcaacatgc tgttgttctt ggatcgtcca 10380
ctgtctgacg atgaactcaa ggcgtttgag gattccatgt tttcccgctg gtctgctggt 10440
gtggttaagg ccggtatgga cgcgccactg cgtgagcacg gggtcaaact tgatcaggtg 10500
tctacctggg gtggagacgc tgcgaaaatg gcaacctacc tcgctaaggg catgtctcag 10560
gaactgactg gctccgctac taaaaccgcg tctaaggggt cgtacacgcc gtttcagatg 10620
ttggatatgt tggccgatca aagcgacgcc ggcgaggata tggacgctgt tttggtggct 10680
cggtggcgtg agtatgaggt tggttctaaa aacctgcgtt cgtcctggtc acgtggggct 10740
aagcgtgctt tgggcattga ttacatagac gctgatgtac gtcgtgaaat ggaagaagaa 10800
ctgtacaagc tcgccggtct ggaagcaccg gaacgggtcg aatcaacccg cgttgctgtt 10860
gctttggtga agcccgatga ttggaaactg attcagtctg atttcgcggt taggcagtac 10920
gttctcgatt gcgtggataa ggctaaggac gtggccgctg cgcaacgtgt cgctaatgag 10980
gtgctggcaa gtctgggtgt ggattccacc ccgtgcatga tcgttatgga tgatgtggac 11040
ttggacgcgg ttctgcctac tcatggggac gctactaagc gtgatctgaa tgcggcggtg 11100
ttcgcgggta atgagcagac tattcttcgc acccactaaa agcggcataa accccgttcg 11160
atattttgtg cgatgaattt atggtcaatg tcgcgggggc aaactatgat gggtcttgtt 11220
gttggcgtcc cggagcgtaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 11280
aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccttgatgat accgctgcct 11340
tactgggtgc attagccagt ctgaatgacc tgtcacggga taatccgaag tggtcagact 11400
ggaaaatcag agggcaggaa ctgctgaaca gcaaaaagtc agatagcacc acatagcaga 11460
cccgccataa aacgccctga gaagcccgtg acgggctttt cttgtattat gggtagtttc 11520
cttgcatgaa tccataaaag gcgcctgtag tgccatttac ccccattcac tgccagagcc 11580
gtgagcgcag cgaactgaat gtcacgaaaa agacagcgac tcaggtgcct gatggtcgga 11640
gacaaaagga atattcagcg atttgcccga gcttgcgagg gtgctactta agcctttagg 11700
gttttaaggt ctgttttgta gaggagcaaa cagcgtttgc gacatccttt tgtaatactg 11760
cggaactgac taaagtagtg agttatacac agggctggga tctattcttt ttatcttttt 11820
ttattctttc tttattctat aaattataac cacttgaata taaacaaaaa aaacacacaa 11880
aggtctagcg gaatttacag agggtctagc agaatttaca agttttccag caaaggtcta 11940
gcagaattta cagataccca caactcaaag gaaaaggact ag 11982

Claims (7)

1.一种重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产赖氨酸中的应用，其特征在于，所述的重组谷氨酸棒杆菌的胞外核酸酶ExeR被失活，同时三磷酸腺苷酶ATPase的表达被增强；
其中，所述胞外核酸酶ExeR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三磷酸腺苷酶ATPase的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
其中，所述的发酵为固定化发酵。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌在含有固体载体的培养基中进行发酵，得到赖氨酸发酵液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的固体载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣、玉米秸秆、活性炭、塑料、玻璃中的任意一种或几种组合。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，固体载体在发酵培养基中的用量为1~100g/L。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，培养基中各组分的浓度为：葡萄糖80~300g/L、硫酸铵30~50 g/L、硫酸镁0.5~1.5 g/L、糖蜜10~25 g/L、玉米浆10~25 g/L、磷酸二氢钾1~5 g/L、硫酸亚铁100~300 mg/L、硫酸锰100~200 mg/L、烟酰胺40~80 mg/L、泛酸钙5~15mg/L、VB1 5~15 mg/L、硫酸铜0.5~2 mg/L、硫酸锌0.5~2 mg/L、生物素0.5~2 mg/L、碳酸钙10~50 g/L，溶剂为水。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，每一批发酵结束后，用新的发酵培养基替换得到的发酵液，培养至糖耗尽，获得赖氨酸发酵液。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的发酵为在温度28~34℃，200~250rpm/min条件下发酵20~90 h。
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