KR20190107380A - 시계유전자 및 보고유전자가 도입된 동물 세포의 활동일주기 변화 분석용 형질전환 세포주 및 이를 이용한 약물 독성 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시계유전자(clock gene) 및 보고유전자(reporter gene) 유전자가 도입된 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 세포주 및 상기 세포주를 이용한 약물 독성의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 형질전환 세포주는 시계유전자 및 보고유전자의 도입을 통해 세포주의 활동일주기를 안정적으로 발현함으로써 시험물질 처리에 의한 활동일주기 변화 분석이 가능하고, 세포사멸이 나타나지 않는 저농도에서도 시험물질의 약물 독성 확인이 가능하므로 관련 분야의 연구용 및 약물개발 단계에서 약물 독성 스크리닝 모델로서 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 시계유전자(clock gene) 및 보고유전자(reporter gene)가 도입된 동물 세포의 활동일주기 변화 분석용 형질전환 세포주 및 이를 이용한 약물 독성 스크리닝 방법에 관한 것이다.
세포의 활동일주기(circadian rhythm)는 포유동물의 유전자 발현과 호르몬 분비 및 에너지 대사, 혈압, 체온유지와 같은 생체의 생리학적 기능과 관련되어 있어 활동일주기의 교란에 의해 대사증후군, 염증성 질환 및 암 등이 발생할 수 있다. 따라서 세포에서 발현되는 활동일주기를 측정하는 기법은 약물의 암 유발성과 암의 진단에 있어서 유용한 방법으로 대두되고 있다. 빛이나 다른 환경적인 스트레스에 의한 뇌의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus)에 의해 24시간 주기의 활동일주기가 발생하여 이 신호를 뇌의 다른 부분과 멀리 떨어진 장기에 보내 말초시계를 동기화시킴으로써 송과선 호르몬 및 멜라토닌을 분비하고 식이섭취 및 체온을 조절하게 한다. 이러한 과정에서 BMAL1과 CLOCKB 결합체가 E-box elements에 결합하여 Per1 및 Cry유전자에 붙어 이들 단백질을 발현시킴으로써 활동일주기의 발현과 조절에 작용한다.
현재 생물학적 영향이 활동일주기의 교란과 이로 인해 건강에 미치는 영향에 대한 많은 정보들이 보고되고 있지만 어떤 형태의 노출이 활동일주기 유전자 발현에 이상을 일으키는지와 이러한 결과가 독성학적 시험이나 환경에 어떠한 영향을 미칠지에 대한 정보는 매우 부족하다. 이러한 작용기전을 규명하기 위해서는 화학물질이 정상세포의 활동일주기에 어떻게 영향을 미치는 지를 밝히는 것이 필수적인 사항이다. 배양세포를 이용한 활동일주기 연구들이 생체 내의 신경세포 및 장기에의 활동일주기와 관련된 생화학 및 유전적인 영향을 연구하는 것을 가능하게 하였다. 이러한 대체 스크리닝 전략은 짧은 시간에 낮은 용량으로 노출되었을 때의 활동일주기에 미치는 영향을 조기에 예측하기 위한 기전적인 정보를 제공하도록 할 수 있는 방법이다. 신경계에서는 비정상적인 활동일주기와 신경변성 및 불면증의 정도와의 연관성을 정하기 위한 많은 임상시험들이 수행되어왔으며 최근에 유전자발현과 임상시험 결과는 활동일주기와 뇌의 연령과 관련된 기능저하 사이에 관계가 되고 있음이 보고되고 있다. 또한 다양한 환경오염물질이 퇴행성신경질환 발현위험성이 증가와 관련되어 있음이 보고되고 있다. 그러므로 독성물질을 조기에 스크리닝하기 위해서 활동일주기의 발현을 측정할 수 있는 세포 및 이용한 독성물질의 스크리닝 방법을 개발하여 검증하는 것이 필수적이다.
간장은 화학물질을 대사 배출시키는 중심기관으로 이들 기관들에 대한 독성은 이차적인 전신독성 및 질환을 유발하기 때문에 약물의 개발단계 및 임상적용단계에서 간장의 독성은 산업체가 약물을 개발하는데 있어서 주요한 제약요인이 되고 있다. 활동일주기는 약물의 대사 및 분포에 영향을 미침으로서 약물의 독성에 영향을 미치는 것이 알려지고 있으나 기존의 독성시험에서 이런 영향에 대한 평가가 이루어지지 않고 있다.
이에 본 발명자들은 사람의 활동일주기를 측정하기 위하여 연구하던 중 시계유전자 및 보고유전자를 세포에 도입시켜 활동일주기가 발현되는 안정화된 세포주를 제조하고, 상기 세포주를 이용하여 약물 독성을 스크리닝할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 시계유전자 및 보고유전자가 도입된 동물 세포의 활동일주기 변화 분석용 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포주를 포함하는 약물 독성 스크리닝용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포주를 이용한 약물 독성 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시계유전자 및 보고유전자가 도입된 동물 세포의 활동일주기 변화 분석용 형질전환 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 포함하는 약물 독성 스크리닝용 조성물 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시험물질을 상기 세포주에 처리하는 단계 및 시험물질이 처리된 세포주의 활동일주기 변화를 분석하는 단계를 포함하는 약물 독성 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 형질전환 세포주는 시계유전자 및 보고유전자의 도입을 통해 세포주의 활동일주기를 안정적으로 발현함으로써 시험물질 처리에 의한 활동일주기 변화 분석이 가능하고, 세포사멸이 나타나지 않는 저농도에서도 시험물질의 약물 독성 확인이 가능하므로 관련 분야의 연구용 및 약물개발 단계에서 약물 독성 스크리닝 모델로서 활용될 수 있다.
도 1은 제작된 pGL4[hPer2/Luc2P/Neo] DNA 벡터(DNA vector)를 나타낸 도이다.
도 2는 제작된 pGL4[hPer2/Luc2P/Neo] DNA 벡터(DNA vector) 내 인간 Per2 프로모터의 (941 bp) 염기서열을 나타낸 도이다.
도 3은 벡터(Vector)를 형질도입(transfection)시킨 세포에서 발광효소(luciferase)의 발현을 측정하여 유전자도입 여부를 확인한 도이다.
도 4는 유전자 도입 간세포주(HepG2/hPer2-dLuc)의 활동일주기 활성을 72시간 동안 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 케타코나졸의 농도의 변화에 따른 유전자 도입 간세포주(HepG2/hPer2-dLuc)의 활동일주기에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 저용량의 시험물질이 유전자 도입 간세포주(HepG2/hPer2-dLuc)의 활동일주기에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 제작된 pGL4[hPer2/Luc2P/Neo] DNA 벡터(DNA vector) 내 인간 Per2 프로모터의 (941 bp) 염기서열을 나타낸 도이다.
도 3은 벡터(Vector)를 형질도입(transfection)시킨 세포에서 발광효소(luciferase)의 발현을 측정하여 유전자도입 여부를 확인한 도이다.
도 4는 유전자 도입 간세포주(HepG2/hPer2-dLuc)의 활동일주기 활성을 72시간 동안 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 케타코나졸의 농도의 변화에 따른 유전자 도입 간세포주(HepG2/hPer2-dLuc)의 활동일주기에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 저용량의 시험물질이 유전자 도입 간세포주(HepG2/hPer2-dLuc)의 활동일주기에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 시계유전자 및 보고유전자가 도입된 동물 세포의 활동일주기 변화 분석용 형질전환 세포주를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서, 상기 시계유전자는 Bmal1 유전자, 서캐디안 로코모터 아웃풋 사이클스 카풋(circadian locomotor output cycles kaput; Clock) 유전자, 피리오드 서캐디안 클락 1(period circadian clock 1; Per1) 유전자, 피리오드 서캐디안 클락 2(period circadian clock 2; Per2) 유전자, 피리오드 서캐디안 클락 3(period circadian clock 3; Per3) 유전자, 크립토크롬 1(cryptochrome 1; Cry1) 유전자, 크립토크롬 2(cryptochrome 2; Cry2) 유전자, Rev-Erbα 유전자 또는 카제인인산화효소Ⅰε(CKIε) 유전자 일 수 있고, 바람직하게는 피리오드 서캐디안 클락(Per) 유전자일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 피리오드 서캐디안 클락 2(Per2) 유전자일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 보고유전자는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 유전자, 적색형광(RFF) 유전자, 루시퍼라아제(luciferase) 유전자, 베타-칼락토시다제(beta-galactosidase; EBG) 유전자, 클로람페니콜 유전자, 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase; CAT) 유전자 또는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 유전자 일 수 있으며, 바람직하게는 루시퍼라아제 유전자일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 세포주는 형질도입된 세포주로서 동물세포주인 것이 바람직하고, 본 발명의 목적상 간세포주인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한 본 발명의 세포주는 보다 바람직하게는 HepG2 세포일 수 있다.
본 발명에서 시계유전자 및 보고유전자를 형질도입한 세포주는 백터를 이용하여 형질도입을 수행한 형질전환 세포주일 수 있다. 상기 백터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 실시예에서는 도 1에 개시된 재조합 벡터를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 포함하는 약물 독성 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 약물 독성 스크리닝용 키트를 제공한다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트, 또는 단백질 칩 키트를 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 목적상, 약물 독성은 세포 기능의 손상 또는 세포사멸을 이르는 경우뿐만 아니라, 정상세포와 대비하여 활동일주기에 영향을 미치는 경우를 포함하는 개념이다. 상기 조성물 및 키트는 약물 독성이 형질도입된 세포주의 활동일주기를 변화시키는 것에 기인하여, 약물 독성 여부에 대해서 예측이 가능하다.
또한 본 발명은, 시험물질을 상기 세포주에 처리하는 단계 및 시험물질이 처리된 세포주의 활동일주기 변화를 분석하는 단계를 포함하는 약물 독성 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 "시험물질"이란 약물 독성을 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 시험물질은 또한 천연물질뿐 아니라, 합성물질도 포함한다.
상기 활동일주기의 변화는 보고유전자의 발현을 통해 확인될 수 있으며, 시험물질의 처리에 따른 세포주의 활동일주기의 주기 및 진폭의 변화를 정상세포와 비교하여 판단될 수 있다. 상기 판단에 따른 활동일주기에 변화가 있을 경우, 세포독성이 있는 물질로 판단한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
시계유전자
(clock gene) 및 보고유전자(reporter gene)가 도입된 세포주의 제조 및 배양
1-1.
pGL4
[
hPer2
/
Luc2P
/Neo] DNA 벡터 제작 및 형질도입 세포주 확립
세포주의 활동일주기 발현을 측정하기 위하여 발광효소 리포터 벡터(Luciferase reporter vector)인 pGL4.18[Luc2P/Neo] (Promega사) 벡터 (GenBank® Accession Number: DQ188838)에 hPer2 프로모터를 라이게이션(ligation)하여 pGL4[hPer2/Luc2P/Neo] DNA 벡터를 제조하였으며, 그 후 상기 벡터(vector)를 수용성 세포(competent cell)에서 증폭시켰다. 상기와 같이 제조된 벡터를 도 1에 나타내었다.
형질도입을 위한 시험 세포주로는 사람의 간암유래세포주인 HepG2 세포를 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 유전자 도입 비교를 위한 양성 대조세포로서는 유전자 도입이 잘되는 것으로 알려진 NIH3T3 세포(마우스 섬유아세포)를 이용하였다.
실험 하루 전 날 시험 세포주를 6 웰 플레이트(plate)에 분주 (HepG2 6X105 cell/well)한 후, Promega사의 FuGENE® HD 형질도입(transfection) 시약을 이용하여 세포밀집도(cell confluency)가 80%일 때 형질도입을 시작하였다. 그 후, 항생제가 첨가되지 않은 각각의 배양배지에서 배양하였다. 벡터 DNA 3.3μg과 FuGENE HD 형질도입 시약 15 μL를 Opti-MEM 배지 117.39 μL에 넣어서 혼합 후, 실온에서 15분간 정치하고 상기에서 제조된 용액을 각 웰에 한 방울씩 첨가하고 플레이트를 20회 가량 흔들어 섞어주었다. 그 후, 40~46시간 동안 37℃에서 배양하고, 700 μg/ml의 G-418(Geneticin, ThermoFisher scientific사)이 첨가된 선택배지에서 계대배양 하였다. 계대배양을 위한 선택배지의 구성 및 용량은 하기 표 1에 나타내었다.
| 구성 | 용량 |
| EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium) | 43.877 ml |
| FBS(fetal bovine serum) | 4.93 ml |
| 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin) | 493 μL |
| G-418(Geneticin) | 700 μL |
| Total | 50 ml |
계대배양은 7일간 수행하였으며, 이 때 G-418을 포함한 배양 배지로 교체하면서 세포를 관찰하였다. 대다수의 세포가 죽고, 살아남은 세포들이 안정적으로 유지될 때까지 계속해서 G-418을 포함한 배양 배지로 유지하면서 배양하였으며 형질도입 24~25일 경과 후 살아남은 세포 콜로니(colony)를 새로운 플레이트(plate)로 옮기고, 이후 계속해서 G-418을 포함하는 선택 배지로 유지 및 계대배양하여 안정된 형질도입 세포주를 확립하였다.
제작된 pGL4[hPer2/Luc2P/Neo] DNA 벡터(DNA vector) 내 인간 Per2 프로모터의 (941 bp) 염기서열을 도 2에 나타내었다.
1-2. 형질도입 여부 확인
상기 1-1에서 수득한 형질도입된 세포주에서 목적유전자의 정상적인 형질도입 여부를 발광효소 분석 키트(Luciferase assay kit, Promega사)를 이용하여 확인하였다.
먼저 5X lysis buffer를 1X로 준비하여 실온에서 보관하고, 1X PBS로 세포를 세척(washing)한 후, 6 웰 플레이트에서 배양 중인 세포주에 1X lysis buffer를 각 600 μL씩 분주하였다. 잠시 후, 세포를 웰에서 떼어내고 1.5 ml 튜브로 옮겼다. 그 후 튜브를 1초간 볼텍싱(Vortexing)하고 원심분리기에서 12,000 g 로 2분간 처리하였다. 원심분리기에 의해 분리된 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 White 96 웰 플레이트(plate)에 분리한 상층액을 20 μL씩 분주하였으며, 발광효소 분석 시료(Luciferase Assay reagent)는 측정 직전에 100 μL씩 웰에 분주하였다. 그 후 SoftMax Pro(molecular devices사) 기기에서 발광 측정(integration : 1,500)을 수행하였다.
작출한 세포에서 발광효소의 발현을 측정하여 유전자 도입 여부를 확인하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, HepG2 세포주에서는 발광평균이 14,928이었으며 NIH/3T3 세포주에서는 9,261임을 확인하였다. 이는 상기 실시예 1-1에서 수득한 형질전환 HepG2 세포주에 유전자가 정상적으로 도입되었음을 나타낸다.
실험예
1. 안정된 세포주의 활동일주기 측정
상기 실시예 1-1에서 제조된 유전자가 도입된 형질전환 간세포주(HepG2/hPer2-dLuc)는 30일이 경과하였을 때 하나의 콜로니를 관찰할 수 있었으며 이들 콜로니를 선택적 배지에서 계속배양하였다. 수립한 세포주를 3.5 mm 배양접시에 2-3.5
105씩 분주하고, EMEM (10% FBS, 1% penicilin-streptomycin) 배지에서 3-4일간 배양하면서 세포상태를 관찰하였다. 세포 밀집도가 70%에 이르면 활동일주기 발현 동기화를 위해서 포스콜린(Forskolin, 10 μM)이 함유된 EMEM 배지로 교체하고 2시간 동안 37℃에서 정치하였으며 포스콜린을 제거하고 남아있는 것을 PBS로 2회 세척하였다. 세척 후 레코딩(recording) 배지를 배양접시에 3 mL씩 분주하고, 대조군으로 레코딩 배지에 루시페린이 결여된 배지(음성대조군, 빨간색)와 IC261(10 μM) 배지(양성대조군, 노란색)도 각각 3 mL씩 분주하였다. 레코딩 배지의 구성 및 용량은 하기 표 2에 나타내었다.
| 구성 | 용량 |
| FBS(2%) | 1 ml |
| 소듐 바이카보나이트(sodium bicarbonate), 7.5% | 375 μL |
| 페니실린/스트렙토마이신(penicilin/streptomycin) | 250 μL |
| 50 mM 루시페린(Lucinferin) | 100 μL |
| 1 M HEPES | 500 μL |
| EMEM | 50 ml |
그 후 그리스로 배양접시의 경계면을 잘 바르고 커버 글라스로 덮어 밀봉한 후, Lumicycler (Actimetrics사) 기기에서 배양하면서 3일 간 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 루시페린이 결여된 배지(빨간색)를 처리한 경우 어떠한 활성도 관찰되지 않았으며, 활동일주기를 억제하는 IC261 배지(노란색)을 처리한 경우 28.7 시간의 주기(period)를 보여, 안정된 세포주의 활동일주기 (초록색)인 26.69 시간 주기보다 장 주기성을 나타내었다. 이는 유전자가 도입된 세포주가 정상적인 활동일주기를 발현하는 것을 의미한다.
이를 통해, 상기 세포주가 동물 세포의 활동일주기 변화 분석에 사용될 수 있음을 확인하였다.
실험예
2. 세포주의 활동일주기(circadian rhythm) 측정을 통한 약물 독성 스크리닝
세포의 생존율에 낮은 영향을 미치는 농도(IC15; 15% 세포증식 억제농도, MTT assay를 이용해 결정)에서 약물의 독성이 생체세포의 활동일주기에 미치는 영향을 하기와 같이 조사하였다.
상기 실시예 1-1에서 제조된 유전자가 도입된 형질전환 간세포주(HepG2/hPer2-dLuc)에 시험약물을 농도별로 투여하여 총 4반복 처리하고 세포생존율과 각각의 세포리듬을 모니터링 한 후, Actimetrics社에서 제공하는 분석 소프트웨어를 활용하여 주기 및 진폭을 분석하였다. 여기서 양성대조군은 상기 형질전환 세포주에 특정 화학물질이 활동일주기를 변화시킬 수 있음을 나타내고, 시험약물을 처리한 경우의 활동일주기 변화를 음성대조군(Control)과 비교하여 활동일주기 그래프의 주기 및 진폭, 그래프의 형태를 종합적으로 분석하여 활동일주기의 변화가 있는 것으로 판단되면, 시험물질이 활동일주기에 영향을 미치는 것으로 판단한다. 이때, 시험물질의 독성은 세포를 손상 또는 사멸에 이르게 하지 않더라도, 음성대조군과 대비하여 활동일주기에 영향을 미치는 경우 독성이 있는 것으로 판단한다. 이에 따라 케토코나졸 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 μM을 준비하여 본 발명의 형질전환 간세포주(HepG2/hPer2-dLuc)에 농도별로 총 4반복 처리하고 세포생존율과 각각의 세포리듬을 모니터링 한 후, Actimetrics社에서 제공하는 분석 소프트웨어를 활용하여 주기 및 진폭의 분석 결과를 음성대조군과 비교한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 케토코나졸을 처리한 경우, 처리농도가 높아질수록 음성대조군의 활동일주기와 대비할 때, 주기 및 진폭, 그래프의 형태의 변화가 크게 나타나는 경향을 보이는 것을 확인하였다.
이를 통해, 케토코나졸을 처리한 경우, 농도의존적으로 활동일주기에 크게 영향을 미치는 것을 확인하였다.
또한, 아세트아미노펜(Acetaminophen), 푸라졸리돈(furazolidone) 및 5-플루오로우라실(5-fluorourasil)의 시험약물은 모두 DMSO(Dimethyl sulfoxide, Sigma aldrich사)를 이용하여 저장액을 만들었다. 각각의 저장액 농도는 아세트아미노펜 5 M, 푸라졸리돈 5 mM, 5-플루오로우라실 5 mM로 제조하였다. 그 후 상기 표 1에 나타낸 레코딩 배지에 각각의 시험약물의 저장액을 IC15 농도인 아세트아미노펜 1 mM, 푸라졸리돈 10 μM, 5-플루오로우라실 10 μM, 케토코나졸 100 μM로 희석하였다. 이는 상기와 같이 희석된 저농도, 즉, 세포사멸을 유발하지 않는 농도에서 약물이 활동일주기에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위함이다.
상기 실시예 1-1에서 제조된 유전자가 도입된 세포주(HepG2/hPer2-dLuc)를 3.5 mm 배양접시에 2-3.5
105씩 분주하고 3-4일간 배양하면서 세포밀집도가 70%가 되었을 때 포스콜린(10 μM)이 함유된 EMEM 배지로 교체하고 2시간 동안 37℃에서 정치하였다. 포스콜린을 제거하고 남아있는 것을 PBS로 2회 세척한 후, 상기와 같이 준비한 IC15 농도의 시험 약물들을 배양접시에 3 mL 씩 분주하고, 대조군으로 시험약물이 포함되지 않은 레코딩 배지(음성대조군, 빨간색)와 IC261(10 μM) 배지(양성대조군, 노란색)도 각각 3 mL씩 분주하였다. 그 후 그리스로 배양접시의 경계면을 잘 바르고 커버 글라스로 덮어 밀봉한 후, Lumicycler (Actimetrics사) 기기에서 배양하면서 3일 간 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 약물을 처리하지 않은 대조군(초록색, Control)과 비교하여 시험약물을 처리한 세포에서는 활동일주기의 주기 및 진폭의 변화를 나타내었다.
이를 통해, 시험약물이 상기 실시예 1-1에서 제조된 세포주의 활동일주기에 미치는 변화를 측정함으로써 약물 독성 여부를 판단할 수 있음을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 시계유전자 및 발광효소 유전자가 도입된 형질전환 세포주는 세포주의 활동일주기를 안정적으로 발현함으로써 동물 세포의 활동일주기 변화 분석 및 약물 독성의 확인이 가능함을 확인하였다.
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hPer2 promoter
<400> 1
aggtggaggt ctccctcgtc cggcttcggc gcgccgggtc tgccaggccg gccggaggtg 60
cgcaggagcc ccgcgcccag ctcccccgcc cgcaatggta cgcgccactc cgcgctcccc 120
gagctggcgg gcttgagggc gtagtgaatg gaaggcgccg acgccggaag tggatgagac 180
cactagggag gacgacgggt agcacgaacg cgccgcgtct ccattgagga accgacgagg 240
tgaacatgga gttccatgtg cgtccatgtg aaaaagagcg agcgacgggc gcggccacca 300
atgggcgcgc ggcgttcgta ggccccgccc ctcatgtatg cagatgagac ggagtcgcgg 360
ccaatggcgg aggccggggg cgggcgcggc gcgcgcggtc acgttttcca ctatgtgaca 420
gcggcgactc ggccgcggcg gaggcggcgg cgctgagggg atacgtgcag ctgtgggcgg 480
cggcggcggg cgcggggccg ggcggacaga gccgcgagtc ggcggaggga ccggcggacg 540
ggctgacgcg ggcgcggccg gcggtaagtg gcgcggcgcg gccccgctgc ggcttacgta 600
accgccgccg gcgcgcgggc ctcgggcagg tcggggtccc agcgccggct cgggcagcgg 660
aggcgccgcc ggaagttcct tgggctgctg gactcctcgg cttgaaacgg cgccggcgtg 720
ggggcgtgtg cccttggccc tgtcccaggt ggagagtggt cgagccgcgc gcagggtgcg 780
ctcgtttgaa ctgcggtgac accgagggtt ggggactcga acccccgctt cgcagctcag 840
gagcctgagg tccgaaaggt gaggcagcgt gtgtagggca ccgagctacc gagtgactgc 900
gcgcgggctg cggttccgtg ggcgattctc ttttgggaac cctcc 945
<210> 2
<211> 5727
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pGL4.18[Luc2P/Neo]
<400> 2
ggcctaactg gccggtacct gagctcgcta gcctcgagga tatcaagatc tggcctcggc 60
ggccaagctt ggcaatccgg tactgttggt aaagccacca tggaagatgc caaaaacatt 120
aagaagggcc cagcgccatt ctacccactc gaagacggga ccgccggcga gcagctgcac 180
aaagccatga agcgctacgc cctggtgccc ggcaccatcg cctttaccga cgcacatatc 240
gaggtggaca ttacctacgc cgagtacttc gagatgagcg ttcggctggc agaagctatg 300
aagcgctatg ggctgaatac aaaccatcgg atcgtggtgt gcagcgagaa tagcttgcag 360
ttcttcatgc ccgtgttggg tgccctgttc atcggtgtgg ctgtggcccc agctaacgac 420
atctacaacg agcgcgagct gctgaacagc atgggcatca gccagcccac cgtcgtattc 480
gtgagcaaga aagggctgca aaagatcctc aacgtgcaaa agaagctacc gatcatacaa 540
aagatcatca tcatggatag caagaccgac taccagggct tccaaagcat gtacaccttc 600
gtgacttccc atttgccacc cggcttcaac gagtacgact tcgtgcccga gagcttcgac 660
cgggacaaaa ccatcgccct gatcatgaac agtagtggca gtaccggatt gcccaagggc 720
gtagccctac cgcaccgcac cgcttgtgtc cgattcagtc atgcccgcga ccccatcttc 780
ggcaaccaga tcatccccga caccgctatc ctcagcgtgg tgccatttca ccacggcttc 840
ggcatgttca ccacgctggg ctacttgatc tgcggctttc gggtcgtgct catgtaccgc 900
ttcgaggagg agctattctt gcgcagcttg caagactata agattcaatc tgccctgctg 960
gtgcccacac tatttagctt cttcgctaag agcactctca tcgacaagta cgacctaagc 1020
aacttgcacg agatcgccag cggcggggcg ccgctcagca aggaggtagg tgaggccgtg 1080
gccaaacgct tccacctacc aggcatccgc cagggctacg gcctgacaga aacaaccagc 1140
gccattctga tcacccccga aggggacgac aagcctggcg cagtaggcaa ggtggtgccc 1200
ttcttcgagg ctaaggtggt ggacttggac accggtaaga cactgggtgt gaaccagcgc 1260
ggcgagctgt gcgtccgtgg ccccatgatc atgagcggct acgttaacaa ccccgaggct 1320
acaaacgctc tcatcgacaa ggacggctgg ctgcacagcg gcgacatcgc ctactgggac 1380
gaggacgagc acttcttcat cgtggaccgg ctgaagagcc tgatcaaata caagggctac 1440
caggtagccc cagccgaact ggagagcatc ctgctgcaac accccaacat cttcgacgcc 1500
ggggtcgccg gcctgcccga cgacgatgcc ggcgagctgc ccgccgcagt cgtcgtgctg 1560
gaacacggta aaaccatgac cgagaaggag atcgtggact atgtggccag ccaggttaca 1620
accgccaaga agctgcgcgg tggtgttgtg ttcgtggacg aggtgcctaa aggactgacc 1680
ggcaagttgg acgcccgcaa gatccgcgag attctcatta aggccaagaa gggcggcaag 1740
atcgccgtga attctcacgg cttccctccc gaggtggagg agcaggccgc cggcaccctg 1800
cccatgagct gcgcccagga gagcggcatg gatagacacc ctgctgcttg cgccagcgcc 1860
aggatcaacg tctaaggccg cgactctaga gtcggggcgg ccggccgctt cgagcagaca 1920
tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct 1980
ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 2040
aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg 2100
ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat cgataaggat ccgtttgcgt 2160
attgggcgct cttccgctga tctgcgcagc accatggcct gaaataacct ctgaaagagg 2220
aacttggtta gctaccttct gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt gtcagttagg 2280
gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 2340
gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat 2400
gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac 2460
tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga 2520
ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg 2580
cctaggcttt tgcaaaaagc tcgattcttc tgacactagc gccaccatga tcgaacaaga 2640
cggcctccat gctggcagtc ccgcagcttg ggtcgaacgc ttgttcgggt acgactgggc 2700
ccagcagacc atcggatgta gcgatgcggc cgtgttccgt ctaagcgctc aaggccggcc 2760
cgtgctgttc gtgaagaccg acctgagcgg cgccctgaac gagcttcaag acgaggctgc 2820
ccgcctgagc tggctggcca ccaccggcgt accctgcgcc gctgtgttgg atgttgtgac 2880
cgaagccggc cgggactggc tgctgctggg cgaggtccct ggccaggatc tgctgagcag 2940
ccaccttgcc cccgctgaga aggtttctat catggccgat gcaatgcggc gcctgcacac 3000
cctggacccc gctacctgcc ccttcgacca ccaggctaag catcggatcg agcgtgctcg 3060
gacccgcatg gaggccggcc tggtggacca ggacgacctg gacgaggagc atcagggcct 3120
ggcccccgct gaactgttcg cccgactgaa agcccgcatg ccggacggtg aggacctggt 3180
tgtcacacac ggagatgcct gcctccctaa catcatggtc gagaatggcc gcttctccgg 3240
cttcatcgac tgcggtcgcc taggagttgc cgaccgctac caggacatcg ccctggccac 3300
ccgcgacatc gctgaggagc ttggcggcga gtgggccgac cgcttcttag tcttgtacgg 3360
catcgcagct cccgacagcc agcgcatcgc cttctaccgc ttgctcgacg agttctttta 3420
atgatctaga accggtcatg gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt 3480
tggttttttg tgtgttcgaa ctagatgctg tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc 3540
agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt 3600
ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 3660
actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 3720
tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 3780
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 3840
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 3900
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 3960
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 4020
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 4080
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 4140
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 4200
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 4260
gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 4320
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 4380
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 4440
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 4500
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 4560
agtaaacttg gtctgacagc ggccgcaaat gctaaaccac tgcagtggtt accagtgctt 4620
gatcagtgag gcaccgatct cagcgatctg cctatttcgt tcgtccatag tggcctgact 4680
ccccgtcgtg tagatcacta cgattcgtga gggcttacca tcaggcccca gcgcagcaat 4740
gatgccgcga gagccgcgtt caccggcccc cgatttgtca gcaatgaacc agccagcagg 4800
gagggccgag cgaagaagtg gtcctgctac tttgtccgcc tccatccagt ctatgagctg 4860
ctgtcgtgat gctagagtaa gaagttcgcc agtgagtagt ttccgaagag ttgtggccat 4920
tgctactggc atcgtggtat cacgctcgtc gttcggtatg gcttcgttca actctggttc 4980
ccagcggtca agccgggtca catgatcacc catattatga agaaatgcag tcagctcctt 5040
agggcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcggtg ttgtcgctca tggtaatggc 5100
agcactacac aattctctta ccgtcatgcc atccgtaaga tgcttttccg tgaccggcga 5160
gtactcaacc aagtcgtttt gtgagtagtg tatacggcga ccaagctgct cttgcccggc 5220
gtctatacgg gacaacaccg cgccacatag cagtactttg aaagtgctca tcatcgggaa 5280
tcgttcttcg gggcggaaag actcaaggat cttgccgcta ttgagatcca gttcgatata 5340
gcccactctt gcacccagtt gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttcggggtg 5400
tgcaaaaaca ggcaagcaaa atgccgcaaa gaagggaatg agtgcgacac gaaaatgttg 5460
gatgctcata ctcgtccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt actagtacgt 5520
ctctcaagga taagtaagta atattaaggt acgggaggta ttggacaggc cgcaataaaa 5580
tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatcgata gtactaacat 5640
acgctctcca tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc aaaataggct gtccccagtg 5700
caagtgcagg tgccagaaca tttctct 5727
Claims (10)
- 시계유전자(clock gene) 및 보고유전자(reporter gene)가 도입된 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 형질전환 세포주.
- 제1항에 있어서,
상기 시계유전자는 Bmal1 유전자, 서캐디안 로코모터 아웃풋 사이클스 카풋(circadian locomotor output cycles kaput; Clock) 유전자, 피리오드 서캐디안 클락 1(period circadian clock 1; Per1) 유전자, 피리오드 서캐디안 클락 2(period circadian clock 2; Per2) 유전자, 피리오드 서캐디안 클락 3(period circadian clock 3; Per3) 유전자, 크립토크롬 1(cryptochrome 1; Cry1) 유전자, 크립토크롬 2(cryptochrome 2; Cry2) 유전자, Rev-Erbα 유전자 및 카제인인산화효소Ⅰε(CKIε) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 형질전환 세포주.
- 제1항에 있어서,
상기 보고유전자는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 유전자, 적색형광(RFF) 유전자, 발광효소(luciferase) 유전자, 베타-칼락토시다제(beta-galactosidase; EBG) 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase; CAT) 유전자 및 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 형질전환 세포주.
- 제1항에 있어서,
상기 시계유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 Per2 유전자인 것을 특징으로 하는, 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 형질전환 세포주.
- 제1항에 있어서,
상기 보고유전자는 루시퍼라아제(luciferase) 유전자인 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 형질전환 세포주.
- 제1항에 있어서,
상기 세포주는 간세포주인 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 형질전환 세포주.
- 제6항에 있어서,
상기 간세포주는 HepG2 세포인 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활동일주기(circadian rhythm) 변화 분석용 형질전환 세포주.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포주를 포함하는 약물 독성 스크리닝용 조성물.
- 제8항의 조성물을 포함하는 약물 독성 스크리닝용 키트.
- 시험물질을 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포주에 처리하는 단계 및 상기 시험물질이 처리된 세포주의 활동일주기 변화를 분석하는 단계를 포함하는 약물 독성 스크리닝 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180028569A KR20190107380A (ko) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | 시계유전자 및 보고유전자가 도입된 동물 세포의 활동일주기 변화 분석용 형질전환 세포주 및 이를 이용한 약물 독성 스크리닝 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180028569A KR20190107380A (ko) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | 시계유전자 및 보고유전자가 도입된 동물 세포의 활동일주기 변화 분석용 형질전환 세포주 및 이를 이용한 약물 독성 스크리닝 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190107380A true KR20190107380A (ko) | 2019-09-20 |
Family
ID=68067538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180028569A KR20190107380A (ko) | 2018-03-12 | 2018-03-12 | 시계유전자 및 보고유전자가 도입된 동물 세포의 활동일주기 변화 분석용 형질전환 세포주 및 이를 이용한 약물 독성 스크리닝 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20190107380A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL280736A (en) * | 2021-02-08 | 2022-09-01 | Yeda Res & Dev | Methods for monitoring biological clock rhythms |
-
2018
- 2018-03-12 KR KR1020180028569A patent/KR20190107380A/ko unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL280736A (en) * | 2021-02-08 | 2022-09-01 | Yeda Res & Dev | Methods for monitoring biological clock rhythms |
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